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KR100771148B1 - 그룹 b 스트렙토코커스 항원 - Google Patents

그룹 b 스트렙토코커스 항원 Download PDF

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KR100771148B1
KR100771148B1 KR1020007009237A KR20007009237A KR100771148B1 KR 100771148 B1 KR100771148 B1 KR 100771148B1 KR 1020007009237 A KR1020007009237 A KR 1020007009237A KR 20007009237 A KR20007009237 A KR 20007009237A KR 100771148 B1 KR100771148 B1 KR 100771148B1
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하멜조세
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Abstract

그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 상기 단백질은 항원성이므로, 동물에서 스트렙토코커스 감염의 예방 또는 치료용 백신 구성성분으로서 유용하다. 또한, 단백질 항원을 제조하는 재조합 방법뿐만 아니라 스트렙토코커스 박테리아 감염을 검출하기 위한 진단 측정법이 개시된다.

Description

그룹 B 스트렙토코커스 항원{Group B streptococcus antigens}
본 발명은 항원, 더 구체적으로는 치료 및/또는 예방용 백신 성분으로 유용한 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 박테리아 병원체의 단백질 항원에 관한 것이다.
스트렙토코커스는 그들의 세포 표면상에서 발견되는 그룹 특이성 탄수화물 항원 A 내지 O에 의해 구별되는 그람(+) 박테리아이다. 스트렙토코커스 그룹은 또한 타입-특이성 캡슐형 다당(polysaccharide) 항원에 의해 구별된다. 그룹 B 스트렙토코커스(GBS)에 대해 여러 항원형(serotypes)이 동정되었다: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII. GBS는 또한 "C-단백질"로 알려진 항원성 단백질(알파, 베타, 감마 및 델타)을 함유하며, 이들중 몇몇은 클로닝되었다.
비록 GBS가 정상 인간 질(vaginal) 및 결장(colonic) 플로라의 공통 성분이지만, 이 병원체는 오랫동안 신생아 패혈증(sepsis) 및 수막염(meningitis), 유아의 후기-발병(late-onset) 수막염, 분만후 자궁내막염(endometritis)뿐만아니라 낙농 가축의 유선염(mastitis)의 주요 원인으로 인식되어 왔다. GBS에 노출된 임신중인 모체는 분만후 감염의 위험에 있으며, 아기가 산도(birth canal)를 통과함에 따라 그 감염을 그들의 아기에게 전달할 수도 있다. 비록 그 유기체가 항생제에 민감하더라도, 신생아에서 패혈증 및 유아에서 수막염의 높은 공격율 및 빠른 발병 은 높은 이병률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 초래한다.
GBS로부터 개인을 보호할 수 있는 백신을 개발하기 위해, 연구자들은 타입-특이성 항원에 눈을 돌렸다. 불행하게도 이들 다당류는 인간에서 면역원성이 약하다고 밝혀졌으며, 다당류가 비롯된 특정 항원형에 제한된다. 더욱이, 캡슐형 다당류는 T 세포 비의존성 응답을 나타내며, 즉 IgG가 생산되지 않는다. 따라서, 캡슐형 다당류 항원은 GBS 감염에 대한 보호를 위한 백신 성분으로서 부적합하다.
다른 것들은 마우스(mice) 및 래빗(rabbit) 모델에서 면역원성을 나타내는 C-단백질 베타 항원에 초점을 맞추었다. 이 단백질은 인간 IgA의 Fc 영역과 고 친화성으로 비-면역원적으로 상호작용하는 바람직하지 않은 성질 때문에 인간 백신으로서 부적합하다고 밝혀졌다. C-단백질 알파 항원은 대부분의 GBS 매개 질환의 원인이 되는 항원형인 GBS의 타입 III 항원형에서 드물기 때문에 백신 성분으로서 유용성이 거의 없다.
따라서, GBS 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 성분으로서 사용될 수 있는 GBS 항원의 필요성이 제기되어 왔다.
(발명의 요약)
한 태양에 따르면, 본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택된 서열을 함유하는 제2 폴리펩티드에 적어도 70% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편, 상사체(analogs) 또는 유도체를 제공한다:
서열번호(SEQ ID NO): 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번 호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41 및 서열번호: 44.
다른 태양에서, 발현 조절 영역에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터뿐만 아니라, 상기 벡터로 형질감염(transfect)된 숙주 세포, 및 발현에 적합한 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법이 제공된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 신규의 폴리펩티드가 제공된다.
도 1a는 전사 해독 프레임(open reading frames)을 위한 해당 아미노산 서열을 갖는 클론 1(서열번호: 1)의 DNA 서열이고(Clonel-dna/aa);
도 1b는 서열번호: 2의 아미노산 서열이고;
도 1c는 서열번호: 3의 아미노산 서열이고;
도 1d는 서열번호: 4의 아미노산 서열이고;
도 1e는 서열번호: 5의 아미노산 서열이고;
도 1f는 서열번호: 6의 아미노산 서열이고;
도 2a는 전사 해독 프레임(open reading frames)을 위한 해당 아미노산 서열을 갖는 클론 2(서열번호: 7)의 DNA 서열이고;
도 2b는 서열번호: 8의 아미노산 서열이고;
도 2c는 서열번호: 9의 아미노산 서열이고;
도 2d는 서열번호: 10의 아미노산 서열이고;
도 2e는 서열번호: 11의 아미노산 서열이고;
도 2f는 서열번호: 12의 아미노산 서열이고;
도 3a는 전사 해독 프레임(open reading frames)을 위한 해당 아미노산 서열을 갖는 클론 3(서열번호: 13)의 DNA 서열이고;
도 3b는 서열번호: 14의 아미노산 서열이고;
도 3c는 서열번호: 15의 아미노산 서열이고;
도 3d는 서열번호: 16의 아미노산 서열이고;
도 3e는 서열번호: 17의 아미노산 서열이고;
도 3f는 서열번호: 18의 아미노산 서열이고;
도 3g는 서열번호: 19의 아미노산 서열이고;
도 3h는 서열번호: 20의 아미노산 서열이고;
도 3i는 서열번호: 21의 아미노산 서열이고;
도 4a는 전사 해독 프레임(open reading frames)을 위한 해당 아미노산 서열을 갖는 클론 4(서열번호: 22)의 DNA 서열이고;
도 4b는 서열번호: 23의 아미노산 서열이고;
도 4c는 서열번호: 24의 아미노산 서열이고;
도 4d는 서열번호: 25의 아미노산 서열이고;
도 4e는 서열번호: 26의 아미노산 서열이고;
도 5a는 전사 해독 프레임(open reading frames)을 위한 해당 아미노산 서열을 갖는 클론 5(서열번호: 27)의 DNA 서열이고;
도 5b는 서열번호: 28의 아미노산 서열이고;
도 5c는 서열번호: 29의 아미노산 서열이고;
도 5d는 서열번호: 30의 아미노산 서열이고;
도 5e는 서열번호: 31의 아미노산 서열이고;
도 6a는 클론 6(서열번호: 32)의 DNA 서열이고;
도 6b는 서열번호: 33의 아미노산 서열이고;
도 6c는 서열번호: 34의 아미노산 서열이고;
도 6d는 서열번호: 35의 아미노산 서열이고;
도 6e는 서열번호: 36의 아미노산 서열이고;
도 7a는 클론 7(서열번호: 37)의 DNA 서열이고;
도 7b는 서열번호: 38의 아미노산 서열이고;
도 7c는 서열번호: 39의 아미노산 서열이고;
도 7d는 서열번호: 40의 아미노산 서열이고;
도 7e는 서열번호: 41의 아미노산 서열이고;
도 8은 신호 서열를 포함하는 클론 7의 일부의 DNA 서열(서열번호: 42)이고;
도 9는 신호 서열이 없는 클론 7의 일부의 DNA 서열(서열번호: 43)이고;
도 9a는 아미노산 서열(서열번호: 44)이고;
도 10은 서열번호: 39에 해당하는 재조합 GBS 단백질로 면역화된 CD-1 마우스로부터의 혈청에서 항-GBS ELISA 역가(titers)의 분포를 나타낸다.
(발명의 상세한 설명)
본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열에 의해 특성화된 그룹 B 스트렙토코커스(GBS)의 신규 항원성 폴리펩티드 및 그 단편, 상사체(analogs) 또는 유도체를 제공한다:
서열번호(SEQ ID NO): 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41 및 서열번호: 44.
본 발명의 바람직한 구체예는 서열번호: 39 및 서열번호: 44를 포함한다.
본 발명의 더 바람직한 구체예는 서열번호: 39이다.
본 발명의 더 바람직한 구체예는 서열번호: 44이다.
여기에 사용된, 본 발명의 폴리펩티드의 "단편", "유도체" 또는 "상사체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존된(conserved) 또는 비-보존된 아미노산 잔기 ( 바람직하게는 보존된)로 치환된 자연적이거나 비자연적인 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 용어 "단편", "유도체" 또는 "상사체"는 또한 폴리펩티드가 면역 응답을 유도하는 능력을 가지는 한 아미노산의 첨가, 결실, 치환에 의해 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "보존된 아미노산"은 치환에도 불구하고 주어진 항원의 항원 결정기 (그것의 2차 구조 및 하이드로패식(hydropathic) 성질을 포함)가 완전히 또는 부분적으로 보존되는 하나 이상의 아미노산의 치환을 의미한다.
예컨대, 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 침묵(silent) 변이를 초래하는 기능적 균등물로서 작용하는 유사한 극성(polarity)의 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 서열내의 아미노산의 치환체는 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 일원중에서 선택될 수 있다. 예컨대, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하의(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하의(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드의 유도체 및 상사체는 도면에 예시된 서열 또는 그 단편과 약 70% 동일성을 가질 수 있다. 즉, 잔기의 70%가 동일하다. 더 바람직하게는, 폴리펩티드는 95% 이상의 상동성을 가질 것이다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 유도체 및 상사체는 약 20 미만, 더 바람직하 게는 10 미만의 아미노산 잔기 치환, 변형 또는 결실을 가질 것이다. 바람직한 치환은 당업계에서 보존(conserved)된다고 알려진, 즉 치환된 잔기가 소수성, 크기, 전하 또는 작용기와 같은 물리 또는 화학적 성질을 공유하는 것들이다.
더욱이, 아미노산 영역이 다형(polymorphic)이라고 밝혀진 경우에는, 다른 GBS 균주의 다른 에피토프를 더 효과적으로 의태(mimic)하기 위한 하나 이상의 특정 아미노산들을 변화시키는 것이 바람직할 것이다.
또한, 그것에 폴리펩티드 생물학적 또는 약학적 성질을 변화시키는 다른 화합물들, 즉 반감기를 증가시키는 폴리에틸렌글리콜(PEG); 정제 용이를 위한 리더(leader) 또는 분비 아미노산 서열; 프레프로- 및 프로- 서열; 및 (다)당류를 융합시킨 폴리펩티드가 포함된다.
더욱이, 본 발명의 폴리펩티드는 안정성, 서포트 또는 다른 분자에 연결 또는 결합하기 위한 증가된 소수성을 제공하기 위해 말단 -NH2 아실화 (예컨대, 아세틸화, 또는 티오글리콜산 아미드화, 말단 카르보시 아미드화에 의해, 예컨대 암모니아 또는 메틸아민으로)에 의해 변형될 수 있다.
또한, 폴리펩티드 단편, 상사체 및 유도체의 헤테로 및 호모 폴리펩티드 멀티머가 고려된다. 이들 폴리머 형태는 예컨대, 아비딘/비오틴, 글루테르알데히드 또는 디메틸-수퍼이미데이트와 같은 가교-결합체(cross-linkers)로 가교-결합된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 폴리머 형태는 또한 재조합 DNA 기술에 의해 발생된 멀티시스트론 mRNA로부터 제조된 두 개 이상의 병렬(tandem) 또는 역전(inverted) 접촉(contiguous) 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하 게는, 본 발명의 폴리펩티드의 단편, 상사체 또는 유도체는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 적어도 하나의 에피토프를 함유할 것이다.
항원성 폴리머(즉, 합성 멀티머)의 형성을 달성하기 위하여, 시약(reagents)가 티오(thio) 기에 특이성인, 비샬로아세틸 기, 니트로아릴할라이드 등을 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 따라서, 서로 다른 펩티드의 두 개의 메르캅토 기사이의 연결(link)은 단일 결합이거나, 2 이상, 전형적으로는 4 이상 및 16 이하, 일반적으로는 약 16 이하의 탄소 원자의 연결 기로 이루어질 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 단편, 상사체 및 유도체는 메티오닌(Met) 출발 잔기를 함유하지 않는다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 리더 또는 2차 서열 (신호 서열)을 포함하지 않을 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 신호 부분은 확립된 분자생물학적 기술에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 목적 폴리펩티드는 GBS 배양물에서 단리되고, 이어서 성숙 단백질의 개시 잔기 및 따라서 성숙 폴리펩티드의 서열을 결정하기 위해 시퀀싱(sequenced)될 수 있다.
다른 태양에 따르면, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 혼합된 본 발명의 하나 이상의 GBS 폴리펩티드를 함유하는 백신 조성물이 제공된다.
적합한 보조제는 오일, 즉 Freund 완전 또는 불완전 보조제; 염, 즉 AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4) 2, Al(OH)3, AlPO4, 실리카, 카올린; 사포닌 유도체; 탄소 폴리뉴클레오티드, 즉 폴리 IC 및 폴리 AU 및 또한 점막 면역성 유도를 위한 탈독소화된 콜레라 독소 (CTB) 및 E.coli 열불안정 독소를 포함한다. 바람직 한 보조제는 QuilATM, AlhydrogelTM 및 AdjuphosTM 을 포함한다. 본 발명의 백신은 주사, 신속한 주입, 비인두 흡수, 피부 흡수에 의해 비경구적으로, 또는 구강 또는 경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 스트렙토코커스 감염 및/또는 스트렙토코커스 감염, 구체적으로 그룹 A 스트렙토코커스 (pyogenes), 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS 또는 agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia 뿐만 아니라 Staphylococcus aureus에 의해 매개되는 질병 및 증상의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 스트렙토코커스에 대한 일반 정보는 P.R.Murray et al.에 의한 Manual of Clinical Microbiology (1995, 6th Edition, ASM Press, Washington, D.C.)에서 구할 수 있다. 더 구체적으로는 그룹 B 스트렙토코커스, agalactiae. 특정 구체예에서, 백신은 패혈증, 수막염 및 폐염을 대한 임신한 여성 및 유아와 같은 GBS의 감염 위험에 있는 개인들뿐만 아니라, 당뇨병, 간 질환 또는 암을 갖는 자와 같은 면역손상된 개인들에게 투여된다. 백신은 또한 상기 박테리아뿐만 아니라 E.coli에 의해 매개되는 소에서 유선염의 치료용과 같은 가축 용도를 가진다.
본 발명의 백신은 또한 스트렙토코커스 감염 및/또는 스트렙토코커스 감염, 구체적으로 그룹 A 스트렙토코커스 (pyogenes), 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS 또는 agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia 뿐만 아니라 Staphylococcus aureus에 의해 매개되는 질병 및 증상의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 더 구체적으로는 그룹 B 스트렙토코커스, agalactiae.
백신 조성물은 바람직하게는 약 0.001 내지 100 μg/kg (항원/체중) 및 더 바람직하게는 0.01 내지 10 μg/kg 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 1 μg/kg의 단위 투여량으로 면역화사이에 약 1 내지 12 주 간격 및 더 바람직하게는 1 내지 6 주 간격으로 1 내지 3회 투여된다.
다른 태양에 따르면, 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열에 의해 특성화된 그룹 B 스트렙토코커스(GBS)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그 단편, 상사체 또는 유도체를 제공한다:
서열번호: 2, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41 및 서열번호: 44.
바람직한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 전사 해독 프레임에 해당하는 도 1a (서열번호: 1), 2a (서열번호: 7), 3a (서열번호: 13), 4a (서열번호: 22), 5a (서열번호: 27), 6a (서열번호: 32), 7a (서열번호: 37), 8 (서열번호: 42) 및 9 (서열번호: 43)에 도시된 것들이다.
바람직한 폴리뉴클레오티드는 도 1a (서열번호: 1), 2a (서열번호: 7), 3a (서열번호: 13), 4a (서열번호: 22), 5a (서열번호: 27), 6a (서열번호: 32), 7a ( 서열번호: 37), 8 (서열번호: 42) 및 9 (서열번호: 43)에 도시된 것들 및 그 단편, 상사체 및 유도체이다.
더 바람직한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 도 7 (서열번호: 37), 8 (서열번호: 42) 및 9 (서열번호: 43)에 도시된 것들이다.
가장 바람직한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 도 8 (서열번호: 42) 및 9 (서열번호: 43)에 도시된 것들이다.
도면에 예시된 폴리뉴클레오티드 서열은 축퇴(degenerate) 코돈으로 바뀔 수 있으나, 본 발명의 폴리펩티드를 여전히 코딩한다고 이해될 것이다.
뉴클레오티드 코딩 서열의 축퇴로 인해, 본 발명과 실질적으로 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 실행에 사용될 수도 있다. 이들은 서열내의 동일한 아미노산 잔기를 코딩하는 다른 코돈의 치환에 의해 변화되어 침묵 변이를 생성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
따라서, 본 발명은 또한 서열들 사이에 적어도 50% 바람직하게는 적어도 70%의 동일성을 가져서 상기 폴리뉴클레오티드 서열(또는 그 상보 서열)에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 더 구체적으로, 폴리뉴클레오티드는 긴축(stringent) 조건하에 혼성화가능한, 즉 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 갖는다.
긴축 조건하에 혼성화가능하다는 것은 비상보적 뉴클레오티드 서열의 혼성화에 불리한 경향이 있는 예컨대 고온 및/또는 저 염 농도와 같은 표전 조건하에 핵 산 분자를 적어도 한 영역의 제2 핵산 서열(cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA) 또는 그 상보적 가닥에 어닐링(annealing)하는 것을 의미한다. 적합한 프로토콜은 여기 참조문헌으로 포함한 Maniatis T. et al., Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982에 기재된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 단편, 상사체 또는 유도체는 DNA 면역 방법에 사용될 수 있다. 즉, 그들은 주사시 복제가능하고 발현가능하여 생체내(in vivo)에서 항원성 폴리펩티드를 생성하는 벡터내로 통합될 수 있다. 예컨대, 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에서 작용하는 CMV 프로모터의 제어하의 플라스미드 벡터내로 통합될 수 있다. 바람직하게는 벡터는 근육내로 주사된다.
또 다른 태양에 따르면, 숙주세포내에서 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키고 발현된 폴리펩티드 산물을 회수함으로써 재조합 기술에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제공된다. 이와 달리, 폴리펩티드는 확립된 합성 화학 기술, 즉 전장 폴리펩티드을 생성하기 위해 라이게이션되는 (블럭 라이게이션) 액상 또는 고상 올리고펩티드 합성법에 따라 제조될 수 있다.
재조합 생성을 위해, 숙주 세포는 폴리펩티드를 코딩하는 벡터로 형질감염된 후, 프로모터를 활성화하고 형질전환체를 선택하거나 유전자를 증폭하기에 적당하게 변형된 영양 배지에서 배양된다. 적합한 벡터는 선택된 숙주에서 생존가능하고 복제가능한 것들이며, 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열, 예컨대 벡테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바쿨로비루스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조 합에서 유래된 벡터를 포함한다. 폴리펩티드 서열은 그것이 프로모터, 리보솜 결합 부위(공통 영역 또는 Shine-Dalgarno 서열), 및 임의로 오퍼레이터(제어 요소)를 포함하는 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결되도록, 제한 효소를 사용하여 적당한 부위에 벡터내로 통합될 수 있다. 당업자는 확립된 분자생물학 원리(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 참고문헌으로 포함됨)에 따라 주어진 숙주 및 벡터에 적당한 발현 제어 영역의 개별 구성성분을 선택할 수 있다. 적합한 프로모터는 LTR 또는 SV40 프로모터, E.coli lac, tac 또는 trp 프로모터 및 파지 람다 PL 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 바람직하게는 복제의 기원뿐만 아니라 선택 마커, 즉 암피실린 내성 유전자를 통합할 것이다. 적합한 박테리아 벡터는 pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10 파지스크립트, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 및 진핵 벡터 pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL을 포함한다. 숙주 세포는 박테리아, 즉 E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; 균류(fungal), 즉 Aspergillus niger , Aspergillus nidulins; 효모, 즉 Saccharomyces 또는 진핵, 즉 CHO, COS일 수 있다.
배양에서 폴리펩티드의 발현시, 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수확된 다음, 물리 또는 화학적 수단에 의해 분쇄되고(만약 발현된 폴리펩티드가 배지내로 분비되지 않는 경우), 결과의 조(crude) 추출물이 유지되어 목적 폴리펩티드를 단 리한다. 배양 배지 또는 용해물(lysate)로부터 폴리펩티드의 정제는 폴리펩티드의 성질에 따라 확립된 기술에 의해, 즉 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 및 양이온 교환 크로마토그라피, 포스포셀룰로스 크로마토그라피, 소수성 상호작용 크로마토그라피, 히드록실아파타이트 크로마토그라피 및 렉틴 크로마토그라피를 사용하여 성취될 수 있다. 최종 정제는 HPLC를 사용하여 성취될 수 있다.
폴리펩티드는 리더 또는 분비 서열있이 또는 없이 발현될 수 있다. 전자의 경우, 리더는 번역후(post-translational) 프로세싱(US4,431,739; 4,425,437; 및 4,338,397 참조문헌으로 포함)을 사용하여 제거되거나, 발현 폴리펩티드의 정제후에 화학적으로 제거될 수 있다.
또 다른 태양에 따르면, 본 발명의 GBS 폴리펩티드는 스트렙토코커스 감염, 특히 GBS 감염의 진단 시험에서 사용될 수 있다. 여러 진단 방법이 가능하나, 예컨대 생물학적 샘플에서 스트렙토코커스 유기체를 검출하는 방법은 다음과 같다:
a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하고;
b) 그 생물학적 샘플과 본 발명의 GBS 폴리펩티드와 반응성인 항체 또는 그 단편을 배양하여 혼합물을 형성하고; 및
c) 혼합물에서 스트렙토코커스의 존재를 가리키는 특이적 결합 항체 또는 결합 단편을 검출한다.
이와 선택적으로, 상기 항체를 함유하거나 함유한다고 의심되는 생물학적 샘플에서 스트렙토코커스 항원에 특이적인 항체를 검출하는 방법은 다음과 같다:
a) 환자로부터 생물학적 샘플을 단리하고;
b) 그 생물학적 샘플과 본 발명의 하나 이상의 GBS 폴리펩티드 또는 그 단편을 배양하여 혼합물을 형성하고; 및
c) 혼합물에서 스트렙토코커스에 특이적인 항체의 존재를 가리키는 특이적 결합 항원 또는 결합 단편을 검출한다.
당업계의 기술자는 유기체에 단백질에 특이적인 항체가 존재하는지를 결정하기 위한 진단 시험이 효소-연결 면역흡착 측정법(ELISA), 방사성면역측정법 또는 라텍스 응집 측정법과 같은 면역학적 시험을 포함하는 여러 형태를 가질 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 또한 그러한 박테리아를 함유한다고 의심되는 생물학적 샘플에서 스트렙토코커스의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 DNA 프로브를 디자인하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 검출 방법은 다음을 포함한다:
a) 환자로부터 생물학적 샘플을 단리하고;
b) 그 생물학적 샘플과 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 또는 그 단편을 가지는 하나 이상의 DNA 프로브를 배양하여 혼합물을 형성하고; 및
c) 혼합물에서 스트렙토코커스 박테리아의 존재를 가리키는 특이적 결합 DNA 프로브를 검출한다.
본 발명의 DNA 프로브는 또한 스트렙토코커스 감염의 진단 방법으로서 예컨대 중합효소 연쇄반응을 사용하여 샘플내에 순환(circulating) 스트렙토코커스, 즉 GBS 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 프로브는 종래 기술을 사용하여 합성 될 수 있고 고상에 고정화되거나 검출가능한 라벨로 표지될 수 있다. 이 용도의 바람직한 DNA 프로브는 본 발명의 GBS 폴리펩티드의 적어도 약 6 연속 뉴클레오티드에 상보적인 서열을 가지는 올리고머이다.
환자에서 스트렙토코커스의 검출을 위한 또 다른 진단 방법은 다음을 포함한다:
a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 단편과 반응성인 항체를 검출가능한 라벨로 표지하고;
b) 표지된 항체 또는 표지된 단편을 환자에 투여하고; 및
c) 환자에서 스트렙토코커스의 존재를 가리키는 특이적 결합 표지 항체 또는 표지 단편을 검출한다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 GBS 폴리펩티드를 스트렙토코커스 감염의 진단 및 특히 치료용 특이적 항체의 생성을 위한 면역원으로 사용하는 용도이다. 적합한 항체는 적당한 스크리닝 방법, 예컨대, 시험 모델에서 스트렙토코커스 감염에 대해 수동적으로 방어하는 특정 항체의 능력을 측정함으로써 결정될 수 있다. 동물 모델의 한 예는 여기 실시예에서 기재된 마우스 모델이다. 항체는 전체 항체 또는 그 항원-결합 단편일 수 있으며, 일반적으로 어떤 면역글로불린 클래스에 속할 수 있다. 항체 또는 단편은 동물 기원, 구체적으로 포유동물 기원, 더 구체적으로 쥐(murine), 래트 또는 인간 기원일 수 있다. 그것은 자연 항체 또는 그 단편, 필요하다면 재조합 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 용어 재조합 항체 또는 항체 단편은 분자생물학 기술을 이용하여 생성되는 항체 또는 항체 단편을 의미한 다. 항체 또는 항체 단편은 폴리클로날 또는 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 그것은 GBS 폴리펩티드와 관련된 다수의 에피토프에 특이적일 수 있지만 바람직하게는 하나에 특이적이다.
실시예 1: 치사(lethal) 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS) 감염의 쥐 모델
GBS 감염의 쥐 모델은 Lancefield et al (J Exp Med 142:165-179, 1975)에 상세히 기술된다. GBS 균주 C388/90 (캐나다, 오타와, 이스턴 온타리오의 아동 병원, 수막염을 앓고 있는 환자의 뇌척수액에서 1990년에 수득된 임상적 분리물) 및 NCS246 (캐나다, 에드몬톤, 노스턴 알베르타의 공중건강 지방 연구소, 스트렙토코커스의 내셔널 센타)은 각각 타입 Ia/c 및 타입 II/R과 같이 항원형이 결정되었다.
그들의 독성(virulence)를 증가시키기 위해, GBS 균주 C388/90 (항원형 Ia/c) 및 NCS 246 (항원형 II/R)을 상기한 바와 같이(Lancefield et al. J Exp Med 142: 165-179, 1975)마우스를 통해 일련으로 통과(passage)시켰다. 요약하면, 독성의 증가는 감염된 마우스의 혈액 또는 비장에서 얻어진 Todd-Hewitt 브로스에서 서브배양의 일련의 희석의 복강내 접종을 사용하여 모니터되었다. 마지막 통과에서, 감염된 혈액 샘플을 사용하여 Todd-Hewitt 브로스를 접종시키는데 사용하였다. 7% CO2로 37 ℃에서 2시간의 배양후에, 10% (v/v)의 최종농도의 글리세롤을 배양에 첨가하였다. 그 다음 GBS 공격(challenge) 실험에 사용하기 위해 배양물을 분액(aliquoted)하고 -80 ℃에서 저장하였다. 이들 냉동 샘플에 존재하는 GBS의 cfu의 개수를 결정하였다. 18 주된 마우스의 100% (LD100)를 죽이는데 필요한 박 테리아 농도는 GBS 균주 C388/90 및 NCS246에 대해 각각 3.5X105 및 1.1X105 이라고 결정되었으며, 이것은 양 균주에서 독성의 상당한 증가에 해당한다. 실제로, 이들 두 균주의 통과전에 기록된 LD100은 109 cfu 보다 높았다.
박테리아 공격에서, 독성 GBS 균주의 신선하게 해동된 분액을 Todd-Hewitt 브로스를 사용하여 적당한 박테리아 농도로 조정하고, 1 ml를 각 암컷 CD-1 마우스에 intra 주사하였다. 공격시에 수동적(passive) 방어 실험에 사용된 마우스는 6 내지 8 주인 반면, 능동적(active) 방어 실험에 사용된 마우스는 약 18 주였다. 모든 접종원(inocula)은 콜로니 카운트에 의해 확인되었다. 동물을 공격후 처음 48 h 동안 매일 4회, 그리고 다음 12 일동안 매일 감염의 어떤 사인에 대해 관찰하였다. 그 기간의 끝에서, 생존자로부터 혈액 샘플을 수득하여 -20 ℃에서 동결시켰다. 공격에서 살아남은 각 마우스로부터 수득된 비장을 배양하여 어떤 잔존 GBS를 동정하였다.
실시예 2: 포름알데히드 사멸된 전체 GBS 세포에 의한 마우스에서의 면역화 및 방어
포름알데히드 사멸된 GBS 전체 세포를 Lancefield et al(J Exp Med 142:165-179, 1975)에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 요약하면, GBS 균주의 양(sheep) 혈액 아가 플레이트(Quelab Laboratories, Montreal, Canada)상에서 하룻밤 배양물을 PBS 버퍼(포스페이트 버퍼된-염수, pH7.2)에서 2회 세척하고, 약 3X109 cfu/mL로 조정하고, 0.3% (v/v) 포름알데히드를 함유하는 PBS에서 하룻밤 배양하였다. 사멸된 GBS 현탁액을 PBS로 세척하고, -80 ℃에서 동결유지하였다.
6 내지 8 주된 암컷 CD-1 마우스(Charles River, St-Constant, Quebec, Canada)를 포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 (~6X107 GBS)의 세포 0.1 ml 또는 대조군으로 PBS 0.1 ml로 2 주 간격으로 3회 피하주사하였다. 면역화전날에, 0.14 mg 또는 0.21 mg의 Al의 최종농도의 AlhydrogelTM (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark)을 이들포름알데히드 사멸된 제조에 첨가하고, 교반과 함께 4 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 면역화 프로토콜의 시작전 최종 주사 2주후에 각 마우스로부터 혈청 샘플을 수득하였다. 혈청을 -20 ℃에서 동결시켰다.
PBS로 주사된 각 대조군에서 8 마우스 및 포름알데히드 사멸된 전체 세포 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)으로 면역화된 군을 세 번째 주사후 1 주일에 1.5X104 cfu의 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)으로 공격하였다. 포름알데히드 사멸된 GBS 전체 세포로 면역화된 모든 마우스는 상동 공격에 생존한 반면, 공격후 5일내에 PBS로 주사된 8 마우스중 4마리만 주사로부터 생존하였다. 대조군에서 사멸률 증가시키기 위하여, 박테리아 현탁액은 박테리아 공격시에 마우스의 나이에 따라 조정되어야 하였다. 후속 공격 실험에서, 마우스가 15주 이상일 때, 박테리아 접종원을 3.0X105 내지 2.5X106 cfu 사이의 농도로 증가시켰다.
〔표 1 〕
포름알데히드 사멸된 GBS 전체 세포에 의한 CD1 마우스의 면역화 및 후속 상동 공격 [균주 C388/90 (Ia/c)] 및 이종 공격 [균주 NCS246 (II/R)]
면역화에 사용된 항원성 제제1 박테리아 공격후 14일째 생존 마우스 개수 (% 생존율)
상동 공격: 균주 C388/90 (Ia/c) 이종 공격: 균주 NCS246 (II/R)
1차 주사
포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 세포 (Ia/c)2 8/8 (100)3 n.d.5
대조 PBS 4/8 (50) n.d.
2차 주사
포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 세포 (Ia/c) 6/6 (100)4 0/6 (0)6
대조 PBS 2/6 (33) 0/6 (0)
1. 0.14 mg 또는 0.21 mg의 최종농도의 alhydrogelTM이 사용됨;
2. 약 6X107 cfu;
3. 1.5X104 cfu로 조정된 GBS C388/90 (Ia/c) 현탁액을 함유하는 1mL Todd-Hewitt 배양 배지로 복강내 공격;
4. 2.1X106 cfu로 조정된 GBS C388/90 (Ia/c) 현탁액을 함유하는 1mL Todd-Hewitt 배양 배지로 복강내 공격;
5. 하지 않음;
6. 1.2X105 cfu로 조정된 GBS NCS246 (II/R) 현탁액을 함유하는 1mL Todd-Hewitt 배양 배지로 복강내 공격;
다른 실험에서, 대조군에 해당하는 12 마우스의 한 군을 PBS로 주사하는 반 면, 12 마우스의 제2 군을 포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)의 세포로 면역화하였다.
이들 두 개의 군의 각각으로부터 6 마우스를 2.1X106 cfu의 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)으로 공격하였다 (표 1). 제1 공격 실험에서, GBS 균주 C388/90 (Ia/c)로 면역화된 모든 마우스는 상동 공격에 생존하였다. PBS로 주사된 6 마우스중 오직 2 마리만이 주사에 생존하였다.
양쪽 군에서 남아있는 6 마우스를 그 다음 1 주일후에 사용하여 이 항원성 제제가 혈청학적으로 구별되는 캡슐을 생성하는 균주 NCS246 (II/R)에 대한 교차 방어를 제공할 수 있는 지를 확인하였다. 이 제2 GBS 균주로 감염된 마우스의 어떤 것도 감염에 생존하지 못했다. 나중 결과는 포름알데히드 사멸된 균주 C388/90으로 유도된 방어적 면역 응답의 대부분이 캡슐형 다당에 대항하여 지시된다는 것과 그것이 특정 항원형의 균주에 제한될 수 있다는 것을 제시하였다. 이들 결과는 이 특정 감염 모델이 백신접종에 의해 제공되는 방어를 연구하는데 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 명백히 가리켰다.
실시예 3: 포름알데히드 사멸된 전체 GBS 세포에 의한 래빗의 면역화 및 마우스에서 수동적 방어
뉴질랜드 래빗(2.5 kg, Charles River, St-Constant, Quebec, Canada)을 포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)의 세포로 면역화시켜 과면역(hyperimmune) 혈청을 수득하였다. 이 래빗을 약 1.5X109 cfu의 포름알데히드 사멸된 전체 세포의 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)로 3주 간격으로 3회 피하주사하였다. Freund 완전 보조제 (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, New York)를 제1 면역화를 위한 보조제로서 사용한 반면, Freund 불완전 보조제 (Gibco BRL)를 다음 두 주사를 위해 사용하였다. 면역화 프로토콜의 시작전 및 최종 주사 2주후에 혈청 샘플을 수득하였다. 혈청을 -20 ℃에서 동결시켰다.
GBS의 의한 치사 감염에 대해 마우스를 수동적으로 방어하는 이 특정 래빗 과면역 혈청의 능력을 또한 평가하였다. 공격 18 시간전에 15 또는 25 μL의 과면역 래빗 혈청으로 마우스를 복강내 주사하였더니 감염에 대항하여 5 마우스중 4마리 (80%)를 방어하였다. 대조적으로, PBS 또는 수막구균 외막 제제로 면역화된 래빗에서 수득된 혈청으로 주사된 대조군에서의 마우스에 대하여는 20% 미만의 생존률을 기록하였다. 이 결과는 사멸된 GBS 세포로 다른 동물종을 면역화하면 마우스를 수동적으로 방어할 수 있는 항체의 생산을 유도할 수 있다는 것을 명백히 가리킨다. 이 시약은 또한 클론을 특성화하는데 사용될 것이다.
〔표 2〕
포름알데히드 사멸된 그룹 B 전체 스트렙토코커스 (균주 C388/90 (Ia/c)) 항원 제제로 면역화후에 수득된 래빗 혈청에 의해 제공되는 CD-1 마우스의 수동적 방어
그룹 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)로 박테리아 공격후 14일째 생존 마우스의 개수2 생존율 %
래빗 과면역 혈청2 - 25 μl 4/5 80
래빗 과면역 혈청 - 25 μl 4/5 80
대조 래빗 혈청 - 25 μl 1/5 20
대조 PBS 1/10 10
1. Freund 완전 보조제를 제1 면역에 사용하고, Freund 불완전 보조제를 다음 두 주사에 사용함;
2. 2X104 cfu로 조정된 GBS C388/90 (Ia/c) 현탁액을 함유하는 1 ml Todd-Hewitt 배양배지로 복강내 공격.
실시예 4: His.Tag-GBS 융합 단백질의 재조합 생성
각각 제한효소 부위 BglII(AGATCT) 및 HindIII(AAGCTT)의 첨가를 위한 염기 연장(extensions)을 포함하는 올리고를 사용하여 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)의 게놈 DNA로부터 GBS 유전자의 코딩 영역을 PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA)에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 Qiagen(Chatsworth, CA)제 Qiaex II 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하고, 제한효소 BglII 및 HindIII (Pharmacia Canada Inc Baie d'Urfe, Canada)로 분해하고, 에탄올 침전전에 페놀:클로로포름으로 추출하였다. 티오레옥신-His.Tag 서열을 함유하는 pET-32b(+) 벡터 (Novagen, Madison, WI)를 제한효소 BglII 및 HindIII로 분해하고, 페놀:클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전시켰다. BglII-HindIII 게놈 DNA 단편을 BglII-HindIII pET-32b(+) 벡터에 라이게이션시켜 유전자가 T7 프로모터의 제어하에 있는 티오레독신-His.Tag-GBS 융합 단백질의 코딩 서열을 제조하였다. 라이게이션된 생성물을 Simanis 의 방법(Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed.), pp. 109-135)에 따라 E.coli 균주 XLI 블루 MRF'(△(mcrA)183△(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi -1 recA1, gyrA96 relA1 lac [F'proAB lacIqZ△M15Tn10 (Tet)r]c)(Stratagene, La Jolla, Ca)내로 형질전환시켰다. 재조합 pET 플라스미드를 Qiagen 키드(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 정제하고, DNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 DNA 시퀀싱(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing 키트, ABI, Foster City, CA)에 의해 확인하였다. 재조합 pET 플라스미드를 일렉트로포레이션(Gene Pulser II 장치, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada)의해 E.coli 균주 AD494 (DE3)(△ara-leu7697 △lacX74 △phoA PvuII phoR △malF3 F'[lac +(lacIq) pro] trxB::Kan (DE3))(Novagen, madison, WI)내로 형질전환시켰다. 이 E.coli 균주에서, 융합 단백질의 발현을 제어하는 T7 프로모터는 이소프로필-β-D-티오-갈락토피라노시드 (IPTG)에 의해 유동가능한 lac 프로모터의 제어하에 유전자가 있는 T7 RNA 폴리머라제 (λDE3 프로마지상에 존재)에 의해 특이적으로 인식된다.
형질전환체 AD494 (DE3)/rpET를 A600이 0.6의 값에 도달할 때까지 mL당 100 μg의 암피실린(Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada)을 함유하는 LB 브로스 (펩톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L)에 250 rpm에서 교반과 함께 37 ℃에서 생장시켰다. 티오레독신-His.Tag-GBS 융합 단백질의 생성을 유도하기 위하여, 세포를 1mM의 최종 농도의 IPTG의 존재하에 2시간 더 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수확하였다.
2 h 동안 IPTG 유도시 AD494 (DE3)/rpET32에 의해 생성된 재조합 융합 단백질을 불용성 응집물(aggregate)에 의해 내생적 E.coli 단백질에서 정제된 불용성 봉입체로서 부분적으로 수득하였다(Gerlach, G.F. et al 1992, Infect. Immun. 60:892). 500 mL 배양물로부터 유도된 세포를 20 mL의 25% 수크로스-50mM Tris-HCl 버퍼(pH8.0)에 재현탁시키고, -70℃에서 동결시켰다. 해동된 현탁액에서 세포의 용해는 5mL의 250M Tris-HCl 버퍼(pH8.0)중 리소자임(10mg/mL) 용액을 첨가한후 빙상에서 10 내지 15 분간 배양하고, 150mL의 세제 혼합물(5부의 20mM Tris-HCl 버퍼[pH7.4]-300mM NaCl-2% 데옥시콜산-2% Nonidet P-40 및 4부의 100mM Tris-HCl 버퍼[pH8]-50mM EDTA-2% Triton X-100)을 첨가한후 빙상에서 5분간 배양함으로써 성취하였다. 초음파분해시, 단백질 응집체는 35,000 X g에서 30분간 원심분리에 의해 수확되었고, 가용성 세포 분획의 샘플을 유지하였다. 응집된 단백질을 6M 구아니딘 히드로콜라이드에서 용해시켰다. 가용성 및 불용성 분획 모두에서 융합 단백질의 존재는 대응 GBS 균주로 인한 박테리아 공격에 생존한 포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 (Ia/c) 세포로 주사된 마우스의 혈청을 사용하여 Western Blot 분석에서 밝혀졌다.
IPTG-유도된 AD494 (DE3)/rpET의 가용성 분획으로부터 융합 단백질의 정제는 His.Tag 서열(6 연속 히스티딘 잔기)이 His.Bind 메탈 킬레이션 수지(Novagen, Madison, WI)상에 고정된 2가 양이온 (Ni2+)에 결합하는 성질에 기초한 친화성 크로마토그라피에 의해 수행하였다. 사용된 정제 방법은 pET 시스템 매뉴얼, 제6 판(Novagen, Madison, WI)에 기재된 것들이다. 요약하면, IPTG로 유도된 100mL 배양액에서 수득된 펠릿화(pelleted)된 세포를 결합 버퍼(5mM 이미다졸-500mM NaCl-20mM Tris-HCl pH7.9) 4mL에 재현탁하고, 초음파분해하고, 20분간 39,000 X g에서 회전시켜 데브리(debris)를 제거하였다. 상청액을 여과하고(0.45 μm 포어 사이즈 막), 결합 버퍼에 평형화된 His.Bind 수지의 칼럼상에 축적하였다. 그 다음 칼럼을 10 칼럼 부피의 결합 버퍼, 이어서 6 칼럼 부피의 세척 버퍼(20mM 이미다졸-500mM NaCl-20mM Tris-HCl pH7.9)로 세척하였다. 티오레독신-His.Tag-GBS 융합 단백질을 융출 버퍼(1M 이미다졸-500mM NaCl-20mM Tris-HCl pH7.9)로 용출시켰다. 샘플로부터 염 및 이미다졸의 제거는 4 ℃에서 3 X 1 리터 PBS 에 대한 투석에 의해 수행하였다.
E.coli의 가용성 또는 불용성 세포질 분획에서 수득된 융합 단백질의 양은 이들 단백질 과 소 혈청 알부민 표준 (Pierce Chemical Co. Rockford, Ill.)의 일련의 희석에 의한 소디움 도데실 술페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔의 Coomassie 염색에 의해 측정하였다.
실시예 5: 람다 P L 프로모터의 제어하에 GBS 단백질의 재조합 생성
GBS 단백질의 DAN 코딩 영역을 번역 벡터 pURV22내로 프로모터 λPL의 하류 에 삽입하였다. 이 플라스미드는 p629(George et al, 1987, Bio/Technology 5:600)에서 유래되었는데, 여기서 헤르페스 심플렉스 비루스 타입 I(HSV-I) 당단백질 (gD-1)의 일부의 코딩 영역이 제거되고 암피실린 내성 유전자가 플라스미드 벡터 pUC4K(Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canada)에서 수득된 카나마이신 카세트으로 치환되었다. 그 벡터는 기능적 PR 프로모터가 결실된 박테리오파지 λ cI857 온도 민감성 리프레서 유전자의 카세트를 함유하였다. 30-37 ℃ 내지 37-42 ℃ 범위의 온도 증가에 의한 cI857 리프레서의 불활성화는 λ PL 제어하의 유전자의 유도를 초래하였다. 유전자의 번역은 BglII 제한효소 부위 (AGATCT) 및 ATG에 의해 하류가 따라오는 리보솜 결합 부위 cro: ACTAAGGAGGTTAGATCTATG 에 의해 제어되었다.
제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 공급자(Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canada; 및 New England Biolabs Ltd., Mississauga, Canada)에 따라 사용되었다. DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동은 Cambrook et al.(Molecular cloning: A laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y)에 기술된대로 수행하였다. GBS 박테리아의 염색체 DNA는 Jayarao et al(J. Clin. Microbiol., 1991, 29:2774)에 기술된 방법에 따라 제조되었다. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 DNA 증폭 반응은 DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR 시스템 2400(Perkin Elmer, San Jose, CA)을 사용하여 수행하였다. DNA 시퀀싱에 사용된 플라스미드는 Qiagen(Chatsworth, CA)제의 플라스미드 키트를 사용하여 정제하었 다. DNA 단편은 Qiagen(Chatsworth, CA)제의 Qiaex II 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하였다. 플라스미드 형질전환은 Hanahan(DNA Cloning, Glover (de.) pp, 109-135, 1985))에 기술된 방법에 의해 실시하였다. 플라스미드에서 게놈 DNA 삽입체의 시퀀싱은 올리고뉴클레오티드 신서사이저 모델 394(the Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div. (ABI), Foster City, CA)에 의해 합성된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다. 시퀀싱 반응은 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing 키트(ABI, Foster City, CA)를 사용한 PCR에 의해 실시하였고, DNA 전기영동은 자동화된 DNA 시퀀서 373A(ABI, Foster City, CA)상에서 수행하였다. DNA 서열의 조합은 프로그램 시퀀서 3.0(Gene Codes Corporation, Ann Argor, MI)을 사용하여 수행하였다. DNA 서열 및 그 예상 폴리펩티드의 분석은 프로그램 Gene Works 버전 2.45(Intelligenetics, Inc., Mountain View CA)로 수행하였다.
GBS 유전자의 코딩 영역은 각각 제한효소 부위 BglII (AGATCT) 및 XbaI (TCTAGA)의 첨가를 위한 염기 연장을 함유하는 올리고를 사용하여 GBS 균주 C388/90 (Ia/c) 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 Qiagen(Chatsworth,CA)제 Qiaex II 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하고, 제한효소 BglII 및 XbaI로 분해하고, 에탄올 침전전에 페놀:클로로포름으로 추출하였다. pURV22 벡터를 제한효소 BglII 및 XbaI로 분해하고, 페놀:클로로포름으로 추출하고, 에탄올 침전시켰다. BglII-XbaI 게놈 DNA 단편을 GBS 유전자가 λPL 프로모터의 제어하에 있는 BglII-XbaI pURV22 벡터에 라이게이션시켰다. 라이게이션 생성물을 Hanahan, 상기에 기재된 방법에 따라 E.coli 균주 XLI 블루 MRF' (△(mcrA)183△(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi -1 recA1, gyrA96 relA1 lac [F'proAB lacIqZ△M15Tn10 (Tet)r]c)(Stratagene, La Jolla CA)내로 형질전환시켰다. 삽입체를 갖는 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 용해된 세포를 아가로스 겔상의 전기영동시키는 분석법(Sambrook et al, 상기)에 의해 동정되었다. 재조합 pURV22 플라스미드는 Qiagen 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 정제하였고, DNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
형질전환체 XLI 블루 MRF'/rpURV22를 A600이 0.6의 값에 이를때까지 mL당 50μg의 카나마이신을 함유하는 LB 브로스에서 250 rpm으로 교반과 함께 34℃에서 생장시켰다. 융합 단백질의 생성을 유도하기 위해, 세포를 39℃에서 4시간 더 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 샘플 버퍼에서 재현탁하고, 10분간 비등시키고, -20℃에서 유지하였다.
실시예 6: CMV 플라스미드 pCMV-GH에서 GBS 단백질 유전자의 서브클로닝
GBS 단백질의 DNA 코딩 영역을 플라스미드 벡터 pCMV-GH(Tang et al, Nature, 1992, 356:152)에 사이토메갈로비루스(CMV) 프로모터의 전사 제어하에 있는 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자의 페이즈(phase) 하류에 삽입하였다. CMV 프로모터는 E.coli 세포에서 비기능적이나, 진핵세포에 플라스미드의 투입시 활성화된다. 그 벡터는 또한 암피실린 내성 유전자를 포함하였다.
이 유전자의 코딩 역역을 제한효소 부위 BglII (AGATCT) 및 HindIII (AAGCTT)의 첨가를 위한 염기 연장을 함유하는 올리고를 사용하여 GBS 균주 C388/90 (Ia/c)의 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 Qiagen (Chatsworth, CA)제 Qiaex II 겔 추출 키트를 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하고, 제한효소 BglII 및 HindII로 분해하고, 에탄올 침전전에 페놀:클로로포름으로 추출하였다. 융합 단백질을 생성하기 위해 인간 성장 호르몬을 함유하는 pCMV-GH 벡터 (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)를 제한효소 BamHI 및 HindIII로 분해하고, 페놀:클로로포름으로 추출하고, 에톤올 침전시켰다. 1.3-kb BglII-HindIII 게놈 DNA 단편을 BamHi-HindIII pCMV-GH 벡터에 라이게이션시켜 CMV 프로모터 제어하의 hGH-GBS 융합 단백질을 생성하였다. 라이게이션 생성물을 Hanahan, 상기에 기재된 방법에 따라 E.coli 균주 DH5α[ф80 lacZ △M15 endA1 recA1 hsdR17 (r K-mK+) supE44 thi-1λ- gyrA96 relA1 △(lacZYA-argF)U169](Gibco BRL, Gaithersburg, MD)내로 형질전환시켰다. 삽입체를 갖는 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 용해된 세포를 아가로스 겔상에 전기영동시키는 분석법(Sambrook, J. et al, 상기)에 의해 동정되었다. 재조합 pCMV 플라스미드를 Qiagen 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 정제하고, DNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
실시예 7: GBS 공격에 대한 GBS 단백질의 면역학적 활성
6 내지 8 주의 12 암컷 CD-1 마우스(Charles River, St-Constant, Quebec, Canada)의 4 그룹을 다음 항원성 제제 0.1mL로 3주 간격으로 3회 피하주사하였다: 포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 세포(~6X107 cfu), E.coli의 불용성(봉입체)에서 수득된 티오레독신-His.Tag-GBS 융합 단백질 20 μg 또는 E.coli의 가용성 세포질 분획에서 친화성 정제된(니켈 칼럼) 융합 단백질 20 μg, 또는 친화성 정제된(니켈 칼럼) 티오레독신-His.Tag 제어 폴리펩티드 20 μg. 20μg의 QuilATM (Cedarlane Laboratories Ltd. Hornby, Canada)을 보조제로서 각 항원성 제제에 첨가하였다. 혈청 샘플을 면역화전에(PB) 및 면역화 프로토콜중에 20일째(TB1), 41일째(TB2) 및 54일째(TB3) 각 마우스로부터 수득하였다. 혈청을 -20℃에서 동결하였다.
ELISA 역가의 증가를 융합 단백질의 각 주사후에 기록하였고, 이것은 양호한 1차 응답 및 각각의 제2 및 제3 투여후에 특이적 체액성 면역 응답의 부스트(boost)를 가리킨다. 면역화 기간의 끝에, 상호적 ELLISA 역가의 자산(means)은 봉입체에서 수득된 20 μg 융합 단백질로 면역화된 군에서 456,145인데 비하여, E.coli의 가용성 분획에서 수득된 단백질로 면역화된 마우스 군에서 290,133이었다. 후자 결과는 봉입체에서 수득된 단백질이 가용성 단백질보다 더 면역원성일 수 있다는 것을 제시한다. 코트 플레이트에 대한 친화성 정제된 티오레독신-His.Tag을 사용한 ELISA에서 마우스 혈청의 분석은 무시할만한 항체 역가가 융합 단백질의 티오레독신-His.Tag 부분에 대해 만들어진다는 것을 보여주었다. 재조합 융합 단백질로 주사된 마우스로부터의 혈청의 반응성은 또한 포름알데히드 사멸된 GBS 균주 C388/90 전체 세포에 대한 ELISA에 의해 시험되었다. 재조합 융합 단백질로 면역화에 의해 유도된 항체는 또한 GBS 세포상의 그들의 특이적 에피토프를 인식하였으며, 이는 그들의 구조가 교차-반응성 항체를 유도할 정도로 음성 스트렙토코커스 단백질에 충분히 유사하다는 것을 가리킨다.
면역화에 의해 유도된 면역 응답이 GBS 감염에 대해 방어할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 마우스를 3.5X105 cfu의 GBS 균주 C338/90(Ia/c) 및 1.2X105 cfu의 균주 NCS246(II/R)로 공격하였고, 그 결과는 표 3 및 4에 각각 도시되었다. 대조 티오레독신-His.Tag 펩티드로 면역화된 마우스는 각 GBS 균주에 의한 공격에 대해 방어적이지 못한 반면, 포름알데히드 사멸된 C388/90 전체 세포로 면역화된 것들은 상동 공격에 대해 방어를 제공하였다. 본 발명의 티오레독신-His.Tag-GBS 융합 단백질은 양 GBS 균주에 의한 공격으로부터 마우스를 방어하였다. 이들 마우스의 혈액 및 비장 배양물은 어떤 GBS의 존재를 나타내지 않았다.
〔표 3〕
GBS 균주 C388/90 (Ia/c) 공격1 으로부터의 생존률
면역화 제 공격에 생존하는 마우스 개수 % 생존률
티오레독신-His.Tag2 1/6 17
포름알데히드 사멸된 C388/90 세포3 6/6 100
티오레독신-His.Tag-GBS 융합 (봉입체 제제)4 6/6 100
티오레독신-His.Tag-GBS 융합 (세포질 분획)4 6/6 100
1. 3.5X105 cfu로 조정된 1ml Todd-Hewitt 배양 배지로 복강내 투여;
2. 20 μg 투여; 생존 마우스중 뒷다리 마비; 혈액 및 비장에서 GBS 검출;
3. 6X107 cfu 투여;
4. 20 μg 투여.
〔표 4〕
GBS 균주 NCS246 (II/R) 공격1 으로부터의 생존률
면역화 제 공격에 생존하는 마우스 개수 % 생존률
티오레독신-His.Tag2 0/6 0
포름알데히드 사멸된 C388/90 세포3 2/6 34
티오레독신-His.Tag-GBS 융합 (봉입체 제제)4 5/54 100
티오레독신-His.Tag-GBS 융합 (세포질 분획)4 6/6 100
1. 1.2X105 cfu로 조정된 GBS NCS246 (II/R) 현탁액을 함유하는 1ml Todd-Hewitt 배양 배지로 복강내 투여;
2. 20 μg 투여;
3. 6X107 cfu 투여;
4. 면역화도중 1 마우스 사망.
실시예 8: 재조합 GBS 단백질에 의한 면역화는 실험적 GBS 감염에 대해 방어를 제공한다
이 실시예는 서열번호: 39에 해당하는 재조합 단백질로 면역화에 의한 치명적 GBS 감염에 대한 방어를 예시한다.
10 암컷 CD-1 마우스(Charles River)의 군들을 20μg의 QuilATM 보조제 (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada)의 존재하에 서열번호: 42에 해당하는 GBS 유전자를 함유하는 재조합 pURV22 플라스미드 벡터를 포함하는 E.coli 균주 BLR (Novagen)에서 정제된 재조합 단백질 20 μg로, 또는 대조군으로서 PBS중 QuilATM 보조제 단독으로 3주 간격으로 3회 피하주사로 면역화하였다. 혈액 샘플을 1, 22 및 43일째에 각 면역화전에 및 14일후(57일째) 제3 주사후에 안와 동(orbital sinus)으로부터 수집하였다. 1주일후에 마우스를 약 104 내지 106 CFU의 다양한 독성 GBS 균주로 공격하였다. GBS 공격 접종원의 샘플을 TSA/5% 양 혈액 아가 플레이트상에 플레이팅하여 CFU를 결정하고 공격 투여량을 확인하였다. 14일 동안 및 공격후 14일째 사멸을 기록하였으며, 생존 마우스를 희생시키고 혈액 및 비장을 GBS 유기체의 존재에 대해 시험하였다. 생존률 데이터는 표 5에 보여진 다.
공격전(prechallenge) 혈청을 표준 면역측정법에 의해 GBS와 반응성인 항체의 존재에 대해 분석하였다. ELISA 및 면역블롯 분석은 재조합 GBS 단백질에 의한 면역화가 E.coli에서 재조합 및 천연 GBS 단백질 양쪽에 반응성인 항체를 생성한다는 것을 가리켰다. GBS에 대한 항체 응답은 실시예 9에 기술된다.
〔표 5〕
8개의 다양한 GBS 공격 균주에 대한 방어를 유도하는 서열번호: 39에 해당하는 재조합 GBS 단백질의 능력
면역원 공격 균주 생존No.:사멸No.1
명칭 타입
rGBS 단백질 없음 C388/90 Ia/c 8 : 2 (P<0.0001) 0 : 10
rGBS 단백질 없음 NCS 246 II/R 10 : 0 (P=0.0012) 3 : 7
rGBS 단백질 없음 ATCC12401 Ib 10 : 0 (P=0.001) 3 : 7
rGBS 단백질 없음 NCS 535 V 10 : 0 (P=0.01) 5 : 5
rGBS 단백질 없음 NCS 9842 VI 10 : 0 (P<0.0001) 0 : 10
rGBS 단백질 NCS 915-F3 없음 NCS 915 III 7 : 3 (P=0.0007)2 1 : 9 4 : 6
rGBS 단백질 NCS 954-F 없음 NCS 954 III/R 7 : 3 (P=0.002) 4 : 6 1 : 9
rGBS 단백질 COH1-F 없음 COH1 III 4 : 6 (P=0.0004) 3 : 7 0 : 10
1. 그룹당 10 마우스의 그룹을 사용, 감염에 생존한 마우스의 개수 및 죽은 마우스의 개수를 가리킴. 비매개변수 분석에 대한 log-rank 시험을 이용하여 재조합 GBS 단백질-면역화된 동물에 해당하는 생존 곡선을 모의(mock)-면역화된 동물에 해당하는 생존 곡선과 비교됨.
2. NCS915-F-면역화된 동물에 대한 비교 분석.
3. 동물을 QuilATM 보조제의 존재하에 포름알데히드 사멸된 GBS로 면역화시킴.
생존 마우스로부터의 모든 혈액배양물(hemocultures)은 공격후 14일째 음성이었다. 생존 마우스로부터의 비장 배양물은 실험 MB-11으로부터의 몇몇 마우스를 제외하고 음성이었다.
실시예 9: 재조합 GBS 단백질에 의한 백신접종은 GBS에 대한 면역 응답을 유도한다
10 암컷 CD-1 마우스의 그룹들을 실시예 8에 기술된 대로 서열번호: 39에 해당하는 재조합 GBS 단백질로 피하주사로 면역화하였다. 음성 GBS 단백질에 대한 항체 응답을 평가하기 위해, 각 면역화전에 및 제3 면역화후 14일째에 수집된 혈액 샘플로부터의 혈청을 타입 III 균주 NCS 954, 타입 Ib 균주 ATCC12401, 타입 V 균주 NCS 535 또는 타입 VI 균주 NCS 9842로부터의 포름알데히드 사멸된 GBS 세포로 피복된 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 GBS 세포와 반응성인 항체에 대해 시험하였다. GBS 단백질에 대한 키워진(raised) 항체의 특이성은 GBS 세포 추출물 및 정제된 재조합 항원에 대한 웨스턴(Western) 블롯 분석에 의해 확인되었다. 도 10에 보여진 그 결과는 동물들이 피복 항원에 의존하여 제3 면역화후에 수집된 혈청에 대해 12000 내지 128000 사이로 변하는 중간 상호적 항체 역가를 가지며 면역원으로서 재조합 GBS 단백질에 강하게 응답한다는 것을 증명한다. 모든 면역전(preimmune)혈청은 1 : 100 희석에서 시험시 음성이었다. GBS-반응성 항체는 재조합 GBS 단백질의 단일 주사후에 각 동물의 혈청에서 검출가능하였다.
실시예 10: 본 발명의 GBS 단백질의 항원성 보존
본 발명의 GBS 단백질에 특이적인 모노클로날 항체(MAbs)를 사용하여 이 표면 항원이 모든 GBS에 의해 생성된다는 것과 그것이 또한 항원성면에서 높게 보존적이라는 것을 증명하였다.
68 GBS 단리체들의 집단을 사용하여 GBS-특이적 MAbs의 반응성을 평가하였다. 이들 균주는 National Cener for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Canada; Centre Hospitalier Universitaire de Quebec, Pavillon CHUL, Quebec, Canada; American Type Culture Collection, USA; Laboratoire de Sante Publique 여 Quebec, Canada; 및 Dept. of Infectious Disease, Children's Hospital and Medical Center, Seattle, USA에서 수득하였다. 모든 8 Mabs를 다음 균주의 패널에 대해 시험하였다: 항원형 Ia 또는 Ia/c의 6 단리체, 항원형 Ib의 3 단리체, 항원형 II의 4 단리체, 항원형 III의 14 단리체, 항원형 IV의 2 단리체, 항원형 V의 2 단리체, 항원형 VI의 2 단리체, 항원형 VII의 2 단리체, 항원형 VIII의 1 단리체, 항원형이 결정되지 않은 10 단리체 및 3 소 S. agalactiae 균주. MAb 3A2는 또한 추가적 GBS: 항원형 Ia/c의 9 단리체 및 항원형 V의 10 단리체와 반응시켰다. 균주를 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 혈액 아가 플레이트상에서 하룻밤 생장시켰다. 배양물을 20% (v/v) 글리세롤을 갖는 하트 주입 브로스에 70℃에서 저장하였다.
GBS 단백질-특이적 MAbs를 수득하기 위해, 마우스를 20% QuilATM 보조제의 존재하에 정제된 재조합 GBS 단백질 (서열번호: 44) 20 μg으로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 상기된 바와 같이(Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23: 163-170), 면역화된 마우스에서 회수된 비장 세포를 비분비성 SP2/O 골수 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포주를 생성하였다. 혼성(hybrid) 클론 상청액을 상기된 바와 같이(Hamel, J. et al. 1987. J. Med. Microbiol. 23: 163-170) 포름알데히드 불활성화된 GBS 및 정제된 재조합 GBS 단백질을 사용한 ELISA에 의해특이적 항체 생성에 대해 시험하였다. 특이적 혼성체를 제한적(limiting) 희석에 의해 클로닝하고, 팽창시키고, 액체 질소에서 동결시켰다. 재조합 GBS 단백질의 생성은 실시예 4 & 5에 제시되었다. 정제된 재조합 GBS 단백질 또는 포름알데히드 불활성화된 GBS는 제조자에 의해 추천된 대로 Laemmli의 비연속 버퍼 시스템을 사용하여 전기영동에 의해 분해(resolved)한 다음, 상기한 대로(Martin et al. 1992. Infect. Immun. 60: 2718-2725) 웨스턴 면역블롯팅을 위해 니트로셀룰로스 막상에 전달시켰다.
웨스턴 면역블롯팅 실험은 모든 8 MAbs가 정제된 재조합 GBS 단백질(서열번호: 39)에 해당하는 단백질 밴드를 인식한다는 것을 명백히 가리켰다. 이들 MAbs 는 또한 지금까지 시험된 모든 GBS 단리체들에 존재하는 단백질 밴드와 반응하였다. 이들 GBS-특이적 MAbs의 반응성은 표 6에 제시된다. 각 MAb는 모든 46 GBS와 잘 반응하였다. 더욱이, 이들 MAbs는 또한 시험된 소 기원의 3 S. agalactiae 균주를 인식하였다. MAb 3A2는 또한 19 GBS: 항원형 Ia/c의 9 단리체 및 항원형 V의 10 단리체를 인식하였다. 다른 MAbs는 이들 추가적 균주들에 대해 시험되지 않았다.
이들 결과는 GBS 단백질(서열번호: 39)이 지금까지 시험된 모든 65 GBS 및 소 기원의 세 개의 3 S. agalactiae 균주들에 의해 생성된다는 것을 증명하였다. 더 중요하게는, 이들 결과는 이들 8 GBS-특이적 MAbs에 의해 인식되는 에피토프는 GBS중에 널리 분포되고 보존된다는 것을 명백히 증명하였다. 이들 결과는 또한 주요 질병 유발 그룹을 포함하는 모든 공지의 GBS 항원형의 대표들이 시험되었기 때문에, 이들 에피토프가 혈청학적으로 연관된 단리체들에만 제한되지 않는다는 것을 가리켰다.
결론적으로, 본 실시예에서 제시된 데이터는 본 발명의 GBS 단백질이 모든 GBS에서 생성되고 항원성면에서 매우 보존적이라는 것을 명백히 증명하였다.
〔표 6〕
웨스턴 면역블롯에 의해 평가된 서로다른 S. agalactiae 균주들과 8 GBS 단백질-특이적 MAbs와의 반응성
Mabs MAbs에 의해 인식되는 각 항원형의s. agalactiae 균주의 개수
Ia 또는 Ia/c (6) Ib (3) II (4) III (4) IV (2) V (2) VI (2) VII (2) VIII (1) NT (10)2 총계 (26) 소 (3)
3A21 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
5A12 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
6G11 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
8B9 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
8E11 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
12B12 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
18F11 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
20G2 6 3 4 4 2 2 2 2 1 10 46 3
1. 9 추가적 항원형 Ia/c 균주 및 10 항원형 V 균주가 MAb 3A2에 의해 인식됨.
2. 이들 균주는 항원형이 결정 않됨.
SEQUENCE LISTING <110> BioChem Vaccins RIOUX, Clement DENIS, Martin BRODEUR, Bernard R. HAMEL, Josee CHARLEBOIS, Isabelle BOYER, Martine <120> NOVEL GROUP B STREPTOCOCCUS ANTIGENS <130> 12806-9PCT <150> 60/075,425 <151> 1998-02-20 <160> 43 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 4514 <212> DNA <213> Streptococcus <220> <221> CDS <222> (3)...(464) <221> CDS <222> (534)...(887) <223> <221> CDS <222> (1024)...(1765) <221> CDS <222> (1841)...(4288) <400> 1 ta tct ggc aaa gag cca gct aat cgt ttt agt tgg gct aaa aat aaa 47 Ser Gly Lys Glu Pro Ala Asn Arg Phe Ser Trp Ala Lys Asn Lys 1 5 10 15 tta tta atc aat gga ttc att gca act cta gca gca act atc tta ttt 95 Leu Leu Ile Asn Gly Phe Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ile Leu Phe 20 25 30 ttt gca gtt caa ttc ata ggt ctt aaa cca gat tac cct gga aaa acc 143 Phe Ala Val Gln Phe Ile Gly Leu Lys Pro Asp Tyr Pro Gly Lys Thr 35 40 45 tac ttt att atc cta ttg aca gca tgg act ttg atg gca tta gta act 191 Tyr Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ala Trp Thr Leu Met Ala Leu Val Thr 50 55 60 gct tta gtg gga tgg gat aat agg tat ggt tcc ttc ttg tcg tta tta 239 Ala Leu Val Gly Trp Asp Asn Arg Tyr Gly Ser Phe Leu Ser Leu Leu 65 70 75 ata tta tta ttc cag ctt ggt tca agc gca gga act tac cca ata gaa 287 Ile Leu Leu Phe Gln Leu Gly Ser Ser Ala Gly Thr Tyr Pro Ile Glu 80 85 90 95 ttg agt cct aag ttc ttt caa aca att caa cca ttt tta ccg atg act 335 Leu Ser Pro Lys Phe Phe Gln Thr Ile Gln Pro Phe Leu Pro Met Thr 100 105 110 tac tct gtt tca gga tta aga gag acc atc tcg ttg acg gga gac gtt 383 Tyr Ser Val Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ile Ser Leu Thr Gly Asp Val 115 120 125 aac cat caa tgg aga atg cta gta atc ttt tta gta tca tcg atg ata 431 Asn His Gln Trp Arg Met Leu Val Ile Phe Leu Val Ser Ser Met Ile 130 135 140 ctt gct ctt ctt att tat cgt aaa caa gaa gat taatagaaag tatctagtga 484 Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Arg Lys Gln Glu Asp 145 150 tagactaaca gtatgatatg gtatgtcaaa gtatttagga ggagaagat atg tct act 542 Met Ser Thr 155 tta aca ata att att gca aca tta act gct ttg gaa cat ttt tat att 590 Leu Thr Ile Ile Ile Ala Thr Leu Thr Ala Leu Glu His Phe Tyr Ile 160 165 170 atg tat ttg gag acg tta gcc acc cag tca aat atg act ggg aag att 638 Met Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Thr Gln Ser Asn Met Thr Gly Lys Ile 175 180 185 ttt agt atg tct aaa gaa gag ttg tca tat tta ccc gtt att aaa ctt 686 Phe Ser Met Ser Lys Glu Glu Leu Ser Tyr Leu Pro Val Ile Lys Leu 190 195 200 205 ttt aag aat caa ggt gta tac aac ggc ttg att ggc cta ttc ctc ctt 734 Phe Lys Asn Gln Gly Val Tyr Asn Gly Leu Ile Gly Leu Phe Leu Leu 210 215 220 tat ggg tta tat att tca cag aat caa gaa att gta gct gtt ttt tta 782 Tyr Gly Leu Tyr Ile Ser Gln Asn Gln Glu Ile Val Ala Val Phe Leu 225 230 235 atc aat gta ttg cta gtt gct att tat ggt gct ttg aca gtt gat aaa 830 Ile Asn Val Leu Leu Val Ala Ile Tyr Gly Ala Leu Thr Val Asp Lys 240 245 250 aaa atc tta tta aaa cag ggt ggt tta cct ata tta gct ctt tta aca 878 Lys Ile Leu Leu Lys Gln Gly Gly Leu Pro Ile Leu Ala Leu Leu Thr 255 260 265 ttc tta ttt taatactact tagccgttcg atttagttga acggctttta 927 Phe Leu Phe 270 gtaatcattt ttttctcata atacaggtag tttaagtaat ttgtctttaa aaatagtata 987 atataactac gaattcaaag agaggtgact ttgatt atg act gag aac tgg tta 1041 Met Thr Glu Asn Trp Leu 275 cat act aaa gat ggt tca gat att tat tat cgt gtc gtt ggt caa ggt 1089 His Thr Lys Asp Gly Ser Asp Ile Tyr Tyr Arg Val Val Gly Gln Gly 280 285 290 caa ccg att gtt ttt tta cat ggc aat agc tta agt agt cgc tat ttt 1137 Gln Pro Ile Val Phe Leu His Gly Asn Ser Leu Ser Ser Arg Tyr Phe 295 300 305 310 gat aag caa ata gca tat ttt tct aag tat tac caa gtt att gtt atg 1185 Asp Lys Gln Ile Ala Tyr Phe Ser Lys Tyr Tyr Gln Val Ile Val Met 315 320 325 gat agt aga ggg cat ggc aaa agt cat gca aag cta aat acc att agt 1233 Asp Ser Arg Gly His Gly Lys Ser His Ala Lys Leu Asn Thr Ile Ser 330 335 340 ttc agg caa ata gca gtt gac tta aag gat atc tta gtt cat tta gag 1281 Phe Arg Gln Ile Ala Val Asp Leu Lys Asp Ile Leu Val His Leu Glu 345 350 355 att gat aaa gtt ata ttg gta ggc cat agc gat ggt gcc aat tta gct 1329 Ile Asp Lys Val Ile Leu Val Gly His Ser Asp Gly Ala Asn Leu Ala 360 365 370 tta gtt ttt caa acg atg ttt cca ggt atg gtt aga ggg ctt ttg ctt 1377 Leu Val Phe Gln Thr Met Phe Pro Gly Met Val Arg Gly Leu Leu Leu 375 380 385 390 aat tca ggg aac ctg act att cat ggt cag cga tgg tgg gat att ctt 1425 Asn Ser Gly Asn Leu Thr Ile His Gly Gln Arg Trp Trp Asp Ile Leu 395 400 405 tta gta agg att gcc tat aaa ttc ctt cac tat tta ggg aaa ctc ttt 1473 Leu Val Arg Ile Ala Tyr Lys Phe Leu His Tyr Leu Gly Lys Leu Phe 410 415 420 ccg tat atg agg caa aaa gct caa gtt att tcg ctt atg ttg gag gat 1521 Pro Tyr Met Arg Gln Lys Ala Gln Val Ile Ser Leu Met Leu Glu Asp 425 430 435 ttg aag att agt cca gct gat tta cag cat gtg tca act cct gta atg 1569 Leu Lys Ile Ser Pro Ala Asp Leu Gln His Val Ser Thr Pro Val Met 440 445 450 gtt ttg gtt gga aat aag gac ata att aag tta aat cat tct aag aaa 1617 Val Leu Val Gly Asn Lys Asp Ile Ile Lys Leu Asn His Ser Lys Lys 455 460 465 470 ctt gct tct tat ttt cca agg ggg gag ttt tat tct tta gtt ggc ttt 1665 Leu Ala Ser Tyr Phe Pro Arg Gly Glu Phe Tyr Ser Leu Val Gly Phe 475 480 485 ggg cat cac att att aag caa gat tcc cat gtt ttt aat att att gca 1713 Gly His His Ile Ile Lys Gln Asp Ser His Val Phe Asn Ile Ile Ala 490 495 500 aaa aag ttt atc aac gat acg ttg aaa gga gaa att gtt gaa aaa gct 1761 Lys Lys Phe Ile Asn Asp Thr Leu Lys Gly Glu Ile Val Glu Lys Ala 505 510 515 aat t gaaaaagtca aatcactgac ttctgtgatt aaaattgtat tttttatatc 1815 Asn tgttttagtg cttattattg ttgaa at gat tca ttt gaa acg aac tat ttc 1866 Tyr Asp Ser Phe Glu Thr Asn Tyr Phe 520 525 tgt tga gca act aaa gag tgt ttt tgg gca att atc tcc aat gaa tct 1914 Cys * Ala Thr Lys Glu Cys Phe Trp Ala Ile Ile Ser Asn Glu Ser 530 535 540 ttt ctt aat tat cct tgt ggg ggt tat cgc tgt ctt acc gac aac cgg 1962 Phe Leu Asn Tyr Pro Cys Gly Gly Tyr Arg Cys Leu Thr Asp Asn Arg 545 550 555 ata tga ctt tgt act gaa tgg act ttt acg tac aga taa aag caa aag 2010 Ile * Leu Cys Thr Glu Trp Thr Phe Thr Tyr Arg * Lys Gln Lys 560 565 570 gta tat ttt aca gac tag ttg gtg tat caa cac ttt taa taa ctt gtc 2058 Val Tyr Phe Thr Asp * Leu Val Tyr Gln His Phe * * Leu Val 575 580 585 agg att cgg tgg ctt aat cga tat tgg gtt gcg cat ggc ttt tta tgg 2106 Arg Ile Arg Trp Leu Asn Arg Tyr Trp Val Ala His Gly Phe Leu Trp 590 595 600 taa aaa agg tca aga gaa gag tga cct aag aga agt gac tcg ttt ttt 2154 * Lys Arg Ser Arg Glu Glu * Pro Lys Arg Ser Asp Ser Phe Phe 605 610 615 acc cta tct tat ttc tgg tct gtc att tat tag tgt gat tgc ctt aat 2202 Thr Leu Ser Tyr Phe Trp Ser Val Ile Tyr * Cys Asp Cys Leu Asn 620 625 630 cat gag cca tat ttt tca tgc caa agc tag tgt tga tta cta tta ttt 2250 His Glu Pro Tyr Phe Ser Cys Gln Ser * Cys * Leu Leu Leu Phe 635 640 645 ggt att aat tgg tgc tag tat gta ttt tcc tgt tat tta ttg gat ttc 2298 Gly Ile Asn Trp Cys * Tyr Val Phe Ser Cys Tyr Leu Leu Asp Phe 650 655 660 tgg tca taa agg aag cca tta ttt cgg aga tat gcc atc tag tac tcg 2346 Trp Ser * Arg Lys Pro Leu Phe Arg Arg Tyr Ala Ile * Tyr Ser 665 670 tat aaa att agg tgt tgt ttc ttt ttt tga atg ggg atg tgc ggc cgc 2394 Tyr Lys Ile Arg Cys Cys Phe Phe Phe * Met Gly Met Cys Gly Arg 675 680 685 agc att tat aat tat cgg tta ttt aat ggg cat tca tct acc agt tta 2442 Ser Ile Tyr Asn Tyr Arg Leu Phe Asn Gly His Ser Ser Thr Ser Leu 690 695 700 705 taa aat ttt acc act att ttg tat tgg ttg tgc cgt cgg gat tgt atc 2490 * Asn Phe Thr Thr Ile Leu Tyr Trp Leu Cys Arg Arg Asp Cys Ile 710 715 720 cct tat tcc cgg tgg att agg aag ttt tga att agt tct att tac agg 2538 Pro Tyr Ser Arg Trp Ile Arg Lys Phe * Ile Ser Ser Ile Tyr Arg 725 730 735 gtt tgc tgc cga ggg act acc taa aga aac tgt ggt tgc atg gtt att 2586 Val Cys Cys Arg Gly Thr Thr * Arg Asn Cys Gly Cys Met Val Ile 740 745 750 act tta tcg ttt agc cta cta tat tat tcc att ctt tgc agg tat cta 2634 Thr Leu Ser Phe Ser Leu Leu Tyr Tyr Ser Ile Leu Cys Arg Tyr Leu 755 760 765 ttt ctt tat cca tta ttt agg tag tca aat aaa tca acg tta tga aaa 2682 Phe Leu Tyr Pro Leu Phe Arg * Ser Asn Lys Ser Thr Leu * Lys 770 775 780 tgt ccc gaa aga gtt agt atc aac tgt tct aca aac cat ggt gag cca 2730 Cys Pro Glu Arg Val Ser Ile Asn Cys Ser Thr Asn His Gly Glu Pro 785 790 795 ttt gat gcg tat ttt agg tgc att ctt aat att ttc aac agc att ttt 2778 Phe Asp Ala Tyr Phe Arg Cys Ile Leu Asn Ile Phe Asn Ser Ile Phe 800 805 810 tga aaa tat tac tta tat tat gtg gtt gca gaa gct agg ctt gga ccc 2826 * Lys Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Val Val Ala Glu Ala Arg Leu Gly Pro 815 820 825 att aca aga aca aat gtt atg gca gtt tcc agg ttt att gct ggg ggt 2874 Ile Thr Arg Thr Asn Val Met Ala Val Ser Arg Phe Ile Ala Gly Gly 830 835 840 ttg ttt tat tct ctt agc tag aac tat tga tca aaa agt gaa aaa tgc 2922 Leu Phe Tyr Ser Leu Ser * Asn Tyr * Ser Lys Ser Glu Lys Cys 845 850 855 ttt tcc aat tgc tat tat ctg gat tac ttt gac att gtt tta tct taa 2970 Phe Ser Asn Cys Tyr Tyr Leu Asp Tyr Phe Asp Ile Val Leu Ser * 860 865 870 ttt agg tca tat tag ttg gcg act atc ttt ctg gtt tat ttt act att 3018 Phe Arg Ser Tyr * Leu Ala Thr Ile Phe Leu Val Tyr Phe Thr Ile 875 880 885 gtt agg ctt att agt cat taa gcc aac tct cta taa aaa aca att tat 3066 Val Arg Leu Ile Ser His * Ala Asn Ser Leu * Lys Thr Ile Tyr 890 895 900 tta tag ctg gga aga gcg tat taa gga tgg aat cat tat cgt tag ttt 3114 Leu * Leu Gly Arg Ala Tyr * Gly Trp Asn His Tyr Arg * Phe 905 910 aat ggg agt tct att tta tat tgc agg act act att ccc tat cag ggc 3162 Asn Gly Ser Ser Ile Leu Tyr Cys Arg Thr Thr Ile Pro Tyr Gln Gly 915 920 925 930 tca tat tac agg tgg tag tat tga acg cct gca tta tat cat agc atg 3210 Ser Tyr Tyr Arg Trp * Tyr * Thr Pro Ala Leu Tyr His Ser Met 935 940 gga gcc gat agc att ggc tac gtt gat tct tac tct cgt tta ttt atg 3258 Gly Ala Asp Ser Ile Gly Tyr Val Asp Ser Tyr Ser Arg Leu Phe Met 945 950 955 960 ttt ggt taa gat ttt aca agg aaa atc ttg tca gat tgg tga tgt gtt 3306 Phe Gly * Asp Phe Thr Arg Lys Ile Leu Ser Asp Trp * Cys Val 965 970 caa tgt gga tcg tta taa aaa act act tca agc tta cgg tgg ttc ttc 3354 Gln Cys Gly Ser Leu * Lys Thr Thr Ser Ser Leu Arg Trp Phe Phe 975 980 985 gga tag cgg ttt agc ctt ttt aaa tga taa aag gct cta ctg gta cca 3402 Gly * Arg Phe Ser Leu Phe Lys * * Lys Ala Leu Leu Val Pro 990 995 1000 aaa aaa tgg aga aga ttg cgt tgc gtt cca att tgt aat tgt caa taa 3450 Lys Lys Trp Arg Arg Leu Arg Cys Val Pro Ile Cys Asn Cys Gln * 1005 1010 1015 taa atg tct tat tat ggg gga acc agc cgg tga tga cac tta tat tcg 3498 * Met Ser Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Arg * * His Leu Tyr Ser 1020 1025 1030 tga agc tat tga atc gtt tat tga tga tgc tga taa gct aga cta tga 3546 * Ser Tyr * Ile Val Tyr * * Cys * * Ala Arg Leu * 1035 cct tgt ttt tta cag tat tgg aca gaa gtt gac act act ttt aca tga 3594 Pro Cys Phe Leu Gln Tyr Trp Thr Glu Val Asp Thr Thr Phe Thr * 1040 1045 1050 gta tgg ttt tga ctt tat gaa agt tgg tga gga tgc ttt agt taa ttt 3642 Val Trp Phe * Leu Tyr Glu Ser Trp * Gly Cys Phe Ser * Phe 1055 1060 1065 aga aac gtt tac tct taa agg gaa taa gta caa acc ttt cag aaa tgc 3690 Arg Asn Val Tyr Ser * Arg Glu * Val Gln Thr Phe Gln Lys Cys 1070 1075 1080 cct aaa tag agt tga aaa gga tgg ttt cta ttt cga agt tgt aca atc 3738 Pro Lys * Ser * Lys Gly Trp Phe Leu Phe Arg Ser Cys Thr Ile 1085 1090 1095 gcc aca tag tca aga gct act aaa tag ttt gga aga gat ttc taa tac 3786 Ala Thr * Ser Arg Ala Thr Lys * Phe Gly Arg Asp Phe * Tyr 1100 1105 ttg gtt aga agg acg tcc tga aaa agg ttt ctc act agg ata ttt taa 3834 Leu Val Arg Arg Thr Ser * Lys Arg Phe Leu Thr Arg Ile Phe * 1110 1115 1120 taa aga tta ttt cca aca agc ccc aat agc ttt ggt aaa aaa tgc tga 3882 * Arg Leu Phe Pro Thr Ser Pro Asn Ser Phe Gly Lys Lys Cys * 1125 1130 1135 aca cga agt tgt tgc ttt tgc taa tat tat gcc aaa cta tga aaa gag 3930 Thr Arg Ser Cys Cys Phe Cys * Tyr Tyr Ala Lys Leu * Lys Glu 1140 1145 1150 tat tat ctc tat tga ttt aat gcg tca cga taa aca gaa aat tcc gaa 3978 Tyr Tyr Leu Tyr * Phe Asn Ala Ser Arg * Thr Glu Asn Ser Glu 1155 1160 tgg cgt tat gga ttt cct ctt ttt atc att att ctc tta tta tca aga 4026 Trp Arg Tyr Gly Phe Pro Leu Phe Ile Ile Ile Leu Leu Leu Ser Arg 1165 1170 1175 1180 gaa ggg ata cca cta ttt tga ttt ggg gat ggc acc ttt atc agg agt 4074 Glu Gly Ile Pro Leu Phe * Phe Gly Asp Gly Thr Phe Ile Arg Ser 1185 1190 1195 tgg tcg cgt tga aac aag ttt tgc taa aga gag aat ggc gta tct tgt 4122 Trp Ser Arg * Asn Lys Phe Cys * Arg Glu Asn Gly Val Ser Cys 1200 1205 cta tca ttt cgg tag tca ttt cta ctc att taa tgg ttt aca caa gta 4170 Leu Ser Phe Arg * Ser Phe Leu Leu Ile * Trp Phe Thr Gln Val 1210 1215 1220 taa gaa gaa gtt tac acc att gtg gtc gga acg tta tat ttc ttg ttc 4218 * Glu Glu Val Tyr Thr Ile Val Val Gly Thr Leu Tyr Phe Leu Phe 1225 1230 1235 tcg ttc gtc ctg gtt aat ttg tgc tat ttg tgc cct att aat gga aga 4266 Ser Phe Val Leu Val Asn Leu Cys Tyr Leu Cys Pro Ile Asn Gly Arg 1240 1245 1250 tag taa aat taa gat tgt taa a taagctttat ttggcaatta aaaagagcat 4318 * * Asn * Asp Cys * 1255 gtcatgcgac atgctctttt taaatcattt aataccattg attgcttgaa tctactttat 4378 aatatgatgt gcttttaaat attgtttagc tactgtagct gctgatttat gctttacagc 4438 tacttggtag ttcatttctt gcatttcttt ttcagtgata tgaccagcaa gtttattgag 4498 agcttttttt acttga 4514 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 2 Ser Gly Lys Glu Pro Ala Asn Arg Phe Ser Trp Ala Lys Asn Lys Leu 1 5 10 15 Leu Ile Asn Gly Phe Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ile Leu Phe Phe 20 25 30 Ala Val Gln Phe Ile Gly Leu Lys Pro Asp Tyr Pro Gly Lys Thr Tyr 35 40 45 Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ala Trp Thr Leu Met Ala Leu Val Thr Ala 50 55 60 Leu Val Gly Trp Asp Asn Arg Tyr Gly Ser Phe Leu Ser Leu Leu Ile 65 70 75 80 Leu Leu Phe Gln Leu Gly Ser Ser Ala Gly Thr Tyr Pro Ile Glu Leu 85 90 95 Ser Pro Lys Phe Phe Gln Thr Ile Gln Pro Phe Leu Pro Met Thr Tyr 100 105 110 Ser Val Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ile Ser Leu Thr Gly Asp Val Asn 115 120 125 His Gln Trp Arg Met Leu Val Ile Phe Leu Val Ser Ser Met Ile Leu 130 135 140 Ala Leu Leu Ile Tyr Arg Lys Gln Glu Asp 145 150 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 3 Met Ser Thr Leu Thr Ile Ile Ile Ala Thr Leu Thr Ala Leu Glu His 1 5 10 15 Phe Tyr Ile Met Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Thr Gln Ser Asn Met Thr 20 25 30 Gly Lys Ile Phe Ser Met Ser Lys Glu Glu Leu Ser Tyr Leu 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Ile Ser 50 55 60 Leu Asp Thr Met Ser Ser Gly Glu His Asp Leu Val Lys Val Asn Ile 65 70 75 80 Ile Arg Pro Thr Thr Glu His Thr Ile Pro Thr Met Met Thr Ala Ser 85 90 95 Pro Tyr His Gln Gly Ile Asn Asp Pro Ala Ala Asp Gln Lys Thr Tyr 100 105 110 Gln Met Glu Gly Ala Leu Ala Val Lys Gln Pro Lys His Ile Gln Val 115 120 125 Asp Thr Lys Pro Phe Lys Glu Glu Val Lys His Pro Ser Lys Leu Pro 130 135 140 Ile Ser Pro Ala Thr Glu Ser Phe Thr His Ile Asp Ser Tyr Ser Leu 145 150 155 160 Asn Asp Tyr Phe Leu Ser Arg Gly Phe Ala Asn Ile Tyr Val Ser Gly 165 170 175 Val Gly Thr Ala Gly Ser Thr Gly Phe Met Thr Ser Gly Asp Tyr Gln 180 185 190 Gln Ile Gln Ser Phe Lys Ala Val Ile Asp Trp Leu Asn Gly Lys Val 195 200 205 Thr Ala Phe Thr Ser His Lys Arg Asp Lys Gln Val Lys Ala Asp Trp 210 215 220 Ser Asn Gly Leu Val Ala Thr Thr Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Thr Met 225 230 235 240 Ser Thr Gly Leu Ala Thr Thr Gly Val Glu Gly Leu Lys Val Ile Ile 245 250 255 Ala Glu Ala Ala Ile Ser Thr Trp Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Asn Gly 260 265 270 Leu Val Cys Ser Pro Gly Gly Tyr Pro Gly Glu Asp Leu Asp Val Leu 275 280 285 Thr Glu Leu Thr Tyr Ser Arg Asn Leu Leu Ala Gly Asp Tyr Ile Lys 290 295 300 Asn Asn Asp Cys Tyr Gln Ala Leu Leu Asn Glu Gln Ser Lys Ala Ile 305 310 315 320 Asp Arg Gln Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Tyr Trp His Asp Arg Asn Tyr 325 330 335 Leu Thr His Val Asn Asn Val Lys Ser Arg Val Val Tyr Thr His Gly 340 345 350 Leu Gln Asp Trp Asn Val Lys Pro Arg His Val Tyr Lys Val Phe Asn 355 360 365 Ala Leu Pro Gln Thr Ile Lys Lys His Leu Phe Leu His Gln Gly Gln 370 375 380 His Val Tyr Met His Asn Trp Gln Ser Ile Asp Phe Arg Glu Ser Met 385 390 395 400 Asn Ala Leu Leu Ser Gln Glu Leu Leu Gly Ile Asp Asn His Phe Gln 405 410 415 Leu Glu Glu Val Ile Trp Gln Asp Asn Thr Thr Glu Gln Thr Trp Gln 420 425 430 Val Leu Asp Ala Phe Gly Gly Asn His Gln Glu Gln Ile Gly Leu Gly 435 440 445 Asp Ser Lys Lys Leu Ile Asp Asn His Tyr Asp Lys Glu Ala Phe Asp 450 455 460 Thr Tyr Cys Lys Asp Phe Asn Val Phe Lys Asn Asp Leu Phe Lys Gly 465 470 475 480 Asn Asn Lys Thr Asn Gln Ile Thr Ile Asn Leu Pro Leu Lys Lys Asn 485 490 495 Tyr Leu Leu Asn Gly Gln Cys Lys Leu His Leu Arg Val Lys Thr Ser 500 505 510 Asp Lys Lys Ala Ile Leu Ser Ala Gln Ile Leu Asp Tyr Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Arg Phe Lys Asp Thr Pro Thr Ile Lys Phe Leu Asn Ser Leu Asp 530 535 540 Asn Gly Lys Asn Phe Ala Arg Glu Ala Leu Arg Glu Leu Pro Phe Thr 545 550 555 560 Lys Asp His Tyr Arg Val Ile Ser Lys Gly Val Leu Asn Leu Gln Asn 565 570 575 Arg Thr Asp Leu Leu Thr Ile Glu Ala Ile Glu Pro Glu Gln Trp Phe 580 585 590 Asp Ile Glu Phe Ser Leu Gln Pro Ser Ile Tyr Gln Leu Ser Lys Gly 595 600 605 Asp Asn Leu Arg Ile Ile Leu Tyr Thr Thr Asp Phe Glu His Thr Ile 610 615 620 Arg Asp Asn Ala Ser Tyr Ser Ile Thr Val Asp Leu Ser Gln Ser Tyr 625 630 635 640 Leu Thr Ile Pro Thr Asn Gln Gly Asn 645 <210> 39 <211> 119 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 39 Met Lys Leu Leu Thr Lys Glu Arg Phe Asp Asp Ser Gln His Phe Trp 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Asn Leu Leu Gln Glu Ser Asn Phe Gly Ala Val Phe Asp 20 25 30 His Asp Asn Lys Asn Ile Pro Gln Val Val Ala Thr Ile Val Asp Asp 35 40 45 Leu Gln Gly Ser Gly Ser Ser Asn His Phe Trp Tyr Phe Gly Asn Thr 50 55 60 Thr Asp Thr Ser Ile Leu Met Ile Ala His Leu Asn Arg Lys Phe Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Val Asn Leu Lys Asp Phe Asp Phe Ala Leu Asn Leu Ile Ala 85 90 95 Ile Asn Asn Trp Lys Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu Glu Ala Leu Asn 100 105 110 Asp Thr Leu Ala Ile Phe Gln 115 <210> 40 <211> 326 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 40 Met Ser Ser Tyr Trp Asn Asn Tyr Pro Glu Leu Lys Lys Asn Ile Asp 1 5 10 15 Glu Thr Asn Gln Leu Ile Gln Glu Arg Ile Gln Val Arg Asn Lys Asp 20 25 30 Ile Glu Ala Ala Leu Ser Gln Leu Thr Ala Ala Gly Gly Lys Gln Leu 35 40 45 Arg Pro Ala Phe Phe Tyr Leu Phe Ser Gln Leu Gly Asn Lys Glu Asn 50 55 60 Gln Asp Thr Gln Gln Leu Lys Lys Ile Ala Ala Ser Leu Glu Ile Leu 65 70 75 80 His Val Ala Thr Leu Ile His Asp Asp Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu 85 90 95 Arg Arg Gly Asn Met Thr Ile Gln Ser Lys Phe Gly Lys Asp Ile Ala 100 105 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320 Leu Leu Lys Arg Lys Ile 325 <210> 41 <211> 247 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 41 Leu Pro Asn Lys Pro Tyr Asp Phe Ser Val Lys Asn Leu Ser Phe Gln 1 5 10 15 Tyr Lys Pro Gln Glu Lys Trp Val Leu His His Leu Asp Leu Asp Ile 20 25 30 Lys Glu Gly Glu Lys Ile Ala Ile Leu Gly Arg Ser Gly Ser Gly Lys 35 40 45 Ser Thr Leu Ala Ser Leu Leu Arg Gly Asp Leu Lys Ala Ser Gln Gly 50 55 60 Lys Ile Thr Leu Gly Gly Ala Asp Val Ser Ile Val Gly Asp Cys Ile 65 70 75 80 Ser Asn Tyr Ile Gly Val Ile Gln Gln Ala Pro Tyr Leu Phe Asn Thr 85 90 95 Thr Leu Leu Asn Asn Ile Arg Ile Gly Asn Gln Asp Ala Ser Glu Glu 100 105 110 Asp Val Trp Lys Val Leu Glu Arg Val Gly Leu Lys Glu Met Val Thr 115 120 125 Asp Leu Ser Asp Gly Leu Tyr Thr Met Val Asp Glu Ala Gly Leu Arg 130 135 140 Phe Ser Gly Gly Glu Arg His Arg Ile Ala Leu Ala Arg Ile Leu Leu 145 150 155 160 Lys Asp Val Pro Ile Val Ile Leu Asp Glu Pro Thr Val Gly Leu Asp 165 170 175 Pro Ile Thr Glu Gln Ala Leu Leu Arg Val Phe Met Lys Glu Leu Glu 180 185 190 Gly Lys Thr Leu Val Trp Ile Thr His His Leu Lys Gly Ile Glu His 195 200 205 Ala Asp Arg Ile Leu Phe Ile Glu Asn Gly Gln Leu Glu Leu Glu Gly 210 215 220 Ser Pro Gln Glu Leu Ser Gln Ser Ser Gln Arg Tyr Arg Gln Leu Lys 225 230 235 240 Ala Ala Asp Asp Gly Asp Leu 245 <210> 42 <211> 434 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 42 Met Lys Met Asn Lys Lys Val Leu Leu Thr Ser Thr Met Ala Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ser Val Ala Ser Val Gln Ala Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp 20 25 30 Thr Ala Arg Thr Val Ser Glu Val Lys Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp 35 40 45 Asn Lys Ser Ser Tyr Thr Val Lys Tyr Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile 50 55 60 Ser Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn Val Leu Ala Lys Ile Asn Asn 65 70 75 80 Ile Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro Glu Thr Thr Leu Thr Val Thr 85 90 95 Tyr Asp Gln Lys Ser His Thr Ala Thr Ser Met Lys Ile Glu Thr Pro 100 105 110 Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu Lys Thr 115 120 125 Asn Gln Val Ser Val Ala Asp Gln Lys Val Ser Leu Asn Thr Ile Ser 130 135 140 Glu Gly Met Thr Pro Glu Ala Ala Thr Thr Ile Val Ser Pro Met Lys 145 150 155 160 Thr Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu Lys Ser Lys Glu Val Leu Ala Gln 165 170 175 Glu Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala Asn Glu Gln Val Ser Thr Ala 180 185 190 Pro Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val Pro Ala Ala Lys Glu Glu Val 195 200 205 Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala 210 215 220 Ser Val Ala Ala Glu Thr Pro Ala Pro Val Ala Lys Val Ala Pro Val 225 230 235 240 Arg Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Ala Ser Val Lys Val Val Thr Pro 245 250 255 Lys Val Glu Thr Gly Ala Ser Pro Glu His Val Ser Ala Pro Ala Val 260 265 270 Pro Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ser Lys Leu Gln Ala Thr 275 280 285 Glu Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln Lys Ala Pro Thr Ala Thr Pro 290 295 300 Val Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala His Pro Glu 305 310 315 320 Asn Ala Gly Leu Gln Pro His Val Ala Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala 325 330 335 Ser Thr Tyr Gly Val Asn Glu Phe Ser Thr Tyr Arg Ala Gly Asp Pro 340 345 350 Gly Asp His Gly Lys Gly Leu Ala Val Asp Phe Ile Val Gly Lys Asn 355 360 365 Gln Ala Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln Tyr Ser Thr Gln Asn Met Ala 370 375 380 Ala Asn Asn Ile Ser Tyr Val Ile Trp Gln Gln Lys Phe Tyr Ser Asn 385 390 395 400 Thr Asn Ser Ile Tyr Gly Pro Ala Asn Thr Trp Asn Ala Met Pro Asp 405 410 415 Arg Gly Gly Val Thr Ala Asn His Tyr Asp His Val His Val Ser Phe 420 425 430 Asn Lys <210> 44 <211> 1305 <212> DNA <213> Streptococcus <400> 44 atgaaaatga ataaaaaggt actattgaca tcgacaatgg cagcttcgct attatcagtc 60 gcaagtgttc aagcacaaga aacagatacg acgtggacag cacgtactgt ttcagaggta 120 aaggctgatt tggtaaagca agacaataaa tcatcatata ctgtgaaata tggtgataca 180 ctaagcgtta tttcagaagc aatgtcaatt gatatgaatg tcttagcaaa aattaataac 240 attgcagata tcaatcttat ttatcctgag acaacactga cagtaactta cgatcagaag 300 agtcatactg ccacttcaat gaaaatagaa acaccagcaa caaatgctgc tggtcaaaca 360 acagctactg tggatttgaa aaccaatcaa gtttctgttg cagaccaaaa agtttctctc 420 aatacaattt cggaaggtat gacaccagaa gcagcaacaa cgattgtttc gccaatgaag 480 acatattctt ctgcgccagc tttgaaatca aaagaagtat tagcacaaga gcaagctgtt 540 agtcaagcag cagctaatga acaggtatca acagctcctg tgaagtcgat tacttcagaa 600 gttccagcag ctaaagagga agttaaacca actcagacgt cagtcagtca gtcaacaaca 660 gtatcaccag cttctgttgc cgctgaaaca ccagctccag tagctaaagt agcaccggta 720 agaactgtag cagcccctag agtggcaagt gttaaagtag tcactcctaa agtagaaact 780 ggtgcatcac cagagcatgt atcagctcca gcagttcctg tgactacgac ttcaacagct 840 acagacagta agttacaagc gactgaagtt aagagcgttc cggtagcaca aaaagctcca 900 acagcaacac cggtagcaca accagcttca acaacaaatg cagtagctgc acatcctgaa 960 aatgcagggc tccaacctca tgttgcagct tataaagaaa aagtagcgtc aacttatgga 1020 gttaatgaat tcagtacata ccgtgcaggt gatccaggtg atcatggtaa aggtttagca 1080 gtcgacttta ttgtaggtaa aaaccaagca cttggtaatg aagttgcaca gtactctaca 1140 caaaatatgg cagcaaataa catttcatat gttatctggc aacaaaagtt ttactcaaat 1200 acaaatagta tttatggacc tgctaatact tggaatgcaa tgccagatcg tggtggcgtt 1260 actgccaacc attatgacca tgttcacgta tcatttaaca aataa 1305 <210> 45 <211> 232 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 45 Met Pro His Leu Ser Lys Glu Ala Phe Lys Lys Gln Ile Lys Asn Gly 1 5 10 15 Ile Ile Val Ser Cys Gln Ala Leu Pro Gly Glu Pro Leu Tyr Thr Glu 20 25 30 Ser Gly Gly Val Met Pro Leu Leu Ala Leu Ala Ala Gln Glu Ala Gly 35 40 45 Ala Val Gly Ile Arg Ala Asn Ser Val Arg Asp Ile Lys Glu Ile Gln 50 55 60 Glu Val Thr Asn Leu Pro Ile Ile Gly Ile Ile Lys Arg Glu Tyr Pro 65 70 75 80 Pro Gln Glu Pro Phe Ile Thr Ala Thr Met Thr Glu Val Asp Gln Leu 85 90 95 Ala Ser Leu Asp Ile Ala Val Ile Ala Leu Asp Cys Thr Leu Arg Glu 100 105 110 Arg His Asp Gly Leu Ser Val Ala Glu Phe Ile Gln Lys Ile Lys Gly 115 120 125 Lys Tyr Pro Glu Gln Leu Leu Met Ala Asp Ile Ser Thr Phe Glu Glu 130 135 140 Gly Lys Asn Ala Phe Glu Ala Gly Val Asp Phe Val Gly Thr Thr Leu 145 150 155 160 Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Xaa Arg Gln Glu Glu Gly Pro Asp Ile Glu 165 170 175 Leu Leu Asn Lys Leu Cys Gln Ala Gly Ile Asp Val Ile Ala Glu Gly 180 185 190 Lys Ile His Thr Pro Lys Gln Ala Asn Glu Ile Asn His Ile Gly Val 195 200 205 Ala Gly Ile Val Val Gly Gly Ala Ile Thr Arg Pro Lys Glu Ile Ala 210 215 220 Glu Arg Phe Ile Ser Gly Leu Ser 225 230 <210> 46 <211> 39 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 46 Met Ser Ile Lys Lys Ser Val Ile Gly Phe Cys Leu Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ser Met Phe Ala Cys Val Asp Ser Ser Gln Ser Val Met Ala Ala 20 25 30 Glu Lys Asp Lys Val Glu Ile 35 <210> 47 <211> 409 <212> PRT <213> Streptococcus <400> 47 Gln Glu Thr Asp Thr Thr Trp Thr Ala Arg Thr Val Ser Glu Val Lys 1 5 10 15 Ala Asp Leu Val Lys Gln Asp Asn Lys Ser Ser Tyr Thr Val Lys Tyr 20 25 30 Gly Asp Thr Leu Ser Val Ile Ser Glu Ala Met Ser Ile Asp Met Asn 35 40 45 Val Leu Ala Lys Ile Asn Asn Ile Ala Asp Ile Asn Leu Ile Tyr Pro 50 55 60 Glu Thr Thr Leu Thr Val Thr Tyr Asp Gln Lys Ser His Thr Ala Thr 65 70 75 80 Ser Met Lys Ile Glu Thr Pro Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Thr Thr 85 90 95 Ala Thr Val Asp Leu Lys Thr Asn Gln Val Ser Val Ala Asp Gln Lys 100 105 110 Val Ser Leu Asn Thr Ile Ser Glu Gly Met Thr Pro Glu Ala Ala Thr 115 120 125 Thr Ile Val Ser Pro Met Lys Thr Tyr Ser Ser Ala Pro Ala Leu Lys 130 135 140 Ser Lys Glu Val Leu Ala Gln Glu Gln Ala Val Ser Gln Ala Ala Ala 145 150 155 160 Asn Glu Gln Val Ser Thr Ala Pro Val Lys Ser Ile Thr Ser Glu Val 165 170 175 Pro Ala Ala Lys Glu Glu Val Lys Pro Thr Gln Thr Ser Val Ser Gln 180 185 190 Ser Thr Thr Val Ser Pro Ala Ser Val Ala Ala Glu Thr Pro Ala Pro 195 200 205 Val Ala Lys Val Ala Pro Val Arg Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Ala 210 215 220 Ser Val Lys Val Val Thr Pro Lys Val Glu Thr Gly Ala Ser Pro Glu 225 230 235 240 His Val Ser Ala Pro Ala Val Pro Val Thr Thr Thr Ser Thr Ala Thr 245 250 255 Asp Ser Lys Leu Gln Ala Thr Glu Val Lys Ser Val Pro Val Ala Gln 260 265 270 Lys Ala Pro Thr Ala Thr Pro Val Ala Gln Pro Ala Ser Thr Thr Asn 275 280 285 Ala Val Ala Ala His Pro Glu Asn Ala Gly Leu Gln Pro His Val Ala 290 295 300 Ala Tyr Lys Glu Lys Val Ala Ser Thr Tyr Gly Val Asn Glu Phe Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Ala Gly Asp Pro Gly Asp His Gly Lys Gly Leu Ala Val 325 330 335 Asp Phe Ile Val Gly Lys Asn Gln Ala Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln 340 345 350 Tyr Ser Thr Gln Asn Met Ala Ala Asn Asn Ile Ser Tyr Val Ile Trp 355 360 365 Gln Gln Lys Phe Tyr Ser Asn Thr Asn Ser Ile Tyr Gly Pro Ala Asn 370 375 380 Thr Trp Asn Ala Met Pro Asp Arg Gly Gly Val Thr Ala Asn His Tyr 385 390 395 400 Asp His Val His Val Ser Phe Asn Lys 405

Claims (50)

  1. 서열번호: 39 및 서열번호: 44로 구성된 군에서 선택된 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 그룹 B 스트렙토코커스에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 폴리뉴클레오티드.
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  3. 서열번호: 39 및 서열번호: 44로 구성된 군에서 선택된 서열을 가지는 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 생성할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 그룹 B 스트렙토코커스에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 3 항의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 서열번호: 42 또는 서열번호: 43에 기재된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 그룹 B 스트렙토코커스에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
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  17. 폴리뉴클레오티드가 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 제 1 항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
  18. 폴리뉴클레오티드가 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 제 3 항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
  19. 제 17 항의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  20. 제 18 항의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  21. 재조합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 제 19 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 제조방법.
  22. 재조합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 제 20 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 제조방법.
  23. 서열번호: 39 및 서열번호: 44로 구성된 군에서 선택된 서열을 가지는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 그룹 B 스트렙토코커스에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 폴리펩티드.
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  26. 서열번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 생성할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 그룹 B 스트렙토코커스에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 폴리펩티드.
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  29. 서열번호: 39에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 상기 서열번호: 39의 폴리펩티드에 대한 결합 특이성을 가지는 항체를 생성할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 그룹 B 스트렙토코커스에 특이적인 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는 폴리펩티드.
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  32. 제 29 항에 있어서, N-말단 Met 잔기가 결실된 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  33. 제 29 항에 있어서, 분비성 아미노산 서열이 결실된 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  34. 제 23 항, 제 26 항 및 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 함유하는 백신 조성물.
  35. 제 32 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 함유하는 백신 조성물.
  36. 제 33 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 함유하는 백신 조성물.
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  38. 삭제
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  40. 제 34 항에 따른 조성물의 치료 또는 예방적 양을 소에게 투여하는 것을 포함하는 스트렙토코커스 감염에 감수성인 소에서 스트렙토코커스 박테리아 감염의 치료 또는 예방 방법.
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  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
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  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 제 21 항의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하는 백신 조성물.
  50. 제 22 항의 방법에 따라 제조된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 보조제를 포함하는 백신 조성물.
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