KR100786987B1 - Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 ｌ-아미노산 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-아미노산 생산능이 있지만, ybjE 유전자의 발현이 증강되도록 변형된 미생물을 배양하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 L-아미노산은 배양 배지로부터 수거하거나 미생물로부터 수거한다.

ybjE 유전자, L-아미노산, L-아미노산 배출능, 코리네폼 세균, 메틸로필러스, 메틸로바실러스

Description

Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 Ｌ-아미노산 생산 방법{L-Amino acid-producing microorganism and method for producing L-amino acid}

본 발명은 미생물을 이용한 발효에 의해 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-트레오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-시스테인 및 L-글루탐산과 같은 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 L-아미노산은 산업상 유용하다. 즉, L-리신, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-프롤린은 동물 사료 첨가제, 건강 식품 성분 및 아미노산 주입물로서 유용하다. L-아르기닌과 L-오르니틴은 간기능 촉진제, 아미노산 주입물 및 종합 아미노산 제제의 성분으로서 유용하다. L-히스티딘은 간기능 촉진제 및 히스타민 전구물질로서 유용하다. L-페닐알라닌은 감미제 전구물질로서 유용하다.

L-아미노산은 공업적으로 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 에스케리치아(Escherichia) 속 등에 속하는 미생물을 이용한 발효에 의해 생산된다.

L-리신 생산방법은 EP 0857784A, JP 11-192088A, WO 00/53726 및 WO 96/17930에 보고되어 있다. L-아르기닌 생산방법은 EP 0999267A, EP 1170358A 및 JP 2002-017342A에 보고되어 있다. 이와 같이 보고된 방법에서는 염기성 L-아미노산 생산 세균 균주로서, 천연 분리 균주 또는 이의 인공 변이 균주는 물론 염기성 L-아미노산 생합성 효소의 활성이 강화된 재조합 균주 등이 사용되었다.

또한, 저렴한 비용으로 대량 발효에 유용한 메탄올을 원료로 한 L-아미노산 생산방법은 메틸로필러스(Methylophilus) 또는 메틸로바실러스(Methylobacillus) 속에 속하는 돌연변이 또는 유전자 변형된 미생물 균주를 이용한 방법으로서 보고되었다(WO 00/61723 및 JP 2001-120269A).

세균 세포의 L-아미노산 흡수 또는 배출을 변형시키는 방법은 세균의 L-아미노산 생산능을 증강시키는 것으로 알려졌다. L-아미노산 흡수 변형방법으로는 L-아미노산이 세포로 흡수되는 것을 제거 또는 감소시켜 L-아미노산 생산능을 증강시키는 방법이 있다. 구체적으로, 이러한 방법에는 L-글루탐산의 흡수를 제거하거나 약화시키기 위해 gluABCD 오페론 또는 이의 일부를 결실시키는 방법이 있다(EP 1038970A).

배출인자(exporter) 변형 방법에는 L-아미노산 생합성용 중간체 또는 기질의 배출을 제거 또는 감소시키는 방법 및 생산된 L-아미노산의 배출을 향상시키는 방법이 있다. L-글루탐산 생합성 중간체의 배출을 제거하거나 감소시키는 방법으로서, α-케토글루타르산의 배출을 감소시키기 위해 α-케토글루타레이트 퍼미아제 유전자를 변이 또는 파괴시키는 방법은 공지되어 있다(WO 01/005959).

L-아미노산 배출을 증강시키는 방법으로서, L-리신(WO 97/23597) 또는 L-아르기닌(미국 특허 공개 제2003-0113899호)을 생산하기 위해 코리네박테리움 세균 균주에서 lysE(염기성 L-아미노산 배출인자의 유전자; J.Mol.Microbiol.Biotechnol., 1999 Nov; 1(2): 327-36)를 증강시키는 방법이 공지되었다. L-아미노산의 배출에 연관이 있는 것으로 추정된 rhtA, B, C 유전자(JP2000-189177A) 및 yfiK, yahN 유전자(EP 1016710A)의 발현을 에스케리치아 세균의 세포에서 증강시키는 방법도 공지되었다.

염기성 L-아미노산의 배출에 관여하는 유전자로서, 전술한 lysE 유전자는 공지되어 있다. 하지만, lysE 유전자가 메틸로필러스 세균과 같은 메탄올 동화 세균에서 증폭되어, 수득되는 균주가 L-리신 또는 L-아르기닌의 생산에 사용될 때, 코리네폼 세균 유래의 야생형 lysE 유전자는 메틸로필러스 세균에게 치명적이어서, 숙주 미생물을 성장시키는 돌연변이체 lysE 유전자(EP 1266966A)의 도입을 필요로 한다. 하지만, lysE 유전자가 이종 미생물에 도입되는 경우에는 항상 L-리신이나 L-아르기닌을 배출시키는 작용을 하는 것은 아니다. 따라서, 다양한 이종 숙주 미생물에서 L-리신 및 L-아르기닌을 포함하는 L-아미노산을 충분하게 분비하는 능력을 나타내는 L-아미노산 배출인자 및 생산용 유전자의 수득이 당업계에서 요망되는 사항이다.

ybjE 유전자는 예상된 에스케리치아 콜리의 게놈에 존재하고 추정상 표면 단백질을 암호화한다(Science, 277(5331): 1453-74, 1997). 하지만, 이 유전자의 클로닝 및 세균 세포에서의 발현을 통한 유전자 분석은 보고되어 있지 않으며, 이의 생리학적 기능 역시 밝혀진 바가 없다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 L-아미노산을 효율적으로 생산할 수 있는 세균 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 균주를 사용하여 L-아미노산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 전술한 목적을 달성하기 위해 예의 연구한 결과, 고농도 L-리신에 대한 내성에 근거하여 L-아미노산 배출인자의 신규 유전자인 ybjE 유전자를 수득했다. 또한, ybjE 유전자의 발현이 증강된 미생물을 사용하여 L-아미노산, 예컨대 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴 및 L-히스티딘과 같은 염기성 L-아미노산; L-이소류신과 같은 지방족 L-아미노산; L-트레오닌과 같은 히드록실 L-아미노산; L-프롤린과 같은 환상 L-아미노산; L-페닐알라닌과 같은 방향족 L-아미노산; L-시스테인과 같은 황함유 L-아미노산; 및 L-글루탐산과 같은 산성 L-아미노산 등을 효율적으로 생산할 수 있음을 발견했다.

본 발명의 다른 목적은 ybjE 유전자의 발현이 증강되도록 변형시킨, L-아미노산 생산능이 있는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 ybjE 유전자의 발현이 상기 ybjE 유전자의 카피수 증가에 의해 증강되거나 또는 상기 ybjE 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의해 증강된 것임이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 ybjE에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 2, 9 및 10으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 이러한 단백질이 L-아미노산 배출능이 있는 것임이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 ybjE 유전자가,

(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 및

(b) 엄중 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드할 수 있으며 L-아미노산 배출능이 있는 단백질을 암호화하는 DNA

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 ybjE 유전자가,

(a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 49번에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA; 및

(b) 엄중 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 49번에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 서열번호 1의 뉴클레오타이드 49번에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드할 수 있으며 L-아미노산 배출능이 있는 단백질을 암호화하는 DNA

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물의 L-아미노산 배출능이 상기 ybjE 유전자의 발현 증강에 의해 증가되는 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체에 대한 미생물의 내성이 ybjE 유전자의 발현 증강에 의해 증가되는 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-아미노산이 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-트레오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-시스테인 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물이 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 것임이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 엔테로박테리아세애 과에 속하는 미생물이 에스케리치아(Escherichia)속에 속하는 미생물인 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물이 코리네폼(Coryneform) 세균인 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미생물이 메탄올 동화 세균인 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메탄올 동화 세균이 메틸로필러스(Methylophilus) 또는 메틸로바실러스(Methylobacillus) 속에 속하는 미생물인 것이 특징인 전술한 바와 같은 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L-아미노산의 생산 및 축적 유발을 도모하는 배지에서 전술한 바와 같은 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양 배지 또는 미생물로부터 상기 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L-아미노산의 생산 및 축적 유발을 도모하는 주탄소원으로서 메탄올을 함유하는 액체 배지에서 전술한 바와 같은 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배양 배지 또는 미생물로부터 상기 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-아미노산이 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-트레오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-시스테인 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 전술한 바와 같은 생산방법을 제공하는 것이다.

도 1은 에스케리치아 세균에서 ybjE 유전자를 증폭시키기 위한 플라스미드의 구축 설계도를 도시한 것이다.

도 2는 고농도 L-리신의 존재 하에 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 3은 고농도 L-리신의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 파괴 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 4는 메탄올 동화 세균에서 ybjE 유전자를 증폭시키기 위한 플라스미드의 구축 설계도를 도시한 것이다.

도 5는 메탄올 동화 세균을 사용하여 L-리신을 생산하기 위한 플라스미드의 구축 설계도를 도시한 것이다.

도 6은 L-리신 유사체의 존재 하에 메틸로필러스 메틸로트로퍼스(Methylophilus methylotrophus)의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 7은 고농도 L-이소류신의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 8은 고농도 L-글루타메이트의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 9는 고농도 L-트레오닌의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 10은 고농도 L-히스티딘의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 11은 고농도 L-프롤린의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 12는 고농도 L-오르니틴의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 13은 고농도 L-페닐알라닌의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 14는 고농도 L-시스테인의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 15는 고농도 L-아르기닌의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

도 16은 고농도 L-리신의 존재 하에 에스케리치아 콜리의 대조 균주 및 ybjE (948bp 또는 900bp) 유전자 증폭 균주의 성장 곡선을 도시한 것이다.

바람직한 양태의 상세한 설명

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

<1> 본 발명의 미생물

본 발명의 미생물은 L-아미노산 생산능이 있고, ybjE 유전자의 발현이 증강되도록 변형된 것이다. 본 명세서에 사용된 "L-아미노산을 생산하는 능력(L-아미노산 생산능)"이란 표현은 본 발명의 미생물이 배지에서 배양된 경우 배지 또는 미생물의 세포에 L-아미노산을 축적시키는 능력을 의미한다. 본 발명의 미생물은 다양한 종류의 L-아미노산을 생산하는 능력이 있을 수 있다. L-아미노산 생산능이 있는 미생물은 본래 L-아미노산 생산능이 있는 미생물이거나, 또는 이하에 언급되는 바와 같은 미생물의 모균주를 돌연변이유발법이나 재조합 DNA 기법을 사용하여 L-아미노산 생산능이 있도록 변형시켜 수득한 미생물일 수 있다. 또한, 본 발명의 미생물은 ybjE 유전자 발현의 증강을 통해 L-아미노산 생산능을 수득한 미생물일 수 있다.

본 발명에서 생산하고자 하는 L-아미노산은 특별한 제한은 없고, L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘 및 L-시트룰린과 같은 염기성 L-아미노산; L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신 및 L-글리신과 같은 지방족 L-아미노산; L-트레오닌 및 L-세린과 같은 히드록실 L-아미노산; L-프롤린과 같은 환상 L-아미노산; L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판과 같은 방향족 L-아미노산; L-시스테인, L-시스틴 및 L-메티오닌과 같은 함황 L-아미노산; 및 L-글루탐산, L-아르파르긴산, L-글루타민 및 L-이스파라긴과 같은 산성 L-아미노산 및 이의 아미드 등을 포함한다. 본 발명의 미생물은 이러한 L-아미노산을 2종류 이상 생산하는 능력이 있을 수 있다.

<L-아미노산 생산능 부여>

본 발명에 사용되는 L-아미노산 생산능이 있는 미생물의 예는 이하에 설명하는 바와 같다. 하지만, 이러한 미생물들은 이러한 예들에만 제한되는 것이 아니고, L-아미노산 생산능이 있는 것이면 어떤 미생물이어도 된다.

또한, 본 발명의 미생물 모균주로는, 에스케리치아균, 판토에아(Pantoea)균 또는 코리네폼(Coryneform)균 등과 같은 엔테로박테리아세애 과가 사용될 수 있다. 또한, 메탄올로부터 L-아미노산을 생산할 수 있는 메틸로필러스균 및 메틸로바실러스균과 같은 메탄올 동화균도 사용될 수 있다. 구체적으로, 모균주의 예에는 예컨대 에스케리치아, 판토에아, 엔테로박터(Enterobacer), 크렙시엘라(Krebsiella), 세라티아(Serratia), 에르위니아(Erwinia), 살모넬라(Salmonella) 및 모르가넬라(Morganella) 속에 속하는 세균, 기타 알리시클로바실러스균 및 바실러스균을 포함 하는 다른 세균을 포함하는 γ-프로테오박테리아에 속하는 엔테로박테리아세애 과 a, 및 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida) 속 등에 속하는 효모 등이 있다. 이러한 모균주는 본래 ybjE 유전자를 보유하거나 보유하지 않을 수 있고, ybjE 유전자가 도입되었을 때 개선된 L-아미노산 배출능을 나타낸다.

나이드하르트 등(Neidhardt F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)에 의해 보고된 에스케리치아균, 예컨대 에스케리치아 콜리가 사용될 수 있다. 야생형 에스케리치아 콜리 균주의 예에는 K12 균주 및 이의 유도체, 에스케리치아 콜리 MG1655 균주(ATCC 47076) 및 W3110 균주(ATCC 27325)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 균주들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 주소: 미국 버지니아 20108, 마나사스 사서함 1549)에서 입수할 수 있다.

엔테로박터 세균의 예에는 엔테로박터 어글로머란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등이 있다. 판토에아 균의 예에는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 등이 있다. 본래 엔테로박터 아에로게네스로 분류된 일부 세균은 현재 16S rRNA 분석에 근거하여 판토에아 어글로머란스(Pantoea agglomerans), 판토에아 아나나티스 또는 판토에아 스튜워티(Pantoea stewartii)로 분류되기도 하지만, 본 발명에 사용되는 엔테로박테리아세애 과에 속하는 미생물이면 엔테로박터 균이어도 판토에아 균이어도 무방하다. 판토에아 아나나티스의 구체예에는 판토에아 아나나티스 AJ13355(FERM BP-6614), 판토에아 아나나티스 AJ13356(FERM BP-6615), 판토에아 아나나티스 AJ13601(FERM BP-7207) 및 이의 유도체가 있다. 이러한 균주는 최초 엔테로박터 어글로머란스로 동정되어 기탁되었었지만, 현재는 판토에아 아나나티스로 분류되어 있다.

메틸로필러스(Methylophilus)균의 예에는 메틸로필러스 메틸로트로퍼스(Methylophilus methylotrophus)가 이에 국한됨이 없이 포함되고, 이 메틸로필러스 메틸로트로퍼스의 대표 예에는 AS1 균주(NCIMB10515) 등이 있다. 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 AS1 균주(NCIMB 10515)는 국립산업해양균수집소(주소: 영국 애버딘 AB9 8DG 압베이 로드 135 토리 리서치 스테이션 NCIMB Lts.)에서 입수할 수 있다.

메틸로바실러스 균의 예에는 메틸로바실러스 글리코게네스(Methylobacillus glycogenes), 메틸로바실러스 플라젤라텀(Methylobacillus flagellatum) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 메틸로바실러스 글리코게네스의 예에는 T-11 균주(NCIMB 11375), ATCC 21276 균주, ATCC 21371 균주, ATR80 균주(Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, pp 67-72(1994)), A513 균주(Appl.Microbiol.Biotechnol., vol. 42, pp.67-72(1994)) 등이 있다. 메틸로바실러스 글리코게네스 NCIMB 11375 균주는 국립산업해양균수집소(주소: 영국 애버딘 AB9 8DG 압베이 로드 135 토리 리서치 스테이션 NCIMB Lts.)에서 입수할 수 있다. 메틸로바실러스 플라젤라텀의 예에는 KT 균주(Arch. Microbiol., vol. 149, pp.441-446(1988)) 등이 있다.

코리네폼 균은 버지스 매뉴얼(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., p.599(1974))에 정의된 일군의 미생물로서, 본 발명에 사용될 수 있다. 이 미생물은 포자 형성을 할 수 없는 호기성, 그람 양성의 비산 내성 바실러스로 분류된다. 또한, 코리네폼 균은 과거 브레비박테리움 (Brevibacterium)으로 분류되었었으나 현재는 코리네박테리움 속에 통합된 세균(Int.J.Syst.Bacteriol., 41, 255(1991)), 뿐만 아니라 코리네박테리움 속에 밀접한 관련성이 있는 브레비박테리움 또는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속에 속하는 세균도 포함한다.

이러한 코리네폼 균의 예는 다음과 같다:

코리네박테리움 아세토애시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)

코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum)

코리네박테리움 알칸올리티컴(Corynebacterium alkanolyticum)

코리네박테리움 칼룬내(Corynebacterium callunae)

코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)

코리네박테리움 릴리엄(Corynebacterium lilium)

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes(코리네박테리움 에피션스:Corynebacterium efficiens)

코리네박테리움 헤르큘리스(Corynebacterium herculis)

브레비박테리움 디바리카텀(Brevibacterium divaricatum)

브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum)

브레비박테리움 임마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)

브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)

브레비박테리움 로슘(Brevibacterium roseum)

브레비박테리움 사카로리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)

브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)

코리네박테리움 암모니아겐스(Corynebacterium ammoniagens)

브레비박테리움 앨범(Brevibacterium album)

브레비박테리움 세리넘(Brevibacterium cerinum)

마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum).

구체적으로, 다음과 같은 균주를 예로 들 수 있다:

코리네박테리움 아세토애시도필럼 ATCC 13870

코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC 15806

코리네박테리움 알칸올리티컴 ATCC 21511

코리네박테리움 칼룬내 ATCC 15991

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060

코리네박테리움 릴리엄 ATCC 15990

코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965

코리네박테리움 에피션스 AJ 12340(FERM BP-1539)

코리네박테리움 헤르큘리스 ATCC 13868

브레비박테리움 디바리카텀 ATCC 14020

브레비박테리움 플라범 ATCC 13826, ATCC 14067, AJ 12418(FERM BP-2205)

브레비박테리움 임마리오필럼 ATCC 14068

브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869(코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13869)

브레비박테리움 로슘 ATCC 13825

브레비박테리움 사카로리티컴 ATCC 14066

브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6871, ATCC 6872

브레비박테리움 앨범 ATCC 15111

브레비박테리움 세리넘 ATCC 15112

마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC 15354

이러한 균주들은 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수할 수 있다. 각 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 카탈로그에 기재된 고유 등록 번호를 갖고 있다. 균주는 이러한 등록 번호를 사용하여 정렬할 수도 있다. 또한, AJ12340 균주는 부다페스트 조약 하에 국제 기탁 기관인 국립 생명과학 인간 공학 연구소(산업과학기술청, 국제통상부; 현재, 독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 305-5466 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1-1 츠쿠바 센터 6))에 1987년 10월 27일에 기탁되어, 수탁번호 FERM BP-1539를 부여받았다. AJ12418 균주는 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 국립진보과학기술연구소, 국제특허유기체 기탁국에 1989년 1월 5일에 기탁되어 수탁번호 FERM BP-2205를 부여받았다.

다음은 전술한 바와 같은 모균주에 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법에 대한 설명이다.

L-아미노산 생산능을 부여하기 위한 방법으로는, 통상 사용되는 에스케리치 아 또는 코리네폼 속 세균 등에 속하는 L-아미노산 생산균을 개량하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, L-아미노산 생산능이 있는 영양요구성 변이주, 유사체 내성 균주, 또는 대사 조절 변이주를 수득하는 방법 및 L-아미노산 생합성 효소의 활성을 증강시킨 재조합 균주의 제조 방법이 사용될 수 있다("Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1st Edition, published on May 30,1986, pp. 77-100). 이러한 방법으로 L-아미노산 생산균을 개량하면, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이를 비롯한 하나 이상의 성질이 부여될 수 있다.

재조합 균주를 제조할 때에는, 단일 또는 복수의 L-아미노산 생합성 효소의 활성이 증강될 수 있다. 또한, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이의 성질을 부여하는 방법을 L-아미노산 생합성 효소의 활성을 증강시키는 방법과 조합하여 사용할 수도 있다.

L-아미노산 생산능이 있는 영양요구성 돌연변이 균주, L-아미노산 유사체 내성 균주 또는 대사 조절 변이 균주는 모균주 또는 야생형 균주를 전형적인 돌연변이유발 처리, 예컨대 X선 또는 자외선 조사 처리, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)과 같은 돌연변이유발제로 처리하여 수득할 수 있다. 그 다음, 돌연변이된 균주로부터 영양요구 균주, 유사체 내성 균주 또는 대사 조절 변이 균주를 선발할 수 있다.

L-리신 유사체의 예에는 옥살리신, 리신 히이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로카프로락탐, 노르류신 등이 있다. L- 아르기닌 유사체의 예에는 아르기닌 하이드록사메이트, 호모아르기닌, D-아르기닌, 카나바닌, 아르기닌 하이드록사메이트가 있다.

L-리신 생산능이 있는 L-리신 유사체 내성 균주 또는 대사 조절 변이 균주의 구체예에는 에스케리치아 콜리 AJ11442 균주(FERM BP-1543, NRRL B-12185, JP 56-18596A 및 미국 특허 제4,346,170호), 에스케리치아 콜리 VL611 균주(JP 2000-189180A) 등이 있다. 또한, WC196 균주(WO 96/17930)도 L-리신 생산성 에스케리치아 콜리로서 사용할 수 있다. WC196 균주는 본래 에스케리치아 콜리 K-12 유래의 W3110 균주에 AEC(S-(2-아미노에틸)시스테인) 내성을 부여하여 개량된 균주이다. 이 WC196 균주는 에스케리치아 콜리 AJ13069 균주로 명명되기도 했고, 독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 305-8566 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1-1 츠쿠바 센터 6))에 1994년 12월 6일에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-14690을 부여받았다. 이후, 이 기탁물은 부탁페스트 조약 하의 국제기탁기관으로 1995년 9월 29일에 이관되어, 수탁번호 FERM BP-5252를 부여받았다.

L-리신 생산능이 있는 코리네폼 균의 예에는 S-(2-아미노에틸)시스테인(이하, "AEC"라 함) 내성 변이 균주, 예컨대 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11082(NRRL B-11470)(JP56-1914B, JP56-1915B, JP57- 14157B, JP57-14158B, JP57-30474B, JP58-10075B, JP59-4993B, JP61-35840B, JP62-24074B, JP62-36673B, JP5-11958B, JP7-112437B 및 JP7- 112438B에 기술되어 있다), 호모세린과 같은 아미노산의 영양요구성인 돌연변이 균주(JP48-28078B 및 JP56-6499B), AEC에 내성이며 L-류신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌 및 L-발린과 같은 아미노산 영양요구성인 돌연변이 균주(미국 특허 제3,708,395호 및 제3,825,472호), DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파르트산 유사체, 설파 약물, 퀴노이드 및 N-라우로일류신에 내성인 L-리신 생산성 돌연변이 균주, 옥살로아세테이트 데카복실라제 억제제, 기도 효소 억제제에 내성인 L-리신 생산성 돌연변이 균주(JP50-53588A, JP50-31093A, JP52-102498A, JP53-9394A, JP53-86089A, JP55-9783A, JP55-9759A, JP56-32995A, JP56-39778A, JP53-43591B 및 JP53-1833B), 이노시톨 또는 아세트산 영양요구성인 L-리신 생산성 돌연변이 균주(JP55-9784A 및 JP56-8692A), 플루오로피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 민감한 L-리신 생산성 돌연변이 균주(JP55-9783A 및 JP53-86090A), 에틸렌 글리콜에 내성인 브레비박테리움 또는 코리네박테리움 균의 L-리신 생산성 돌연변이 균주(미국 특허 제4,411,997호) 등이 있다.

또한, L-아미노산 생산능은 L-아미노산 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시켜 부여할 수도 있다.

예를 들어, L-리신 생산능은 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자 및 아스파토키나제를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시켜 부여할 수 있다. 즉, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자 단편 및 아스파토키나제를 암호화하는 유전자 단편을 L-리신 생산에 사용되는 숙주 미생물에서 작동할 수 있는 벡터, 바람직하게는 다중 카피 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 제조한다. 형질전환의 결과로서, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자 및 아스파토키나제를 암호화하는 유전자의 카피 수가 숙주 세포에서 증가하고, 이에 의해 상기 효소의 활성이 증강된다. 이하, 디하이드로피콜리네이트 신타제, 아 스파토키나제 및 아스파토키나제 III은 각각 약어 DDPS, AK 및 AKIII으로 명명한다.

DDPS 및 AK를 암호화하는 유전자는 이들이 각각 DDPS 또는 AK 활성이 있는 단백질을 암호화하는 한 특별히 제한되지 않는다. 이러한 유전자의 예에는 에스케리치아 콜리, 메틸로필러스 메틸로트로퍼스, 코리네박테리움 글루타미컴 등의 유전자가 포함된다. DDPS 유전자(dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297(1986)) 및 AKIII 유전자(lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. and Patte, J. C., J. Biol.Chem., 261, 1052(1986))에 대한 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있는 바, 이러한 유전자들은 상기 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 설계된 프라이머를 이용하여 이.콜리 K-12 균주와 같은 미생물의 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 수득할 수 있다. 이하, DDPS를 암호화하는 유전자 및 AK를 암호화하는 유전자는 이.콜리 유래의 dapA 및 lysC를 예로 들어 설명하지만, DDPS를 암호화하는 유전자 및 AK를 암호화하는 유전자가 dapA 및 lysC에만 국한되는 것은 아니다.

에스케리치아 콜리 유래의 야생형 DDPS는 L-리신에 의한 피드백 억제(feedback inhibition)를 받고, 에스케리치아 콜리 유래의 야생형 AKIII은 L-리신에 의한 억제 및 피드백 억제를 받는다. 따라서, dapA 및 lysC가 사용되는 경우에는 L-리신에 의한 피드백 억제에 내성인 DDPS 및 AK를 암호화하는 돌연변이 유전자를 이용하는 것이 바람직하다. 이하, L-리신에 의한 피드백 억제를 받지 않는 돌연변이성인 DDPS는 "돌연변이 DDPS"로 명명할 것이며, 이러한 돌연변이 DDPS를 암호화하는 DNA 역시 "돌연변이 dapA" 또는 "dapA ^* "로 명명할 것이다. 이와 마찬가지로, L-리신에 의한 피드백 억제를 받지 않는 돌연변이성인 에스케리치아 콜리 유래의 AKIII은 "돌연변이 AKIII"으로 명명하고, 이러한 돌연변이 AKIII을 암호화하는 DNA도 "돌연변이 lysC"로 명명할 것이다. 코리네박테리움 균 유래의 DDPS는 본래 L-리신에 의한 피드백 억제에 내성이 있는 바, 본 발명에 사용할 당해 DDPS 및 AK에는 반드시 돌연변이를 실시할 필요는 없다.

L-리신에 의한 피드백 억제에 내성인 돌연변이 DDPS를 암호화하는 DNA의 예에는 118-히스티딘 잔기를 티로신으로 치환시킨 것을 포함하는 아미노산 서열을 가진 DDPS를 암호화하는 DNA가 포함된다(미국 특허 제5,661,012호 및 제6,040,160호). 또한, L-리신에 의한 피드백 억제에 내성인 돌연변이 AKIII을 암호화하는 DNA의 예에는 352 트레오닌 잔기를 이소류신으로 치환시킨 것을 포함하는 아미노산 서열을 가진 AKIII을 암호화하는 DNA를 포함한다(미국 특허 제5,661,012호 및 제 6,040,160호). 돌연변이 DNA는 PCR 등을 이용한 부위 지시된 돌연변이유발법으로 수득할 수 있다.

유전자 클로닝에 사용되는 플라스미드는 미생물에서 복제할 수 있는 한, 어떠한 플라스미드일 수 있으며, 이의 구체예에는 pBR322, pTWV228(Takara Bio), pMW119(Nippon Gene), pUC19 등이 있다.

형질전환에 사용되는 숙주 미생물에서 작동할 수 있는 벡터는 각 미생물의 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 플라스미드이다. 에스케리치아 콜리용 벡터의 구체 예에는 pSTV29(Takara Bio), RSF1010(Gene, vol. 75(2), pp. 271-288, 1989), pUC19, pBR322, pMW119 등이 있다. 또한, 파아지 DNA 벡터도 사용할 수 있다. 메틸 로필러스 세균용 벡터는 예를 들어 메틸로필러스 세균의 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 플라스미드이다. 메틸로필러스 세균용 벡터의 구체 예에는 RSF1010 및 이의 유도체, 예컨대 pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRP301 및 pTB70(Nature, 287, 396(1980))이 있다. 코리네폼 세균에서 작동할 수 있는 벡터의 예에는 pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A) 및 pSFK6 (JP2000-262288A)이 있다. 또한, 플라스미드가 코리네폼 세균에서 자율적으로 복제할 수 있게 하는 DNA 단편을 절제한 후, 이 단편을 에스케리치아 콜리용 벡터에 삽입하여 수득한 벡터는 에스케리치아 콜리 및 코리네폼 세균 모두에서 자율적으로 복제할 수 있는, 소위 셔틀 벡터로서 사용될 수 있다.

전술한 임의의 벡터와 dapA 및 lysC의 연결을 통해 재조합 DNA를 제조하기 위해서는, dapA 및 lysC를 함유하는 DNA 단편과 벡터를 모두 절단하는 제한효소를 사용할 수 있다. 연결은 일반적으로 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 수행한다. dapA 및 lysC는 별도의 벡터 또는 하나의 벡터에 삽입될 수 있다. 제한효소 분해, DNA 연결, 염색체 DNA 제조, PCR, 플라스미드 DNA 제조, 형질전환, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 설계 등에 사용될 수 있는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려진 통상의 방법일 수 있다. 이러한 방법에 대한 설명은 문헌[Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, T.,"Molecular Cloning A, Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 등]을 참조할 수 있다. 전술한 바와 같이 제조한 재조합 DNA를 미생물에 도입시키는 방법으로는 형 질전환 효율이 충분하기만 하다면 어떠한 방법이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, 전기천공(electroporation)를 사용할 수 있다(Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)).

돌연변이 DDPS를 암호화하는 돌연변이 dapA 및 돌연변이 AKIII을 암호화하는 돌연변이 lysC를 함유하는 플라스미드로는 숙주 스펙트럼이 광범위한 플라스미드 RSFD80을 사용할 수 있다(미국 특허 제6,040,160호). RSFD80으로 형질전환된 에스케리치아 콜리 JM109 균주는 AJ12396(미국 특허 제6,040,160호)로 명명되었고, 독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 1993년 10월 28일에 기탁되어, 수탁번호 FERM P-13936을 부여받았다. 이후, 이 기탁물은 부탁페스트 조약 하의 국제기탁기관으로 1994년 11월 1일에 이관되어, 수탁번호 FERM BP-4859를 부여받았다. RSFD80은 공지의 방법에 따라 AJ12396 균주로부터 수득할 수 있다.

또한, DDPS 유전자 및 AK 유전자의 발현은 미생물의 염색체 DNA에 dapA 및 lysC의 다중 카피를 통합시킴으로써 증강될 수 있다. 미생물의 염색체 DNA에 dapA 및 lysC의 다중 카피를 도입시키기 위해서는 염색체 DNA에 다중 카피수로 존재하는 서열을 표적으로 하여 상동성 재조합을 수행하는 방법을 사용할 수 있다. 전이성 인자의 말단에 존재하는 반복성 DNA 또는 역위성 반복체는 염색체 DNA에 다중 카피수로 존재하는 서열로서 사용할 수 있다. 또는, JP2-109985A에 개시된 바와 같이 dapA 및/또는 lysC의 다중 카피를 트랜스포존을 이용하여 염색체 DNA에 도입시킬 수도 있다. 어떤 방법에서든지 DDPS 및 AK의 활성은 형질전환된 균주에서의 dapA 및 lysC의 카피 수 증가로 인해 증강된다.

전술한 유전자 증폭 방법 외에도, DDPS 유전자 및 AK 유전자의 발현은 발현 조절 서열, 예컨대 dapA 및 lysC의 프로모터를 더욱 강력한 것으로 치환시켜 증강시킬 수도 있다(JP1-215280A). 이러한 강력한 프로모터의 예에는 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지의 P_R 프로모터 및 P_L 프로모터, tet 프로모터, amyE 프로모터, spac 프로모터 등이 있다. 본래 프로모터 위치에 이러한 프로모터들의 삽입은 dapA 및 lysC의 발현을 증강시키고, 결과적으로 DDPS 및 AK 활성을 증강시킨다. 발현 조절 서열의 증강은 dapA 및 lysC의 카피 수 증폭과 병용될 수도 있다.

또한, L-리신 생산능은 DDPS 및 AK 이외의 다른 L-리신 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시켜 부여할 수도 있다. 이러한 효소의 예에는 디아미노피멜레이트 합성 경로의 효소, 예컨대 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 데카복실라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제(WO 96/40934), 포스포에놀피루베이트 카복실라제(JP60-87788A), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(JP6-102028B), 디아미노피멜레이트 에피머라제(JP2003-135066A) 및 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(WO00/61723) 등이 있다. 이러한 효소의 다른 예에는 아미노아디페이트 경로의 효소, 예컨대 호모아코니테이트 하이드라타제(JP2000-157276A) 등이 있다. 이러한 효소들의 유전자 발현의 증강은 DDPS 및 AK 유전자 발현의 증강과 함께 병용될 수도 있다.

또한, L-리신 생산능이 있는 미생물은 L-리신 이외의 다른 화합물을 합성하여 L-리신 생합성 경로에서 분기되는 반응을 촉매하는 효소의 세포내 활성을 감소 시키거나 제거하여 수득할 수도 있다. 이러한 효소의 예에는 호모세린 데하이드로게나제 및 리신 데카복실라제가 있다. 이러한 효소의 활성이 감소 또는 제거된 균주는 WO 95/23864 및 WO 96/17930에 기술되어 있다.

효소의 세포내 활성을 감소 또는 제거하는 방법으로는, 돌연변이되지 않은 균주에 비해 세포내 활성이 감소되거나 제거되도록 미생물 세포에서 효소를 암호화하는 유전자를 변이 또는 결실시키는 방법을 포함한다. 이러한 유전자 변이 또는 결실 방법의 예에는 프로모터 및 샤인-달가노(SD) 서열과 같은 발현 조절 서열의 변형, 개방 판독 프레임에 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이 또는 프레임 이동 돌연변이의 도입, 및 유전자 일부의 결실 방법이 있다(J Biol Chem. 1997 272 (13): 8611-7). 돌연변이된 유전자는 염색체 상의 야생형 유전자를 돌연변이 유전자로 치환시키는 상동성 재조합법을 사용하거나 또는 트랜스포존이나 IS 인자를 사용하여 미생물에 도입시킬 수 있다. 상동성 재조합법에는 선형 DNA, 감온성 플라스미드 및 비복제성 플라스미드를 사용하는 방법 등이 있다. 이러한 방법들은 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6; 97 (12): 6640-5], 미국 특허 제6303383호, JP05-007491A 등에 기술되어 있다.

L-리신 생합성 효소의 활성을 증강 및 감소시키는 방법은 다른 L-아미노산 생산능을 부여하는 데에도 사용할 수 있다. L-아르기닌 생산능이 있는 에스케리치아 콜리의 구체 예에는 α-메틸메티오닌, p-플루오로페닐알라닌, D-아르기닌, 아르기닌 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)시스테인, α-메틸세린, β-2-티에닐알라닌 또는 설포구아니딘(JP 56-106598A) 등에 내성인 돌연변이 균주가 포함된다. 또 한, L-아르기닌에 의한 피드백 억제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이를 보유하고, 높은 N-아세틸글루타메이트 신타제 활성을 나타내는 L-아르기닌 생산균인 에스케리치아 콜리 237 균주(러시아 특허원 제2000117677호)도 사용할 수 있다. 이 균주는 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM) GMII 제네티카에 2000년 4월 10일에 등록번호 VKPM B-7925로 기탁되고, 2001년 5월 18일에 부타페스트 조약 하의 국제 기탁 기관으로 이관되어 있다. 균주 237에서 유래되고 아세테이트 동화능이 증강된 에스케리치아 콜리 382 균주도 사용할 수 있다(JP2002-017342A). 이 에스케리치아 콜리 382 균주는 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)에 2000년 4월 10일에 수탁번호 VKPM B-7926으로 기탁되었다.

L-아르기닌 생산능이 있는 코리네폼 세균의 예에는 2-티아졸알라닌에 내성일 뿐만 아니라 L-히스티딘, L-프롤린, L-트레오닌, L-이소류신, L-메티오닌 또는 L-트립토판 영양요구성인 코리네폼 세균의 균주(JP 54-44096A), 케토말론산, 플루오로말론산 또는 모노플루오로아세트산에 내성인 코리네폼 세균의 균주(JP 54-18989A), 아르기니놀에 내성인 코리네폼 세균의 균주(JP62-24075A), X-구아니딘에 내성인 코리네폼 세균의 균주(X는 지방족 쇄 또는 지방산의 유도체를 나타낸다), 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성인 코리네폼 세균의 균주(JP57-150381A), ArgR(아르기닌 생합성 효소의 리프레서 단백질)이 결손된 코리네폼 세균의 균주(JP2002-51790A) 등이 포함된다.

L-아르기닌, L-히스티딘, L-오르니틴 및 다른 L-아미노산의 생합성 효소의 활성은 L-리신 생합성 효소에 대한 전술한 방법과 유사한 방법으로 증강될 수 있다.

L-아르기닌 생합성 효소의 예에는 N-아세틸글루타메이트 신타제(argA), N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제(argC), 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 데아세틸라제(argE), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제(argF), 아르기니노석시네이트 신타제(argG), 아르기니노석시네이트 리아제(argH) 및 카르바모일 포스페이트 신타제(carAB) 중에서 선택되는 1종 이상의 효소가 있다. 이러한 효소의 명칭 다음에 괄호 안에 제시한 명칭은 각각 상기 효소를 암호화하는 유전자의 명칭이다. 이러한 효소들의 활성이 증강된 균주의 예에는 JP2000-287693A, JP2000-197490A, JP07-028749B 등에 기술된 균주가 있다.

또한, L-아르기닌 생산능은 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시키거나(EP1057893A) 또는 글루타메이트 신테타제 활성을 증강시켜(미국 특허원 제2005-00142236호) 부여할 수도 있다. L-아르기닌 생합성 효소는 L-아르기닌에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있는 바, L-아르기닌 생산능도 역시 아르기닌 리프레서를 결실시키거나 또는 피드백 억제에 대한 내성을 부여하는 N-아세틸글루타민 신타제에 돌연변이를 도입시켜(EP1154020A 및 EP1170361A) 효율적으로 증강시킬 수 있다.

또한, 히스티딘 유사체 또는 트립토판 유사체에 내성인 바실러스 세균(JP52-114092A), L-메티오닌, L-히스티딘, L-트레오닌, L-프롤린, L-이소류신, L-리신, 아데닌, 구아닌 및 우라실(또는 우라실 전구체) 중 적어도 하나에 대해 영양요구성인 바실러스 세균(JP52-99289A), 아르기닌 하이드록사메이트에 내성인 바실러스 세균(JP51-6754B), 숙신산에 대해 영양요구성이거나 뉴클레오타이드 유사체에 대해 내성인 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens)(JP58-9692A), 아르기닌 대사능이 결손되어 있고, 아르기닌 길항물질 및 카나바닌에 내성이며 리신 영양요구성인 세라티아 마르세슨스(JP52-8729A), 아르기닌, 아르기닌 하이드록사메이트, 호모아르기닌, D-아르기닌, 카나바닌, 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성인 사카로마이세스 세레비지애(JP53-143288A), 카나바닌에 내성인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)(JP53-3586A) 등도 역시 L-아르기닌 생산 균주로서 사용할 수 있다.

L-히스티딘 생합성 효소의 예에는 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제(hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로하이드롤라제(hisI), 포스포리보실-ATP 피로포스포하이드롤라제(hisIE), 포스포리보실포름이미노-5-아미노이미다졸 카르복사미드 리보타이드 이소머라제(hisA), 아미도트랜스퍼라제(hisH), 히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제(hisC), 히스티디놀 포스파타제(hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제(hisD) 등이 있다.

L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 유전자(hisG, hisBHAFI)는 L-히스티딘에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있는 바, L-히스티딘 생산능도 역시 피드백 억제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이를 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제(hisG)에 도입시켜 효과적으로 증강시킬 수 있다(러시아 특허 2003677 및 2119536).

L-히스티딘 생산능이 있는 미생물의 구체 예에는 L-히스티딘 생합성 효소를 암호화하는 DNA를 운반하는 벡터가 도입되어 있는 이.콜리 균주 FERM-P5038 및 5048(JP56-005099A), 아미노산 배출용 유전자인 rht가 도입된 균주(EP1016710A), 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신 내성이 부여된 이. 콜리 80 균주(VKPM B-7270, 러시아 특허 제2119536호) 등이 있다.

L-오르니틴 생합성 경로는 L-아르기닌 생합성 경로와 공통적인 여러 효소를 포함한다. L-오르니틴 생합성 효소의 예에는 N-아세틸글루타메이트 신타제(argA), N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제(argC), 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 데아세틸라제(argE) 등이 있다.

L-오르니틴 생산능이 있는 세균의 예에는 L-시트룰린 또는 L-아르기닌 영양요구성 돌연변이가 도입된 코리네폼 세균 및 아트로박터(Arthrobacter) 세균(JP02-283290A), 비타민 P 유사 활성 물질에 내성인 코리네폼 세균 AJ11589 균주(FERM-P5644, JP57-016696A) 등이 포함된다.

L-트레오닌 생산능이 있는 미생물의 예에는 L-트레오닌 생산능이 있는 6-디메틸아미노퓨린 내성 돌연변이(JP5-304969A), 효소 활성 증강을 위한 돌연변이가 있는 트레오닌 생합성 효소의 유전자가 플라스미드에 의해 증폭된 균주(JP1-29559B, JP05-227977A), 트레오닌 오페론이 플라스미드에 의해 증폭된 균주(JP2-109985A), 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자 및 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 증폭된 균주(JP2002-51787A) 등이 있다.

또한, 에스케리치아 콜리 VKPM B-3996 균주(미국 특허 제5,175,107호)도 L-트레오닌 생산 균주로서 사용할 수 있다. VKPM B-3996은 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM), GNII 제네티카에 1987년 11월 19일에 등록번호 VKPM B-3996으로 기탁되었다. VKPM B-3996 균주는 스트렙토마이신 내성 마커 유전자를 보유하는 플라스미드 pAYC32(Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167)에 트레오닌 오페론(thrABC)을 삽입시켜 수득한 플라스미드 pVIC 40(국제 특허 공개번호 WO 90/04636)을 보유하고 있다. pVIC40에 함유된 돌연변이 thrA 유전자에 의해 암호된 아스파토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I는 L-트레오닌에 의한 피드백 억제를 받지 않는다.

또한, 에스케리치아 콜리 VKPM B-5318 균주(EP 0593792B)도 L-트레오닌 생산 균주로서 사용할 수 있다. VKPM B-5318은 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM), GNII 제네티카(VKPM GNII Genetika 주소: 러시아 모스코바 113545 도로즈흐니 프로에즈드 1)에 1990년 5월 3일에 등록번호 VKPM B-5318로 기탁되었다. 이러한 VKPM B-5318 균주는 L-이소류신 영양요구성이고, 트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 트레오닌 오페론이 C1 감온성 리프레서, PR 프로모터 및 λ 파아지 유래의 Cro 단백질의 N 말단보다 후위에 위치해 있고, 더욱이 트레오닌 생합성 유전자의 발현이 λ 파아지 유래의 프로모터 및 리프레서에 의해 조절되도록 작제된 플라스미드 DNA를 보유한다.

또한, 에스케리치아 콜리 MG442 균주(미국 특허 제4,278,765호)도 L-트레오닌 생산균주로서 사용할 수도 있다. MG442 균주는 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)에 CMIMB-1628로서 기탁되어 있다.

L-트레오닌 생산능이 있는 세균은 L-트레오닌 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수 있다. L-트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 예에는 아스파토키나제 III 유전자, 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자 등이 있다. L-트레오닌 생합성 효소의 활성은 트레오닌 분해 효소 활성이 저해되는 세균에서 증강될 수 있다. 트레오닌 분해 효소의 활성이 억제된 세균의 예에는 트레오닌 데하이드로게나제 활성이 결손된 TDH6 균주가 있다(JP2001-346578A).

L-글루탐산 생산능이 있는 세균은 또한 L-글루탐산 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수도 있다. L-글루탐산 생합성 효소의 예에는 글루타메이트 데하이드로게나제, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제, 피루베이트 카복실라제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 포스포에놀피루베이트 신타제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제 등이 있다.

구체적으로, 이러한 L-글루탐산 생합성 효소의 활성이 증강된 세균에는 WO 00/18935 및 JP2000-232890A에 개시된 코리네폼 세균의 균주, 및 JP2001-333769A, JP2000-106869A, JP2000-189169A 및 JP2000-333769A에 개시된 엔테로박테리아세애 과의 균주가 있다.

또한, L-글루탐산 생산능이 있는 세균은 L-글루탐산 합성으로부터 분기시키 고 L-글루탐산 이외의 다른 화합물을 생산하는 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성을 감소시키거나 또는 제거하여 수득할 수도 있다. 이러한 효소에는 이소시트레이트 리아제, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시 산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제, 글루타메이트 데카복실라제, 1-피로포스페이트 데하이드로게나제 등이 있다.

구체적으로, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 세균에는 WO 95/34672에 개시된 브레비박테리움 락토퍼멘텀 △s 균주, JP6-237779A에 개시된 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821 균주(FERM BP-4172), JP5-244970A 또는 JP7-203980A에 개시된 에스케리치아 콜리 균주 및 JP2001-333769A에 개시된 엔테로박터 어글로머란스 균주가 있다.

L-시스테인 생산능이 있는 세균의 예에는 시스타티오닌 β-리아제 활성이 감소된 에스케리치아 콜리 균주(JP2003-169668A) 및 세린 아세틸트랜스퍼라제 L-시스테인의 피드백 억제가 해제된 에스케리치아 콜리(JP11-155571A) 또는 코리네폼 세균(JP2002-233384A) 균주가 있다.

L-프롤린 생산능이 있는 에스케리치아 세균의 예에는 3,4-디하이드록시프롤린 및 아자티딘-2-카복실레이트에 내성인 에스케리치아 콜리 702 균주(VKPM B-8011) 및 702 균주의 ilvA 유전자를 결실시켜 수득한 702ilvA 균주(VKPM B-8012)가 있다(JP2002-300874A).

L-페닐알라닌 생산능이 있는 에스케리치아 세균의 예에는 tyrA 및 tyrR 유전자가 결실된 에스케리치아 콜리 AJ12739 균주(tyrA::Tn10, TyrR; VKPM B-8197), 변이된 pheA가 도입되어 있는 에스케리치아 콜리 HW1089 균주(미국 특허 제5,354,672호) 및 yddG 및 yedA 유전자가 증폭된 에스케리치아 콜리 균주(WO 03/044192)가 있다. L-페닐알라닌 생산능이 있는 코리네폼 세균의 예에는 티로신 영양요구성이고 L-페닐알라닐-L-티로신에 내성인 균주(JP5-49489A)가 있다.

L-트립토판 생산능이 있는 세균은 포스포글리세레이트 데하이드로게나제 및 안트라닐레이트 신타제를 비롯한 L-트립토판 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수 있다. 이러한 효소는 L-트립토판 또는 L-세린의 피드백 억제에 내성이 있을 수 있다. 예를 들어, 이러한 피드백 내성 효소를 보유한 세균은 L-트립토판 내성 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 돌연변이 serA 유전자를 함유하는 플라스미드 pGH5를, L-세린 내성의 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 보유하는 에스케리치아 콜리 SV164 균주(WO 94/08031)에 도입시켜 수득할 수 있다.

또한, L-트립토판 생산능이 있는 세균은 트립토판 오페론에 의해 암호화된 L-트립토판 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수도 있다. 이러한 효소에는 L-트립토판 오페론 트립토판 신타제 및 안트라닐레이트 신타제가 있다. 이러한 세균의 예에는 L-세린 내성의 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유한 트립토판 오페론이 도입되어 있는 에스케리치아 콜리 균주가 있다(JP57-71397A, JP62-244382A 및 미국 특허 제4,371,614호).

또한, L-트립토판 생산능이 있는 세균의 예에는 L-페닐알라닌 및 L-티로신에 대한 영양요구성인 에스케리치아 콜리 AGX17(pGX44)[NRRL B-12263] 균주, 및 트립토판 오페론을 함유한 플라스미드 pGX50을 보유하는 AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264] 균주가 있다(미국 특허 제4,371,614호).

L-이소류신 생산능이 있는 에스케리치아 세균의 예에는 6-디메틸아미노퓨린에 내성인 돌연변이 균주(JP5-304969A), L-이소류신하이드록사메이트, 티아이소류신, DL-에티오닌 또는 아르기닌하이드록사메이트(JP5-130882A)에 내성인 돌연변이 균주, 및 트레오닌 데아미나제 및 아세토하이드록실산 신타제를 암호화하는 유전자가 플라스미드와 함께 증폭된 재조합 균주(JP2-458A, JP2-42988A 및 JP8-47397A)가 있다.

L-발린 생산능이 있는 세균은 상기 ilvGMEDA 오페론에 의해 암호화된 효소, 특히 ilvG 유전자에 의해 암호화된 아세토하이드록실레이트 신타제(JP02-748418B)를 비롯하여 L-발린 생합성 효소의 활성을 증강시켜 수득할 수 있다. 이들 효소들은 L-발린에 의한 피드백 억제에 내성이 있을 수 있다.

L-발린 생산능이 있는 세균은 아세토락테이트 신타제 III 유전자(ilvIH 유전자)의 발현이 감소된 세균일 수 있다.

L-발린 생산능이 있는 세균은 아미노산 유사체에 내성일 수 있다. 이러한 세균의 예에는 L-이소류신 및 L-메티오닌 영양요구성이고 D-리보스, 퓨린 뉴클레오사이드 또는 피리미딘 리보뉴클레오사이드에 내성인 돌연변이 균주(FERM P-1841, P-5556; JP53-025034A), 및 폴리케토노이드에 내성인 돌연변이 균주(FERM P-9325; JP04-045314B)가 있다.

L-알라닌 생산능이 있는 세균의 예에는 H⁺-ATPase 활성이 결손된 코리네폼 세균 균주(Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov; 57(4): 534-40) 또는 아스파르트산 β-데카복실라제 유전자가 증폭된 코리네폼 세균 균주(JP07-163383A)가 있다.

<ybjE 유전자의 발현 증강>

본 발명의 미생물은 ybjE 유전자의 발현이 증강되도록 전술한 바와 같이 L-아미노산 생산능이 있는 미생물을 변형시켜 수득할 수 있다. 또는, 먼저 ybjE 유전자의 발현을 증강시킨 후, L-아미노산 생산능을 부여할 수도 있다.

ybjE 유전자의 발현은 프로모터와 같은 발현 조절 서열의 변형을 통해 내인성 ybjE 유전자의 발현을 증강시키거나 또는 플라스미드 등을 사용하여 외인성 ybjE 유전자를 도입시켜 증강시킬 수 있다. 이러한 기술은 병용할 수도 있다.

ybjE 유전자 발현의 증강은 본 발명의 세균에서 나타나는 ybjE 유전자 발현에 의한 RNA의 양을 노던 하이브리드화 또는 RT-PCR(Molecular cloning: Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)로 측정한 뒤, 이를 야생형 또는 미변형 균주의 양과 비교하여 확인할 수 있다. 본 발명의 미생물에서 나타나는 ybjE 유전자의 발현은 야생형 또는 미변형 균주의 발현 보다 더 증강된 것으로서, 바람직하게는 야생형 또는 미변형 균주의 1.5배 이상, 더 바람직하게는 2배 이상, 가장 바람직하게는 3배 이상인 것이다.

ybjE 유전자는 에스케리치아 콜리 또는 이의 동족체로부터 수득될 수 있다. 에스케리치아 콜리 유래의 ybjE 유전자의 예에는 서열번호 2의 아미노산 번호 17번에서 315번까지의 아미노산 서열을 가진 단백질을 암호화하는 유전자, 바람직하게 는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49번에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 가진 유전자가 포함된다. 서열번호 2의 아미노산 서열에서 위치 1번에 있는 Val의 코돈은 gtg이지만, 이는 Met으로 해독될 수도 있고, 이러한 ybjE 유전자에 의해 암호화된 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열(1번에서 315번까지)을 갖는 단백질일 수 있다. 이러한 경우에는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 1번에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA를 사용하는 것이 바람직하다. 하지만, 이하 실시예에서 분명하게 확인할 수 있듯이, 본 발명의 제조방법에 사용할 수 있는 미생물은 아미노산 잔기가 해독 개시 코돈인 것에 관계없이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열(49번에서 948번까지)을 함유하는 DNA를 사용하여 수득할 수 있다.

에스케리치아 콜리 ybjE 유전자의 동족체는 에스케리치아 콜리 ybjE 유전자와 높은 구조적 유사성을 보이고 숙주 미생물의 L-아미노산 배출능이나 L-아미노산 내성, 및 L-아미노산 생산능을 증강시키는 유전자를 의미한다. ybjE 유전자 동족체의 예에는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 유전자가 포함된다. 서열번호 9의 아미노산 서열은 에스케리치아 콜리 YbjE 단백질(서열번호 2)과 살모넬라 티피뮤리엄 LT2 균주의 YbjE 단백질 사이에 보존성인 서열이다. 서열번호 10의 아미노산 서열은 에스케리치아 콜리 YbjE 단백질과 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis) CO92 YPO1361 균주의 YbjE 단백질 사이에 보존성인 서열이다.

ybjE 유전자 동족체는 서열번호 2의 전체 아미노산 서열이나 서열번호 2의 아미노산 17 내지 315의 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 있고, L-아미노산 배출능이 있는 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 또한, ybjE 유전자 동족체의 예에는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고 L-아미노산 배출능이 있는 단백질이 있다. 아미노산 서열 및 DNA 서열의 상동성은 카를린 및 알트슐에 의한 BLAST 알고리듬(Pro.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 5873(1993)) 및 FASTA 알고리듬(Methods Enzymol., 183, 63(1990))을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, BLASTN 및 BLASTX라는 프로그램은 상기 BLAST 알고리듬을 기반으로 하여 개발된 것이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).

이.콜리 이외의 다른 미생물 유래의 ybjE 유전자도 사용할 수 있으며, 그 예에는 진뱅크 수탁번호 AE016980의 뉴클레오타이드 번호 275793 내지 276692 또는 275793 내지 276740에 상보적인 서열을 보유한 시겔라 플렉스네리 2a str. 2457T 균주 유래의 유전자, 진뱅크 수탁번호 AE008740의 뉴클레오타이드 번호 97 내지 996에 상보적인 서열을 보유한 살모넬라 티피뮤리엄 LT2 균주 유래의 유전자, 및 진뱅크 수탁번호 AJ414147의 뉴클레오타이드 번호 197812 내지 198708에 상보적인 서열을 보유한 예르시니아 페스티스 CO92 유래의 유전자가 있다. 또한, ybjE 유전자는 코리네박테리움 글루타미컴 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀과 같은 코리네폼 세균, 슈도모나스 아에루기노사과 같은 슈도모나스 세균, 마이코박테리움 튜베르큘로시스와 같은 마이코박테리움 세균 등으로부터 전술한 바와 같은 유전자에 대한 상동성에 근거하여 클로닝할 수도 있다.

더욱이, 본 발명의 ybjE 유전자는 야생형 유전자에 국한되지 않으며, 서열번 호 2의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 번호 17 내지 315의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 돌연변이 또는 인공 변형된 유전자일 수도 있다. 따라서, 암호화된 단백질은 하나 이상의 위치에 하나 또는 몇몇 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을, 암호화된 YbjE 단백질의 기능, 즉 L-리신 배출능이 유지되는 한 포함할 수 있다. 본원에서 말하는 "몇몇" 아미노산 잔기의 수는 아미노산 잔기의 입체 구조 중의 위치 또는 종류에 따라서 다르지만, 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 더 바람직하게는 2 내지 5개일 수 있다. 아미노산의 치환은 보존적 치환, 예컨대 ala 대신 ser 또는 thr로의 치환, arg 대신 gln, his 또는 lys으로의 치환, asn 대신 glu, gln, lys, his 또는 asp로의 치환, asp 대신 asn, glu 또는 gln으로의 치환, cys 대신 ser 또는 ala으로의 치환, gln 대신 asn, glu, lys, his, asp 또는 arg으로의 치환, glu 대신 gly, asn, gln, lys 또는 asp로의 치환, gly 대신 pro으로의 치환, his 대신 asn, lys, gln, arg 또는 tyr으로의 치환, ile 대신 leu, met, val 또는 phe으로의 치환, leu 대신 ile, met, val 또는 phe으로의 치환, lys 대신 asn, glu, gln, his 또는 arg으로의 치환, met 대신 ile, leu, val 또는 phe으로의 치환, phe 대신 trp, tyr, met, ile 또는 leu으로의 치환, ser 대신 thr 또는 ala으로의 치환, thr 대신 ser 또는 ala으로의 치환, trp 대신 phe 또는 tyr으로의 치환, tyr 대신 his, phe 또는 trp로의 치환, 및 val 대신 met, ile 또는 leu으로의 치환이 바람직하다. 또한, 전술한 바와 같은 하나 또는 여러 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입에는 ybjE 유전자를 보유하는 미생물 종의 차이 및 각각의 차이로부터 나타나는 천연 발생의 돌연변이도 포함한다(돌연변이 또는 변형체).

이러한 유전자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49 내지 948까지의 뉴클레오타이드 서열을, 예컨대 부위 특이적 돌연변이유발로 변형시켜, 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질의 특정 부위에 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입이 도입되게 함으로써 수득할 수 있다.

서열번호 1의 서열에 돌연변이가 있는 ybjE 유전자의 예에는 서열번호 1의 서열에서 3번 위치의 뉴클레오타이드(구아닌)가 아데닌으로 치환된 ybjE 유전자가 있다.

더욱이, 이러한 유전자는 또한 이하에 설명되는 바와 같은 통상의 돌연변이유발 처리를 통해 수득할 수도 있다. 돌연변이유발 처리의 예에는 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 가진 유전자를 시험관내에서 하이드록실아민으로 처리하는 방법, 및 이러한 유전자를 보유하는 에스케리치아 세균과 같은 미생물을 자외선 조사 또는 통상의 돌연변이 처리에 사용되는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS(에틸 메탄설포네이트)와 같은 돌연변이유발제로 처리하는 방법이 있다. 이러한 유전자가 L-아미노산 배출능이 있는 단백질을 암호화하는 지의 여부는 예를 들어 이러한 유전자를 적당한 세포에서 발현시킨 뒤, 배지에 배출된 L-아미노산의 양이 증가되었는 지를 측정함으로써 확인할 수 있다. 이러한 유전자가 숙주 미생물에 대한 L-아미노산 내성을 부여하는 지의 여부는 이러한 유전자를 숙주 미생물에 도입시킨 뒤, 상기 L-아미노산의 고농도 존재하에 숙주를 배양하고, 이 미생물의 성장을 대조 균주의 성장과 비교하여 확인할 수 있다.

또한, ybjE 유전자에는 엄중 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 서열로부터 제조한 프로브와 하이브리드할 수 있고 L-아미노산 배출능이 있는 단백질을 암호화하는 DNA도 포함된다. 본 명세서에 사용된 "엄중 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 이러한 조건을 어떠한 수치의 값으로 분명하게 나타내기는 어렵다. 그러나 엄중 조건으로는 서로 상동성이 높은 DNA, 예컨대 상동성이 50% 이상인 DNA가 서로 하이브리드화하고, 상동성이 50% 보다 낮은 DNA는 서로 하이브리드하지 않는 조건, 및 서던 하이브리드화에 전형적인 세척, 즉 1xSSC, 0.1% SDS 하에 60℃에서, 바람직하게는 0.1xSSC, 0.1% SDS하에 60℃에서, 더 바람직하게는 0.1xSSC, 0.1% SDS하에 68℃에서의 1회 세척 또는 바람직하게는 2 내지 3회 세척을 통해 일정 염 농도에서 서로 하이브리드하는 조건을 예로 들 수 있다.

ybjE 유전자의 발현은 예를 들어, 세포의 ybjE 유전자 카피수를 유전자 재조합법을 통해 증가시킴으로써 증강될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA는 ybjE 유전자를 함유하는 유전자 단편을 숙주 미생물에서 복제할 수 있는 벡터, 바람직하게는 다중 카피 벡터에 연결시킨 뒤, 수득되는 벡터를 숙주 미생물에 도입시켜 제조할 수 있다.

에스케리치아 콜리의 ybjE 유전자를 사용하는 경우에, 이 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 기반으로 하여 설계한 프라이머, 예컨대 서열번호 5 또 는 6의 서열을 각각 보유하는 프라이머를 사용하고, 주형으로서 에스케리치아 콜리의 염색체 DNA를 사용하는 PCR법(폴리머라제 연쇄 반응, White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)) 등으로 수득할 수 있다. 또한, 다른 미생물 유래의 ybjE 유전자도 사용할 수 있는데, 이 유전자는 상기 미생물의 염색체 DNA 또는 염색체 DNA 라이브러리로부터, 이 미생물의 ybjE 유전자 서열 또는 이의 상동성 서열, 또는 다른 미생물 종 유래의 YbjE 단백질을 기반으로 하여 설계한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 PCR에 의해, 또는 이러한 서열 정보를 기반으로 하여 제조한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용한 하이브리드화에 의해 수득할 수 있다. 염색체 DNA는 예컨대 사이토와 미우라의 방법(H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619(1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-98, Baifukan, 1992)에 의해 DNA 공급체로서 사용되는 미생물로부터 제조할 수 있다.

그 다음, ybjE 유전자를 숙주 미생물에서 작동할 수 있는 벡터 DNA에 연결시켜 재조합 DNA를 수득한다. 특히, 숙주 미생물에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

에스케리치아 콜리에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (pHSG 및 pACYC는 Takara Bio에서 입수할 수 있다), RSF1010, pBR322, pMW219(pMW는 Nippon Gene에서 입수할 수 있다) 등이 있다.

코리네폼 세균에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 pAM330 (JP58- 67699A), pHM1519(JP58-77895A), pVK7(US2003-0175912) 및 pSFK6 (JP2000-262288A)이 있다. 또한, 에스케리치아 콜리 및 코리네폼 세균 모두에서 자율적으로 복제할 수 있는 소위 셔틀 벡터를 사용할 수도 있다.

메틸로필러스 세균에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터의 예에는 RSF1010, 및 이의 유도체, 예컨대 pAYC32(Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 16, pp. 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, p. 53 (1990)), pRK301 및 pTB70 (Nature, 287,396 (1980))이 있다.

ybjE 유전자와 전술한 임의의 벡터를 연결시켜 재조합 DNA를 제조하기 위해서는 ybjE 유전자를 함유하는 단편 및 벡터를 제한효소로 절단하고, 통상적으로 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 연결시킨다.

전술한 바와 같이 제조한 재조합 DNA를 미생물에 도입시키고자 하는 경우에는 지금까지 보고된 임의의 공지된 형질전환법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 에스케리치아 콜리에 대해 보고된 DNA 투과성 증가를 위한 세포의 염화칼슘 처리법(Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol. Biol., 53, 159(1970)) 및 바실러스 서브틸리스에 대해 보고된 DNA 도입을 위한 성장 세포로부터 제조한 컴피턴트 세포의 사용법(Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153(1977))을 이용할 수 있다. 이러한 방법외에도, 바실러스 서브틸리스, 방선균류 및 효소에 적용할 수 있는 것으로 보고된 원형질 또는 스페로플라스트류의 수용체 세포로 재조합 DNA를 도입시키는 방법(Chang, S. and Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111(1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929(1978))도 이용할 수 있다. 또한, 코리네폼 세균의 형질전환은 전기 펄스법으로 수행하여도 좋다(Sugimoto et al., JP2-207791A).

ybjE 유전자의 카피 수는 또한 미생물의 염색체 DNA에 유전자의 다중 카피를 통합시켜 증가시킬 수도 있다. 이와 같이 미생물의 염색체 DNA에 ybjE 유전자의 다중 카피를 통합시키고자 하는 경우에는 염색체 DNA에 다중 카피로 존재하는 서열을 표적화하여 상동성 재조합을 수행할 수 있다. 염색체 DNA에 다중 카피가 존재하는 서열로는, 트랜스포존 말단에 위치한 반복성 DNA 및 역위성 반복체를 이용할 수 있다. 또는, JP2-109985A에 개시된 바와 같이 ybjE 유전자를 트랜스포존에 삽입시킨 다음, 전이시켜 이 유전자의 다중 카피를 염색체 DNA로 통합시킬 수 있다. 염색체로 ybjE 유전자의 통합은 ybjE 유전자의 부분 서열을 가진 프로브를 이용한 서던 하이브리드화를 통해 확인할 수 있다.

ybjE 유전자의 발현 증강은 염색체 DNA 상이나 플라스미드 상의 발현 조절 서열, 예컨대 ybjE 유전자의 프로모터를 WO 00/18935에 기술된 바와 같은 더 강력한 서열로 치환시키는 방법, ybjE 유전자의 발현을 증가시키는 조절 인자를 증폭시키는 방법, 또는 ybjE 유전자의 발현을 감소시키는 조절 인자를 결실시키거나 약화시키는 방법으로 달성할 수 있다. 강력한 프로모터의 예로는 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 등이 공지되어 있다. 또한, 이러한 프로모터가 더욱 강력해지도록 ybjE 유전자의 프로모터 영역에 몇몇 뉴클레오타이드 치환을 도입시킬 수도 있다. 프로모터의 효능을 평가하는 방법 및 강력한 프로모터의 예는 문헌 (Goldstein et al., Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128)에 개시되어 있다. 더욱이, 리보솜 결합 부위(RBS)와 해독 개시 코돈, 특히 개시 코돈에 바로 상부에 위치한 몇몇 뉴클레오타이드 사이에 스페이서 서열은 해독 효율에 큰 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이 서열은 변형될 수 있다. ybjE 유전자의 발현 조절 서열은 프로모터 동정용 벡터를 사용하거나 또는 GENETYX와 같은 유전자 분석 소프트웨어를 사용하여 확인할 수 있다.

ybjE 유전자의 발현은 프로모터의 이와 같은 치환이나 변형에 의해 증강된다. 또한, 발현 조절 서열의 치환은 감온성 플라스미드의 사용 등을 통해 수득될 수도 있다. 코리네폼 세균용 감온성 플라스미드의 예에는 p48K 및 pSFKT2(JP2000-262288A), pHSC4(프랑스 특허 공개 번호 2667875, 1992 및 JP5-7491A) 등이 있다. 이러한 플라스미드는 코리네폼 세균에서 적어도 25℃의 온도에서 자율적으로 복제할 수 있지만, 37℃의 온도에서는 자율적으로 복제할 수 없다. 발현 조절 서열의 변형은 ybjE 유전자의 카피수 증가와 병용될 수 있다.

ybjE 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성을 증강시키기 위해서는, L-아미노산 배출능을 증강시키는 돌연변이를 ybjE 유전자에 도입시킬 수 있다. ybjE 유전자에 의해 암호화된 단백질(YbjE 단백질)의 활성을 증가시키는 돌연변이의 예에는 ybjE 유전자의 전사를 증가시키는 프로모터 서열의 돌연변이 및 YbjE 단백질의 비활성을 증강시키는 ybjE 유전자의 암호화 영역의 돌연변이가 있다.

본 발명의 미생물은 ybjE 유전자의 발현을 증가시키는 변형으로 인해 L-아미 노산 배출능이 증강된 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 "L-아미노산 배출능이 증강된"이란 표현은 ybjE 유전자의 발현을 증강시키는 변형이 실시된 미생물을 배양할 때, 이 미생물에 의해 배지로 배출된 L-아미노산의 양이 모균주 또는 상응하는 야생형 균주와 같은 미변형 균주로부터 배출된 L-아미노산의 양보다 많은 것을 의미한다. L-아미노산 배출능의 증가는 배지에 존재하는 L-아미노산 농도의 증가를 측정하여 관찰한다. 또한, L-아미노산 배출능의 증가는 미생물에 ybjE 유전자의 도입 시, L-아미노산의 세포내 농도의 감소를 측정하여 관찰할 수도 있다. 본 발명의 미생물로부터 배출된 L-아미노산의 양은 미변형 균주로부터 배출되는 L-아미노산 양과 비교했을 때 10% 이상 증가되는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 30% 이상, 특히 바람직하게는 50% 이상 증가되는 것이 좋다. 더욱이, L-아미노산 배출능의 증가는 미생물에 ybjE 유전자의 도입 시, 세포내 L-아미노산 농도의 감소에 의하여 측정하기도 한다. L-아미노산의 세포내 농도는 예를 들어 다음과 같이 측정할 수 있다: 비중이 1.07인 실리콘 오일의 적당한 양을 미생물 세포 함유 배지에 첨가하고, 이 세포를 원심분리, 바람직하게는 12,000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 배지로부터 수거한다. 수거된 세포를 그 다음 22% 과염소산으로 처리한다(A. Ishizaki et al, Biotech. Teqniq. (1995) Vol9, No. 6, p409). 이와 같이 제조된 세포를 사용하여 L-아미노산의 세포내 농도를 측정할 수 있다. 또한, "L-아미노산 배출능"은 뒤집힌 막 소포를 사용하여 방사능표지된 L-아미노산의 세포 흡수를 측정하여 간접적으로 조사할 수도 있다(J. Biol. Chem. , Vol. 277, Issue 51, 49841-49849). 예를 들어, 뒤집힌 막 소포는 ybjE 유전자가 도입된 세포를 사용하여 제조한다. 그 다음, 이 소포에 구동 에너지를 제공하는 ATP 또는 다른 기질을 첨가하고, 방사능표지된 L-아미노산의 세포 흡수를 측정한다. 또는, "L-아미노산 배출능"은 미표지 아미노산과 표지 아미노산 사이의 교환 반응 속도를 활성 세포에서 측정하여 조사할 수도 있다.

또한, 본 발명의 미생물은 ybjE 유전자 발현을 증강시키는 변형으로 인해 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체에 더욱내성이 된 미생물인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 미생물은 미변형 균주가 성장할 수 없는 농도의 L-아미노산이나 L-아미노산 유사체의 존재에서 성장할 수 있는 미생물이다. L-아미노산이나 L-아미노산 유사체 존재 하에서의 세포 성장은 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체를 고농도, 예컨대 0.3g/L 이상으로 함유하는 최소 배지에서 확인할 수 있다. ybjE 유전자 증강 균주의 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체 내성은 고농도의 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체를 함유하는 최소 배지에서 상기 균주의 성장을 측정한 뒤, 모균주 또는 미변형 균주의 성장과 비교하여 확인할 수 있다. 성장을 비교하는 방법에는 580 내지 660nm에서 각 균주가 성장한 배지의 광학 밀도를 비교하는 방법이 있다. 배지에 첨가하는 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체의 농도는 미변형 균주의 성장을 억제하는 한 특별한 제한은 없으며, 특히 0.3g/L 이상인 것이 바람직하다. 예를 들어, L-리신 하이드로클로라이드는 80g/L로 첨가하고, L-아르기닌 하이드로클로라이드는 90g/L로 첨가하며, L-오르니틴 하이드로클로라이드는 45g/L로 첨가하고, L-히스티딘 하이드로클로라이드는 30g/L로 첨가하고, L-이소류신은 12g/L로 첨가하며, L-트레오닌은 40g/L로 첨가하고, 일나트륨 L-글루타메이트는 15g/L로 첨가 하고, L-페닐알라닌은 8g/L로 첨가하고, L-프롤린은 85g/로 첨가하고, L-시스테인은 0.3g/L로 첨가한다.

본 발명의 미생물은 ybjE 유전자 발현을 증강시키는 변형으로 인해 L-리신 또는 L-리신 유사체에 더욱 더 내성이 된 것일 수 있다. L-리신 유사체의 예에는 옥살리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로카프롤락탐 등이 있으나, 이에 국한되지는 않는다. L-리신 내성은 전술한 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체 내성과 동일한 방식으로 확인할 수 있다.

본 발명의 미생물은 ybjE 유전자 발현을 증강시키는 변형으로 인해 L-아르기닌 또는 L-아르기닌 유사체에 더욱 내성이 된 것일 수 있다. L-아르기닌 유사체의 예에는 아르기닌 하이드록사메이트, 호모아르기닌, D-아르기닌, 카나바닌, 아르기닌 하이드록사메이트 등이 있다. L-아르기닌 또는 L-아르기닌 유사체 내성은 전술한 L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체 내성과 동일한 방식으로 확인할 수 있다.

<2> L-아미노산 생산 방법

본 발명의 생산 방법은 배지 또는 미생물 세포 내에 L-아미노산의 생산하고 축적시키는 배지에서 본 발명의 미생물을 배양하는 단계 및 이러한 배지 또는 세포로부터 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 사용되는 배지는 미생물을 사용한 발효에 의해 L-아미노산을 발효 생산하기 위해 통상적으로 사용하는 널리 공지된 배지 중에서 선택할 수 있다. 즉, 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요한 경우 다른 유기 성분을 함유하는 통상의 배지가 사용될 수 있다. 탄소원으로는, 글루코스, 슈크로스, 락토스, 갈락토스, 프럭 토스 또는 전분 가수분해물과 같은 당류, 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 알콜류, 또는 푸마르산, 시트르산 또는 석신산과 같은 유기산이 사용될 수 있다. 질소원으로는, 황산암모늄, 염화암모늄 또는 인산암모늄과 같은 무기 암모늄염, 대두 단백질 가수분해물, 암모니아 가스, 수성 암모니아 등과 같은 유기 질소가 사용될 수 있다. 유기 미량 성분으로서 비타민 B₁ 및 L-호모세린, 효모 추출물 등과 같은 물질을 배지에 적당한 양으로 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 이 외에, 필요하다면 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등도 소량으로 첨가한다. 본 발명에 사용되는 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요하다면 다른 유기 성분을 함유하기만 한다면 천연 배지 또는 합성 배지일 수 있다.

배양은 호기성 조건 하에 1 내지 7일 동안 실시하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 24 내지 37℃로 조절하는 것이 바람직하고, pH는 배양 동안 5 내지 9로 조절하는 것이 바람직하다. pH의 조정에는 무기 또는 유기, 산성 또는 알칼리성 물질 뿐만 아니라 암모니아 가스 등도 사용될 수 있다. L-아미노산은 이온 교환 수지, 침전 및 다른 방법 등과 같은 공지된 기술의 조합을 통해 발효액으로부터 일반적으로 수거할 수 있다. L-아미노산이 세포에 축적되는 경우에는, 예컨대 세포를 초음파로 파괴한 뒤, 파괴된 세포를 원심분리로 제거하고, 수득되는 상청액을 이온교환 수지 등을 사용하여 L-아미노산을 수거할 수 있다.

메탄올이 본 발명의 생산 방법에서 주탄소원으로서 사용된다면, 비용이 절감되고, 메탄올 동화능이 있는 메틸로필러스 및 메틸로바실러스 균과 같은 미생물이 바람직하다. 이러한 경우, 배양은 통상의 메탄올 동화 세균에 일반적인 배양법에 따라 실시할 수 있다(예컨대, WO 00/61723, JP2001-120269A 등), 주탄소원으로서 메탄올을 사용하여 배양을 실시할 때, 메탄올은 배지에 0.001 내지 30%의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다. 메탄올 동화 세균의 배양 시, 황산암모늄 등을 배지에 첨가하여 질소원으로서 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 인산칼륨, 인산나트륨, 황산마그네슘, 황산철 및 황산망간과 같은 미량 성분을 소량으로 첨가하는 것도 바람직하다.

메탄올 동화 세균의 배양은 통기를 위한 교반이나 진탕 하의 호기 조건에서, 5 내지 9의 pH 범위와 20 내지 45℃의 온도에서 통상 24 내지 120시간 동안 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 배양물로부터 L-아미노산은 예컨대 이온 교환 수지, 침전 및 기타 다른 방법과 같은 널리 공지된 기술의 조합으로 수거할 수 있다. 세포로부터 L-아미노산의 수거는 전술한 바와 같은 방식으로 수행할 수 있다.

이하, 본 발명은 비제한적인 실시예를 참조로 하여 더 상세히 설명될 것이다. 다음 실시예에 사용된 시약은 다른 표시가 없는 한 제조원[Wako Pure chemicals or Nakarai Tesque]에서 입수했다. 각 실시예에 사용된 배지의 조성은 다음과 같다. pH는 모든 배지마다 NaOH 또는 HCl로 조정했다.

L 배지:

박토 트립톤(Difco) 10g/L

효모 추출물(Difco) 5g/L

염화나트륨 10g/L

pH 7.0

이 배지는 120℃에서 20분 동안 증기살균 처리했다.

L 한천 배지:

L 배지

박토 한천 15g/L

이 배지는 120℃에서 20분 동안 증기살균 처리했다.

최소 배지: (Molecular cloning Vol.3에 따른 배지)

5^*M9 염 200ml

20% 글루코스 20ml

1M 황산마그네슘 2ml

1M 염화칼슘 0.1ml

1L로 채우고, pH 7.0으로 조정했다.

5^*M9 염

인산이나트륨 64g

인산칼륨 15g

염화나트륨 2.5g

염화암모늄 5.0g

1L로 채운다

1L로 채운 후, 이 배지는 115℃에서 10분 동안 증기살균하고, L-리신은 적당 한 시기에 첨가했다.

최소 한천 배지:

최소 배지

박토 한천 15g/L

이 배지는 115℃에서 10분 동안 증기살균 처리했다.

에스케리치아 세균용 L-리신 생산 배지:

글루코스 40g/L

황산암모늄 24g/L

인산이수소칼륨 1.0g/L

황산마그네슘 7수화물 1.0g/L

황산철(IV) 7수화물 0.01g/L

황산망간(IV) 7수화물 0.01g/L

효모 추출물 2.0g/L

약전 탄산칼슘 30g/L

pH는 수산화칼륨으로 7.0으로 조정하고, 성분들은 115℃에서 10분 동안 증기 살균으로 처리했다. 단 글루코스와 MgSO₄·7H₂O는 별도로 살균했다. 항생제로서 클로람페니놀 50mg/L을 첨가했다.

에스케리치아 세균용 L-아르기닌 생산 배지:

글루코스(별도 살균) 60g/L

황산마그네슘 7수화물(별도 살균) 1g/L

황산암모늄 25g/L

인산이수소칼륨 2g/L

효모 추출물(Difco) 5g/L

비타민 B1 0.1mg/L

pH 7.2

약전 탄산칼슘(별도 살균) 25g/L

pH는 수산화칼륨으로 7.2로 조정하고, 성분들은 115℃에서 10분 동안 증기 살균으로 처리했다. 단 글루코스와 MgSO₄·7H₂O는 별도로 살균했다. 항생제로서 클로람페니놀 50mg/L을 첨가했다.

메틸로필러스 세균용 L-리신 생산 배지(SEII 배지):

인산이수소칼륨 1.9g/L

인산이수소나트륨 1.56g/L

황산마그네슘 0.2g/L

황산암모늄 5g/L

황산구리 5수화물 5㎍/L

황산망간(IV) 5수화물 25㎍/L

황산아연(IV) 7수화물 23㎍/L

염화칼슘(II) 2수화물 72mg/L

염화철(II) 6수화물 9.7mg/L

탄산칼슘(Kanto Kagaku) 30g/L

메탄올 2%(vol/vol)

pH 7.0

메탄올 이외의 다른 성분은 121℃에서 15분간 증기 살균으로 처리하고, 메탄올은 성분들이 충분히 냉각된 후 첨가했다. 이 배지는 참고로 문헌[Journal of General Microbiology (1989) 125, 135, 3153-3164, Silman N.J., Carver M. A. & Jones C. W.]에 기재된 바에 따라 제조했다. 황산암모늄 대신에 아세트아미드 1.18g을 사용했고, 염화칼슘은 72mg/L의 농도로 첨가했다.

SEII 한천 배지:

인산이수소칼륨 1.9g/L

인산이수소나트륨 1.56g/L

황산마그네슘 0.2g/L

황산암모늄 5g/L

황산구리 5수화물 5㎍/L

황산망간(IV) 5수화물 25㎍/L

황산아연(IV) 7수화물 23㎍/L

염화칼슘(II) 2수화물 72mg/L

염화철(II) 6수화물 9.7mg/L

탄산칼슘(Kanto Kagaku) 30g/L

메탄올 2%(vol/vol)

pH 7.0

박토 한천(Difco) 15g/L

메탄올 이외의 다른 성분은 121℃에서 15분간 증기 살균으로 처리하고, 메탄올은 성분들이 충분히 냉각된 후 첨가했다.

코리네폼 세균용 CM2S 배지:

폴리펩톤 10g/L

효모 추출물 10g/L

염화나트륨 5g/L

슈크로스 5g/L

DL-메티오닌 0.1g/L

pH는 수산화칼륨으로 7.2로 조정했고, 성분들을 120℃에서 30분 동안 증기 살균했다. 배지를 평판 배양에 사용하는 경우에는 한천 20g/L를 첨가했다.

코리네폼 세균용 L-리신 생산 배지:

글루코스 100g/L

황산암모늄 55g/L

대두 가수분해물 총 질소 1.05g/L

인산이수소칼륨 1.0g/L

황산마그네슘 7수화물 1.0g/L

황산철(IV) 6수화물 0.01g/L

황산망간(IV) 5수화물 0.01g/L

황산마그네슘 0.2g/L

GD113 0.05ml/L

약전 탄산칼슘(별도 살균) 50g/L

pH는 수산화칼륨으로 7.5로 조정하고, 성분들은 115℃에서 10분 동안 증기 살균으로 처리했다. 단 글루코스와 MgSO₄·7H₂O는 별도로 살균했다.

실시예 1: L-리신 배출 유전자의 선별

L-리신 배출 유전자에 대한 조사는 다음과 같이 실시했다.

<1-1>

플라스미드 라이브러리가 도입된 에스케리치아 콜리 균주의 작제

MG1655(ATCC 47076) 균주에서 lysA(디아미노피멜레이트 데카복실라제 유전자)를 결실시켜 수득한 균주로부터 통상의 방법에 따라 염색체 DNA를 추출했다. 이러한 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI로 부분 절단하여 수득한 2 내지 4kbp 단편을, 사전에 BamHI으로 절단해 둔 각 벡터 pTWV229(Takara Bio), pSTV28(Takara Bio) 및 pMW118(Nippon Gene)로 도입시켜, 플라스미드 라이브러리를 수득했다. 이러한 각 플라스미드 라이브러리를 전기천공에 의해 MG1655 균주로 도입시켰다.

<1-2> L-리신 내성 유전자의 선별

플라스미드 라이브러리가 도입된 MG1655 균주는 pTWV229 도입된 균주에 대해서는 암피실린 내성에 근거하여, pSTV28 도입된 균주에 대해서는 클로람페니콜 내성에 근거하여, pMW118 도입된 균주에 대해서는 암피실린 내성에 근거하여 L 배지에서 선발했다. 총 약 80,000개의 형질전환된 콜로니를 수득했다. 이러한 형질전환체를, MG1655 균주가 극소의 콜로니를 형성할 수 있는 리신 하이드로클로라이드 60g/L을 함유하는 최소 배지에 도말하였다.

37℃에서 36시간 동안 배양한 후, 고농도의 리신을 함유하는 배지에서 나타난 약 50개의 콜로니를 후보 리신 내성 균주로서 선발했다. 이러한 후보 리신 내성 균주의 벡터에 삽입된 서열을 측정하기 위해서, 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 인접한 DNA 서열에 상보적인 서열번호 3(M13 정배향 프라이머) 및 서열번호 4(M13 역배향 프라이머)의 서열을 가진 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR을 실시하고, 증폭된 단편의 서열을 분석했다.

뉴클레오타이드 서열을 분석한 결과, 거의 모든 단편이 L-리신 내성 균주에서 913181 내지 914128번에 위치한 ybjE를 함유하고 있음을 발견했다.

ybjE 유전자 서열로부터 추정되는 아미노산 서열을 분석했다. 단백질 서열을 소수성 성질에 대해 분석했을 때, 그 단백질의 소수성이 높은 것을 확인했다. 즉, 이러한 ybjE에 의해 암호화된 단백질이 막 단백질이며 아미노산 배출에 관여할 수도 있음을 암시했다.

실시예 2: 에스케리치아 콜리에서 ybjE 유전자 증폭의 효과

<2-1> ybjE 증폭용 플라스미드의 작제 및 에스케리치아 콜리로 당해 플라스미드의 도입

다음으로, ybjE 유전자의 증폭 효과를 연구하기 위하여 ybjE 증폭용 벡터를 작제하여 MG1655로 도입시켰다. 에스케리치아 콜리(에스케리치아 콜리 K-12 균주)의 염색체 전체 뉴클레오타이드 서열은 보고되어 있고(Science, 277, 1453-1474(1997)), 따라서, 이 문헌에 보고된 ybjE 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 근 거하여, 진뱅크 수탁번호 AE000189의 뉴클레오타이드 번호 4085 내지 4104 서열에 상보적인 서열을 가진 서열번호 5의 합성 올리고뉴클레오타이드 및 상기 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 번호 2689 내지 2708의 서열에 상응하는 서열번호 6의 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하여, 각각 5' 프라이머 및 3' 프라이머로서 PCR을 실시하는데 사용했다. 에스케리치아 콜리 MG1655 균주의 염색체 DNA는 주형으로서 사용했다.

수득한 PCR 산물을, SmaI으로 분해된 벡터 pSTV28(Takara Bio)에 연결시켜 ybjE 증폭용 플라스미드 pSYBJE를 작제했다. 이 작제 도식은 도 1에 제시했다. ybjE 유전자가 lac 프로모터에 대해 정배향으로 연결된 플라스미드는 pSYBJE1로 명명하고, 역배향으로 연결된 플라스미드는 pSYBJE2로 명명했다.

ybjE 유전자 증폭용 플라스미드, pSYBJE1, pSYBJE2 및 대조용 플라스미드 pSTV28(Takara Bio)을 각각 통상의 방법에 따라 MG1655(ATCC 47076)에 도입시켰다. 클로람페니콜 내성에 근거하여 형질전환체를 선발하고, pSYBJE1이 도입된 균주는 MG1655/pSYJE1로 명명하고, pSYBJE2가 도입된 균주는 MG1655/pSYBJE2로 명명했으며, pSTV28이 도입된 균주는 MG1655/pSTV28로 명명했다.

<2-2> 에스케리치아 세균에서 ybjE 유전자 증폭의 효과

에스케리치아 콜리 MG1655 균주의 각종 아미노산에 대한 내성에 미치는 ybjE 유전자의 증폭 효과는 pSYBJE1 또는 pSYBJE2가 도입된 균주를 사용하여 조사했다. 즉, MG1655/pSYBJE1, MG1655/pSYBJE2 및 대조용 MG1655/pSTV28 균주를 각각 클로람페니콜 50㎍/ml을 함유하는 L 배지 5ml에 접종하고, 왕복 운동으로 진탕되는 배양 장치에서 약 6시간 동안 배양했다. 세포가 OD600 = 약 1.0의 혼탁도로 증식된 배양액을 원심분리한 후, 세포를 M9 최소 배지로 2회 세척했다. 그 다음, 세포를 클로람페니콜 50㎍/ml를 함유하는 M9 최소 배지 및 리신 하이드로클로라이드 80g/L을 함유하는 M9 최소 배지에 OD600 = 0.05의 혼탁도로 접종하고 약 70시간 동안 배양했다.

그 결과는 도 2에 도시했는데, 이 도면은 ybjE 유전자 발현의 증강이 대조군 균주에 비해 고농도 L-리신의 존재하에 초기 단계에서의 성장 속도 뿐만 아니라 대수기 성장 단계 동안의 세포 분열 속도를 증가시킨다는 것을 보여준다.

실시예 3: 에스케리치아 세균의 아미노산 내성에 대한 ybjE 유전자 파괴의 효과

<3-1> ybjE 유전자 파괴된 균주의 작제

ybjE 유전자의 결실은 "적색 구동 통합법(Red-driven integration)"으로 불리는 다첸코와 워너에 의해 개발된 방법에 따라 수득했다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645). 이 방법에 따르면, PCR 산물은 5' 측에 목적 유전자를 함유하고 3' 측에 항생제 내성 유전자를 함유하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수득했다. 이 방법을 사용하면 유전자 파괴된 균주가 단일 단계로 작제될 수 있다. 이 방법에 따라, ybjE 유전자 주위 영역에 상보적인 프라이머 또는 주형 플라스미드에 항생제 내성을 부여하는 유전자를 설계하고, 내인성 ybjE 유전자의 PCR 산물을 수득했다. 이러한 PCR 산물은 플라스미드 pACYC184(NBL Gene Sciences Ltd., U.K., GenBank/EMBL 수탁번호 X06403)를 주형으 로 사용하고, 서열번호 7 및 8의 서열을 가진 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 수득할 수 있다.

증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔에서 정제하고, 감온성 복제능이 있는 플라스미드 pKD46을 보유하는 에스케리치아 콜리 MG1655 균주의 전기천공에 사용했다. 플라스미드 pKD46(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640-6645)은 아라비노스 유도성 ParaB 프로모터에 의해 조절되는 λ Red 상동성 재조합 시스템의 유전자(λ, β, exo 유전자)를 함유하는 λ 파아지의 2154 뉴클레오타이드 DNA 단편을 함유한다(진뱅크/EMBL 수탁번호 J02459, 31088번에서 33241번까지의 뉴클레오타이드). 플라스미드 pKD46은 상기 PCR 산물을 MG1655 균주의 염색체로 삽입시키는 데 반드시 필요하다.

전기천공에 사용되는 컴피턴트 세포는 다음과 같이 제조했다. 에스케리치아 콜리 MG1655 균주를 앰피실린 100mg/L을 함유하는 LB 배지, 30℃에서 하룻밤 동안 배양하고, 그 다음 앰피실린과 L-아라비노스(1mM)를 함유하는 SOB 배지(Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 5ml로 100배 희석했다. 희석된 세포를 OD600이 약 0.6이 될 때까지 통기 하에 30℃에서 성장시킨 후, 100배 농축한 뒤, 세포를 전기천공에 사용할 수 있도록 빙냉한 탈이온수로 3회 세척했다. 전기천공은 컴피턴트 세포 70㎕와 PCR 산물 약 100ng을 사용하여 수행했다. 전기천공 후 세포를 SOC 배지(Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) 1ml에 첨가하고, 37℃에서 2.5시간 동안 배양한 다음, 37℃의 L 한천 배지 위에 도말하였다. 이러한 방식에 따라 Cm(클로람페니콜) 내성의 재조합 균주를 선발했다. 그 다음, pKD46b 플라스미드를 제거(cure)하기 위해 Cm(클로람페니콜)을 함유하는 L 한천 배지, 42℃에서 2회 계대배양하고, 수득되는 콜로니의 앰피실린 내성을 조사했다. 이러한 방식에서, pKD46이 제거된 앰피실린 감수성 균주가 수득되었다.

클로람페니콜 내성을 통해 동정될 수 있는 돌연변이 균주에서 ybjE 유전자의 파괴는 PCR로 확인했다. ybjE 유전자 파괴된 균주 MG1655△ybjE::cat의 세포에 존재하는 DNA를 사용하여 수득한 PCR 산물의 길이는 야생형 균주에서 수득된 것보다 길었다. 이로써, 클로람페니콜 내성 유전자가 ybjE 유전자에 삽입된 것이 확인되었고, ybjE 유전자가 파괴되었음을 확인했다. ybjE 유전자 파괴되고 클로람페니콜 내성 유전자가 삽입되어 있는 균주는 MG1655△ybjE::Cm으로 명명했다.

<3-2> ybjE 유전자 결손 균주의 아미노산 내성의 확인

ybjE 유전자 결손 균주인 MG1655△ybjE::Cm이 아미노산 내성에 미치는 영향을 조사했다. MG1655△ybjE::Cm 및 대조용 MG1655 균주를 L 배지에 접종하고 왕복 운동으로 진탕되는 배양 장치 상에서 약 6시간 동안 배양하여 수득한 배양액(600 OD = 약 1.0)을 원심분리했다. 그 다음, 세포를 M9 최소 배지로 2회 세척하고, M9 최소 배지 또는 리신 하이드로클로라이드를 80g/L 함유하는 M9 최소 배지에 OD 600=0.05의 농도로 접종하고, 약 70시간 동안 배양했다. 그 다음 성장을 조사했다.

그 결과는 도 3에 제시했다. 도 3에 제시된 바와 같이, 대조용 균주에 비해, ybjE 유전자의 결실은 고농도의 L-리신 존재하에 배양될 때 초기 단계의 성장이 감 소되었다. 이러한 결과 및 실시예 2의 결과로부터 ybjE 유전자가 L-리신에 대한 내성을 부여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: ybjE 증폭이 에스케리치아 세균의 L-리신 생산에 미치는 효과

에스케리치아 콜리의 L-리신 생산 균주로서, AEC(S-(2-아미노에틸)시스테인) 내성인 WC196 균주(AJ13069(FERM BP-5252), WO 96/17930)를 사용했다.

WC196 균주를 ybjE 증폭용 플라스미드 pSYBJE1로 형질전환시켰다. 대조용으로, 플라스미드 pSTV28(Takara Bio)을 별도로 형질전환시켰다(실시예 2에서와 같이). 그 결과, 클로람페니콜 내성 균주가 수득되었다. 플라스미드의 도입을 확인하고, 플라스미드 pSYBJE1이 도입된 균주를 WC196/ybjE 로 명명하고, 대조용 플라스미드 pSTV28이 도입된 균주는 WC196/pSTV28로 명명했다.

WC196/ybjE 및 WC196/pSTV28 균주를 각각 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L 배지, 37℃에서 OD600이 약 0.6이 될 때까지 배양했다. 그 다음, 각 배양액에 40% 글리세롤 용액의 동등량을 첨가하고, 교반한 뒤, 적당한 부피로 나누어, -80℃에 보관했다. 이러한 배양액을 본 명세서에서는 글리세롤 스톡이라 명명했다.

이러한 균주의 글리세롤 스톡을 해동시켜, 각 스톡 100㎕를 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L 평판에 균일하게 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 평판에서 수집한 세포의 약 1/8을 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 발효 배지(M9 최소 배지) 20ml가 담긴 500ml 사카구치 플라스크에 접종하고, 왕복 운동으로 진탕되는 배양 장치, 37℃에서 27시간 동안 배양했다. 배양 후, 배지에 축적된 리신의 양을 분석기(Biotech Analyzer AS210; Sakura Seiki)로 측정했다. 세포에 존재하는 L-리신 농도는 적당한 부피의 배양액을 비중이 1.07인 실리콘 오일에 첨가하고, 12000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세포를 수거한다. 이어서 수거된 세포를 22% 과염소산 처리로 파괴시켜 리신의 농도를 측정하였다.

L-리신의 축적 및 수율뿐만 아니라 24시간 후 세포외 대 세포내 리신 농도의 비를 표 1에 제시했다. ^*로 표시한 세포외 대 세포내 리신 농도의 비는 세포외 리신 농도(건조 세포 중량 1g당 mg)를 세포내 리신 농도(건조 세포 중량 1g당 mg)로 나누어 측정했다. 표 1에 제시된 바와 같이, WC196/pSYBJE1 균주는 ybjE 유전자가 도입되지 않은 WC196/pSTV28 균주에 비해 더 많은 리신 양을 축적하였다. 더욱이, ybjE 유전자가 도입된 WC196/pSYBJE1 균주에서는 대조용 WC196/pSTV28 균주에 비해 세포내 리신 농도의 현저한 감소로 인하여 세포내 L-리신 농도에 비해 세포외 L-리신 농도가 증가된 것을 보여주었으며, 이는 ybjE 유전자가 L-리신 배출 유전자임을 암시했다.

균주	L-리신 축적(g/L)	L-리신 수율(%)	세포외 대 세포내 리신 농도의 비*
WC196	1.3	3.3	17.7
WC196/pSTV28	0.9	2.3	12.2
WC196/pSYBJE1	7.6	19	35.3

실시예 5: 에스케리치아 세균의 L-아르기닌 생산에 미치는 ybjE 증폭의 효과

L-리신의 축적 및 수율은 대조용 균주에 비해 ybjE 유전자 증폭된 균주에서 모두 증가된 것으로 관찰되었다. 또한, L-리신과 유사한 공지된 염기성 아미노산인 L-아르기닌의 생산에 미치는 ybjE 증폭의 효과도 조사했다. 에스케리치아 콜리의 L-아르기닌 생산 세균으로서, N-아세틸글루타메이트 신타제의 피드백 억제가 해제된 237 균주(VKPM B-7925, 러시아 특허출원번호 2000117677)를 사용했다.

<5-1> 에스케리치아 콜리 237 균주로부터의 ybjE 유전자 증폭된 균주의 제조

실시예 4에서와 같은 방법을 사용하여 ybjE 유전자 증폭된 237/pSYBJE1 균주 및 대조용 237/pSTV28 균주를 제조했다.

<5-2> L-아르기닌 생산

이하에 기술되는 배지, 배양 방법 및 분석 방법을 사용하여 L-아르기닌 생산에 미치는 ybjE 유전자 증폭의 효과를 조사했다. 전배양으로, 글리세롤 스톡 100㎕를 L 한천 배지에 접종하고, 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L 평판에 균일하게 도말한 뒤, 32℃에서 24시간 동안 항온배양했다. 평판에서 수거된 세포의 약 1/8을 아르기닌 생산 배지 20ml에 접종하고, 32℃에서 90시간 동안 배양했다. 플라스미드 도입된 균주의 배양은 클로람페니콜 첨가하에 수행했다.

배양액 1ml을 배양 동안 채취하여, 세포 및 배양액에 존재하는 글루코스 농도 및 L-아르기닌 축적을 측정했다. 배양액의 글루코스 농도 및 L-아르기닌 축적을 측정하기 위해, 배양액을 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 수득되는 상청액을 물로 적당히 희석한 뒤, 희석된 상청액에서의 농도를 바이오텍 분석기(Biotech Analyzer)(Sakura Seiki) 및 아미노산 분석기 L-8500(Hitachi Instrument Service)을 사용하여 측정했다. 세포에 존재하는 L-아르기닌 농도를 측정하기 위하여 배양액의 적당한 용량을 비중이 1.07인 실리콘 오일에 첨가하고 12000rpm에서 2분 동안 원심분리한 뒤, 수거된 세포를 22% 과염소산 처리로 파괴시켜 L-아르기닌 농도를 측정했다. 90시간 후 L-아르기닌의 축적 및 수율, 그리고 세포외 대 세포내 L-아르기닌 농도의 비는 표 2에 정리했다. ^*로 표시한 세포외 대 세포내 비는 세포외 L-아르기닌 농도(건조 세포 중량 1g당 mg)를 세포내 L-아르기닌 농도(건조 세포 중량 1g당 mg)로 나누어 측정했다.

ybjE 유전자 증폭된 균주의 L-아르기닌 생산

균주	L-아르기닌 축적(g/L)	L-아르기닌 수율(%)	세포외 대 세포내 아르기닌 농도의 비*
237/pSTV28	0.8	1.7	23.0
237/pSYBJE1	1.7	3.6	25.6

L-아르기닌의 축적 및 수율은 ybjE 유전자 증폭된 균주에서 대조용 균주에 비해 증가된 것으로 관찰되었다. 또한, 세포외 대 세포내 아르기닌 농도의 비도 증가되었다. 즉, 상기 유전자가 역시 L-아르기닌의 배출에도 관련이 있음이 암시되었다.

실시예 6: 에스케리치아 세균 유래의 ybjE 유전자를 메틸로필러스 세균으로 도입시킨 효과

<6-1> ybjE 증폭용 플라스미드 pRSybjE의 작제

메틸로필러스 세균에 ybjE 유전자를 도입시키기 위해, 공지의 플라스미드 pRS(JP 3-501682A)를 사용하여 ybjE 발현용 플라스미드 pRSybjE를 작제했다. pRS는 트레오닌 오페론을 암호화하는 DNA 영역을 결실시켜 수득한 pVIC40 플라스미드(WO 90/04636, JP 3-501682A)의 벡터 분절을 보유한 플라스미드이다. 이 플라스미드 pVIC40은 RSF1010의 유도체인 숙주 스펙트럼이 광범위한 벡터 플라스미드 pAYC32(Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D. , Plasmid, 1986,16, 161-167)에서 유도된 것이다.

먼저, tac 프로모터를 함유하는 플라스미드 pRStac를 도 3에 도시한 설계도에 따라 pRS로부터 다음과 같이 작제했다. pRS 벡터를 제한효소 EcoRI 및 PstI으로 절단하고, 페놀/클로로포름 용액에 첨가하여 혼합하여 반응을 정지시켰다. 이러한반응 혼합물을 원심분리한 후, 상층을 수거하고 여기에서 DNA를 에탄올 침전으로 수거하고, 0.8% 아가로스 겔로 분리했다. EASY TRAP Ver.2(DNA 수거 키트, Takara Bio)를 사용하여 약 8킬로염기쌍(이하, "kbp"라 한다)의 DNA 단편을 수집했다. 또는, tac 프로모터 영역을, 주형으로 pKK223-3 플라스미드(발현 벡터, Pharmacia)를 사용하고 서열번호 16 및 17의 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다(사이클은 94℃에서 20초간의 변성 반응, 55℃에서 30초간의 어닐링 반응 및 72℃에서 60초간의 신장 반응을 30회 반복하여 실시했다). PCR에 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용했다. tac 프로모터를 함유하는 증폭된 DNA 단편을 PCR prep(Promega)을 사용하여 정제하고, 제한효소 EcoRI 및 EcoT22I로 절단했다(이러한 인식 부위는 프라이머에 설계되어 있는 것이다). 그 다음, 반응 혼합물을 페놀/클로로포름 용액에 첨가하고, 혼합하여 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 원심분리한 후, 상층을 수거하고, 에탄올 침전으로 DNA를 수거한 뒤, 0.8% 아가로스 겔에서 분리했다. 약 0.15kbp의 DNA 단편을 EASY TRAP Ver.2를 사용하여 수거했다.

pRS 벡터 및 전술한 바와 같이 제조한 tac 프로모터 영역 단편의 절단 산물을 DNA 연결 키트 Ver.2(Takara Bio)를 사용하여 연결시켰다. 이러한 연결 반응 용액을 에스케리치아 콜리(에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포, Takara Bio)의 형질전환에 사용했다. 세포를 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양했다. 한천 배지에 나타나는 콜로니를 각각 20mg/L의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 액체 배지에 접종하고, 진탕하에 37℃에서 8시간 동안 배양했다. 알칼리-SDS 방법을 통해 각 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 각 플라스미드의 구조를 제한효소 분해로 확인했다. 스트렙토마이신 내성 유전자 및 tac 프로모터의 전사 방향이 동일한 플라스미드를 선발하여 pRStac로 명명했다.

이와 같이 수득한 pRStac를 Sse8387I(Takara Bio)로 절단하고, 페놀/클로로포름 용액과 혼합하여 반응을 종결시켰다. 이러한 반응 혼합물을 원심분리한 후, 상층을 수거하여 에탄올 침전과 이어서 DNA 평활말단 키트를 사용하여 평활말단화한 후 DNA를 수거했다.

또한, 전술한 바와 같은 pSYBJE1을 제한효소 PvuII로 절단하고, 페놀/클로로포름 용액과 혼합하여 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 원심분리한 후, 상층을 수거하고, DNA를 에탄올 침전으로 수거한 뒤, 0.8% 아가로스 겔에서 분리시켰다. lac 프로모터 및 ybjE 유전자를 함유하는 약 1.5kbp의 DNA 단편을 EASY TRAP Ver.2(DNA 수거 키트, Takara Bio)를 사용하여 수거했다.

이와 같이 제조한 ybjE 유전자 영역 단편과 pRStac 벡터의 절단 산물은 DNA 연결 키트 Ver.2(Takara Bio)를 사용하여 함께 연결시켰다. 이러한 연결 반응 용액을 사용하여 에스케리치아 콜리(에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포, Takara Bio)를 형질전환시켰다. 이러한 세포를 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양했다. 한천 배지에 나타나는 콜로니를 각각 20mg/L의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 액체 배지에 접종하고, 진탕하에 37℃에서 8시간 동안 배양했다. 알칼리-SDS 방법을 통해 각 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 각 플라스미드의 구조를 제한효소 분해 및 DNA 서열분석으로 확인하여 pRSybjE를 선발했다(도 4). pRSybjE 플라스미드에서, ybjE 유전자는 tac 프로모터와 동일 방향으로 전사되도록 위치되어 있었다.

<6-2> 메틸로필러스 세균에 pRSybjE의 도입

전술한 바와 같이 수득한 pRSybjE를 전기천공(Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997))를 통해 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 AS1 균주(NCIMB10515)에 도입시켰다. 또한, pRS는 대조용으로서 AS1 균주로 도입시켰다. 스트렙토마이신 내성에 근거하여 pRSybjE 및 pRS에 대한 형질전환체를 수득했다.

pRS 또는 pRSybjE를 보유하는 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 AS1 균주(각각 AS1/pRS, AS1/pRSybjE)를 스트렙토마이신 20mg/L를 함유하는 SEII 평판에 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 그 다음, 배지 표면의 약 0.3㎠에 존재하는 세포를 박리시켜, 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 SEII 생산 배지(20ml)에 접종한 뒤, 37℃에서 34시간 동안 진탕하에 배양했다. 배양을 완료한 후, 세포를 원심분리로 제거하고, 배양 상청액에 존재하는 L-리신 농도를 아미노산 분석기(Nihon Bunko, 고성능 액체 크로마토그래피)로 측정했다. 결과는 표 3에 정리했다.

균주	L-리신 생산양(g/L)	L-아르기닌 생산양(g/L)
AS1/pRS	<0.01	<0.01
AS1/pRSybjE	0.70	0.14

ybjE 유전자 증폭의 결과로서, L-리신 및 L-아르기닌의 축적량이 대조용 AS1/pRS 균주에 비해 현저히 증가되었다. 즉, ybjE가 메틸로필러스 메틸로트로퍼스에서도 염기성 L-아미노산 배출 작용을 한다는 것이 암시되었다.

실시예 7: 피드백 억제 해제형 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자 및 ybjE 유전자가 도입된 메틸로필러스 메틸로트로퍼스의 평가

ybjE 유전자의 도입이 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 AS1 균주에서 L-리신의 배출을 촉진시킨다고 밝혀졌기 때문에, L-리신 생산을 추가로 개선시키기 위하여 ybjE 유전자 도입된 균주에 존재하는 L-리신 생합성 효소의 활성을 증강시켰다.

<7-1> L-리신에 의한 피드백 억제에 내성인 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유한 플라스미드 pRSdapA의 작제

L-리신에 의한 피드백 억제에 내성인 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 유전자를 함유한 플라스미드(이하, "dapA ^* "로 명명함)를 도 5에 제시된 작제 설계에 따라 제조했다.

실시예 6에서 제조한 pRStac를 Sse8387I 및 XbaI로 절단하고, 페놀/클로로포름 용액과 혼합하여 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 원심분리한 후, 상층을 수거하여, DNA를 에탄올 침전으로 수거하고, 0.8% 아가로스 겔로 분리했다. 결과적으로, 약 8.2kbp의 DNA 단편이 수거되었다.

dapA^* 유전자 단편을 주형으로 dapA^* 유전자를 함유하는 플라스미드 RSFD80(미국 특허 제6,040,160호) 및 서열번호 14와 15의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다(94℃에서 20초간의 변성 반응, 55℃에서 30초간의 어닐링 반응 및 72℃에서 60초간의 신장 반응). PCR에 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용했다. 이와 같이 수득된 dapA^* 단편을 PCR prep(Promega)을 사용하여 정제하고, 제한효소 Sse8387I 및 XbaI로 절단했다. 반응 용액을 페놀/클로로포름 용액과 혼합하여 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 원심분리한 후, 상층을 수거하고, 에탄올 침전으로 DNA를 수거한 뒤, 0.8% 아가로스 겔에서 분리했다. 결과적으로, 약 1.0kbp의 DNA 단편이 수거되었다.

pRStac 벡터 및 전술한 바와 같이 제조한 dapA ^* 유전자 단편의 절단 산물을 DNA 연결 키트 Ver.2(Takara Bio)를 사용하여 서로 연결시켰다. 이러한 연결 반응 용액을 에스케리치아 콜리 세포(에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포, Takara Bio)의 형질전환에 사용했다. 세포를 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양했다. 한천 배지에 나타나는 콜로니를 각각 20mg/L의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 액체 배지에 접종하고, 진탕하에 37℃에서 8시간 동안 배양했다. 알칼리-SDS 방법을 통해 각 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 각 플라스미드의 구조를 제한효소 분해 및 DNA 서열분석으로 확인하여 pRSdapA 플라스미드를 선발했다. pRSdapA 플라스미드에서, dapA ^* 유전자는 tac 프로모터와 동일한 방향으로 전사되도록 위치되어 있었다.

이와 같이 수득한 pRSdapA 플라스미드로 형질전환된 에스케리치아 콜리 JM109 균주를 AJ13831로 명명하고, 이 균주를 독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 305-5466 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1초메 1-1 츠쿠바 센터 6))에 2001년 6월 4일에 기탁하여, 수탁번호 FERM P-18370을 부여받았다. 이후, 이 기탁물은 부탁페스트 조약 하의 국제기탁기관으로 2002년 5월 13일에 이관되어, 수탁번호 FERM BP-8041을 부여받았다. 따라서, pRSdapA 플라스미드는 이 균주로부터 수득할 수 있다.

<7-2> ybjE 및 dapA ^* 를 함유하는 플라스미드의 작제

ybjE 및 dapA ^* 를 조합한 효과를 평가하기 위하여, pRSdapA 플라스미드에 ybjE 유전자를 삽입시켜 수득한 플라스미드를 도 5에 제시된 방법에 따라 작제했다. 실시예 6에서 제조한 pRSybjE를 제한효소 SapI로 절단하고, DNA 평활말단 키트(Takara Bio)를 사용하여 평활말단화했다. 또한, 플라스미드 pRSdapA를 제한효소 EcoRI 및 SapI로 절단하고, tac 프로모터 및 dapA ^* 영역을 함유하는 약 1kbp의 단편을 0.8% 아가로스 겔로 분리한 뒤, EASY TRAP Ver.2(Takara Bio)를 사용하여 수거했다. 이 단편을 전술한 바와 동일한 방식으로 평활말단화하고, DNA 연결 키트 Ver.2(Takara Bio)를 사용하여 전술한 pRSybjE의 절단 산물에 연결시켰다.

이러한 연결 반응 용액을 사용하여 에스케리치아 콜리(에스케리치아 콜리 JM109 컴피턴트 세포, Takara Bio)를 형질전환시켰다. 이러한 세포를 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양했다. 한천 배지에 나타나는 콜로니를 각각 20mg/L의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 액체 배지에 접종하고, 진탕하에 37℃에서 8시간 동안 배양했다. 알칼리-SDS 방법을 통해 각 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 각 플라스미드의 구조를 제한효소 분해 및 DNA 서열분석으로 확인하여 pRSybjEdapA 플라스미드를 확인했다. 이 플라스미드에서 ybjE 유전자 및 dapA ^* 유전자는 서로 동일한 방향으로 전사되도록 위치되어 있었다.

전술한 바와 같이 수득한 pRSybjEdapA 뿐만 아니라 pRSybjE, pRSdapA 및 대조용 플라스미드 pRS를 각각 전기천공을 통해 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 AS1 균주(NCIMB 10515)에 도입시켰다.

<7-3> ybjE 및 dapA ^* 를 보유하는 메틸로필러스 세균에 의한 L-리신의 생산

전술한 바와 같이 수득한 pRSybjEdapA, pRSybjE, pRSdapA 또는 pRS가 도입된 AS1 균주를 각각 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 SEII 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양했다. 그 다음, 배지 표면의 약 0.3㎠에 존재하는 세포를 박리하여, 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 SEII 생산 배지(20ml)에 접종한 뒤, 37℃에서 34시간 동안 진탕하에 배양했다. 배양을 완료한 후, 세포를 원심분리로 제거하고, 배양 상청액에 존재하는 L-리신 농도를 아미노산 분석기(Nihon Bunko, 고성능 액체 크로마토그래피)로 측정했다. 결과는 표 4에 정리했다. pRSybjEdapA가 도입된 균주는 pRSdapA 또는 pRSybjE가 유일하게 도입된 균주에 비해 L-리신 축적의 증가를 나타냈다. 즉, ybjE 및 dapA ^* 유전자 둘다 L-리신 생산의 상승 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

균주	L-리신 생산량(g/L)
AS1/pRS	0.00
AS1/pRSybjE	0.7
AS1/pRSdapA	0.12
AS1/pRSybjEdapA	1.38

실시예 8: 리신 유사체 내성에 미치는 ybjE 증폭의 효과

다음으로, ybjE 유전자 증폭이 리신 유사체 내성에 미치는 효과를 조사했다. 전술한 AS1/pRSybjE 또는 대조용 pRS를 보유하는 메틸로필러스 메틸로트로퍼스 AS1 균주를 각각 스트렙토마이신 20mg/L을 함유하는 SEII배지에서 하룻밤동안 배양했다. 각 배양물을 새로운 SEII 배지(스트렙토마이신 20mg/L 함유)에 10%의 용량으로 접종하고, 세포가 대수 성장기에 도달할 때까지 진탕하에 37℃에서 배양했다. 각 배양물을 스트렙토마이신 20mg/L, S-(2-아미노에틸)시스테인(AEC) 0, 3 또는 5g/L을 함유하는 SEII 배지에 4% 용량으로 접종하고, 진탕하에 37℃에서 배양했다. 배양 동안 660nm에서의 OD값을 30분마다 측정하여 균주의 AEC 내성 정도를 조사했다. 결과를 도 6에 도시했다. Advantec에서 제작된 생물분광기록계(biophotorecorder) TN-1506을 사용하여 내성 정도를 측정하고, 배양물 5ml을 시험관에 넣어 분석했다. 결과는 도 6에 제시했다.

결과로서, AEC 첨가 시, AS1/pRSybjE 균주에서는 성장 지연이 관찰되지 않은 반면, AS1/pRS 균주의 성장은 상당히 지연되었다. 즉, ybjE 유전자의 증폭이 L-리신 내성을 부여할 뿐만 아니라 L-리신 유사체 내성도 부여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 9: L-트레오닌 생산에 미치는 ybjE 증폭의 효과

출발 균주로서 에스케리치아 콜리 B-5318 균주(EP 0593792)를 사용했다. B-5318 균주를 실시예 2에 기술된 바와 같은 플라스미드 pSYBJE1 또는 대조용 플라스미드 pSTV28(Takara Bio)로 형질전환시켜 클로람페니콜 내성 균주를 수득했다. 서열 분석 후, B-5318/pSYBJE1 균주 및 B-5318/pSTV28 균주를 선발했다.

이 균주들을 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L 배지, 37℃에서 OD600이 약 0.6이 될 때까지 배양했다. 그 다음, 각 배양액에 40% 글리세롤 용액을 동량으로 첨가하고, 혼합한 뒤, 적당한 부피로 나누어, -80℃에 보관했다.

이러한 글리세롤 스톡을 해동시켜, 각 스톡 100㎕를 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L 평판에 균일하게 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 그 다음, 세포를 배지 표면의 약 1/8에서 수집하여, L-트레오닌 생산 배지에 접종한 뒤, 진탕하에 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 배양 완료 후, 세포를 원심분리로 제거하고, 배양 상청액의 L-트레오닌 농도를 통상의 방법에 따라 측정했다. 그 결과, ybjE 유전자가 증폭되고 L-트레오닌 생산능이 증강된 균주를 수득할 수 있었다.

실시예 10: 코리네폼 세균에서 ybjE 유전자 증폭의 효과

<10-1> ybjE 유전자 증폭용 플라스미드의 작제

실시예 2에 기술된 바와 같은 pSYBJE2를 EcoRI 및 PstI로 절단하고, 절단된 단편을, 동일 효소로 절단된 pVK7(미국 특허원 제20030175912호)에 연결시켰다. 수득되는 플라스미드를 pVYBJE1로 명명했다.

<10-2> 코리네폼 세균을 이용한 L-리신 생산에 미치는 ybjE 유전자 증폭의 효과

코리네박테리움 글루타미컴(브레비박테리움 락토퍼멘텀) ATCC13861 균주를 출발 균주로서 사용했다. 이러한 ATCC13861 균주를 플라스미드 pVYBJE1 또는 대조용 플라스미드 pVK7로 형질전환시켜 카나마이신 내성 균주를 수득했다. 서열 분석 후, ATCC13861/pVYBJE1 균주 및 ATCC13861/pVK7 균주를 선발했다.

이러한 균주를 카나마이신 25mg/L을 함유하는 M-CM2S 배지에서 31.5℃ 하에 OD600이 약 0.6이 될 때까지 배양했다. 이 배양물을 동량의 40% 글리세롤 용액과 혼합하고, 적당한 용량으로 나누어 -80℃에 보관했다.

이러한 글리세롤 스톡을 해동시켜, 각 스톡 100㎕를 가나마이신 25mg/L을 함유하는 M-CM2S 평판에 균일하게 접종하고, 31.5℃에서 24시간 동안 배양했다. 그 다음, 세포를 배지 표면의 약 1/8에서 수거하여, 가나마이신 25mg/L을 함유하는 발효 배지 20ml에 접종한 뒤, 115rpm으로 진탕하에 31.5℃에서 42시간 동안 배양했다. 배양 완료 후, 세포를 원심분리로 제거하고, 배양 상청액의 L-리신 농도를 바이오텍 분석기(Biotech Analyzer) AS210(Sakura Seiki)으로 측정했다. 42시간 동안 배양 후, 배지의 글루코스는 완전히 소비되어 있었다.

결과는 표 5에 정리했다. ybjE 유전자가 증폭된 ATCC13861/pVYBJE1은 대조용 ATCC13861/pVK7 균주에 비해 더 많은 양의 L-리신을 축적시킬 수 있었다. 즉, ybjE 유전자가 코리네폼 세균에서도 L-아미노산 배출에 작용하고 L-리신 생산을 증강시킴을 알 수 있었다.

균주	L-리신 생산량(g/L)
ATCC13861/pVK7	1.1
ACC13861/pVYBJE1	4.2

실시예 11

고농도 L-아미노산의 존재하에 성장에 미치는 ybjE 유전자 증폭의 효과

에스케리치아 콜리 MG1655 균주(ATCC47076)를 ybjE 유전자를 함유하는 pSYBJE1 또는 대조용 플라스미드 pTSV28(Takara Bio)로 형질전환시켰다. 또한, MG1655 균주를 3번째 뉴클레오타이드(구아닌)가 아데닌으로 치환된 서열번호 1의 서열을 가진 돌연변이 ybjE 유전자를 포함하는 pSYJE1^*2-1로 형질전환시켰다.

이러한 플라스미드들이 도입된 형질전환체는 클로람페니콜 내성에 따라 선발하고, 선발된 균주를 MG1655/pSYJE1, MG1655/pSYJE1^*2-1, 및 MG1655/pSTV28로 각각 명명했다.

pSYJE1^*2-1은 다음과 같이 작제했다. 돌연변이 ybjE 유전자를 E.콜리의 L-리신 생산성 NVC578 균주의 염색체 DNA로부터 서열번호 5 또는 6을 각각 보유하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 서열분석하여, 3번째 위치의 뉴클레오타이드(구아닌)가 아데닌으로 치환된 서열번호 1의 서열을 갖는 것을 확인했다. 증폭된 DNA를 SmaI 절단된 pTV28에 연결시키고, lac 프로모터에 의해 발현되도록 돌연변이 ybjE 유전자가 배치된 플라스미드를 선발하여 pSYJE1^*2-1로 명명했다.

또한, 돌연변이 ybjE 유전자는 중첩 신장 PCR(Nucleic Acids Res, 25, 2227-8, 1997)과 같은 방법을 사용하여 야생형 ybjE 유전자에 돌연변이를 도입시켜 수득할 수도 있고, 여기서, 돌연변이 ybjE 유전자는 한 프라이머에 뉴클레오타이드 치환이 있는 프라이머들을 사용하여 증폭시킨다.

그 다음, 각 L-아미노산의 고농도 존재하에 MG1655//pSYJE1, MG1655/pSYJE1^*2-1, 및 MG1655/pSTV28 균주의 성장을 조사했다.

각 균주를 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L-배지 5ml에서 약 6시간 동안 진탕하에 배양했다. 배지의 OD600이 약 1.0에 도달한 후, 배양액을 원심분리하고, 세포를 M9 최소 배지로 2회 세척한 후 클로람페니콜 50mg/L과 각 L-아미노산(이소류신 12g/L, 트레오닌 40g/L, 나트륨 글루타메이트 15g/L, 히스티딘 하이드로클로라이드 30g/L, 오르니틴 하이드로클로라이드 45g/L, 아르기닌 하이드로클로라이드 90g/L, 페닐알라닌 8g/L, 프롤린 85g/L 또는 시스테인 0.3g/L)을 함유하는 M9 최소 배지에 OD600 = 0.05의 농도로 접종하고, 70시간 동안 배양했다. L-이소류신은 지방족 L-아미노산의 대표로서 선택하고, L-트레오닌은 히드록실 L-아미노산의 대표로서 선택했으며, L-프롤린은 환형 L-아미노산의 대표로, L-페닐알라닌은 방향족 L-아미노산의 대표로, L-시스테인은 함황 L-아미노산의 대표로, L-글루탐산은 산성 L-아미노산 및 이의 아미드의 대표로 선택했다. 그 결과는 도 7 내지 15에 제시했다. 이로부터, 고농도 L-아미노산, 특히 L-아르기닌, L-오르니틴, L-이소류신, L-글루탐산, L-트레오닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-페닐알라닌 및 L-시스테인의 존재 하에 MG1655 균주의 성장이 ybjE 유전자 증폭에 의해 증강된다는 것이 확인되었다. 또한, 돌연변이 ybjE 유전자가 야생형 ybjE 유전자보다 더 효율적으로 MG1655 균주에 아미노산 내성을 부여한다는 것도 확인되었다.

실시예 12: 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 가진 ybjE 유전자의 효과

서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 49에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 가진 ybjE 유전자(이하, ybjE-900이라 명명함)를 MG1655 균주의 염색체 DNA로부터 서열번호 13 또는 12의 뉴클레오타이드 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 또한, 위치 1번의 구아닌이 아데닌으로 치환된 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 1에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 가진 ybjE 유전자(이하, ybjE-948이라 명명함)도 서열번호 11 또는 12의 뉴클레오타이드 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다.

각 반응에서 수득된 PCR 산물을 정제하고, 각각 SmaI 절단된 pTV28 벡터(Takara Bio)에 연결시켜, ybjE-900 유전자 또는 ybjE-948 유전자 증폭용 플라스미드를 수득했다. ybjE-900 유전자가 lac 프로모터에 의해 발현되도록 배치된 플라스미드를 선발하고 pSYBJE900이라 명명하고, ybjE-948 유전자가 lac 프로모터에 의해 발현되도록 배치된 플라스미드를 선발하여 pSYBJE948이라 명명했다.

에스케리치아 콜리 MG1655 균주(ATCC47076)를 pSYBJE900, pSYBJE948, 실시예 2에서 사용된 pSYBJE1 또는 대조용 플라스미드 pSTV28로 형질전환시켰다. 이러한 플라스미드들이 도입된 형질전환체를 클로람페니콜 내성에 따라 선발하고, 선발된 균주를 각각 MG1655/pSYBJE900, MG1655/pSYBJE948, MG1655/pSYJE1 및 MG1655/pSTV28로 명명했다.

그 다음, 고농도 L-리신의 존재하에 MG1655/pSYBJE900, MG1655/pSYBJE948, MG1655/pSYJE1 및 MG1655/pSTV28 균주의 성장을 조사했다.

이들 균주들을 클로람페니콜 50mg/L을 함유하는 L 배지 3ml에서 진탕하에 약 6시간 동안 배양했다. 배지의 OD600이 약 1.0이 된 후, 배양액을 원심분리하고, 세포를 M9 최소 배지로 2회 세척한 후, 50mg/L의 클로람페니콜 및 80g/L의 리신 하이드로클로라이드를 함유하는 M9 최소 배지에 OD600=0.05의 농도로 접종하고, 약 20시간 동안 배양했다. 그 결과를 도 16에 도시했다. 그 결과, ybjE-900 유전자의 증폭이 고농도 L-리신의 존재하에 초기 성장기는 물론 대수 성장기의 MG1655 균주의 성장을 pSYJE1에 함유된 ybjE-948 및 ybjE 유전자와 거의 동일한 정도까지 증가시키는 것을 알 수 있었다. 이러한 데이터는 ybjE 유전자 서열(서열번호 1)에서 뉴클레오타이드 49번 내지 948번까지의 서열이 L-아미노산 배출 효과를 발휘하는데 충분하다는 것을 암시한다.

본 발명에 따르면, L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소류신, L-프롤린, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티틴, L-페닐알라닌 및 L-글루탐산이 발효에 의해 효과적으로 생산될 수 있다. L-리신, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-프롤린은 동물 사료 첨가제, 건강 식품 성분 및 아미노산 주입물로서 유용하다. L-아르기닌과 L-오르니틴은 간기능 촉진제, 아미노산 주입물 및 종합 아미노산 제제의 성분으로서 유용하다. L-히스티딘은 간기능 촉진제 및 히스타민 전구물질로서 유용하다. L-페닐알라닌은 감미제 전구물질로서 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

1. ybjE 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 2, 9 및 10으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 ybjE 유전자의 발현이, ybjE 유전자 카피수의 증가 또는 ybjE 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 통해 증강되도록 변형된, L-아미노산 생산능이 있는 미생물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, ybjE 유전자가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA인 미생물.
5. 제1항에 있어서, ybjE 유전자가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 49번에서 948번까지의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA인 미생물.
6. 제1항에 있어서, 미생물의 L-아미노산 배출능이 ybjE 유전자의 발현 증강에 의해 증가되는 미생물.
7. 제1항에 있어서, L-아미노산 또는 L-아미노산 유사체에 대한 미생물의 내성이 ybjE 유전자의 발현 증강에 의해 증가되는 미생물.
8. 제1항에 있어서, L-아미노산이 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-트레오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-시스테인 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 미생물.
9. 제1항에 있어서, 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물.
10. 제9항에 있어서, 엔테로박테리아세애 과의 에스케리치아(Escherichia)속에 속하는 미생물.
11. 제1항에 있어서, 코리네폼(Coryneform) 세균인 미생물.
12. 제1항에 있어서, 메탄올 동화 세균인 미생물.
13. 제12항에 있어서, 메탄올 동화 세균이 메틸로필러스(Methylophilus) 또는 메틸로바실러스(Methylobacillus) 속에 속하는 미생물.
14. L-아미노산을 생산하고 축적시키는 배지에서 제1항 및 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배지 또는 미생물로부터 상기 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법.
15. L-아미노산을 생산하고 축적시키는, 주탄소원으로서 메탄올을 함유하는 액체 배지에서 제12항 또는 제13항에 따른 미생물을 배양하는 단계 및 상기 배지 또는 미생물로부터 상기 L-아미노산을 수거하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산방법.
16. 제14항에 있어서, L-아미노산이 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-트레오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-시스테인 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 생산방법.
17. 제15항에 있어서, L-아미노산이 L-리신, L-아르기닌, L-오르니틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-트레오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-시스테인 및 L-글루탐산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 생산방법.
18. 제14항에 있어서, L-아미노산이 염기성 L-아미노산으로부터 선택되는 방법.
19. 에스케리치아 콜라이에서 ybjE 유전자의 발현이 서열번호 1의 3번 위치에 있는 구아닌의 아데닌으로의 치환에 의해 증강되도록 변형된, L-아미노산 생성능이 있는 에스케리치아 콜라이.
20. L-리신을 생산하고 축적시키는 액체 배지에서 제19항에 따른 에스케리치아 콜라이를 배양하는 단계 및 상기 배지 또는 에스케리치아 콜라이로부터 L-리신을 수거하는 단계를 포함하는, L-리신 생산방법.

Images