ES2278436T3 - Antigenos de estreptococos del grupo b. - Google Patents
Antigenos de estreptococos del grupo b. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2278436T3 ES2278436T3 ES99904646T ES99904646T ES2278436T3 ES 2278436 T3 ES2278436 T3 ES 2278436T3 ES 99904646 T ES99904646 T ES 99904646T ES 99904646 T ES99904646 T ES 99904646T ES 2278436 T3 ES2278436 T3 ES 2278436T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- baselineskip
- polynucleotide
- seq
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 126
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 125
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 124
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 40
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 206010061372 Streptococcal infection Diseases 0.000 claims description 9
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 59
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 9
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 4
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- -1 for example Polymers 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 2
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010014792 Endometritis decidual Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N Ethyl hydrogen sulfate Chemical compound CCOS(O)(=O)=O KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010058780 Meningitis neonatal Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 208000006816 Neonatal Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N tamsulosin hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].CCOC1=CC=CC=C1OCCN[C@H](C)CC1=CC=C(OC)C(S(N)(=O)=O)=C1 ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, o un fragmento de dicho polipéptido, en donde dicho polipéptido o fragmento de dicho polipéptido retiene la capacidad de inducir una respuesta inmune específica de estreptococos del grupo B.
Description
Antígenos de estreptococos del grupo B.
La presente invención se refiere a antígenos,
más particularmente a antígenos de patógenos bacterianos de
estreptococos del grupo B (GBS), que son útiles como componentes de
vacunas para la terapia y/o la profilaxis.
Los estreptococos son bacterias gram (+) que se
diferencian por antígenos de carbohidratos específicos de la A a la
O en su superficie celular. Los grupos de estreptococos se
distinguen además por antígenos de polisacáridos capsulares de tipo
específico. Se han identificado varios serotipos para los
estreptococos de Grupo B (GBS): Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y
VIII. Los GBS también contienen proteínas antigénicas conocidas como
"proteínas-C" (alfa, beta, gamma y delta),
algunas de las cuales han sido clonadas. Aunque el GBS es un
componente común de la flora colónica y vaginal humana, dicho
patógeno ha sido reconocido durante mucho tiempo como una causa
principal de sepsis neonatal y de meningitis, de meningitis de
activación tardía en niños, de endometritis
post-parto, así como de mastitis en el ganado
lechero. Las madres parturientas expuestas a GBS corren el riesgo
de infección post-parto y pueden transferir la
infección a sus bebés cuando atraviesan el canal de nacimiento.
Aunque el organismo es sensible a antibióticos, la elevada velocidad
de ataque y el rápido inicio de la sepsis en neonatos, y de la
meningitis en niños, da lugar a una elevada tasa de mortalidad.
Para encontrar una vacuna que proteja a
individuos frente a la infección por GBS, los investigadores se han
fijado en los antígenos de tipo específico. Desafortunadamente estos
polisacáridos han demostrado ser pobremente inmunogénicos en
humanos y están restringidos al serotipo concreto del cual procede
el polisacárido. Además, el polisacárido capsular provoca una
respuesta independiente de células T, es decir, sin producción de
IgG. Por consiguiente los antígenos de polisacáridos capsulares no
son adecuados como componentes de vacunas para la protección frente
a la infección por GBS.
Otros investigadores se han centrado en el
antígeno beta de proteína-C, que ha demostrado
presentar propiedades inmunogénicas en modelos de ratón y de
conejo. Se descubrió que esta proteína era inadecuada como vacuna
humana debido a la no deseable propiedad de interaccionar con una
alta afinidad y de un modo no inmunogénico con la región Fc del IgA
humano. El antígeno alfa de proteína-C es poco común
en los serotipos de tipo III de GBS, que es el serotipo responsable
de la mayoría de afecciones originadas por GBS y que, por tanto, es
de poca utilidad como componente de una vacuna.
Por tanto, sigue existiendo una necesidad no
satisfecha de antígenos de GBS que puedan ser usados como
componentes de vacuna para la profilaxis y/o la terapia de la
infección por GBS.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos una identidad del 70% con un segundo polipéptido
que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, o fragmentos de las mismas.
En otros aspectos, se proporcionan vectores que
comprenden polinucleótidos de la invención ligados operativamente a
una región de control de la expresión, así como células hospedantes
transfectadas con dichos vectores, y métodos para producción
polipéptidos que comprenden cultivar dichas células hospedantes en
las condiciones adecuadas para la expresión.
En otro aspecto adicional, se proporcionan
nuevos polipéptidos codificados por polinucleótidos de la
invención.
La Figura 1a (únicamente a modo de referencia)
es la secuencia de ADN del clon 1 (SEQ ID NO: 1) con las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los marcos de lectura
abiertos;
la Figura 1b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 2;
la Figura 1c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 3;
la Figura 1d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 4;
la Figura 1e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 5;
la Figura 1f es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 6.
La Figura 2a (únicamente a modo de referencia)
es la secuencia de ADN del clon 2 (SEQ ID NO: 7) con las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los marcos de lectura
abiertos;
la Figura 2b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 8;
la Figura 2c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 9;
la Figura 2d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 10;
la Figura 2e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 11;
la Figura 2f es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 12.
La Figura 3a (únicamente a modo de referencia)
es la secuencia de ADN del clon 3 (SEQ ID NO: 13) con las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los marcos de lectura
abiertos;
la Figura 3b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 14;
la Figura 3c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 15;
la Figura 3d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 16;
la Figura 3e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 17;
la Figura 3f es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 18;
la Figura 3g es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 19;
la Figura 3h es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 20;
la Figura 3i es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 21.
La Figura 4a (únicamente a modo de referencia)
es la secuencia de ADN del clon 4 (SEQ ID NO: 22) con las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los marcos de lectura
abiertos;
la Figura 4b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 23;
la Figura 4c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 24;
la Figura 4d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 25;
la Figura 4e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 26.
La Figura 5a (únicamente a modo de referencia)
es la secuencia de ADN del clon 5 (SEQ ID NO: 27) con las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los marcos de lectura
abiertos;
la Figura 5b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 28;
la Figura 5c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 29;
la Figura 5d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 30;
la Figura 5e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 31.
La Figura 6a (únicamente a modo de referencia)
es la secuencia de ADN del clon 6 (SEQ ID NO: 32) con las
correspondientes secuencias de aminoácidos de los marcos de lectura
abiertos;
la Figura 6b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 33;
la Figura 6c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 34;
la Figura 6d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 35;
la Figura 6e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 36.
La Figura 7a es la secuencia de ADN del clon 7
(SEQ ID NO: 37); (inventiva);
la Figura 7b es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 38;
la Figura 7c es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 39;
la Figura 7d es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 40;
la Figura 7e es la secuencia de aminoácidos SEQ
ID NO: 41.
La Figura 8 es la secuencia de ADN de una parte
del clon 7 que una secuencia señal (SEQ ID NO: 42); (inventiva).
La Figura 9 es la secuencia de ADN de una parte
del clon 7 sin secuencia señal (SEQ ID NO: 43); (inventiva).
La Figura 9a es la secuencia de aminoácidos (SEQ
ID NO: 44); (inventiva).
La Figura 10 representa la distribución de
títulos de ELISA anti-GBS en sueros procedentes de
ratones CD-1 inmunizados con proteína de GBS
recombinante correspondiente a la SEQ ID NO: 39. (inventiva).
La presente invención se refiere a nuevos
polipéptidos antigénicos de estreptococos del grupo B (GBS), que se
caracterizan por la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
que consiste en: SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44.
La invención incluye la SEQ ID NO: 39 y la SEQ
ID NO: 44.
Una realización preferida adicional de la
invención es la SEQ ID NO: 39.
Una realización preferida adicional de la
invención es la SEQ ID NO: 44.
Tal como se usan en la presente memoria,
"fragmentos" de los polipéptidos de la invención incluyen
aquellos polipéptidos en los que se sustituye uno o más residuos de
aminoácido con un residuo de aminoácido conservado o no conservado
(preferiblemente conservado) y que pueden ser naturales o no
naturales.
El término "fragmentos" de polipéptidos de
la presente invención también incluye polipéptidos que se modifican
mediante adición, eliminación, sustitución de aminoácidos, siempre
que los polipéptidos retengan la capacidad de inducir una respuesta
inmune.
Por el término "aminoácido conservado" se
entiende una sustitución de uno o más aminoácidos por otro en el
cual el determinante antigénico (incluyendo su estructura secundaria
y la naturaleza hidropática) de un antígeno dado se conserva
completa o parcialmente a pesar de la sustitución.
Por ejemplo, se puede sustituir uno o más
residuos de aminoácido de la secuencia con otro aminoácido de
polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, dando
como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos de un
aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar entre otros
miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo,
los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina,
isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.
Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos
cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e
histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen
ácido aspártico y ácido glutámico.
Preferiblemente, los derivados y análogos de
polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente un 70% de
identidad con respecto a las secuencias ilustradas en las figuras, o
a fragmentos de las mismas. Es decir, el 70% de los residuos son
los mismos. Más preferiblemente, los polipéptidos tendrán una
homología superior al 95%. En otra realización preferida, los
derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos
de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o eliminaciones
de residuos de aminoácido, y más preferiblemente menos de 10. Las
sustituciones preferidas son las que se conocen en la técnica como
conservadas, es decir, los residuos sustituidos comparten
propiedades físicas o químicas tales como la hidrofobicidad, el
tamaño, la carga o grupos funcionales.
Además, en las situaciones en las que se
descubre que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede
ser deseable variar uno o más aminoácidos en particular para imitar
de forma más eficaz los diferentes epítopos de las diferentes cepas
de GBS.
También se incluyen polipéptidos fusionados a
otros compuestos que alteran las propiedades biológicas y
farmacológicas de los polipéptidos, por ejemplo, polietilénglicol
(PEG) para aumentar la vida media; secuencias de aminoácidos
líderes o secretoras para facilitar la purificación; prepro- y
pro-secuencias; y (poli)sacáridos.
Además, los polipéptidos de la presente
invención se pueden modificar mediante acilación terminal de
-NH_{2} (por ejemplo mediante acetilación, o amidación con ácido
tioglicólico, amidación carbositerminal, por ejemplo con amoníaco o
metilamina) para proporcionar estabilidad, y aumentar la
hidrofobicidad para la unión a un soporte u a otra molécula.
También se contemplan los multímeros de hetero y
homo polipéptido de los fragmentos de polipéptido, análogos y
derivados. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más
polipéptidos que han sido reticulados con agentes reticulantes
tales como avidita/biotina, glutaraldehído o
dimetil-superimidato. Dichas formas poliméricas
también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias
contiguas invertidas o emparejadas, producidos a partir de mARNs
multicistrónicos generados mediante tecnología de ADN
recombinante.
Preferiblemente, un fragmento, análogo o
derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una
región antigénica, es decir, al menos un epítopo.
Con el fin de alcanzar la formación de polímeros
antigénicos (es decir, multímeros sintéticos), se pueden utilizar
polipéptidos que tengan grupos bishaloacetilo, nitroarilhaluros, o
similares, en donde los reactivos sean específicos para los grupos
tiol. Por tanto, el enlace entre dos grupos mercapto de los
diferentes péptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar
compuesto por un grupo de unión de al menos dos átomos de carbono,
típicamente de al menos cuatro, y no más de 16, pero normalmente no
más de aproximadamente 14.
En una realización concreta, los fragmentos de
polipéptido de la invención no contienen un residuo de metionina
(Met) de inicio. Preferiblemente, los polipéptidos no incorporarán
una secuencia líder o secretora (secuencia señal). La porción señal
de un polipéptido de la invención se puede determinar de acuerdo con
técnicas biológicas moleculares establecidas. En general, el
polipéptido de interés se puede aislar a partir de un cultivo de
GBS, y posteriormente puede
secuenciarse para determinar el residuo inicial de la proteína madura y, por tanto, la secuencia del polipéptido maduro.
secuenciarse para determinar el residuo inicial de la proteína madura y, por tanto, la secuencia del polipéptido maduro.
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
composiciones de vacuna que comprenden uno o más polipéptidos de
GBS de la invención mezclados con un vehículo, diluyente o adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
Los adyuvantes adecuados incluyen aceites, por
ejemplo adyuvante de Freund completo o incompleto; sales, por
ejemplo AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2},
AlNH_{4}(SO_{4})_{2},
Al(OH)_{3}, AlPO_{4}, sílice, caolín; derivado de
saponina; polinucleótidos de carbono, por ejemplo poli IC y poli AU
y también toxina del cólera detoxificada (CTB), y toxina de E.
coli térmicamente lábil para la inducción de inmunidad mucosal.
Los adyuvantes preferidos incluyen QuilA^{TM}, Alhydrogel^{TM} y
Adjuphos^{TM}. Las vacunas de la invención se pueden administrar
parenteralmente mediante inyección, infusión rápida, absorción
nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral.
Las composiciones de vacuna de la invención se
usan para el tratamiento o profilaxis de la infección por
estreptococos y/o de enfermedades y síntomas mediados por la
infección por estreptococos, en particular de estreptococos del
grupo A (pyogenes), de estreptococos del grupo B (GBS o
agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia, así como
Staphylococcus aureus. Se dispone de información general
sobre los estreptococos en el Manual of Clinical
Microbiology de P.R. Murria y col. (1995, 6ª Edición, ASM Press,
Washington, D.C.). Más concretamente, de los estreptococos del
grupo B, agalactiae. En una realización particular se
administran vacunas a individuos con riesgo de infección de GBS,
tales como mujeres embarazadas y niños para sepsis, meningitis y
neumonía, así como individuos inmunocomprometidos tales como los
que padecen diabetes, enfermedades del hígado o cáncer. Las vacunas
también pueden tener aplicaciones veterinarias tales como para el
tratamiento de la mastitis en ganado, que está mediada por las
anteriores bacterias, así como por E. coli.
La vacuna de la presente invención también se
puede usar para la fabricación de un medicamento usado para el
tratamiento o profilaxis de la infección de estreptococos y/o de
enfermedades o síntomas mediados por la infección de estreptococos,
en particular de estreptococos del grupo A (pyogenes), de
estreptococos del grupo B (GBS o agalactiae),
dysgalactiae, uberis, nocardia, así como Staphylococcus
aureus. Más particularmente estreptococos del grupo B,
agalactiae.
Las composiciones de vacuna se encuentran
preferiblemente en formas unitarias de dosis de entre
aproximadamente 0,001 y 100 \mug/Kg (antígeno/peso corporal) y
más preferiblemente de 0,01 a 10 \mug/Kg, y aún más
preferiblemente de 0,1 a 1 \mug/Kg de 1 a 3 veces con un
intervalo de aproximadamente 1 a 12 semanas entre inmunizaciones, y
más preferiblemente de 1 a 6 semanas.
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
polinucleótidos que codifican polipéptidos de estreptococos del
grupo B (GBS) que se caracterizan por la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 39, y SEQ ID NO:
44, o fragmentos de las mismas.
Los polinucleótidos preferidos son los
ilustrados en las Figuras 7a (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) y 9
(SEQ ID NO: 43) que corresponden a marcos de lectura abiertos, que
codifican polipéptidos de la invención.
Los polinucleótidos preferidos son los
ilustrados en las Figuras 7a (SEQ ID NO: 37), 8 (SEQ ID NO: 42) y 9
(SEQ ID NO: 43), y fragmentos de los mismos.
Los polinucleótidos más preferidos de la
invención son los ilustrados en las Figuras 7 (SEQ ID NO: 37), 8
(SEQ ID NO: 42) y 9 (SEQ ID NO: 43).
Los polinucleótidos aún más preferidos de la
invención son los ilustrados en las Figuras 8 (SEQ ID NO: 42) y 9
(SEQ ID NO: 43).
Cabe destacar que las secuencias de
polinucleótidos ilustradas en las figuras pueden alterarse con
codones degenerados y aún así seguir codificando los polipéptidos
de la invención.
Debido a la degeneración de las secuencias
codificadoras de nucleótidos, en la práctica de la invención pueden
usarse otras secuencias de polinucleótidos que codifiquen
sustancialmente los mismos polipéptidos de la presente invención.
Éstas incluyen, aunque sin limitación, secuencias de nucleótidos que
son alteradas por la sustitución de diferentes codones que
codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia,
produciendo de este modo un cambio silencioso.
En consecuencia, la presente invención
proporciona adicionalmente polinucleótidos que se hibridan con las
secuencias de polinucleótidos descritas en la presente memoria (o
con las secuencias complementarias de las mismas) que tengan al
menos un 70% de identidad entre secuencias. Más preferiblemente, los
polinucleótidos son hibridables en condiciones severas, por ejemplo
que tengan un 95% de identidad y más preferiblemente más de un 97%
de identidad.
Por "capaces de hibridarse en condiciones
severas" se entiende templar una molécula de ácido nucleico a al
menos una región de una segunda secuencia de ácido nucleico (como
cADN, mARN ó ADN genómico) o a su cadena complementaria en
condiciones estándar, por ejemplo alta temperatura y/o bajo
contenido salino, que tiende a desfavorecer la hibridación de
secuencias de nucleótidos no complementarias. Se describe un
protocolo adecuado en Maniatis T. y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, que se
incorpora a la presente memoria a modo de referencia.
En un aspecto adicional, se pueden usar
polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención, o
fragmentos de los mismos, en un método de inmunización de ADN. Es
decir, se pueden incorporar en un vector que es replicable y
expresable mediante inyección, produciendo con ello el polipéptido
antigénico in vivo. Por ejemplo, se pueden incorporar
polinucleótidos en un vector plásmido bajo el control del promotor
CMV que es funcional en células eucarióticas. Preferiblemente el
vector se inyecta intramuscularmente.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un
proceso para la producción de polipéptidos de la invención mediante
técnicas recombinantes a través de la expresión de un polinucleótido
que codifica dicho polipéptido en una célula hospedante, y
recuperando el polipéptido producto. De forma alternativa, los
polipéptidos se pueden producir de acuerdo con técnicas químicas
sintéticas establecidas, por ejemplo, síntesis de oligopéptidos en
fase sólida o en disolución, que son ligados para producir el
polipéptido completo (ligadura en bloque).
Para la producción recombinante, se transfectan
células hospedantes con vectores que codifican el polipéptido, y a
continuación se cultivan en un medio nutriente modificado de forma
apropiada para activar promotores, seleccionando transformantes o
amplificando los genes. Los vectores adecuados son aquellos que son
viables y replicables en el hospedante elegido e incluyen
secuencias de ADN cromosomales, no cromosomales y sintéticas, por
ejemplo, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos
de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN
de fago. La secuencia de polipéptidos se puede incorporar al vector
en una posición apropiada usando enzimas de restricción, de tal
forma que se une operativamente a una región de control de la
expresión que comprende un promotor, una posición de unión de
ribosomas (región de consenso o secuencia de
Shine-Dalgarno), y opcionalmente un operador
(elemento de control). Uno puede seleccionar componentes
individuales de la región de control de la expresión que sean
apropiados para un hospedante y un vector dados de acuerdo con
principios establecidos de biología molecular (Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor, N.Y., 1989, incorporado a la presente memoria a modo
de referencia). Los promotores adecuados incluyen, aunque sin
limitación, el promotor LTR ó SV40, los promotores lac, tac ó trp de
E. coli y el promotor P_{L} lambda de fago.
Preferiblemente los vectores incorporarán un origen de replicación
así como marcadores de selección, por ejemplo gen de resistencia a
ampicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70,
pQE60, pQE-9, pbs, pD10 phagescript, psiX174,
pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, y
los vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWL-NEO,
pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células
hospedantes pueden ser bacterianas, por ejemplo E. coli, Bacillus
subtilis, Streptomyces; fúngicas, por ejemplo
Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; de
levaduras, por ejemplo Saccharomyces; o eucarióticas, por
ejemplo CHO, COS.
En la expresión del polipéptido en cultivo, las
células se recolectan normalmente mediante centrifugación, a
continuación se rompen empleando medios físicos o químicos (si el
polipéptido expresado no es segregado al medio) y el extracto crudo
resultante se retiene para aislar el polipéptido de interés. La
purificación del polipéptido a partir del medio de cultivo o lisato
se puede lograr empleando técnicas establecidas que dependen de las
propiedades del polipéptido, por ejemplo, usando precipitación en
sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de
intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de
hidroxilapatita y cromatografía de lectina. La purificación final se
puede lograr empleando HPLC.
El polipéptido se puede expresar con o sin una
secuencia líder o de secreción. En el primer caso el líder se puede
eliminar usando procesado post-traducción (véanse
los documentos US 4.431.739, 4.425.437 y 4.338.397) o pueden ser
eliminados químicamente después de purificar el polipéptido
expresado.
De acuerdo con un aspecto adicional, los
polipéptidos de GBS de la invención se pueden usar en un ensayo
diagnóstico para la infección de estreptococos, en concreto la
infección de GBS. Es posible utilizar varios métodos diagnósticos,
por ejemplo la detección de un organismo estreptococal en una
muestra biológica. Se puede seguir el siguiente procedimiento:
- a)
- obtener una muestra biológica de un paciente;
- b)
- incubar un anticuerpo o fragmento del mismo que sea reactivo con un polipéptido de GBS de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y
- c)
- detectar anticuerpos unidos específicamente o fragmentos unidos en la mezcla, lo que indica la presencia de estreptococos.
De forma alternativa, se puede llevar a cabo un
método para la detección de anticuerpos específicos de un antígeno
de estreptococos en una muestra biológica que contiene, o que se
sospecha que contiene, dicho anticuerpo de la siguiente manera:
- a)
- aislar una muestra biológica de un paciente;
- b)
- incubar uno o más polipéptidos de GBS de la invención, o fragmentos de los mismos, con la muestra biológica para formar una mezcla; y
- c)
- detectar antígenos unidos específicamente o fragmentos unidos en la mezcla, lo que indica la presencia de anticuerpos específicos de estreptococos.
El especialista en la técnica reconocerá que
este ensayo diagnóstico puede presentarse en diversas formas, que
incluyen un ensayo inmunológico tal como el ensayo inmunosorbente
ligado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de
aglutinación de látex, esencialmente para determinar si los
anticuerpos específicos de la proteína están presentes en un
organismo.
Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos
de la invención también pueden usarse para diseñar sondas de ADN
para su uso en la detección de la presencia de estreptococos en una
muestra biológica que se sospecha contiene dichas bacterias. El
método de detección de la invención comprende:
- a)
- aislar la muestra biológica de un paciente;
- b)
- incubar una o más sondas de ADN que presenten una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y
- c)
- detectar la sonda de ADN unida específicamente en la mezcla, lo que indica la presencia de bacterias estreptococales.
Las sondas de ADN de esta invención también
pueden usarse para detectar estreptococos circulantes, por ejemplo
ácidos nucleicos de GBS en una muestra, por ejemplo usando una
reacción en cadena de polimerasa, como un método para diagnosticar
infecciones de estreptococos. La sonda se puede sintetizar usando
técnicas convencionales y puede inmovilizarse sobre una fase
sólida, o puede etiquetarse con una marca detectable. Una sonda de
ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una
secuencia complementaria a al menos 6 nucleótidos contiguos de los
polipéptidos de GBS de la invención.
Otro método diagnóstico para la detección de
estreptococos es un paciente comprende:
- a)
- etiquetar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención o un fragmento del mismo con una marca detectable;
- b)
- administrar el anticuerpo marcado o el fragmento marcado al paciente; y
- c)
- detectar anticuerpos marcados o fragmentos marcados unidos específicamente en el paciente, lo que indica la presencia de estreptococos.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de polipéptidos de GBS de la invención como inmunógenos para la
producción de anticuerpos específicos para la diagnosis, y en
concreto para el tratamiento de la infección de estreptococos. Los
anticuerpos adecuados se pueden determinar usando métodos de
escrutinio apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un
anticuerpo concreto para proteger pasivamente frente a infección de
estreptococos en un modelo de ensayo. Un ejemplo de un modelo animal
es el modelo de ratón descrito en los Ejemplos de la presente
memoria. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un fragmento
de unión a antígeno del mismo, y puede pertenecer en general a
cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede
ser de origen animal, específicamente de origen mamífero y más
específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un
anticuerpo natural o un fragmento del mismo, o si se desea, un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. El término
anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produjo usando técnicas
de biología molecular. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo
puede ser policlonal, o preferiblemente monoclonal. Puede ser
específico de una serie de epítopos asociados con los polipéptidos
de GBS, pero preferiblemente es específico de uno solo.
El modelo de ratón de infección de GBS se
describe con detalle en Lancefield y col. (J Exp Med 142:
165-179, 1975). La cepa de GBS C388/90 (producto
clínico aislado obtenido en 1990 a partir de fluido cefalorraquídeo
de un paciente que sufría meningitis, Hospital Infantil de Eastern
Notario, Ottawa, Canadá) y la cepa NCS246 (Nacional Center for
Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern
Alberta, Edmonton, Canadá) fueron serotipadas respectivamente como
el tipo Ia/c y el tipo II/R.
Para aumentar su virulencia, se sometió en serie
a ratones a las cepas de GBS C388/90 (serotipo Ia/c) y NCS246
(serotipo II/R) tal como se ha descrito previamente (Lancefield y
col., J. Exp. Med. 142: 165-179, 1975). En resumen,
se siguió la evolución del aumento de la virulencia usando
inoculaciones intraperitoneales de diluciones en serie de un
subcultivo en caldo de Todd-Hewitt obtenido a partir
de sangre o de bazo de ratones infectados. Tras la última
exposición, las muestras de sangre infectadas se usaron para
inocular caldo de Todd-Hewitt. Tras una incubación
de 2 horas a 37ºC con un 7% de CO_{2}, se añadió al cultivo
glicerol con una concentración final del 10% (v/v). A continuación
se dividió en alícuotas el cultivo y se almacenó a -80ºC para su
uso en los experimentos de exposición a GBS. Se determinó el número
de cfu de GBS presentes en estas muestras congeladas. Se determinó
que las concentraciones bacterianas necesarias para matar al 100%
(LD100) de los ratones de 18 semanas de edad eran de 3,5 x
10^{5} y de 1,1 x 10^{5} respectivamente para las cepas de GBS
C388/90 y NCS246, que corresponden a un aumento significativo de la
virulencia para ambas cepas. De hecho, las LD100 registradas antes
de las exposiciones para estas dos cepas eran superiores a 10^{9}
cfu.
En una exposición bacteriana, se ajustó una
alícuota recién congelada de una cepa virulenta de GBS a la
concentración bacteriana apropiada usando caldo de
Todd-Hewitt, y se inyectó 1 mL intraperitonealmente
a cada ratón CD-1 hembra. Los ratones usados para
los experimentos de protección pasiva tenían una edad de 6 a 8
semanas, mientras que los usados para los experimentos de
protección activa tenían una edad de aproximadamente 18 semanas en
el momento de la exposición. Todos los inóculos fueron verificados
mediante conteo de colonias. Se observó a los animales en busca de
cualquier signo de infección cuatro veces al día durante las
primeras 48 horas después de la exposición, y a continuación a
diario durante los siguientes 12 días. Al final de dicho periodo,
se obtuvieron muestras de sangre de los supervivientes y se
congelaron a -20ºC. El bazo obtenido de cada ratón que sobrevivió a
la exposición se cultivó con el objetivo de identificar cualquier
GBS remanente.
Se prepararon células enteras de GBS muertas por
formaldehído de acuerdo con los procedimientos descritos en
Lancefield y col. (J. Exp. Med. 142: 165-179, 1975).
En resumen, se lavó un cultivo de una noche de placas de agar de
sangre de oveja (Quelab Laboratorios, Montreal, Canadá) de una cepa
de GBS dos veces en tampón PBS (disolución salina de fosfato
tamponada, pH 7,2), se ajustó a aproximadamente 3 x 10^{9} cfu/mL
y se incubó toda la noche en PBS que contenía formaldehído al 0,3%
(v/v). La suspensión muerta por formaldehído se lavó con PBS y se
mantuvo congelada a -80ºC.
Se inyectó subcutáneamente ratones
CD-1 hembra, con una edad de 6 a 8 semanas (Charles
River, St-Constant, Québec, Canadá), tres veces con
un intervalo de dos semanas, con 0,1 mL de células muertas por
formaldehído de la cepa de GBS C388/90 (aproximadamente 6 x
10^{7} GBS), o con 0,1 mL de PBS para el grupo de control. El día
antes de la inmunización, se añadió a estas preparaciones
Alhydrogel^{TM} (Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca)
con una concentración final de 0,14 mg ó de 0,21 mg de Al, y se
incubó una noche a 4ºC con agitación. Se obtuvieron muestras de
suero de cada ratón antes de comenzar el protocolo de inmunización y
dos semanas después de la última inyección. Los sueros se
congelaron a -20ºC.
Ocho ratones de cada grupo de control inyectados
con PBS y del grupo inmunizado con células de GBS de la cepa
C388/90 (Ia/c) enteras muertas por formaldehído, fueron expuestos a
1,5 x 10^{4} cfu de la cepa de GBS C388/90 (Ia/c) una semana
después de la tercera inyección. Todos los ratones inmunizados con
las células enteras de GBS muertas por formaldehído sobrevivieron a
la exposición homóloga, mientras que, a los 5 días tras la
exposición, sólo 4 de cada 8 ratones inyectados con PBS
sobrevivieron a la infección. Con el fin de aumentar la tasa de
mortalidad en los grupos de control, la suspensión bacteriana se
tuvo que ajustar de acuerdo con la edad de los ratones en el
momento de la exposición bacteriana. En los experimentos de
exposición posteriores, cuando los ratones tenían más de 15 semanas
de edad, el inóculo bacteriano fue incrementado hasta
concentraciones entre 3,0 x 10^{5} y 2,5 x 10^{6} cfu.
En otro experimento, se inyectó PBS a un grupo
de 12 ratones correspondiente a un grupo de control, mientras que
un segundo grupo de 12 ratones fue inmunizado con células de GBS
enteras muertas por formaldehído de la cepa C388/90 (Ia/c). Seis
ratones de cada uno de estos dos grupos fueron expuestos a 2,1 x
10^{6} cfu de la cepa de GBS C388/90 (Ia/c) (Tabla 1). Como
primer experimento de exposición, todos los ratones inmunizados con
la cepa de GBS C388/90 (Ia/c) sobrevivieron a la exposición
homóloga. Solamente dos de cada 6 ratones inyectados con PBS
sobrevivieron a la infección.
Los restantes 6 ratones de ambos grupos fueron
usados a continuación una semana después para verificar si dicha
preparación antigénica podía conferir protección cruzada frente a la
cepa NCS246 (II/R), que produce una cápsula serológicamente
distinta. Ninguno de los ratones infectados con esta segunda cepa de
GBS sobrevivió a la infección. Este último resultado sugirió que la
mayoría de la respuesta inmune protectora inducida por la cepa
C388/90 muerta por formaldehído se dirige contra el polisacárido
capsular, y que podría estar restringida a cepas de dicho serotipo
en particular. Estos resultados indicaron claramente que este modelo
concreto de infección se puede usar de forma eficaz para estudiar
la protección conferida a través de vacunación.
Se inmunizó un conejo de Nueva Zelanda (2,5 Kg,
Charles River, St-Constant, Québec, Canadá) con
células de GBS de cepa C388/90 (Ia/c) muertas por formaldehído para
obtener suero hiperinmune. Dicho conejo fue inyectado
subcutáneamente tres veces, con un intervalo de tres semanas, con
aproximadamente 1,5 x 10^{9} cfu de células enteras muertas por
formaldehído de GBS cepa C388/90 (Ia/c). Se usó adyuvante completo
de Freund (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, Nueva York)
como adyuvante para la primera inmunización, y se usó adyuvante
incompleto de Freund (Gibco BRL) para las siguientes dos
inyecciones. Se obtuvieron muestras de suero antes de comenzar el
protocolo de inmunización y dos semanas después de la última
inyección. Los sueros se congelaron a -20ºC.
También se evaluó la capacidad de este
particular suero hiperinmune de conejo para proteger pasivamente
ratones frente a infección letal con GBS. La inyección
intraperitoneal de los ratones con 15 ó 25 \muL de suero
hiperinmune de conejo 18 horas antes de la exposición protegió a 4
de cada 5 ratones (80%) frente a la infección. De forma
comparativa, para los ratones del grupo de control, inyectados con
PBS o con suero obtenido a partir de conejo inmunizado con una
preparación de membrana exterior meningococal, se registraron tasas
de supervivencia inferiores al 20%. Este resultado indica
claramente que la inmunización de otra especie animal con células
de GBS muertas puede inducir la producción de anticuerpos que pueden
proteger pasivamente a ratones. Este reactivo también se usará para
caracterizar clones.
Se amplificó la región codificadora de un gen de
GBS mediante PCR (Sistema DNA Termal Cycler GeneAmp PCR 2400 Perkin
Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de la cepa de GBS
C388/90 (Ia/c) usando los oligos que contenían las extensiones de
base correspondientes a la adición de las posiciones de restricción
BgIII (AGATCT) y HindIII (AAGCTT), respectivamente. El producto de
PCR se purificó en gel de agarosa usando un kit de extracción de
gel Qiaex II de Qiagen (Chatsworth, CA), se digirió con las enzimas
de restricción BgIII y HindIII (Pharmacia Canada Inc. Baie d'Urfe,
Canadá), y se extrajo con fenol:cloroformo antes de ser precipitado
en etanol. El vector pET-32b(+) (Novagen, Madison,
WI) que contiene la secuencia tiorredoxin-His.Tag se
digirió con las enzimas de restricción BgIII y HindIII, se extrajo
con fenol:cloroformo, y a continuación se precipitó en etanol. El
fragmento de ADN genómico BgIII-HindIII se ligó al
vector BgIII-HindIII pET-32b(+) para
crear la secuencia codificadora correspondiente a la proteína de
fusión tiorredoxin-His.Tag-GBS, cuyo
gen estaba bajo el control del promotor T7. Los productos ligados se
transformaron en la cepa de E. coli XLI Blue MRF'
(\Delta(mcrA) 183\Delta
(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1
supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1
lac [F' proAB lacI^{q}Z\DeltaM15Tn10
(Tet^{r})]^{c}) (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con el
método de Simanis (Hanahan, D., DNA Cloning, 1985, D.M.
Glover (ed.), páginas 109-135). El plásmido pET
recombinante se purificó usando un kit de Qiagen (Qiagen,
Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos del injerto de ADN se
verificó mediante secuenciamiento de ADN (kit Taq Dye Deoxy
Terminador Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). El plásmido pET
recombinante fue transformado mediante electroporación (aparato
Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá)
en la cepa de E. coli AD494 (DE3)
(\Deltaara^{-}leu7697 \DeltalacX74
\DeltaphoA PvuII phoR \DeltamaIF3
F' [lac^{+} (lacI^{q}) pro]
trxB::Kan (DE3)) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de
E. coli, el promotor T7 que controla la expresión de la
proteína de fusión, es reconocido específicamente por la polimerasa
de ARN T7 (presente en el profago \lambdaDE3), cuyo gen se
encuentra bajo el control del promotor lac que es inducible
mediante
isopropil-\beta-D-tio-galactopiranósido
(IPTG).
El transformante AD494(DE3)/rpET se
cultivó a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10 g/L,
extracto de levadura 5 g/L, NaCl 10 g/L) que contiene 100 \mug de
ampicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville,
Canadá) por mL hasta que la A_{600} alcanzó un valor de 0,6. Con
el fin de inducir la producción de la proteína de fusión
tiorredoxin-His.Tag-GBS, las células
se incubaron otras 2 horas más en presencia de IPTG con una
concentración final de 1 mM. Las células bacterianas se recogieron
por centrifugación.
La proteína de fusión recombinante producida por
AD494(DE3)/rpET32 tras inducción con IPTG durante 2 h se
obtuvo parcialmente como cuerpos de inclusión insolubles que fueron
purificados a partir de las proteínas de E. coli endógenas
mediante aislamiento de los agregados insolubles (Gerlach, G.F., y
col., 1992, Infect. Immun. 60: 892). Las células inducidas a partir
de un cultivo de 500 mL se resuspendieron en 20 mL de tampón
Tris-HCl 50 mM con un 25% de sacarosa (pH 8,0) y se
congelaron a -70ºC. La lisis de las células en suspensión congelada
se logró mediante la adición de 5 mL de una disolución de lisozima
(10 mg/mL) en tampón Tris-HCl 250 mM (pH 8,0)
seguida de una incubación de 10 a 15 minutos en hielo, y de la
adición de 150 mL de mezcla detergente (5 partes de tampón
Tris-HCl 20 mM (pH 7,4)-NaCl 300
mM-ácido desoxicólico al 2%-Nonidet P-40 al 2% y 4
partes de tampón Tris-HCl 100 mM (pH
8)-EDTA 50 mM-Triton
X-100 al 2%) seguida de una incubación de 5 minutos
en hielo. Después de ser sometido a sonicación, se recogieron los
agregados proteicos mediante centrifugación durante 30 minutos a
35.000 x g, y se mantuvo una muestra de la fracción celular soluble.
Las proteínas agregadas fueron solubilizadas en hidrocloruro de
guanidina 6 M. El análisis Western blot demostró la presencia de la
proteína de fusión en las fracciones soluble e insoluble a la vez,
realizado usando el suero de un ratón inyectado con células de GBS
cepa C388/90 (Ia/c) muertas por formaldehído que sobrevivió a la
exposición bacteriana con la correspondiente cepa de GBS.
La purificación de la proteína de fusión a
partir de la fracción soluble de AD494(DE3)/rpET inducida por
IPTG se realizó mediante cromatografía de afinidad basada en las
propiedades de la secuencia His.Tag (6 residuos de histidina
consecutivos) para ligarse a cationes divalentes (Ni^{2+})
inmovilizados sobre resina de quelación metálica His.Bind (Novagen,
Madison, WI). Los métodos de purificación usados son los descritos
en el Manual del sistema pET, 6ª Edición (Novagen, Madison, WI). En
resumen, las células paletizadas obtenidas de un cultivo de 100 mL
inducido con IPTG se resuspendieron en 4 mL de tampón de Unión
(imidazol 5 mM-NaCl 500
mM-Tris-HCl 20 mM, pH 7,9), se
sometieron a sonicación, y se giraron a 39.000 x g durante 20
minutos para eliminar los desechos. Se filtró el sobrenadante
(membrana con un tamaño de poro de 0,45 \mum) y se depositó en una
columna de resina His.Bind equilibrada en tampón de unión. A
continuación se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de
tampón de unión seguidos de 6 volúmenes de columna de tampón de
lavado (imidazol 20 mM-NaCl 500
mM-Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). La
eliminación de la sal y del imidazol de la muestra se realizó
mediante diálisis frente a 3 x 1 litro de PBS a 4ºC.
Las cantidades de proteína de fusión obtenidas
de las fracciones citoplásmicas soluble e insoluble de E.
coli se estimaron mediante tinción de Coomassie de un gel de
dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida con
diluciones en serie de dichas proteínas, y con un patrón de
albúmina de suero bovino (Pierce Chemical Co., Rockford, I11).
Se insertó la región de codificación de ADN de
una proteína de GBS por debajo del promotor \lambdaP_{L} en el
vector de traducción pURV22. Este plásmido fue derivado de p629
(George y col., 1987, Bio/Technology 5: 600), del cual se eliminó
la región codificadora de una porción de la glicoproteína
(gD-1) de virus simple del herpes de tipo I
(HSV-I), y se sustituyó el gen de resistencia a la
ampicilina por una casete de canamicina obtenida del vector
plásmido pUC4K (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canadá).
El vector contenía una casete del gen represor sensible a la
temperatura \lambda cI857 bacteriófago, en el cual se había
eliminado el promotor funcional P_{R}. La desactivación del
represor cI857 mediante un aumento de la temperatura desde los
intervalos 30-37ºC hasta 37-42ºC dio
como resultado la inducción del gen bajo el control de \lambda
P_{L}. La traducción del gen se controló mediante la posición de
unión de ribosomas cro, seguida por debajo de una posición de
restricción BgIII (AGATCT) y la ATG: ACTAAGGAGGTTAGATCTATG.
Se usaron enzimas de restricción y ligasa de ADN
T4 de acuerdo con los suministradores (Pharmacia Biotech Canada
Inc., Baie D'Urfe, Canadá; y New England Biolabs Ltd., Mississauga,
Canadá). Se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa de
los fragmentos de ADN tal como se describe en Sambrook y col.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, N.Y.). Se preparó el AND de las bacterias
GBS de acuerdo con procedimientos descritos en Jayarao y col.
(J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 2774). Se realizaron
reacciones de amplificación de ADN mediante reacción en cadena de
polimerasa (PCR) usando el Sistema DNA Termal Cycler GeneAmp PCR
2400 (Perkin Elmer, San Jose, CA). Los plásmidos usados para el
secuenciamiento de ADN se purificaron usando kits de plásmidos de
Qiagen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN fueron purificados en
geles de agarosa usando kits de extracción de gel Qiaex II de
Qiagen (Chatsworth, CA). Las transformaciones de plásmidos se
llevaron a cabo mediante el método descrito por Hanahan (DNA
Cloning, Glover (ed.), páginas 109-135, 1985).
El secuenciamiento de injertos de ADN genómico en plásmidos se
realizó usando oligonucleótidos sintéticos que fueron sintetizados
mediante el sintetizador de oligonucleótidos modelo 394
(Perkin-Elmer Corp., Applied Biosystems Div. (ABI),
Foster City, CA). Las reacciones de secuenciamiento se llevaron a
cabo mediante PCR, usando el kit Taq Dye Deoxy Terminador Cycle
Sequencing (ABI, Foster City, CA), y se realizó electroforesis de
ADN en un secuenciador de ADN automatizado 373A (ABI, Foster City,
CA). El montaje de la secuencia de ADN se realizó usando el
programa Sequencer 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). El
análisis de las secuencias de ADN y de sus polipéptidos predichos
se realizó con el programa Gene Works versión 2.45 (Intelligenetics,
Inc., Mountain View, CA).
La región codificadora del gen de GBS se
amplificó mediante PCR de ADN genómico de la cepa de GBS C388/90
(Ia/c) usando oligos que contenían extensiones base para la adición
de posiciones de restricción BgIII (AGATCT) y XbaI (TCTAGA),
respectivamente. El producto de PCR se purificó en gel de agarosa
usando un kit de extracción de gel Qiaex II de Qiagen (Chatsworth,
CA), se digirió con las enzimas de restricción BgIII y XbaI, y se
extrajo con fenol:cloroformo antes de ser precipitado en etanol. El
vector pURV22 se digirió con las enzimas de restricción BgIII y
XbaI, se extrajo con fenol:cloroformo, y se precipitó en etanol. El
fragmento de ADN genómico BgIII-XbaI se ligó al
vector BgIII-XbaI pURV22, en el cual el gen de GBS
estaba bajo el control del promotor \lambdaP_{L}. Los productos
ligados se transformaron en la cepa de E. coli XLI Blue MRF'
(\Delta(mcrA) 183\Delta
(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1
supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1
lac [F' proAB lacI^{q}Z\DeltaM15Tn10
(Tet^{r})]^{c}) (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con los
métodos descritos en Hanahan (ver anteriormente). Los transformantes
que alojan plásmidos con el injerto fueron identificados mediante
el análisis de células lisadas sometido a electroforesis sobre gel
de agarosa (Sambrook y col., ver anteriormente). El plásmido pURV22
recombinante fue purificado usando un kit Qiagen (Qiagen,
Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos del injerto de ADN se
verificó mediante secuenciamiento de ADN.
El transformante XLI Blue MRF'/rpURV22 se
cultivó a 34ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB que contenía 50
\mug de canamicina por mL hasta que la A_{600} alcanzó un valor
de 0,6. Con el fin de inducir la producción de la proteína de
fusión, las células fueron incubadas durante otras 4 horas más a
39ºC. Las células bacterianas se recogieron mediante
centrifugación, se resuspendieron en un tampón de muestra, se
hirvieron durante 10 minutos y se mantuvieron a -20ºC.
Se insertó la región codificadora de ADN de una
proteína en fase por debajo del gen de la hormona de crecimiento
humana (hGH), que estaba bajo el control transcripcional del
promotor de citomegalovirus (CMV) en el vector plásmido
pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992, 356:
152). El promotor CMV no es funcional en células de E. coli
pero es activo cuando se administra el plásmido en células
eucarióticas. El vector también incorporaba el gen de resistencia a
ampicilina.
La región codificadora del gen se amplificó
mediante PCR a partir de ADN genómico de la cepa C388/90 (Ia/c) de
GBS usando los oligos que contenían extensiones base para la adición
de las posiciones de restricción BgIII (AGATCT) y HindIII (AAGCTT).
El producto de la PCR se purificó en gel de agarosa usando el kit de
extracción de gel Qiaex II de Qiagen (Chatsworth, CA), se digirió
con las enzimas de restricción BgIII y HindIII, y se extrajo con
fenol:cloroformo antes de precipitarse con etanol. El vector
pCMV-GH (Laboratorio del Dr. Stephen A. Johnston,
Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas),
que contiene hormona de crecimiento humana para crear proteínas de
fusión, se digirió con las enzimas de restricción BamHI y HindIII,
se extrajo con fenol:cloroformo, y se precipitó con etanol. El
fragmento de ADN genómico de 1,3 Kb BgIII-HindIII se
ligó al vector BamHI-HindIII
pCMV-GH para crear la proteína de fusión
hGH-GBS bajo el control del promotor CMV. Los
productos ligados fueron transformados en la cepa de E. coli
DH5\alpha[\phi80 lacZ \DeltaM15 endA1
recA1 hsdR17 (^{r}K^{-m}K^{+}) supE44
thi-1\lambda^{-} gyrA96 relA1 \Delta
(lacZYA-argF) U169] (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) de acuerdo con los métodos descritos por Hanahan
(ver anteriormente). Los transformantes que albergan plásmidos con
el injerto fueron identificados mediante análisis de células lisadas
sometidas a electroforesis sobre gel de agarosa (Sambrook, J. y
col., ver anterior). El plásmido pCMV recombinante fue purificado
usando un kit Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y la secuencia de
nucleótidos del injerto de ADN se verificó mediante secuenciamiento
de ADN.
Se inyectó subcutáneamente a cuatro grupos de 12
ratones CD-1 hembra (Charles River,
St-Constant, Québec, Canadá), de 6 a 8 semanas de
edad, tres veces a intervalos de tres semanas con 0,1 mL de las
siguientes preparaciones antigénicas: células de cepa C388/90 de
GBS muertas por formaldehído (aproximadamente 6 x 10^{7} cfu), 20
\mug de la proteína de fusión, purificada por afinidad (columna de
níquel), a partir de la fracción citoplásmica soluble de E.
coli, ó 20 \mug de polipéptido de control
tiorredoxin-His.Tag purificado por afinidad (columna
de níquel). Como adyuvante, se añadieron 20 \mug de QuilA^{TM}
(Cedarlane Laboratorios Ltd., Hornby, Canadá) a cada preparación
antigénica. Se extrajeron muestras de suero de cada ratón antes de
la inmunización (PB) y en los días 20 (TB1), 41 (TB2) y 54 (TB3)
durante los protocolos de inmunización. Los sueros se congelaron a
-20ºC.
Se registró un aumento en los títulos de ELISA
después de cada inyección de la proteína de fusión, lo que indica
una buena respuesta primaria y un aumento brusco de la respuesta
inmune humoral después de la segunda y de la tercera
administración. Al final del periodo de inmunización, el valor medio
de los títulos de ELISA recíprocos fue de 456.145 para el grupo
inmunizado con 20 \mug de proteína de fusión obtenida de cuerpos
de inclusión, en comparación a 290.133 correspondiente al grupo de
ratones inmunizados con la proteína procedente de la fracción
soluble de E. coli. Este último resultado sugiere que la
proteína obtenida a partir de cuerpos de inclusión podría ser más
inmunogénica que la proteína soluble. El análisis de sueros de
ratones en ELISA usando la tiorredoxin-His.Tag
purificada por afinidad para cubrir placas demostró que se obtienen
títulos despreciables frente a la porción de
tiorredoxin-His.Tag de la proteína de fusión. La
reactividad de los sueros de ratones inyectados con la proteína de
fusión recombinante también fue evaluada mediante ELISA frente a
células enteras muertas por formaldehído de GBS de cepa C388/90. Los
anticuerpos inducidos por inmunización con proteína de fusión
recombinante también reconocieron sus epítopos específicos sobre
células de GBS, lo que indica que su conformación está
suficientemente próxima a la de la proteína estreptococal nativa
para inducir anticuerpos reactivos.
Para verificar si la respuesta inmune inducida
por la inmunización podría proteger frente a una infección de GBS,
se expuso a los ratones a 3,5 x 10^{5} cfu de GBS de la cepa
C388/90 (Ia/c) y 1,2 x 10^{5} cfu de GBS de la cepa NCS246
(II/R), cuyos resultados se muestran en las tablas 3 y 4,
respectivamente. Los ratones inmunizados con péptido de
tiorredoxin-His.Tag de control no fueron protegidos
frente a la exposición a cualquiera de las cepas de GBS, mientras
que los inmunizados con células enteras muertas por formaldehído de
cepa C388/90 sólo proporcionaron protección frente a la exposición
homóloga. La proteína de fusión
tiorredoxin-His.Tag-GBS de la
invención protegió a los ratones frente a la exposición con ambas
cepas de GBS. Los cultivos de sangre y de bazo de estos ratones no
revelaron presencia alguna de GBS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra la protección de ratones
contra infección fatal de GBS mediante inmunización con la proteína
recombinante correspondiente a la SEQ ID NO: 39.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones
CD-1 hembra (Charles River) subcutáneamente tres
veces con intervalos de tres semanas con 20 \mug de proteína
recombinante purificada a partir de la cepa de E. coli BLR
(Novagen), que aloja el vector plásmido pURV22 recombinante que
contiene el gen de GBS correspondiente a la SEQ ID NO: 42, en
presencia de 20 \mug de adyuvante QuilA^{TM} (Cedarlane
Laboratorios Ltd, Hornby, Canadá) o, a modo de control, solo con
adyuvante QuilA^{TM} en PBS. Se tomaron muestras de sangre del
seno orbital en los días 1, 22 y 43 antes de cada inmunización, y
catorce días (día 57) después de la tercera inyección. Una semana
después, se expusieron los ratones a aproximadamente entre 10^{4}
y 10^{5} cfu de diversas cepas virulentas de GBS. Las muestras
del inóculo de exposición a GBS se colocaron en placas de agar de
sangre de oveja al 5%/TSA para determinar la CFU y para verificar
la dosis de exposición. Se registraron las muertes durante un
periodo de 14 días, y en el día 14 después de la exposición los
ratones supervivientes fueron sacrificados y se determinó la
presencia de organismos GBS en la sangre y en el bazo. Los datos de
supervivencia se muestran en la Tabla 5.
Los sueros pre-exposición fueron
analizados en busca de la presencia de anticuerpos reactivos con GBS
mediante inmunoensayos estándar. Los análisis Elisa y de
inmunotinción indicaron que la inmunización con proteína de GBS
recombinante producida en E. coli provocó anticuerpos
reactivos con proteínas de GBS nativas y recombinantes. Las
respuestas de anticuerpos a GBS se describen en el Ejemplo 9.
Todos los hemocultivos de ratones supervivientes
dieron negativo en el 14 después de la exposición. Los cultivos de
bazo de los ratones supervivientes dieron negativo excepto para
algunos ratones del experimento MB-11.
Se inmunizó grupos de 10 ratones
CD-1 hembra subcutáneamente con proteína de GBS
recombinante correspondiente a la SEQ ID NO: 39, tal como se
describe en el Ejemplo 8. Con el fin de establecer la respuesta de
anticuerpos frente a la proteína de GBS nativa, se analizaron los
sueros procedentes de muestras de sangre antes de cada inmunización
y a los catorce días de la tercera inmunización en busca de
anticuerpos reactivos a células de GBS mediante ELISA usando placas
recubiertas con células de GBS muertas por formaldehído de tipo III
de cepa NCS 954, de tipo Ib de cepa ATCC12401, de tipo V de cepa
NCS 535 ó de tipo VI de cepa NCS 9842. La especificidad de los
anticuerpos activados por la proteína de GBS se confirmó mediante
análisis Western blot realizados sobre extractos celulares de GBS y
sobre antígenos recombinantes purificados. Los resultados mostrados
en la Figura 10 demuestran claramente que los animales responden
enérgicamente a la proteína de GBS recombinante usada como
inmunógeno, con títulos de anticuerpos recíprocos medios que varían
entre 12.000 y 128.000, para sueros recogidos después de la tercera
inmunización, dependiendo del antígeno que recubre. Todos los sueros
preinmunización resultaron negativos cuando fueron evaluados con
una dilución de 1 : 100. Los anticuerpos reactivos a GBS eran
detectables en los sueros de cada animal después de una única
inyección de proteína de GBS recombinante.
Se usaron anticuerpos monoclonales (MAbs)
específicos de la proteína de GBS de la presente invención para
demostrar que dicho antígeno superficial se produce en todos los
GBS, y también que es antigénicamente altamente conservado.
Se usó una colección de 68 elementos aislados de
GBS para evaluar la actividad de MAbs específicos de GBS. Dichas
cepas se obtuvieron del National Center for Streptococcus, del
Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta,
Canadá; del Centre Hospitalier Universitaire de Quebec, Pabellón
CHUL, Québec, Canadá; de la American Type Culture Collection,
EE.UU.; del Laboratoire de Sante Publique du Québec, Canadá; y del
Dept. of Infectious Disease, Children's Hospital and Medical Center,
Seattle, EE.UU. Se evaluó los ocho MAbs frente al siguiente panel
de cepas: 6 elementos aislados de serotipo Ia ó Ia/c, 3 elementos
aislados de serotipo Ib, 4 elementos aislados de serotipo II, 14
elementos aislados de serotipo III, 2 elementos aislados de serotipo
IV, 2 elementos aislados de serotipo V, 2 elementos aislados de
serotipo VI, 2 elementos aislados de serotipo VII, 1 elemento
aislado de serotipo VIII, 10 elementos aislados que no estaban
serotipados y 3 cepas bovinas de S. agalactiae. También se
hizo reaccionar MAb 3A2 con GBS adicional: 9 elementos aislados de
serotipo Ia/c y 10 elementos aislados de serotipo V. Se cultivaron
las cepas una noche sobre placas de agar de sangre a 37ºC en una
atmósfera con un 5% en CO_{2}. Los cultivos fueron almacenados a
-70ºC en un caldo de infusión de corazón con un 20% (v/v) de
glicerol.
Para obtener los MAbs específicos de proteína de
GBS, se inmunizó ratones tres veces a intervalos de tres semanas
con 20 \mug de proteína de GBS recombinante purificada (SEQ ID NO:
44), en presencia de adyuvante QuilA^{TM} al 20%. Se generaron
líneas celulares de hibridoma mediante fusión de células de bazo
recuperadas de los ratones inmunizados con la línea celular de
mieloma SP2/0 no secretora tal como se ha descrito previamente
(Hamel, J. y col., 1987, J. Med. Microbiol. 23:
163-170). Se evaluaron los sobrenadantes de clones
híbridos en busca de una producción de anticuerpos específicos
mediante ELISA usando GBS desactivado por formaldehído y proteína
de GBS recombinante purificada (SEQ ID NO: 39 ó 44) como antígeno
cubriente, tal como se ha descrito previamente (Hamel, J. y col.,
1987, J. Med. Microbiol. 23: 163-170). Los
híbridos específicos fueron clonados mediante diluciones
limitantes, fueron expandidos y congelados en nitrógeno líquido. La
producción de proteína de GBS recombinante se presentó en los
Ejemplos 4 y 5. La proteína de GBS recombinante purificada o el GBS
desactivado por formaldehído fueron redisueltos mediante
electroforesis usando el sistema tampón discontinuo de Laemmli, tal
como recomienda el fabricante, y a continuación se transfirieron a
una membrana de nitrocelulosa para realizar la inmunotinción
Western tal como se ha descrito previamente (Martin y col., 1992,
Infect. Immun. 60: 2718-2725).
Los experimentos de inmunotinción de Western
claramente indicaron que los ocho MAbs reconocen una banda de
proteína que se corresponde con proteína de GBS recombinante
purificada (SEQ ID NO: 39). Dichos MAbs también reaccionaron con
una banda de proteína presente en todos los elementos aislados de
GBS evaluados. La reactividad de estos MAbs específicos de GBS se
presenta en la Tabla 6. Cada MAb reaccionó bien con los 46 GBS.
Además, estos MAbs también reconocieron las 3 cepas de S.
agalactiae de origen bovino que fueron evaluadas. El MAb 3A2
también reconoció diecinueve GBS; 9 elementos aislados de serotipo
Ia/c y 10 de serotipo V. Los otros MAbs no fueron evaluados frente a
estas cepas adicionales.
Estos resultados demuestran que la proteína de
GBS (SEQ ID NO: 39) fue producida por todos los 65 GBS, y por las 3
cepas de S. agalactiae de origen bovino que fueron evaluadas.
Aún más importante, estos resultados claramente demuestran que los
epítopos reconocidos por estos ocho MAbs específicos de GBS estaban
distribuidos y conservados ampliamente entre los GBS. Estos
resultados también indicaron que dichos epítopos no estaban
restringidos a elementos aislados relacionados serológicamente, ya
que se evaluaron representantes de todos los serotipos de GBS
conocidos, incluyendo los grupos principales causantes de
enfermedades.
En conclusión, los datos presentados en este
Ejemplo demuestran claramente que la proteína de GBS de la presente
invención es producida por todos los GBS y que es antigénicamente
altamente conservada.
<110> BioChem Vaccins
\hskip1cm RIOUX, Clément
\hskip1cm DENIS, Martin
\hskip1cm BRODEUR, Bernard R.
\hskip1cm HAMEL, Josée
\hskip1cm CHARLEBOIS, Isabelle
\hskip1cm BOYER, Martine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS ANTÍGENOS DE ESTREPTOCOCOS
DEL GRUPO B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 12806-9PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/075,425
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-02-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160>44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(464)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (534)...(887)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1024)...(1767)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1841)... (4288)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2735)...(4288)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 816
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Adn
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(687)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (701)...(2557)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2566)...(3036)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3106)...(4842)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4850)...(5125)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(122)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (133)...(2511)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (367)...(2511)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2946)...(2716)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> de cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3252)...(2995)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> de cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3676)...(3299)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> de cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4124)...(3837)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> de cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5214)...(4351)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> de cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5058
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(663)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (763)...(1344)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1362)...(1739)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2266)...(5058)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 931
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5607
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(301)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4171
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 649
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3480
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1230
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Estreptococos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
Claims (43)
1. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo
polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, o un fragmento de dicho
polipéptido, en donde dicho polipéptido o fragmento de dicho
polipéptido retiene la capacidad de inducir una respuesta inmune
específica de estreptococos del grupo B.
2. El polinucleótido aislado de acuerdo con
la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que tiene al menos
un 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y
SEQ ID NO: 44, en donde dicho polipéptido retiene la capacidad de
inducir una respuesta inmune específica de estreptococos del grupo
B.
3. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polinucleótido codifica un
polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con el segundo
polipéptido.
4. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo
polipéptido capaz de generar anticuerpos que presentan especificidad
de unión por un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, o un
fragmento de dicho polipéptido, y en donde dicho polipéptido o
fragmento de dicho polipéptido retiene la capacidad de inducir una
respuesta inmune específica de estreptococos del grupo B.
5. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo
polipéptido capaz de generar anticuerpos que presentan especificidad
de unión por un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, y en donde
dichos polipéptidos retienen la capacidad de inducir una respuesta
inmune específica de estreptococos del grupo B.
6. Un polinucleótido aislado que es
complementario al polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.
7. Un polinucleótido aislado que es
complementario al polinucleótido de la reivindicación 4 ó 5.
8. El polinucleótido de la reivindicación 1 ó
2, en donde dicho polinucleótido es ADN.
9. El polinucleótido de la reivindicación 4 ó
5, en donde dicho polinucleótido es ADN.
10. El polinucleótido de la reivindicación 1 ó
2, en donde dicho polinucleótido es ARN.
11. El polinucleótido de la reivindicación 4 ó
5, en donde dicho polinucleótido es ARN.
12. Un polinucleótido aislado que se hibrida en
condiciones severas con el complemento de un segundo polinucleótido
que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ
ID NO: 37, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, o un fragmento de dicho
polinucleótido, en donde dicho polinucleótido tiene al menos un 70%
de identidad con dicho segundo polinucleótido y en donde dicho
polinucleótido, o fragmento del mismo, codifica un polipéptido que
retiene la capacidad de inducir una respuesta inmune específica de
estreptococos del grupo B.
13. Un polinucleótido aislado que se hibrida en
condiciones severas con un segundo polinucleótido que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ
ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en donde dicho polinucleótido tiene al
menos un 70% de identidad con dicho segundo polinucleótido y en
donde dicho polinucleótido codifica un polipéptido que retiene la
capacidad de inducir una respuesta inmune específica de
estreptococos del
grupo B.
grupo B.
14. Un polinucleótido aislado que se hibrida en
condiciones severas con el complemento de un segundo polinucleótido
que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ
ID NO: 37, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en donde dicho
polinucleótido tiene al menos un 95% de identidad con dicho segundo
polinucleótido y en donde dicho polinucleótido codifica un
polipéptido que retiene la capacidad de inducir una respuesta
inmune específica de estreptococos del grupo B.
15. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 14, que se hibrida en condiciones severas con el
complemento de un segundo polinucleótido que tiene la secuencia SEQ
ID NO: 37.
16. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 14, que se hibrida en condiciones severas con el
complemento de un segundo polinucleótido que tiene la secuencia SEQ
ID NO: 42.
17. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 14, que se hibrida en condiciones severas con el
complemento de un segundo polinucleótido que tiene la secuencia SEQ
ID NO: 43.
18. Un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 12, en donde dicho polinucleótido tiene al menos un
95% de complementariedad con el segundo polinucleótido.
19. Un vector que comprende el polinucleótido
de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polinucleótido está
ligado operativamente a una región de control de expresión.
20. Un vector que comprende el polinucleótido
de la reivindicación 4 ó 5, en donde dicho polinucleótido está
ligado operativamente a una región de control de expresión.
21. Una célula hospedante transfectada con el
vector de la reivindicación 19.
22. Una célula hospedante transfectada con el
vector de la reivindicación 20.
23. Un proceso para producir un polipéptido que
comprende cultivar una célula hospedante de acuerdo con la
reivindicación 21 en las condiciones adecuadas para la expresión de
dicho polipéptido.
24. Un proceso para producir un polipéptido que
comprende cultivar una célula hospedante de acuerdo con la
reivindicación 22 en las condiciones adecuadas para la expresión de
dicho polipéptido.
25. Un polipéptido aislado que tiene al menos
un 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 39 y
SEQ ID NO: 44, o un fragmento de dicho polipéptido, y en donde
dicho polipéptido o fragmento de dicho polipéptido retiene la
capacidad de inducir una respuesta inmune específica de
estreptococos del grupo B.
26. Un polipéptido aislado que tiene al menos
un 70% de identidad con un segundo polipéptido que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y SEQ
ID NO: 44, y en donde dicho polipéptido retiene la capacidad de
inducir una respuesta inmune específica de estreptococos del grupo
B.
27. El polipéptido aislado de la reivindicación
25 ó 26 que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 39.
28. El polipéptido aislado de la reivindicación
25 ó 26 que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 44.
29. Un polipéptido aislado que tiene al menos
un 70% de identidad con un segundo polipéptido, y que es capaz de
generar anticuerpos que presentan especificidad de unión por un
polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en: SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, o un fragmento de dicho
polipéptido, en donde dicho polipéptido o fragmento de dicho
polipéptido retiene la capacidad de inducir una respuesta inmune
específica de estreptococos del grupo B.
30. Un polipéptido aislado que tiene al menos
un 70% de identidad con un segundo polipéptido, y que es capaz de
generar anticuerpos que presentan especificidad de unión por un
polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que
consiste en: SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 44, en donde dichos
polipéptidos retienen la capacidad de inducir una respuesta inmune
específica de estreptococos del grupo B.
31. El polipéptido aislado de la reivindicación
29 ó 30 que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO:
39.
39.
32. El polipéptido aislado de la reivindicación
29 ó 30 que tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO:
44.
44.
33. Un polipéptido aislado que tiene una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ
ID NO: 39, o fragmentos del mismo, y en donde dicho polipéptido o
fragmento de dicho polipéptido retiene la capacidad de inducir una
respuesta inmune específica de estreptococos del grupo B.
34. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 33, en donde se elimina el residuo
N-terminal Met.
35. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 33, en donde se elimina la secuencia de aminoácidos
secretora.
36. Una composición de vacuna que comprende un
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
25 a 33 y un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
37. Una composición de vacuna que comprende un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 34 y un vehículo,
diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
38. Una composición de vacuna que comprende un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 35 y un vehículo,
diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
39. El uso de un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33 para la fabricación de
una vacuna para el tratamiento terapéutico o profiláctico de
infección bacteriana estreptococal de grupo B en un animal
susceptible a la infección estreptococal de grupo B.
40. El uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 34 para la fabricación de una vacuna para el
tratamiento terapéutico o profiláctico de infección bacteriana
estreptococal de grupo B en un animal susceptible a la infección
estreptococal de grupo B.
41. El uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 35 para la fabricación de una vacuna para el
tratamiento terapéutico o profiláctico de infección bacteriana
estreptococal de grupo B en un animal susceptible a la infección
estreptococal de grupo B.
42. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 39 a 41, en donde dicho animal es un bovino.
43. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 39 a 41, en donde dicho animal es un humano.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7542598P | 1998-02-20 | 1998-02-20 | |
| US75425P | 1998-02-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2278436T3 true ES2278436T3 (es) | 2007-08-01 |
Family
ID=22125658
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99904646T Expired - Lifetime ES2278436T3 (es) | 1998-02-20 | 1999-02-17 | Antigenos de estreptococos del grupo b. |
| ES10180962.2T Expired - Lifetime ES2540281T3 (es) | 1998-02-20 | 1999-02-17 | Antígenos de estreptococos del grupo B |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10180962.2T Expired - Lifetime ES2540281T3 (es) | 1998-02-20 | 1999-02-17 | Antígenos de estreptococos del grupo B |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20030031682A1 (es) |
| EP (3) | EP2280072B1 (es) |
| JP (2) | JP4637350B2 (es) |
| KR (1) | KR100771148B1 (es) |
| CN (2) | CN1944652A (es) |
| AP (1) | AP2000001886A0 (es) |
| AT (1) | ATE347600T1 (es) |
| AU (1) | AU2505999A (es) |
| CA (1) | CA2321106C (es) |
| CZ (1) | CZ301056B6 (es) |
| DE (1) | DE69934299T2 (es) |
| EA (1) | EA200000860A1 (es) |
| ES (2) | ES2278436T3 (es) |
| HU (1) | HU228497B1 (es) |
| ID (1) | ID27482A (es) |
| IL (3) | IL137921A0 (es) |
| NO (2) | NO330491B1 (es) |
| NZ (1) | NZ529854A (es) |
| OA (1) | OA11686A (es) |
| TR (1) | TR200002437T2 (es) |
| WO (1) | WO1999042588A2 (es) |
| ZA (1) | ZA991325B (es) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU228497B1 (en) | 1998-02-20 | 2013-03-28 | Id Biomedical Corp Quebec | Group b steptococcus antigens |
| JP2002531054A (ja) * | 1998-07-27 | 2002-09-24 | マイクロビアル テクニクス リミティッド | Ｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質 |
| US7098182B2 (en) | 1998-07-27 | 2006-08-29 | Microbial Technics Limited | Nucleic acids and proteins from group B streptococcus |
| GB0105922D0 (en) * | 2001-03-09 | 2001-04-25 | Microscience Ltd | Genes and proteins, and their use |
| US6812021B1 (en) | 1998-12-22 | 2004-11-02 | Microscience Limited | Genes and proteins and their use |
| US6890539B2 (en) | 1998-12-22 | 2005-05-10 | Microscience, Ltd. | Genes and proteins, and their use |
| US7128918B1 (en) | 1998-12-23 | 2006-10-31 | Id Biomedical Corporation | Streptococcus antigens |
| CA2382795A1 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | Medimmune, Inc. | Homologs of a pneumococcal protein and fragments for vaccines |
| US6833356B1 (en) | 1999-08-25 | 2004-12-21 | Medimmune, Inc. | Pneumococcal protein homologs and fragments for vaccines |
| US6833134B2 (en) | 2000-06-12 | 2004-12-21 | University Of Saskacthewan | Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection |
| DK1294771T3 (da) | 2000-06-12 | 2008-12-15 | Univ Saskatchewan | Kimært GapC-protein fra Streptococcus og anvendelse deraf til vaccinering og diagnosticering |
| EP1734050A3 (en) * | 2000-06-12 | 2012-12-05 | University Of Saskatchewan | Immunization of dairy cattle with GapC protein against streptococcus infection |
| US6866855B2 (en) | 2000-06-12 | 2005-03-15 | University Of Saskatchewan | Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection |
| ES2273861T3 (es) * | 2000-06-12 | 2007-05-16 | University Of Saskatchewan | Inmunizacion de ganado vacuno lechero con proteina gapc frente a infecciones por streptococcus. |
| CA2424433A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Shire Biochem Inc. | Bvh-a2 and bvh-a3 antigens of group b streptococcus |
| AU1412702A (en) | 2000-10-27 | 2002-05-06 | Chiron Spa | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a and b |
| AU1686302A (en) * | 2000-12-21 | 2002-07-01 | Shire Biochem Inc | Streptococcus pyogenes antigens and corresponding dna fragments |
| FR2824074A1 (fr) * | 2001-04-26 | 2002-10-31 | Pasteur Institut | Sequence du genome streptococcus agalactiae, application au developpement de vaccins, d'outils de diagnostic, et a l'identification de cibles therapeutiques |
| EP1472353B1 (en) * | 2002-02-11 | 2012-02-01 | ID Biomedical Corporation | Group b streptococcus antigen |
| GB0210128D0 (en) * | 2002-05-02 | 2002-06-12 | Chiron Spa | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B |
| PT1648500E (pt) | 2003-07-31 | 2014-10-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Composições imunogénicas para estreptococos piogenes |
| US8945589B2 (en) | 2003-09-15 | 2015-02-03 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl | Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae |
| EP1784211A4 (en) | 2004-07-29 | 2010-06-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR GRAMPOSITIVE BACTERIA SUCH AS STREPTOCOCCUS AGALACTIAE |
| JP2008544949A (ja) | 2004-10-08 | 2008-12-11 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 化膿性レンサ球菌のための免疫激性組成物および治療用組成物 |
| JP2008530021A (ja) * | 2005-02-08 | 2008-08-07 | アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック シー．オー．ビー． アズ グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ノース アメリカ | 医薬組成物 |
| GB0605247D0 (en) * | 2006-03-15 | 2006-04-26 | Chiron Srl | Compositions and methods for immunisation |
| MX2010002773A (es) | 2007-09-12 | 2010-03-31 | Novartis Ag | Antigenos mutantes de gas57 y anticuerpos de gas57. |
| CA2709927C (en) | 2007-12-21 | 2017-05-16 | Novartis Ag | Mutant forms of streptolysin o |
| CN102304185A (zh) * | 2011-09-02 | 2012-01-04 | 黑龙江八一农垦大学 | 预防奶牛乳房炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用 |
| EP2949340A1 (en) * | 2014-05-30 | 2015-12-02 | IDT Biologika GmbH | Vaccine composition against Streptococcus suis infection |
| CN115057944B (zh) * | 2022-06-24 | 2025-06-24 | 南京农业大学 | 一种针对所有gbs血清型的多表位亚单位疫苗 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4431739A (en) | 1979-11-05 | 1984-02-14 | Genentech, Inc. | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein |
| US4425437A (en) | 1979-11-05 | 1984-01-10 | Genentech, Inc. | Microbial polypeptide expression vehicle |
| US5302386A (en) * | 1986-04-16 | 1994-04-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture |
| US5472696A (en) * | 1988-02-26 | 1995-12-05 | Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. | Antigen of group B streptococci |
| US5648241A (en) * | 1989-09-15 | 1997-07-15 | The General Hospital Corporation | Conjugate vaccine against group B streptococcus |
| US5679768A (en) * | 1991-02-15 | 1997-10-21 | Uab Research Foundation | Epitopic regions of pneumococcal surface protein A |
| US5225331A (en) * | 1991-04-25 | 1993-07-06 | National Research Council Of Canada | Immunoassay for detecting group b streptococcus |
| JP3976334B2 (ja) * | 1993-03-19 | 2007-09-19 | リンダール， グンナル | Ｂ群れんさ球菌の多くの菌株に対する免疫を与える細胞表面タンパク質であるタンパク質Ｒｉｂ、そのタンパク質の精製方法、薬剤キットおよび医薬組成物 |
| US5595740A (en) * | 1994-05-16 | 1997-01-21 | University Of Florida | Cloning of non-IgA FC binding forms of the group B streptococcal beta antigens |
| EP0754703A4 (en) * | 1994-11-01 | 1999-11-24 | Kirin Brewery | PEPTIDE SEQUENCE FORMING A MUCIN CHAIN AND TECHNIQUE FOR MODIFYING THE PROTEIN TO BE LINKED TO THE MUCIN CHAIN |
| DE69739981D1 (de) * | 1996-10-31 | 2010-10-14 | Human Genome Sciences Inc | Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe |
| HU228497B1 (en) * | 1998-02-20 | 2013-03-28 | Id Biomedical Corp Quebec | Group b steptococcus antigens |
| US6248329B1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-06-19 | Ramaswamy Chandrashekar | Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof |
| JP2002531054A (ja) | 1998-07-27 | 2002-09-24 | マイクロビアル テクニクス リミティッド | Ｂ群連鎖球菌由来の核酸およびタンパク質 |
| PT1140157E (pt) | 1998-12-21 | 2009-05-06 | Medimmune Inc | Proteínas de streptococcus pneumoniae e fragmentos imunogénicos para vacinas |
| CN100398653C (zh) | 1998-12-23 | 2008-07-02 | 益得生物医学公司 | 新颖的链球菌抗原 |
| US7128918B1 (en) * | 1998-12-23 | 2006-10-31 | Id Biomedical Corporation | Streptococcus antigens |
| GB9921125D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-11-10 | Microbial Technics Limited | Proteins |
| EP1472353B1 (en) | 2002-02-11 | 2012-02-01 | ID Biomedical Corporation | Group b streptococcus antigen |
-
1999
- 1999-02-17 HU HU0102304A patent/HU228497B1/hu unknown
- 1999-02-17 CN CNA2006100913640A patent/CN1944652A/zh active Pending
- 1999-02-17 CA CA2321106A patent/CA2321106C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 OA OA1200000228A patent/OA11686A/en unknown
- 1999-02-17 JP JP2000532528A patent/JP4637350B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 TR TR2000/02437T patent/TR200002437T2/xx unknown
- 1999-02-17 EP EP10180962.2A patent/EP2280072B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 WO PCT/CA1999/000114 patent/WO1999042588A2/en not_active Ceased
- 1999-02-17 CN CNB998052485A patent/CN1268745C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 ES ES99904646T patent/ES2278436T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 EP EP20060022306 patent/EP1757697A3/en not_active Withdrawn
- 1999-02-17 EP EP99904646A patent/EP1054971B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 EA EA200000860A patent/EA200000860A1/ru unknown
- 1999-02-17 DE DE69934299T patent/DE69934299T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 AT AT99904646T patent/ATE347600T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-17 ID IDW20001856A patent/ID27482A/id unknown
- 1999-02-17 AU AU25059/99A patent/AU2505999A/en not_active Abandoned
- 1999-02-17 ES ES10180962.2T patent/ES2540281T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 AP APAP/P/2000/001886A patent/AP2000001886A0/en unknown
- 1999-02-17 IL IL13792199A patent/IL137921A0/xx active IP Right Grant
- 1999-02-17 KR KR1020007009237A patent/KR100771148B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-17 CZ CZ20003054A patent/CZ301056B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-02-18 ZA ZA9901325A patent/ZA991325B/xx unknown
- 1999-02-18 US US09/252,088 patent/US20030031682A1/en active Pending
-
2000
- 2000-08-17 IL IL137921A patent/IL137921A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-08-18 NO NO20004161A patent/NO330491B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-13 US US10/340,792 patent/US7914794B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-28 NZ NZ529854A patent/NZ529854A/en not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-03-09 IL IL190018A patent/IL190018A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-06-02 JP JP2009132976A patent/JP2009242403A/ja active Pending
-
2010
- 2010-11-30 NO NO20101682A patent/NO20101682L/no not_active Application Discontinuation
- 2010-12-28 US US12/980,172 patent/US8226953B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-07-16 US US13/550,363 patent/US8580262B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2278436T3 (es) | Antigenos de estreptococos del grupo b. | |
| ES2400280T3 (es) | Antígenos de estreptococos | |
| US7262024B2 (en) | Streptococcus antigens | |
| US7074415B2 (en) | Streptococcus antigens | |
| AU2010227084B2 (en) | Group B Streptococcus Antigens | |
| AU2007200130B2 (en) | Group B Streptococcus Antigens | |
| EP1950302B1 (en) | Streptococcus antigens | |
| HK1100752A (en) | Group b streptococcus antigens | |
| HK1118575B (en) | Streptococcus antigens |