KR101599802B1

KR101599802B1 - 세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 l-아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101599802B1
Application number: KR1020140062593A
Authority: KR
Inventors: 장준호; 박혜민; 이광호; 이근철; 홍형표
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2016-03-04
Anticipated expiration: 2034-05-23
Also published as: JP6810611B2; EP3147351A1; PL3147351T3; RU2700384C2; EP3147351A4; DK3147351T3; EP3147351B1; BR112016027341B1; US20170081633A1; BR112016027341A2; JP2019106993A; RU2016145258A; RU2733433C1; MY184391A; JP2017516474A; CN107075454B; HUE047361T2; KR20150134996A; RU2016145258A3; CN107075454A

Abstract

본 발명은 세포내 에너지 수준이 향상된 재조합 미생물 및 이 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포내 에너지 수준이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법 {Microorganisms with enhanced intracellular ATP level and method for production of L-amino acids using the same}

미생물을 이용한 목적 물질의 생산을 위해 주로 목적 물질의 생성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근방법이 주로 이용되었다. 예를 들면, 목적 L-아미노산의 생합성 경로의 강화에 의해 L-아미노산을 고수율로 생산할 수 있는 대장균을 포함한 다수의 유용한 균주들이 개발되었다. 미생물을 이용한 유용한 목적 물질의 고수율 생산을 위해서는 충분한 에너지의 생성 및 유지가 필요하다.

생체 내에서 단백질, 핵산 등과 같은 물질을 생합성하기 위해서는 NADH, NADPH 및 ATP(Adenosine-5'-triphosphate)의 형태로 에너지가 보존되어 이용된다. 특히, ATP는 대사과정에서 생성된 화학적 에너지를 생물체의 다양한 활동에 전달하는 에너지 운반자이다.

ATP는 주로 미생물의 대사과정에서 생성된다. 해당 과정(glycolysis)을 통해 일어나는 기질수준 인산화 반응(substrate level phosphorylation)이나 해당과정 중에 NADH 등에 축적된 환원력을 이용하여 전자전달계를 통해 ATP를 생성하는 산화적 인산화반응(oxidative phosphorylation)이 세포내 주요 ATP 생성 경로이다. 생성된 ATP는 생합성, 운동, 신호전달 및 세포 분열과 같은 생체 내의 활동에서 소비된다. 따라서, 유용한 목적 물질을 생산하기 위해 이용되는 산업용 미생물은 ATP 에 대한 요구도가 높은 편이다. 이에, 유용한 목적 산물의 대량생산 시 세포내 에너지 수준을 증가시킴으로써 생산성을 향상시키려는 연구가 진행되기도 하였다(Biotechnol Adv (2009) 27:94-101).

철은 미생물의 항상성 유지에 반드시 필요한 원소 중의 하나이고, 대장균의 경우 다양한 경로를 통해서 세포 내로 철을 흡수한다(Mol Microbiol (2006) 62:120-131). 이러한 철 흡수 경로 중 하나는 FhuC, FhuD, 및 FhuB 단백질이 형성하는 FhuCDB 복합체 채널을 통해 철분을 유입하는 것이다. 최근에는 세포 내에 L-트립토판이 과량 존재할 때 L-트립토판 생합성 관련 유전자들의 발현을 조절하는 TrpR 단백질과 L-트립토판이 복합체를 형성하고, 다시 이 복합체가 fhuCDB 오페론의 조절 부위에 결합한다는 사실이 밝혀져 FhuCDB 단백질 복합체를 통한 철분의 유입이 L-트립토판의 생합성과 관련이 있다는 가능성이 제기되고 있다. 그러나 아직까지 L-트립토판의 생합성에서 FhuCDB 단백질 복합체의 기능 및 이를 통한 철분의 유입이 미치는 영향이 정확히 알려져 있지는 않다(Nat Chem Biol (2012) 8:65-71).

본 발명자들은 ATP 수준을 향상시키고 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생산성을 증가시키는 방법에 대한 연구를 수행하여, fhuCDB 유전자의 결실에 의해 FhuCDB 단백질 복합체의 기능을 불활성화시키는 것에 의해 세포내 ATP 수준을 향상시키고, 이에 의해 목적 물질의 생산성을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포내 ATP 수준이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포내 ATP 수준이 향상된 미생물을 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 세포내 ATP 수준이 향상된 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 철 흡수 시스템을 구성하는 단백질 FhuC, 단백질 FhuD, 및 단백질 FhuB 중 하나 이상의 활성이 불활성화되도록 변형되어, 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 미생물일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "FhuCDB"는 하나의 오페론 내에 배열된, fhuA, fhuC, fhuD 및 fhuB의 발현 산물로 이루어진 철 흡수 시스템(fhu system)의 구성요소이다. fhuA는 페리크롬-철(ferrichrome-iron), 파아지(phage), 박테리아 독소 및 항생제 등의 수용체로 작용하는 다기능성 OMP FhuA (79 kDa)를 코딩한다. FhuA는 Fe³ ⁺-페리크롬에 특이적이고, 리간드-특이적 의존성 채널(ligand-specific gated channel)로 작용한다(Protein Sci 7, 1636-1638). fhu 시스템의 나머지 단백질, 즉, FhuD, FhuC 및 FhuB도 이 철 흡수 시스템의 기능에 필수적이다. 주변세포질 단백질인 FhuD와 세포막-결합 단백질인 FhuC 및 FhuB는 FhuCDB 복합체를 형성하여, 주변세포질로부터 세포막을 통과하여 세포질 내로 페리크롬 및 기타 Fe³ ⁺-히드록사메이트 화합물 (Fe³ ⁺-에어로박틴, Fe³ ⁺-코프로겐)을 수송시키는 기능을 한다(J Bacteriol 169, 3844-3849). FhuCDB 복합체를 통한 철분의 유입시 한 분자의 ATP가 소모되며, 이러한 철 흡수 과정을 위해 단백질 복합체 TonB-ExbB-ExbD가 에너지를 제공한다(FEBS Lett 274, 85-88).

FhuC는 29 kDa의 세포막-결합 단백질을 코딩하고, FhuD 및 FhuB와 함께 철분의 유입을 위한 채널을 형성한다. FhuC는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 구체적인 예로 서열번호 1의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.

FhuD는 31 kDa의 세포막-결합 단백질을 코딩하고, FhuC 및 FhuB와 함께 철분의 유입을 위한 채널을 형성한다. FhuD는 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 구체적인 예로 서열번호 2의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.

FhuB는 41 kDa의 세포막-결합 단백질을 코딩하고, FhuC 및 FhuB와 함께 철분의 유입을 위한 채널을 형성한다. FhuB는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 구체적인 예로 서열번호 3의 염기 서열에 의해 코딩될 수 있다.

구체적으로, 동일한 활성을 갖는 단백질이라도 개체에 따라 아미노산 서열에 약간의 차이가 있을 수 있으므로, FuhC, FhuD, 및 FhuB는 각각 서열번호 5, 6, 및 7의 서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 명세서에서, FuhC, FhuD, 및 FhuB는 상기 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 변이체일 수 있으며, 상기 서열번호 5, 6, 및 7과 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 또는 95% 이상 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 또한 상기 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 기재된 염기서열은 당업자에게 잘 알려지 방법으로 다양하게 구현될 수 있는 염기서열의 한 일례로 제시될 뿐 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어, "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 또는 염기서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

본 발며에서 사용된 용어, "미생물"은 L-아미노산과 같은 유용한 목적 물질의 생산능을 갖는 원핵 미생물 또는 진핵 미생물을 의미한다. 예를 들어, 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 미생물은 에스케리시아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) , 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.), 노카디아 속(Norcardia) 또는 곰팡이(fungi) 또는 효모(yeast)에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 에스케리시아속 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 상기 미생물은 대장균일 수 있다.

본 발명에서, "비변형 균주"는 돌연변이 또는 재조합 방법과 같은 분자생물학 기법에 의해 변형되지 않은 미생물, 구체적으로, 철 흡수 시스템, FhuCDB 복합체를 구성하는 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상이 불활성화되도록 변형되어, 세포내 ATP 소모의 감소에 의해 세포내 ATP 수준이 증가되기 전의 미생물을 의미한다. 즉, 재조합 미생물이 유래된 기원 미생물을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상의 활성이 불활성화 된 것일 수 있으며, FhuC, FhuD, 및 FhuB이 조합되어 불활성화 된 것을 포함하며, 구체적으로는 FhuC, FhuD, 및 FhuB가 모두 불활성화된 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "불활성화"는 해당 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 치환, 또는 삽입에 의한 변이, 상기 유전자의 발현 감소를 초래하는 발현 조절 서열의 변형, 상기 단백질의 활성 약화 또는 제거를 초래하는 염색체상의 상기 유전자의 염기 서열의 변형, 또는 이들의 조합에 의해 변형되어, 해당 단백질이 활성을 상실하거나 약화된 것을 의미한다.

구체적으로 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실은 박테리아 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내의 내재적 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 그의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체하는 것에 의해 수행될 수 있다. 또한, 화학물질이나 자외선과 같은 돌연변이 유발원을 이용한 돌연변이 유발에 의해 해당 유전자가 결실된 돌연변이체를 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어, "발현 조절 서열"은 유전자의 발현을 조절하는 염기 서열로, 개체 내에서 특정 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 세그먼트를 의미하며, 프로모터, 전사조절인자 결합 부위, 리보좀 결합 부위, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 유전자의 발현 감소를 초래하는 발현조절 서열의 변형은 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화시키도록 핵산 서열의 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의해 발현 조절 서열상의 변이를 유도하거나, 더 약한 활성을 갖는 발현 조절 서열로 교체하는 것에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 비변형 균주에 비해 향상된 목적물질 생산능이 향상된 에스케리시아 속 미생물일 수 있다. 본 발명의 에스케리시아속 미생물은 FhuCDB 복합체를 형성하는 단백질 중 하나 이상의 불활성화에 의해 그를 통한 철분 유입 경로를 불활성화시키고, 이 경로를 통한 철분 유입에 따른 ATP 소모를 감소시켜, 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 수준을 가지며, 이에 의해 목적물질의 생산능이 증가된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "생산능이 향상된" 미생물은 변이 전의 비변형 균주 또는 모세포에 비해 목적 물질의 생산성이 증가된 미생물을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "목적 물질"은 미생물 세포내 ATP 수준을 증가 시켜 생산량이 증가된 물질이면 제한없이 포함되며, 구체적으로는 L-아미노산이며, 더욱 구체적으로는 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균으로부터 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상의 불활성화에 의해 수득된, 세포내 ATP 수준이 비변형 균주에 비해 증가된 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균일 수 있다. 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균은 L-트립토판 오페론 유전자의 발현을 증가시키거나, 최종 산물인 L-트립토판에 의한 피드백 저해를 해제시키거나, L-트립토판 오페론 유전자의 전사 수준의 억제 및 감쇠(attenuation)를 해제시키는 것에 의해 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균으로부터 FhuC, FhuD, 및 FhuB 중 하나 이상의 불활성화에 의해 수득된, 세포내 ATP 수준이 비변형 균주에 비해 증가된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균일 수 있다. 상기 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균은 L-쓰레오닌 오페론 유전자의 발현을 증가시키거나, 최종 산물인 L-쓰레오닌에 의한 피드백 저해를 해제시키거나, L-쓰레오닌 오페론 유전자의 전사 수준의 억제 및 감쇠를 해제시키는 것에 의해 수득된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에서, 세포내 ATP 수준이 향상된 에스케리시아속 미생물을 배양하는 단계, 및 수득된 미생물의 배양액으로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, 상기 "세포내 ATP 수준이 향상된 에스케리시아속 미생물"은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 일 구체예에 따른 L-아미노산을 생산하는 방법에서, L-아미노산 생산능을 갖는 미생물의 배양은 당업계에 공지된 적합한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자가 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법의 예로, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다. 이들 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분들을 포함한다. 탄소원은 포도당, 유당, 자당, 과당, 맥아당, 전분 및 섬유소와 같은 탄수화물; 대두유, 해바라기 오일, 피마자유(castor oil) 및 코코넛 오일(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산, 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)과 같은 지방산; 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올과 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육즙(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트와 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으며, 이들 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 디히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염(sodium-containing salts)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 황산철(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있고, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다.

또한, 배양액의 호기성 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20-45℃일 수 있으며, 구체적으로는 25-40℃일 수 있다. 배양의 기간은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판과 같은 L-아미노산의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고 구체적으로는, 배양시간은 10-100 시간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 L-아미노산을 생산하는 방법은 수득된 미생물의 배양액으로부터 추가적으로 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함한다. L-아미노산의 분리는 본 발명의 미생물의 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-아미노산을 정제 또는 회수하는 것에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 에스케리시아속 미생물 및 이를 이용한 목적 물질의 생산 방법을 이용하면, 높은 세포내 ATP 농도가 유전자 발현, 생합성, 물질 수송 등을 증진시키므로 단백질, L-아미노산 등을 포함한 유용한 목적 물질을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 2는 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 야생주 유래의 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 3은 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 4는 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균의 세포내 ATP 수준을 보여준다.
도 5는 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균의 L-쓰레오닌 생산능을 보여준다.
도 6은 비변형 균주 대비 본 발명의 일 구체예에 따른 L-트립토판 생산능을 갖는 대장균의 L-트립토판 생산능을 보여준다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: fhuC , fhuD , 및 fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생형 대장균 W3110 의 제작

본 실시예에서는 야생형 대장균 W3110 (ATCC^® 39936^TM)의 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 상동 재조합에 의하여 각각 결실시켰다.

결실대상 유전자인 fhuC, fhuD, 및 fhuB 유전자는 각각 서열번호 1, 2 및 3의 염기 서열을 가지며, 이들은 서열번호 4의 오페론 형태로 존재한다.

fhuC, fhuD, 및 fhuB의 결실을 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소(lambda Red recombinase)를 이용한, 1-단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였다(Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645). 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로, pUC19 (New England Biolabs (USA))에 rmf 프로모터를 라이게이션시키고, pACYC184(New England Biolab)로부터 수득된 돌연변이 loxP-Cm^R-loxP 카세트를 라이게이션시켜 수득된 pUCprmfmloxC의 클로람페니콜 유전자를 사용하였다(대한민국 출원공개 제2009-0075549호).

먼저, fhuC 및 fhuB 유전자의 일부분과 pUCprmfmloxC 유전자의 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 서열번호 8와 9, 10과 11, 12와 13, 및 8과 13의 프라이머 조합을 이용하여 pUCprmfmloxC를 주형으로 하고, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 1차 중합효소 연쇄반응(이하 'PCR')에 의해 약 1.2 kb의 PCR 산물 △fhuC1st, △fhuD1st, △fhuB1st, 및 △fhuCDB1st를 수득하였다.

그 후, PCR을 통해 수득된 1.2 kb의 PCR 산물 △fhuC1st, △fhuD1st, △fhuB1st, 및 △fhuCDB1st를 0.8% 아가로스겔에서의 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 수득된 PCR 산물의 5' 및 3' 영역의 20 bp의 염기서열을 포함하는 서열번호 14와 15, 16과 17, 18과 19, 14와 19의 프라이머 조합을 이용하여, 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 하여, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 것에 의해 수행하여 약 1.3kb의 PCR 산물 △fhuC, △fhuD, △fhuB, △fhuCDB를 수득하였다. 수득된 PCR 산물을 0.8% 아가로스겔에서의 전기영동후 용리하여 재조합에 사용하였다.

Datsenko KA 등이 개발한 1-단계 불활성화 방법 (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645)에 따라 pKD46 벡터로 형질전환된 대장균 W3110을 컴피턴트(competent)한 상태로 제조한 후, 1차 및 2차 PCR을 통해 수득된 1.3 kb의 단편을 유입하여 형질전환시켰다. 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 클로람페니콜 내성을 갖는 형질전환체를 선별하였다. 선별된 균주로부터 수득된 게놈을 주형으로, 서열번호 20과 21의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 증폭된 크기가 각각 약 4.4 kb, 4.3 kb, 3.3 kb, 1.6 kb인 것을 확인하여 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 단독 또는 모두 결실되었다는 것을 확인하였다.

상기에서 수득된 클로람페니콜 내성을 갖는 1차 재조합 균주로부터 pKD46을 제거한 후, pJW168 벡터(Gene, (2000) 247,255-264)를 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene, (2000) 247,255-264). 최종적으로 수득된 균체로부터 서열번호 20와 21의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 수득된 약 3.4 kb, 3.3 kb, 2.2 kb, 0.6 kb의 PCR 산물에 의해 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 단독 또는 모두 결실되었다는 것을 확인하고, 대장균 W3110_ΔfhuC, W3110_ΔfhuD, W3110_ΔfhuB 및 W3110_ΔfhuCDB로 명명하였다.

실시예 2: 제작된 야생형 대장균 유래 fhuC , fhuD , fhuB 유전자 결실 대장균의 세포내 ATP 수준 측정

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 균주를 이용하여 실제 세포내 ATP 수준을 측정하였다.

이를 위하여 키요타카 Y. 하라 등이 개발한 루시페라제(luciferase)를 이용한 "세포 ATP 합성능의 정량적 측정 방법"(An Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity)을 이용하였다(J Biom Scre, (2006) Vol. 11, No.3, pp310-17). 요약하면, 글루코오스가 포함된 LB 액체 배지에 실시예 1에서 사용된 비변형 균주인 대장균 W3110과 유전자 결실에 의해 수득된 대장균 W3110_ΔfhuCDB를 각각 밤새 배양하였다. 배양 후, 원심분리로 상측액을 제거하고 100 mM Tris-Cl(pH 7.5)를 이용하여 수득된 균체를 세척하고, PB 완충액(Permeable buffer: 40%[v/v] 글루코오스, 0.8%[v/v] 트리톤 X-100)을 30분간 처리하여 세포 내의 ATP가 세포 외부로 스며 나오게 하였다. 그 후, 다시 원심분리하여 상등액을 분리하고, 루시페라아제의 기질로 이용되는 루시페린(Luciferin)을 첨가하여 10분간 반응시켰다. 루미노미터를 이용하여 루시페라아제에 의한 발색 정도를 측정하여 ATP를 정량하였다. 도 1에 그 결과가 표시된다. 도 1의 결과는 3회의 반복 실험 결과의 평균값을 나타낸다.

도 1에 표시된 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 야생형 대장균 유래 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 단독 또는 모두 결실된 대장균 W3110_ΔfhuC, W3110_ΔfhuD, W3110_ΔfhuB 및 W3110_ΔfhuCDB에서 세포내 ATP 수준이 비변형 균주인 대장균 W3110에 비해 증가하였음을 확인하였다.

실시예 3: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주의 제작 및 세포내 ATP 수준 측정

본 실시예에서는 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주인 대장균 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 균주(대한민국 공개특허 10-2013-0082121호)의 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 상동 재조합에 의하여 단독 또는 모두 결실하여 W3110 trpΔ2_ΔfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpΔ2_ΔfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpΔ2_ΔfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 및 W3110 trpΔ2_ΔfhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA 균주를 제작하였다. 이렇게 제작한 균주들에 대해서 실시예 2에서와 동일한 방법으로 세포내 ATP 수준을 측정하였으며 그 결과를 도 2에 나타냈다.

도 2에 표시된 바와 같이 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주로부터 제작된 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 각각 또는 모두 결실된 균주들은 세포내 ATP 수준이 비변형 균주 및 대조군 균주보다 증가됨을 확인하였다.

실시예 4: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주의 역가확인

실시예 3에서 기술된 바와 같이 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주인 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA와 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 단독 또는 모두 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들을 대상으로 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 역가 평가를 수행하였다.

상기 균주들을 LB 고체 배지에 한 백금이씩 접종하고, 37℃ 배양기에서 밤새 배양하고, 표 1의 조성을 갖는, 글루코오스가 함유된 25 mL의 역가 배지에 한 백금이씩 접종하였다. 그 후, 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였다. 그 결과가 표 2에 표시된다. 모든 결과는 3회 반복실험 결과의 평균값을 나타낸다.

조성물	농도 (리터당)
글루코오스	60 g
K₂HPO₄	1 g
(NH₄)₂SO₄	15 g
NaCl	1 g
MgSO₄·H₂O	1 g
소디움 시트레이트	5 g
효모 추출물	2 g
CaCO₃	40 g
L-페닐알라닌	0.15 g
L-티로신	0.1 g
pH	6.8

균주	L-트립토판 생산량(mg/L)^*
W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	562
W3110 trpΔ2_ΔfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	781
W3110 trpΔ2_ΔfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	816
W3110 trpΔ2_ΔfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	779
W3110 trpΔ2_ΔhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	796

* 48 시간 측정치

표 2에 표시된 바와 같이, 실시예 3에서 제작된 야생주 유래의 L-트립토판 생산균주인 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA에서 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 단독 또는 모두 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들은 비변형 균주인 W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA에 비해 L-트립토판의 생산량이 비변형 균주 대비 최대 약 63%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 도 2에서 확인한 세포내 ATP 수준을 고려할 때, 세포내 ATP 수준 증가를 통해 균주의 L-트립토판 생산능력이 증가되었다는 것을 반영하는 것으로 볼 수 있다.

실시예 5: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 L-쓰 레오 닌 생산균주 및 L-트립토판 생산균주의 제작

본 실시예에서는 L-트립토판 생산균주인 대장균 KCCM10812P(대한민국 등록특허 제0792095호)와 L-쓰레오닌 생산균주인 KCCM10541P (대한민국 등록특허 제0576342호)의 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 실시예 1에 기재된 바와 같이 상동 재조합에 의하여 각각 결실시켰다.

L-트립토판 생산능을 갖는 비변형 균주인 대장균 KCCM10812P는 L-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)로부터 유래된 균주로, 염색체상의 트립토판 요구성이 해제되고, pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자가 약화되고, aroG 및 trpE 유전자가 변이된 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균이다.

또한, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 비변형 균주인 대장균 KCCM10541P는 대장균 KFCC10718(대한민국 출원공개 제1992-0008365호)로부터 유래된 균주로, L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균이다.

결실대상 유전자인 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 대장균 KCCM10812P 및 대장균 KCCM10541P로부터 각각 실시예 1에서와 동일한 방법으로 결실시켰고, 이에 의해 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM10541_ΔfhuCDB와 L-트립토판 생산균주 KCCM10812P_ΔfhuCDB를 제작하였다.

실시예 6: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 L-쓰 레오 닌 생산균주 및 L-트립토판 생산균주의 ATP 수준 측정

본 실시예에서는 실시예 5에서 제작된 균주들을 이용하여 실제 세포내 ATP 수준을 측정하였다.

실시예 2에서와 동일한 방법으로 세포내 ATP 수준을 측정하였다. 그 결과가 도 3 및 도 4에 표시된다. 도 3 및 도 4의 결과는 결과는 3회 반복 실험 결과의 평균값을 나타낸다. 대조군으로서, 실시예 3에서 비변형 균주로 이용된 대장균 KCCM10812P 및 대장균 KCCM10541P보다 세포내 ATP 수준이 높다고 알려진 ysa와 ydaS 유전자가 결실된 L-쓰레오닌 생산균주(대장균 KCCM10541P_△ysa△ydaS)와 L-트립토판 생산균주(대장균 KCCM10812P_△ysa△ydaS)를 이용하였다.(대한민국 등록특허 제1327093호)

도 3과 4에 표시된 같이, L-쓰레오닌 생산균주 및 L-트립토판 생산균주로부터 실시예 3에 의해 제작된 fhuC, fhuD, fhuB 유전자가 결실된 균주들은 세포내 ATP 수준이 비변형 균주 및 대조군 균주보다 증가되었다.

실시예 7: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 기능이 불활성화된 L- 쓰레오닌 생산균주의 역가확인

실시예 5에서 기술된 바와 같이 L-쓰레오닌 생산 미생물인 대장균 KCCM10541P(대한민국 등록특허 제0576342호)에서 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들을 대상으로 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 역가 평가를 수행하였다. ysa와 ydaS 유전자가 결실된 L-쓰레오닌 생산 균주(대장균 KCCM10541P_△ysa△ydaS )를 대조군으로 포함시켜 역가 평가의 결과를 비교하였다.

상기 균주들을 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 표 1의 조성을 갖는, 글루코오스가 함유된 25 mL의 역가 배지에 한 백금이 씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 50시간 배양하였다. 그 결과가 표 2 및 도 4에 표시된다. 모든 결과는 3회 반복실험 결과의 평균값을 나타낸다.

조성	농도 (리터당)
글루코오스	70 g
KH₂PO₄	2 g
(NH₄)₂SO₄	25 g
MgSO₄·H₂O	1 g
FeSO₄·H₂O	5 mg
MnSO₄·H₂O	5 mg
효모 추출물	2 g
CaCO₃	30 g

균주	OD₅₆₂	당소모량 (g/L)^*	L-쓰레오닌 생산량(g/L)^**
KCCM10541P	22.8	41.0	28.0 ± 0.5
KCCM10541P_△ysaA△ydaS	23.9	42.1	29.8 ± 0.9
KCCM10541P_△fhuCDB	23.1	41.8	30.5 ± 1.

* 30 시간 측정치

** 50 시간 측정치

표 4에 표시된 바와 같이, 본 발명에 따라 제작된 재조합 L-쓰레오닌 생산 대장균 균주는 비변형 균주와 비슷한 생리활성을 나타내면서 L-쓰레오닌의 생산량이 비변형 균주 대비 약 9%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 도 2에서 확인한 세포내 ATP 수준을 고려할 때, 세포내 ATP 수준 증가를 통해 균주의 L-쓰레오닌 생산능력이 증가되었다는 것을 반영하는 것으로 볼 수 있다.

실시예 8: fhuC , fhuD , fhuB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 기능이 불활성화된 L-트립토판 생산균주의 역가확인

실시예 5에서 기술된 바와 같이 L-트립토판 생산균인 KCCM10812P(대한민국 등록특허 제0792095호)에서 fhuC, fhuD, fhuB 유전자를 결실시켜 세포 내의 ATP를 증가시킨 균주들을 대상으로 글루코오스를 탄소원으로 사용하여 역가 평가를 수행하였다. ysa와 ydaS 유전자가 결실된 L-트립토판 생산 균주(대장균 KCCM10812P_△ysa△ydaS )를 대조군으로 포함시켜 실시예 4에서와 동일한 방법으로 역가 평가를 수행하였다.

역가 평가 결과는 표 5 및 도 6에 표시되었으며, 모든 결과는 3회 반복실험 결과의 평균값을 나타낸다.

균주	OD₆₀₀	당소모량 (g/L)^*	L-트립토판 생산량(g/L)^**
KCCM10812P	18.2	45.7	5.5 ± 0.2
KCCM10812P_△ysaA△ydaS	18.3	46.3	6.7 ± 0.1
KCCM10812P_△fhuCDB	17.9	47.4	7.1 ± 0.5

* 33 시간 측정치

** 48 시간 측정치

표 5에 표시된 바와 같이, 본 발명에 따라 제작된 재조합 L-트립토판 생산 대장균 균주는 비변형 균주와 비슷한 생리활성을 나타내면서 L-트립토판의 생산량이 비변형 균주 대비 약 30%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 도 3에서 확인한 세포내 ATP 수준을 고려할 때, 증가된 세포내 ATP 수준을 통해 균주의 L-트립토판 생산능력이 증가되었다는 것을 반영하는 것으로 볼 수 있다.

본 발명에서 재조합된 균주 CA04-2801(KCCM10812P_△fhuCDB)은 2013년 11월 15일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁되어 KCCM11474P로 기탁번호를 부여받았다.

전술된 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 한정하는 것은 아닌 것으로서 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위와 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11474P

20131115

<110> CJ Cheiljedang <120> Microorganisms with enhanced intracellular ATP level and method for production of L-amino acids using the same <130> PN103858 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 798 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(798) <223> ORF of fhuC <400> 1 atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60 gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct ttcctgccgg gaaagtgacc 120 ggtctgattg gtcacaacgg ttctggtaaa tccactctgc tcaaaatgct tggccgtcat 180 cagccgccgt cggaagggga gattcttctt gatgcccaac cgctggaaag ctggagcagc 240 aaagcgtttg cccgcaaagt ggcttatttg ccgcagcagc ttcctccggc agaagggatg 300 accgtgcgtg aactggtggc gattggtcgt tacccgtggc atggcgcgct ggggcgcttt 360 ggggcggcag atcgcgaaaa agtcgaggaa gctatctcgc tggttggctt aaaaccgctg 420 gcgcatcggc tggtcgatag tctctctggc ggcgaacgtc agcgggcgtg gatcgccatg 480 ctggtggcgc aggatagccg ttgtctgttg ctcgacgaac cgacctcggc gctggatatc 540 gcccaccagg ttgatgtgct gtcgctggtg caccgtttaa gtcaggagcg tggcctgacg 600 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acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60 gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct ttcctgccgg gaaagtgacc 120 ggtctgattg gtcacaacgg ttctggtaaa tccactctgc tcaaaatgct tggccgtcat 180 cagccgccgt cggaagggga gattcttctt gatgcccaac cgctggaaag ctggagcagc 240 aaagcgtttg cccgcaaagt ggcttatttg ccgcagcagc ttcctccggc agaagggatg 300 accgtgcgtg aactggtggc gattggtcgt tacccgtggc atggcgcgct ggggcgcttt 360 ggggcggcag atcgcgaaaa agtcgaggaa gctatctcgc tggttggctt aaaaccgctg 420 gcgcatcggc tggtcgatag tctctctggc ggcgaacgtc agcgggcgtg gatcgccatg 480 ctggtggcgc aggatagccg ttgtctgttg ctcgacgaac cgacctcggc gctggatatc 540 gcccaccagg ttgatgtgct gtcgctggtg caccgtttaa gtcaggagcg tggcctgacg 600 gtcattgccg tgttgcacga tatcaatatg gcggcacgct actgtgatta tctggtcgcc 660 ctgcgcggcg gtgaaatgat tgctcaggga acgcctgcgg aaattatgcg cggcgaaacc 720 ctcgaaatga tttatggcat cccgatgggt attttgccgc atccggcggg tgctgcacct 780 gtgagttttg tttattgatg agcggcttac ctcttatttc gcgccgtcga ctgttaacgg 840 cgatggcgct ttctccgttg ttatggcaga tgaataccgc ccacgcggcg gctattgatc 900 ccaatcgtat tgtggcgctg gagtggttgc cggtggaatt actgctggcg ctcggcatcg 960 tgccttacgg cgtggcggat accatcaact atcgcctgtg ggtcagcgaa ccaccattgc 1020 cggactcagt gatcgacgtc ggtttgcgca cagaacctaa ccttgaactg ctgaccgaaa 1080 tgaaaccatc gtttatggtc tggtcggcag gatatggccc ttcaccagaa atgctggctc 1140 gtattgcgcc gggtcgcgga tttaacttca gtgacggcaa acagccgttg gcgatggcgc 1200 gtaaatcgct gacggaaatg gcagatttac ttaacctgca aagcgcagcg gaaacgcatt 1260 tagcgcaata tgaagacttt atccgcagca tgaaaccccg ctttgtgaag cgtggtgcgc 1320 gtccgttatt gctgacgacg cttatcgatc cgcgccatat gctggtcttc ggtccaaaca 1380 gcttgttcca ggaaattctt gatgagtacg gcatcccaaa tgcctggcaa ggggaaacca 1440 acttctgggg cagtaccgcc gtcagtatcg atcgtctggc ggcgtataaa gacgttgatg 1500 tgctctgttt tgatcacgac aacagcaaag acatggatgc gctaatggca acgccgctgt 1560 ggcaggccat gccgtttgtc cgcgccggac gctttcagcg cgtacctgca gtctggtttt 1620 atggtgcgac gctctcggca atgcactttg tgcgcgttct ggataacgcc atcggaggta 1680 aagcgtgagt aaacgaattg cgcttttccc ggcgttattg ctggcgctgt tagtgattgt 1740 cgctacggcg ctcacctgga tgaacttctc gcaggcgctg ccgcgtagcc agtgggcgca 1800 ggctgcctgg tcgccggata ttgacgtcat cgagcagatg atttttcact acagcttgtt 1860 gccgcgtctg gcgatttcgc tgctggtggg cgcgggtctg gggctggtgg gcgtgctgtt 1920 tcagcaagtg ctgcgtaacc cgctggcgga gccgacgacg cttggcgttg ctacaggcgc 1980 gcaactgggg attaccgtca ctacgctctg ggcgatccct ggtgcgatgg cgagccagtt 2040 tgctgcgcag gcaggggctt gtgttgttgg cttaattgtc tttggcgtcg cgtgggggaa 2100 acggctgtcg ccggtaacgc tgattctcgc ggggttggta gtgagccttt attgcggcgc 2160 aatcaatcag ttactggtta tcttccatca tgaccaactg caaagcatgt ttctgtggag 2220 cactggaacg ctgacgcaaa ccgactgggg cggcgttgag cgtttatggc cgcagctgct 2280 gggcggtgtg atgctgacgt tgctgctact tcgtccgtta accctgatgg ggcttgatga 2340 tggcgtggcg cgcaatctcg ggctggcctt gtcgcttgcg cgtctggcag cgctgtcgct 2400 ggcgattgtc atcagtgcgc tgctggtgaa cgctgtgggg attatcggct ttatcgggtt 2460 gttcgcgccg ctgctggcaa aaatgctggg ggcgcggcgt ctgctgccac gactgatgct 2520 ggcgtcgttg attggtgcgc tgatcctctg gctttccgat caaatcatcc tctggctgac 2580 tcgcgtgtgg atggaagtgt ccaccggttc ggtcactgcg ttgatcggtg cgccgctgct 2640 actgtggctg ttgccgcgtt tacgcagcat tagcgcgccg gatatgaagg tcaacgatcg 2700 tgtcgcggct gaacgccaac atgtgctggc gtttgccctc gcgggcggcg tgctgctgtt 2760 gatggctgtg gtggtggcgc tgtcgtttgg tcgtgatgcg cacggctgga cgtgggcgag 2820 cggggcgttg ctcgaggatt taatgccctg gcgctggccg cgaattatgg cggcgctgtt 2880 tgcgggcgtc atgctggcgg tggcgggctg tattattcag cgactgaccg gaaacccgat 2940 ggcaagcccg gaagtgctgg ggattagctc cggcgcggcg tttggcgtgg tgttgatgct 3000 gtttctggtg ccgggtaatg cctttggctg gctgttacct gcaggcagtc tcggcgcggc 3060 ggtgacgctg ttgatcatta tgatcgccgc cggccgcggt ggattttccc cacaccgtat 3120 gttactggcg gggatggcgt taagcaccgc gttcaccatg cttttgatga tgttgcaggc 3180 aagtggtgac ccgcgaatgg cgcaagtgct gacctggatt tccggttcga cctacaacgc 3240 gaccgatgcg caggtctggc gcaccggaat tgtgatggtg attttgctgg cgattacccc 3300 gctgtgccgc cgctggctga ccattttacc gctgggtggt gataccgccc gagccgtagg 3360 aatggcgctg acgccgacgc gaattgcgct gctgctgtta gcggcttgcc tgacggcgac 3420 cgcgacgatg actattggac cgttgagttt tgttggttta atggcaccgc atattgcgcg 3480 gatgatgggc tttcgacgga cgatgccaca catcgtaatt tcggcgctgg tgggtggttt 3540 actgctggtg ttcgctgact ggtgtgggcg gatggtgctg tttccattcc agatcccggc 3600 ggggctgctg tcaaccttta tcggcgcgcc atattttatc tatttgttga gaaagcagag 3660 ccgttaa 3667 <210> 5 <211> 265 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(265) <223> FhuC <400> 5 Met Gln Glu Tyr Thr Asn His Ser Asp Thr Thr Phe Ala Leu Arg Asn 1 5 10 15 Ile Ser Phe Arg Val Pro Gly Arg Thr Leu Leu His Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Thr Phe Pro Ala Gly Lys Val Thr Gly Leu Ile Gly His Asn Gly Ser 35 40 45 Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Met Leu Gly Arg His Gln Pro Pro Ser 50 55 60 Glu Gly Glu Ile Leu Leu Asp Ala Gln Pro Leu Glu Ser Trp Ser Ser 65 70 75 80 Lys Ala Phe Ala Arg Lys Val Ala Tyr Leu Pro Gln Gln Leu Pro Pro 85 90 95 Ala Glu Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Val Ala Ile Gly Arg Tyr Pro 100 105 110 Trp His Gly Ala Leu Gly Arg Phe Gly Ala Ala Asp Arg Glu Lys Val 115 120 125 Glu Glu Ala Ile Ser Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Ala His Arg Leu 130 135 140 Val Asp Ser Leu Ser Gly Gly Glu Arg Gln Arg Ala Trp Ile Ala Met 145 150 155 160 Leu Val Ala Gln Asp Ser Arg Cys Leu Leu Leu Asp Glu Pro Thr Ser 165 170 175 Ala Leu Asp Ile Ala His Gln Val Asp Val Leu Ser Leu Val His Arg 180 185 190 Leu Ser Gln Glu Arg Gly Leu Thr Val Ile Ala Val Leu His Asp Ile 195 200 205 Asn Met Ala Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Leu Val Ala Leu Arg Gly Gly 210 215 220 Glu Met Ile Ala Gln Gly Thr Pro Ala Glu Ile Met Arg Gly Glu Thr 225 230 235 240 Leu Glu Met Ile Tyr Gly Ile Pro Met Gly Ile Leu Pro His Pro Ala 245 250 255 Gly Ala Ala Pro Val Ser Phe Val Tyr 260 265 <210> 6 <211> 296 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(296) <223> FhuD <400> 6 Met Ser Gly Leu Pro Leu Ile Ser Arg Arg Arg Leu Leu Thr Ala Met 1 5 10 15 Ala Leu Ser Pro Leu Leu Trp Gln Met Asn Thr Ala His Ala Ala Ala 20 25 30 Ile Asp Pro Asn Arg Ile Val Ala Leu Glu Trp Leu Pro Val Glu Leu 35 40 45 Leu Leu Ala Leu Gly Ile Val Pro Tyr Gly Val Ala Asp Thr Ile Asn 50 55 60 Tyr Arg Leu Trp Val Ser Glu Pro Pro Leu Pro Asp Ser Val Ile Asp 65 70 75 80 Val Gly Leu Arg Thr Glu Pro Asn Leu Glu Leu Leu Thr Glu Met Lys 85 90 95 Pro Ser Phe Met Val Trp Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Met 100 105 110 Leu Ala Arg Ile Ala Pro Gly Arg Gly Phe Asn Phe Ser Asp Gly Lys 115 120 125 Gln Pro Leu Ala Met Ala Arg Lys Ser Leu Thr Glu Met Ala Asp Leu 130 135 140 Leu Asn Leu Gln Ser Ala Ala Glu Thr His Leu Ala Gln Tyr Glu Asp 145 150 155 160 Phe Ile Arg Ser Met Lys Pro Arg Phe Val Lys Arg Gly Ala Arg Pro 165 170 175 Leu Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asp Pro Arg His Met Leu Val Phe Gly 180 185 190 Pro Asn Ser Leu Phe Gln Glu Ile Leu Asp Glu Tyr Gly Ile Pro Asn 195 200 205 Ala Trp Gln Gly Glu Thr Asn Phe Trp Gly Ser Thr Ala Val Ser Ile 210 215 220 Asp Arg Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Val Asp Val Leu Cys Phe Asp His 225 230 235 240 Asp Asn Ser Lys Asp Met Asp Ala Leu Met Ala Thr Pro Leu Trp Gln 245 250 255 Ala Met Pro Phe Val Arg Ala Gly Arg Phe Gln Arg Val Pro Ala Val 260 265 270 Trp Phe Tyr Gly Ala Thr Leu Ser Ala Met His Phe Val Arg Val Leu 275 280 285 Asp Asn Ala Ile Gly Gly Lys Ala 290 295 <210> 7 <211> 660 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(660) <223> FhuB <400> 7 Met Ser Lys Arg Ile Ala Leu Phe Pro Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Val Ile Val Ala Thr Ala Leu Thr Trp Met Asn Phe Ser Gln Ala Leu 20 25 30 Pro Arg Ser Gln Trp Ala Gln Ala Ala Trp Ser Pro Asp Ile Asp Val 35 40 45 Ile Glu Gln Met Ile Phe His Tyr Ser Leu Leu Pro Arg Leu Ala Ile 50 55 60 Ser Leu Leu Val Gly Ala Gly Leu Gly Leu Val Gly Val Leu Phe Gln 65 70 75 80 Gln Val Leu Arg Asn Pro Leu Ala Glu Pro Thr Thr Leu Gly Val Ala 85 90 95 Thr Gly Ala Gln Leu Gly Ile Thr Val Thr Thr Leu Trp Ala Ile Pro 100 105 110 Gly Ala Met Ala Ser Gln Phe Ala Ala Gln Ala Gly Ala Cys Val Val 115 120 125 Gly Leu Ile Val Phe Gly Val Ala Trp Gly Lys Arg Leu Ser Pro Val 130 135 140 Thr Leu Ile Leu Ala Gly Leu Val Val Ser Leu Tyr Cys Gly Ala Ile 145 150 155 160 Asn Gln Leu Leu Val Ile Phe His His Asp Gln Leu Gln Ser Met Phe 165 170 175 Leu Trp Ser Thr Gly Thr Leu Thr Gln Thr Asp Trp Gly Gly Val Glu 180 185 190 Arg Leu Trp Pro Gln Leu Leu Gly Gly Val Met Leu Thr Leu Leu Leu 195 200 205 Leu Arg Pro Leu Thr Leu Met Gly Leu Asp Asp Gly Val Ala Arg Asn 210 215 220 Leu Gly Leu Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Ala Ala Leu Ser Leu Ala 225 230 235 240 Ile Val Ile Ser Ala Leu Leu Val Asn Ala Val Gly Ile Ile Gly Phe 245 250 255 Ile Gly Leu Phe Ala Pro Leu Leu Ala Lys Met Leu Gly Ala Arg Arg 260 265 270 Leu Leu Pro Arg Leu Met Leu Ala Ser Leu Ile Gly Ala Leu Ile Leu 275 280 285 Trp Leu Ser Asp Gln Ile Ile Leu Trp Leu Thr Arg Val Trp Met Glu 290 295 300 Val Ser Thr Gly Ser Val Thr Ala Leu Ile Gly Ala Pro Leu Leu Leu 305 310 315 320 Trp Leu Leu Pro Arg Leu Arg Ser Ile Ser Ala Pro Asp Met Lys Val 325 330 335 Asn Asp Arg Val Ala Ala Glu Arg Gln His Val Leu Ala Phe Ala Leu 340 345 350 Ala Gly Gly Val Leu Leu Leu Met Ala Val Val Val Ala Leu Ser Phe 355 360 365 Gly Arg Asp Ala His Gly Trp Thr Trp Ala Ser Gly Ala Leu Leu Glu 370 375 380 Asp Leu Met Pro Trp Arg Trp Pro Arg Ile Met Ala Ala Leu Phe Ala 385 390 395 400 Gly Val Met Leu Ala Val Ala Gly Cys Ile Ile Gln Arg Leu Thr Gly 405 410 415 Asn Pro Met Ala Ser Pro Glu Val Leu Gly Ile Ser Ser Gly Ala Ala 420 425 430 Phe Gly Val Val Leu Met Leu Phe Leu Val Pro Gly Asn Ala Phe Gly 435 440 445 Trp Leu Leu Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Leu Leu Ile 450 455 460 Ile Met Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Phe Ser Pro His Arg Met Leu 465 470 475 480 Leu Ala Gly Met Ala Leu Ser Thr Ala Phe Thr Met Leu Leu Met Met 485 490 495 Leu Gln Ala Ser Gly Asp Pro Arg Met Ala Gln Val Leu Thr Trp Ile 500 505 510 Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Ala Thr Asp Ala Gln Val Trp Arg Thr Gly 515 520 525 Ile Val Met Val Ile Leu Leu Ala Ile Thr Pro Leu Cys Arg Arg Trp 530 535 540 Leu Thr Ile Leu Pro Leu Gly Gly Asp Thr Ala Arg Ala Val Gly Met 545 550 555 560 Ala Leu Thr Pro Thr Arg Ile Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Leu 565 570 575 Thr Ala Thr Ala Thr Met Thr Ile Gly Pro Leu Ser Phe Val Gly Leu 580 585 590 Met Ala Pro His Ile Ala Arg Met Met Gly Phe Arg Arg Thr Met Pro 595 600 605 His Ile Val Ile Ser Ala Leu Val Gly Gly Leu Leu Leu Val Phe Ala 610 615 620 Asp Trp Cys Gly Arg Met Val Leu Phe Pro Phe Gln Ile Pro Ala Gly 625 630 635 640 Leu Leu Ser Thr Phe Ile Gly Ala Pro Tyr Phe Ile Tyr Leu Leu Arg 645 650 655 Lys Gln Ser Arg 660 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 8 ctcctttcgt gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct aggtgacact 60 atagaacgcg 70 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 9 caataaacaa aactcacagg tgcagcaccc gccggatgcg gcaaaatacc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 10 cgactgttaa cggcgatggc gctttctccg ttgttatggc agatgaatac aggtgacact 60 atagaacgcg 70 <210> 11 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 11 tcacgcttta cctccgatgg cgttatccag aacgcgcaca aagtgcattg tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 12 gtgagtaaac gaattgcgct tttcccggcg ttattgctgg cgctgttagt aggtgacact 60 atagaacgcg 70 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 13 aggttgacag cagccccgcc gggatctgga atggaaacag caccatccgc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 14 atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60 gtgcccgggc 70 <210> 15 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 15 gccatcgccg ttaacagtcg acggcgcgaa ataagaggta agccgctcat caataaacaa 60 aactcacagg 70 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 16 cctgtgagtt ttgtttattg atgagcggct tacctcttat ttcgcgccgt cgactgttaa 60 cggcgatggc 70 <210> 17 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 10 <400> 17 aatcactaac agcgccagca ataacgccgg gaaaagcgca attcgtttac tcacgcttta 60 cctccgatgg 70 <210> 18 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 11 <400> 18 tcggcaatgc actttgtgcg cgttctggat aacgccatcg gaggtaaagc gtgagtaaac 60 gaattgcgct 70 <210> 19 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 12 <400> 19 ttaacggctc tgctttctca acaaatagat aaaatatggc gcgccgataa aggttgacag 60 cagccccgcc 70 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 13 <400> 20 gaatacgtcg ccagctgctt taacac 26 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 14 <400> 21 tggtttgtcg gatgcggcgt gaac 24

Claims

철 흡수 시스템을 구성하는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 하나 이상의 활성이 불활성화된, 비변형 균주에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 에스케리시아속 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 에스케리시아속 미생물은 서열번호 5, 6, 및 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성이 모두 불활성화된 것인 에스케리시아속 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인 에스케리시아속 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 에스케리시아속 미생물은 비변형 균주에 비해 향상된 L-아미노산 생산능을 갖는 것인 에스케리시아속 미생물.
청구항 4에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인 에스케리시아속 미생물.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 에스케리시아속 미생물을 배양하는 단계, 및 수득된 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-쓰레오닌 또는 L-트립토판인 것인 방법.