JPH061271B2

JPH061271B2 - カテコ−ルアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造法およびそれに使用する抗原

Info

Publication number: JPH061271B2
Application number: JP61037252A
Authority: JP
Inventors: 正則吉岡; 正人杉
Original assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd; Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Fujifilm RI Pharma Co Ltd; Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1985-02-27
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: JPS6211165A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、カテコールアミンの酸性代謝物に対する抗体
の製造法およびそれに使用する抗原に関するものであ
る。

〔従来技術および問題点〕

カテコールアミン産生腫瘍として、成人では褐色細胞
腫、小児では神経芽細胞腫が知られている。その診断に
はカテコールアミンの酸性代謝物であるホモバニリン酸
（ＨＶＡ）とバニルマンデル酸（ＶＭＡ）を測定するこ
とが行われている。これらの物質は最終代謝物であるた
め、カテコールアミンや中間代謝物に比べ、数百〜数千
倍の高濃度で尿中に排泄されている。

ＨＶＡやＶＭＡの分析法としては、比色法、蛍光法、ガ
スクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などが開発されて
いる。これらの分析法のうち、比色法は簡便迅速に分析
が行われる利点を有し、１次スクリーニングとして現在
利用されているが、ジアゾカップリング反応による呈色
の判定を肉眼で行うため、精度が低く、また他のフェノ
ール性化合物にも妨害されるため、特異性に問題が残っ
ている。正確度において優れているＨＰＬＣも、多種類
の検体の測定には簡便さに欠ける。

一方、カテコールアミンおよびメチル化カテコールアミ
ンの抗原および抗体に関する研究はすでに報告されてい
る（吉岡，Methods in Biogenic Amine Research,ｐ２
９５〜３０９、Elsevier Science Publishers B.V.,１
９８３、特公昭５６−４９３１２号公報）。しかし、カ
テコールアミンの酸性代謝物の抗原および抗体に関する
報告はない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、カテコールアミンの酸性代謝物の免疫学的測
定に使用されうるそれらに対して特異的に抗体を製造す
る方法、およびその抗体の製造に使用する抗原を提供す
ることを目的とするものである。

すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は水素原
子または水酸基を示す）で表されるカテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体を、抗原を動物に免疫させて得
る方法において、抗原として一般式（II）（式中、Ｒ_１及びＲ_２は前記と同意義であり、−ＮＨ−
Ｑは担体タンパク質またはペプチドを意味する）で模式
的に表示され、かつ担体タンパク質またはペプチド１モ
ル当たりカテコールアミンの酸性代謝物が２９〜３７モ
ル結合したものを使用することを特徴とする抗体の製造
法に関するものである。さらに本発明は、その抗体の製
造に使用される前記一般式（II）で模式的に表され、か
つ担体タンパク質またはペプチド１モル当りカテコール
アミンの酸性代謝物が２９〜３７モル結合した、カテコ
ールアミンの酸性代謝物に対する抗体の製造に使用する
抗原に関するものである。

本発明において「カテコールアミン酸性代謝物」は前記
一般式（Ｉ）で表わされ、具体的にはたとえばジヒドロ
キシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ；Ｒ_１＝Ｒ_２＝Ｈ）、ジ
ヒドロキシマンデル酸（ＤＯＭＡ；Ｒ_１＝Ｈ，Ｒ_２＝Ｏ
Ｈ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ；Ｒ_１＝CH₃，Ｒ_２＝
Ｈ）、バニルマンデル酸（ＶＡＭ；Ｒ_１＝CH₃，Ｒ_２＝
ＯＨ）などが挙げられる。

本発明の抗原は、カテコールアミンの酸性代謝物のカテ
コールまたはメチルカテコール骨格と担体蛋白質または
ペプチドのアミノ基とをマンニッヒ反応により結合させ
たものであり、特異性の高い優れた抗体を産性させるこ
とができる。

担体蛋白質またはペプチドとしては、ハプテン抗原作成
に使用しうるものであればよく、たとえば哺乳動物の血
清アルブミン、γ−グロブリンなどの蛋白質、ポリリジ
ンなどのペプチドなどが用いられる。さらに、これらの
担体蛋白質またはペプチドに末単に１級アミノ基を有す
るスペーサー（たとえば、アミノアルキルシラン残基、
アミノ酸残基、ω−アミノアルキルアミノ残基など）を
導入したものを使用することができる。

マンニッヒ反応は、たとえばカテコールアミンの酸性代
射物をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）などの担体に対して、数十〜数百
倍モル量用い、水に溶解後、過剰量のホルムアルデヒド
および酢酸塩緩衝液を加えて室温でまたは加温して数日
間反応させることにより行うことができる。

反応後、たとえば蒸留水などに対して１０℃で数回透析
し、過剰のホルムアルデヒドおよびカテコールアミンの
酸性代謝物を除去し、凍結乾燥することにより抗原を得
ることができる。

かくして得られる抗原の一例の理化学的性質は次のとお
りである。

Ａ．セルロースアセテート膜電気泳動実施例１および２で調製した抗原溶液（約５mg／ml）１
μをセルロースアセテート膜に添加する。４℃、１mA
／cmで１５〜２０分間０．０７Ｍベロナール緩衝液（pH
８．６）で泳動する。ポンソ３Ｒで染色後、１％酢酸で
脱色し、乾燥する。

ハプテンを除いて抗原調製法と同様にして調製したＨＳ
Ａ（ＨＣＨＯ−ＨＳＡ）を対照とする。

ε−ジニトロフェニルリジン（ε−ＤＮＰ−Lys）を原
点とし、プロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）の移動度
を＋１．００とした。各移動度は次のとおりであった。

上表に明らかなように、酸性代謝物がＨＳＡに結合する
ことにより、ＨＳＡは酸性となり、陽極に対照のＨＳＡ
より大きく移動している。

Ｂ．酸性代謝物の結合量酸性代謝物の担体蛋白質の結合量は、２８０nm付近の極
大波長における抗原反応液の透析後の吸光度の増加率よ
り、ハプテンの結合モル比を算出する。

ハプテンは０．０２５mg／ml、抗原およびＨＣＨＯ−Ｈ
ＳＡは０．５mg／mlの濃度で、ＨＣＨＯ−ＨＳＡを比較
対照として用いる。

この結果、実施例１および２で得られたものは１５〜４
０モルのハプテンが１モルの担体に結合していた。ハプ
テンの平均結合モル比は、１モルのＨＳＡあたりＨＶＡ
３７モル、ＶＭＡ２９モルであった。この比と、電気泳
動度は比例していた。

本発明抗原を用いたカテコールアミン酸性代謝物に対し
て特異的な抗体を製造する方法は常法によればよい。

たとえば、前記のようにして得られた抗原をりん酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１ＭＫＨＰＯ_４、０．
１５ＭＮａＣｌ，pH７．４）に溶解させ、等量のフロ
インドの補助液（Complete Freund′s Adjuvant）と混
合し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンをウシ、ウサギ、ヒツジ、
ラット、マウス、モルモット等の哺乳動物に投与し、２
週〜数ヶ月間の適当な時期に追加免疫を行って抗血清を
得ることができる。

また、このようにして免疫を獲得した動物から抗体産生
細胞を取得し、ミエローマ細胞と細胞融合することによ
りハイブリドーマを得、モノクローナル抗体を産生させ
ることもできる。細胞融合法の詳細について総説、成
書、たとえば岩崎辰夫ら著「単クローン抗体−ハイブリ
ドーマとＥＬＩＳＡ−」、株式会社講談社、昭和５８年
２月２０日発行などのの記載を参照することができる。

得られた抗血清については、必要に応じて担体の抗体を
吸収した後、二重拡散法（O.Ouchterlony,Handbook of
Experimental Immunology,１９，１３（１９７３））に
よってそれぞれの抗原に特異性のある抗体であることが
確かめられた。

さらに、抗血清の特異性は、酸素免疫測定法（ＥＩＡ）
により確認することができた。

ＥＩＡは、次のような手順で行った。すなわち、一定量
の抗原を塩化ビニル製マイクロプレートに吸着させ、こ
れに抗血清を希釈して加えて抗体を反応させる。この時
の抗血清に、抗原試料の場合はそのまま、ハプテン試料
の場合はＨＳＡとマンニッヒ反応後希釈して試料を加え
る。アルカリ性ホスタファーゼ標識第二抗体を反応させ
る。プレートを洗浄後、基質であるｐ−ニトロフェニル
ホスフェートを加えて酵素反応させる。反応後、生成す
るｐ−ニトロフェノールをアルカリ性で400nmの吸光度
を測定する。

実施例３で得られたＨＶＡに対する抗血清（Ａnti-ＨＶ
Ａ）は、第１図に示したようにＨＶＡ−ＨＳＡにＶＭＡ
−ＨＳＡより低濃度で反応する。また、実施例４で得ら
れたＶＭＡに対する抗血清（Ａnti-ＨＶＡ）では、第２
図に示すように、ＶＭＡ−ＨＳＡにＨＶＡ−ＨＳＡより
低濃度で反応する。しかし、これらの抗血清は、いずれ
もハプテンであるＨＶＡおよびＶＭＡとは高濃度でなけ
れば反応しないので、ハプテン相互の特異性を比較する
ために、マンニッヒ反応でＨＶＡまたはＶＭＡをＨＳＡ
と結合させて抗原と同一構造にして試験した。

実施例３で得られたＡnti-ＨＶＡは、第３図に示したよ
うに、ＨＶＡ−ＨＳＡと最も低濃度で反応し、ＶＭＡ−
ＨＳＡ、ＤＯＰＡＣ−ＨＳＡ、バニルピルビン酸（ＶＰ
Ａ）−ＨＳＡ、メタネフリン−ＨＳＡおよびＨＣＨＯ−
ＨＳＡの順に交叉が弱くなった。

一方、同様に実施例４で得られたＡnti-ＶＭＡは、第４
図に示したようにＶＭＡ−ＨＳＡと最も強く反応した。

〔効果〕

本発明による抗原を免疫に用いることにより、カテコー
ルアミンの酸性代謝物に特異的な抗体を産生させること
ができる。したがって、これらの抗体を用いる免疫学的
測定法によりカテコールアミン産生腫瘍の診断等に有用
なカテコールアミン酸性代謝物の測定を正確かつ間便に
行うことが可能になる。

〔実施例〕実施例１ＨＶＡ抗原の調製ＨＶＡ０．３ミリモルおよびＨＳＡ１００mgを０．３Ｍ
炭酸水素ナトリウム１．０mlに溶解させ、これに３７％
ホルマリン０．２mlを加え、pH6.0〜７．０になるよう
に３Ｍ酢酸ナトリウムで調製した。共栓試験管の空間部
を窒素ガスで置換し、２０±３℃で約７０時間遮光放置
した。反応後、１０℃の蒸留水で数回透析し、凍結乾燥
し、−１８℃で保存してＨＶＡ抗原（ＨＶＡ−ＨＳＡ）
を得た。

実施例２ＶＭＡ抗原の調製ＨＶＡの代りにＶＭＡを用いて実施例１と同様に操作し
てＶＭＡ抗原（ＶＭＡ−ＨＳＡ）を得た。

実施例３ＨＶＡに対する抗体の調製ＨＶＡ−ＨＳＡＯ．１７〜７５μｇを完全にアジュバン
ドに溶解させた。これを、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ×ＤＢ
Ａ，Ｆ_１，雄，５週令）に１週間予備飼育した後、腹腔
内投与し、以後２週間から数ヶ月の間隔で０．１７〜４
０μｇのＨＶＡ−ＨＳＡを不完全アジュバンドに溶解さ
せ、数回投与した。採血により、ＨＶＡ−ＨＳＡの抗血
清（Ａnti−ＨＶＡ）を得、凍結乾燥して−１８℃で保
存した。

実施例４ＶＡＭに対する抗体の調製ＨＶＡ−ＨＳＡの代りにＶＭＡ−ＨＳＡを使用して実施
例３と同様に操作してＶＭＡ−ＨＳＡの抗血清（Ａnti
−ＶＭＡ）を得た。

参考例酸素免疫測定法抗原は、ＰＢＳpH７．３で２００μｇ／mlより倍々
希釈する。塩化ビニル製のマイクロプレートに５μｌ／
well塗布し、直ちに２５℃で１時間吸着させる。

溶液を除去し、０．０５％ツイーン（Tween）２０
のＰＢＳ溶液（ｔＰＢＳ）１００μ／wellを分注し、
ブロッキングする。これを３回くり返す。

第一抗体である抗血清はｔＰＢＳで希釈する。抗原
の場合はそのまま、ハプテンの場合はＨＳＡとマンニッ
ヒ反応後、それぞれの抗血清で倍倍希釈して用いる。こ
れを３７℃で１０分間反応させた後、マイクロプレート
に各濃度５μ／well分注し、３７℃で１時間反応させ
る。ハプテンに対するマンニッヒ反応は抗原の調製法を
応用する。すなわち、ＨＶＡまたはＶＭＡ100μｇをＰ
ＢＳ１００μに溶解させ、さらにＨＳＡ１mgを加えて
溶解させ、次いで３５％ホルマリン２１μを加え、３
７℃の１時間反応させる。

ｔＰＢＳで２回洗浄後、第二抗体であるアルカリ性
ホスファターゼ標識抗マウス１ｇＧを２５μ／well分
注し、３７℃で１時間反応させる。

ｔＰＢＳで３回洗浄した後、酵素基質として１６mM
ｐ−ニトロフェニルホスフェイトとなるよう１mM塩化マ
グネシウム含有１００mM炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH
９．８）で希釈する。２５μ／well分注し、３７℃で
１時間酵素反応させる。反応停止には０．１Ｎ水酸化ナ
トリウム２５μ／wellを分注する。

反応液４０μを、さらに０．１Ｎ水酸化ナトリウ
ム５００μで希釈後、波長４００nmにて吸光度を測定
する。

実施例５Ｉ．ハイブリドーマの取得ＶＭＡ−ＨＳＡ（１mg／μ）を生理食塩水に溶解さ
せ、完全フロインドアジュバンドと１：１で混合してエ
マルジョンとしたものを、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６
週冷）に２週間おきに数回腹腔内投与し、最後にＶＭＡ
−ＨＳＡ５０μｇを静注した。

最終免疫から３日後にマウスの脾細胞を取り出し、イー
グル最少基本倍地（ＭＥＭ）で洗浄した。マウスミエロ
ーマＭＯＰＣ−２１ライン由来のＰ_３／Ｘ６３−Ａｇ８
Ｕ_１（Ｐ_３Ｕ_１）（Current Topics in Micro biology
and Immunology,８１，ｐ１−７（１９７８））をＭＥ
Ｍで洗浄し、脾細胞とＰ_３Ｕ_１を１０：１で混合して遠
心後、ペレットに５０％ポリエチレングリコール１００
０イーグル最少基本培地（ＭＥＭ）溶液１mlを徐々に加
えて細胞融合を行わせた。さらにＭＥＭ溶液を徐々に加
え、最終的に１０mlとした。再び遠心し、ペレットを１
５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０倍地にＰ_３Ｕ_１
として１×１０^５cell／0.1mlとなるように懸濁させ、
９６穴マイクロプレートに０．１mlずつまいた。

１日後、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン
（ＨＡＴ）培地を０．１mlずつ添加し、その後３〜４日
ごとに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換した。７
日間当たりから、いくつかのウェルでハイブリドーマの
生育が認められた。

ハイブリドーマが生育してきたウェルの上清０．０５ml
を取り、それぞれ予めＶＭＡ−ＨＳＡおよびＨＳＡでコ
ートした９６穴マイクロプレートに添加した。アジビン
Ｄ−酵素結合体としてアジビンＤ−ペルオキシダーゼ
（ベクター社製）、基質および発色剤として過酸化水
素、４−アミノアンチピリン、フェノールを用いてＥＬ
ＩＳＡ法により、ＶＭＡ−ＨＳＡとは反応するが、ＨＳ
Ａとは反応しないものを選び、限界希釈法によりクロー
ニングを行った。

その結果、ＶＭＡ−ＨＳＡに特異性を有する抗体を産生
するハイブリドーマ８株を取得した。

II．単一クローン抗体の生産ハイブリドーマＶＭ１、ＶＭ２、ＶＭ３、ＶＭ４、ＶＭ
５、ＶＭ６、ＶＭ７、ＶＭ８株をそれぞれ１５％ウシ胎
児血清含有ＲＰＭＩ1640培地で９６穴マイクロプレー
ト、２５cm²フラスコ、７５cm²フラスコとスケールアッ
プしながら培養し、培養上清を集めた。

III．抗体のサブクラスの決定９６穴マイクロプレートに各単一クローン抗体をコート
し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後、ＭＯ
ＮＯＡＢＩＤＥＩＡＫＩＴ（ＺＹＭＥＤ社製）によ
り抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＧ_１抗体、抗ＩｇＧ_２ａ抗体、
抗１ｇＧ_２ｂ抗体、抗ＩｇＧ_３抗体、抗ＩｇＭ抗体との
反応を見て、各単一クローン抗体のサグクラスを決定し
た。

またＬ鎖の抗χ抗体、抗λ抗体との反応性を調べてタイ
プを決定した。

その結果、ＶＭ１、ＶＭ３、ＶＭ４、ＶＭ６の４株の産
生するモノクローナル抗体がＩｇＧ_１，χ、ＶＭ２株の
産生するモノクローナル抗体がＩｇＧ，λ、ＶＭ８株の
産生するモノクローナル抗体がＩｇＧ_２ａ，χ、ＶＭ７
株の産生するモノクローナル抗体がＩｇＧ_２ｂ，χであ
った。

実施例６ＨＶＡ抗原の調製ＨＶＡ３ミリモルおよび１，６−ヘキサンジアミン３ミ
リモルに蒸留水１６０μと、３７％ホルマリン３１０
μを加え、８０℃で１時間反応させ、ＨＶＡと１，６
−ヘキサンジアミンの結合物を得た。

この結合物１０mg、ＨＳＡ１０mgおよびＤＣＣ２０mgを
５０mMクエン酸緩衝液に溶解させた後、pHを６〜７に調
整し、総液量を１ml程度とした。４℃で約１２時間遮光
放置して反応させ、ＰＢＳで数回透析し、ＨＶＡを１，
６−ヘキサンジアミン基（ｈｄ）を介してＨＳＡと結合
させたＨＶＡ抗原（ＨＶＡ−ｈｄ−ＨＳＡ）を得た。

実施例７ＶＭＡ抗原の調製ＨＶＡの代りにＶＭＡを用いて実施例６と同様に操作し
てＶＭＡを１，６−ヘキサンジアミノ基を介してＨＳＡ
と結合させたＶＭＡ抗原（ＶＭＡ−ｈｄ−ＨＳＡ）を得
た。

実施例８ＨＶＡ−ｈｄ−ＨＳＡを用いて実施例５と同様に操作し
てＨＶＡ−ｈｄ−ＨＳＡに特異性を有する抗体を産生す
るハイブリドーマ５株、ＨＶ41、ＨＶ42、ＨＶ43、ＨＶ
44、ＨＶ45株を取得した。

これらのハイブリドーマから実施例５と同様にしてＨＶ
Ａに対するモノクローナル抗体を調製し、それぞれのサ
ブクラスを決定した。その結果、ＨＶ41、ＨＶ42、ＨＶ
43、ＨＶ45株の産生するモノクローナル抗体がＩｇ
Ｇ_１，κ、ＨＶ44株の産生するモノクローナル抗体がＩ
ｇＧ_２ａ、χであった。

また、これらの抗体の力価ならびに特異性がＥＬＩＳ、
法によって調べたところ、全てがＨＶＡに対して高い特
異性を示すことがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例で得られたホモバニリン酸に対
する抗血清（anti-ＨＶＡ）とホモバニリン酸抗原（Ｈ
ＶＡ−ＨＳＡ）およびバニルマンデル酸抗原（ＶＭＡ−
ＨＳＡ）との反応を示し、第２図は、同じくバニルマン
デル酸に対する抗血清（anti-ＶＭＡ）とＨＶＡ−ＨＳ
ＡおよびＶＭＡ−ＨＳＡとの反応を示す。第３図は、an
ti-ＨＶＡとハプテンおよび類縁体との反応を示し、第
４図はanti-ＶＡとハプテンおよび類縁体との反応を示
す。なお、図中ＶＰＡはバニルピルビン酸、ＤＯＰＡＣ
はヒドロキシフェニル酢酸を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は水素原
子または水酸基を示す）で表されるカテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体を、抗原を動物に免疫させて得
る方法において、抗原として一般式（II）（式中、Ｒ_１及びＲ_２は前記と同意義であり、−ＮＨ−
Ｑは担体タンパク質またはペプチドを意味する）で模式
的に表され、かつ担体タンパク質またはペプチド１モル
当りカテコールアミンの酸性代謝物が２９〜３７モル結
合したものを使用することを特徴とする抗体の製造法。
【請求項２】一般式（II）（式中、Ｒ_１は水素原子またはメチル基、Ｒ_２は水素原
子または水酸基、−ＮＨ−Ｑは担体タンパク質またはペ
プチドを意味する）で模式的に表され、かつ担体タンパ
ク質またはペプチド１モル当りカテコールアミンの酸性
代謝物が２９〜３７モル結合した、カテコールアミンの
酸性代謝物に対する抗体の調製に使用する抗原。