KR100937736B1

KR100937736B1 - 유도 조직 재생을 위한 다공성 지지체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100937736B1
Application number: KR1020080093339A
Authority: KR
Inventors: 서영권; 한미정; 윤희훈; 송계용; 박정극
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-09-23
Filing date: 2008-09-23
Publication date: 2010-01-21
Anticipated expiration: 2028-09-23
Also published as: WO2010036009A2; WO2010036009A3

Abstract

본 발명은 유도 조직 재생(guided tissue regeneration)을 위한 다공성 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 다공성 지지체는 생분해가 가능하여 부가적인 제거수술이 필요하지 않고, 조직 재생 및 기계적 물성이 우수할 뿐만 아니라 천연 고분자만으로 구성되어 이식시 문제시되는 면역반응(immune response)을 거의 일으키지 않아 생체적합성이 우수하며, 직조된 실크가 사용되어 봉합이 가능하여 지지체의 물성을 향상시키므로 치조골 또는 치주인대의 재생뿐만 아니라 정형외과 영역의 골재생 촉진 기질로서 유용하게 사용될 수 있다.

유도 조직 재생, 생분해, 다공성, 지지체, 실크층, 면역반응, 치조골, 치주인대

Description

유도 조직 재생을 위한 다공성 지지체 및 그의 제조방법{POROUS SUPPORT FOR GUIDED TISSUE REGENERATION AND A METHOD OF MANUFACTURING SAME}

본 발명은 유도 조직 재생(guided tissue regeneration), 특히 치주조직의 재생을 유도하기 위한 생분해성의 다공성 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

치아를 지지하는 치주조직은 크게 치조골, 치주 인대조직 및 결체조직으로 이루어진다. 치주염의 진행으로 인한 치조골의 소실은 치주 인대조직의 상실을 동반하며, 치주염 치료 후 소실된 조직 부위에서는 결체조직의 과다생장으로 인해 치조골과 치주 인대조직의 정상적인 회복이 불가능해진다. 나아가 새로운 뼈가 생성되더라도 치주 인대조직이 정상적으로 분화되지 않아 치아기능상실을 유발할 수 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해 치조골 재생술로 자가골이식술(autografting)과 함께 인위적인 차폐막을 이용하여 조직의 재생 또는 신형성을 유도하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다.

대표적으로, 대한민국 특허 제0464930호는 키토산 부직포 사이에 다공성 생분해성 고분자막(폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산 중합체 및 폴리카프로락톤)이 샌드위치된 조직재생 유도용 차폐막을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제0563476호는 폴리인산 또는 폴리인산염을 함유하는 골조직 형성을 촉진하기 위한 골재생 재료를 개시하고 있으며, 대한민국 특허 제0341243호는 락트산 또는 락트산과 글리콜산의 공중합체, 트리칼슘인산 세라믹 또는 하이드록시아파타이트, 및 성장인자를 이용하여 차폐막을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허 제0564366호는 천연 고분자와 합성 고분자의 혼합물로부터 제조되는 조직 재생용 차폐막을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제0262142호는 폴리글리콜산계 섬유로 제조된 망사에 생분해성 합성 고분자(폴리락트산, 폴리락트-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시부티르산 등)를 도포한 다음 여기에 성장인자 또는 약물이 함유된 마이크로스피어(microsphere)를 압착시켜 얻어진 치주조직 재생유도용 생분해성 차폐막을 개시하고 있다. 그러나 키토산 및 합성고분자는 생체적합성 측면에서 천연 고분자에 비해 체내 염증반응이 많이 유발되는 문제점이 있고, 천연 고분자는 높은 생체 적합성과 낮은 항원성 등의 장점은 있으나 물성이 약하고 염증부위에서 빨리 분해되어 치료 효율이 떨어지는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 이식시 우려되는 면역반응을 줄이고 생체조직과 좀더 유사하면서 조직친화성 및 물성이 우수한 치주조직 재생유도용 생분해성 지지체를 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 직조된 실크로 제조된 실크층, 콜라겐 스폰지층 및 임의적으로 나노하이드록시아파타이트 및/또는 골형성 단백질을 이용한 코팅 및/또 는 차폐층으로 구성된 다공성 지지체가 치주조직 재생 및 기계적 물성면에서 우수하고 이식 후 면역반응을 거의 일으키지 않음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 단독으로 혹은 세포를 배양하여 체내에 이식될 수 있고, 이식 후에는 면역거부 반응이 거의 일어나지 않아 생착율이 높으면서도 기계적 물성이 우수하며, 생분해가 가능하여 부가적인 제거수술이 필요하지 않는, 유도 조직 재생을 위한 다공성 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유도 조직 재생을 위한 다공성 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 1) 세리신이 제거된 직조된 실크로 형성된 실크층; 및 2) 상기 실크층상에 형성된 콜라겐 스폰지층을 포함하는, 유도 조직 재생용 다공성 지지체를 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 1) 세리신이 제거된 직조된 실크를 이용하여 실크층을 형성하는 단계; 2) 단계 1)의 실크층에 콜라겐을 도포한 다음 동결건조시켜 콜라겐 스폰지층을 형성하는 단계; 및 3) 단계 2)의 결과적인 구조물을 가교결합시키는 단계를 포함하는, 유도 조직 재생용 다공성 지지체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다공성 지지체는, 생분해가 가능하여 부가적인 제거수술이 필요하지 않고, 조직 재생 및 기계적 물성 측면에서 우수할 뿐만 아니라 합성 고분자 지지체 또는 천연-합성 고분자 지지체에 비해 이식 후 면역반응을 거의 일으키지 않아 생체적합성이 우수하며, 직조된 실크가 사용되어 봉합이 가능하여 지지체의 물성을 향상시키므로 치조골 또는 치주인대의 재생뿐만 아니라 정형외과 영역의 골재생 촉진 기질로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 1) 세리신이 제거된 직조된 실크로 형성된 실크층; 및 2) 상기 실크층상에 형성된 콜라겐 스폰지층을 포함하는, 유도 조직 재생용 다공성 지지체를 제공한다.

실크층은 염증반응을 일으키는 세리신이 제거된 직조된 실크로 형성된다. 세리신이 제거된 직조된 실크는 봉합이 가능하여 지지체의 물성을 향상시키고, 체내에 이식된 후에도 염증반응을 유발함이 없이 주위 조직과 융화가 잘되며 일정 기간이 지난 후에는 스스로 분해되어 이물질로 남지 않는다. 예를 들면, 직경 300 - 500 ㎛의 실크섬유를 직조기를 이용하여 면형태의 기질로 직조한 다음 소다 회(Na₂CO₃), 수산화나트륨(NaOH)과 같은 알칼리염으로 처리하여 세리신을 제거할 수 있다. 실크층의 두께는 1 내지 2 mm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

실크층은 나노하이드록시아파타이트 및/또는 골형성 단백질로 코팅될 수 있다.

이때, 나노하이드록시아파타이트는 콜라겐과 함께 실제 골의 기질을 구성하는 주요 성분으로 골세포의 활성을 촉진하고 콜라겐과 결합하여 줄기세포의 골세포분화를 촉진시킨다. 이를 위해 나노하이드록시아파타이트는 1 내지 1000 nm의 입경을 가질 수 있다.

골형성 단백질(bone morphogeneic protein, BMP)은 골형성을 촉진하기 위해 사용되는 것으로, BMP-2 또는 BMP-12가 사용될 수 있다.

콜라겐 스폰지층은 다공성으로서 세포의 부착, 이동 및 증식을 촉진시킨다.

콜라겐 스폰지층은 콜라겐 단독 또는 콜라겐과 히아론산 및/또는 글리코사미노글리칸의 혼합물을 이용하여 형성될 수 있다.

콜라겐은 나노하이드록시아파타이트와 함께 실제 골의 기질을 구성하는 주요 성분으로 골세포의 활성을 촉진시키며 나노하이드록시아파타이트와 결합하여 줄기세포의 골세포 분화를 촉진한다.

콜라겐은 불용성 콜라겐과 가용성 콜라겐이 모두 이용될 수 있으며, 소와 같은 포유동물로부터 유래하거나 경골어류의 피부와 같은 해양생물로부터 유래한 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 무색소 피부를 갖는 어류, 가장 바람직하게는 가자미류, 예를 들어 서대, 문치가자미, 터봇, 브릴과 같은 어류가 이용될 수 있다.

히아론산은 골분화를 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 분자량이 180 내지 200만인 히아론산이 사용될 수 있다.

글리코사미노글리칸은 콜라겐간에 가교 역할을 수행하며, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파란, 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 다공성 지지체는 콜라겐 스폰지층 또는 실크층의 일면에 차폐층을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 차폐층은 실크층과 접촉하도록 형성될 수 있다.

차폐층은 다른 연조직 세포의 침입을 억제하는 작용을 수행하며, 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막, 젤라틴막 등이 이용될 수 있으며 일반적으로 0.5 내지 1 mm의 두께를 가질 수 있다. 다른 연조직 세포의 침입을 억제할 수 있다면 특별히 제약되지는 않는다.

본 발명의 일 실시양태에 따른 다공성 지지체의 개략적인 단면 및 사진이 도 1 및 도 2에 각각 도시되어 있다.

본 발명에 따른 다공성 지지체에 치수세포를 배양하여 골분화를 유도한 결과 골분화가 촉진되었으며, 이를 누드마우스에 이식한 결과, 골형성이 촉진되었을 뿐만 아니라, 염증세포가 거의 관찰되지 않았으며, 기계적 강도 또한 우수한 것으로 확인되었다.

상술한 본 발명에 따른 유도 조직 재생용 다공성 지지체는 1) 세리신이 제거된 직조된 실크를 이용하여 실크층을 형성하는 단계; 2) 단계 1)의 실크층에 콜라겐을 도포한 다음 동결건조시켜 콜라겐 스폰지층을 형성하는 단계; 및 3) 단계 2)의 결과적인 구조물을 가교결합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 달리 언급이 없는 한 상술한 다공성 지지체에 대한 설명이 그대로 적용된다.

구체적으로, 단계 1)에서는, 직조된 실크에서 세리신을 제거하고 세정제를 이용하여 세척하여 실크층을 형성한다. 실크층은 두께가 대략 1 내지 2 mm일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

세리신의 제거는 소다회, 수산화나트륨과 같은 알칼리염을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 0.02 내지 0.1 M, 바람직하게는 0.02 내지 0.05M의 소다회가 사용될 수 있고, 염증반응을 야기하는 세리신을 충분히 제거하기 위해 100℃에서 8시간 동안 소다회로 처리할 수 있다.

나노하이드록시아파타이트는 1 내지 1000 nm의 입경을 가질 수 있고, 0.1 내지 0.2 g/ml, 바람직하게는 0.15 g/ml의 농도로 사용될 수 있다.

골형성 단백질은 예를 들어 1 ㎍/ml의 골형성 단백질을 카보디이미드 가교시약에 용해시켜 실크층에 200 ng/cm²의 농도로 코팅될 수 있다. 바람직하게는 골형성 단백질은 BMP-2 또는 BMP-12일 수 있다.

나노하이드록시아파타이트와 골형성 단백질을 함께 코팅하는 경우에는 골형성 단백질의 손실을 최소화하기 위해 먼저 나노하이드록시아파타이트를 코팅하고 4 내지 20℃에서, 바람직하게는 4℃에서, 24 내지 48시간 동안, 바람직하게는 48시간 동안 건조한 다음 골형성 단백질을 코팅하고 상기와 동일 조건하에 건조하는 것이 바람직하다.

단계 2)에서는, 단계 1)에서 얻어진 실크층 또는 나노하이드록시아파타이트 및/또는 골형성 단백질로 코팅된 실크층에 콜라겐을 도포한 다음 동결건조시켜 다공성의 콜라겐 스폰지층을 형성한다. 콜라겐 스폰지층은 다공성으로서 세포의 부착, 이동 및 증식을 촉진시킨다. 콜라겐은 콜라겐 단독 또는 콜라겐과 히아론산 및/또는 글리코사미노글리칸의 혼합물 형태로 사용될 수 있다.

바람직하게는, 콜라겐을 2% (w/v)미만, 바람직하게는 1 내지 1.5% (w/v)농도로 산성용액에 용해시켜 크림형태의 용액을 제조한 다음 히아론산 용액과 글리코사미노글리칸 용액과 혼합하여 사용될 수 있다. 이때, 히아론산은 5 내지 15% (v/v), 바람직하게는 10% (v/v)의 농도로 사용될 수 있고, 글리코사미노글리칸은 0.5 내지 5%(v/v), 바람직하게는 1%(v/v)의 농도로 사용될 수 있다. 산성용액으로는 초산 또는 염산 수용액이 사용될 수 있으며, 산성용액의 농도는 0.001 내지 0.01 M이 바람직하다.

동결건조는 -50 내지 -80℃ 조건에서 수행될 수 있다.

단계 3)에서 가교결합은 물리적 또는 화학적으로 수행될 수 있으며, 물리적 가교결합의 경우에는 진공하에 100 내지 110℃에서 열건조(예를 들면, 105℃에서 72시간 동안)시키거나, 4 내지 25℃의 온도 및 5 내지 20W의 전력조건하에 UV 조사(예를 들면, 4℃ 및 10W의 조건에서 254 nm의 UV를 4 시간 동안 조사)시켜 수행될 수 있고, 화학적 가교결합의 경우에는 4 내지 25℃에서 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 또는 카보디이미드를 처리하여 수행될 수 있다. 이러한 가교결합은 12 내지 24시간 동안 수행될 수 있다.

단계 3) 이후에 콜라겐 스폰지층 또는 실크층의 일면에 차폐층을 추가로 형성할 수 있으며, 바람직하게는, 차폐층을 실크층과 접촉하도록 형성할 수 있다.

차폐층은 다른 연조직 세포의 침입을 억제하는 작용을 수행하며, 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막, 젤라틴막 등이 이용될 수 있으며, 두께는 0.5 내지 1 mm일 수 있다. 다른 연조직 세포의 침입을 억제할 수 있다면 특별히 제약되지는 않는다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 치수세포(dental pulp stem cells)의 배양 및 분석

치주는 발치되어 버리는 사랑니를 환자의 동의하에 실험에 이용하였다. 발치한 치아를 무혈청 배지(DMEM, Gibco, 미국)에 담아 냉장상태(4 내지 8℃)로 실험실로 운반해 온 다음 치아를 70% 에탄올에 30초간 세척하고 항생제(antibiotic-antimycotic agent: 100 unit/ml penicillin G sodium, 100 unit/ml streptomycin sulfate, 0.25 ㎍/ml amphotericine B; WellGen, 한국)가 들어있는 PBS 용액으로 3분간 충분히 세척하였다.

이후, 치아를 반으로 쪼개어 치수 조직을 치아로부터 분리한 후 4 mg/ml의 프로테이즈(P-3417, Sigma, 미국)와 3 mg/ml의 콜라겐에이즈(Sigma)가 1:1로 혼합된 효소 용액에 넣고 4℃ 냉장실에서 12시간 동안 보관했다. 치수 조직을 0.25% 트립신 용액(3 ml)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 30 rpm으로 10 내지 15분간 교반하여 세포-조직간을 느슨하게 하고 우태아 혈청(FBS; BioWhittaker^TM, CAMBREX, 미국)이 10% 첨가된 α-MEM(alpha Modified Eagle's Medium, Sigma) 배지로 트립신 작용을 멈추게 한 다음 약 30회 정도 피펫팅하여 조직으로부터 치수세포를 분리하였다.

분리된 치수세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 α-MEM 배지에서 37℃에서 7일간 일차 배양하였으며, 이틀에 한번씩 동일배지로 교체하면서 동일 배양조건으로 배양하였다.

도 3a는 발치된 사랑니에서 얻은 치수조직 및 일차 배양된 치수세포를 도시하고 있으며, 도 3b는 치수세포가 줄기세포 특성을 가짐을 보여주는 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 결과를 도시하고 있다.

<실시예 2> 실크층의 제조

실크(Won Corporation, 한국)를 직조기를 이용하여 메쉬타입으로 직조한 후 세리신을 제거하기 위해 0.02 M Na₂CO₃ 용액에 이어 0.3% 아이보리 세정제에 넣어 세척하였다. 증류수로 3일간 세정한 후 4℃에서 건조시켜 실크층을 형성하였다.

<실시예 3> 다공성 지지체의 제조 및 평가 (1)

1% (w/v) 아텔로 콜라겐(바이오랜드, 한국)에 1% (w/v) 히아론산(NovaMatrix, 노르웨이)과 0.1% (w/v) 콘드란틴 설페이트(sigma, 미국)를 혼합하여 약 5분간 균질화(homogenization)시킨 다음 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 6.8-7.2로 조절된 콜라겐 용액을 제조하였다. 이때 콜라겐 용액은 하기와 같이 구분하여 제조하였다: 1) 콜라겐 : 히아론산 = 4 ml : 0 ml, 2) 콜라겐 : 히아론산 = 4 ml : 0.4 ml, 3) 콜라겐 : 히아론산 = 4 ml : 1 ml.

이렇게 제조된 콜라겐 용액을 실시예 2에서 얻어진 실크층상에 도포하고 -80℃에서 동결건조시켰다.

이후, 가교를 위해 먼저 콜라겐이 도포된 실크층을 50 mM 모포린에탄설폰 산(2-morpholineoethane sulfonic acid; MES, Fluka Chemic AG, pH 5.5)이 포함된 20 ml의 40% (v/v) 에탄올로 30분간 처리한 다음, 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5), 24 mM 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, Fluka Chemic AG) 및 5 mM 하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide, Fluka Chemic AG)가 포함된 40% (v/v) 에탄올로 12시간 동안 처리하였다. 이후, 0.1 M 인산수소나트륨(Na₂HPO_4,pH 9.0)으로 12시간, 1 M 염화나트륨으로 6 시간, 2 M 염화나트륨으로 2일간, 3차 증류수로 2일간 순차적으로 세척하였다.

이후, -80℃에서 다시 동결건조하고 지름 6 mm의 펀치로 지지체 샘플을 제조한 다음 10 KGy의 감마조사(γ-irradiation)로 멸균하여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

앞서 제조한 지지체 샘플상에 실시예 1에서 얻어진 치수세포를 5 × 10⁵세포의 농도로 접종하였다. 접종 후, 지지체 샘플을, 10% 우태아 혈청(FBS; BioWhittaker^TM, CAMBREX) 및 항생제(100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 1 μg/ml 암포테리신, Invitrogen)를 함유한 증식용 α-MEM 배지에서 2주간, 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양한 다음, 여기에 0.1 μM 덱사메타손, 10 mM 베타글루타알데하이드, 및 0.05 mM 아스코르빈산 2-인산(Asc 2-P, Sigma)을 첨가하여 분화배지를 제조하고 4주간 37℃, 5% CO₂ 조건으로 추가 배양하였다.

치수세포를 접종하고 배양 후 10일째에 지지체 샘플을 12-웰 플레이트에 넣고 각각의 웰에 MTT 용액(0.33 mg/ml DMEM) 1 ml를 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 이후, MTT 용액을 제거하고 0.04 N 염산으로 산성화된 1 ml의 이소프로판올을 넣어 실온에서 20분간 추출하였다. 추출된 용액을 분광 광도계(spectrophotometer, Amersham Pharmarcia)를 이용하여 540 nm의 파장에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 모든 지지체에서 치수세포가 잘 증식하고 있으며, 특히, 히아론산이 함유된 지지체에서 치수세포가 더욱더 잘 증식함을 알 수 있다.

아울러, 분화유도 배양이 끝난 후 지지체 샘플을 RT-PCR을 통해 골세포에서 많이 발현되는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로 잘 알려진 제1형 콜라겐, 제3형 콜라겐, 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin), 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 등에 대해 mRNA 발현 수준을 측정하였다. RNA 분리는 Trizol(Sigma)을 사용하였다. 얻어진 총 RNA(total RNA)는 분광 광도계(spectrophotometer, Amersham Pharmarcia)를 사용하여 정량한 후 동량의 총 RNA를 헥사머 프라이머(Promega, 미국)와 superscript II 역전사효소(Gibco BRL)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR을 위해 미리 혼합된 PCR 키트(Kisan Biotech.)를 사용하였으며, 전기영동으로 발현양상을 관찰하였다. 그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 모든 지지체에서 골세포에서 많이 발현되는 세포외 기질인 제3형 콜라겐, 오스테오폰틴 등이 잘 발현되는 것을 알 수 있으며, 특히 0.4 ml의 히아론산이 함유된 지지체에서 더욱더 잘 발현되는 것을 확인 할 수 있다.

한편, 지지체의 세포적합성과 골세포로의 분화를 확인하기 위해, 4주간의 분화 후 지지체 샘플을 누드마우스의 등(back)에 포켓 이식하였다. 이를 위해, 먼저 럼푼(Yuhan Corp., 한국)과 케타민(Byer Korea Ltd., 한국)을 1:9 비율로 섞은 후 약 300㎕를 복강 주사하여 마취하고 마우스 등을 포비돈으로 제균하였다. 이후 표피층을 절제한 후 근막위에 지지체를 포켓이식하고 수술 부위를 봉합사로 6 군데 봉합하였다. 헤마톡실린-에오신(hematoxylin/eosin, H/E) 염색과 면역화학적 염색(본코사(Vonkossa))을 수행하기 위해, 봉합 후 8주 후에 수술부위를 절개하여 지지체를 꺼내고 이를 4% 포름알데히드 용액으로 고정한 다음 알콜을 이용하여 탈수, 자일렌으로 청명, 파라핀으로 포매하여 절단하였다. 절단하여 얻은 절편에 대해 조직검사를 수행하고, H/E 및 본코사 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 조직 검사는 조직검사학 (전국임상병리교수협의회, 고려의학 1992)과 병리조직특수염색도감(김주호, 신광출판사 1993)을 참고하여 실시하였다.

그 결과, 도 4c 및 4d에 나타낸 바와 같이, 모든 지지체에서 칼슘 침착이 관찰되었으며, 특히 0.4 ml의 히아론산이 함유된 지지체에서 칼슘 침착이 더욱더 잘 이루어져 H/E 및 본코사 발현이 더욱 잘 됨에 따라 골 분화에 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 4> 다공성 지지체의 제조 및 평가(2)

0.001N HCl에 나노하이드록시아파타이트를 0 g/ml, 0.03 g/ml, 0.15 g/ml, 0.3 g/ml의 농도로 혼합하여 현탁액을 제조하고 여기에 실시예 2에서 제조한 실크층을 담근 다음 꺼내어 공기 중에서 건조시켰다. 실크층에 나노하이드록시아파타이트를 코팅하고 건조시키는 작업을 2 내지 3회 반복한 다음 1% 아텔로 콜라겐을 도포하고 -80℃에서 동결건조하였다.

이후, 가교를 위해 먼저 실크층을 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5)이 포함된 20 ml의 40% (v/v) 에탄올로 30분간 처리하고, 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5), 24 mM 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드 및 5 mM 하이드록시석신이미드가 포함된 40% (v/v) 에탄올로 12시간 동안 처리하였다. 이후, 0.1 M 인산수소나트륨(Na₂HPO_4,pH 9.0)으로 12시간, 1 M 염화나트륨으로 6 시간, 2 M 염화나트륨으로 2일간, 3차 증류수로 2일간 순차적으로 세척하였다.

이후, -80℃에서 다시 동결건조한 뒤 지름 6 mm의 펀치로 일정한 크기의 지지체 샘플을 제조한 다음 10 KGy의 감마조사(γ-irradiation)로 멸균하여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

이렇게 제조된 지지체 샘플에 실시예 1에서 제조한 치수세포를 2.8 × 10⁶세포의 농도로 접종하고, 실시예 3과 동일한 방식으로 세포증식 및 분화를 유도하였다.

배양 3일 및 3주 후에 MTT 분석을 수행한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방식으로 지지체 샘플에 대해 MTT 분석 및 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, 모든 지지체에서 세포가 잘 증식하는 것으로 나타났으며, 골세포에서 많이 발현되는 세포외 기질인 제3형 콜라겐, 파이브로넥틴, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 오스테오폰틴, 오스테오프로테게린, BMP-2 등이 잘 발현되는 것을 알 수 있다. 특히 0.15 g/ml의 나노하이드록시아파타이트가 코팅된 지지체에서 세포가 더욱더 잘 증식하고 세포외 기질들이 더 많이 발현되는 것으로 나타났다.

한편, 4주간의 분화 유도후 실시예 3과 동일한 방식으로 지지체 샘플을 누드마우스의 등(back)에 포켓 이식을 한 후 8주차에 생검을 통하여 조직검사를 수행하고, H/E 염색과 본코사 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이, 모든 지지체에서 칼슘 침착이 잘 이루어져 H/E 및 본코사 발현이 잘 됨을 확인할 수 있으며, 특히 0.15 g/ml의 나노하이드록시아파타이트가 코팅된 지지체에서 칼슘 침착이 더욱더 잘 이루어져 H/E 및 본코사 발현이 더욱 잘 됨에 따라 골 분화에 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 5> 다공성 지지체의 제조 및 평가 (3)

200 ng/cm²의 BMP-2를 실시예 2에서 제조한 실크층에 코팅하고, 1% 아텔로 콜라겐을 도포한 후 -80℃에서 동결건조하였다. 한편, 실시예 2에서 제조한 실크층상에, BMP-2를 코팅함이 없이 1% 아텔로 콜라겐을 도포하고 동일조건으로 동결건조 하였다.

이후, 가교를 위해 결과적인 구조물을 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5)이 포함된 20 ml의 40% (v/v) 에탄올로 30분간 처리하고, 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5), 24 mM 에틸디메틸아미노프로필카보디이미드 및 5 mM 하이드록시석신이미드가 포함된 40% (v/v) 에탄올로 12시간 동안 처리하였다. 이후 0.1 M 인산수소나트륨(Na₂HPO_4,pH 9.0)으로 12시간, 1 M 염화나트륨으로 6 시간, 2 M 염화나트륨으로 2일간, 및 3차 증류수로 2일간 순차적으로 세척하였다. -80℃에서 다시 동결건조하고 지름 6 mm의 펀치로 지지체 샘플을 제조한 다음 10 KGy의 감마조사(γ-irradiation)로 멸균하여 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

앞서 제조한 지지체 샘플상에 실시예 1에서 제조한 치수세포를 2 × 10⁶세포 농도로 접종하고, 실시예 3과 동일한 방식으로 세포증식 및 분화를 유도하였다.

치수세포를 접종하고 배양 3일 후에 MTT 분석을 수행한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방식으로 지지체 샘플에 대해 MTT 분석 및 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 모든 지지체에서 세포가 잘 증식하고 골세포에서 많이 발현되는 세포외 기질인 제3형 콜라겐, 오스테오칼신 등이 잘 발현되는 것을 알 수 있으며, 특히 BMP-2가 도포된 지지체에서 세포가 더욱더 잘 증식하고 세포외 기질들이 더욱더 잘 발현되는 것을 알 수 있다.

한편, 4주간의 분화 유도후 실시예 3과 동일한 방식으로 지지체 샘플을 누드마우스의 등(back)에 포켓 이식을 한 후 8주차에 생검을 통하여 조직검사를 수행하 고, 본코사 염색, 오스테오넥틴 염색 및 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 6c 및 도 6d에 나타낸 바와 같이, 모든 지지체에서 칼슘 침착이 잘 이루어져 본코사, 오스테오넥틴 및 알시안 블루 발현이 잘 되는 것으로 나타났으며, 특히 BMP-2가 도포된 지지체에서 칼슘 침착이 더 잘 이루어져 본코사, 오스테오넥틴 및 알시안 블루 발현이 더 잘 됨에 따라 골 분화에 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 6> 다공성 지지체의 제조 및 평가 (4)

0.15 g/ml의 나노하이드록시아파타이트와 1 ㎍/ml의 BMP-2를 실시예 2에서 제조한 실크층에 코팅하였다. 실크층의 코팅면에 1% 아텔로 콜라겐을 도포하여 -80℃에서 동결건조하고 가교결합을 수행한 다음, 실크층의 타면에 양막을 부착하였다. 한편, 실시예 2에서 제조한 실크층의 일면에 나노하이드록시아파타이트 및 BMP-2를 이용한 코팅없이 상기와 동일한 실험을 수행하였다.

가교결합은 하기의 방식으로 수행되었다. 즉, 구조체를 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5)이 포함된 20 ml의 40% (v/v) 에탄올로 30분간 처리한 다음, 50 mM 모포린에탄설폰산(MES, pH 5.5), 24 mM 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드 및 5 mM 하이드록시석신이미드가 포함된 40% (v/v) 에탄올로 12시간 동안 처리하였다. 이후, 0.1 M 인산수소나트륨(Na₂HPO_4,pH 9.0)으로 12시간, 1 M 염화나트륨으로 6 시간, 2 M 염화나트륨으로 2일간, 3차 증류수로 2일간 순차적으로 세척하였다.

양막을 부착한 후 -80℃에서 다시 동결건조한 다음 지름 6 mm의 펀치로 지지체 샘플을 제조한 다음 10 KGy의 감마조사(γ-irradiation)로 멸균하여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

이렇게 제조된 지지체 샘플에 실시예 1에서 제조한 치수세포를 1 × 10⁶세포의 농도로 접종하고, 실시예 3과 동일한 방식으로 세포증식 및 분화를 유도하였다.

분화유도 배양이 끝난 후 지지체 샘플을 실시예 3과 동일한 방식으로 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 모든 지지체에서, 골세포에서 많이 발현되는 세포외기질인 제1형 콜라겐, 제3형 콜라겐, 오스테오넥틴, 오스테오프로테게린, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 등이 잘 발현되는 것을 확인할 수 있으며, 특히 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2가 도포된 지지체에서 더욱더 잘 발현되는 것을 알 수 있다.

한편, 4주간의 분화 유도후 실시예 3과 동일한 방식으로 지지체 샘플을 누드마우스의 등(back)에 포켓 이식을 한 후 8주차에 생검을 통하여 조직검사를 수행하고, H/E 염색과 본코사 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 7b 및 도 7c에 나타낸 바와 같이, 모든 지지체에서 칼슘 침착이 잘 이루어져 H/E 및 본코사 발현이 잘 됨을 알 수 있으며, 특히 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2가 코팅된 지지체에서 칼슘 침착이 더 잘 이루어지고 H/E 및 본코사 발현이 더 잘 됨에 따라 골분화에 더 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 7> 염증반응시험

먼저, 비교예로서, 세리신이 제거된 직조된 실크로 이루어진 실크층 대신에, 수술용 봉합사와 다양한 생체재료로 이용되는 PGA(polyglycolic acid, 삼양사, 한국)로 형성된 PGA층과 실크 섬유(원산업, 한국)로 형성된 실크 섬유층을 형성하고 히아론산 0.4 ㎖를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방식으로 다공성 지지체를 제조하였다.

앞서 제조한 PGA층을 포함한 다공성 지지체 및 실크 섬유층을 포함하는 다공성 지지체와, 본 발명에 따라 실시예 3에서 히아론산 0.4 ㎖를 사용하여 제조한 다공성 지지체를 10 KGy의 감마조사(γ-irradiation)로 멸균하였다.

실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방식으로 누드 마우스의 등(back)에 포켓이식한 후 2주째에 조직 검사를 실시하였다.

그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, PGA층을 포함한 다공성 지지체 및 실크 섬유층을 포함하는 다공성 지지체에서는 많은 염증세포가 관찰되었으나, 본 발명에 따라 제조된 다공성 지지체에서는 염증세포가 거의 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 세리신이 제거된 실크층을 포함하는 다공성 지지체는 체내에 이식하여도 염증반응이 현저히 줄어듬을 알 수 있다.

<실시예 8> 인장강도 시험

먼저, 비교예로서, 실크층을 형성하지 않고 나노하이드록시아파타이트 및 BMP-2를 이용한 코팅없이 실시예 6과 동일한 방식으로 다공성 지지체를 제조하였다.

앞서 제조한 다공성 지지체와 본 발명에 따라 실시예 6에서 나노하이드록시아파타이트 및 BMP-2를 이용한 코팅없이 제조한 다공성 지지체를 10mm × 5mm의 크기로 준비한 다음 인장강도측정기(H5KT, HOUNSFIELD, 영국)를 이용하여 2 mm/분(10% 변형률속(strain rate))의 속도로 인장강도를 측정하였다.

그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 다공성 지지체의 인장강도가 40 ± 8 N로서, 이는 비교예로서 제조한 다공성 지지체(2 ± 0.5 N)에 비해 약 20배 정도 강한 물성을 지닌 것으로 나타났다.

도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 일 실시양태에 따른 다공성 지지체의 개략적인 단면 및 사진이다.

도 3a는 발치된 사랑니에서 얻은 치수조직 및 이로부터 분리 배양된 치수세포의 사진이다.

도 3b는 치수세포가 줄기세포임을 보여주는 FACS 결과이다.

도 4a는 히아론산(HA)을 농도별로 콜라겐과 혼합하여 실크층에 도포하여 얻어진 다공성 지지체상에 치수세포를 접종한 다음 배양 10일 후에 세포증식을 보여주는 MTT 분석 결과이다.

도 4b는 도 4a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양한 후 RT-PCR을 통하여 골관련 mRNA 발현 양상을 확인한 결과이다:

(a) 히아론산 무첨가군, (b) 히아론산 0.4 ml 첨가군,

(c) 히아론산 1 ml 첨가군.

도 4c는 도 4a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양하고 누드마우스의 등(back)에 포켓이식한 다음 8주차에 생검을 한 사진이다:

A: 히아론산 무첨가군, B: 히아론산 0.4 ml 첨가군,

C: 히아론산 1 ml 첨가군.

도 4d는 도 4c의 생검된 조직을 H/E 염색 및 본코사(Vonkossa) 염색한 결과(200배)이다:

(a): 히아론산 무첨가군, (b) 히아론산 0.4 ml 첨가군,

(c) 히아론산 1 ml 첨가군.

도 5a는 나노하이드록시아파타이트가 농도별로 함유된 다공성 지지체에 치수세포를 접종하고 배양 3일과 3주 후에 MTT분석을 통하여 세포의 증식을 확인한 결과이다.

도 5b는 도 5a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양한 후 RT-PCR을 통하여 골관련 mRNA 발현 양상을 확인한 결과이다:

(a) 나노하이드록시아파타이트 무첨가군,

(b) 나노하이드록시아파타이트 0.03g/ml 처리군,

(c) 나노하이드록시아파타이트 0.15g/ml 처리군,

(d) 나노하이드록시아파타이트 0.3g/ml 처리군.

도 5c는 도 5a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양하고 누드마우스의 등(back)에 포켓이식한 다음 8주차에 생검을 한 사진이다:

A: 나노하이드록시아파타이트 무첨가군,

B: 나노하이드록시아파타이트 0.03g/ml 처리군,

C: 나노하이드록시아파타이트 0.15g/ml 처리군,

D: 나노하이드록시아파타이트 0.3g/ml 처리군.

도 5d는 도 5c의 생검된 조직을 H/E 염색 및 본코사(Vonkossa) 염색한 결과(200배)이다:

(a) 나노하이드록시아파타이트 무첨가군,

(b) 나노하이드록시아파타이트 0.03g/ml 처리군,

(c) 나노하이드록시아파타이트 0.15g/ml 처리군,

(d) 나노하이드록시아파타이트 0.3g/ml 처리군.

도 6a는 골형성 단백질(BMP-2)이 도포된 다공성 지지체에 치주세포를 접종하고 배양 3일후에 MTT 분석을 통해 세포의 증식을 확인한 결과이다.

도 6b는 도 6a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양한 후 RT-PCR을 통하여 골관련 mRNA 발현 양상을 확인한 결과이다:

(a) BMP-2 무처리군, (b) BMP-2 처리군

도 6c는 도 6a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양하고 누드마우스의 등(back)에 포켓이식한 다음 8주차에 생검을 한 사진이다:

A, C: BMP-2 무처리군, B, D: BMP-2 처리군

도 6d는 도 6c의 생검된 조직을 H/E 염색 및 본코사(Vonkossa) 염색한 결과(200배)이다:

A, B: 본코사 염색(200배), C, D: 오스테오넥틴 염색(400배)

E, F: 알시안 블루 염색(400배)

도 7a는 나노하이드록시아파타이트와 골형성유도단백질(BMP-2)이 도포된 다공성 지지체에 치수세포를 접종하고 골분화유도 배지에서 4주간 배양한 다음 RT-PCR을 통하여 골관련 mRNA 발현 양상을 확인한 결과이다:

(a) 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2 무처리군,

(b) 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2 처리군.

도 7b는 도 7a의 다공성 지지체를 분화배지에서 4주간 배양하고 누드마우스 의 등(back)에 포켓이식한 다음 8주차에 생검을 한 사진이다:

A: 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2 무처리군,

B: 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2 처리군.

도 7c는 도 7b의 생검된 조직을 H/E 염색 및 본코사(Vonkossa) 염색한 결과(200배)이다:

(a) 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2 무처리군,

(b) 나노하이드록시아파타이트와 BMP-2 처리군.

도 8a는 본 발명에 따라 실시예 3에서 제조한 다공성 지지체와 비교예로서 세리신이 제거된 직조된 실크층 대신 PGA층 및 실크 섬유층을 포함하는 다공성 지지체들을 누드마우스의 등(back)에 포켓이식한 다음 2주차에 염증정도를 확인한 현미경 사진이다:

(a) PGA를 이식한 시험군

(b) 실크섬유를 이식한 시험군

(c) 세리신이 제거된 직조된 실크를 이식한 시험군.

도 8b는 본 발명에 따라 실시예 6에서 제조한 다공성 지지체와 비교예로서 실크층이 배제된 다공성 지지체의 인장강도를 측정한 결과이다:

Claims

1) 세리신이 제거된 직조된 실크로 형성되고, 나노하이드록시아파타이트 및 골형성 단백질 BMP-2로 코팅된 실크층; 및

2) 상기 실크층상에 형성된 콜라겐 스폰지층

을 포함하는, 유도 조직 재생용 다공성 지지체.

삭제

제 1 항에 있어서,

상기 콜라겐 스폰지층이 콜라겐 단독 또는 콜라겐과 히아론산 및 글리코사미노글리칸으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 성분의 혼합물을 이용하여 형성되는 것을 특징으로 하는 다공성 지지체.

제 1 항에 있어서,

상기 조직이 치조골 및 치주인대로 구성된 군으로부터 선택되는 치주조직인 것을 특징으로 하는 다공성 지지체.

제 1 항에 있어서,

상기 실크층 또는 콜라겐 스폰지층의 일면에 차폐층을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 지지체.

제 6 항에 있어서,

상기 차폐층이 상기 실크층에 접하도록 형성되는 것을 특징으로 하는 다공성 지지체.

제 6 항에 있어서,

상기 차폐층이 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막 및 젤라틴막으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 다공성 지지체.

1) 세리신이 제거된 직조된 실크를 이용하여 실크층을 형성하는 단계;

2) 단계 1)의 실크층에 콜라겐을 도포한 다음 동결건조시켜 콜라겐 스폰지층을 형성하는 단계; 및

3) 단계 2)의 실크층 및 콜라겐 스폰지층을 가교결합시키는 단계

를 포함하는, 유도 조직 재생용 다공성 지지체를 제조하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 단계 1)에서, 소다회 및 수산화나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 알칼리염을 이용하여 세리신을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 단계 1) 이후에, 실크층을 나노하이드록시아파타이트 및 골형성 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 성분으로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 11 항에 있어서,

상기 실크층에 나노하이드록시아파타이트를 코팅한 다음 골형성 단백질을 코팅하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 11 항에 있어서,

상기 골형성 단백질이 BMP-2 또는 BMP-12인 것을 특징으로 하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 단계 2)에서, 콜라겐이 히아론산 및 글리코사미노글리칸으로 구성된 군으로부터 선택되는 1이상의 성분을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 단계 3)의 가교결합이, 진공하에 열건조 또는 UV 조사에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 단계 3)의 가교결합이 가교제의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 16 항에 있어서,

상기 가교제가 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 및 카보디이미드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 단계 3) 이후에, 실크층 또는 콜라겐 스폰지층의 일면에 차폐층을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 18 항에 있어서,

상기 차폐층이 실크층에 접하도록 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 18 항에 있어서,

상기 차폐층의 형성이 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막 및 젤라틴막으로 이루어진 군으로부터 선택되는 막을 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 9 항에 있어서,

상기 조직이 치조골 및 치주인대로 구성된 군으로부터 선택되는 치주조직인 것을 특징으로 하는 방법.