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JPS63152393A - グリコシル誘導体 - Google Patents

グリコシル誘導体

Info

Publication number
JPS63152393A
JPS63152393A JP16189887A JP16189887A JPS63152393A JP S63152393 A JPS63152393 A JP S63152393A JP 16189887 A JP16189887 A JP 16189887A JP 16189887 A JP16189887 A JP 16189887A JP S63152393 A JPS63152393 A JP S63152393A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
reaction
polyethylene glycol
protein
mmol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP16189887A
Other languages
English (en)
Inventor
Isao Minami
南　功
Itsuo Ueno
上野　逸夫
Masahiko Fujino
藤野　政彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of JPS63152393A publication Critical patent/JPS63152393A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/08—Polyoxyalkylene derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C08G65/2603—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen
    • C08G65/2606—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen containing hydroxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生理活性蛋白質に化学修飾基を導入する化合
物などとして有用な高分子化合物に関する。
従来の技術 生理活性を有する蛋白質は有用な医薬として期待されて
いる。近年、遺伝子組み換え技術の発展にともない、生
理活性蛋白質を大量に製造することが可能になってきた
。しかし、生体に生理活性蛋白質を投与したとき、生体
内におけるクリアランスが非常に速いため、あるいは目
標とする細胞・組織への送達が悪いため有効な生理活性
を得ることができない場合がある。また、異種動物ある
いは微生物などヒト以外の生物体から得た生理活性蛋白
質をヒトに投与した場合には、免疫反応のため重篤な症
状を惹起する危険が予想される。従って、これらを医薬
として用いるに際しては、その活性を保持したまま、ク
リアランスを遅延させる、あるいは特定の細胞・組織へ
集中的に取り込ませる、あるいはその免疫反゛応誘発原
性（抗原性）を減弱させる技術の開発が望まれる。
上記したことのために、種々の化学修飾が試みられてき
た。
また、蛋白質の分別に用いることのできる高分子化合物
の検索が試みられてきた。
発明が解決しようとする問題点 前記のとおり、生理ｌ＆性蛋白質を化学修飾することが
試みられてきたが、本発明は、生理活性蛋白質を化学修
飾する新規な高分子化合物を提供するところにある。
また、蛋白質の分別に用いることのできる高分子化合物
を提供するところにある。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、生体内の糖蛋白質糖鎖のもつ生物学的意
義に注目した。即ち、糖鎖部分は、糖蛋白質の物理化学
的な性質の調節、蛋白質分解酵素に対する安定化、生物
における認識機構、あるいは認識機構に対する保護作用
の面できわめて重要な役割を果していると考えられてい
る。
一方、ポリエチレングリコール誘導体により修飾された
蛋白質は生体内におけるクリアランスが遅延され、また
、毒性・抗原性が低減することが知られている。そこで
糖鎖部分を有するポリエチレングリコール誘導体を合成
し、これを用いて蛋白質を修飾し、糖鎖部分の有する生
理活性とポリエチレングリコール修飾蛋白質の特性の両
方を有する蛋白質を得たところ、該修飾蛋白質は、生体
内におけるクリアランスが著しく遅延され、また毒性・
抗原性も著しく低減されていることを見い出した。また
、誘導体のあるものは、蛋白質の分別等に用いることが
できることを見い出した。本発明者らは、これらの知見
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。
本発明は、式 ％式％（） ［式中、Ｒはグリコジルを、ｍは任意に変わりうる正の
整数を、ｎはＩないし３の整数を、Ｚは−ＣＨＯ，−Ｃ
Ｈ２０Ｈまたは−ＣＯＯＨをそれぞれ示す。］で表わさ
れる化合物である。
上記式（Ｄ中、Ｒで示されるグリコジルとしては、単糖
類、オリゴ糖類のいずれでもよい。該単糖類としては、
たとえばアラビノピラノシル、キシロピラノシル、リキ
ソピラノシル、リボフラノシル等のアルドペントース、
グルコピラノシル、ガラクトピラノシル、マンノピラノ
シル、フコピラノシル等のアルドヘキソースからなる基
、２−アミノ−２−デオキシグルコピラノシル、２−ア
ミノ−２−デオキシガラクトピラノシル等のへキソザミ
ンからなる基、２−アセトアミド−２−デオキシグルコ
ピラノシル、２−アセトアミド−２−デオキシガラクト
ピラノシル等のへキソサミン誘導体からなる基、Ｎ−ア
セチルノイラミニル等のシアル酸からなる基などがあげ
られ、またオリゴ糖類基としては、たとえばラクトシル
、キシロビオシル、マルトシル、セロビオシル、キトビ
オシル、ビシアノシル、サンプビオシル、メリビオシル
、エビセロビオシル、ツラノシル、スクロシル、ラクツ
ロシル、ルチノシル等の二糖類基、ラフイノシル、ウン
ベリフェロシル、シアリルラクトシル、６′−ガラクト
シルラクトシル等の三糖類基、ジフコシルラクトシル、
ラクト−Ｎ−テトラオシル、ラクトーＮ−ネオテトラオ
シル等の四糖類基などが挙げられる。　グリコジル基が
ウロン酸又はウロン酸誘導体の形である場合、それらは
遊離のカルボキシル基であっても又はアルキル基でエス
テル化されたカルボキシル基を有する形であってもよい
。該基の例としては、グルクロン酸、ガラクツロン酸、
グルクロン酸メチル、セロビオウロン酸等が挙げられる
。
個々の糖単位間のグリコシド結合はα−およびβ−形で
あることができる。
上記式（１）においてＺが一〇　〇　ＯＨである場合、
その活性体でもよい。該活性体としては、たとえばアミ
ド化合物、活性エステル、活性チオエステルなどが挙げ
られる。
該アミド化合物としては、たとえばピラゾール。
イミダゾール、４−置換イミダゾール、ジメチルピラゾ
ール、ベンゾトリアゾール等の環内の窒素にアシル基が
結合した化合物が挙げられる。
該活性エステルとしては、たとえば４−ニトロフェニル
エステル、２．４−ジニトロフェニルエステル、トリク
ロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル
、メシルフェニルエステル等のエステルの他、■−ヒド
ロキシーＩ　Ｈ−２−ピリドン、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ベンゾトリア
ゾール等とのエステル等が挙げられる。
該活性チオエステルとしては、たとえば２−ピリジルチ
オール、２−ベンズチアゾリルチオール等の複素環チオ
ール等とのチオエステル等が挙げられる。
上記式（１）中、ｍで示される任意に変りうる正の整数
としては約２００以下が好ましく、とりわけ約５乃至１
００が好ましい。
前記した化合物（１）は、例えば次に示す反応式に従っ
て製造することができる。
（ｉ）　　化合物（１）においてＺ＝ＣＨＯである化合
物（１′）の製造法： ［上記式中、Ｒ，ｍおよびｎは前記と同意義を有する。
Ｒ′はＲ上の水酸基およびアミノ基をアセチルなどのア
シル基で保護した単糖類基またはオリゴ糖類基を、Ｙは
ハロゲン（例、フッ素原子、クロル原子、ブロム原子）
またはアセテート基を、Ｚ′は２−テトラヒドロピラニ
ル基またはベンジル基などの保護基をそれぞれ示す。］
。
化合物（ＶＩ）は、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＶ）とか
ら種々のグリコジル化法を用いて合成することができる
。例えば、Ｙがフッソ原子の場合には、５ｎＣＩ２．−
ＡｇＣ（２０，等のグリコジル化触媒の存在下に、また
Ｙがクロル原子、ブロム原子の場合には、ケーニッヒ・
シノール法（ベリヒテ（Ｂｅｒｉｃｈｔｅ）。
３４、９５７（１９０１））またはオルトエステル法（
リーセント・デベロプメンツ・イン・ザ・ケミストリー
・才ブ・ナチュラル・プロダクツ（ＲｅｃｅｎｔＤｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　ｏｆ　ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ）、　４．
７７（１９７２））により、またＹがアセテート基でＲ
′の２位にアセトアミド基を有するヘキソサミン誘導体
の場合には、オキサゾリン法（カーボハイドレート・リ
サーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、　７２．　Ｃｌ２−Ｃｌ４（１９
７９））により合成することができる。
化合物（ＶＩ）から化合物（■）への反応は、Ｚ′が２
−テトラヒドロピラニル基の場合には、約５０〜８０％
の酢酸−水中的６０〜１００℃で約０゜５〜３時間反応
させることが、またＺ′がベンジル基の場合には、メタ
ノール、エタノールあるいは酢酸溶液巾約１０％Ｐｄ−
Ｃを用いて接触加水素分解させるのが好ましい。
また、化合物（■）は、化合物（ＩＩＩ）と化合物（Ｖ
）とから化合物（Ｖｌ）を得たと同様の反応で得ること
もできる。
化合物（■）から化合物（■）への酸化反応は、ジクロ
ロメタン中、オキザリルクロリド、ジメチルスルホキシ
ドおよびトリエチルアミンを用いて約−７８〜−４０℃
でおこなうことが好ましい。
化合物（■）から化合物（１′）への反応は、例えば水
酸化ナトリウムのメタノール溶液中、約０〜４℃で約５
〜２０時間おこなうことが好ましい。
（ｉｉ）　　化合物（１）においてＺ＝ＣＨ，ＯＨであ
る化合物（Ｉ″）の製造法： （■′） （上記式中、Ｒ，Ｒ’、ｍおよびｎは前記と同意義を有
する。） 化合物（■″）は前記した化合物（■）を例えば約０〜
４℃にて水酸化ナトリウムのメタノール溶液で約５〜２
０時間処理することによって得られる。
また、前記した化合物（■′）を水溶液中で水素化ホウ
素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還
元剤と反応させることによっても化合物（■“）を得る
ことができる。
（ｉｉｉ　）　　化合物（Ｉ）においてＺ−−ＣＯＯＨ
である化合物（■″′）の製造法： （上記式中、Ｒ，Ｒ’、ｍおよびｎは前記と同意義を有
する。） 前記した化合物（■）から化合物（ＩＸ）への酸化は四
酸化ルテニウム法（ジャーナル・オブ・オーガニック・
ケミストリー　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、、　４６．
３９３６−３９３８．１９８１）により行なうことがで
きる。
化合物（ＩＸ）から化合物（Ｉ”）への変換は、例えば
約０〜４℃で約５〜２０時間、水酸化ナトリウムのメタ
ノール溶液で処理することによって行なうことができる
。
上記いずれの反応物も抽出、濃縮、再結晶、再沈澱、ク
ロマトグラフィーなど通常の化学的処理により精製する
ことができる。
各反応に用いる化合物において、反応に支障を及ぼす恐
れのある基を有する化合物は、自体公知の保護基（例、
ベンジル、トリチル、ベンジルオキシカルボニル、　ｔ
ｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ベンジリデン、イソプ
ロピリデン）で該基を保護して反応を行ない、反応後、
自体公知の脱保護反応に付し、目的とする化合物を得る
こともできる。
本発明の化合物（Ｉ′）および（１″′）は、たとえば
生理活性蛋白質に化学修飾基を導入する化合物として有
用である。
上記生理活性蛋白質としては、生理活性を有するものが
挙げられ、ヒトを含む各種動物由来のもの、微生物由来
のもの、植物由来のもの、遺伝子工学産物、合成品のい
ずれでもよい。たとえば、サイトカイン（例、各種イン
ターフェロン［インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、
インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロ
ン−γ（ＩＦＮ−γ）］、インターロイキン２（ＩＬ−
２））、ホルモン（例、生長ホルモン、インスリン）、
酵素（例、ウロキナーゼ、スーパーオキシドディスムタ
ーゼ（ＳＯＤ）、アスパラギナーゼ）、他の蛋白たとえ
ば免疫グロブリン、トリプシンインヒビター、各種プロ
テアーゼあるいはペプチダーゼ、各種チトクローム。
インスリン分泌活性化蛋白質（ＩＡＰ）、各種の阻害蛋
白質、ネオカルチノスタチン等が挙げられる。
とりわけ好ましい生理活性蛋白質として遺伝子組み換え
技術で生産される各種ＩＦＮ（ｒｌＦＮ−α。
ｒＴ　ＰＮ−β、ｒｌ　ＦＮ−７）、ｒＩ　Ｌ−２など
や動物および微生物由来のＳＯＤなどが挙げられる。
該蛋白質としては、その分子量が約５０００乃至約５０
０００のものが好ましく、とりわけ約１００００乃至約
３００００のものが好ましい。
上記化学修飾基は、生理活性蛋白質の一級アミノ基に結
合する。該−級アミノ基としては、Ｎ末端のアミノ基も
しくはりジン残基のε−アミノ基が挙げられる。
上記の化学修飾蛋白質は、例えば生理活性蛋白質と、式 ％式％（１） ［式中、Ｒ，ｍおよびｎは前記と同意義を有する。］で
表わされるアルデヒドとを還元剤の存在下反応させるこ
とにより製造することができる。
上記反応に用いる還元剤としては、たとえば水素化ホウ
素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどが挙
げられるが、中でもシアノ水素化ホウ素ナトリウムが反
応の選択性の点でより好ましい。
反応に際しては、化合物（Ｉ′）を生理活性蛋白質に対
して約１〜１００００倍モル程度、ポウ素糸還元剤は化
合物（Ｉ′）に対して約１〜５０倍モル程度用いればよ
く、蛋白質と化合物（■′）のモル比を増減すること、
あるいは蛋白質と化合物（Ｉ′）の反応液濃度を増減す
ることによって修飾の程度を任意に選択することができ
る。反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないものであれ
ばいずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝
液、酢酸緩衝液などの緩衝液があげられる。また、蛋白
質を失活させず、反応の支障にならない低級アルカノー
ル（例、メタノール、エタノール、ｌ−プロパツール）
、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホ
ルムアミドなどの有機溶媒を添加してもよい。反応のｐ
Ｈは約３〜１２の広い範囲で可能であるが、中性付近が
より望ましい。反応温度は蛋白質が変性しない温度であ
れば、いずれでもよいが約０°〜４０℃の範囲がより好
ましい。反応時間は約０．５〜７２時間、通常は約３〜
３０時間程度で十分である。反応液は、透析、塩析、限
外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ケルろ過、高
速液体クロマトグラフィー、電気泳動等の通常の蛋白質
の精製法で精製し、目的とする化学修飾蛋白質を得るこ
とができる。またアミノ基の修飾の程度は、例えば酸分
解のあと、アミノ酸分析を行なって算出することができ
る。
また、上記化学修飾蛋白質は、例えば生理活性蛋白質と
式 ％式％（） ［式中、Ｒ，ｍおよびｎは前記と同意義を有する。］で
表わされる化合物とを水溶性カルボジイミドなどの縮合
剤の存在下反応させることによって製造することができ
る。
上記反応に用いる縮合剤としては、たとえばｌ−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド　ハイドロクロリド、１−シクロへキシル−３−（２
−モルフォリノエチル）−カルボジイミド　メソーパラ
ートルエンスルフオナートなどが挙げられる。
反応に際しては化合物（Ｉ”）を生理活性蛋白質に対し
て約１〜１００００倍モル程度、水溶性カルボジイミド
は化合物（Ｉ”’）に対して約１〜５倍モル程度用いれ
ばよく、蛋白質と化合物（Ｖ″）のモル比を増減するこ
と、あるいは蛋白質と化合物（ビ′）の反応液濃度を増
減することによって修飾の程度を任意に選択することが
できる。反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないもので
あればいずれでもよいが、例えばリン酸緩衝液、トリス
緩衝液などの緩衝液もあげられる。また、蛋白質を失活
させず反応の支障にならない低級アルカノール（例、メ
タノール、エタノール、ｉ−プロノくノール）。
アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミドなどの有機溶媒を添加してもよＬ）。
反応のｐＨは約４〜ＩＯの広い範囲で可能であるが中性
付近がより望ましい。反応温度は蛋白質が変性しない温
度であれば、いずれでもよいが約０°〜４０℃の範囲が
より好ましい。反応時間は約０．５〜７２時間１時間１
約常〜３０時間程度で十分である。反応液は透析、塩析
、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過
、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等の通常の蛋
白質の精製法で精製し、目的とする化学修飾蛋白質を得
ることができる。また、蛋白質中のアミノ基の修飾の程
度は２，４．６−ドリニトロベンゼンスルホニツク　ア
ンド法（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１４．
３２８−３３６、１９６６）によって測定できる。
また、（Ｖ″）を用いて蛋白質を修飾するときには、活
性エステルあるいは活性アミド体に変換後、（Ｉ”’）
と同様に蛋白質の修飾に用いることができる。この場合
、水溶性カルボジイミドなどの縮合剤は用いる必要はな
い。
このようにして得られた化学修飾蛋白質は、生理活性蛋
白質の一部アミノ基の少なくとも一部に直接結合した式 ％式％（［） ［式中、Ｘは−ＣＨ２−または−ＣＯ−を示す。Ｒｌｍ
およびｎは前記と同意義を有する。］で表わされる基を
有するものである。
化学修飾される蛋白質が、Ｎ末端アミノ基のみを有する
場合は、上記で得られる化学修飾蛋白質はそのアミノ基
に直接結合した式（ＩＩ）で表わされる基を有するもの
である。また生理活性蛋白質中に１個以上のリジンを有
する場合は、そのε−アミノ基の一部に、好ましくはε
−アミノ基の約５乃至８０％（平均）とりわけ約ＩＯ乃
至６０％（平均）に直接結合した式（ＩＩ）で表わされ
る基を有するものであり、この場合、Ｎ末端アミノ基は
直接結合した式（ｎ）で表わされる基を有しても、有し
なくてもよい。
上記の化学修飾蛋白質は、対応している非修飾生理活性
蛋白質と同様の有用な生理活性を有し、医薬品などとし
て有用である。
上記の化学修飾蛋白質は、対応する公知の非修飾生理活
性蛋白質に比し、生体内におけるクリアランスが遅延さ
れ、長時間有効にその活性を示すのみならず、特定の細
胞・組織への送達が向上され、しかも毒性、抗原性も低
減され、公知の生理活性物質と同様の目的に、同様の方
法で安全に使用することができる。
上記の化学修飾蛋白質は、通常自体公知の担体。
希釈剤等を用い適宜の医薬品組成物（例、カプセル剤、
注射剤）として経口的または非経口的に哺乳動物（例、
サル、イヌ、ブタ、ウサギ、マウス、ヒト）に投与する
ことができる。
例えば、上記の化学修飾ｒＩＬ−２を腫瘍の予防、治療
剤として用いるには、たとえば注射剤、カプセル剤など
として、ｒＩＬ−２と同様の投与量、すなわち、極く少
量投与される。
上記の化学修飾ｒｌ　ＦＮ−γを抗ウィルス、抗腫瘍作
用、細胞増殖抑制、免疫増強のための医薬として用いる
には、たとえばｒＩ　ＦＮ−γの量とじて成人１日当り
約１０万〜１億ユニツトを静注又は筋注などにより投与
される。
上記の化学修飾ｒｌＦＮ−αＡを抗腫瘍または抗ウイル
ス治療のための医薬として用いるには、たとえばｒＩＦ
Ｎ−αＡの量として約（１〜１０）×１０５単位７日で
患者に注射投与しうる。
上記の化学修飾ＳＯＤを抗炎症剤として用いるには、た
とえば錠剤、注射剤などとして、ＳＯＤの量として１日
約１〜５　ｍｇ／ｋｇを哺乳動物に投与し得る。
化合物（Ｉ　”）はポリエチレングリコールと同様に蛋
白質の分別に用いることができ、この場合に使用される
濃度は約０〜７０％である。一般に蛋白質は沈澱として
得られるが、沈澱の形成は化合物（■″）の濃度、塩濃
度、イオン強度、　ｐ　Ｈなどによって著しく影響され
るため、蛋白質の高濃度溶液として得られることもある
。たとえば１、化合物（１″）を用いてヒト血漿蛋白質
の分別を行なうには、約４℃に冷却したヒト血漿蛋白質
溶液に５０％濃度の化合物（Ｖ′）を攪拌しながら所定
濃度まで加え約１０分放置したのち、３５，０００ｇで
３０分間遠心して沈澱を分取すればよい。上清の化合物
（１″）の濃度を段階的に順次増加させることにより血
漿蛋白質の分別ができる。
また、化合物（１″）はデキストランなどと２層系を形
成させ水性２層分配法にも用いることができる。この場
合に使用される濃度は約Ｏ〜７０％であるが通常は約１
〜３０％が使用される。蛋白質を水性２層分配法により
分別するためには例えば４．４％の化合物（■“）、７
．０％のデキストランＴ−５００（ファルマシア、スエ
ーデン）、０．１ＭＮａＣ１を含む０．０１Ｍの緩衝液
の系が用いられ、液を十分に混合して室温で１０分以上
放置したのち、２，０００ｇで５分遠心して２相に分離
し、上層あるいは下層を取ることにより蛋白質を分別す
ることができる。
化合物（■“）の使用は、いずれの場合もポリエチレン
グリコールによる分別効果に糖鎖による親和性の効果が
加味されることが期待される。
本明細書中、アミノ酸に関し略号で表示する場合は、Ｉ
　Ｕ　Ｐ　Ａ　Ｃ−Ｉ　ＵＢ　（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
　ｏｎ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａ
ｔｕｒｅ）による略号に基づく。
Ｌｙｓ　　：　　リジン 実施例 以下に実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものでは
ない。
実施例Ｉ　（β−Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレン
グリコール　アルデヒド体の合成）（ｉ）　　２，３，
４．６−チトラーＯ−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラ
ノシルポリエチレングリコールの合成 平均分子量１２００のポリエチレングリコールモノ−２
−テトラヒドロピラニル　エーテル９４８ｍｇ（０，７
９ミリモル）をニトロメタン８−に溶解し、シアン化第
二水銀１．４ｇ（５，５４ミリモル）１トリエライト（
Ｗ、Ａ、Ｈａｍｍｏｎｄ　Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ製）１ｇおよびＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチ
ルウレア４３３ｍｇ（３，７３ミリモル）を加え室温で
工０分間かきまぜた。この溶液にアセトブロムガラクト
ース１．５３ｇ（３，７３ミリモル）を無水ベンゼン８
旙に溶解した液を滴下した後、遮光して５５℃で２４時
間かきまぜた。冷後、反応液をクロロホルムで希釈し、
冷水１次いでヨー化カリウム３．７ｇおよび炭酸水素ナ
トリウム３ｇを水６０蔵に溶解した液、更に冷水で洗浄
し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下
留去し、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー
「シリカゲル：４０ｇ；溶出液：クロロポルム−メタノ
ール（９５：５）］にて分離精製して、テトラヒドロピ
ラニルエーテル体５２０ｍｇを得た。次いで、このもの
を酢酸−水（２：１）４．５滅に溶解し７０℃で１゜５
時間かきまぜた。反応液にトルエンを加え減圧下に乾固
した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー［
シリカゲル：１０ｇ；溶出液：クロロホルム−メタノー
ル（９：］）］にて分離精製して、目的物（淡黄色油状
物）３７０ｍｇ（３３％）を得た。
Ｎ　Ｍ　Ｒ（９０ＭＨ２，ＣＤＣ１３）δ：　１．９７
，２．０５および２．１４（１２Ｈ，各ｓ）、　３．６
７．４．５７（ＩＨ，ｄ）、　５．０５〜５．４２（３
Ｈ，ｍ）（ｉｉ）　　２，３，４．６−テトラ−０−ア
セチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレングリ
コール　アルデヒド体の合成 オギザリル　クロライド４６μ（２（０，５２ミリモル
）を塩化メチレン０．７４ｄに溶解し、−６０℃以下で
ジメチルスルホキシド７４μ１２（１，０４ミリモル）
の塩化メチレン溶液０．１５−を滴下した。５分後に（
ｉ）で得たアルコール体３７０ｍｇ（０，２６ミリモル
）の塩化メチレン溶液０．６−を滴下した。更に１５分
後にトリエチルアミン０．３４−を滴下し５分間かきま
ぜた。反応液を０℃に戻して水を加えた後、塩化メチレ
ンで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧
下に溶媒を留去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィ
ー［シリカゲル：ＩＯｇ；溶出液：クロロホルム−メタ
ノール（９：ｌ）］で分離精製し、目的物（淡黄色油状
物）２９０ｍｇ（７８％）を得た。
ＮＭＲ（９０ＭＨ２，ＣＤＣｌ！りδ：　１．９７，２
．０４および２，１３（１，２Ｈ，各ｓ）、　３．６６
．４．５６（ＩＨ，ｄ）、　５．０３〜５．４０（３Ｈ
，ｍ）（ｉｉｉ）　　β−Ｄ−ガラクトピラノシルポリ
エチレングリコール　アルデヒド体の合成 水酸化ナトリウム３２ｍｇ（０，８ミリモル）をメタノ
ール１．６滅に溶解し、（ｉｉ）で得たアルデヒド体２
９０ｍｇ（０，２ミリモル）を加え、冷蔵庫で１５時間
放置した。反応液に酢酸を加えて中和後、減圧下に溶媒
を留去した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフ
ィー［シリカゲル＝３ｇ；溶出液：クロロホルムーメタ
ノール（９：］）］で分離精製し、目的物（無色油）Ｉ
　Ｉ　Ｏｍｇ（４，３％）を得た。
２．４−ジニトロフェニルヒドラジン反応：陽性アンス
ロン反応：　陽性 実施例２　（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ
−グルコピラノシルポリエチレングリコール　アルデヒ
ド体の合成） （ｉ）　２−アセトアミド−３，４，６−トリー〇−ア
セチルー２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルポリ
エチレングリコールの合成 塩化第二鉄３４．Ｏｍｇ（２，１ミリモル）Ｎ、Ｎ、Ｎ
’。
Ｎ′−テトラメチルウレア２４４ｍｇ（２，１ミリモル
）およびトリエライト５４５　ｍｇを塩化メチレン１０
ｄに加え、室温で１０分間かきまぜた。この溶液に２−
アセトアミド−１，３，４，，６−チトラーＯ−アセデ
ルー２−デオキシ−β−Ｄ−グルコビラノース５４５ｍ
ｇ（１，４ミリモル）を加え１時間かきまぜた後、平均
分子量１２００のポリエチレングリコール　モノ−２−
テトラヒドロピラニル　エーテル６７２ｍｇ（０，５６
ミリモル）を加え、更に室温で２日間かきまぜた。反応
液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｙｄ中に注ぎ、
クロロホルムで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
した。減圧下に溶媒を留去し、得られた粗生成物をカラ
ムクロマトグラフィー［シリカゲル：１０ｇ；溶出液：
クロロホルム−メタノール（９５：５）］にて分離精製
して、テトラヒドロピラニルエーテル体０．８ｇを得た
。次いで、このものを酢酸−水混合溶液（２：１）６！
に溶解し、７０℃で１．５時間かきまぜた。反応液にト
ルエンを加え減圧下に乾固した。得られた粗生成物をカ
ラムクロマトグラフィー［シリカゲル：１０ｇ；溶出液
：クロロホルム−メタノール（９：　Ｉ　）］にて分離
精製して、目的物（淡黄色油状物）０．５ｇ（６７％）
を得た。
ＮＭＲ（９０ＭＨ２，ＣＤＣ１３）δ：　１．９５，１
．９９および２．０７（１２）１．各ｓ）、　３．６５
，４．７８（ＬＨ，ｄ）、　５．０２〜５．１．３（２
Ｈ，ｍ）。
６．６０（ｉＨ，ｄ） （ｉｉ）　　２−アセトアミド−３，４，６〜トリー〇
−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル
ポリエチレングリコール　アルデヒド体の合成 上記（ｉ）で得たアルコール体１．１ｇ（０，７７ミリ
モル）を上記実施例１−（ｉｉ）と同様に反応し処理し
て、目的物（淡黄色油状物）８１８ｍｇ（７４％）を得
た。
ＮＭＲ（９０ＭＨｚ、ＣＤＣＩＪδ、　１．９５，１．
９８および２．０３（１２Ｈ，各ｓ）、　３．６５，４
．７８（ＩＨ，ｄ）、　５．０２−５．１３（２Ｈ，ｍ
）。
６．６７（ＩＨ，ｄ） （ｉｉｉ）　　２−アセトアミド−２−デオキシ−β−
り一グルコピラノシルポリエチレングリコール　アルデ
ヒド体の合成 上記（１１）で得たアルデヒド体８１８＋ｎｇ（０，５
７ミリモル）を上記実施例１−（ｉｉｉ）と同様に反応
し処理して、目的物（無色油状物）３７０　ｍｇ（５０
％）を得た。
Ｎ　Ｍ　Ｒ（９０ＭＨ２，ＣＤＣｌ５）δ：　２．０４
（３Ｈ，ｓ）、　３．６７．４゜６３（ＩＨ，ｄ）、　
７．１６（ＩＨ，ｄ）２．４−ジニトロフェニルヒドラ
ジン反応：＠性実施例３　（β−Ｄ−グルコピラノシル
ポリエヂレングリコール　アルデヒド体の合成）（ｉ）
　　２，３，４．６−テト？−０−アセチル−β−Ｄ−
グルコピラノシルポリエチレングリコールの合成 平均分子量６００のポリエチレングリコールＩＯ，８ｇ
（１８ミリモル）をニトロメタン１８ｔｒｔｌＪこ溶解
し、シアン化第二水銀２．２７ｇ（９ミリモル）。
トリエライト６ｇおよびＮ、Ｎ、Ｎ　’、Ｎ　’−テト
ラメチルウレア０．７ｇ（６ミリモル）を加え室温で１
０分間かきまぜた。この溶液にアセトブロムダルコース
２．４６ｇ（６ミリモル）を無水ベンゼン１８滅に溶解
した液を滴下した後、遮光して５５℃で２４時間かきま
ぜた。冷後、反応液をクロロホルムで希釈し、冷水、次
いでヨー化カリウム６ｇおよび炭酸水素ナトリウム４．
８ｇを水９６−に溶解した液、更に冷水で洗浄し、有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、
得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー［シリカ
ゲル：５０ｇ；溶出液：クロロホルム−メタノール（９
７：３）］にて分離精製して、目的物（無色油状物）１
．７ｇ（３０％）を得た。
Ｎ　Ｍ　Ｒ（９０ＭＨｚ、　ＣＤＣｌ５）δ：　１．９
９，２．０２，２．０３および２．０７（ｉ２Ｈ，各ｓ
）、　３．６６．４．６１（１！Ｔ、ｄ）、　４．８８
−５．３３（３Ｈ，ｍ） （ｉｉ）　　２，３，４．６−テトラ−０−アセチルー
β−Ｄ−グルコピラノシルポリエチレングリコールアル
デヒド体の合成 上記（１）で得たアルコール体１．６４ｇ（１，７６ミ
リモル）を上記実施例１−（ｉｉ）と同様に反応し処理
して、目的物（無色油状物）９７０ｍｇ（６０％）を得
た。
ＮＭＲ（９０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ：　１．９９，２
．０１，２．０３および２．０７（＋、２Ｈ，各ｓ）、
　３．６６．４．６０（ＩＨ，ｄ）、　４．６６および
９．７６（ＩＨ，ＣＨＯ）、　４．８７−５．２３（３
Ｈ，ｍ）（ｉｉｉ）　　β−Ｄ−グルコピラノシルポリ
エチレングリコール　アルデヒド体の合成 上記（１１）で得たアルデヒド体９７０ｍｇ（１，０４
ミリモル）を上記実施例１−（ｉｉｉ）と同様に反応し
処理して、目的物（無色油状物）３４０ｍｇ（４３％）
を得た。
２．４−ジニトロフェニルヒドラジン反応：陽性アンス
ロン反応：陽性 実施例４　（β−Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレン
グリコール　モノカルボキシリック　アシッドの合成） （ｉ）　　２，３，４．６−テトラ−０−アセチルーβ
−Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレングリコール　モ
ノカルボキシリック　アシドの合成実施例３−（ｉ）の
方法に従って平均分子量６００のポリエチレングリコー
ルとアセトブロムガラクトースから合成した２、３，４
．６−チトラー〇−アセチルーβ−ガラクトピラノシル
ポリエチレングリコール８３４ｍｇ（０，９ミリモル）
に四塩化炭素ｊ、８ｄ、アセトニトリル１．８−および
水２．７戒を加え激しく攪拌した。これにＮａｌ０＜５
７７ｍｇ（２，３ミリモル）を加え直ちにルテニウムト
リクロライド結晶７ｍｇ（０，０２７ミリモル）を加え
室温で１時間反応させた。反応液を塩化メチレン１０滅
ずつを用いて３回抽出した。塩化メヂレン層を合し無水
硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に乾固し、淡黄色油
状物８１０ｍｇを得た。
ＮＭＲ（９０ＭＨ２，ＣＤＣｌ５）δ：　１．９ｇ、２
．０５および２．１５（１，２１（、各ｓ）、　３．６
５，４．５６（ＩＨ，ｄ）、　５．００〜５．４３（３
１（、ｍ）（１１）　　β−Ｄ−ガラクトピラノシルポ
リエチレングリコール　モノカルボキシリック　アシド
の合成 水酸化ナトリウム１７４．　ｍｇ（４，、４ミリモル）
を８．７滅のメタノールに溶かし、上記（１）で得たモ
ノカルボキシリック　アシド８１０ｍｇ（０，８７ミリ
モル）を加え冷蔵庫中で一夜反応させた。反応液に酢酸
を加えて中和後、減圧下に溶媒を留去した。得られた粗
生成物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル：２０
ｇ；溶出液　クロロホルム−メタノール−酢酸（７：３
：１）］で分離精製後、溶出液を減圧下に留去した。残
留物をクロロホルムに溶解後、水洗し、クロロホルム層
を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下でクロロホルムを留
去し、目的物（淡黄色油状物）３０ｍｇ得た。
ＮＭＲ（９０ＭＨ２，ＣＤＣｌ５）δ：　３．６６（−
０ＣＨ２ＣＩ（２０−）ＩＲ；　　１７３３ｃｍ−’　
（ＣＯＯＨ）アンスロン反応：　陽性 実施例５　（β〜Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレン
グリコールの合成） 実施例３−（ｉ）の方法に従って平均分子量６００のポ
リエチレングリコールとアセトブロムガラクトースから
合成した２、３，４．６−チトラー〇−アセチルーβ−
Ｄ−ガラクトピラノシルボリエヂレングリコール４９４
ｍｇ（０，５３ミリモル）を実施例１−（市）と同様に
処理し目的物１９０ｍｇ（淡黄色油状物）を得た。
ＮＭＲ（９０Ｍｔ（ｚ、ＣＤＣｌ５）δ：　３．６６（
−ＯＣＲ２ＣＨ２０−）アンスロン反応：　陽性 実施例６　（β−Ｄ−ガラクトピラノシルジエチレング
リコール　アルデヒド体の合成）（ｉ）　　２，３，４
．６−テトラ−０−アセデル−β３ｌ− −Ｄ−ガラクトピラノシルジエチレングリコールベンジ
ル　エーテル体の合成 ジエチレングリコール　モノベンジル　エーテル体５８
９ｍｇ（３ミリモル）をニトロメタン１９゜５７ｎ１に
溶解し、シアン化第二水銀３．４１ｇ（１３゜５ミリモ
ル）およびトリエライト３ｇを加え室温で１０分間かき
まぜた。この溶液にアセトブロムガラクトース３．６９
ｇ（９ミリモル）を無水ベンゼン１９．５滅に溶解した
液を滴下した後、遮光して５５℃で２４時間かきまぜた
。冷後、反応液をクロロホルムで希釈し、冷水、次いで
ヨー化カリウム１８ｇおよび炭酸水素ナトリウム１４．
６ｇを水３００滅に溶解した液、更に冷水で洗浄し、有
機層を硫酸すトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し
、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー［シリ
カゲル：５０ｇ；溶出液：クロロホルム層にて分離精製
して、目的物（無色油状物月、４．５ｇ（９２％）を得
た。
Ｎ　Ｍ　Ｒ（９０ＭＨ２，ＣＤＣ１３）δ：　１．９５
．２．００，２．０２および２．１２（１２Ｈ，各ｓ）
、　４．５５および４．９３（１）１．各ｄ）、　４．
５５（２Ｈ，ｓ）、　５．０２−５．４５（３Ｈ，ｍ）
、　７Ｊ１（５Ｈ，５）（ｉｉ）　　２，３，４．６−
テトラ−０〜アセデルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシルジ
エチレングリコールの合成 １０％Ｐｄ−Ｃ（５０％ｗｅｔ）０．９６ｇに上記（ｉ
）で得たベンジル　エーテル体１．３７ｇ（２，６ミリ
モル）を酢酸３２．５旋に溶解した液を加え、水素ガス
気流下にて室温で５時間かきまぜた。反応液をろ過し、
ろ液にトルエンを加え減圧下に乾固した。得られた粗生
成物をカラムクロマトグラフィー［シリカゲル：３０ｇ
；溶出液：クロロホルム−メタノール（９７：３）］に
て分離精製して、目的物（無色油状物）０．８ｇ（７１
％）を得た。
ＮＭＲ（９０ＭＨｚ、Ｃ’ＤＣ１３）δ：　］、、９７
，２．０３，２．０５および２．１３（１２Ｈ，各ｓ）
’、　４．５５および、１．９４（ＩＨｌｄ）、　５．
０５−５．４０（３Ｈ，ｍ） （ｉｉｉ）　　２，３，４．６−チトラーＯ−アセデル
ーβ−Ｄ−ガラクトピラノシルジエヂレングリコールア
ルデヒド体の合成 上記（１１）で得たアルコール体０．８ｇ（１，８ミリ
モル）を上記実施例１−（ｉｉ）と同様に反応し処理し
て、目的物（無色油状物）０．６７ｇ（８６％）を得た
。　ＮＭＲ（９０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）δ：　１．９７
，２．０３，２．０６および２．１４（１２）１．各ｓ
）、　４．５７および４．９５（ＩＨ，各ｄ）。
５．０４−５．４１（３Ｈ，ｍ）、　９．７１（ｓ）（
ｉｖ）　　β−Ｄ−ガラクトピラノシルジェヂレングリ
コール　アルデヒド体の合成 上記（ｉｉｉ）で得たアルデヒド体６６０ｍｇ（１，５
２ミリモル）を上記実施例１−（ｉｉｉ）と同様に反応
し処理して、目的物（無色粉末用８５ｍｇ（４６％）を
得た。
２．４−ジニトロフェニルヒドラジン反応：陽性アンス
ロン反応、陽性 参考例１　（ポリエチレングリコール修飾ＩＦＮ−ａＡ
の製造） （ｉ）　　オギザリル　クロライド０．４滅（４，４ミ
リモル）を塩化メチレン１０滅に溶解し、−６０℃以下
でジメチルスルホキシド０．６８滅（８，８ミリモル）
を塩化メチレン２７ｎ１に溶解した液を滴下した。５分
後に平均分子量１２００のポリエチレングリコール　モ
ノ−２−テトラヒドロピラニル　エーテル５ｇ（４ミリ
モル）を塩化メチレン４成に溶解した液を滴下した。更
に１５分後にトリエチルアミン２．８滅を滴下し５分間
かきまぜた。
反応液を０℃に戻して水を加えた後、塩化メチレンで抽
出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。
減圧下に溶媒留去し、得られた残留物に酢酸−水混合溶
液（２：１）３０−を加えて、７０℃で１．５時間かき
まぜた。反応液にトルエンを加え減圧下に乾固した。得
られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー１シリカゲ
ル：４０ｇ；溶出液：クロロホルム−メタノール（９５
：５）］にて分離精製して、目的物（淡黄色固型物）３
．５ｇ（８０％）を得た。
Ｎ　Ｍ　Ｒ（９０ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）δ・３．６５，
４．１５および９．７２（ＩＨ，５） （ｉｉ）　　特開昭５’ｌ−７９８９７号公報に記載の
方法で得られたＩ　ＦＮ−α（ｒＩ　ＦＮ−ａＡ）の溶
液５滅（蛋白量にして５　ｍｇ）を０．２Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）＋０．１５Ｍ食塩に対し、４℃で一夜
透析した。透析内液を取り出し、これに参考例１−（ｉ
）で得たポリエチレングリコール　モノアルデヒド一体
（平均分子量１１００）４５ｍｇを加え、４℃で５時間
かきまぜた。次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム１４
ｍｇを加え、４℃で２４時間かきまぜた。
反応液を２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０
）十０．１５Ｍ食塩に対し、４℃で２４時間透析した。
透析内液を取り出し、５ｅｐｈａｄｅｘＧ−７５のカラ
ム（２゜２ｘ４５ｃｍ）に注ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ５，０）＋０．１５Ｍ食塩で溶出
した。主溶出画分３Ｉ滅を集めた。この溶出液の蛋白質
含量は、牛血清アルブミンを標準としてローリ−法で測
定すると７６μｇ／滅であった。酸加水分解後のアミノ
酸分析によりＩＦＮ−α中の１１個のＬｙｓのうち４．
５個が修飾されていることがわかった。
酵素免疫測定法により活性を測定したところ、０゜８８
Ｘ］０７国際単位／ｍｇであった。
参考例２　（β−Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレン
グリコール修飾ＩＰＮ−ａＡの製造）（１）特開昭５７
−７９８９７号公報に記載の方法で得られたｒ　ＦＮ−
ａ（ｒｌ　ＦＮ−ａＡ）の溶液５−（蛋白質量にして５
　ｍｇ）を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）＋０．
１５Ｍ食塩に対し、４℃で一夜透析した。透析内液を取
り出し、これに実施例１−（ｉｉｉ）で得たアルデヒド
体（平均分子量１３００）８４ｍｇを加え、４℃で５時
間かきまぜた。次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム２
１ｍｇを加え、４℃で２４時間かきまぜた。反応液を２
５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）　＋　０
．１５Ｍ食塩に対し、４℃で２４時間透析した。透析内
液を取り出し、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５のカラム
（２，２ｘ４５ｃｍ）に注ぎ込み、２５ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ５，０）十０．１５Ｍ食塩で展開し
た。主溶出画分７６滅を集めた。この溶出液の蛋白質含
量は、牛血清アルブミンを標準としてローリ−法で測定
すると５４μｇ／７ｎｆｌであった。酸加水分解後のア
ミノ酸分析によりＩＦＮ−α中の１１個のＬｙｓのうち
２．４個が修飾されていることがわかった。酵素免疫測
定法により活性を測定したところ、０．２５ＸＩＯＢ国
際単位／ｍｇであった。
（１１）非修飾ＩＦＮ−α、参考例１−（ｉｉ）で得た
ポリエチレングリコール修飾ＩＦＮ−αおよび参考例２
で得たβ−Ｄ−ガラクトピラノシルポリエチレングリコ
ール修飾ＩＦＮ−αについて、非還元末端β−ガラクト
ースを特異的に認識し結合するヒママメレクチンをアガ
ロースゲルに固定化したＲ　ＣＡ　１２０−　Ａｇａｒ
ｏｓｅ（豊年製油製）を用いてアフィニティークロマト
グラフィーをおこなったところ、非修飾ＩＦＮ−αおよ
びポリエチレングリコール修飾ＩＦＮ−αは吸着されず
に素通りしたが、β−Ｄ〜ガラクトピラノシルボリエヂ
レングリコール修飾ＩＦＮ−αは吸着されることを認め
た。
それらの結果を第１図に示す。第１図において、（ａ）
　、　（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ非修飾ＩＦＮ−
ａ、参考例１−（ｉｉ）で得たポリエチレングリコール
修飾１１””Ｎ−α、および参考例２で得たβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシルボリエヂレングリコール修飾■ＦＮ−
αを用いて２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした時
の溶出パターンをそれぞれ示す。各図において、矢印Ｉ
は、食塩を０．１５Ｍ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）にそれぞれの試料が溶解している試料溶液をチ
ャージした位置、矢印２は、溶出液を食塩を０．１５Ｍ
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）からメチルβ
−Ｄ−ガラクトピラノシド１０ｍＭおよび食塩を０．１
５Ｍ含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に切り換
えた位置、および矢印３は、溶出液をもとの食塩を０．
１５Ｍ含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に変え
た位置をそれぞれ示す。
参考例３　（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ
−グルコピラノシルポリエヂレングリコール修飾ＩＦ’
Ｎ−αＡの製造） （１）上記実施例２−（ｉｉｉ）で得たアルデヒド体（
平均分子量１３００）５３ｍｇ、シアノ水素化ホウ素ナ
トリウム１４ｍｇを用いて、参考例２と同様に■ＦＮ−
αと反応させ、処理して主溶出画分４２゜５−を集めた
。この溶出液の蛋白質含量は、８６μｇ／−であった。
アミノ酸分析によりＩＦＮ−α中の１１個のＬｙｓのう
ち４．６個が修飾されていることがわかった。酵素免疫
測定法により活性を測定したところ、０．７０ｘ１０７
国際単位／ｍｇであった。
（１１）上記実施例２　　（ｉｉｉ）で得たアルデヒド
体（平均分子量］　３００）１０７ｍｇ、シアノ水素化
ホウ素ナトリウム２８ｍｇを用いて、参考例２と同様に
１ＰＮ−αと反応させ、処理して主溶出画分２４．５戒
を集めた。この溶出液の蛋白質含量は、■３８μｇ／−
であった。アミノ酸分析によりＩＦＮ−α中の１１個の
Ｌｙｓのうち６．９個が修飾されていることがわかった
。酵素免疫測定法により活性を測定したところ、０．８
３ｘｌＯ６国際単位／ｍｇであった。
（ｉｉｉ　）　　非修飾ＩＰＮ−α、参考例１−（ｉｉ
）で得たポリエチレングリコール修飾ＩＦＮ−αおよび
（Ｉ）と（ｉｉ）で得た２−アセトアミド−２−デオキ
シ−β−Ｄ−グルコピラノシルボリエヂレングリコール
修飾ＩＰＮ−αについて、非還元末端β−Ｎ−アセチル
グルコサミンを特異的に認識し結合する小麦胚芽レクチ
ンをアガロースゲルに固定化したＷ　Ｇ　Ａ　−Ａｇａ
ｒｏｓｅ（豊年製油製）を用いてアフィニティークロマ
トグラフィーをおこなったところ、非修飾ＩＦＮ−αお
よびポリエチレングリコール修飾ＩＦＮ−αは吸着され
ずに素通りしたが、２−アセトアミド−２−デオキシ−
β−Ｄ−グルコピラノシルポリエチレングリコール修飾
ＩＦＮ−αは吸着されることおよび修飾率が大きくなる
ほど吸着の度合が大になることを認めた。
それらの結果を第２図に示す。第２図において（ａ）’
、　（ｂ）　、　（ｃ）および（ｄ）は、非修飾ＴＰＮ
−ａ、参考例１−（ｉｉ）で得たポリエチレングリコー
ル修飾ＩＰ’Ｎ−α、（ｉ）および（ｉｉ）で得た２−
アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシ
ルポリエチレングリコール修飾ＩＦＮ−αを用いて２８
０ｎｍにおける吸光度をモニターした時の溶出パターン
をそれぞれ示す。各図において、矢印１は、食塩を０．
１５Ｍ含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，
０）にそれぞれの試料が溶解している試料溶液をチャー
ジした位置、矢印２は、溶出液を食塩を０．１５Ｍ含む
２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５，０）から２
−プロペニル　２−アセトアミド−２−デオキシ−β−
Ｄ−グルコピラノンドを１０ｍＭおよび食塩を０．１５
Ｍ含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム綬衝液（ｐＨ５，０）
に切り換えた位置、および矢印３は、溶出液をもとの食
塩を０．１５Ｍ含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（
ｐＨ５，０）に変えた位置をそれぞれ示す。
発明の効果 式（Ｉ′）および（１″′）で表わされる高分子化合物
は、効率良く生理活性蛋白質を修飾することができ、こ
のようにして得られた化学修飾蛋白質は、対応する非修
飾蛋白質に比し、生体内持続性が向上され、特定の細胞
・組織への送達が向上され、毒性および抗原性の低減も
期待されるので、たとえば医薬として有利に、安全に使
用することができる。
また、式（■″）で表わされる高分子化合物は、効率良
く蛋白質を分別することができるので、たとえば蛋白質
分別のための試薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】 第１図および第２図は、参考例２および３に示した修飾
蛋白質の固定化レクチンに対する結合能をそれぞれ示す
。 築　２ （Ｃ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 式 Ｒ−Ｏ−（ＣＨ＿２・ＣＨ＿２・Ｏ）＿ｍ−（ＣＨ＿２
    ）＿ｎ−Ｚ［式中、Ｒはグリコシルを、ｍは任意に変わ
    りうる正の整数を、ｎは１ないし３の整数を、Ｚは−Ｃ
    ＨＯ、−ＣＨ＿２ＯＨまたは−ＣＯＯＨをそれぞれ示す
    。］で表わされる化合物。
JP16189887A 1986-07-03 1987-06-29 グリコシル誘導体 Pending JPS63152393A (ja)

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