KR100836559B1 - 염증성 질환 치료 및 예방에 유용한 녹제초 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증성 질환 치료 및 예방에 유용한 녹제초 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 녹제초 추출물 중 알부틴(Arbutin)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시키고, 진통억제, 연골조직에 작용하는 귀부종 억제, 급성 염증억제, 염증 유발 물질의 발현 정도, 효소 p-p38 MAP 및 p-NFκB 단백질 발현양 억제 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료 및 예방에 유용한 약제로 사용할 수 있는 녹제초 추출물에 관한 것이다.

녹제초, 관절염, 급성염증, 귀 부종, p-p38 MAP, p-NFκB, 알부틴

Description

염증성 질환 치료 및 예방에 유용한 녹제초 추출물{Pyrola japonica Klenze extracts compositions for treating or preventing inflammatory diseases}

도 1은 알부틴의 NMR 스팩트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 녹제초 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 녹제초 추출물에 의한 iNOS의 발현 정도를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 녹제초 추출물에 의한 NO의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 녹제초 추출물에 의한 효소 p-p38 MAP 을 억제함을 나타낸 것이다

도 6은 본 발명에 따른 녹제초 추출물에 의한 p-NFκB 단백질 발현양 변화를 나타낸 것이다.

본 발명은 염증성 질환 치료 및 예방에 유용한 녹제초 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 녹제초 추출물 중 알부틴(Arbutin)의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시키고, 진통억제, 연골조직에 작용하는 귀부종 억제, 급성 염증억제, 염증 유발 물질의 발현 정도, 효소 p-p38 MAP 및 p-NFκB 단백질 발현양등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료 및 예방에 유용한 약제로 사용할 수 있는 녹제초 추출물에 관한 것이다.

관절염은 의학적으로 세균이나 외상과 같은 어떤 원인에 의해서 관절 내에 염증성 변화가 생긴 것을 총괄해서 지칭하는 병명이다. 이러한 관절염은 크게 급성과 만성으로 나뉜다.

급성 관절염은 다음과 같이 분류한다. ① 장액성(奬液性) 관절염:보통 외상(外傷)에 의해서 일어나는데 원인불명의 것도 있으며, 대개 하나의 관절에만 발생한다. ② 장액섬유소성(奬液纖維素性) 관절염: 급성관절류머티즘 때에 일어나는데, 관절강 내에 혼탁한 삼출액(渗出液)이 괸다. 섬유소의 위막(僞膜)이 생겨 염증이 가라앉아도 심한 운동장애를 남긴다. ③ 화농성(化膿性) 관절염:관절의 개방창(開放創) 또는 임질·장티푸스·성홍열·패혈증(敗血症) 같은 전염병에 다발성을 보인다. 생후 1 ∼ 2개월의 유아는 뼈가 심하게 상하여 치료할 수 없는 탈구(脫臼)를 일으킨다. 성인에서는 골막골수염에 걸려 화농부가 터져 고름이 관절로 들어가는 것이 많은데, 이를 2차 화농관절염이라고 한다.

만성 관절염은 다음과 같이 분류한다. ① 특수성(特殊性) 염증:결핵성 ·매독성 혹은 중년 이후의 남자에 많은 요산(尿酸)의 대사 장애로 인한 통풍성(痛風性) 관절염이 있다. ② 다발성 관절염 : 만성관절류머티즘에 의한 것이 많은데 급성장액성 관절염에서 이행(移行)되거나 결핵·매독·임질의 경과 중에 다발성으로 나타나기도 하며 패혈증의 하나인 것도 있다. 그밖에 스틸병(病)이라는 관절염도 포함된다. ③ 변형성 골관절염 : 뼈나 관절의 노화 또는 외상이 원인이다. ④ 혈우병성(血友病性) 관절염 : 혈우병을 앓을 때 관절 내의 출혈에 의한 것이다.

상기한 바와 같은 관절염으로 대표되는 염증성 변화에 의한 질환의 치료를 목적으로 많은 약제들이 개발되고 있다.

한편, 녹제초(Pyrola japonica Klenze)는 한약재로 이미 수천년 전부터 민간에서 널리 사용하고 있으며, 백대하에 유효하고 생리를 정상으로 유도하기 위하여 음료수로 복용할 수 있으며, 기관지염, 유선염, 편도선염, 등의 일반적인 염증에 효과적인 것으로 잘 알려져 있다. 또한 다리나 무릎에 무력감이 올 때에도 응용되었고 반신불수 하지마비, 손발이 차거나 저린데, 허리와 어께 통증 등에 달여서 내복하거나 혹은 술에 넣었다가 복용하여 왔다. 이들 증상은 현대 병리학적 개념으로 보면 만성 류마티스 관절염을 포함한 일반적 관절염의 증상과 유사하다.

이러한 녹제초는 약명이고 우리말로는 노루발톱풀이라고 하며, 백합과의 다년생 초본으로, 우리나라 전역의 산기슭 능선 부근에 대개는 모여서 큰 군락을 형성하고 자생한다. 한편 녹제초의 잎을 채취하여, 햇볕에 말린 것을 악재로 사 용하여 온 무독한 한방 생약이다.

지금까지 알려진 녹제초의 성분으로는 피롤라틴(Pirolatin), 치마필린(Chimaphillin), 모노트로페인(Monotropein), 알부틴(arbutin), 퀘르세틴(quercetin), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 알파-시토스테롤(α-sitosterlo), 우로솔 산(ursolic acid), 올레아놀 산(oleanolic acid) 등이 가장 널리 알려져 있다[대한본초학회지(본초분과학회지), 13권, 1호, pp 95 ∼118, 신민교, 송호준, 변종호, 손인경, 노병규].

또한, 예로부터 동의보감, 향약집성방 및 광제비급 등의 기성 한약서나 관련문헌에서 상기한 녹제초를 단방 생약으로서의 처방하고 있으나, 이러한 처방은 녹제초의 외형상의 형태감별 방법 및 한방의학적 약효와 탕액의 제조방법에 관한 간단한 언급에 불과하였다. 즉, 상기 제시된 방법을 통해 추출된 성분 중 약효를 발현하는 유효활성 성분들에 관한 의견은 얻을 수 없었다.

그리고, 녹제초는 산지 및 채취시기별로 지표성분의 함량편차가 크게 나타나기 때문에 추출물의 규격화가 어렵고, 소염진통, 혈액순환 개선, 관절염 치료 등의 활성이 우수한 활성 분획을 재현성 있게 얻을 수 없어서 상품화가 곤란하다는 사실도 해결하여야할 문제점으로 남아있다.

이에 본 발명의 발명자들의 상기와 같은 문제점을 해결하여 염증성 변화에 의한 제증상의 억제로서, 소염 진통작용, 급성염증억제 관절조직 분해효소 억제 작 용, 효소 p-p38 MAP 및 p-NFκB 단백질 발현양 억제 및 급성부종억제 등의 효과가 우수한 특정 성분 및 이의 함량 조절에 따른 녹제초 추출물의 규격화를 달성하기 위하여 연구 노력하였다.

이러한 본 발명의 연구 결과에 따르면, 녹제초 추출물 중 알부틴을 일정함량 포함하는 녹제초 추출물을 용이하고 재현성 있게 얻을 수 있어 상품화가 가능함을 알게 되었다.

따라서, 본 발명은 염증성 질환 치료 및 예방에 유용한 녹제초 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 상기한 녹제초 추출물 중 지표물질로서 알부틴의 함량이 특정 범위로 포함된 녹제초 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 지표물질로 알부틴(Arbutin)이 0.1∼1.0 중량% 함유되어 있는 녹제초(Pyrola japonica Klenze) 추출물인 염증성 질환의 치료 및 예방용 약제를 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 녹제초 추출물 중 알부틴의 함량이 일정범위로 포함되도록 규격화 및 표준화시켜 진통억제, 급성염증억제, 효소 p-p38 MAP 및 p-NFκB 단백질 발현양 억제, 급성부종억제 등의 염증성 변화에 의하여 나타나는 제증상의 억제 효과가 우수하게 발현되어 관절염 등의 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용한 약제에 적용할 수 있는 녹제초 추출물에 관한 것이다.

이는 원 생약에 함유된 유효 생리 활성물질의 함량이 산지, 채취시기, 보관기간 및 보관상태 등에 따라 크게 달라질 수 있으므로 각 생약조성물의 조성을 한정함에 있어 사용성분의 중량비의 한정보다는 특정 유효물질의 함량을 한정하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 유효 생리 활성물질의 함량에 따라 관절보호 생리활성에 커다란 차이를 나타낸다.

따라서, 본 발명에서는 약효 발현을 극대화하는 녹제초 추출물을 얻기 위한 지표물질로서 종래 제안된 바 없는 알부틴(arbutin)을 선정한 것이다. 상기 알부틴(arbutin)의 활성으로는 미백작용, 항산화 활성, 항균 활성 및 항통풍 작용 등이 알려져 있다[(이영노, 원색한국식물도감, 교학사, 592p(1998), 안덕균, 원색한국본초도감, 교학사(1998), 이우철, 원색한국기준식물도감, 아카데미서적(1996), 이창복, 대한식물도감, 향문사(1979), 정태현, 한국식물도감, 신지사(1958)].

본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제 중에 사용되는 녹제초 추출물은 녹제초로부터 추출한 추출물 자체(생약 엑기스)나, 녹제초 추출물로부터 특정 활성분획을 추출하여 선택 사용할 수 있다. 이때의 배합비율은 원생약인 녹제초의 함량과는 관계없이 지표물질인 알부틴(arbutin)의 함량으로 결정되는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 경우 상기 지표물질인 알부틴(arbutin)이 약제에 사용된 녹제초 추출물 중 0.1 ∼ 1.0 중량% 함유되어 있을 때 목적하는 약효를 얻을 수 있었다. 이때, 상기 알부틴(arbutin) 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 관절염 등의 치료에 상대적으로 저조한 결과를 얻게 된다. 또한 본 발명에서 상기 알부틴(arbutin)의 함량의 상한 범위에 대해 특별한 제한은 두지 않으나, 다만 일정수준 이상을 초과하여 알부틴(arbutin)이 함유하게 되면 효과가 더 이상 증가하지 않을 뿐만 아니라 제조하기에도 기술적, 경제적 측면에서 바람직하지 않으므로 0.5 중량% 정도 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 지표물질로 선정한 알부틴(arbutin)은 본 발명의 염증성 변화에 의한 질환 치료용 약제의 중요한 성분이며, 일정 함량범위로 함유되어 있을 때 약효 상승효과를 발현하여 보다 강력한 약효를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에서 얻은 약제의 유효성분으로서 상기 성분 이외에의 기타 다른 성분의 작용을 배제할 수는 없다.

본 발명에 따른 염증성 변화에 의한 질환 치료에 유효한 녹제초 추출물의 제조방법을 간단하게 설명하면 다음과 같다.

1) 세척, 건조 및 절단한 녹제초 원생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물 또는 알콜 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하고, 다시 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과하는 단계; 2) 상기 1)에서 얻어진 여액을 동량의 알콜 수용액으로 층분리한 후 60 ∼ 80 ℃ 로 감압 농축하는 단계, 및, 3) 상기 2)의 농축물에 상기 2)의 감압 농축시 회수된 알콜을 가한 후 500 ∼ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 감압 농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하는 단계를 포함하여 이루어진다.

이를 상세하게 설명하면, 세척 및 건조하고, 세절한 녹제초 원생약에 물 또 는 알콜 수용액을 가하고 2 ∼ 3 시간, 2 ∼ 5 회 반복하여 추출하며, 상온에서 서서히 냉각시킨 후 원심분리 등의 방법으로 여과하여 잔사와 분리한다. 상기 잔사에 상기 혼합 생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물 또는 알콜 수용액을 가하고 가온하여 재추출한 후 여과한 다음, 이전의 여액과 혼합하여 여과한다. 상기와 같이 잔사에 물 또는 알콜 수용액을 가하여 재추출 및 여과함으로써 추출 효율을 높일 수 있다. 이때, 추출에 사용되는 물 또는 알콜 수용액의 사용량이 너무 적으면 추출물의 용해도가 나빠져서 추출효율이 떨어지고, 사용량이 너무 많으면 층분리에 사용하는 알콜 수용액의 사용량이 증가하고, 감압 농축 시간이 오래 걸리는 등의 경제적이지 못하거나 취급상의 문제가 생길 수 있다.

본 발명에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택하였는데, 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 ∼ 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌고, 3차 이상의 다단계 추출은 경제성이 없는 것으로 판단된다.

상기와 같이 1, 2차에 걸쳐 물 또는 알콜 수용액로 추출하여 얻은 추출액은 여과 및 농축한 다음, 여액 중에 함유된 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제하는데, 본 발명에서는 여액과 동량의 알콜 수용액을 용매로 사용량 2 ∼ 5 회 층 분리를 실시하여 용매 분획을 얻음으로써 불순물을 정제한다.

상기 알콜로는 탄소수 1 내지 6개의 알콜이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 % 에탄올 수용액을 사용하는데, 저급 알콜 수용액 사용량이 여액에 비하여 적을 경우에는 지방산 등의 불필요한 성분들에 의한 미립자가 형성되어 층 분리가 원활하지 못할 뿐만 아니라 유효활성 성분의 추출 함량이 낮아지게 되므로 효율적이지 못하다.

상기 알콜은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 지방족, 방향족 알콜이 모두 사용 가능하며, 바람직하기로는 지방족 알콜 보다 바람직하기로는 탄소수 1 ∼ 6의 저급 알콜을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 층분리한 추출액은 60 ∼ 80 ℃에서 감압 농축하여 잔존하는 용매를 제거하며, 이렇게 얻어진 농축물에 상기 감압 농축시 회수된 알콜을 가한 후 500 ∼ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 가하여 농축물을 혼탁시킨 다음 재차 감압 농축시킨다.

이렇게 얻어진 농축물을 60 ∼ 80 ℃에서 0.08 ∼ 0.3 pa로 진공건조시킨 후 30 ∼ 200 메쉬로 분쇄 및 멸균하여 분말상의 녹제초 추출물을 얻는데, 이러한 녹제초 추출물은 관절염 등의 치료 작용이 우수하여, 이 추출물을 포함하는 생약제는 관절 보호제로 유용하리라 기대된다.

본 발명에 따른 녹제초 추출물을 통상의 제조방법으로 제형화하여 정제, 캅셀제 주사제 등을 제조하는데, 이들 중 정제 제조시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 상기 녹제초 추출물을 1 : 1의 비율로 사용하면 관절염 등의 염증성 변화에 의한 질환 치료에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.

이러한 의약물로 제조시에는 생약추출 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(dilute)등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 또는 주사제 등으로 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 녹제초 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 녹제초 추출물은 체중 1kg당 200 ~ 400 mg 정도를 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 녹제초 추출물의 제조

물로 세척하고 잘 건조시킨 녹제초를 30% 에탄올 수용액을 가하여 잘 교반하여 주면서 2시간 단위로 2회 열탕추출 하였다. 상기 추출 물질을 상온으로 서서히 냉각한 후 원심여과하여 찌꺼기를 제거한 후 여액을 병합하여 60 ∼ 80 ℃에 서 감압 농축 하였다.

상기한 에탄올 분획을 통하여 회수된 에탄올을 상기 농축물에 가한 후 농축물을 충분히 현탁시킨 후 5000 rpm으로 원심여과한 여액을 다시 감압농축한 다음 60 ℃, 0.08pa 조건으로 진공건조시킨 후 80 메쉬로 분쇄 과정을 거쳐 멸균시켰다. 상기한 방법으로 추출, 정제한 녹제초 추출물 중 알부틴의 함량은 0.5 중량% 이었다. 또한, 상기 방법으로 얻어진 녹제초 추출물을 다음과 같은 조건으로 HPLC 분석하였다[도 1].

1) 전개용매(Eluent) = MeOH : Formic acid 0.04% (v/v) = 90:10

2) 컬럼 : ZORBAX SB-C18 4.6 X 250 mm, 3.5 um

3) 유속 : 0.6 mL/min

4) 컬럼온도 : 25℃

5) 검출기 : UV 280 nm

실험예 1 : TPA 유도 귀부종 테스트( TPA - induced mouse ear edema .)

상기 실시예에 의해 제조된 녹제초 추출물에 대한 TPA 유도 귀부종 테스트(TPA-induced mouse ear edema)를 실시하였고, 그 결과는 두께와 6mm 펀치를 이용하여 그 무게를 측정 하여 표 1, 표 2에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 1]

24 시간 절식시킨 7 주령 된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 Sk Joins 제품을 400, 200 mg/Kg, 녹제초 추출물 400, 200, 20 mg/Kg 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 TPA(2.5 ㎍/20 ㎕)는 아세톤(Aceton)에 녹인 후, 오른쪽 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 4 시간 뒤 각 실험구 별로 귀 부종의 두께 측정하였고, 부종의 무게를 확인 하고자, 6mm 펀치를 이용하여 염증 유발된 오른쪽 귀와 염증이 유발되지 않은 왼쪽 귀의 부종의 무게 차이를 측정하였다. 측정 시에는 경추 탈골법을 이용하여 실험체를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다.

처리	귀의 두께± 표준편차	부종 억제율(%)
Control	0.675 ± 0.025	-
Sk Joins제품 400 mg	0.317 ± 0.075	53 %
Sk Joins제품 200 mg	0.395 ± 0.045	41 %
녹제초(400 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	0.346 ± 0.023	49 %
녹제초(200 mg/kg-알부틴함량 0.5중량%)	0.405 ± 0.066	40 %
녹제초(20 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	0.666 ± 0.013	1 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ± S.T.D (n=12) 2. Control : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

처리	귀의 무게± 표준편차	부종 억제율(%)
Control	15.92 ± 0.78	-
Sk Joins제품 400mg	8.62 ± 1.62	46 %
Sk Joins제품 200mg	11.69 ± 1.1	27 %
녹제초(400 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	11.52 ± 1.13	28 %
녹제초(200 mg/kg-알부틴함량 0.5중량%)	11.74 ± 1.39	26 %
녹제초(20 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	15.14 ± 1.03	5 %
1. Data represent the mean of difference in ear weight(mg) ± S.T.D (n=12) 2. Control : 부종유발후 약제 무처리 실험 구. 오른쪽귀와 왼쪽 귀의 무게 차이

상기 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 사용한 경우 TPA 유도 귀 부종 억제효과가 우수하며, 특히 녹제초 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 TPA 유도 귀 부종 억제율이 가장 바람직함을 알 수 있고, 표 2에서 귀 부종 무게의 경우 400 mg/kg에서 가장 효과적으로 억제 효과가 나타났다.

실험예 2 : 아라키돈산(Arachidonic acid) 유도 귀 부종 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema assay)

상기 실시예에 의해 제조된 녹제초 추출물에 대한 아라키돈산 유도 귀 부종 테스트(Arachidonic acid-induced mouse ear edema)를 실시하였고, 그 결과는 부종의 두께의 경우 다음 표 3에, 부종의 무게의 경우 표 4에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 2]

24 시간 절식시킨 7주령 된 ICR 마우스를 각 실험구별로 분리한 후 Sk Joins제품 400, 200 mg/Kg, 녹제초 추출물 400, 200, 20 mg/Kg 을 경구 투여 후 1 시간 뒤 아라키돈산을 아세톤(2 mg/20 ㎕)에 녹여 주어 귀에 부종을 유발하였다. 부종 유발 시 실험자는 실험체를 뒤에서 완전히 고정 후 2차 실험자가 마이크로 피펫을 이용하여 귀에 부종 유발 물질을 자극해 주었다. 그 후 1 시간 뒤 각 실험구 별로 귀 부종의 두께 측정하였고, 부종의 무게를 확인 하고자, 6 mm 펀치를 이용하여 염증 유발된 오른쪽 귀와 염증이 유발되지 않은 왼쪽 귀의 부종의 무게 차이를 측정하였다. 측정 시에는 경추 탈골법을 이용하여 실험체를 도태 시킨 후 정확한 측정을 유도하였다.

처리	귀의 두께± 표준편차	부종 억제율(%)
Control	0.554 ± 0.012	-
Sk Joins제품 400 mg	0.267 ± 0.022	52 %
Sk Joins제품 200 mg	0.3 ± 0.021	46 %
녹제초(400 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	0.299 ± 0.049	46 %
녹제초(200 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	0.352 ± 0.034	36 %
녹제초(20 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	0.557 ± 0.015	-1 %
1. Data represent the mean of difference in ear thickness(mm) ± S.T.D (n=12) 2. cCntrol : 부종유발후 약제 무처리 실험 구

처리	귀의 무게 ± 표준편차	부종 억제율(%)
control	15.2 ± 0.79	-
Sk Joins제품 400 mg	9.39 ± 1.33	38 %
Sk Joins제품 200 mg	10.91 ± 0.73	28 %
녹제초(400 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	9.91 ± 1.72	35 %
녹제초(200 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	10.79 ± 1.05	29 %
녹제초(20 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	13.99 ± 0.68	8 %
1. Data represent the mean of difference in ear weight(mg) ± S.T.D (n=12) 2. control : 부종유발후 약제 무처리 실험 구. 오른쪽귀와 왼쪽 귀의 무게 차이

상기 표 3에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 사용한 경우 아라키돈산 유도 귀 부종 억제효과가 우수하며, 특히 녹제초 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 아라키돈산 유도 귀 부종 억제율이 가장 바람직함을 알 수 있고, 표 4에서 보는 바와 같이 귀 부종 무게의 경우 400mg/kg에서 억제 효과가 나타났다.

실험예 3 : 아세트산 유도 스트레칭 테스트(Acetic acid-induced writhing response in mice.)

상기 실시예에 의해 제조된 녹제초 추출물에 대한 아세트산 유도 스트레칭 테스트(Acetic acid-induced writhing response in mice)를 실시하였고, 그 결과는 다음 표 5 에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 3]

본 실험은 "Siegmund"의 실험 방법을 참조하여 24 시간 절식시킨 7주령 된 ICR 마우스를 각 생약 후보별로 분리한 후 Sk Joins제품을 400, 200 mg/Kg, 녹제초 추출물 400, 200, 20 mg/Kg을 경구 투여 1시간 후 아세트산(0.7%)의 복강 내 투여(0.1ml/10 g)로 장기의 염증을 유발하였다. 10분 후 10 분 동안 마우스의 스트레칭(streching)을 관찰하여 통각 지표로 사용하였다.

처리	비틀림 횟수± 표준편차 (Writhing number)	진통 억제율(%)
Control	34.63 ± 1.6	-
Sk Joins제품 400 mg	17.5 ± 1.92	49 %
Sk Joins제품 200 mg	19.88 ± 1.46	43 %
녹제초(400 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	18 ± 0.75	48 %
녹제초(200 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	19.25 ± 0.88	44 %
녹제초(20 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	33.38 ± 0.74	4 %
1. Data represent the mean of difference in writhing number ± S.T.D (n=12) 2. Control : 아세트산 투여 후 약제 무처리 실험 구

상기 표 5에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 사용한 경우 아세트산으로 유도 진통의 억제효과가 우수하며, 특히 녹제초 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 아세트산 유도 스트레칭 억제 효과가 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 4 : 급성 관절염 치료효과 검정

상기 실시예에 의해 제조된 녹제초 추출물에 대한 급성 관절염 치료효과 검정을 실시하였고, 그 결과는 다음 표 6에 나타낸 바와 같다.

[실험방법 4]

24 시간 절식시킨 수컷 SD계 레트(200 g 내외)에 미리 조제한 Sk Joins제품을 400, 200 mg/Kg, 녹제초 추출물 400, 200, 100 mg/Kg의 농도로 만들어 1ml 경구 투여하고 1% 카라기난 생리식염수 100 ㎕를 좌측 족저부에 주사하여 급성 족부 부종을 유도하였다. 부종은 플레티스모메터(plethysmometer, Ugo Basile 7140)를 이용하여 3시간 후의 발 용적을 측정 하였다.

처리	염증 유발율 ± 표준오차
Control	89 ± 1.67
Sk Joins제품 400 mg	43 ± 3.9
Sk Joins제품 200 mg	47 ± 3.45
녹제초(400 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	44 ± 3.68
녹제초(200 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	49 ± 4.82
녹제초(100 mg/kg-알부틴함량 0.5 중량%)	72 ± 0.58
1. Data represent the mean of difference in paw edema(ml) ± S.E.M (n=12) 2. Control : 부종유발 후 약제 무처리 실험 구

상기 표 6에서 보는 바와 같이 본 발명에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 사용한 경우 카라기난으로 유도된 급성 관절염 치료효과가 우수하며, 특히 녹제초 추출물 400 mg/kg 농도일 경우 급성 관절염 치료효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 5 : NO , iNOS 생성에 미치는 영향

상기 실시예에 의해 제조된 녹제초 추출물에 대한 염증 관련 인자 억제효과 검정을 실시하였고, 그 결과는 다음 도 3, 도 4에 나타낸 바와 같다

[실험방법]

마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 ㎍/ml)로 처리한 후 24시간 경과 후에 배양액을 모아 효소법 및 라디칼 크로마토그래피법을 이용하고 LPS 처리 후 4시간 경과 후 세포를 용해(Lysis)시키고 iNOS 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용해서 체내 염증유발 분자인 산화질소(nitric oxide, NO), 유발형 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 생성량에 미치는 녹제초 추출물의 영향을 검색하였다. NO는 24시간 배양액 100 ㎕를 취하고 그리스(Griess)시액을 100 ㎕ 씩 혼합하여 OD 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. iNOS는 Raw 264.7 세포주에 LPS(1 ㎍/ml)로 처리한 후 4시간 경과 뒤에 용해(Lysis)시켜 모은 총 단백질(total protein)들을 전기영동과 전환(Transfer)한 다음, iNOS 항체를 가지고 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다. LPS에 의한 대식세포의 NO 생성을 억제하였다.

도 3에서 나타낸 바와 같이, iNOS의 생성억제 효과를 볼 수 있으며, 도 4에서는 LPS에 의한 대식세포의 NO 생성을 억제를 확인하여, 녹제초가 우수한 항염증 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 6 : 녹제초 추출물의 p- p38 MAP 효소의 활성화 와 p- NF κB 단백질의 발현량 변화에 미치는 영향

상기 실시예에 의해 제조된 녹제초 추출물에 대한 효소 관련 인자 치료효과 검정 및 p-NFκB 단백질의 발현량 분석을 실시하였고, 그 결과는 다음 도 5, 도 6에 나타낸 바와 같다

[실험방법 6]

웨스턴 블랏 (Western Blot Analysis)

녹제초 추출물과 함께 처리된 LPS 세포를 PBS로 세척하고, 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 30분간 용해시켰다.

용해물을 4 ℃, 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리 하였고, 상층액을 래밀리 버퍼(Laemmli buffer)에 2회 녹여 SDS-PAGE로 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전이 시켰다.

1차 항체(primary antibodies)로 토끼의 항-iNOS(anti-iNOS), 항 - 포스포-p38(anti-phospho-p38), 항-포스포-NF-κB(anti-phospho-NF-κB) 또는 다른 항체를 사용하였고, 2차 항체(secondary antibodies)로는 호오스래디쉬 퍼옥시다제-결합된(Horseradish peroxidase-conjugated) 항체를 사용하였다. 밴드 검출은 화학형광물질(chemiluminescence, ECL) 검출 시스템을 사용하였다.

도 5에서 나타낸 바와 같이, p-p38 MAP 키나제(kinase)를 억제함을 볼 수 있으며, 도 6에서는 p-NFκB 단백질의 억제함을 확인하였다.

제조예 1 : 정제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

녹제초 추출물 200 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 유당 101 mg, 포비돈 12 mg, 무수에탄올 적량.

제조예 2 : 연고제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

녹제초 추출물 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알콜 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량.

제조예 3 : 주사제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.

[조성]

녹제초 추출물 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트류 25 mg, 주사용 정제수 2974 mg

제조예 4 : 경피제의 제조

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 녹제초 추출물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경피제를 제조하였다.

[조성]

녹제초 추출물 0.4 g, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화알루미늄 0.004 g, 메틸 파라벤 0.2 g, 물 14 g.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면 염증성 변화에 의한 제증상의 억제로서, 소염 진통작용, 연골조직에 작용하는 귀부종 억제, 급성 염증억제, 염증 유발 물질의 발현 정도, 효소 p-p38 MAP 및 p-NFκB 단백질 발현양 억제 등의 효과가 우수한 물질로서 알부틴의 함량 조절에 따른 녹제초 추출물의 규격화를 달성할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 녹제초 추출물은 녹제초로부터 추출 조제된 것으로 알부틴을 지표물질로서 선정하여 지표물질의 함량 조절을 통하여 관절염 치료활성을 약제를 제조할 수 있다.

Claims (3)

1. 녹제초(Pyrola japonica Klenze) 추출물로서, 지표물질인 알부틴(Arbutin)이 0.1 ~ 1.0 중량%가 함유되도록 농축한 녹제초 추출물인 것임을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 약제.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 녹제초 추출물은

   1) 녹제초 원생약 중량의 5 ∼ 8 배량의 물, 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출, 냉각 및 여과하는 단계;

   2) 상기에서 얻어진 여액을 알콜 수용액으로 층분리한 후 60 ∼ 80 ℃ 로 감압 농축하는 단계, 및

   3) 상기에서 얻어진 농축물에, 알콜을 가한 후 500 ∼ 1,000 rpm으로 원심분리한 여액을 감압 농축, 진공건조, 분쇄 및 멸균하는 단계를 포함하여 이루어진 과정으로부터 추출된 지표물질인 알부틴(Arbutin)이 0.1 ∼ 1.0중량% 함유된 분말인 것임을 특징으로 하는 약제.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염 및 부종인 것임을 특징으로 하는 약제.

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