KR100341256B1

KR100341256B1 - 리파제를 이용한 베라파밀 중간체의 분할 및 (ｒ)- 및 (ｓ)-베라파밀의 제조 방법

Info

Publication number: KR100341256B1
Application number: KR1019990038839A
Authority: KR
Inventors: 정찬성; 이소하; 임대식
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1999-09-11
Filing date: 1999-09-11
Publication date: 2002-06-21
Anticipated expiration: 2019-09-11
Also published as: KR20010027210A

Abstract

베라파밀의 제조에 사용하기 위한 베라파밀의 라세미 중간체를 가수분해효소를 사용하여 순수한 (R)- 및 (S)-이성체로 분할하는 방법 및 상기 분할된 (R)- 및 (S)-중간체로부터 순수한 (R)- 및 (S)-베라파밀을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

Description

리파제를 이용한 베라파밀 중간체의 분할 및 (Ｒ)- 및 (Ｓ)-베라파밀의 제조 방법 {Lipase Catalysed Resolutions of Verapamil Intermediate and Process for Preparing (R)- and (S)-Verapamil}

본 발명은 고혈압 치료에 효과적으로 사용되는 베라파밀, 특히 (R)-(+)- 및 (S)-(-)-베라파밀의 제조에 사용하기 위한 베라파밀의 라세미 중간체를 순수한 이성체로 분할하는 방법 및 (R)-(+)- 및 (S)-(-)-베라파밀의 제조 방법에 관한 것이다.

베라파밀은 칼슘 길항체로서 고혈압 치료에 효과적으로 사용된다. 베라파밀은 전압과 관련된 칼슘채널 (voltage-gated Ca²⁺channel)의 엘 부류(L class)에 속하는 대표적인 화합물로서 같은 채널에 속하는 1,4-디히드로피리딘 또는 벤조티아제핀류의 화합물들과는 대사반응 과정이 다른 것으로 알려져 있다. 즉, 베라파밀과 칼슘 채널과의 반응에는 비채널 부위에서의 다양성 및 대사 과정과 단백질 결합 부위에서 나타나는 반응의 입체선택성이 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 베라파밀은 화학구조적으로 비대칭 탄소를 한개 포함하는 다음과 같은 구조를 가지고 있다.

이 화합물은 현재까지 알려져있는 제조방법 (미국특허; 제4593042호, 제4667038호, 제4681889호, 제4681970호)으로는 비대칭 탄소에 기인하는 라세미 혼합물, 즉 (R)- 및 (S)-이성체의 혼합물로 얻어지고 현재 사용되고 있는 의약에 포함되어 있는 베라파밀은 라세미 혼합물로서 존재한다. 그러나, 최근에 알려진 약물동력학적인 다양한 연구들은 이 두 이성체의 반응 메커니즘이 정성적으로 또는 정량적으로 다르다는 것을 보여주고 있다 (Chirality; 3:393-404,1991). 키로사이언스사는 이러한 관점에서 (R)- 및 (S)- 이성체 중에서 어느 쪽이 약물로서의 효과가 더 우수한 지, 그리고 특히 입체 이성체를 분리하여 투여할 경우 베라파밀 혼합물의 고단위 투여에 의한 변비와 같은 부작용을 개선할 수 있을 지에 대하여 연구를 집중한 결과, (S)-이성체 (레보베라파밀)의 약물로서의 효과가 우수하지만, (R)-이성체 (덱스트로베라파밀)는 특히 나트륨 채널 및 세포-펌프 활성과 관련이 있어 특히 여러 가지 항암제에 대해 내성이 있는 질병의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (Int. J. Cancer, 46:113, 1990).

이러한 연구와 관련하여 베라파밀 이성체의 입체선택적 합성 방법이 개발되기도 하였다 (J. Org. Chem., 52:1309, 1987). 이 방법에서는 출발물질로서 (S)-1,2-프로판디올을 사용하여 (S)-이성체를 합성하지만, 출발물질의 가격이 비싸고 제조 과정이 여러 단계로 이루어져 수율이 낮은 단점이 있다.

또한, 일반적인 분할 방법인 키랄아민을 사용한 재결정 방법을 이용하여 베라파밀 중간체를 분할한 결과도 보고되었다 (국제 특허 공개 제WO97/29081호). 여기서는 키랄아민으로서 퀴닌이 사용되고 기질로서는 4-시아노-4-(3,4-디메톡시페닐)-5-메틸헥산산이 사용되었다. 이러한 분할 과정은 기존의 방법 (독일 특허 제3723684호, 국제 특허 공개 제WO93/16035호)인 베라파밀 자체를 분할하는 것보다 분할하려는 대상 화합물이 상대적으로 작고 부산물 생성이 적어 유리하다고 보고되어 있다. 순수한 4-시아노-4-(3,4-디메톡시페닐)-5-메틸헥산산 이성체는 새로운 중간체로 인정이 되었고 키로사이언스사는 이를 이용하여 광학적으로 순수한 최종 베라파밀을 제조하였다 (국제 특허 공개 제WO98/11061호).

따라서, 본 발명자들은 순수한 베라파밀 이성체를 제조하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과 본 발명에 이르렀다.

본 발명의 목적은 베라파밀의 제조에 사용하기 위한 베라파밀의 라세미 중간체를 가수분해효소를 사용하여 순수한 (R)- 및 (S)-이성체로 분할하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 분할된 (R)- 및 (S)-중간체로부터 순수한 (R)- 및 (S)-베라파밀을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적 및 다른 목적과 특징 및 잇점은 후술하는 발명의 상세한 설명에 의해 더욱 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 베라파밀의 제조를 위한 중간체로서 사용되는 비대칭 4급 탄소를 포함하는 1급 알콜의 라세미 혼합물을 효소를 사용하여 높은 ee (enantiomeric excess)를 갖는 (R)- 및 (S)-이성체로 각각 분할하는 방법 및 이로부터 순수한 (R)-(+)- 및 (S)-(-)-베라파밀을 제조하는 방법에 관한 것이다.

먼저, 베라파밀을 제조하기 위한 역합성 방법은 하기 반응식 1로 나타낼 수 있다.

상기 반응식 1로부터, 본 발명에서는 베라파밀을 제조하기 위한 출발물질로서 3,4-디메톡시페닐아세토니트릴을 사용하여 베라파밀을 제조하는 과정은 하기 반응식 2로 나타낼 수 있다.

본 발명에서 베라파밀을 제조하기 위한 중간체인 1급 알콜의 라세미 혼합물의 분할 과정은 하기 반응식 3으로 나타내어진다.

본 발명의 분할 방법에 따르면, 중간체, 화학식 1의 2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시프로필)아세토니트릴의 라세미 혼합물을 가수분해효소의 존재하에 아실기 함유 화합물을 사용하여 선택적으로 (S)-이성체를 트랜스에스테르화시키므로써 (R)- 및 (S)-이성체로 각각 분리하고, 필요에 따라 얻어진 (R)- 및 (S)-이성체를 알콜로 가수분해시킨 후 상기 분할 과정을 반복하여 높은 ee를 갖는 (R)- 및 (S)-이성체를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 하기 반응식 4에 나타낸 바와 같이 상기 화학식 1의 화합물을 에스테르화시킨 화학식 1a의 화합물의 라세미 혼합물을 가수분해효소의 존재하에 선택적으로 (S)-이성체를 가수분해시키므로써 (R)- 및 (S)-이성체로 각각 분리하고, 필요에 따라 상기 분할 과정을 반복하여 높은 ee를 갖는 (R)- 및 (S)-이성체를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 제조된, 베라파밀의 라세미 중간체의 (R)- 또는 (S)-이성체를 메탄술포닐 클로라이드 또는 톨루엔술포닐 클로라이드와 반응시켜 술폰 유도체를 제조하고, 상기 술폰 유도체를 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸아민과 반응시켜 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민을 제조하고, 상기 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민을 메틸화 반응시키므로써, 하기 화학식 8a 및 화학식 8b의 순수한 R-(+)- 및 S-(-)-베라파밀을 제조할 수 있다.

<화학식 8a>

<화학식 8b>

분할되는 기질에 따라 분할 효과가 상이하므로, 가수분해효소를 이용하여 라세미 혼합물을 분할하기 위해서는 효소에 적합한 기질을 적절히 사용하는 것이 중요하다. 또한, 이러한 기질의 선택은 최종 화합물을 효과적이면서도 경제성있게 제조하기 위한 점을 함께 고려하면서 선택되어야 한다. 본 발명자들은 이미 선행연구로 밝혀진 결과 (Biotechnology letter, 1996)를 기초로 하여 예의 연구한 결과, 상기 화학식 1의 2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시프로필)아세토니트릴이 매우 적절하다는 것을 발견하였다.

즉, 벤젠, 알킬, 니트릴 및 알콜기를 포함하는 4급 탄소의 가수분해효소를 이용하는 경우 상기 화학식 1의 화합물을 사용할 때 라세미 혼합물이 효과적으로 분할되며, 알콜기를 포함하는 사슬의 길이에 따라 분할 효율이 달라지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에서는 화학식 (1)의 화합물을 기질로 하여 다양한 가수분해효소를 이용하여 순수한 이성체를 분할하였다.

알콜과 산이 관계하는 반응에서는 가수분해효소 중 에스테라제 또는 리파제가 보편적으로 사용되는데 이들 효소는 가수분해반응 또는 에스테르화반응에 동시에 사용될 수 있는 장점을 갖고 있다.

특히, 기질이 물에 녹지 않을 경우 유기 용매를 이용한 효소반응은 클리바노프의 연구결과 이후 폭발적으로 연구가 되고 있다. 본 발명에서는 유기 용매를 이용한 트랜스에스테르화 반응을 이용하여 4급 탄소를 포함하는 알콜을 분할한다. 본 발명에 사용될 수 있는 용매로는 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 에틸 아세테이트, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 헥산/에틸아세테이트, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 아세토니트릴, 디클로로에탄, 디클로로메탄 등의 비극성 용매 또는 1,4-디옥산, 메탄올, 테트라히드로푸란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름알데히드 등의 극성 용매를 들 수 있지만, 비극성 용매가 바람직하다.

본 발명의 에스테르화 반응에 있어서의 반응 온도는 0 내지 55 ℃가 바람직하고, 특히 바람직하게는 가수분해의 반응 온도는 0 내지 35 ℃가 바람직하다.

본 발명에 사용될 수 있는 가수분해효소로는 상업적으로 얻기 쉬운 리파제, 예를 들어 수도모나스 세파시아 (Pseudomonas cepacia), 수도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 캔디다 루고사 (Candida rugosa), 캔디다 앤타라티카 비 (Candida antarctica B), 아스펠지러스 니거 (Aspergillus niger), 무코르 미하이 (Mucor Miehei), 돼지의 췌장 등으로부터 생산된 효소, 및 피그 리버 에스테라제, 호스 리버 에스테라제, 콜레스테롤 에스테라제, 콜린 에스테라제 (cholinesterase), 휘트 검, 지오트리컴 캔디덤 및 리조푸스 니베우스 (Rhizopus niveus)를 들 수 있으며, 수도모나스 세파시아, 수도모나스 플루오레슨스, 캔디다 루고사, 캔디다 앤타라티카 비로 부터 생산된 리파제가 특히 바람직하다. 또한, 본 발명에서는 효소를 고체 지지체에 고정시켜 사용할 수 있으며, 사용될 수 있는 고체 지지체의 예로는 세라믹 입자, 규조토 등이 있다.

또한, 본 발명의 트랜스에스테르화 반응에서는 효소가 가역반응으로 참여를 하여 알콜에서 에스테르로의 정반응만 진행시키고 역반응은 일어나지 않도록 하기 위해서 아실기 함유 화합물을 사용해야만 한다. 본 발명의 트랜스에스테르화 반응에 사용되는 아실기 함유 화합물로서는 바람직하게는 비닐아세테이트, 아세트산 무수물, 이소프로페닐아세테이트, 비닐부티레이트, 프로판산 무수물, 부탄산 무수물, 비닐라우레이트 등이 있으며, 비닐아세테이트가 특히 바람직하다. 아실기 함유 화합물로서 비닐아세테이트 등을 사용하는 경우 비닐아세테이트로부터 생산된 부산물인 알데히드는 효소에 치명적으로 작용하여 효소의 반응성을 감소시키거나 반응 특이성을 저하시키는 원인이 되기도 한다 (J. Molecular Catalyst. Enzyme).

따라서, 생성된 알데히드를 제거할 수 있는 아민 염기와 같은 첨가제를 사용하는 것이 바람직하며, 이러한 첨가제의 예로서는 아민 염기, 예를 들어 트리에틸아민, 피리딘, 피페리딘, 피페라진, 디이소프로필아민, 이미다졸, 탄산칼슘, 나트륨 아세테이트, 분자체 및 염화리튬을 들 수 있다. 본 발명에서는 피리딘, 탄산칼륨 및 분자체를 사용하는 경우 가장 좋은 반응 속도의 반응 특이성을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필아세토니트릴 (3)의 합성

둥근바닥 삼구 플라스크 (250 ㎖)에서 오일중의 수소화나트륨 (2.26 g, 56.4mmol)의 60 % 분산액을 건조된 디메틸포름알데히드 70 ㎖에 분산시켰다. 생성액에 0 ℃에서 3,4-디메톡시페닐아세토니트릴 (9.16 g, 51.7 mmol)를 디메틸포름알데히드 10 ㎖에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 분산액의 온도를 15 ℃로 하고 2-브로모프로판 (4.41 ㎖, 47.0 mmol)을 조금씩 적가하여 15시간 동안 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 반응물을 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르 50 ㎖로 3회 추출하였다. 합친 유기상을 포화 중탄산나트륨 용액, 염수 및 증류수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과하고, 감압하에 용매를 제거하여 조생성물 14 g을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 분리 (n-핵산:에틸 아세테이트=10:1)하여 표제 화합물 (3) 7.08 g (69 %)을 얻었다.

질량분석기 (m/e) 51, 63, 76, 90, 103, 115, 131, 146, 162, 176(100), 189, 203, 219(M+);¹H-NMR (CDCl₃, ppm): 1.04 (d, J=6.72Hz, 6H, -CH₃x 2), 2.10(m, 1H), 3.89(d, J=6.12Hz, 6H, -OCH₃x 2), 6.79 - 6.84 (m, 3H, 벤젠).

<실시예 2>

2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-테트라히드로피라닐옥시프로필)아세토니트릴 (5) 및 2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시프로필)아세토니트릴 (1)의 합성

둥근바닥 삼구 플라스크 (250 ㎖)에서 오일 중의 수소화나트륨 (1.2 g, 30 mmol)의 60 % 분산액을 잘 건조된 디메틸포름아마이드 50 ㎖에 분산시켰다. 0 ℃에서 2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필아세토니트릴 (3) 5.48 g (25 mmol)을 디메틸포름아마이드 5 ㎖에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 분산액의 온도를 15℃로 하여 3-테트라히드로피라닐옥시프로필브로마이드 5.5 g (25 mmol)을 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르 50 ㎖로 3회 추출하였다. 합친 유기상을 포화 탄산나트륨 용액, 염수 및 증류수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과하고, 감압하에 용매를 제거하여 2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-테트라히드로피라닐옥시프로필)아세토니트릴 (5) 11 g을 얻었고, 이것을 추가의 정제없이 다음 반응에 바로 사용하였다.

둥근바닥 일구 플라스크 (100 ㎖)에 상기 제조한 화합물 (5) 11 g을 넣고, 1 N 메탄올성 염산 용액 20 ㎖를 첨가하여 상온에서 3시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 반응물을 감압하 농축하고 에틸 에테르 50 ㎖로 3회 추출하였다. 합친 유기상을 포화 탄산나트륨 용액, 염수 및 증류수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 이어서, 여과하고, 감압하에 용매를 제거, 농축하고, 실리카겔 컬럼으로 분리 (n-핵산:에틸아세테이트=10:1)하여 2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시프로필)아세토니트릴 화합물 (1) 5.8 g (84 %)을 얻었다.

화합물 (1):

고성능 액체크로마토그래피 컬럼:

-컬럼: 키랄셀 OD (셀룰로오즈 카바메이트 유도체)

-이동상: n-핵산: 이소프로필알콜 (94:6),

-흐름속도 및 검출기: 흐름속도: 1.0, 검출기: 자외선 검출기(254 nm)

-체류시간(분) 21.31 및 37.36,

체류시간(분) 11.32; 질량분석기 (m/e) 51, 65, 77, 103, 115, 138, 146, 170, 186, 189, 216(100), 234, 277 (M+);

1H-NMR (CDCl₃, ppm): 0.81 (d, J=6.78Hz, 3H, -CH₃) 1.20 (d, J=6.57Hz, 3H, -CH₃), 1.29 (m, 1H), 1.32 (s, 1H-OH), 1.63 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.10 (m, 1H), 2.45 (m, 1H), 3.58 (m, 2H), 3.89 (d, J=4.38 Hz, 6H, -OCH₃x 2), 6.84-6.92 (m, 3H, 벤젠).

<실시예 3>

2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-아세톡시프로필)아세토니트릴 (1a)의 합성

둥근바닥 삼구 플라스크 (25 ㎖)에서 화합물 (1) 1.7 g (6.14 mmol)를 건조된 디클로로메탄 10 ㎖에 용해시켰다. 이 용액에 4,4-디메틸아미노피리딘 300 ㎎ 및 피리딘 1.5 ㎖ (18.4 mmol)를 첨가한 후, 0 ℃에서 아세트산 무수물 1.74 ㎖ (18.4 mmol)를 적가하였다. 온도가 서서히 상온이 되도록 한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 반응물을 2 % 염산 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르 30 ㎖로 3회 추출하였다. 합친 유기상을 포화 탄산나트륨 용액, 염수 및 증류수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 감압하에 용매를 제거하여 농축시키고 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 분리 (n-핵산:에틸아세테이트=4:1)하여 표제 화합물 (1a) 1.8 g (92 %)을 얻었다.

화합물 1a:

고성능 액체크로마토그래피 컬럼:

-컬럼: 키랄셀 OD (셀룰로오즈 카바메이트 유도체)

-이동상: n-핵산: 이소프로필알콜 (94:6),

-체류시간(분) 15.52 및 17.26,

체류시간(분) 11.68; 질량분석기(m/e) 51, 77, 91, 103, 115, 128, 138, 174, 189, 216(100), 235, 258, 277, 319(M+).

1H-NMR (CDCl₃, ppm): 0.81 (d, J=6.81 Hz, 3H, -CH₃) 1.20 (d, J=4.95Hz, 3H, -CH₃) 1.32 (m, 1H), 1.72 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 2.03 (s, 3H, -COCH₃), 2.06 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 3.89 (d, J=2.76Hz, 6H, -OCH₃x 2), 4.00 (t, J=6.33 Hz, -CH₂CO-), 6.85 - 6.91 (m, 3H, 벤젠).

<실시예 4>

화합물 (1)의 분할을 위한 효소 스크리닝-트랜스에스테르화 반응

<반응식 3>

둥근바닥 삼구 플라스크 (25 ㎖)에 온도계를 부착하고 화합물 (1) 31.4 ㎎ (0.11 mmol)를 건조된 용매, n-헥산/에틸 아세테이트 (9/1) 5 ㎖에 용해시켰다. 용액에 하기 표 1에 표시된 효소를 기질에 대해 10 중량 % 첨가한 후, 비닐아세테이트 13 ㎖을 첨가하고, 32-34℃에서 교반하면서 박층크로마토그래피 (TLC)로 반응의 정도를 확인하였다. 반응 결과를 표 1에 나타냈다.

효소	반응 시간(시간)전환률 (%)	이성체 비율
효소	반응 시간(시간)전환률 (%)	알콜(R/S) 에스테르(R/S)
LPS(Aldrich사)^a	2.529	61/39 40/60
LPS(Aldrich사)	2.541	61/39 38/62
LPS(Amano사)	718	54/46 34/66
LPS-C	2.538	54/46 42/58
LPS-D	161	68/32 36/64
CCLVII^a	1.517	55/45 45/55
CCLVII^b	1.527	54/46 42/58
CCLVII	733	68/32 36/64
LAYS	240	54/46 -
LAK	710	53/47 14/86
LAS	240	53/47 -
PPL(타입 I)	240	53/47 -
리버(호스)	240	53/47 -
리버(포신)	240	53/47 -
PLE	240	53/47 -
CE	240	53/47 -
리포프로테인	715	72/28 27/75
무코 미하이	718	64/36 34/66
휘트 검 맥아	240	53/47 -
지오트리컴 캔디덤	710	68/32 36/64
리조푸스 니베우스	712	55/45 45/55

a) 반응 용매 (n-헥산), b) 기질과 같은 양의 효소 사용LPS(Aldrich사): 수도모나스 세파시아 리파제LPS(Amano사) : 수도모나스 세파시아 리파제 (>30,000 unit/g)LPS-C(Amano사): 세라믹 입자에 고정화된 수도모나스 세파시아 리파제 (>30,000 unit/g)LPS-D(Amano사): 규조토에 고정화된 수도모나스 세파시아 리파제 (>80,000 unit/g)CCL(Aldrich사): 캔디다 루고사 리파제 (860 unit/g)LAYS(Amano사) : 캔디다 루고사 리파제 (>30,000 unit/g)LAK(Amano사) : 수도모나스 플루오레슨스 리파제 (>20,000 unit/g)LAS(Amano사) : 아스펠지러스 니거 리파제 (>12,000 - 15,000 unit/g)PPL(Sigma사) : 포신 판크레아틴 리파제PLE : 피그 리버 (기니아 피크) 에스테라제CE: 콜린 에스테라제

<실시예 5>

트랜스에스테르화 반응에 미치는 용매 효과

실시예 4와 같은 방법으로 반응시켜 화합물 (1)을 분할하는데 있어서, 효소로서 LAK를 이용하여 용매의 종류에 따라 반응 속도 및 반응 선택성이 어떻게 변하는 지를 시험하였으며, 반응 결과는 하기 표 2에 나타냈다. 표 2로부터, 비극성 용매인 n-헥산이 가장 바람직하지만, 기질의 용해도면에서는 n-헥산과 에틸아세테이트의 비율이 1/1 내지 9/1일 때 가장 좋은 결과를 얻었다.

용매	반응 시간(h)	전환률(%)	알콜 (R)(%)	아세테이트 (S)(%)	E
벤젠	2.4	17	14	66	2.3
아세토니트릴	1.5	54	-	-	-
에틸 아세테이트	10	36	44	66	4.9
테트라히드로푸란	1.5	49	-	-	-
디클로로에탄	7.5	100	-	-	-
1,4-디옥산	1.5	50	40	63	6.5
메탄올	1.5	37	-	-	-
n-헥산	1.5	37	40	70	8.3
n-헥산/에틸 아세테이트 (1/1 - 9/1)	1.5	44	58	76	13
디이소프로필 에테르	2	70	99	44	11

<실시예 6>

트랜스에스테르화 반응에서 첨가제가 반응에 미치는 효과

실시예 4와 같은 방법으로 반응을 시켜 화합물 (1)을 분할하는데 있어서, 효소로서 LAK를 이용하고 비가역반응을 유지하기 위하여 아실기 함유 화합물을 사용하면서 반응 중에 발생하는 알데히드를 제거하기 위해 첨가제를 넣어 주었을 때 반응 속도 및 반응 선택성이 어떻게 변하는 지를 시험하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다. 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 피리딘, 탄산칼슘, 분자체를 사용했을 때 순수한 알콜 이성체를 얻을 수 있었다.

첨가제	반응 시간(h)	전환률(%)	(R)-알콜ee (%)	(S)-아세테이트ee (%)
트리에틸아민 (35 ㎕)	3	30	37	82
피리딘 (35 ㎕)	3	66	99	52
피페리딘 (35 ㎕)	3	20	20	78
피페라진 (18 ㎎)	3	14	14	76
디이소프로필아민 (35 ㎕)	4	48	64	76
이미다졸 (15 ㎎)	21	30	12	52
탄산칼슘 (15 ㎎)	2	67	99	52
2.5 M 염화리튬 수용액 (35 ㎕)	25	7	6	32
분자체 (35 ㎎)	2	63	98	60
물 (35 ㎕)	21	10	8	84
나트륨아세테이트 (15 ㎎)	2	45	62	74

<실시예 7>

화합물 (1a)의 분할을 위한 효소 스크리닝-가수분해 반응

<반응식 4>

25 ㎖의 반응 용기에 라세미 화합물 (1a) 138 ㎎과 인산 완충 용액 (pH 7, 8 ㎖: K₃PO₄1.5 g 및 KH₂PO₄1.75 g을 증류수 500 ㎖에 용해시켜 pH 7.00의 완충 용액을 제조함)에 넣고, 20℃에서 교반하여 분산시켰다. 분산액에 하기 표 4에 표시된 효소 138 ㎎을 넣고 가수분해 반응을 행하였으며, 이때 반응 결과로 유리되어 나오는 아세트산을 pH 적정기를 이용하여 0.01 N NaOH 용액으로 적정하였다. 일정 시간이 경과한 후 시료를 채취한 후 HPLC를 이용하여 이성체의 구성 비율을 측정하였다.

효소	반응 시간 (h)전환률 (%)	0.01N NaOH 소모량(㎖)	이성체 비율알콜(R/S) 에스테르(R/S)
LAK	1.526	14.5	72/28 7/93
LPS	237	16.8	35/65 62/38
CCLVII	2.56	6.5	51/49 48/52

가스크로마토그래피 분석조건 (가스크로마토그래피/질량분석 검출기)

- 컬럼: 휴렛-팩커드 용융 실리카 모세관 칼럼

(HP-5 교차결합된 5 % 페닐 메틸 실리콘)

- 검출기: 질량분석 280 ℃, 주입구 280℃

- 분석조건: 초기온도 70 ℃ (2분), 20 ℃/분, 최종온도 300 ℃(20분)

- 체류시간: 화합물 1: 11.32 분, 화합물 1a: 11.68 분

고성능액체크로마토그래피 분석 조건

- 컬럼 : 키랄셀 OD (셀룰로오즈 카바메이트 유도체)

- 이동상: n-헥산 : 이소프로필알콜 (94:6), 흐름속도 : 1.0

- 검출기: 자외선 검출기 254 nm

- 체류시간: 화합물 1: (R)-이성체 21.31 분

(S)-이성체 37.36 분

화합물 1a: (R)-이성체 15.52 분

(S)-이성체 17.26 분

<실시예 8>

분할 효율을 높이기 위한 이차 트랜스에스테르화 반응

실시예 4에서 화합물 (1)을 분할하여 제조된 일차 분할된 에스테르 화합물 (S-1)을 알콜로 가수분해시킨후 LAK를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 이차 에스테르화 반응을 수행한 결과 96 %의 ee값을 갖는 화합물 (S-1)을 얻었다. 마찬가지 방법으로 이차 에스테르화 반응에 의해 얻어진 화합물 (R-1)의 광학 이성체 순도는 99 %를 나타내었다.

(S-1)-화합물 : [α]_D ²⁹= -16.26 (c 1.15, 클로로포름)

(R-1)-화합물 : [α]_D ²⁹= +16.92 (c 1.77, 클로로포름)

* 참고자료: J. Org. Chem. 1987, 52, 1309 - 1315

<실시예 9>

분할 효율을 높이기 위한 이차 가수분해 반응

실시예 7에서 화합물 (1a)을 분할하여 제조된 일차 분할된 화합물 (S)-1a를 LAK를 이용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 이차 가수분해 반응을 수행한 결과 97 %의 광학 이성체 순도를 갖는 화합물 (S-1a)을 얻었다. 마찬가지 방법으로 이차 가수분해 반응에 의해 얻어진 화합물 (R-1a)의 광학 이성체 순도는 95 %를 나타내었다.

<실시예 10>

(R)- 또는 (S)-2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-메탄술포닐옥시프로필)아세토니트릴 (6)의 합성

실시예 2에서 제조된 (R)- 또는 (S)-2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시프로필)아세토니트릴 (1) 0.38 g (1.4 mmol)을 무수 디클로로메탄 50 ㎖에 녹이고 트리에틸아민 0.97 ㎖ (6.9 mmol)을 첨가하고, 0 ℃에서 질소하에 메탄술포닐 클로라이드 0.12 ㎖ (1.53 mmol)를 천천히 적가하였다. 메탄술포닐 클로라이드를 전부 넣고 실온으로 온도를 올린 후 10 시간 교반시켰다. 유기층을 포화탄산나트륨 수용액으로 추출하고, 건조, 여과 증류하여 표제 화합물을 얻었다.

수율 99 %,¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.84-6.75 (m, 4H), 4.07 (t, J=6.03 Hz, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.04 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.35 (m, 1H), 1.11 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.72 (d, J=6.6 Hz, 3H),¹³C-NMR (300 MHz, CDCl₃) 149.20, 148.51, 129.80, 120.98, 111.81, 109.31, 69.51, 56.00, 53.01, 37.90, 37.24, 33.89, 25.92, 18.91, 18.53, IR (Neat) 2968, 1520, 1352, 1260, 1174, 1026, 808.

<실시예 11>

2-(3,4-디메톡시페닐)에틸아민 (2)의 합성

3,4-디메톡시아세토니트릴 1 g (5.6 mmol)을 에탄올 50 ㎖에 녹이고 활성화된 라니 니켈 50 ㎎을 넣고 12 시간 수소화시켜 조 생성물을 얻었다. 이것을 에틸아세테이트와 트리에틸아민 (20:1, 부피비)의 혼합 용매를 사용하여 컬럼 크로마토그래피하여 얻어진 화합물을 증류하여 목적하는 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸아민 (2)을 얻었다.

수율 90 % (0.92 g),¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.69-6.57 (m, 4H), 3.74 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 2.87 (t, J=6.76 Hz, 2H), 2.62 (t, J=6.76 Hz, 2H), 1.67 (s, 2H),¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃) 149.16, 147.70, 132.47, 121.00, 112.36, 111.67,56.09, 43.61, 39.39.

<실시예 12>

(R)- 또는 (S)-2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민 (7)의 합성

실시예 10에서 제조한 (R)- 또는 (S)-2-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-메탄술포닐옥시프로필)아세토니트릴 (6) 0.1 g (0.28 mmol)을 피리딘 30 ㎖에 용해시키고 실시예 11에서 제조한 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸아민 (2) 42.3 ㎎ (0.28 mmol)을 넣고 10시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 피리딘을 증류하여 제거한 다음, 디클로로메탄 50 ㎖ 및 포화 염화암모늄 수용액 50 ㎖를 넣어 유기층을 추출하여 표제 화합물을 얻었다.

수율 99 %,¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.71-6.49 (m, 6H), 3.77 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.55 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 2.60 (m, 2H), 2.52 (m, 2H), 2.30 (m, 2H), 2.10 (m, 1H), 2.03 (m, 2H), 1.81 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.14 (m, 4H), 0.77 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.73 (d, J=6.6 Hz, 3H), IR (neat) 2962, 2940, 2780, 2230, 1619, 1590, 1460, 1020, 803, 763 cm^-1.

<실시예 13>

(S)-(-)-베라파밀의 합성

실시예 12에서 제조한 (S)-2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민 0.16 g (0.36 mmol)을 무수 아세톤 20 ㎖에 녹이고 탄산칼륨 0.3 g (2.2 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 이 반응 용액에 요오드화메탄 0.11 ㎖ (1.8 mmol)를 첨가하고 24 시간 실온에서 교반시켰다. 아세톤을 증류하여 제거한 후, 디클로로메탄 50 ㎖ 및 물 10 ㎖을 넣은 후 유기층을 분리, 건조, 여과 증류하여 표제 화합물을 얻었다.

수율 95 %,¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.91-6.69 (m, 6H), 3.87 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.66 (m, 2H), 2.50 (m, 2H), 2.34 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.11 (m, 1H), 2.05 (m, 2H), 1.83 (m, 1H), 1.58 (m, 1H), 1.18 (m, 4H), 0.79 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.75 (d, J=6.6 Hz, 3H), IR (neat) 2962, 2942, 2789, 2232, 1609, 1593, 1467, 1028, 803, 763 cm^-1.

<실시예 14>

(R)-(+)-베라파밀의 합성

(R)-2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 13과 같은 방법으로 표제 화합물을 얻었다.

수율 95 %,¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.91-6.69 (m, 6H), 3.87 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.66 (m, 2H), 2.50 (m, 2H), 2.34 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.11 (m, 1H), 2.05 (m, 2H), 1.83 (m, 1H), 1.58 (m, 1H), 1.18 (m, 4H), 0.79 (d, J=6.6 Hz, 3H), 0.75 (d, J=6.6 Hz, 3H), IR (neat)2962, 2942, 2789, 2232, 1609, 1593, 1467, 1028, 803, 763 cm^-1.

본 발명에 따르면, 베라파밀의 제조에 사용하기 위한 베라파밀의 라세미 중간체를 가수분해 효소를 사용하여 높은 ee를 갖는 (R)- 및 (S)-이성체로 각각 분할할 수 있으며, 상기 분할된 (R)- 및 (S)-중간체로부터 순수한 (R)- 및 (S)-베라파밀을 각각 제조할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물의 라세미 혼합물을 가수분해 효소를 사용하여 아실기 함유 화합물의 존재하에 에스테르화 반응시켜 (R)- 및 (S)-이성체로 분리하고, 필요에 따라 얻어진 (R)- 및 (S)-이성체를 알콜로 가수분해시킨 후 상기 분할 과정을 반복하는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 라세미 혼합물의 분할 방법.
하기 화학식 1a의 화합물의 라세미 혼합물을 가수분해 효소를 사용하여 가수분해시켜 (R)- 및 (S)-이성체로 분리하고, 필요에 따라 상기 분할 과정을 반복하는 것을 특징으로 하는 화학식 1a의 화합물의 라세미 혼합물의 분할 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가수분해 효소가 LPS (수도모나스 세파시아 리파제), CCL (캔디다 루고사 리파제), LAYS (캔디다 루고사 리파제), LAK (수도모나스 플루오레슨스 리파제), LAS (아스펠지러스 니거 리파제), PPL (포신 판크레아틴 리파제), PLE (피그 리버 에스테라제), CE (콜린 에스테라제)로 구성되는 군으로부터 선택되고, 고체 지지체에 고정화되어 사용되는 방법
제1항에 있어서, 상기 아실기 함유 화합물이 비닐아세테이트, 아세트산 무수물, 이소프로페닐아세테이트, 비닐부티레이트, 프로판산 무수물, 부탄산 무수물, 비닐라우레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 에스테르화 반응이 0 내지 55 ℃에서 건조된 유기 용매 중에서 진행되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 가수분해가 0 내지 35 ℃에서 pH 7의 인산 완충 용액을 사용하여 진행되는 방법.
제5항에 있어서, 상기 유기 용매가 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 에틸 아세테이트, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 디에틸 에테르, 아세토니트릴, 디클로로에탄, 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 메탄올, 테트라히드로푸란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름알데히드, 디이소프로필 에테르 및 헥산/에틸아세테이트 (9/1 내지 5/5)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 트리에틸 아민, 피리딘, 피페리딘, 피페라진, 디이소프로필아민, 이미다졸, 탄산칼슘 및 나트륨 아세테이트와 같은 염기, 분자체 및 염화리튬으로 구성되는 군으로부터 선택되는 첨가제를 더 사용하는 방법.
(1) 제1항에 따라 제조된 (R)- 또는 (S)-이성체를 메탄술포닐 클로라이드 또는 톨루엔술포닐 클로라이드와 반응시켜 술폰 유도체를 제조하고,

(2) 상기 술폰 유도체를 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸아민과 반응시켜 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민을 제조하고

(3) 상기 2-(3,4-디메톡시페닐)에틸-4-시아노-4-디이소프로필-4-(3,4-디메톡시페닐)부틸아민을 메틸화 반응시키는

것을 포함하는 하기 화학식 8a 및 화학식 8b의 순수한 (R)-(+)- 및 (S)-(-)-베라파밀의 제조 방법.

<화학식 8a>

<화학식 8b>