KR100978126B1

KR100978126B1 - 인테그린 표적화 조영제

Info

Publication number: KR100978126B1
Application number: KR1020047011515A
Authority: KR
Inventors: 란자그레고리; 위클린사무엘에이.; 해리스톰
Original assignee: 반즈 쥬이쉬 하스피털; 브리스톨-마이어즈 스퀴브 메디컬 이머징, 인코포레이티드
Priority date: 2002-01-24
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2010-08-26
Anticipated expiration: 2023-01-24
Also published as: US20080175792A1; BR0307206A; US20040058951A1; US7255875B2; EP1572639A1; WO2003062198A1; EP2269659A1; AU2003209392B2; CN101249269A; JP2005525319A; JP5444154B2; ZA200406686B; AU2009200095A1; US20060147380A1; CA2474386C; TR200401834T2; JP4731117B2; CN1738815A; KR20040090986A; WO2003062198A3

Abstract

바람직하게는, 고비점의 액상 퍼플루오로 화학물질로 형성되고, 지질/계면활성제 코팅으로 피복된 나노입자의 에멀젼은 QvP3 인테그린에 특이적이고 항체가 아닌 리간드에 상기 나노입자를 커플링시킴으로써 활성화된 내피세포 영역에 특이화된다. 이 나노입자는 생물학적 활성제, 방사성 핵종 또는 다른 조영제를 추가로 포함할 수 있다.

인테그린, 조영제, 나노입자

Description

인테그린 표적화 조영제{INTEGRIN TARGETED IMAGING AGENTS}

관련 출원 진술

본 출원은 2002년 1월 24일자 미국 가출원 제 60/351,390호의 우선권 주장 출원이다. 이 출원의 내용은 모두 본 명세서에 참조되어 있다.

본 발명은 인테그린을 이용하는 α_νβ₃-특이적인 표적화제에 특이적으로 표적화된 나노입자-기제 에멀젼에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 이러한 표적화를 위한 비-항체기제의 조성물의 용도에 관한 것이다.

여러 종류의 조영을 위해 소망되는 성분에 대한 결합을 쉽게 해주는 계면활성제 층으로 코팅된 퍼플루오로카본 나노입자로 만들어진 나노입자 조성물의 가치는 익히 알려져 있다. 예컨대, 본 발명에 그 내용이 참조된 미국특허 5,690,907; 5,780,010; 5,989,520; 9,958,371; 및 PCT 공개 WO02/060524를 참조. 이 문헌들은 MRI 조영제, 방사성 핵종 (radionuclide) 및/또는 생활성 제제와 같은, 여러가지 표적화제 및 소망되는 성분들에 커플링되는 퍼플루오로카본 나노입자의 에멀젼에 관해 설명하고 있다. 표적화 조영에 사용되어온 기타 조성물들로는 PCT 공개 WO 99/58162; WO 00/35488; WO 00/35887; 및 WO 00/35492에 기재된 것들을 들 수 있 다. 이 공개문헌의 내용 역시 본 발명에 참조되었다.

비트로넥틴에 결합하는 인테그린 α_νβ₃은 혈관신생의 마커로서 인식되고 있다. 이것은 활성화된 내피세포에 대해 비교적 선택적이면서 성숙한 무활동 세포상에서는 기본적으로 발현되지 않는다. 이 특성에 기초해서, 항암제로서 이 인테그린에 대한 길항제를 사용하려는 시도가 있었다. Kerr, J.S. 외, Anticancer Res. (1999) 19:959-968에는 마우스 모델계에서 신생 혈관형성을 감소시킬 수 있는 펩타이드 미메틱스가 설명되어 있다. 미국특허 6,153,628호는 α_νβ₃길항제인 1,3,4-티아디아졸 및 1,3,4-옥사디아졸이 설명되어 있으며, 염증, 뼈의 퇴화, 종양, 전이, 혈전증 및 세포 응집관련 질환을 비롯한 혈관형성과 관련된 질병의 치료에 유용한 것으로 설명되어 있다. 미국특허 6,130,231호 및 6,322,770호는 α_νβ₃길항제인 융합 헤테로사이클이 PCT 공개 WO01/97848과 동일한 목적에 유용하다고 설명되어 있다.

WO 01/97848 공개문헌은 임의로 링커 모이어티 (moieties)를 통해 보조 물질 (ancillary substances)에 링크될 수 있는 특이적인 화합물을 개시하고 있는데, 여기서, 이들 보조 물질들은 방사성 핵종, 자기공명영상 및 X-선 조영제에 유용한 물질들을 포함하는 것이다. 이 공개문헌은 또한 일반적으로 가스상 기포를 포함하는 특정한 초음파 조영제에 커플링된 이들 화합물의 용도도 개시하고 있다.

활성화된 내피세포에서의 그의 발현에 더해, α_νβ₃는 맥관계 벽의 대식세포를 비롯한, 혈관 평활근 세포상에서 발현된다. 이 복합체는 세포를 주변 매트릭 스에 결합시킴으로 해서 그 세포의 분화과정에서 이용된다. 따라서, α_νβ₃는 세포가 루멘 (lumen) 내로 이동하는 것을 보조함으로써 재협착에서 어떤 역할을 한다. 재협착의 주요 성분은 혈관 평활근세포 활성화, 증식 및 이동과 연관이 있다. 인테그린 헤테로다이머, 특히 α_νβ₃는 세포외 매트릭스에 세포를 부착시키고, 세포외 메탈로프로테이나제 발현을 유도하며, 평활근 세포의 이동에 관여함으로써 이들 프로세스의 중요한 요소인 것으로서 인식되고 있다. α_νβ₃ 인테그린은 내피세포, 자극된 단구, T-임파구, 섬유아세포, 혈관 평활근세포 및 혈소판에 널리 분포하고 있으며, 오스테오폰틴, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘 및 변성 콜라겐을 비롯한 몇가지 세포외 매트릭스 단백질 리간드에 결합한다.

풍선-확장된 혈관벽 내에서 인테그린 매개성 세포-매트릭스 상호반응의 길항작용은 손상 부위에 대한 염증성 세포의 모집을 억제하고, 평활근 세포의 증식과 이동을 제한하며, 세포외 매트릭스 단백질 합성을 감소시킨다. 시클릭 RGD 펩타이드 길항제를 이용한 인테그린의 선택적 및 비선택적 차단은 몇가지 재흡착 동물 모델에서 신생내막 (neointimal) 과형성을 제한하였다.

재협착은 대부분의 경우, 풍선 카테테르를 이용하여, 혈관계를 팽창시키려는 혈관형성술과 관련하여 일어나며, 혈관이 파열되어, 혈관 평활근 세포가 노출된다.결과적인 파열은 세포가 루멘 내로 이동할 것을 요구하고; α_νβ₃는 콜라겐과 피브린의 매트릭스를 통한 이동을 돕는 역할을 하여 이를 완수한다. 따라서, α_νβ₃를 표적화하는 조성물은 평활근세포를 표적화하여 재협착, 특히 풍선 혈관형성술과 관련된 재협착을 조영하는데 이용될 수 있고, 나아가 패클리탁셀, 라파마이신 및 방사성 핵종, 소형분자, 펩타이드 및 핵산과 같은 기타 치료제 모이어티 등의 항증식제를 전달하는데 이용될 수도 있을 것이다.

스텐트-기제의 전달 시스템은 전신약물 투여의 부작용을 일으키지 않으면서 동맥의 막 매질 (tunica media) 내에서 병소의 치료 약물 효과 가능성을 제공해주어, 스텐트-스트럿-동맥벽의 접촉지점에 근접한 곳에 약물을 높은 국소 내막 농도로 제공하는 반면, 내막 내에서의 지속적인 고도의 항증식성 약물 농도는 동맥벽의 치유와 재내피화를 저해할 수 있고 이로 인해, 루멘 내막의 염증과 재협착을 촉진할 수 있다. 본 발명의 조성물은 이러한 문제를 피해간다.

대부분의 펩티도미메틱 (peptidomimetics)과 무력화 항체 α_νβ₃길항제는 반감기가 짧아서 α_νβ₃에 대한 수용체를 아주 일시적으로만 점령한다. 본 발명의 인테그린-특이적 나노입자는 동맥의 과팽창에 의해 평활근 세포상에 노출된 인테그린의 결합을 표적화 및 차단할 수 있을 뿐만 아니라 염증과 재협착 프로세스를 억제할 수 있는 다양한 치료제들을 세포에 직접 전달할 수 있고 후속적인 재협착에 대한 풍선 손상의 정도와 위중도와 관련된 새롭고도 예후적인 정보에 대한 분자 조영을 제공해준다. 본 발명의 조성물은 이르한 문제를 피해간다.

α_νβ₃ 인테그린에 특이적인 항체들이 미국특허 6,171,588에 설명되어 있다. 이 항체들은 Sipkins, D.A.등의 리포트, Nature Med. (1998) 4:623-626에서 표 적화 자기공명 조영 (MRI)에 사용되었는데; 여기서는 아비딘 링커 단백질을 통해 리포좀 표면에 커플링되었다.

킬레이트화된 가돌리늄을 담지하는 퍼플루오로카본 에멀젼을 이용한 MRI의 표적화제로서 α_νβ₃에 지향된 항체를 사용하는 것 역시 Anderson, S.A. 등 Magn. Reson. Med. (2000) 44:433-439와 상술한 PCT 공개 WO 02/060524에 설명되어 있다. 인테그린에 표적화된 펩티드 리간드 역시 길항제로서 사용되어 왔으며 인테그린과 상호작용하는 것으로 알려진 "RGD"형 서열을 함유하는 시클릭 펩티드를 사용한, Storgard, C.M. 등 (J. Clin. Invest. (1999) 103:47-53))에 의해 류마치스성 관절염을 치료하기 위한 치료전략으로서 제안된 바 있다.

방사성 핵종에 시클릭 펩티드를 직접 커플링시킴으로써 종양을 조영하기 위해 Haubner, R. 등 J. Nucl. Med. (1999) 40:1061-1071에 의해 유사한 시클릭 펩타이드가 사용되었다. 또 다른 논문에서는 방사선 표지 및 PET 두가지 모두를 위해 시클릭 펩티드의 글리코실화 형태를 사용하는 것이 Haubner, R. 등에 의해 제안되었다 (J. Nucl. Med. (2001) 42:326-336).

출원인들이 아는 한, 영상-보조 나노입자 에멀젼 또는 생활성 제제를 함유하는 에멀젼을 염증, 종양, 동맥경화성 플라크 및 재협작 부위와 같은 활성화 내피세포를 함유하는 부위에 전달하는데 있어서, 항체 이외의 α_νβ₃-특이적인 모이어티를 사용할 것이 제안된 예는 없었다.

본 발명은 종양, 염증 부위, 동맥경화증 부위, 및 재협착증과 같이, 고도의 혈관형성을 포함하는 부위에 나노입자 에멀젼을 전달하기 위한 표적화제로서 비항체인 α_νβ₃-특이적인 모이어티를 사용하는, 조성물 및 조영법 및 약물전달법에 관한 것이다. 나노입자 에멀젼을 조영하는 것과 관련해서 이들 제제들을 사용함으로써 조영의 질이 향상되고 표적화된 약물 전달 가능성이 증진된다.

따라서, 한가지 측면에서 본 발명은 고농도α_νβ₃를 특징으로 하는 표적 조직에 나노입자 에멀젼을 전달하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 그러한 조직을 갖는 대상자에게 나노입자 에멀젼을 투여하는 것을 포함하는 것으로서, 여기서 상기 나노입자는 고농도α_νβ₃에 특이적인 리간드 (단, 상기 리간드는 항체나 그 단편이 아님)에 커플링된 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 유용한 조성물, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 조립될 수 있는 조성물 성분을 함유하는 키트에 관한 것이기도 하다. 키트는 일반적으로 별도로 제공되는 표적화제에 결합가능한 반응성기를 함유하거나, 또는 조영이나 약물 전달에 유용한 보조물질에 결합할 수 있는 에멀젼을 제공할 것이다.

도 1은 α_νβ₃ 표적화 및 비표적화 나노입자의 입경 분포를 보여준다.

도 2는 이식된 Vx-2 종양의 T₁-칭량 자기공명 영상의 확대단면을 나타낸다.

도 3은 H&E 염색 (약확대 배율) 및 α_νβ₃ 염색 (인셋, 고확대 배율)된 Vx-2 종양의 조직학적 섹션을 나타낸다.

도 4는 표적화 나노입자 또는 비표적화 나노입자가 투여된 대상자에 있어서 종양 (위) 및 근육 (아래)으로부터의 ROI의 증대를 나타내는 그래프이다.

도 5A-5C는 종양 슬라이스 중 염증의 조직학적 섹션의 여러가지 확대 레벨을 보여준다.

도 6은 α_νβ₃ 표적화 나노입자로 표적화된 종양의 T₂-칭량 및 T₁-칭량 MRI를 나타낸다.

도 7A는 α_νβ₃ 표지된 입자의 투여전 및 투여후의 대동맥 슬라이스의 스핀-에코 영상을 보여준다. 도 7B는 콜레스테롤 처리된 대상자, 미처리 대상자 및 비-표적화 에멀젼이 사용된 콜레스테롤 처리된 대상자에 있어서의 대동맥 조영 개선을 보여준다.

도 8A 및 8B는 표적화 및 비표적화 입자를 사용한 대동맥 및 근육에 있어서 MRI 시그널의 퍼센트 증가를 나타낸다.

도 9는 α_νβ₃-표적화된 상자성 나노입자를 이용한 혈관형성술에 이은 집돼지의 경동맥의 3차원 혈관조영사진으로서, 풍선 과팽창된 손상 패턴을 보여준다.

발명을 수행하기 위한 형태

본 발명은 활성화된 내피세포 농도 부위를 잘 조영할 수 있는 접근방법을 제공해준다. 조영에 유용한 다양한 에멀젼을 사용할 수 있다. 단독 사용할 경우, 나 노입자-함유 에멀젼은 초음파 조영용 조영제로서 유용하다. 자기공명영상 또는 X-선 조영에서 사용될 경우에는, 조영제로서 전이금속을 사용하는 것이 바람직할 수 있다; 그러나, 나노입자가 플루오로카본을 함유할 경우, 플루오로카본 자체가 영상을 얻는데 유용하다. 방사성 핵종 역시 진단제 및 치료제 두가지 모두로서 유용하다. 또한, 플루오로포어와 같은 광학 조영용 시약 역시 나노입자와 결합될 수 있다. 또한, 또는 다른 한편, 에멀젼 중의 나노입자는 한가지 이상의 생활성 제제를 함유할 수 있다.

여하한 나노입자 에멀젼이든지 사용가능하다. 예컨대, PCT 공개 WO 95/03829는 유적 (oil droplet) 내부에 약물이 분산 또는 용해되어 있어 유적이 리간드에 의해 특정 위치로 표적화되는 오일 에멀젼을 설명하고 있다. 미국특허 5,542,935호는 가스-충전된 퍼플루오로카본 마이크로스피어를 사용하는 위치-특이적인 약물 전달에 관해 설명하고 있다. 약물 전달은 표적으로 마이크로스피어를 호밍 (home)시킨 다음 그것을 파열시킴으로써 달성된다. 저비점 퍼플루오로 화합물을 이용하여 입자를 형성함으로써 기포를 형성할 수 있다.

그러나, 상기한 미국특허 5,958,371호에 설명된 것과 같이 나노입자가 고비점 퍼플루오로카본 액체에 기초한 에멀젼을 사용하는 것이 바람직하다. 액체 에멀젼은 지질 및/또는 계면활성제로 구성된 코팅에 의해 둘러싸여진 비교적 비점이 높은 퍼플루오로카본을 포함하는 나노입자를 함유한다. 주변 코팅은 표적화 모이어티에 직접 커플링할 수 있거나 또는 표적화 모이어티에 공유적으로 커플링되는 중간 성분들을 임의로 링커를 통해 트래핑시키거나 또는 바이오틴과 같은 비특이적인 커 플링제를 함유할 수 있다. 다른 한편, 코팅은 양이온성일 수 있음으로 해서 일반적으로는 핵산, 특정적으로는 압타머 (aptamers)와 같이 음하전된 표적화제를 표면에 흡착시킬 수 있다.

표적화 α_νβ₃ 리간드에 더해, 나노입자는 그 표면에 결합된 조영 및/또는 치료에 유용한 "보조제 (ancillary agent)", 방사성 핵종, 자기공명영상 (MRI) 또는 X-선 조영용 조영제, 플루오로포어 및/또는 생물학적 활성 화합물을 함유할 수 있다. 나노입자 그 자신들이 초음파 조영을 위한 조영제 역할을 할 수 있다.

바람직한 에멀젼은 코어로서 고비점의 퍼플루오로카본과, 나노입자에 대해 한가지 이상의 소망성분의 복수개 카피를 결합하기 위한 비히클을 제공해주는 지질/계면활성제 혼합물인 외부 코팅을 함유하는 나노입자 시스템이다. 기본 입자의 제조 및 이들을 함유하는 에멀젼의 형성은, 외표면에 결합된 성분과 관계없이 상기 본 출원에 대한 특허인 미국특허 5,690,907 및 5,780,010호; 딸출원에 대한 특허인 미국특허 5,989,520 및 5,958,371호 (모두 본문에 참조됨)에 설명되어 있다.

고비점 플루오로화학 액체는 그 비점이 체온, 즉, 37℃보다 높은 것이다. 따라서, 비점이 적어도 30℃인 플루오로화학 액체가 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 37℃, 더욱 바람직하게는 50℃보다 높은 것, 가장 바람직하게는 약 90℃인 것이 좋다. 본 발명에 유용한 "플루오로화학 액체 (fluorochemical liquids)"로는 직쇄 및 분지쇄, 그리고 다른 관능기를 갖는 퍼플루오르화 화합물을 비롯한 시클릭 퍼플루오로카본을 들 수 있다. "퍼플루오르화 화합물"에는 순수한 퍼플루오로카본이 아니 라 다른 할로기가 존재할 수 있는 화합물이 포함된다. 이들에는 예컨대 퍼플루오로옥틸브로마이드, 및 퍼플루오로디클로로옥탄이 포함된다.

따라서 이렇게 정의된 퍼플루오르화 화합물이 바람직하다.

유용한 퍼플루오로카본 에멀젼은 본 발명에 참조된 미국특허 4,927,623호, 5,077,036호, 5, 114,703호, 5,171,755호, 5,304,325호, 5,350,571,호 5,393,524호, 및 5,403,575에 개시되어 있으며, 여기서 퍼플루오로카본 화합물은 퍼플루오로데칼린, 퍼플루오로옥탄, 퍼플루오로디클로로옥탄, 퍼플루오로-n-옥틸 브로마이드, 퍼플루오로헵탄, 퍼플루오로데칸, 퍼플루오로시클로헥산, 퍼플루오로모르폴린, 퍼플루오로트리프로필아민, 퍼플루오로트리부틸아민, 퍼플루오로디메틸시클로헥산, 퍼플루오로트리메틸시클로헥산, 퍼플루오로디시클로헥실 에테르, 퍼플루오로-n-부틸테트라히드로퓨란, 및 이들 화합물과 구조적으로 유사한 화합물들 및 부분적으로나 전적으로 할로겐화되건 (적어도 일부가 불소 치환기인) 또는 퍼플루오로알킬화 에테르를 비롯하여 부분적으로나 전적으로 플루오르화된 것, 폴리에테르 또는 크라운 에테르등이 이에 포함된다.

나노입자 상에 외부 코팅을 형성하는데 사용된 지질/계면활성제 (커플링된 리간드를 함유하거나 또는 소망되는 성분들을 표면에 결합시키기 위한 시약을 트래핑할 것임)에는 지질 컨쥬게이션된 폴리에틸렌 글리콜을 비롯하여, 천연 또는 합성 인지질, 지방산, 콜레스테롤, 라이소지질, 스핑고미엘린 등이 포함된다. 여러가지 시판되는 음이온계, 양이온계 및 비이온계 게면활성제, 예컨대 Tweens, Spans, Tritons, 등이 사용될 수 있다. 몇몇 게면활성제는 예컨대 퍼플루오르화 알카노인 산, 예컨대 퍼플루오로헥사노인산 및 퍼플루오로옥타노인산, 퍼플루오르화된 알킬 설폰아미드, 알킬렌 4급 암모늄염 등과 같이 그 자신 플루오르화될 수 있다. 또한, 퍼플루오르화된 알콜 포스페이트 에스테르를 사용할 수 있다. 외층에 포함된 양이온성 지질은 핵산, 특히 압타머와 같은 리간드를 트래핑하는데 유리할 수 있다. 전형적인 양이온성 지질로는 DOTMA, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드; DOTAP, 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판; DOTB, 1,2-디올레일-3-(4'-트리메틸암모니오)부타노일-sn-글리세롤, 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판; 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판; 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-에틸 포스포콜린; 및 3β-[N',N'-디메틸아미노에탄)-카바몰]콜레스테롤-HCl을 들 수 있다.

바람직한 구체예에서는, 지질 및/또는 계면활성제 코팅에, 조영이나 치료에 유용한 α_νβ₃리간드 및/또는 보조물질을 커플링하는데 사용가능한 반응성기를 갖는 성분이 포함된다. 후술되는 바와 같이, 지질/계면활성제 성분은 지질/계면활성제 성분에 함유된 관능기를 통해 이들 반응성 기들에 커플링될 수 있다. 예컨대, 후술되는 바와 같이 포스파티딜에탄올아민은 그의 아미노기를 통해 소망되는 모이어티에 직접 커플링되거나, 또는 카르복실, 아미노 또는 설프히드릴기를 제공할 수 있는 짧은 펩티드와 같은 링커에 커플링될 수 있다. 또는, 말레이미드와 같은 표준 링킹제를 사용할 수도 있다. 표적화 리간드와 보조 물질을 나노입자에 결합시키기 위해 여러가지 방법이 사용될 수 있다: 이들 전략에는 예컨대 폴리에틸렌글리콜이 나 펩티드와 같은 스페이서기를 사용하는 것이 포함된다.

지질/계면활성제 코팅된 나노입자들은 일반적으로 에멀젼을 형성하기 위해 수성 매질 현탁액 중에 외층을 형성하는 지질/계면활성제 혼합물과 코어를 형성하는 플루오로카본 액체 혼합물을 미세유동화 (microfluidizing)시킴으로써 일반적으로 만들어진다. 이 공정에서, 지질/계면활성제는 이미 이들이 나노입자상에 코팅될 때 부가적인 리간드에 커플링되거나 또는 후속적인 커플링을 위한 반응성기를 다순히 함유할 수도 있다. 또는, 지질/계면활성제층에 포함될 성분들을 보조물질의 용해특성에 힘입어 층 중에 단순히 용해시킬 수도 있다. 초음파처리 또는 기타 기술이 요구될 수 있다. 수성 매질 중에 액체/계면활성제의 현탁액을 얻기 위해 초음파처리나 기타 기술이 요구될 수도 있다. 일반적으로, 지질/계면활성제 외층 중 적어도 한가지 물질은 링커나 부가적인 소망 성분을 결합시키는데 유용한 관능기를 포함하거나, 그 성분은 에멀젼이 제조될 때 그 물질에 이미 커플링될 수 있다.

공유결합에 의해 표적화 리간드나 기타 유기 모이어티 (예컨대 상자성 금속의 경우 킬레이트화제)를 외층 성분에 커플링시킬 경우, 여러가지 유형의 결합이나 링킹제가 이용될 수 있다. 이러한 커플링 형성을 위한 전형적인 방법으로는 카보디아미드 사용에 의한 아미드 형성, 또는 말레이미드와 같은 불포화 성분 사용을 통한 설파이드 결합의 형성을 들 수 있다. 기타 커플링제로는 예컨대, 글루타르알데히드, 프로판디알 또는 부탄디알, 2-이미노티올란 염산염, 이관능기 N-히드록시석신이미드 에스테르, 예컨대 디석신이미딜 수버레이트, 디석신이미딜 타르트레이트, 비스[2-(석신이미도옥시카르보닐옥시)에틸]설폰, 헤테로이관능기 시약, 예컨대 N- (5-아지도-2-니트로벤조일옥시)석신이미드, 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 및 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트, 호모이관능기 시약, 예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰, 4,4'-디이소티오시아노-2,2'-디설폰산 스틸벤, p-페닐렌디이소티오시아네이트, 카르보닐비스(L-메티오닌 p-니트로페닐 에스테르), 4,4'-디니트로비스페닐아지드, 에리쓰리톨비스카보네이트 및 이관능기 이미도에스테르, 예컨대 디메틸 아디피미데이트 염산염, 디메틸 수베리미데이트, 디메틸 3,3'-디티로비스프로피온이미데이트 염산염 등을 들 수 있다. 아실화, 설폰화, 환원적 아민화 등에 의한 결합 역시 달성가능하다. 소망되는 리간드를 외층의 한가지 이상의 성분에 대해 공유적으로 커플링하는 여러가지 방법이 기술분야에 익히 알려져 있다. 리간드 자체는 그 비율이 적합하다면 계면활성제 층 중에 포함될 수도 있다. 예컨대, 리간드가 고도로 친지성 부분을 함유할 경우, 이것은 그 자체로 지질/계면활성제 코팅 중에 내장될 수 있다. 또한, 리간드가 코팅에 직접 흡착할 수 있을 경우, 이것 역시 그의 커플링에 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, 핵산은 그의 음전하로 인해 양이온성 계면활성제에 직접 흡착된다.

리간드는 나노입자에 직접 결합될 수 있다. 즉, 리간드는 나노입자 자체와 결합된다. 다른 한편, 바이오틴/아비딘을 경유해서 이루어지는 것과 같은 간접적인 결합 역시 α_νβ₃-특이적인 리간드에 대해 일반적으로 이용될 수 있다. 예컨대, 바이오틴/아비딘 매개성 표적화에 있어서, α_νβ₃리간드는 에멀젼에 커플링되는 것이 아니라, 표적화 조직에 바이오티닐화 형태로서 커플링된다.

코팅층 중의 트래핑을 통해 나노입자에 커플링될 수 있는 보조제로는 방사성 핵종을 들 수 있다. 방사성 핵종은 치료 또는 진단용일 수 있으며; 이러한 방사성 핵종을 이용하는 진단 조영은 잘 알려져 있고 방사성 핵종을 바람직하지 않은 조직에 표적화시킴으로써 치료적인 장점 역시 실현될 수 있다. 전형적인 진단용 방사성 핵종에는 ^99mTc, ⁹⁵Tc, ^lllIn, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, 및 ⁶⁸Ga가 포함되며, 치료용 방사성 핵종에는 ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁴⁹Pm, ⁹⁰Y, ²¹²Bi, ¹⁰³Pd, ¹⁰⁹Pd, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁰La, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹AU, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ⁶⁷Cu, ¹⁰⁵Rh, ^111Ag, 및 ¹⁹²Ir이 포함된다. 방사성 핵종은 예비형성된 에멀젼에 여러가지 방식으로 제공될 수 있다. 예컨대, ⁹⁹Tc-퍼테크네이트는 과량의 염화제1주석 (stannous chloride)과 혼합되어 예비형성된 나노입자의 에멀젼 내로 인코포레이션될 수 있다. 산화제1주석 (stannous oxinate)이 염화제1주석을 대체할 수 있다. 또한, 시판되는 키트, 예컨대 Nycomed Amersham 사가 Ceretek

로 시판하는 HM-PAO (엑사메타진) 키트를 사용할 수 있다. 본 발명의 나노입자에 다양한 라디오리간드를 부착시키는 수단이 기술분야에서 잘 이해되고 있다.

자기공명영상법에 사용되기 위한 상자성 금속을 함유하는 킬레이트화제 역시 보조제로서 이용가능하다. 일반적으로, 상자성 금속을 함유하는 킬레이트화제는 나노입자 상의 코팅의 리피드/계면활성제와 결합하여, 초음파처리된 초기 혼합물 내 로 인코포레이션된다. 킬레이트화제는 코팅층의 하나 이상의 성분과 직접 커플링될 수 있다. 적절한 킬레이트화제에는 EDTA, DPTA, DOTA 등을 비롯한 다양한 다좌 (multi-dentate) 화합물이 포함된다. 이 킬레이트화제들은 예컨대 포스파티딜 에탄올아민, 비스-올리에이트 등에 함유된 관능기에 직접적으로 또는 링킹기를 통해서 커플링될 수 있다.

본 발명의 MRI 조영제에 유용한 상자성 금속에는 희토류 금속, 전형적으로는 망간, 이테르븀, 가돌리늄, 유로퓸 등이 포함된다. 철이온도 사용가능하다.

다른 보조제로는 플루오로포어, 예컨대 플루오레신, 단실, 퀀텀 도트 등을 들 수 있다.

본 발명의 몇몇 구체예에서 나노입자의 표면에는 생물학적 활성제가 포함될 수 있다. 이들 생물학적 활성제는 단백질, 핵산, 약물 등과 같이 광범위할 수 있다. 따라서, 적절한 약물로는 항신생조직제, 호르몬, 진통제, 마취제, 신경근육차단제, 항미생물제 또는 구충제, 항바이러스제, 인터페론, 항당뇨병제, 항히스타민제, 진해제, 항응고제 등을 들 수 있다.

전술한 모든 경우에 있어서, 결합된 부분이 α_νβ₃에 대한 표적화 리간드이거나 보조제이면, 정의된 부분은 지질/계면활성제 층에 비공유적으로 결합될 수 있으며, 지질/계면활성제 층의 성분에 직접 커플링되거나, 또는 스페이서 모이어티를 통해 상기 성분들에 커플링될 수 있다.

표적화 리간드 (targeting ligands)

본 발명의 에멀젼은 항체나 그의 단편이 아닌 α_νβ₃ 인테그린에 특이적인 리간드인 표적화제를 사용한다. 한가지 구체예에서, 리간드는 본 명세서에 참조된 상술한 미국특허 6,130,231호; 6,153,628호; 6,322,770호; 및 PCT 공개 WO 01/97848에 설명된 것들과 같은 비-펩티드 유기 분자이다. 특히, 리간드는 미국특허 6,153,628호의 청구범위 제1항, 미국특허 6,322,770호의 청구범위 제1항에 제시된 것이거나, 또는 미국특허 6,130,231호의 화학식 1의 화합물인 것이다. 일반적으로 "비-펩티드" 모이어티라 함은 유전자를 코딩하건 또는 유전자를 코딩하지 않건, 단순한 아미노산의 폴리머인 화합물 이외의 것들을 말한다. 따라서, "비-펩티드 리간드"는 아미노산의 폴리머 이외의 코어 구조를 요구한다는 특징을 가지면서 폴리머 특성이 결여된, 일반적으로 "소형 분자 (small molecules)"로서 칭해지는 모이어티이다. 본 발명에서 유용한 비-펩티드 리간드는 펩티드에 커플링될 수 있고 또는 α_νβ₃ 모이어티에 대한 친화성에 책임이 있는 리간드의 일부에 커플링되는 펩티드를 포함할 수 있지만, 그의 결합 친화성에 책임이 있는 것은 이 리간드의 비-펩티드 대역이다.

본 발명의 방법과 조성물에서 특히 유용한 α_νβ₃-특이적인 리간드의 한가지 그룹은 다음 화학식 (I)의 화합물, 그의 입체이성질 형태, 또는 그의 입체이성질 형태의 혼합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 전구약물들이다:

식 중,

Hc는 구아니딜 또는 N을 함유하는 헤테로시클릭 고리;

L¹은 링커;

G는 N 또는 CR^B;

R^A는 H 이외의 비-간섭성 치환기;

각각의 R^B는 독립적으로 H 또는 비-간섭성 치환기이고;

M은 임의로 치환된 카르복실산, 설포닐산 또는 인산기 또는 그의 에스테르 또는 아미드를 포함하거나 4- 또는 5-원 고리이고;

고리 A와 고리 B는 비-간섭성 치환기에 의해 임의로 더 치환될 수도 있다.

적절한 경우, 상기 화합물은 염 형태일 수 있다.

화학식 (I)의 화합물들이 하나 이상의 키랄 중심을 함유할 경우, 본 발명은 입체이성질체나 에난티오머의 혼합물 뿐만 아니라 광학적으로 순수한 형태도 포함한다.

화학식 (I)의 화합물에서, M에 포함되는 카르복실산, 설포닐산 또는 인산기 또는 그의 에스테르나 아미드는 그 분자에 대해 여하한 방향으로든 위치할 수 있다 - 즉, 설폰아미드는 SO₂N-일수도 또는 -NSO₂-일수도 있다; 또한, 복수개의 카르복실산, 설포닐산 또는 인산기, 그의 에스테르나 아미드가 직렬로 (in tandem) 포함될 수도 있다. 이 잔기들은 추가로 치환가능하며, PEG를 함유하는 것과 펩티드 결합을 함유하는 것을 비롯, 여러가지 링킹기를 통해서 나노입자의 성분들에 커플링될 수 있다.

M의 바람직한 구체예는 -COR^B, -S0₃H, -P0₃H,-CONHNHS0₂CF ₃, -CONHS0₂R^B, -CONHS0₂NHR^B, -NHCOCF₃, -NHCONHS0₂R^B, -NHS0 ₂R^B, -OP0₃H₂, -OS0₃H, -P0₃H₂, -S0₂NHCOR^B, -S0₂NHC0₂R^B,

중에서 선택된다.

"비-간섭성 치환기 (non-interfering substituent)"라 함은 화학식 (I)의 화합물이 α_νβ₃에 결합하는 능력을 파괴하지 않는 치환기이다. 이 치환기는 결합의 강도를 변경할 수는 있지만, 결합은 고상 지지체가 α_νβ₃에 커플링된 고상 지지체에 결합된 표지를 검색하는 것과 같은 표준법을 이용해서 여전히 검색가능하여야만 한다. 화학식 (I)의 화합물의 기본적인 특징은 식에 제시되어 있으며, 그렇게 결합되는 화합물의 능력의 실질적인 변경 없이 여러가지 치환기들이 추가로 포함될 수 있음은 자명하다. 당업자라면 R^B의 특정 구체예에 있어서 α_νβ₃에 대한 결합 특성이, 테스트된 R^B 구체예의 인코포레이션을 보증하는데 충분히 만족스러운가를 쉽게 평가할 수 있을 것이다. 따라서, 임의로 선택된 어떤 구체예에서든지, 치환기가 간섭을 하는지, 간섭하지 않는지를 결정하는 것은 간단한 일이다.

이렇게 분자의 기본적인 특성을 세세하게 정의한다. "비간섭성 치환기"에 의해 점령된 위치는 기술분야에서 이해되는 바처럼 통상적인 무기 또는 유기 모이어티에 의해 치환가능하다. 이러한 치환기의 외부 한계를 테스트하는 것은 본 발명에서 적절치 못하다. 화합물의 기본적인 특성은 이미 본문에 그 특수성과 함께 제시되어 있다.

또한, 상기한 L¹은 링커이다. 이러한 링커의 특성은 그 분자의 부분들간에 그 링커가 부여하는 거리보다 덜 중요하다. 전형적인 링커로는 알킬렌, 즉, (CH₂)_n; 알케닐렌, 즉, 한 말단에 이중결합을 갖는 것을 포함해서 이중결합을 함유하는 알킬렌 모이어티를 들 수 있다. 다른 적절한 링커에는 예컨대 치환된 알킬렌 또는 알케닐렌, 카르보닐 모이어티가 포함된다.

"히드로카르빌 잔기"란 탄소와 수소만을 함유하는 잔기를 가리킨다. 이 잔기는 지방족, 방향족, 직쇄, 시클릭, 분지쇄, 포화 또는 불포화일 수 있다. 그러나, 그렇게 언급될 때도 히드로카르빌 잔기는 헤테로원자를 함유할 수 있으며, 치환잔기의 탄소와 수소 멤버 대신 다른 것들로 치환될 수 있다. 따라서, 이러한 헤테로원자를 함유하는 것으로서 특별히 언급될 경우, 히드로카르빌 잔기는 카르보닐기, 아미노기, 히드록실기등도 함유할 수 있으며 또는 그 히드로카르빌 잔기의 "골격 (backbone)"에 헤테로원자를 함유할 수 있다.

"알킬", "알케닐" 및 "알키닐"에는 직쇄 및 분지쇄 및 고리형 일가 치환기가 포함된다. 그 예로는 메틸, 에틸, 이소부틸, 시클로헥실, 시클로펜틸에틸, 2-프로페닐, 3-부티닐 등을 들 수 있다. 일반적으로, 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환기는 1-10C (알킬) 또는 2-10C (알케닐 또는 알키닐)를 포함한다. 바람직하게는 이들이 1-6C (알킬) 또는 2-6C (알케닐 또는 알키닐)를 포함하는 것이 좋다. 이러한 헤테로원자 함유 모이어티는 유사하게 정의되지만 그 골격 잔기 중에 1-2개의 O, S, P₁Si 또는 N 헤테로원자나 그의 배합을 함유할 수 있다.

"아실"은 알킬, 알케닐, 알키닐의 정의와 카르보닐기를 통해 부가적인 잔기에 커플링된 관련 헤테로형태의 정의를 포괄한다.

"방향족" 또는 "아실" 모이어티는 페닐이나 나프틸과 같은 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 모이어티를 가리킨다; "헤테로방향족" 역시 O, S 및 N 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 고리 시스템을 가리킨다. 헤테로원자의 포함은 6-원 고리뿐만 아니라 5-원 고리의 포함도 허용한다. 따라서, 전형적인 방향족 시스템에는 피리딜, 피리미딜, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤조티아졸릴, 벤조퓨라닐, 티에닐, 퓨릴, 피롤릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸리 등이 포함된다. 고리 시스템을 통털어 전자 분포의 관점에서 방향성이라는 특징을 갖는 것이면 어떤 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 고리 시스템이라도 이 정의에 포함된다. 일반적으로, 고리 시스템은 5-12개의 고리 멤버 원자를 함유한다.

"비-간섭성 치환기"란 일반적으로 할로, OH, SH, NH₂, NO₂ 또는 기타 무기 치환기이거나 또는 O, S, P, Si 및 N 중에서 선택된 0-6개의 헤테로원자를 함유하는 히드로카르빌 잔기 (1-20C)이다. 바람직하게는 헤테로원자가 O, S 및/또는 N인 것이 좋다. 예컨대, 히드로카르빌 잔기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬일 수 있고, 이 치환기들은 상기 헤테로원자들을 함유하거고/함유하거나 그 자신 1-6개의 치환기에 의해 치환될 수도 있다. 아릴 모이어티상 또는 적절한 헤테로원자상의 치환기들로는 알킬, 알케닐, 알키닐, 부가적인 아릴 또는 아릴알킬, 아릴알케닐 및 아릴알키닐을 들 수 있다. 적절한 헤테로원자를 비롯하여 비시클릭 탄소사슬 상에서 일어날 수 있는 치환기에는 이들 모이어티 및/또는 그의 헤테로원자-함유 형태의 치환형태 뿐만 아니라 할로, OR, NR₂, SR, SOR,S0₂R, OCOR, NRCOR, NRCONR₂, NRCOOR, OCONR₂, RCO, COOR,S0₃R,CONR₂,S0₂NR₂,NRSO ₂NR₂, CN, CF₃,R₃Si, 및 NO₂를 들 수 있으며 이때 상기 각각의 R은 독립적으로 알킬, 알케닐, 아릴등이거나 그의 헤테로형태이다. 2개의 치환기들이 고리를 형성하거나 =O를 형성할 수 있다.

인접한 위치 또는 동일한 C 또는 N 상의 2개의 R^B가 결합하여 3-8원의 융합 된, 임의 치환된 방향족 또는 비방향족 포화 또는 불포화 고리를 형성할 수 있거나 또는 두개의 R^B는 =O이거나 또는 옥심, 옥심 에테르, 옥심 에스테르 또는 그의 케탈일 수도 있다.

한 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물에서, Hc는 하나 또는 두개의 질소를 함유하는 임의 치환된 5 또는 6원고리이다. 바람직한 치환기는 아민이다.

L¹의 한가지 구체예는 하나 또는 2개의 비-인접 구성원이 N, S 또는 O, 바람직하게는 N인 헤테로원자일 수 있는 1-4원 원자의 알킬렌 사슬이다. G의 바람직한 구체예에는 N과 CH가 포함된다.

R^B의 바람직한 구체예는 H, 알킬 (1-10C), 알케닐 (2-10C), 아실 (1-10C), 아릴알킬 또는 아릴아실이 포함되고 여기서 알킬과 아실은 상기한 바와 같이 정의되며 아릴은 5-12원 고리로서 N, O 및 S 중에서 선택된 헤테로원자를 임의로 함유한다. R^B가 탄소상에 치환되면, R^B는 COOR (여기서 R은 H 또는 알킬 (1-10C)), 또는 CONR₂ (여기서 R은 앞서 정의한 바와 같음), OOCR 또는 NROCR (여기서 R은 앞서 정의한 바와 같음), 할로, CF₃ 등일 수 있다.

본 발명에 유용한 화학식 (I)의 구체예들인 α_νβ₃-특이적인 리간드의 한 그룹은 다음 화학식 (II)의 화합물, 그의 입체이성질체 형태, 그의 입체이성질 형태의 혼합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염 또는 전구약물 형태이다:

식 중, R^1e는 다음 중에서 선택된다:

Ae는 -CH₂- 또는 -N(R^lOe)- ;

Ale 및 Be는 독립적으로 -CH₂- 또는 -N(R^10e)-;

De는 -N(R^10e)- 또는 -S-;

E^e-F^e는 -C(R^2e)=C(R^3e)- 또는 -C(R^2e)₂C(R ^3e)₂-;

je는 -C(R^2e)- 또는 -N- ;

K^e, L^e 및 M^e는 독립적으로 -C(R^2e)- 또는 -C(R^3e)-;

R^2e 및 R^3e는 독립적으로 H,C_1-4 알콕시, NR^11eR^12e, 할로겐, NO, CN, CF₃, C_1-6 알킬, C_3-6알케닐, C_3-7 시클로알킬(C_1-4 알킬), 아릴 (C_1-6 알킬)-, (C_1-6 알킬)카르보닐, (C_1-6 알콕시) 카르보닐, 아릴카르보닐 및 0-4개의 R^7e로 치환된 아릴중에서 선택되고,

또는, R^2e와 R³가 인접 원자들 상의 치환기인 경우, 이들은 이들이 결합한 탄소원자와 함께 5-7원 카보시클릭 또는 5-7원 헤테로시클릭 방향족 또는 비방향족 고리 시스템을 형성하고, 상기 카보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리는 C_1-4 알킬, C_1-4 알콕시, 할로, 시아노, 아미노, CF₃ 및 NO₂ 중에서 선택된 0-2개의 기에 의해 치환되고;

R^2ae는 H, C_1-10 알킬, C_2-6 알케닐, C_3-11 시클로알킬, C _3-7 시클로알킬(C_1-4알킬), 아릴, 아릴(C_1-4알킬)-, (C_2-7알킬)카르보닐, 아릴카르보닐, (C_2-10 알콕시)카르보닐, C_3-7시클로알콕시칼보닐, C_7-11 비시클로알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 아릴 (C_1-10 알콕시)카르보닐, C_1-6 알킬카르보닐옥시(C_1-4 알콕시)카르보닐, 아릴카르보닐옥시 (C_1-4 알콕시)카르보닐 및 C_3-7 시클로알킬카르보닐옥시 (C_1-4 알콕시)카르보닐 중에서 선택되고;

R^7e는 H, 히드록시, C_1-4 알킬, C_1-4 알콕시, 아릴, 아릴 (C_1-4 알킬)-, (C_1-4 알킬)카르보닐, CO₂R^18ae, SO₂R^11e, SO₂NR^10eR^11e, OR^10e 및 N(R^11e)R^12e 중에서 선택되고;

여기서 U^e는 -(CH₂)n^e-, -(CH₂)n^eO(CH₂)m ^e-, -(CH₂)n^eN(R¹²)(CH₂)m^e-, -NH(CH₂)n^e-, -(CH₂)n^eC(=O)(CH₂)m^e-, -(CH₂)n^eS(O)p^e(CH²)m^e-, (CH₂)n^eNHNH(CH₂)m^e-, -N(R^10e)C(=O)-, -NHC(=O)(CH₂)n^e-, -C(=O)N(R^10e)-, 및 -N (R^10e)S(O)p^e- 중에서 선택되고;

이 때 G^e는is N 또는 CR^19e이며;

W^e는 -C(=O)-N(R^10e)-(C_1-3 알킬렌)-이고, 여기서 알킬렌기는 R^8e 및 R^9e에 의해 치환되며;

R^8e 및 R^9e는 독립적으로 H, C0₂R^l8be, C(=O)NR¹⁷R ^l8be, 0-1개의 R^6e로 치환된 C_1-10 알킬, 0-1개의 R^6e로 치환된 C_2-10 알케닐, 0-1개의 R^6e로 치환된 C_2-10 알키닐, 0-1개 의 R^6e로 치환된 C_3-8 시클로알킬, 0-1 R^6e로 치환된 C_5-6 시클로알케닐, (C_1-10 알킬)카르보닐, C_3-10 시클로알킬(C_1-4 알킬)-, 0-3개의 R^6e로 치환된 페닐, 0-3개의 R^6e로 치환된 나프틸,

1-3개의 N, O, 또는 S 헤테로원자를 함유하는 5-10원환 헤테로시클릭 고리, (여기서 상기 헤테로시클릭 고리는 포화, 부분 포화 또는 완전 불포화된 것일 수 있고, 상기 헤테로시클릭 고리는 0-2개의 R^7e로 치환된 것임),

0-2개의 R^7e로 치환된 C_1-10 알콕시, 히드록시, 니트로, -N(R^10e)R^11e, -N(R^16e)R^17e, 아릴(C_0-6 알킬)카르보닐, 아릴(C_3-6 알킬), 헤테로아릴 (C_1-6 알킬), CONR^18aeR^20e, SO₂R^18ae, 및 SO₂NR^18aeR ^20e중에서 선택되고,

단, 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴기는 1-2개의 R^7e에 의해 독립적으로 치환되거나 치환되지 안을 수 있으며;

R^6e는 H, C_1-10 알킬, 히드록시, C_1-10 알콕시, 니트로, C_1-10 알킬카르보닐, -N(R^11e)R^12e, 시아노, 할로, CF₃, CHO, CO₂R^18be, C(=O)R^l8be, CONR^17eR^l8be, OC (=O)R^l0e, OR^lOe, OC(=O)NR^10eR^11e, NR^10eC(=O)R^10e, NR^10eC(=O)OR^21e, NR^10eC(=O)NR^10eR^11e, NR^10eSO₂NR^10eR^11e, NR^10eSO₂R^21e, S(O)_pR^11e, SO₂NR^10eR^11e,

할로겐, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬, CF₃, S(O)_m ^eMe, 및 -NMe² 중에서 선택된 0-3개의 기로 치환된 아릴,

아릴 (C_1-4 알킬)- (상기 아릴은 C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬, CF₃, S(O)_p ^eMe, 및 -NMe² 중에서 선택된 0-3개의 기로 치환됨),

1-3개의 N, O 또는 S 헤테로원자를 함유하는 5-10원 헤테로시클릭 고리 (여기서 상기 헤테로시클릭 고리는 포화, 부분 포화, 또는 완전 불포화된 것일 수 있고, 상기 헤테로시클릭 고리는 0-2개의 R^7e로 치환됨) 중에서 선택되며;

R^10e는 H, CF₃, C_3-6 알케닐, C_3-11 시클로알킬, 아릴, (C_3-11 시클로알킬)메틸, 아릴(C_1-4 알킬), 및 0-2개의 R^6e로 치환된 C_1-10 알킬 중에서 선택되고;

R^11e는 H, 히드록시, C_1-8 알킬, C_3-6 알케닐, C_3-11 시클로알킬, (C_3-11 시클로알킬)메틸, C_1-65 알콕시, 벤질옥시, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아릴 (C_1-4 알킬)-, 아릴 (C_1-4알킬), 아다만틸메틸 및 0-2개의 R^4e 로 치환된 C_1-10 알킬 중에서 선택되며;

R^4e는 H, C_1-6 알킬, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬 (C _1-4 알킬)-, (C_1-10 알 킬)카르보닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴 (C_1-6 알킬)- 및 헤테로아릴 (C_1-6 알킬) 중에서 선택되고, 여기서 상기 아릴 또는 헤테로아릴은 C_1-4 알킬, C_1-4 알콕시, F, Cl, Br, CF₃ 및 NO₂ 중에서 독립적으로 선택된 0-2개의 치환기에 의해 치환된 것이며,

또는, R^10e 와 R^11e 두가지 모두가 동일한 질소원자 (-NR ^10eR^11e에서 처럼) 상의 치환기인 경우, 이들은 이들이 결합된 질소원자와 함께 3-아자비시클로노닐, 1,2,3,4-테트라히드로-1-퀴놀리닐, 1,2,3,4-테트라히드로-2-이소퀴놀리닐, 1-피페리디닐, 1-모르폴리닐, 1-피롤리디닐, 티아모르폴리닐, 티아졸리디닐 및 1-피페라지닐 중에서 선택된 헤테로사이클을 형성하며;

상기 헤테로사이클은 C_1-6 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C_1-4 알킬)-, (C_1-6 알킬)카르보닐, (C_3-7 시클로알킬)카르보닐, (C_1-6 알콕시)카르보닐, 아릴(C_1-4 알콕시)카르보닐, C_1-6 알킬설포닐 및 아릴설포닐 중에서 선택된 0-3개의 기로 치환되며;

R^12e는 H,C_1-6 알킬, 트리페닐메틸, 메톡시메틸, 메톡시페닐디페닐메틸, 트리메틸실릴에톡시메틸, (C_1-6 알킬)카르보닐, (C_1-6 알콕시)카르보닐, (C_1-6 알킬)아미노카르보닐, C_3-6 알케닐, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬(C_1-4 알킬)-, 아릴, 헤테로아릴(C_1-6 알킬)카르보닐, 헤테로아릴카르보닐, 아릴(C_1-6 알킬)-, (C_1-6 알킬)카르보 닐, 아릴카르보닐, C_1-6 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아릴 (C_1-6알킬)설포닐, 헤테로아릴설포닐, 헤테로아릴(C_1-6알킬)설포닐, 아릴옥시카르보닐, 및 아릴 (C_1-6알콕시)카르보닐 중에서 선택되고, 이 때 상기 아릴기는 C_1-4알킬, C_1-4알콕시, 할로, CF₃ 및 니트로 중에서 선택된 0-2개의 치환기로 치환된 것임;

R^16e는 -C(=O)OR^18ae, -C(=O)R^18be, -C(=O)N(R^18be)₂, -C(=O)NHSO₂R^18ae, -C(=O)NHC(=O)R^18be, -C(=O)NHC(=O)OR^18ae, -C(=O)NHSO₂NHR^18be, -SO₂R^18ae, -SO²N(R^18be)₂, 및 -SO₂NHC(=O)OR^18be 중에서 선택되고;

R^17e는 H, C_1-6 알킬, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬(C _1-4 알킬)-, 아릴, 아릴(C_1-6 알킬)-, 및 헤테로아릴 (C_1-6 알킬) 중에서 선택되고;

R^18ae는 L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 C_1-8 알킬, L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 C_3-11 시클로알킬, L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 아릴(C_1-6 알킬)-, L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 헤테로아릴 (C_1-6 알킬)-, L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 (C_1-6 알킬) 헤테로아릴, L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 비아릴 (C_1-6 알킬), L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 헤테로아릴, 3-4개의 R^19e로 치환되고 L_n에 대한 결 합으로 임의 치환된 페닐, 0-4개의 R^19e로 치환되고 L_n에 대한 결합으로 임의 치환된 나프틸, 및 L_n에 대한 결합 중에서 선택되고, 이 때 상기 아릴 또는 헤테로아릴기는 임의로 0-4개의 R^19e로 치환되며;

R^18be는 H 또는 R^18ae이고;

여기서 R^19e는 H, 할로겐, CF₃, CO₂H, CN, NO₂, -NR^11eR^12e, OCF₃, C_1-8 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-11 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬(C_1-4 알킬)-, 아릴(C_1-6 알킬)-, C_1-6 알콕시, C_1-4 알콕시카르보닐, 아릴, 아릴-O-, 아릴-SO₂-, 헤테로아릴 및 헤테로아릴-SO₂- 중에서 선택되고 여기서 상기 아릴과 헤테로아릴기는 수소, 할로겐, CF₃, C_1-3 알킬, 및 C_1-3 알콕시 중에서 선택된 0-4개의 기로 치환된 것임;

R^20e는 히드록시, C_1-10 알킬옥시, C_3-11 시클로알킬옥시, 아릴옥시, 아릴(C _1-4 알킬)옥시, C_2-10 알킬카르보닐옥시(C_1-2 알킬)옥시-, C_2-10 알콕시카르보닐옥시(C _1-2 알킬)옥시-, C_2-10 알콕시카르보닐(C_1-2 알킬)옥시-, C_3-10 시클로알킬카르보닐옥시(C _1-2 알킬)옥시-, C_3-10 시클로알콕시카르보닐옥시(C_1-2 알킬)옥시-, C_3-10 시클로알콕시르보닐(C_1-2 알킬)옥시-, 아릴옥시카르보닐(C_1-2 알킬)옥시-, 아릴옥시카르보닐옥시(C _1-2 알킬)옥시-, 아릴카르보닐옥시(C_1-2 알킬)옥시-, C_1-5 알콕시(C_1-5 알킬)카르보닐옥시(C_1-2 알킬)옥시, (5-(C_1-5 알킬)-1,3-디옥사-시클로펜텐-2-온-일)메틸옥시, (5-아릴-1,3-디옥사-시클로펜텐-2-온-일)메틸옥시 및 (R^10e)(R^11e)N-(C_1-10 알콕시)- 중에서 선택되며;

R^21e는 C_1-8 알킬, C_2-6 알케닐, C_3-11 시클로알킬, (C_3-11 시클로알킬)메틸, 아릴, 아릴(C_1-4 알킬)- 및 0-2개의 R^7e로 치환된 C_1-10 알킬 중에서 선택되고;

R^22e는 -C(=O)-R^18be, -C(=O)N(R^18be)₂, -C(=O)NHSO₂R^18ae, -C(=O)NHC(=O)R^18be, -C(=O)NHC(=O)OR^18ae, 및 -C(=O)NHSO₂NHR^18be중에서 선택되며;

여기서 Y^e는 -COR^20e, -SO₃H, -PO₃H, -CONHNHSO₂CF ₃, -CONHSO₂R^18ae, -CONHSO₂NHR^18be, -NHCOCF₃, -NHCONHS0₂R^l8ae, -NHS0 ₂R^18ae, -OP0₃H₂, -OS0₃H, -P0₃H₂, -SO₂NHCOR^18ae, -SO₂NHCO₂R^18ae,

중에서 선택된다.

상기 제시된 리간드는 입자의 지질/계면활성제 코팅 중에 함유된 물질에 링커를 통해 커플링될 수 있다. 한가지 구체예에서 링커는 다음 식을 갖는 것이다:

((W)_h-(CR⁶R⁷)_g)_x-(Z)_k-((CR^6aR^7a)_g'-(W)_h')_x';

식 중 W는 각각 O, S, NH, NHC(=O), C(=O)NH, NR⁸C(=O), C(=O)NR⁸, C(=O), C(=O)O, OC(=O), NHC(=S)NH, NHC(=O)NH, SO₂, S0₂NH, (OCH₂CH₂) _20-200, (CH₂CH₂0)_20-200, (OCH₂CH₂CH₂)_20-200, (CH₂CH₂CH₂0)_20-200, 및 (aa)_t' 중에서 독립적으로 선택되며;

aa는 아미노산을 나타내고;

Z는 0-3개의 R¹⁰으로 치환된 아릴, 0-3개의 R¹⁰으로 치환된 C_3-10 시클로알킬, N, S 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 포함하고 0-3개의 R¹⁰으로 치환된 5-10원 헤테로고리 시스템 중에서 선택되며;

R⁶, R^6a, R⁷, R^7a 및 R⁸은 H, =O, COOH, SO₃H, PO₃H, 0-3개의 R¹⁰ 으로 치환된 C_1-5 알킬, 0-3개의 R¹⁰ 으로 치환된아릴, 0-3개의 R¹⁰ 으로 치환된 벤질, 0-3개의 R¹⁰ 으로 치환된 C_1-5 알콕시, NHC(=O)R¹¹, C(=O)NHR¹¹, NHC(=O)NHR ¹¹, NHR¹¹, R¹¹ 및 부가성분에 대한 결합 중에서 각각 독립적으로 선택되고,

R¹⁰은 S_f, COOR¹¹, C(=O)NHR¹¹, NHC(=O)R¹¹, OH, NHR¹¹, S0₃H, P0₃H, -OP0₃H₂, -OS0₃H, 0-3개의 R¹¹로 치환된 아릴, 0-1개의 R¹²로 치환된 C_1-5 알킬, 0-1개의 R¹²로 치환된 C_1-5 알콕시, 및 N, S, 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 함유하고 0-3개의 R¹¹로 치환된 5-10원 헤테로시클릭 고리 시스템 중에서 선택되며;

R¹¹은 H, 0-1개의 R¹²로 치환된 알킬, 0-1개의 R¹²로 치환된 아릴, N, S, 및 O 중에서 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 함유하고 0-3개의 R¹²로 치환된 5-10원 헤테로시클릭 고리 시스템, 0-1개의 R¹²로 치환된 C_3-10 시클로알킬, 0-1개의 R¹²로 치환된 폴리알킬렌 글리콜, 0-1개의 R¹²로 치환된 탄수화물, 0-1개의 R¹²로 치환된 시클로덱스트린, 0-1개의 R¹²로 치환된 아미노산, 0-1개의 R¹²로 치환된 폴리카르복시알킬, 0-1개의 R¹²로 치환된 폴리아자알킬, 0-1개의 R¹²로 치환된 펩티드 중에서 각각 독립적으로 선택되고, 여기서 펩티드는 2-10 아미노산, 3,6-O-디설포-B-D-갈락토피라노실, 비스(포스포노메틸)글리신 및 부가적인 성분에 대한 결합을 포함하는 것임;

R¹²는 부가적인 성분에 대한 결합이고;

k는 0, 1 및 2 중에서 선택되고;

h는 0, 1 및 2 중에서 선택되고;

h'는 0, 1 및 2 중에서 선택되고;

g는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중에서 선택되고;

g'는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중에서 선택되고;

t'는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중에서 선택되고;

x는 0, 1, 2, 3, 4, 및 5 중에서 선택되고;

x'는 0, 1, 2, 3, 4, 및 5 중에서 선택됨.

몇몇 구체예에서, 나노 입자상에 함유된 부가적인 치환체는 X-선 또는 자기공명영상을 위한 금속 또는 방사성 핵종에 대한 킬레이터를 포함한다. 이러한 킬레이터는 다음 화학식을 갖는 것들과 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함한다:

A¹, A², A³, A⁴, A⁵, A⁶, A⁷, 및 A⁸은 독립적으로 NR¹³, NR¹³R¹⁴, S, SH, S(Pg),O, OH, PR¹³, PR¹³R¹⁴, P(O)R¹⁵R¹⁶ 및 착물 잔기(remainder)와의 결합 중에서 선택된다.

E는 결합, CH, 또는 O-3 R¹⁷로 치환된 C₁-C₁₀알킬렌, O-3 R¹⁷로 치환된 아릴 렌, O-3 R¹⁷로 치환된 C_3-10 시클로알킬렌, O-3 R¹⁷로 치환된 헤테로시클로-C _1-10 알킬렌기로부터 각각 생성된 것에서 선택된 스페이서 그룹이며, 여기서 헤테로시클로 그룹은 N, S 및 O에서 각각 선택된 1-4 헤테로 원자를 함유하는 5-10 원 헤테로시클릭 고리계, O-3 R¹⁷로 치환된 C_6-10 아릴-C_1-10 알킬, O-3 R¹⁷로 치환된 C_1-10 알킬-C_6-10 아릴- 및 0-3 R¹⁷로 치환되고, N, S 및 O 중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10 원 헤테로시클릭 고리계이다.

R¹³ 및 R¹⁴는 각각 독립적으로 다음의 그룹중에서 선택된다. 즉, Ln·과의 결합, 수소, 0-3 R¹⁷로 치환된 C₁-C₁₀ 알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 아릴, 0-3 R¹⁷로 치환된 C_1-10 시클로알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 헤테로시클로-C_1-10 알킬-여기서 헤테로시클로그룹은 N,S 및 O 중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10 원 헤테로시클릭 고리계, 0-3 R¹⁷로 치환된 C_6-10 아릴-C_1-10 알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 C_1-10 알킬 C_6-10 아릴, 0-3 R¹⁷로 치환되고, N,S 및 O 중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10 원 헤테로시클릭 고리계임-, 및 전자, 단, R¹³ 또는 R¹⁴ 중 하나가 전자라면, 나머지 다른것도 전자임;

선택적으로, R¹³ 및 R¹⁴는 =C(R²⁰)(R²¹)과 결합한다;

R¹⁵ 및 R¹⁶은 각각 독립적으로 다음의 그룹중에서 선택된다. 즉, Ln·과의 결합, -OH, 0-3 R¹⁷로 치환된 C₁-C₁₀ 알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 C₁-C₁₀ 알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 아릴, 0-3 R¹⁷로 치환된 C_3-10 시클로알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 헤테로시클로-C _1-10 알킬-여기서 헤테로시클로그룹은 N,S 및 O 중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10 원 헤테로시클릭 고리계, 0-3 R¹⁷로 치환된 C_6-10 아릴-C_1-10 알킬, 0-3 R¹⁷로 치환된 C_1-10 알킬 C_6-10 아릴, 및 0-3 R¹⁷로 치환되고, N,S 및 O중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10원 헤테로시클릭 고리계임;

R¹⁷은 독립적으로 다음의 그룹으로부터 각각 생성된 것에서 선택된다: Ln·과의 결합, =0, F, Cl, Br, I, -CF₃, -CN, -CO₂R¹⁸, -C(=O)R¹⁸, -C(=O)N(R¹⁸)₂, -CHO, -CH₂OR¹⁸, -OC(=O)R¹⁸, -OC(=O)OR^18a, -OR¹⁸, -OC(=O)N(R ¹⁸)₂,-NR¹⁹C(=O)R¹⁸, -NR¹⁹C(=O)OR^18a, -NR¹⁹C(=O)N(R¹⁸)₂, -NR¹⁹SO₂N(R¹⁸)₂, -NR¹⁹SO₂R^18a, -SO ₃H, -SO₂R^18a, -SR¹⁸, -S(=O)R^18a, -SO₂N(R¹⁸)₂, -N(R¹⁸)₂, -NHC(=S)NHR¹⁸, =NOR¹⁸, NO₂, -C(=O)NHOR¹⁸, -C(=O)NHNR¹⁸R^18a,-OCH₂CO₂H, 2-(1-모르폴리노)에톡시, C₁-C₅ 알킬, C₂-C₄ 알케닐, C₃-C₆ 시클로알킬, C₃-C₆ 시클로알킬메틸, C₂-C₆ 알콕시알킬, O-2 R¹⁸로 치환된 아릴, 및 N,S 및 O중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10원 헤테로시클릭 고리계;

R¹⁸, R^18a 및 R¹⁹는 독립적으로 다음의 그룹으로부터 각각 생성된 것에서 선택된다: Ln·과의 결합, H, C₁-C₆ 알킬, 페닐, 벤질, C_1-6 알콕시, 할라이드, 니트로, 시아노 및 트리플루오로메틸;

Pg는 티올 보호기이고;

R²⁰ 및 R²¹은 독립적으로 다음의 그룹에서 선택된다. 즉, H, C₁-C₁₀ 알킬, -CN, -CO₂R²⁵, -C(=O)R²⁵, -C(=O)N(R²⁵)₂, 0-3 R ²³으로 치환된 C₂-C₁₀ 1-알켄, 0-3 R²³으로 치환된 C₂-C₁₀ 1-알킨, 0-3 R²³으로 치환된 아릴, 0-3 R ²³으로 치환되고, N,S 및 O중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 불포화 5-10원 헤테로시클릭 고리계 및 0-3 R²³으로 치환된 불포화 C_3-10 카르보시클;

선택적으로, 다음의 형태를 갖는 이가 탄소 라디칼과 함께 존재하는 R²⁰ 및 R²¹:

R²² 및 R²³은 독립적으로 다음의 그룹에서 선택된다. 즉, H, R²⁴, 0-3 R ²⁴로 치환된 C₁-C₁₀ 알킬, 0-3 R²⁴로 치환된 C₂-C₁₀ 알케닐, 0-3 R²⁴로 치환된 C₂-C₁₀ 알키닐, 0-3 R²⁴로 치환된 아릴, 0-3 R²⁴로 치환되고, N, S, 및 O 중에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 5-10원 헤테로시클릭 고리계, 및 0-3 R²⁴로 치환된 C_3-10 카르보시클;

선택적으로, N,S, 및 O에서 각각 선택된 1-4 헤테로원자를 함유하는 융합 방향족(fused aromatic) 또는 5-10원 헤테로시클릭 고리계를 함께 형성하여 존재하는 R²², R²³;

a 및 b는 임의로 이중결합의 위치를 나타내고, n은 0 또는 1이며;

R²⁴는 독립적으로 다음의 그룹에서 각각 생성되는 것에서 선택된다: =O, F, Cl, Br, I, -CF₃, -CN, -CO₂R²⁵, -C(=O)R²⁵, -C(=O)N(R²⁵)₂, -N(R²⁵)₃+, -CH₂OR²⁵, -OC(=O)R²⁵, -OC(=O)OR^25a, -OR²⁵, -OC(=O)N(R²⁵)₂, -NR²⁶C(=O)R²⁵, -NR²⁶C(=O)OR^25a, -NR²⁶C(=O)N(R²⁵)₂, -NR²⁶SO₂N(R²⁵) ₂, -NR²⁶SO₂R^25a, -SO₃H, -SO₂R^25a, -SR²⁵, -S(=O)R^25a, -SO₂N(R²⁵)₂, -N(R²⁵)₂, =NOR²⁵, -C(=O)NHOR ²⁵, OCH₂CO₂H 및 2-(1-모르폴리노)에톡시; 및

R²⁵, R^25a 및 R²⁶은 각각 독립적으로 수소 및 C₁-C₆ 알킬 그룹으로부터 생성된 것에서 선택된다.

본 발명의 구체예에 있어서, α_vβ₃ 표적화 모이어티는 다음과 같을 수 있다:

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(3,5-디메틸이소옥사졸-4-일설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴 놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(페닐설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸설포닐)아미노프로피온산,

3-[7-[(아미노티아졸-4-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-I-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(3,5-디메틸이소옥사졸-4-일설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일 카보닐아미노]-2-((2,4,6-비페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(1-나프틸설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(벤즈이미다졸-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(4-메틸이미다졸-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(4,5-디메틸이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(4,5,6,7-테트라하이드로벤즈이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(피리딘-2-일아미노)메틸]-l-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-(2-아미노피리딘-6-일)-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(7-아자벤즈이미다졸-2-일)메틸]-1-메틸-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(벤즈이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]프로피온산,

3-[7-[(피리딘-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-I-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(페닐설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(페닐설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(n-부틸설포닐)아미노프로피온산,

3-[7-[(2-아미노티아졸-4-일)메틸]-I-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(페닐설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(2-아미노티아졸-4-일)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸린-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(테트라하이드로피리미드-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(벤질옥시카보닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-(페닐설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,6,디클로로페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4- 온-3-일카보닐아미노]-2-((4-비페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(벤즈이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(4-메틸이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(4,5-디메틸이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(4,5,6,7-테트라하이드로이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-[(피리딘-2-일아미노)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

3-[7-(2-아미노피리딘-6-일)-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산, 또는

3-[7-[(7-아자벤즈이미다졸-2-일)메틸]-1-(2-페닐에틸)-6,8-디플루오로퀴놀린-4-온-3-일카보닐아미노]-2-((2,4,6-트리메틸페닐)설포닐아미노)프로피온산,

제조 방법

본 발명의 에멀젼을 제조하는 통상적인 방법에 있어서, 불소화학액 (fluorochemical liquid)과 지질/계면활성제 코팅 성분을 수성 매질에서 유동화시 켜서 에멀젼을 형성한다. 표면층의 작용 성분은 원래의 에멀젼에 포함되거나, 또는 나노 입자 에멀젼 형성에 이어서 나중에 표면층과 공유적으로 커플링될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 예컨대, 핵산 표적화제 또는 약물이 포함되는 경우, 코팅은 입자 형성 후 표면으로 흡수되는 핵산과 양이온성 계면활성제를 사용할 수 있다.

적절하게 제조된 경우, 보조제(ancillary agent)를 포함하는 나노 입자는 외부 표면에 다수의 이러한 작용제(functional agent)를 포함하며, 나노 입자는 통성적으로 수 백 또는 수 천 개의 분자의 생물학적 활성제, 표적화 리간드, 방사성 핵종(radionuclide) 및/또는 MRI 조영제를 포함한다. MRI 조영제에 있어서, 나노 입자와 커플링되는 성분의 카피 수는 입자당 5,000 카피를 초과하는 것이 통상적이며, 입자당 10,000 카피인 것이 바람직하고, 입자당 30,000 카피인 것이 보다 바람직하며, 입자당 50,000 내지 100,000 카피 이상인 것이 더욱 바람직하다. 입자당 표적화제의 수는 통상적으로 약 수 백 개보다 작은 반면, 플루오로포어(fluorophores), 방사성 핵종 및 생무학적 활성제 또한 다양하다.

나노 입자는 보조제를 포함할 필요가 없다. 일반적으로, α_vβ₃ 특이적 리간드와 직접 커플링된 표적화된 입자는 초음파 조영제로서 유용하다. 또한, 상기 입자는 플루오로카본 코어를 갖기 때문에, 입자들의 상기한 추가적 기능에 부수하여 입자의 위치를 추적하기 위하여 ¹⁹F 자기 공명 영상법 (magnetic resonance imaging)을 사용할 수 있다. 그러나, 다른 성분을 다수의 카피로 포함하기 때문에 다른 측면에서 유용하다. 예컨대, 상자성 이온을 함유하는 킬레이트제를 포함함으 로써, 에멀젼을 자기 공명 영상 조영제로서 사용 가능하게 한다. 생물학적 활성 물질을 포함함으로써, 에멀젼을 약물 전달 시스템으로서 사용 가능하게 한다. The inclusion of 방사성 핵종을 포함함으로써, 에멀젼을 방사선 치료를 위한 치료제 또는 조영(imaging)을 위한 진단제로서 사용 가능하게 한다. 다른 조영제는 플루오레세인(fluorescein) 또는 단실과 같은 플루오로포어를 포함한다. 생물학적 활성제를 포함할 수 있다. 이러한 다양한 활성을 포함할 수 있다; 따라서, 활성 물질이 표적화된 조직에 전달됨과 동시에 표적화된 조직의 영상을 얻을 수 있다.

상기 에멀젼은 코팅에 포함되는 성분의 특성에 따른 범위 내의 방법으로 제조할 수 있다. 단지 예시를 위한 목적으로 사용되는 통상적인 방법에 다음의 공정이 설명되어 있다: 퍼플루오로옥틸브로마이드 (40% w/v, PFOB, 3M), 및 계면활성제 공혼합물 (2.0%, w/v)과 글리세린 (1.7%, w/v)을 제조하고, 이 때, 상기 계면활성제 공혼합물은 클로로포름에 용해된 디팔미토일-L-알파-포스파티딜-에탄올아민 (Pierce Inc.) 1 몰%, 콜레스테롤 (Sigma Chemical Co. ) 35 몰% 및 레시틴 (Pharmacia Inc) 64 몰%를 포함한다. 약물을 메탄올 (~25㎍/20㎕)에 현탁시키고, 2% 계면활성제층의 0.01 몰%와 5.0 몰% 사이, 바람직하게는 0.2 몰%와 2.0 몰% 사이의 적정된 양으로 첨가한다. 상기 클로로포름-지질 혼합물을 감압하에서 증발시키고, 50 ℃ 진공 오븐에서 하룻밤동안 건조시키고, 소니케이션에 의하여 물에 분산시켰다. 상기 현탁액을 증류수 또는 탈이온수에 용해된 퍼플루오로옥틸브로마이드이 들어있는 블랜더 컵(Dynamics Corporation, America)에 옮기고, 30 내지 60 초 동안 에멀젼화하였다. 에멀젼화된 혼합물을 Microfluidics 에멀젼화 장치 (Microfluidics Co.)로 옮기고, 20,000 PSI에서 3 분동안 계속적으로 처리하였다. 얻어진 에멀젼을 유리병에 넣고, 질소로 덮고, 사용시까지 스토퍼 크림프 실(stopper crimp seal)로 봉인하였다. 계면활성제 공혼합물에서 약물을 제거하고 다른 공정은 동일하게 하여 대조 에멀젼을 제조할 수 있다. 레이져 광 산란 서브마이크론 입자 크기 분석기 (Malvem Zetasizer 4, Malvern Instruments Ltd., Southborough, MA))를 이용하여 37 ℃에서 입자 크기를 세 번 측정하였으며, 그 결과, 400 nm 이하의 평균 지름을 갖는 촘촘하고 고도로 재현 가능한 크기 분포를 보였다. 포함되지 않는 약물을 투석 또는 한외여과 (ultrafiltration) 기술에 의하여 제거할 수 있다. 표적화 리간드를 제공하기 위하여, α_vβ₃ 리간드를 상기한 방법에 의하여 이작용성 링커를 통하여 포스파티딜 에탄올아민에 공유적으로 커플링시킨다.

키트

본 발명의 에멀젼을 제조하여 본 발명의 방법에 직접 사용하거나, 또는 상기 에멀젼의 성분들을 키트 형태로 공급할 수 있다. 상기 키트는 원하는 보조 물질을 완충액에 용해시켜서 또는 동결 건조된 형태로 포함하는 미리 제조된 표적화된 조성물을 포함할 수 있다. 또는, 상기 키트는 α_vβ₃ 리간드가 없는 에멀젼 형태를 포함할 수 있으며, 이 때, α_vβ₃ 리간드는 별도로 제공된다. 이러한 경우, 통상적으로, 상기 에멀젼은, 어멀젼이 표적화제와 혼합되는 경우 표적화제를 에멀젼 자체에 결합시키는, 말레이미드기와 같은 반응성 작용기를 포함할 것이다. 별도의 반응 용 기가 커플링 시키는데 사용되는 추가적 시약을 제공할 수 있다. 또는, 상기 에멀젼은 별도로 공급되고 그 자신이 반응성 작용기를 포함하는 원하는 성분에 커플링된 링커에 결합하는 반응성 작용기를 포함하여 할 수 있다. 적절한 키트를 구축하는 다양하고 폭넓은 접근을 계획할 수 있다. 따라서, 최종적인 에멀젼을 구성하는 각각의 성분을 별도의 반응 용기에 공급하거나, 또는 상기 키트는 단순히 키트 자체와 별도로 제공되는 다른 물질과의 배합을 위한 시약을 포함할 수 있다.

배합물의 비소모적 목록은 다음을 포함한다: 자신의 지질-계면활성제 층에 플루오로포어 또는 킬레이트제와 같은 보조 성분을 함유하는 에멀젼 제제 및 α_vβ₃ 표적화제와 커플링하기 위한 반응성 모이어티; 상기 에멀젼이 표적화제와 커플링되고 보조 물질과의 커플링을 위한 반응성 작용기를 포함하는 것인 반대의 경우; 표적화제와 킬레이트제를 모두 포함하는 에멀젼으로, 이 때, 킬레이트화되는 금속이 키트 내에 공급되거나 사용자에 의하여 독립적으로 제공되는 것인 에멀젼; 계면활성제/지질층을 포함하는 나노 입자 제제로서, 지질층 내의 물질이 상이한 반응성 작용기, 즉 α_vβ₃리간드에 대한 반응성 작용기의 한 세트와 보조제에 대한 반응성 작용기의 다른 세트를 포함하는 것인 나노 입자 제제; 상기한 배합물 중 어느 것이라도 포함하는 에멀젼 제제로서, 상기 반응성 작용기가 결합제(lingking agent)에 의하여 제공되는 것인 에멀젼 제제.

적용

상기 에멀전 및 이들의 제조를 위한 키트는 고발현 수준의 α_vβ₃ 인테그린 처리를 포함하는 조직 (이러한 발현 수준이 바람직하지 않은 조직)을 조영하는 것을 포함하는 본 발명의 방법에 사용 가능하다. 고 발현 수준의 α_vβ₃는 활성화된 내피 세포에 전형적이며, 신생 혈관구조(neovasculature)에 대한 진단제로서 고려된다.

진단 방사성 약제를, 일반적으로 살린 용액에 용해시켜서, 체중 70 kg 당 1 내지 100 mCi, 또는 바람직하게는 5 내지 50 mCi의 투여량으로, 정맥내 주입을 통하여 투여한다. 영상화는 알려진 방법을 사용하여 수행한다.

치료 방사성 약제는, 일반적으로 살린 용액에 용해시켜서, 체중 1 kg 당 0.001 내지 5 mCi, 또는 바람직하게는 체중 1 kg 당 0.1 내지 4 mCi의 투여량으로, 정맥내 주입을 통하여 투여한다. 비교 치료 방사성 약제에 있어서, 현 임상 실험은 투여량 범위를 Zevalin^TM에 대하여 0.3 내지 0.4 mCi/kg, 소마토스타틴 펩타이드로 표지된, OctreoTher^TM에 대하여는 1 내지 2 mCi/kg까지로 정한다. 이러한 치료 방사성 약제에 있어서, 종양 세포 사멸 대 정상 기관 독성, 특히 방사선 신염, 사이에 균형이 있다. 이러한 수준에서, 상기 균형은 일반적으로 종양 세포 효과에 유리하다. 이들 투여량은 해당 조영 동위 원소보다 높다.

본 발명의 자기 공명 영상 조영제는 미국특허 제5,155,215호; 미국특허 제5,087,440호; Margerstadt, 등, Magn. Reson. Med. (1986) 3:808; Runge, 등, Radiology (1988) 166:835; 및 Bousquet, 등, Radiology (1988) 166:693에 기재된 다른 MRI 조영제와 유사한 방법으로 사용 가능하다. 사용 가능한 다른 조영제로서 미국특허 공보 제2002/0127182호에 기재된 pH 민감성이고 펄스에 따라서 조영 특성을 변화시킬 수 있는 것이 있다. 일반적으로, 멸균 조영제 수용액을 환자에 체중 1 kg 당 0.01 내지 1.0 mmole 범위의 투여량을 정맥내 투여한다.

특히 바람직한 MRI 킬레이트제 세트는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA) 및 이의 유도체, 특히, 포스파티딜 에탄올아민 또는 이의 펩타이드 유도형의 아미노기와 커플링할 수 있는 이소티오시아네이트 작용기를 포함하는 메톡시벤질 유도체 (DOTA-NCS)를 포함한다. 이 유형의 유도체가 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국특허 제5,573,752호에 개시되어 있다. 다른 적절한 킬레이트제가 미국특허 제6,056,939호에 개시되어 있으며, 이 또한 본 명세서에 참조로서 포함된다.

DOTA 이소시아네이트 유도체 역시 지질/계면활성제에 직접적으로 또는 페밭이드 스페이서를 통하여 커플링할 수 있다. gly-gly-gly를 스페이서로 사용하는 것이 아래의 반응식에 나타나 있다. 직접적인 커플링에 있어서, DOTA-NCS를 단순히 PE와 반응시켜 커플링된 생성물을 얻는다. 펩타이드를 사용하는 경우, 예컨대, 트리글리실 결합의 경우, 포스포에탄올아민 (PE)이 우선 t-boc 보호된 트리글리신에 커플링한다. N-하이드록시 숙신이미드 (NHS) 또는 하이드록시벤조트리아졸 (HBT) 중 하나를 갖는 디이소프로필 카보디이미드 (또는 이의 등가물)을 사용하여 t-boc-트리글리신의 유리산 (free acid)의 활성화된 에스테르를 형성하는 것과 같은 표준 커플링 기술을 사용하고, 상기 t-boc-트리글리신-PE를 정제한다.

트리플루오로아세트산으로 t-boc-트리글리신-PE를 처리하여 트리글리신-PE을 얻은 후, 이를 50 ℃에서 DMF/CHCl₃에 용해된 과량의 DOTA-NCS와 반응시킨다. 용매를 제거하여 최종 생성물을 분리한 후, 잔존하는 고체를 과량의 물로 세척하여, 과량의 용매와 모든 미반응 또는 가수 분해된 DOTA-NCS를 제거한다.

X 레이 조영제로서 사용하기 위하여, 본 발명의 조성물은 일반적으로 1 mM 내지 5 M, 바람직하게는 0.1 M 내지 2 M의 중원자 농도를 가져야 한다. 정맥내 주입에 의하여 투여되는 투여량은 통상적으로 0.5 mmol/kg 내지 1.5 mmol/kg, 바람직하게는 0.8 mmol/kg 내지 1.2 mmol/kg 범위일 것이다. 영상화는 공지된 기술, 바람직하게는, X 레이 전산화 단층촬영술을 사용하여 수행한다.

본 발명의 초음파 조영제를 체중 1 kg 당 10 내지 30 ㎕ 양의 에코발생 가스의 정맥내 주입 또는 약 3 ㎕/kg/분 속도로의 주입에 의하여 투여한다. 영상화를 공지된 초음파 촬영술을 사용하여 수행한다.

본 발명의 나노 입자화된 에멀젼을 사용하는 방법은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 통상적으로, 영상화되거나 처리될 주요 조직은 염증 부위를 포함하며, 이는 아테롬성 동맥경화증에 의하여 영향을 받는 부위, 재발 협착 (restenosis), 종양을 유발하는 혈관 형성술 (angioplasty)에 의하여 영향을 받는 것과 같은 염증 부위 및 류마티스 관절염을 포함하는 다양한 질환의 특성을 갖는다.

다음의 실시예는 예시를 위하여 제공될 뿐이며, 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.

제조 A

파트 A - DSPE-PEG (2000) 말레이미드-머캅토아세트산 부가물

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)2000]을 DMF에 용해시키고, 질소 또는 아르곤으로 살포하여 가스를 제거한다. 상기 무산소 용액을 DIEA를 사용하여 pH 7-8로 조절하고, 머캅토아세트산으로 처리한다. 개시 물질이 완전히 소모된 것으로 분석될 때까지 계속하여 실온에서 교반한다. 상기 용액을 아래의 반응에 직접 사용한다.

파트 B - DSPE-PEG(2000) 말레이미드-머캅토아세트산 부가물과 2-[({4-[3-(N-{2-[(2R)-2-((2R)-2-아미노-3-설포프로필)-3-설포프로필]에틸}카바모일)프로폭시]-2,6-디메틸페닐}설포닐)아미노](2S)-3-({7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-1-메틸-4-옥소(3-하이드로퀴놀일)}카보닐아미노)프로파노익산의 결합

상기 파트 A의 생성물 용액을 HBTU와 충분한 DIEA의 첨가에 의하여 미리 활성화시켜서 pH를 8 내지 9로 유지한다. 상기 용액에 2-[({4-[3-(N-{2-[(2R)-2-( (2R)-2-아미노-3-설포프로필)-3-설포프로필]에틸}카바모일)프로폭시]-2,6-디메틸페닐}설포닐)아미노](2S)-3-({7-[(이미다졸-2-일아미노)메틸]-l-메틸-4-옥소(3-하이드로퀴놀일)}카보닐아미노)프로파노익산을 첨가하고, 상기 용액을 질소 분위기 하에서 18 시간동안 실온에서 교반하였다. 진공에서 DMF를 제거하고 미정제 생성물을 예비 HPLC에 의하여 정제하여 파트 B의 화합물을 얻었다.

실시예 1

종양 영상화

A. 종양 모델 및 나노 입자 제조:

수컷 뉴질랜드 화이트 래빗 (~2.0kg)을 케타민(ketamine)과 크실라진 (xylazine)을 근육내 주입(각각 65 및 13 mg/kg)하여 마취시켰다. 각 피검체의 왼쪽 뒷다리 털을 제거하고, 살균 준비하고, Marcaine^TM으로 국부적으로 침투시킨 후, 상기 슬와(popliteal fossa) 위에 작은 절개를 만들었다. 수여자 피검체로부터 새롭게 얻은, 2 x 2 x 2 mm³ Vx-2 암종 종양 단편을 약 0.5 cm 깊이에 이식하였다. 해부 단면을 다시 접촉시키고 단일 가닥의 흡수 가능한 봉합사로 고정시켰다. 마지막으로, 피부 절개선을 Dermabond 피부 접착제로 봉합하였다. 종양 이식 과정 후, 크실라진의 효과를 요힘빈(yohimbine)으로 역전시키고 피검체를 회복시켰다.

Vx-2 이식 후 12 일 후, 래빗을 1 % 내지 2 %의 Isoflurane^TM으로 마취시키고, 관을 삽입하고, 산소를 공급하고, 연구용 MRI 스캐너의 보어 내에 위치시켰다. 각각의 래빗의 양쪽 귀에 정맥내 카테터 및 동맥내 카테터를 삽입하여 나노 입자와 하기하는 동맥혈 샘플의 전신 주입을 위하여 사용하였다. 워싱턴 대학 의과 대학의 동물 연구 위원회에 의하여 승인된 프로토콜과 과정을 따른 연구를 통하여 피검체를 생리학적으로 모니터링하였다.

이식 후 12 일 째에, α_vβ₃ 표적화된 나노 입자 (130 ± 39 mm³) 또는 표적화되지 않은 나노 입자 (148 ± 36 mm³)의 Vx-2 종양 부피는 다르지 않았다 (p > 0.05).

전술한 바와 같이, Vx-2 종양이 이식된 12 마리의 뉴질랜드 래빗을 3 개의 치료 계획으로 무작위로 나누고 다음 중 한 가지를 투여하였다:

1) α_vβ₃-인테그린 표적화된 상자성 나노 입자 (α_vβ₃ 표적화, n=4),

2) 비표적화된 상자성 나노 입자 (즉, 대조군, n=4), 또는

3) α_vβ₃-인테그린 표적화된 비상자성 나노 입자의 투여 후 α_vβ_3-인테그린 표적화된 상자성 나노 입자 (즉, 경쟁군, n=4).

그룹 1과 그룹 2의 처리에 있어서, 베이스라인 MR 영상을 얻은 후 래빗에 α_vβ₃-인테그린 표적화된 상자성 나노 입자 또는 대조군 상자성 나노 입자 0.5 ml/kg을 투여하였다. 그룹 2의 처리에 있어서, 모든 래빗에 α_vβ₃-인테그린 표적화된 비상자성 나노입자 0.5 ml/kg을 MR 영상화 2 시간 전에 투여한 후 α_vβ₃-인테그린 표적화된 상자성 나노 입자 ml/kg를 투여하였다. 2 시간에 걸쳐서 각각의 피험체에서 주입시와 매 30 분 마다 동적 MR 영상을 얻어서 종양과 근육 부위에서의 시그널 상승에 있어서의 초기 변화를 모니터링하였다. 조직 연구를 위하여 모든 종양을 잘라내어 동결시켜서 MR 분자 영상화 결과를 확인하였다.

상기 상자성 나노 입자는 Flacke, S., 등, Circulation (2001) 104:1280-1285에 개시된 바와 같이 생산하였다. 간단히 말해서, 상기 나노 입자화된 에멀젼은 40 % (v/v)의 퍼플루오로옥틸브로마이드 (PFOB), 2% (w/v)의 계면활성제 공혼합물, 1.7% (w/v)의 글리세린 및 균형을 맞추기 위한 양의 물로 구성되었다.

대조군, 즉 비표적화된 상자성 에멀젼의 계면활성제는 60 몰% 레시틴 (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL), 8 몰% 콜레스테롤 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 2 몰% 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE) (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL) 및 30 몰% 가돌리늄 디에틸렌트리아민펜타아세트산-비솔리에이트 (Gd-DTPA-BOA, Gateway Chemical Technologies, St. Louis, MO)을 포함하였다. Gd-DTPA-BOA의 제조가 Cacheris, W.P., 등, 미국특허 제5,571,498호 및 제5,614,170에 개시되어 있으며, 이들은 모두 본 명세서에 참조로서 포함된다.

α_vβ₃표적화된 상자성 나노 입자를 다음을 포함하는 계면활성제 공혼합물을 사용하여 상기한 바와 같이 제조하였다: 60 몰%의 레시틴, α_vβ₃-인테그린 펩타이드 유사 (peptidomimetic) 길항제 (Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc., North Billerica, MA)에 공유적으로 결합된 0.05 몰%의 N-[{w-[4-(p-말레이미도페닐)부타노일]아미노}폴리(에틸렌글리콜)2000]1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(MPB-PEG-DSPE), 8 몰%의 콜레스테롤, 30 몰%의 Gd-DTPA-BOA 및 1.95 몰%의 DPPE.

α_vβ₃표적화된 비상자성 나노 입자는 친유성 Gd3+ 킬레이트를 첨가하는 것을 제외하고 상기 표적화 제제와 동일한 방식으로 제조하였으며, 상기 친유성 Gd3+ 킬레이트는 계면활성제 공혼합물 내에서 증가된 레시틴 (70 몰%) 및 콜레스테롤 (28 몰%)로 치환되었다.

각각의 나노 입자 제제를 위한 성분을 M110S Microfluidics emulsifier (Microfluidics, Newton, MA)에서 20,000 PSI로 4 시간동안 에멀젼화시켰다. 얻어 진 에멀젼을 크림프 봉인된 유리병에 넣고 질소로 덮었다.

입자 크기는 37 ℃에서 레이져 광 산란 서브마이크론 입자 크기 분석기 (Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 측정하였고 나노 입자의 농도는 예상되는 입자 크기 (즉, 구형 입자 부피)로부터 계산하였다. 입자 크기 분포를 도 1에 나타내었다 - 입자의 대부분은 400 nm 이하의 지름을 가졌다.

퍼플루오로카본 농도를 화염 이온화 검출기 (Model 6890, Agilent Technologies, Inc., Wilmington, DE)를 사용하는 가스 크로마토그래피로 측정하였다. 내부 표준 (Freon

에 용해된 0.1 % 옥탄) 2.0 ml와 에탄올에 용해된 수산화칼륨 10 %와 혼합된 퍼플루오로카본 에멀젼 1 ml을 격렬하게 교반한 후, 30 분동안 계속적으로 쉐이커에서 흔들어 주었다. 하부 추출층을 실리카겔 컬럼을 통하여 여과시키고 분석시까지 4 내지 6 ℃에서 저장하였다. 초기 컬럼 온도는 30 ℃ 이었고, 10 ℃/분 속도로 145 ℃까지 상승하였다.

상기 에멀젼의 가돌리늄 함유량을 300 kW 핵 반응기 (Landsberger, S., Chemical Analysis by Nuclear Methods, pp. 122-140, Z.B. Alfassi (ed.), New York: Wiley (1994))에서 중성자 활성화 분석에 의하여 측정하였다. 나노 입자 당 Gd³⁺ 착물의 수를 Gd³⁺의 농도와 에멀젼 내 나노 입자의 측정 수와의 비율로부터 계산하였다. 또한, 각각의 상자성 나노 입자 제제의 이완성(relaxivities)을 0.47 Tesla 및 40 ℃에서 Minispec Analyzer (Bruker, Inc., Milton, ON, Canada)를 사용하여 측정하였다.

상기 입자의 특성을 표 1에 나타내었다.

총 에멀젼 부피 (리터)에 비례하는 농도가 보고되었다. 이완성 수치 (r 및 r2)은 0.47 Tesla에서 측정하였고, 나타난 바와 같은 [Gd³⁺] 또는 [나노 입자]에 비례하여 계산하였다.

α_νβ₃표적화된 나노입자와 비표적화된 나노입자의 물리적 및 화학적 특성
	α_νβ₃-표적화	비-표적화
입경(nm)	273	263
다분산성지수	0.15	0.21
[Gd³⁺](mM)	6.19	6.77
[¹⁹F]	28.9	28.6
[입자](nM)	65.5	73.3
Gd³⁺ 이온/입자	94,400	92,400
r₁(s*mM)^-1[Gd]	19.1	21.1
r₂(s*mM)^-1[Gd]	22.9	24.6
r₁(s*mM)^-1[입자]	1,800,000	1,950,000
r₂(s*mM)^-1[입자]	2,160,000	2,270,000

B. 자기 공명 영상법 및 조직학적 방법

종양 이식 후 12 일째에, 피검체를 1.5 Tesla 임상 스캐너 (NT Intera with Master Gradients, Philips Medical Systems, Best, Netherlands) 상에서 MRI 스캐닝하였다. 각각의 피검체를 종양에 인접한 뒷다리에 대하여 위치하는 11 cm 지름의 원형 표면 코일을 갖는 직각(quadrature) 해드/넥 버드케이지 코일 내부에 두었다. 상기 직각 바디 코일을 모든 무선 주파수 전달을 위하여 사용하였고; 상기 버드케이지 코일을 스카우트 영상화 동안의 측정을 위하여 사용하였고; 상기 표면 코일을 고해상도 영상화 동안의 측정을 위하여 사용하였다. 가돌리늄 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (Gd-DTPA) 도핑된 물로 채워진 10 ml 주사기를 고해상도 시야 (FOV) 내에 위치시키고 시그널 세기 표준으로서 사용하였다.

T₂-웨이티드 터보 스핀-에코 스캔 (TR: 2000 ms, TE: 100 ms, FOV: 150 mm, 슬라이스 두께: 3 mm, 매트릭스: 128 x 256, 시그널 평균: 2, 터보 인자: 3, 스캔 시간: 3 min)을 사용하여 종양을 이식 부위에 위치시켰다. 종양의, 고해상도, T_l-웨이티드, 지방 억제된, 삼차원, 농도구배 에코 스캔 (TR: 40 ms, TE: 5.6 ms, FOV: 64 mm, 슬라이스 두께: 0.5 mm, 접종 슬라이스: 30, 평면(in-plane) 해상도: 250 ㎛, 시그널 평균: 2, 플립 각: 65 ℃, 스캔 시간: 15 min)를 베이스라인에서 수집하고 상자성 나노 입자 주입 직후, 30, 60, 90 및 120 후에 반복하였다.

종양의 부피를 오프라인 영상 프로세싱 워크스테이션 (EasyVision v5.1, Philips Medical Systems, Best, Netherlands) 상에서 계산하였다. 관심 부위 (Regions-of-interest, ROI)를 T₁-웨이티드 베이스라인 스캔의 각 슬라이스 내의 종양 주변에 수동적으로 적용하고 삼차원 물체내로 결합시키고, 부피를 계산하였다.

시간에 따른 영상 강화(enhancement)를 정량하기 위하여, 비편향(unbiased) 영상 부석 프로그램을 사용하였다. 정맥내 나노 입자 주입 전, 직후, 30, 60, 90 및 120 분 후에 수집된 T₁-웨이티드 이미지 (각각의 종양 중심을 통한 3 개의 인접 슬라이스)를 MATLAB (The MathWorks, Inc., Natick, MA)를 사용하여 분석하였다. 각각의 시점에서의 영상 세기를 기준 가돌리늄 스탠다드를 통하여 베이스라인 영상 으로 정상화하였다. 일련의 영상을 공간적으로 동시 기록하고, 각각의 주입 후 시점에서의 각각의 픽셀에 대하여 조영 강화를 측정하였다. ROI를 베이스라인 이미지의 뒷다리 근육 부분 주위로 수동적으로 끌어당기고 ROI 내부의 평균 픽셀-by-픽셀 (pixel-by-pixel) 시그널 강화를 각 시점에서 계산하였다. 두 번째 ROI를 종양 주위로 수동으로 끌어당기고 각각의 피검체의 베이스라인 영상에서 종양 시그널의 표준 편차를 계산하였다. 시그널 강도가 베이스라인에서의 종양 시그널의 표준 편차의 3 배 이상으로 증가하는 경우 (즉, 베이스라인에서 나타나는 변분(variation)의 99 % 이상), 픽셀이 강화된 것으로 간주한다. 모든 주변 평면내(in-plane) 픽셀이 강화되지 않은, 단독 강화 픽셀을 소음으로 간주하하여 계산에서 제외하였다. 남아있는 강화 픽셀 크러스터를 직후, 30, 60 및 90 분 영상에 대하여 지도화하고 각 인터벌에서의 평균 시그널 강화를 측정하였다. ANOVA (SAS, SAS Institute, Cary, NC)를 사용하여 각 시점에서의 종양 및 근육에 대하여 통계학적 비교를 수행하였다. LSD 방법을 사용하여 처리 중간값을 분리하였다 (p < 0.05).

조영 후, 종양을 조직학 및 면역조직화학적 분석을 위하여 적출하여 종양 병변을 확인하고, 관련된 혈관분포상태(vascularity) 및 신생혈관생성(angiogenesis)을 측정하였다. 종양을 본래의 해부학적 위치 및 MRI 영상 평면에 비례하는 알려진 방향성을 갖는 OCT 배지에서 냉동시켰다 (-78℃). -20℃에서 15 분동안 아세톤에서 고정되고 하룻밤동안 (4℃) 공기 건조된, 4 마이크론의 냉동 절편 (Leica Microsystems, Inc.,Bannockburn, IL)을 헤마톡실린-에오신, 쥐의 항인간/래빗 내피 항체 (QBEND/40, 1:10 희석, Research Diagnostics, Inc. , Flanders, NJ), 또 는 쥐의 항인간 α_vβ₃-인테그린 (LM-609, 1:200 희석, Chemicon International, Temecula, CA)으로 염색하였다. Vector

VIP 키트와 함께 개발되고, Vector

메틸그린 핵 대비 염색제로 대비 염색된, Vectastain

Elite ABC 키트 (Vector Laboratories, Burlingame, CA 94010)를 사용하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다. Nikon 디지털 카메라 (Model DXM 1200)가 장착되고 Nikon ACT-1 소프트웨어를 사용하여 전산화되는 Nikon Eclipse E800 리서치 현미경 (Nikon USA, Melville, NY)을 사용하여 슬라이드를 검사하였다.

C. 조영 및 조직학적 분석 결과

α_vβ₃ 표적화된 상자성 나노 입자를 투여받은 Vx-2 종양 래빗의 T₁-웨이티드 MR 영상은 MR 조영의 현저한 증가가, 배타적이지는 않지만, 우선적으로 종양 주변을 따라 비대칭적으로 위치한다는 것을 보여주었다. α_vβ₃-인테그린 강화는 통상적으로 혈관과 인접 부위 및 조직 근막 경계면을 따라서 불균일하게 분호하는 것으로 나타났다 (도 2). Vx-2 종양의 조직학적 평가 및 면역세포화학적 평가는 신생혈관형성이 종양 주변을 따라서 몇 몇 독립적 영역 내에 가장 집중적으로 분포하고 있다는 것을 종양 세포 소엽(lobule) 사이에 산재된 종양내 결합 조직 트랙 내에서 보다 덜 광범위하게 발견된다는 것을 입증하였다 (도 3).

일시적으로, α_vβ₃ 표적화된 상자성 나노 입자에 의하여 제공된 MRI 조영 강화가 주입 직후 신생혈관생성 부위에서 상대적으로 낮은 수준으로 검출되었으며, 이는 30 분에서 구멍이 난(fenestrated) 신경혈관구조를 통한 나노 입자의 국부적 방출에 기인하는 것으로 보인다 (도 4). 30 분 후에 어떠한 혈관내 혈액 풀 조영 효과도 검출되지 않았다. 두 시간 후, α_vβ₃ 표적화된 나노 입자로 처리된 래빗 사이에서 시그널 강화의 크기가 비효적화된 나노 입자 효과와 비교하여 증가하였다 (56 %) (p < 0.05). α_vβ₃ 표적화된 상자성 나노 입자의 주입 두 시간 전에 미리 표적화된 비상자성 α_vβ₃- 나노 입자를 갖는 α_vβ₃-인테그린 부위의 봉쇄는 표적화된 조영 시그널 강화를 절반으로(p < 0.05), 국부적 신경혈관 누출을 야기하는 시그널 효과보다 약간 낮게, 감소시켰고, 이는 효적화된 나노 입자의 특이성을 확인시키는 것이다.

종양 캡슐 이외에도, 조영 강화는 와(fossa) 내의, 특히 신생혈관형성의 캡슐 부위로부터 단지 수 밀리미터 떨어진 곳에 위치하는 대정맥 혈관벽 내의 많은 혈관 사이에서 불균일한 분포를 나타내었다. 일례로, 종양 캡슐 시그널와 매우 인접하여 정맥 혈관 형성 시그널에 대하여 측정되는 조영 시그널 강화 크기는 시간에 따라 병진적으로 증가하였으며, 이는 소스와 표적을 암시한다 (데이터는 나타내지 않음). 많은 예에 있어서, 종양으로부터 동화된(elaborated) 인자에 의하여 근처의 혈관구조에서 자극되는 신생 혈관 형성은 이식 후 12 일까는 확실히 종양에 연결되지 않았다. 대측성 슬와 내의 혈관 구조를 검사하여 α_vβ₃ 표적화된 또는 비표적화된 상자성 나노 입자의 주입 후에 아무런 MR 시그널 변화가 없다는 것을 밝혔다.

모든 Vx-2 래빗은 통상의 알려진 수술 부위에서의 베이스라인 T2-웨이티드 MRI 조영을 거쳐서 이식 후 12 일째에 종양을 위치화시켰다. 몇 몇 래빗에서는, 종양이 검출되지 않아서 이들을 연구에서 제외시켰다. 소수의 다른 피검체에 있어서, 크기 및 T₂-영상 특성을 기준으로 적절하게 보이는 덩어리가 관찰되었지만, 나중의 조직학적 분석에 의하여 이것이 염증 세포의 많은 침윤병소를 갖는 종양 잔존물인 것으로 나타났으며 (도 5); 이들 피검체 또한 연구에서 제외시켰다. T₂-웨이티드 MRI 상에서의 과도한 강도 양상은 염증과 관련된 부종에 기인하는 것이다.

이러한 아집단 피검체 중에서, 일부에 α_vβ₃ 표적화된 상자성 나노 입자를 투여하였으며, 아무런 MR 조영 강화가 상기 덩어리 주변지역 내에서도 근처의 혈관 구조 내에서도 관찰되지 않았다 (도 6). 이러한 슬와 덩어리 또는 인접 혈관 구조와 관련된 시그널 강화의 결여는 조직학적으로 입증된 종양을 갖는 피검체에서 통상적으로 얻어지는 분자 조영 특성과 구별되었다. 잔존 조직의 조직학 및 면역조직화학적 분석에 의하여 α_vβ₃-인테그린에 대하여 미미하게 염색된 인접 조직과 종양 주변에서 혈관 조직이 부족함을 확인하였다. 이러한 발견은 종양 잔존물로부터 생존 가능한 Vx-2 덩어리를 구별하는 것을 도와주는 분자 조영의 특이성을 보여준다.

실시예 2

아테롬성 동맥경화증의 조영

A. 모델계 및 나노 입자

표적화된 나노 입자와 표적화되지 않은 나노 입자 모두를 실시예 1의 A 단락에서 설명한 바와 같이 제조하였다. 얻어진 특징은 유사하였다 - 입자는 6.17 mM Gd 또는 약 94,200 Gd 원자/입자를 포함하였다. 탄성 광 산란 (Malvern Instruments, Worchestershire, UK)에 의하여 측정된 정상 입자 크기는 273 nm 이었고 0.15의 "다분산성 지수" (또는 분산 대역폭)을 가졌다.

상기 입자 제제의 실제 T_l 및 T₂ 이완성 (각각, rl 및 r2)을 직각 버드케이지 코일 내에 위치하는 순수한 샘플 (59 nM로 나노 입자 존재)에 적용되는 멀티에코 시퀀스 및 표준 인버젼 회복 펄스 시퀀스를 사용하여 측정하고 임상적 1.5T 시스템 (Philips NT Intera CV, Philips Medical Systems, Best, Netherlands)을 사용하여 조영하였다. Gd³⁺ 1 mM 당 나타나는 상자성 나노 입자에 대한 "이온 기준(ionic-based)" rl 및 r2 값은 각각 17.7±0.2 및 25.3±0.6 (sec·mM)^-1이었다. "입자 기준(particle-based)" 이완성은 r1 및 r2에 대하여 1,670,000±100,000 및 2,380,000±120,000 (sec·mM 입자)^-1이었다. 이러한 이완성은 상업적으로 입수가능한 상자성 조영제에 대한 이완성보다 5 오더(orders) 크기만큼 더 큰것이다.

상기 표적화된 나노 입자는 각각, 제제 A, 파트 B에 설명된, 커플링된 인지질을 통하여 입자 지질 멤브레인에 결합하는 펩타이드 유사체를 약 200 내지 300 카피 포함하였다. 약동학적 특성을 포함하는, 나노 입자의 물리적 특징은, 상기 나노 입자가 표적화 리간드를 포함하는 것에 의하여 영향을 받지 않으며, 표적화된 입자 및 대조군 입자 모두 구별되지 않는 상자성 특성을 나타내었다.

아테롬성 동맥경화증을 유도하기 위하여, 13 마리의 수컷 뉴질랜드 화이트 래빗에 % 콜레스테롤 (n=9) 또는 표준 래빗 사료 (n=4)를 ~80 일동안 먹였다. 조영제를 0.5 ml/kg (체중)의 양으로, 즉, 각 분량 당 10¹⁴ 개의 나노 입자의 양으로 귀 정맥을 통하여 정맥내 주입하였다. 다음과 같은 세 개의 시험군이 사용되었다:

1) α_vβ₃ 표적화된 상자성 나노 입자가 투여된 대조 식사 피검체 (n=4);

2) α_vβ₃ 표적화된 나노 입자가 투여된 고콜레스테롤 래빗 (n=5) 또는

3) 표적화되지 않은 대조 나노 입자가 투여된 고콜레스테롤 (n=4).

MRI에 이어서, 조직학적 검사를 위하여 모든 대동맥을 추출하였다. 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 대동맥 벽 단편 (4?m)을 통상적인 헤마토크실린(hematoxylin)/에오신으로 염색하였다. 대동맥에서의 α_vβ₃-인테그린의 발현을 특정 일차 항체 (LM609: Chemicon International, Inc., Temecula, CA), 및 VIP 기질 키트와 함께 개발된 이차 항체를 사용하여 포르말린 고정된 단편의 면역 조직 화학적 분석에 의하여 확인하였다. PECAM를 CD31 일차 항체 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA)와 유사하게 염색하였다. 신경혈관조직의 영상을 Nikon 현미경과 Nikon DXM1200 카메라를 사용하여 고출력 (600x) 하에서 디지털화하였다.

상기 실험 프로토콜은 워싱턴 의과 대학의 동물 연구 위원회 협회에 의하여 승인되었다

B. 조영 및 조직학적 분석

실시예 1의 B 단락에 설명된 것과 유사한 방법으로 MR 영상을 얻었다. 1.5T magnet (NT Intera CV, Philips Medical Systems, Best, Netherlands)을 직각 버드케이지 RF 리시브 코일과 함께 사용하여 상자성 나노 입자로 처리하기 전 후에 생체내에서 대동맥을 조영하였다. 멀티슬라이스 T_l-웨이티드 스핀-에코, 지방-포화된, 대동맥의 흑혈류 영상을 신장 동맥으로부터 다이아그램 (TR 380ms; TE1 lms; 250 by 250 ㎛ 평면 해상도, 5 mm 단편 두께; NSA=8)으로 수행하였다. 생체내 조영을 위하여 사용된 실제 TR은 최상이 아니었지만, 본 시그널 자극에 따르면, 단 시간에 데이터를 얻을 수 있는 실무적인 방법을 제공하였다. 시그널 강도에 대한 효과는 약 두 배의 나노 입자 농도 (약 100 pM까지)를 가질 때 1,5T에서 CNR=5을 얻을 수 있는 것으로 가장 잘 나타났다. 혈액 시그널을 무의미화하기 위하여, "슬라이딩 rf' 포화 밴드를 조영 획득 부위에서 가까운 곳과 먼 곳에 위치시키고 선택된 조영 계획에 따라 이동시켰다.

C. 조영 및 조직화학 분석 결과

표적화된 나노 입자를 사용하여 아테롬성 동맥경화증과 관련된 것으로 입증된 위치에서의 조영 영상 강화를 보여주었다.

도 7A는 표적화된 나오 입자로 처리하기 전 및 처리하고 120 분 후의 선택된 피검체의 동맥의 조영된 부분의 종단면 (상부) 및 횡단 슬라이스(하부)를 보여주며, 각각의 대동맥 슬라이스의 양적 시그널에 대한 소비 설계된 (custom-designed) 영상 분할 알고리즘으로부터의 아웃풋의 예를 또한 보여준다. 대동맥 벽에 있어서의 시그널은 조영제 주입 후 증가하며 (가운데 패널), 이는 α_vβ₃-인테그린 에피토프에 결합되어 있는 표적화된 나노 입자의 존재를 나타낸다. 더욱이, 대동맥 혈액 풀 배경은 사용된 나노 입자의 투여량이 소량이고 조영제의 혈액 풀 제거를 위한 기간을 기다릴 필요없이 대동맥 벽에서의 조영 강화를 즉시 검출할 수 있도록 하는 "흑혈류" 시그널 무의미화 과정의 측면에서 볼 때 혼동스럽지 않다 (주의: 루멘에서의 낮은 혈액 시그널).

도 7B는 세 마리의 선택된 래빗에 대한 동맥을 따른 종단적 조영 강화의 다양성을 보여준다. 전반적으로, 실질적으로 모든 대동맥 단편에서 고콜레스테롤 표적화된 래빗에서 보다 큰 시그널 강화가 관찰되었다. 여기에 보여지는 바와 같이, 고 콜레스테롤 식사를 먹인 래빗에서의 표적화된 입자에 따른 퍼센트 강화는 고콜레스테롤 식사를 먹인 래빗에 비표적화된 나노 입자를 사용하는 조영의 강화 (열린 사각형)보다 현저하게 높았으며, 정상식을 먹인 래빗에 표적화된 입자를 사용하는 조영의 강화 (색 칠해진 삼각형)보다 높았다.

치료한지 120분 후 세마리 토끼에 대해 대동맥벽내에서의 콘트라스트 증가의 변이성을 측정하자 각각의 대동맥 수준에서 유의적인 시그널 이종성이 관찰되었다. 표적화 나노입자를 투여받은 고콜레스테롤 토끼는 특히 전체적으로 커다란 증가를 명백히 나타냈지만, 세가지 샘플 모두에서 "핫 스팟 (hot spot)"이 존재한다.

조직학적 측정결과 혈관 내피세포에 α_νβ₃인테그린 에피토프가 공동국소화되는 것이 확인되었다. H&E 염색은 콜레스테롤-주입 토끼에서만 80일 후에 약간의 내막 비후증이 있었음을 보여주었다. 면역세포화학적 분석결과 콜레스테롤-주입 토끼에 있어서 외막-매질 (adventitia-media) 계면에서 α_νβ₃에 대한 현저한 염색과, PECAM 염색을 나타냈으며, 이는 외막-매질 계면에서 α_νβ₃인테그린 에피토프와 공동국소화된 혈관 내피를 가리키는 것이다. 이것은 콜레스테롤-주입 토끼에서 더욱 현저히 관찰되었으며, 염증성 마커와 연관된 팽창된 모세관의 존재를 확인해주는 것이다.

각각의 조영된 슬라이스에 대한 대동맥 벽의 영상내에서 반자동화 시그널 강도 분석을 위한 "성장-대역 (region-growing)" 분할 알고리즘을 개발하였다. 앞서 분할된 픽셀에 대한 유사성에 대해 주변 픽셀을 평가함으로써 분할된 면적을 반복적으로 증가시키는 접종된 "성장-대역" 알고리즘을 사용함으로써, 대동맥 루멘을 각각 2차원 영상에서 분리하였다. 일단 소정의 유사성 역치에 달하면, 성장이 종결된다. 벽을 포함하도록 이 분할 너비를 증가시키고 앞서 분할된 루멘을 뺌으로써, 대동맥벽의 바이너리 마스크와 몇몇 부가적인 배경 픽셀만을 남긴다. 배경 픽셀을 제거하기 위해 추가로 역치작업을 하여 대동맥 벽만을 분할시켰다. 분할 후, 각각의 슬라이스와 시점에 있어서의 벽의 평균 강도를 베이스라인에 있어서의 동일한 슬라이스의 평균 강도로부터 뺐다. Hong Kong University of Science and Technology의 Michael Brown 박사가 개발한 공정 (www. cs. ust.hk/~brown/에서 찾아볼 수 있음)으로부터 알고리즘 핵심을 채택하였다.

이 공정을 모든 대동맥 데이터 세트에 균일하게 적용시켜 도 7A에 도시한 것 처럼 전체 대동맥벽의 관심있는 주변대역을 생성시킨다. 무작위적으로 선택된 목적하는 인접 골격근육 대역에서 그리고 나노입자 주사전 및 주사후의 MRI 시그널 강도를 각각의 레벨마다 분할된 전체 대동맥 대역 내에서 정량화시켰다. 시계내에 위치한 신탁 마커 (시험관 팬텀 중의 Gd³⁺-DTPA/염수 용액)로부터의 시그널로 시그널 강도를 표준화시켰다. 주사후 15분, 60분 및 120분에서의 영상에 대해 나노입자 주사후의 시그널 강도의 백분율 변화를 산출하였다. MRI 시그널에 있어서 유의차를 구하기 위해 그룹 차이에 대한 Duncan's 복수-범위 테스트를 이용한 일반적인 선형 모델링 (SAS, Inc., Car, North California)을 이용하였다.

조영된 모든 대동맥 수준에서 토끼 한마리에 대한 평균 대동맥 증가를 산출함으로써 보존적 방식으로 대동맥 시그날 강화의 정량화를 수행한 다음, 전체 실험군에 대한 이 토끼 한마리에 있어서의 실험값을 평균내었다. 도 8A는 표적화 나노입자의 주사 직후 (약 15분 이내), 전체 대동맥 벽에서의 시그널이 모든 토끼에 있어서 26±3.8% 증가하였음을 보여준다. 120분까지, 전체 대동맥벽으로부터의 시그널이 베이스라인보다 47±5.4% 더 증가하였다. 비-표적화 나노입자가 투여된 콜레스테롤-주입 토끼의 전체 대동맥벽 역시 15분 이내에 19±0.8% 증가하였지만, 60-120분 (26±1%)에는 안정한 상태로 유지되었으며, 이는 특이적으로 표적화된 증가의 경우에 비해 단지 약 절반의 시그널 개시를 보여주는 것이다.

대조군-식이처리된 토끼들의 경우, 표적화 나노입자의 주사 직후 유의적인 대동맥벽 증가가 그 시점에서 콜레스테롤-주입 토끼의 그것과 동일한 수준으로 관 찰되었다 (14.5±2.2%). 그러나, 2시간 후에는, 시그널이 조금 강화되었다 (23.7±3.7%). 따라서, 콜레스테롤-주입 동물에 있어서 전체 대동맥벽의 시그널 강화는 120분까지의 대조군-식이처리된 동물의 그것보다 약 2배 증가된 것이다.

여하한 시점에서의 여하한 그룹에 있어서의 인접한 골근육에서 관찰된 시그널 강화 (도 8B)는 여하한 대동맥 그룹의 것보다 훨씬 낮았고, 통계적 유의성에 가까스로 미치는 것이다 (p<0.051). 이러한 경향은 나노입자 종류나 ANOVA에 의한 주입 레지멘과는 통계적으로 무관한 것이었다.

이러한 데이터는 혈관 염증에 있어서 α_νβ₃ 에피토프를 특이적으로 동정하는 것이 생체내에서 고해상 MRI를 이용할 경우 가능함을 가리키는 것이다.

앞서의 약동학적 분석에 따르면 입자 소거 (particle clearance)가 1-1.5시간의 β-제거율의 2승 (biexponential)임을 가리킨다. 이러한 특성은 리간드나 가돌리늄 킬레이트를 첨가해도 영향받지 않는다. 따라서, 대동맥이나 근육 중 분자적으로 표적화된 나노입자의 비특이적인 축적을 일으키는 농도 구배는 120분경에는 감소되는 것이다 (이것은 대동맥 중 비특이적 시그널 강화가 평탄대역을 나타내는 본 데이터와 일치하는 것임: 도 8 참조). 반대로, α_νβ₃ 에피토프에 대한 특이적 결합 프로세스는 몇가지 반감기동안 증가되는데 이는, 평균적인 정맥주사 투여당 약 100조개 (100 trillion)의 나노입자가 주입된다고 가정 할 경우, 신생혈관계에 대한 분자 에피토프의 낮은 분포 (low prevalence)에 비해, 순환계 중에 나노시스템이 큰 리간드 과량으로 존재할 것으로 기대되기 때문이다. 근육에 비해 대동맥 벽에서의 더 큰 비특이적 증가는 ㅂ다 큰 분포 용적과 동시에 본 발명의 특별한 "흑혈 (black blood)" 조영법에 의한 시그널 무효화를 덜 일으키는 상자성 나노입자의 보다 큰 국소농도를 제공하는 동형 모세관 (sinusoid-like vasa vasorum)의 팽창과 관련있는 것 같다. 모세관에서의 유입/유출이 대동맥 루멘에서의 그것보다 훨씬 느린 것 같으므로, 시그널 무효는 대동맥 루멘 혈액 풀의 경우가 모세관의 그것보다 훨씬 효과적이다.

따라서 표적화된 상자성 나노입자는 초기단계의 동맥경화증에서 혈관염증 및/또는 혈관신생을 파악하기 위한 통상적인 임상적 조영접근법과 함께 소량 정맥주사 투여량으로 MRI에 이용될 수 있다.

실시예 3

재협착 모델

건강한 집돼지, 당뇨병 집돼지 또는 과지혈증 집돼지를 텔라졸 칵테일 (1 ml/23 kg IM)과 이어서 삽관법에 의해, 그리고 산소 중 1-2% 이소플루란 마취에 의해 진정시켰다. ECG, 혈액 가스 및 동맥혈압을 모니터링하였다. 리도카인, 딜티아젬 및/또는 니트로글리세린을 이용하여 혈관수축시켰다.

말초 동맥에 접근한 다음 덮개 (sheath)를 놓고, 적절한 크기의 혈관형성 풍선, 예컨대 8 mm x 2 cm 크기의 풍선 카테테르 (Proflex, Mallinckrodt Inc., St. Louis)를 경부 척추 레벨 (C-3 내지 C-5)에 위치시킨 다음 6기압의 압력까지 30초씩 수차례 (약 3회) 팽창시키고 이 때 팽창과 팽창의 간격은 60초로 하였다. 풍선 대 동맥의 비율은 통상 이용되는 비율인 약 1.5였다. 이 공정에 의해 내부 신장성 라미나가 지속적으로 파열되고 매질이 손상되었다.

상기 경동맥의 과팽창 풍선-손상에 이어, 실시예 1에서 설명된 바와 같은 나노입자를 함유하는 에멀젼을 국소전달용 카테테르 시스템을 통해 투여하였다. 전달 시스템은 한쌍의 풍선 카테테르 또는 기계적 관주 전달/진공 추출 시스템이었다. 표적화 나노입자 또는 대조군 나노입자 또는 생리식염수 단독을 국소전달하여 1 내지 15분간 인큐베이션시켰다. 경동맥 혈관벽을 조영하기 전에 MR 혈관조영상을 찍었다.

1.0T 내지 7.0T에서 1.5 테슬러 (Tesla) 임상 스캐너 (NT Intera CV, Philips Medical Systems, Best, Netherlands) 또는 이에 필적할만한 임상 시스템을 이용하여 MRI 스캐닝을 행하였다. 적절한 코일에는 직각위상 헤드/넥 새장 코일, 원형 표면 코일, 페이즈드-어레이 (Synergy) 코일이 포함된다. 연구 분석을 위해, 영상 시그널 강도 표준 역할을 하도록 고해상도 시계 (FOV: field of view) 내에 가돌리늄 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (Gd-DTPA) 도핑된 물 표준을 놓았다: 이것은 임상 적용에서는 요구되지 않는다. MR 조영 분석을 Easy Vision v5.1 워크스테이션 (Philips Medical Systems, Best, Netherlands) 또는 이와 유사한 영상 조작시스템을 이용하여 오프라인으로 수행하였다.

도 9는 α_νβ₃-표적화 상자성 나노입자를 이용한 콘트라스트-향상된 풍선 손상 패턴을 3차원으로 재구성해서 보여주는 것이다. 이것은 미세파괴 (microfracture)의 공간 분포가 막 매질 내에 유도되었음을 가리킨다. 보통의 X-선 혈관 조영도로는 검출이 불가능한 이들 데이터는 재협착을 비롯하여, 후속적인 재혈관형성 합병증과 관련한 중요한 예후증상을 갖는 혈관벽 손상을 정량적으로 평가하는 것을 가능케 해준다.

α_νβ₃표적화 모이어티를 포함시키는 것에 더해, 이러한 방사성 핵종, 패클리탁셀 또는 라파마이신과 같은 항증식성 제제를 나노입자에 보충시킨다.

Claims

나노입자의 에멀젼을 포함하는 조성물로서, 상기 나노입자는 지질/계면활성제로 코팅된 액체 퍼플루오로카본 코어로 구성된 것이고, 상기 나노입자는 α_νβ₃에 대해 특이적인 리간드인 하기 식:

을 포함하는 리간드와 커플링되고, 상기 나노입자가 리간드에 커플링되는 것은 스페이서를 통한 공유 결합에 의해 지질/계면활성제 코팅의 성분에 커플링되는 것이며, 상기 나노입자에는 생물학적 활성제, 조영제 및 생물학적 활성제와 조영제의 배합물 중에서 선택된 성분이 1종 이상 혼입되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리간드는 포스파티딜 지질인 지질/계면활성제 코팅의 성분에 스페이서를 통해 커플링되는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 지질/계면활성제 코팅의 성분에 커플링되는 리간드는 하기식을 가지는 것인 조성물:

.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 호르몬 또는 약물 화합물인 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 약물 화합물은 항신생조직제, 진통제, 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 구충제, 항바이러스제, 인터페론, 항당뇨병제, 항히스타민제, 진해제, 또는 항응고제, 또는 항증식제인 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 약물 화합물은 항증식제인 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 약물 화합물은 패클리탁셀 또는 라파마이신인 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조영제는 자기공명영상(MRI) 컨트라스트제(contrast agent) 1종 이상인 것인 조성물.
제8항에 있어서, 상기 MRI 컨트라스트제는 킬레이팅된 상자성 이온인 것인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 상자성 이온은 가돌리늄(gadolinium) 이온인 것인 조성물.
α_νβ₃ 을 발현하는 조직에 표적화되는 나노입자의 에멀젼 제조용 키트로서, 상기 키트는 α_νβ₃에 대해 특이적인 리간드인 하기 식:

을 포함하는 리간드에 공유적으로 커플링시키기 위한 결합 모이어티를 포함하는 나노입자를 함유하는 용기 1개 이상과,

상기 리간드를 함유하는 용기 1개 이상을 함유하는 것이고,

상기 나노입자는 지질/계면활성제로 코팅된 액체 퍼플루오로카본 코어로 구성되는 것인 키트.
하기 식의 리간드가 스페이서를 통해 지질/계면활성제에 공유적으로 커플링되어 있는 컨쥬게이트:

.
제12항에 있어서, 상기 지질/계면활성제는 인지질인 것인 컨쥬게이트.
제12항에 있어서, 상기 스페이서는 폴리알킬렌 글리콜, 펩티드 및 이의 혼합물 중에서 선택된 성분을 1종 이상 포함하는 것인 컨쥬게이트.
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