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JP7762651B2 - 修飾二重鎖ドナー鋳型 - Google Patents

修飾二重鎖ドナー鋳型

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JP7762651B2
JP7762651B2 JP2022523896A JP2022523896A JP7762651B2 JP 7762651 B2 JP7762651 B2 JP 7762651B2 JP 2022523896 A JP2022523896 A JP 2022523896A JP 2022523896 A JP2022523896 A JP 2022523896A JP 7762651 B2 JP7762651 B2 JP 7762651B2
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クロレ，アダム
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サン，ベイメン
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インテグレーティッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレーティッド
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Description

関連出願への相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／９２５，３６６号の優先権を主張する。
配列表への参照
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１（ｃ）に従ったコンピュータ可読形式の配列表と共に出願される。ＥＦＳによって提出されたテキストファイル「０１３６７０－９０６０－ＵＳ０２＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿２２－ＯＣＴ－２０２０＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」は、２０２０年１０月２２日に作成され、２３５個の配列を含み、８６．３Ｋバイトのファイルサイズを有し、参照によりその全体が組み込まれる。
技術分野
相同性指向修復（ＨＤＲ）効率を改善し、遺伝子操作ヌクレアーゼによる二重鎖切断の導入後の相同非依存性組込みを低減するための組成物および方法が、本明細書に記載される。さらに、プログラム可能なヌクレアーゼを用いた二重鎖切断の導入後の相同性指向修復のドナー効力および効率を改善するための二重鎖ＤＮＡドナーに対する修飾である。
プログラム可能なヌクレアーゼを用いたゲノム編集により、目的の標的ゲノムへのＤＮＡの部位特異的導入が可能となる。いくつかのシステムで標的化ゲノム編集が可能であり、これらのシステムには、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガー（ＺＦＮ）、またはクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、真核細胞で部位特異的なゲノム編集を行うために広く利用されている。Ｃａｓ９タンパク質を標的部位に動員するには配列特異的なガイドＲＮＡが必要であり、その後、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは標的ＤＮＡの両方の鎖を切断して二重鎖切断（ＤＳＢ）を作成する。このＤＳＢは、細胞の生来のＤＮＡ損傷修復経路によって修正される。ＤＳＢ修復の２つの主な経路は、標的ＤＮＡにランダムな挿入または削除（インデル）をもたらし得る、エラーが起きやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路と、ＤＳＢのいずれかの側に相同性を持つ一本鎖または二重鎖ＤＮＡ分子を修復鋳型として用いて標的ＤＮＡに望ましい変異を生成する、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路である［１］。
プラスミドＤＮＡ、二重鎖線状ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のような、様々な形態のＤＮＡをＨＤＲ実験の修復鋳型として使用できる。ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの両方のドナーは、哺乳類の組織培養細胞に自然免疫応答を誘導することができる。短い挿入（概して≦１２０ｂｐ）または変異については、ＩＤＴ（登録商標）Ｕｌｔｒａｍｅｒ（商標）ｓｓＤＮＡのような化学合成オリゴヌクレオチドをＨＤＲ実験のための一本鎖オリゴドナー（ｓｓＯＤＮ）として使用できる。合成ｓｓＤＮＡを使用することで、分子に化学修飾を加えて、ＨＤＲ効率を改善することができる。より大きな挿入（一般に＞１２０ｂｐ）の鋳型は、合成の複雑さが増加するために制限される。長いｓｓＤＮＡの生成は、労力およびコストのかかるプロセスであり得る一方で、線状ｄｓＤＮＡは概して迅速かつ大量に生成される可能性がある。より一般的なＮＨＥＪ修復経路はブラント末端のライゲーションを促進するため、線状ｄｓＤＮＡドナーは、細胞内に存在する任意のＤＳＢ（オンターゲットＣａｓ９切断部位、任意のＣａｓ９オフターゲット部位、および任意の内因性ＤＳＢを含む）への相同非依存性組込みのリスクが高くなる［２、３］。相同非依存性組込みが標的部位で起こる場合、相同性アームを含むドナー全体が組み込まれ、一方または両方の相同性アーム領域の重複をもたらす。
線状ｄｓＤＮＡドナーに５’－ビオチン修飾を加えると、コンカテマーの形成およびＮＨＥＪ経路を介した組込みを減少させることができることが報告されている［４］。同様に、５’末端のビオチン化またはｓｓＤＮＡオーバーハングにより、ブラント挿入を低減させることができることが、別のグループにより報告された［５］。別のグループは、ｄｓＤＮＡドナーの５’末端にあるＴＥＧおよび２’－ＯＭｅリボヌクレオチドアダプターが、ドナーの自由端へのＮＨＥＪ機構のアクセスを制限することにより、ＨＤＲ率を潜在的に増加させる可能性があることを示唆したが、ブラント組込みの減少は示されなかった［６］。
ＨＤＲの効率を高め、線状ｄｓＤＮＡドナーに典型的に関連する望ましくない相同非依存性組込み（標的部位および潜在的なオフターゲットまたは内因性ＤＳＢの両方）を低減する、ＨＤＲのための修飾ｄｓＤＮＡ鋳型の組成物およびその方法の必要性が存在する。
本明細書に記載される一実施形態は、第１の相同性アーム領域、挿入領域、および第２の相同性アーム領域を含む二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーであって、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーである。一態様では、修飾は、第１の相同性アーム領域の５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドの２’位に対する修飾、および第２の相同性アーム領域の５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドの２’位に対する修飾を含む。別の態様では、修飾は、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目（３番目）のヌクレオチド、または５’末端もしくはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に対する修飾を含む。別の態様では、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、または２’－Ｏ－メトキシルエチル（２’－ＭＯＥ）のうちの１つまたは複数を含む。別の態様では、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の修飾は、２’－ＭＯＥを含む。別の態様では、５’末端またはその近傍の修飾は、標的ＤＮＡに対する非鋳型ミスマッチである。別の態様では、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域は、４０から１５０ヌクレオチドの長さである。別の態様では、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。別の態様では、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、ユニバーサルプライマー配列をさらに含む。別の態様では、挿入領域は１００ｂｐより大きい。一態様では、挿入領域は、０．２５ｋｂより大きいか、０．５ｋｂより大きいか、１ｋｂより大きいか、２ｋｂより大きいか、３ｋｂより大きいか、４ｋｂより大きいか、５ｋｂより大きいか、６ｋｂより大きいか、７ｋｂより大きいか、８ｋｂより大きいか、９ｋｂより大きいか、または１０ｋｂより大きい。別の態様では、二重鎖ＨＤＲドナーは、５’末端または３’末端のいずれかにヘアピンを含む。別の態様では、二重鎖ＨＤＲドナーは、５’末端と３’末端の両方にヘアピンを含む。別の態様では、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、相同性指向修復効率を改善し、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同非依存性組込みを減少させる。
本明細書に記載の別の実施形態は、修飾二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナー、プログラム可能なヌクレアーゼ酵素、およびｇＲＮＡを含むプログラム可能なヌクレアーゼシステムであって、ｇＲＮＡ分子が、プログラム可能なヌクレアーゼ分子を標的核酸に標的化することができる、プログラム可能なヌクレアーゼシステムである。一態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、第１の相同性アーム領域、挿入領域、および第２の相同性アーム領域を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域は、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、または５’末端またはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に対する修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドへの少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、５’末端またはその近傍に１つまたは複数の２’－ＭＯＥ修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、ユニバーサルプライマー配列を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、相同性指向修復効率を改善し、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同非依存性組込みを減少させる。別の態様では、プログラム可能なヌクレアーゼシステムは、１つまたは複数の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガー（ＺＦＮ）、またはクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）を含む。別の態様では、プログラム可能なヌクレアーゼシステムはＣＲＩＳＰＲである。別の態様では、プログラム可能なヌクレアーゼ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ関連－９（Ｃａｓ９）である。別の態様では、プログラム可能なヌクレアーゼシステムは、１つまたは複数のＨＤＲエンハンサーをさらに含む。
本明細書に記載の別の実施形態は、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復（ＨＤＲ）率を増加させ、相同非依存性組込みを減少させる方法であって、候補編集標的部位遺伝子座を活性でプログラム可能なヌクレアーゼシステムおよび修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーで標的化することを含む方法である。一態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、第１の相同性アーム領域、挿入領域、および第２の相同性アーム領域を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域は、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、または５’末端もしくはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に対する修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、５’末端またはその近傍に１つまたは複数の２’－ＭＯＥ修飾を含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、ユニバーサルプライマー配列を含む。別の態様では、本方法は、１つまたは複数のＨＤＲエンハンサーをさらに含む。別の態様では、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーは、相同性指向修復効率を改善し、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同非依存性組込みを減少させる。
本明細書に記載の別の実施形態は、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復（ＨＤＲ）率を増加させ、相同非依存性組込みを減少させるための修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの使用であって、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域および任意選択で、１つまたは複数のユニバーサルプライミング配列を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、使用である。一態様では、修飾は、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む。
本明細書に記載の別の実施形態は、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーを製造するための方法であって、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域；および任意選択で、１つまたは複数のユニバーサルプライミング配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することを含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、方法である。一態様では、修飾は、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む。
本明細書に記載の別の実施形態は、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーを製造するための方法であって、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域を含む標的核酸配列を１つ以上のユニバーサルプライマーで増幅することを含み、ユニバーサルプライミング配列が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、方法である。一態様では、修飾は、ユニバーサルプライマーの５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドでの少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む。
Ｃａｓ９指向性切断（図１Ａ）または内因性二重開始切断またはＣａｓ９オフターゲット切断（図１Ｂ）のためにｄｓＤＮＡ ＨＤＲドナー鋳型を使用する場合の相同非依存性および相同依存性組込み事象を示す概略を示す図である。これらの相同非依存性組込み事象は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入された二重鎖切断での相同性アームの取り込みまたは複製をもたらす。 Ｃａｓ９指向性切断（図１Ａ）または内因性二重開始切断またはＣａｓ９オフターゲット切断（図１Ｂ）のためにｄｓＤＮＡ ＨＤＲドナー鋳型を使用する場合の相同非依存性および相同依存性組込み事象を示す概略を示す図である。これらの相同非依存性組込み事象は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入された二重鎖切断での相同性アームの取り込みまたは複製をもたらす。 １ｋｂの挿入を含む修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。 ４２ｂｐの挿入を含む修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。修飾は、複数の２’－ＭＯＥリボヌクレオチドおよび内部に配置された２’－ＭＯＥリボヌクレオチドに拡張された。 ４２ｂｐの挿入を含む修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。非相同部位を標的とするＣａｓ９ガイドを使用して、オフターゲットのＣａｓ９切断を模倣した。 ４２ｂｐの挿入を含む修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。修飾は、追加の２’－修飾を含むように拡張された。非相同部位を標的とするＣａｓ９ガイドを使用して、オフターゲットのＣａｓ９切断を模倣した。 ヘアピン遮断ｄｓＤＮＡ ＨＤＲ鋳型の合成方法を示す図である。灰色は、２’－ＭＯＥリボヌクレオチドで構成されるＤＮＡヘアピンを示す。黒は、化学合成された非修飾ＤＮＡを示す。白は、利用可能なプライマー結合部位を持つＤＮＡ鋳型配列を示す。図６Ａは、短いＨＤＲ挿入については、５’－ＭＯＥヘアピンを含む２つの化学合成されたｓｓＤＮＡオリゴをアニーリングすることにより、ヘアピン遮断ｄｓＤＮＡドナーを生成できることを示す図である。図６Ｂは、より長いＨＤＲ挿入については、ヘアピン遮断ｄｓＤＮＡドナーをＰＣＲ増幅によって生成できることを示す図である。５’－ＭＯＥヘアピンを持つプライマーを使用して、標的ＨＤＲ鋳型を増幅できる。ＤＮＡポリメラーゼは、ヘアピンを含むＭＯＥを介して増幅できないはずである。数サイクル後、両方の５’末端にＭＯＥヘアピンを含む最終ｄｓＤＮＡ産物が生成される。 ５’末端にヘアピンまたは１×ＭＯＥ修飾塩基のいずれかを有するドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。ＥｃｏＲＩ制限部位をＳＥＲＰＣＩＮ１遺伝子座に導入するために、ドナーには３０ｂｐの相同性アームを含ませ、６ｂｐの挿入を媒介させた。ヘアピンは、「ＴＴＴＴ」ループを備えた３ｂｐのステムで構成され、非修飾のＤＮＡ塩基（ＤＮＡのみ）または２’－ＭＯＥ修飾塩基（ＭＯＥ修飾）のいずれかを含んでいた。ヘアピンは初期試験のためにライゲートされていなかった。 修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲ（図８Ａ）またはＮＨＥＪ（図８Ｂ）経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。ＨＤＲ対ブラント組込みの比率を図８Ｃに示す。ドナーは、４つのゲノム遺伝子座で４２ｂｐの挿入を媒介するように設計され、２つの細胞株で試験された（修飾ごとにｎ＝８）。結果は、各部位および細胞株について、非修飾ｄｓＤＮＡドナーに対する倍率変化として報告される。 修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲ（図８Ａ）またはＮＨＥＪ（図８Ｂ）経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。ＨＤＲ対ブラント組込みの比率を図８Ｃに示す。ドナーは、４つのゲノム遺伝子座で４２ｂｐの挿入を媒介するように設計され、２つの細胞株で試験された（修飾ごとにｎ＝８）。結果は、各部位および細胞株について、非修飾ｄｓＤＮＡドナーに対する倍率変化として報告される。 修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲ（図８Ａ）またはＮＨＥＪ（図８Ｂ）経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。ＨＤＲ対ブラント組込みの比率を図８Ｃに示す。ドナーは、４つのゲノム遺伝子座で４２ｂｐの挿入を媒介するように設計され、２つの細胞株で試験された（修飾ごとにｎ＝８）。結果は、各部位および細胞株について、非修飾ｄｓＤＮＡドナーに対する倍率変化として報告される。 図９Ａは、２つのゲノム遺伝子座で３００ｂｐ、５００ｂｐ、または１ｋｂの挿入を媒介する修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。比較のため、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座を標的とする長いｓｓＤＮＡドナーが提供された。図９Ｂは、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座での挿入を評価するための比較直交分析方法を示す図である。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）のＭｉｎＩＯＮ（商標）システムを使用したロングリードシーケンシングを、ゲノムＤＮＡサンプルからのＰＣＲアンプリコンをＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒで実行および定量するアンプリコン長分析と比較した。 図９Ａは、２つのゲノム遺伝子座で３００ｂｐ、５００ｂｐ、または１ｋｂの挿入を媒介する修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。比較のため、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座を標的とする長いｓｓＤＮＡドナーが提供された。図９Ｂは、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座での挿入を評価するための比較直交分析方法を示す図である。Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＯＮＴ）のＭｉｎＩＯＮ（商標）システムを使用したロングリードシーケンシングを、ゲノムＤＮＡサンプルからのＰＣＲアンプリコンをＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒで実行および定量するアンプリコン長分析と比較した。 ユニバーサルプライミング配列を含むｄｓＤＮＡ ＨＤＲドナー鋳型設計の概略を示すである。ハッシュされた黒は、ゲノムＤＮＡ標的およびＨＤＲドナーの間で相同であるＤＮＡ配列を示す（すなわち、相同性アーム）。黒は、望ましい挿入ＤＮＡ配列を示す。白は、ユニバーサルプライミング配列に相同なＤＮＡ配列を示す。 １００ｂｐの相同性アームに隣接する５００ｂｐの挿入から構成される、修飾線状ｄｓＤＮＡドナーを使用した、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ経路を介するｄｓＤＮＡドナー組込みの評価を示す図である。ドナーは、ターミナルユニバーサルプライミング配列と共に、または無しで合成された。 ＩＧＶを使用した１×ＭＯＥドナーからのＨＤＲ読み取りの視覚的評価を示す図である。ユニバーサルプライミング配列を用いて製造されたＥＭＸ１およびＳＥＲＰＩＮＣ１ １×ＭＯＥ ｄｓＤＮＡドナーからのＨＤＲ読み取りは、正しいＨＤＲ配列（図１２Ａ）またはユニバーサル配列を有するＨＤＲ配列（すなわち、誤ったＨＤＲ）（図１２Ｂ）のいずれかを含む参照に対してアラインされた。比較のために、ユニバーサル配列を欠く１×ＭＯＥ ｄｓＤＮＡドナーからのＨＤＲ読み取りを、正しいＨＤＲ参照に対してアラインした（図１２Ｃ）。ＩＧＶプロット内では、個々の読み取りは細い水平線として表される。参照に正しくアラインしていない個々のヌクレオチド（すなわち、挿入、ギャップ、または変異）は黒でマークされる。ＭｉｎＩＯＮ（商標）シーケンシングからのバックグラウンドエラー率は、図１２Ｃにおいて評価できる。各ＩＧＶパネルの上にＨＤＲ参照の表示を示す。黒色は、望ましい５００ｂｐ挿入を表す。破線領域は、１００ｂｐのドナー相同性アームに相同な配列を表す。点線領域は、３０ｂｐのユニバーサルプライミング配列を表す。目的の領域は矢印により示されている。誤ったＨＤＲ参照（図１２Ｂ）に対するミスアライメントは、全てのＨＤＲ読み取りで明らかであり、修復後の３０ｂｐユニバーサル配列の欠如を示している。ＥＭＸ１ドナーのパネルは、およそ５００回の読み取りを表す。ＳＥＲＰＩＮＣ１ドナーのパネルは、およそ３７００回の読み取りを表す。 非修飾または１ｘＭＯＥ修飾のｄｓＤＮＡドナー鋳型のいずれかを使用した場合のＨＤＲ率の評価を示す図である。ドナーは、標的遺伝子のＮ末端またはＣ末端にＧＦＰを挿入するように設計されており、２００ｂｐの相同性アームが含まれていた。ドナーは、ユニバーサルプライミング配列で生成された。ＨＤＲ率はフローサイトメトリーによって評価された（％ＧＦＰ陽性細胞として報告される）。 ｄｓＤＮＡ ＨＤＲ鋳型がユニバーサルプライマーまたは遺伝子特異的プライマーのいずれかを使用して製造された場合の収量の評価を示す図である。＞５００ｂｐの１２個の配列および＜５００ｂｐの１２個の配列を製造し、ＰＣＲの収量を評価した。各グループの全体的な収量が図１４Ａに示され、各配列についてのユニバーサルプライマーを有する場合と無い場合の鋳型間の比較が図１４Ｂに示される。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される任意の命名法およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。競合が発生した場合は、定義を含む本文書が優先される。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料が本発明の実践または試験に使用されることができるものの、以下に好ましい方法および材料を記載する。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」、「ヌクレオチド」、「ポリペプチド」、「ポリヌクレオチド」、および「ベクター」という用語は、生化学者の当業者によって理解されるような共通の意味を有する。標準一文字ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）および標準一文字アミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＲ）が、本明細書において使用される。
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含み（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有し（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する」などの用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態、態様、または要素を「含む」、「からなる」、および「本質的になる」他の実施形態を企図する。
本明細書で使用される場合、本開示の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および同様の用語は、本明細書で他に示されるか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。また、他に特定されない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」は、「１つまたは複数」を意味する。
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、接続的または離接的であり得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、大部分またはかなりの程度であるが、完全ではないことを意味する。
本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される「約」または「およそ」という用語は、記載された参照値に類似する値、または当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内の値を指し、測定システムの制限など、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。一態様では、「約」という用語は、「約」という用語によって修正された値の最大±１０％の変動内にある整数および小数成分の両方を含む、任意の値を指す。あるいは、「約」は、当技術分野の慣行に従って、３以上の標準偏差内を意味することができる。あるいは、生物学的システムまたはプロセスに関するような、「約」という用語は、値の１桁以内、いくつかの実施形態では５倍以内、およびいくつかの実施形態では２倍以内を意味することができる。本明細書で使用される場合、記号「～」は「約」または「およそ」を意味する。
本明細書に開示される全ての範囲には、離散値としてのエンドポイント、ならびに範囲内で特定される全ての整数と分数の両方が含まれる。例えば、０．１～２．０の範囲には、０．１、０．２、０．３、０．４．．．２．０が含まれる。エンドポイントが「約」という用語で修飾された場合、特定された範囲は、エンドポイントを含む範囲内または３以上の標準偏差内の任意の値の最大±１０％の変動によって拡張される。
本明細書で使用される場合、「制御」または「参照」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「参照」または「対照」レベルは、測定結果を評価するためのベースラインまたはベンチマークとして使用される、予め定められた値または範囲であってもよい。「対照」は、対照実験または対照細胞も指す。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の化合物の「有効量」という句は、生物学的応答、例えば、酵素またはタンパク質活性の減少または阻害を誘発するか、または症状を改善するか、症状を緩和するか、病気の進行を遅らせるもしくは遅延させるか、または疾患を予防するかなど、本明細書に記載の化合物の量を指す。
本明細書で使用される場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」、または「阻害し（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語は、所与の状態、症状、もしくは障害、もしくは疾患の減少または抑制、あるいは生物活性もしくは処理のベースライン活性の有意な減少を指す。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルプライマー」という用語は、標的配列に対する既知のアラインメントを持たない配列を指す。ユニバーサルプライマーは、標的配列の配列非依存性増幅を可能にする。
ＨＤＲ効率を改善し、ブラント組込み事象を低減するための、ｄｓＤＮＡドナー鋳型の方法および組成物が、本明細書で開示される。様々な実施形態では、開示された方法および組成物は、プログラム可能なヌクレアーゼを用いたゲノム編集後の相同非依存性組込みを減少させる。いくつかの実施形態では、かさ高い修飾は、線状ｄｓＤＮＡドナーの５’末端に配置される。さらなる実施形態では、かさ高い修飾は、線状ｄｓＤＮＡドナーの５’末端またはその近傍に配置される。さらに、修飾は、ｄｓＤＮＡドナーの５’ヌクレオチドもしくはヌクレオチド（複数）またはその近傍のＤＮＡの２’位置に配置されてもよい（例えば、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭＥ、または２’－Ｆヌクレオチド）。相同非依存性組込みを減少する効果の改善が、これらの修飾により実証される。さらに、ヌクレアーゼ分解を遮断する能力が確立されている他の修飾（ＰＳなど）が他の２’修飾と同程度にはブラント組込み率を減少させないため、この減少はドナー安定性の増加によって媒介されるものではないと思われる。
相同非依存性組込みがオンターゲット部位で起こる場合、相同性アーム（図１）を含むドナー全体が組み込まれ、複製相同性アームをもたらす。図１は、ｄｓＤＮＡ ＨＤＲドナー鋳型を使用する場合の相同非依存性（複製相同性アーム）および相同依存性組込み事象の概略図である。薄い灰色のバーは標的ゲノムＤＮＡ配列を示し、白は非相同ゲノムＤＮＡ配列（内因性ＤＳＢまたはＣａｓ９オフターゲット部位のいずれか）を示す。ハッシュされた黒は、ゲノムＤＮＡ標的およびＨＤＲドナー（すなわち、相同性アーム）の間で相同であるＤＮＡ配列を示す。黒は、望ましい挿入ＤＮＡ配列を示す。図１Ａは、オンターゲットＣａｓ９切断部位でのＨＤＲまたはＮＨＥＪ修復経路を介したｄｓＤＮＡドナーの挿入を示す。ＮＨＥＪ経路を介した挿入は、ドナー相同性アームの重複をもたらす。図１Ｂは、内因性ＤＳＢまたはオフターゲットＣａｓ９切断部位でのＮＨＥＪ修復経路を介したｄｓＤＮＡの挿入を示す。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、線状ｄｓＤＮＡドナーの５’末端に導入される。これらの化学修飾は、ＮＨＥＪ組込みのリスクを減少させ、ＨＤＲ実験における修復鋳型としての有用性を改善させるために使用される。いくつかの実施形態では、かさ高いまたは大きな修飾が、ｄｓＤＮＡドナーの５’末端に導入される。追加の実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの末端または５’－ＤＮＡヌクレオチドに導入されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍に導入されてもよい。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍のＤＮＡヌクレオチドまたはヌクレオチド（複数）は、修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾には、ビオチン、ホスホロチオエート（ＰＳ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、２’－酸素－４’－炭素メチレン結合）、ヘキサエチレングリコール（Ｓｐ１８）、１，３－プロパンジオール（ＳｐＣ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）ヌクレオチド、またはリボヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡドナーの５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目の（第３の）ヌクレオチド、または５’末端もしくはその近傍のヌクレオチドの組合せに配置される。追加の実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡドナーの５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目の（第３の）のヌクレオチド、または５’末端もしくはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に配置される。さらに追加の実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡドナーの５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目の（第３の）ヌクレオチド、または５’末端もしくはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に配置される。
２’－修飾リボヌクレオチド、特に２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）の使用は、ビオチンまたは他の修飾と比較した場合、最適な改善を与えることが見出された。大きな挿入を媒介するドナーを用いたこれらの修飾の使用を確立する追加の実験が本明細書に記載されている。
ｄｓＤＮＡドナーの製造プロセスのさらなる改善が評価された。ユニバーサルプライミング配列は、一般的なゲノム（ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ）との相同性がないように選択された。我々のグループによる以前の研究は、クローニング応用におけるこれらのプライミング配列の有用性を確立した（すなわち、非常に効率的で信頼性の高い増幅）。（１）幅広く様々な配列での増幅の成功、および（２）全体的な増幅収率の顕著な改善が、これらのユニバーサル配列をドナー製造プロセスに組み込むことにより達成できる。完全なＨＤＲドナー配列に隣接して配置された場合のこれらのユニバーサル配列の試験が、本明細書に記載される。５’－ｄｓＤＮＡ修飾を使用する場合、相同非依存性組込みのリスクが低下するため、これらの配列は、修飾ドナーを用いて正しいＨＤＲ率に悪影響を与えないし、ブラント組込み中に組み込まれることは稀である。
本明細書に開示される方法および組成物は、ＨＤＲ効率を改善し、相同非依存性事象（ブラント組込み事象または多量体化事象）を減少するのに使用するためのｄｓＤＮＡドナー鋳型のものである。様々な実施形態では、開示された方法および組成物は、プログラム可能なヌクレアーゼを用いたゲノム編集後の相同非依存性組込みの減少または相同性依存性組込みの増加を可能にする。いくつかの実施形態では、かさ高いヌクレオチド修飾は、線状ｄｓＤＮＡドナーの５’末端に配置される。追加の実施形態では、ｄｓＤＮＡの５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の近傍のヌクレオチドの２’位のヌクレオチド（例えば、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ）に配置された修飾は、相同非依存性組込みを減少させる有効性の改善を実証する。さらに、ヌクレアーゼ分解を阻害する確立された能力（ＰＳなど）を有する他の修飾もまた、他の２’修飾と同じ程度にブラント組込み率を減少させないため、この減少はドナーの安定性の増加によって媒介されるようには見えない。
いくつかの実施形態では、化学修飾は、線状ｄｓＤＮＡドナーの５’末端に導入される。これらの化学修飾は、ＮＨＥＪ組込みのリスクを減少させ、ＨＤＲ実験における修復鋳型としてのその有用性を改善させるために使用される。いくつかの実施形態では、かさ高いまたは大きな修飾が導入される。追加の実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーの５’末端の近傍に導入されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾は、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーの５’末端またはその近傍に導入されてもよい。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍のヌクレオチドが修飾されてもよい。追加の実施形態では、修飾には：ビオチン（Ｂ）；ホスホロチオエート（ＰＳ、＊）；トリエチレングリコール（ＴＥＧ）；ロックド核酸、例えば、２’－酸素－４’－炭素メチレン結合（ＬＮＡ）；ヘキサエチレングリコール（Ｓｐ１８）；１，３－プロパンジオール（ＳｐＣ３）；２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）リボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）ヌクレオチド、およびリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態では、ｄｓＤＮＡドナーの末端でのヘアピン構造の使用は、同様に、ブラント組込みを減少させる。
一実施形態では、末端修飾されたｄｓＤＮＡドナー鋳型は、プログラム可能なヌクレアーゼによる二重鎖切断の導入に続く使用に適しているであろう。さらなる実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガー（ＺＦＮ）、またはクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）を含む。一実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼシステムはＣＲＩＳＰＲである。一態様では、プログラム可能なヌクレアーゼ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ関連－９（Ｃａｓ９）である。
一実施形態では、５’末端修飾ｄｓＤＮＡドナーは、ＰＣＲ増幅によって生成される。ビオチン、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ＴＥＧ、ＬＮＡ、スペーサー１８（ＳＰ１８）、Ｃ３スペーサー（ＳｐＣ３）、またはＭＯＥで修飾されたプライマーは、挿入領域を増幅し、末端修飾されたｄｓＤＮＡドナーを生成するために使用される。いくつかの実施形態では、挿入領域は１２０ｂｐより大きい。いくつかの実施形態では、挿入領域は、少なくとも１ｋｂの挿入領域である。いくつかの実施形態では、挿入領域は、１ｋｂより大きいか、２ｋｂより大きいか、３ｋｂより大きいか、４ｋｂより大きいか、５ｋｂより大きいか、６ｋｂより大きいか、７ｋｂより大きいか、８ｋｂより大きいか、９ｋｂより大きいか、または１０ｋｂより大きい。
追加の実施形態では、５’末端またはその近傍の修飾には、ビオチン、ホスホロチオエート（ＰＳ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、ロックド核酸、例えば、２’－酸素－４’－炭素メチレン結合（ＬＮＡ）、ヘキサエチレングリコール（Ｓｐ１８）、１，３プロパンジオール（ＳｐＣ３）、２’－Ｏ－メトキシエチルリボヌクレオチド（ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）ヌクレオチド、およびリボヌクレオチドが含まれる。
さらなる実施形態では、５’末端またはその近傍の修飾には、二重鎖ＤＮＡドナーの５’末端またはその近傍のＤＮＡヌクレオチドの２’位の修飾が含まれる。いくつかの実施形態では、２’－修飾は、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ、または２’－フルオロであり、ヌクレオチドの修飾は、二重鎖ＤＮＡドナーの５’末端またはその近傍で起こる。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、二重鎖ＤＮＡドナーの５’末端ヌクレオチド上にある。追加の実施形態では、５’末端修飾は、ｄｓＤＮＡドナーの５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目の（第３）ヌクレオチド、または５’末端またはその近傍のヌクレオチドの組合せに位置する。他の実施形態では、５’末端修飾は５’末端に位置付けられ、修飾は５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、または５’末端から３番目の（第３の）ヌクレオチドに位置する。さらに別の実施形態では、５’末端修飾は、末端５’位、５’末端から２番目のヌクレオチド位置、５’末端から３番目の（第３の）ヌクレオチド位置、またはそれらの組合せに位置する２’－ＭＯＥ修飾リボヌクレオチドである。さらに別の実施形態では、５’末端修飾は、末端５’位、５’末端から２番目のヌクレオチド位置、５’末端から３番目の（第３の）ヌクレオチド位置、またはそれらの組合せに位置する２’－ＭＯＥリボヌクレオチドである。
追加の実施形態では、ＨＤＲドナーは、挿入のいずれかの側に相同性アームを含む。相同性アームは、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入された二重鎖切断に隣接する配列に相補的である。いくつかの実施形態では、相同性アームは、少なくとも２０ヌクレオチド長から５００ヌクレオチド長まで長さが変化する。いくつかの実施形態では、相同性アームは、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、相同性アームの長さは、５００ヌクレオチドを超える長さであってもよい。追加の実施形態では、相同性アームは、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、挿入は相同性アームの間に配置される。いくつかの実施形態では、挿入は２０ヌクレオチドを超える長さである。いくつかの実施形態では、挿入は、少なくとも１ヌクレオチドから４ｋｂまでの長さである。いくつかの実施形態では、挿入は１～２ｋｂの範囲の長さである。いくつかの実施形態では、挿入は、少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂの長さであってもよい。さらに追加の実施形態では、挿入は、１０ｋｂ以上の長さであってもよい。
追加の実施形態では、ＨＤＲドナーには、挿入のいずれかの側に相同性アームが含まれ、挿入は、ＳＮＰ、ＭＮＰ、または欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、挿入は、少なくとも１ヌクレオチドから４ｋｂまでの長さである。いくつかの実施形態では、挿入は１～２ｋｂの範囲の長さである。いくつかの実施形態では、挿入は、少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂの長さであってもよい。さらに追加の実施形態では、挿入は１０ｋｂ以上の長さであってもよい。
本明細書に記載のポリヌクレオチドには、１つまたは複数のヌクレオチドが関与し得る置換、欠失、および／または付加を有する変異体が含まれる。変異体は、コーディング領域、非コーディング領域、またはその両方で変えることができる。コード領域の変化は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいものは、結合の特性と活性を変えないサイレントな置換、付加、および欠失である。
本明細書に記載のさらなる実施形態は、（ａ）ヌクレオチド配列、もしくはその縮重、相同、もしくはコドン最適化変異体；または（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列のいずれかの相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列と、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一、より好ましくは少なくとも約９０～９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、核酸分子を含む。
参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９０～９９％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり最大約１０～１の点変異、付加または欠失を含み得ることを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。
換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも約９０～９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大１０％を欠失、付加、もしくは別のヌクレオチドで置換することができ、または、参照配列の全ヌクレオチドの最大１０％の数のヌクレオチドを参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置、またはそれらの末端位置の間の任意の場所で起きることができ、参照配列、または参照配列内の１つもしくは複数の隣接グループ内のヌクレオチド間で個別に散在している。同じことが、参照ポリペプチド配列と少なくとも約９０～９９％同一のポリペプチド配列にも当てはまる。
いくつかの実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）または構成要素（例えば、ｇＲＮＡ）は、様々なアプローチを使用して細胞に導入され得る。例としては、プラスミドまたはウイルス発現ベクター（酵素、ｇＲＮＡのいずれか、またはその両方の内因性発現をもたらす）、別々のｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡトランスフェクションによる酵素の送達、またはリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）複合体としてのｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡによる酵素の送達が挙げられる。
本明細書に記載の組成物、製剤、方法、プロセス、装置、アセンブリ、および用途への適切な修正および適応が、その任意の実施形態または態様の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、関連技術分野における当業者にとっては明らかであろう。提供される組成物、装置、アセンブリ、および方法は例示的なものであり、任意の開示された実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に開示される全ての様々な実施形態、態様、および任意選択は、任意の変形または反復において組み合わせることができる。本明細書に記載の組成物、製剤、方法、装置、アセンブリ、およびプロセスの範囲には、本明細書に記載の実施形態、態様、任意選択、実施例、および選好の全ての実際または潜在的な組合せが含まれる。本明細書に記載の組成物、製剤、装置、アセンブリ、または方法は、任意の構成要素もしくは工程を省略してもよく、本明細書に開示される任意の構成要素もしくは工程を置換してもよく、または本明細書の他の場所に開示される任意の構成要素もしくは工程を含んでもよい。本明細書に開示される任意の組成物または製剤の任意の構成要素の質量と、製剤中の他の構成要素の質量または製剤中の他の構成要素の総質量との比は、それらが明示的に開示されるかのように本明細書に開示される。参照により組み込まれる特許または刊行物のいずれかの用語の意味が、本開示で使用される用語の意味と矛盾する場合、本開示の用語または語句の意味が支配する。本明細書で引用される全ての特許および刊行物は、その特定の教示について、参照により本明細書に組み込まれる。
参照
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7. Robinson et al., “Integrative Genomics Viewer,” Nature Biotechnology 29: 24-26 (2011).
実施形態
Ａ１． 第１の相同性アーム領域、挿入領域、および第２の相同性アーム領域を含む二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーであって、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ２． 修飾が、第１の相同性アーム領域の５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドの２’位に対する修飾、および第２の相同性アーム領域の５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドの２’位に対する修飾を含む、Ａ１に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ３． 修飾が、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、または５’末端またはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に対する修飾を含む、Ａ１～Ａ２に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ４． 二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の修飾が、２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、もしくは２’－ＭＯＥのうちの１つまたは複数を含む、Ａ１に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ５． 二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の修飾が、２’－ＭＯＥを含む、Ａ１～Ａ４に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ６． ５’末端またはその近傍の修飾が、標的ＤＮＡに対する非鋳型ミスマッチである、Ａ１～Ａ５に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ７． 第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、４０～１５０ヌクレオチドの長さである、Ａ１～Ａ６に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ８． 第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである、Ａ１～Ａ７に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ９． 二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、ユニバーサルプライマー配列をさらに含む、Ａ１～Ａ８に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ１０． 挿入領域が、１００ｂｐより大きい、Ａ１～Ａ９に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ１１． 挿入領域が、０．２５ｋｂより大きいか、０．５ｋｂより大きいか、１ｋｂより大きいか、２ｋｂより大きいか、３ｋｂより大きいか、４ｋｂより大きいか、５ｋｂより大きいか、６ｋｂより大きいか、７ｋｂより大きいか、８ｋｂより大きいか、９ｋｂより大きいか、または１０ｋｂより大きい、Ａ１～Ａ１０に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ１２ 二重鎖ＨＤＲドナーが、５’末端または３’末端のいずれかにヘアピンを含む、Ａ１～Ａ１１に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ１３． 二重鎖ＨＤＲドナーが、５’末端および３’末端の両方にヘアピンを含む、Ａ１～Ａ１２に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ａ１４． 二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、Ａ１～Ａ１３に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
Ｂ１． 修飾二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナー、プログラム可能なヌクレアーゼ酵素、およびｇＲＮＡを含む、プログラム可能なヌクレアーゼシステムであって、ｇＲＮＡ分子が、プログラム可能なヌクレアーゼ分子を標的核酸に標的化することができる、プログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ２． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域、挿入領域、および第２の相同性アーム領域を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、Ｂ１に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ３． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、または５’末端またはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に対する修飾を含む、Ｂ１～Ｂ２に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ４． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｂ１～Ｂ３に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ５． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、５’末端またはその近傍に１つまたは複数の２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｂ１～Ｂ４に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ６． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、ユニバーサルプライマー配列を含む、Ｂ１～Ｂ５に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ７． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを減少させる、Ｂ１～Ｂ６に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ８． 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガー（ＺＦＮ）、またはクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）の１つまたは複数を含む、Ｂ１～Ｂ７に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ９． ＣＲＩＳＰＲである、Ｂ１～Ｂ８に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ１０． プログラム可能なヌクレアーゼ酵素がＣＲＩＳＰＲ関連－９（Ｃａｓ９）である、Ｂ１～Ｂ９に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｂ１１． １つまたは複数のＨＤＲエンハンサーをさらに含む、Ｂ１～Ｂ１０に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
Ｃ１． プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復（ＨＤＲ）率を増加させ、相同非依存性組込みを減少させる方法であって、候補編集標的部位遺伝子座を活性でプログラム可能なヌクレアーゼシステムおよび修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーで標的化する工程を含む方法。
Ｃ１． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域、挿入領域、および第２の相同性アーム領域を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、Ｃ１に記載の方法。
Ｃ２． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端ヌクレオチド、５’末端から２番目のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、または５’末端もしくはその近傍のヌクレオチドの組合せの２’位に対する修飾を含む、Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｃ１～Ｃ２に記載の方法。
Ｃ４． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、５’末端またはその近傍に１つまたは複数の２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｃ１～Ｃ３に記載の方法。
Ｃ５． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、ユニバーサルプライマー配列を含む、Ｃ１～Ｃ４に記載の方法。
Ｃ６． １つまたは複数のＨＤＲエンハンサーをさらに含む、Ｃ１～Ｃ５に記載の方法。
Ｃ７． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、相同性指向修復効率を改善し、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同非依存性組込みを減少させる、Ｃ１～Ｃ６に記載の方法。
Ｄ１． プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復（ＨＤＲ）率を増加させ、相同非依存性組込みを減少させるための、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの使用であって、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域および任意選択で、１つまたは複数のユニバーサルプライミング配列を含み；第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、使用。
Ｄ２． 修飾が、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｄ１に記載の使用。
Ｅ１． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーを製造するための方法であって、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域；および任意選択で、１つまたは複数のユニバーサルプライミング配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを合成する工程、第２の相補的なオリゴヌクレオチド配列を合成する工程、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド配列をハイブリダイズさせる工程を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、方法。
Ｅ２． 修飾が、二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーの５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｅ１に記載の方法。
Ｆ１． 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーを製造するための方法であって、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域を含む標的核酸配列を１つ以上のユニバーサルプライマーで増幅する工程を含み、ユニバーサルプライミング配列が、５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドに対する修飾を含む、方法。
Ｆ２． 修飾が、ユニバーサルプライマーの５’末端またはその近傍の１つまたは複数のヌクレオチドでの少なくとも１つの２’－ＯＭＥ、２’－Ｆ、または２’－ＭＯＥ修飾を含む、Ｆ１に記載の方法。
実施例１
修飾ｄｓＤＮＡドナーでＨＤＲ率は増加し、ＮＨＥＪ挿入は減少する。
非修飾線状ｄｓＤＮＡ、５’－ビオチン修飾を含むドナー、または５’末端またはその近傍に代替修飾を有するドナーのＨＤＲ挿入率に対する、相同非依存性（すなわち、ブラント）組込みを比較するために初期試験を行った。ｄｓＤＮＡドナーは、ヒトＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子を標的とする１００ｂｐの隣接相同性アームを有する１ｋｂ挿入を含むプラスミドをＰＣＲ増幅して生成した（１００－１０００－１００；配列番号１；増幅プライマー配列については表１を参照；配列番号２～２１）。増幅プライマーは、非修飾配列または示された修飾のいずれかで設計された。精製されたｄｓＤＮＡドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、ＳＥＲＰＩＮＣ１を標的とする２μＭ Ｃａｓ９ Ｖ３（商標）ＲＮＰ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）を有する最終容量２８μＬヌクレオフェクション緩衝液中、１００ｎＭ（１μｇ）で、３．５×１０５個のＨＥＫ－２９３細胞に送達された。使用したＳＣ１（ＳＥＲＰＩＮＣ１）プロトスペーサー配列は表１（配列番号２２）に見出すことができる。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、４８時間後に細胞を溶解した。ＨＤＲおよびブラント組込み率は、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により、標的ＤＮＡと挿入間の接合部に隣接するプライマーを用いたＰＣＲアッセイを使用して評価した（表１；配列番号２３～２７）。ＨＤＲおよびブラント接合部アッセイの両方に、非組込みドナーからの増幅を避けるために、相同性アーム配列の外部に１つのプライマーが含まれていた。ＨＤＲアッセイプローブ（配列番号２５）は、標的部位および挿入配列の接合部をカバーしていた。ブラントアッセイプローブ（配列番号２７）は、標的部位と組込み相同性アーム配列との間の接合部をカバーした。
ホスホロチオエート結合（２×ＰＳ、３×ＰＳ、または６×ＰＳ）または５’－末端上のＬＮＡヌクレオチドのような既知のヌクレアーゼ耐性修飾を含むｄｓＤＮＡドナーは、修飾がＨＤＲおよびブラント組込みの両方の比率を増加させているため、非修飾（ｕｎｍｏｄ）ドナーよりもＨＤＲ：ブラント比を改善しなかった（図２）。ドナーの５’－修飾（ビオチン、ＴＥＧ、Ｓｐ１８、およびＳｐＣ３）により、ブラント組込みの減少の程度が変化するにつれて、ＨＤＲ率が増加した。これらのドナーのうち、ＴＥＧ、ビオチン、およびＳｐ１８は、ＨＤＲ：ブラント比の増加を示した（非修飾に対して、それぞれ１．８倍、２．０倍、および２．５倍の改善）。図２を参照されたい。両方の５’末端に２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）修飾リボヌクレオチドを含むドナーは、最大のＨＤＲ：ブラント比の増加を示した（非修飾ドナーに対して５．０倍の改善）。図２を参照されたい。ＨＤＲ率は、２’－ＭＯＥ修飾と他の修飾ドナーの間で類似しているが、これは、安定性の上昇だけがＨＤＲ：ブラント比の上昇の原因ではないことを示唆している。さらに、前述のように、ＬＮＡ修飾ドナーおよびＰＳ修飾ドナーは、ＨＤＲ：ブラント比を増加させなかったが、これは、ブラント組込みの減少が鋳型のヌクレアーゼ耐性の増加に起因しない可能性が高いことを示している。また、ドナーの５’末端近傍に２’修飾リボヌクレオチドを使用することは、ブラント組込みを低下させるには不十分であり、２’－ＭＯＥ修飾鋳型は、ここで試験した修飾の中でこの活性に最も適していることも実証している。
実施例２
５’－修飾は、短いドナー鋳型を使用すると、オフターゲット組込みがより低くなることが実証される。
相同非依存性組込み率はドナーの全長に依存し、ドナーのサイズが小さくなるとブラント挿入が増加する。５’末端修飾が（実施例１で試験した１ｋｂ挿入と比較して）より小さい４２ｂｐ挿入を用いることでブラント挿入率を低下させるか否かを決定するために、実施例１に記載したＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座を標的化する修飾ｄｓＤＮＡドナーを生成した（ＳＣ１－１６６Ｓ；配列番号２２）。ドナーは、４０ｂｐの相同性アームと共にＥｃｏＲＩ制限部位を含む４２ｂｐの挿入（ＳＣ１ ４０－４２－４０；配列番号２８）からなり、１００ｂｐの隣接相同性アームと共に４２ｂｐの挿入を含むプラスミドのＰＣＲ増幅によって生成された（増幅プライマー配列については表２を参照；配列番号２９～４４）。
実施例１からの３つの修飾（ビオチン、Ｓｐ１８、およびＭＯＥ）が追加の試験のために選択された一方で、６×ＰＳの修飾が中程度の実行対照として含まれた。追加の修飾残基によってブラント組込みがさらに減少できるか否かを決定するために、５’末端に３つの２’－ＭＯＥリボヌクレオチド（３×ＭＯＥ）を有するドナーも含めた。２’－ＭＯＥリボヌクレオチドもまた、５’末端からの様々な距離で試験された（Ｉｎｔ ＭＯＥ－３および－５、５’末端から３または５ヌクレオチドに位置する２’－ＭＯＥと共に；配列番号４１～４４）。修飾および非修飾ドナーを、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、２８μＬの最終容量で３．５×１０５個のＨＥＫ－２９３細胞に、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座を標的とする２μＭ Ｃａｓ９ Ｖ３（商標）（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）ＲＮＰと共に５００ｎＭ（１．１μｇ）で送達させた。４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＤＮＡを抽出した。組込み率は、バンド定量化のためにＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）マシン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）を使用し、ＥｃｏＲＩ消化を使用したＲＦＬＰによって評価された。ＨＤＲおよびブラント組込み事象は、相同性アームの重複による４０ｂｐのサイズの相違によって区別できた。
１×ＭＯＥおよび３×ＭＯＥ修飾ドナーは、ＨＤＲ：ブラント比の最大の改善をもたらした（非修飾に対してそれぞれ４．１倍および４．６倍の改善）。図３を参照されたい。以前に観察されたように、６×ＰＳ、ビオチン、およびＳｐ１８は、いくらかの改善（それぞれ、非修飾に対して１．９倍、２．７倍、および２．８倍の改善）をもたらしたが、ＭＯＥ修飾ドナーと同程度にブラント組込みを減少させなかった。図３を参照されたい。興味深いことに、ドナー内の２’－ＭＯＥリボヌクレオチドの位置は、そのブラント組込みを減少させる有用性にわずかに影響を及ぼした。ドナーの５’末端から３または５ヌクレオチドにＭＯＥリボヌクレオチドをシフトさせると、非修飾ドナーと比較して、ＨＤＲ：ブラント比は３．１倍または２．４倍のみの改善であった。図３を参照されたい。したがって、当技術分野のユーザは、ドナー鋳型の５’末端の２～３ヌクレオチド内に配置された２’－ＭＯＥリボヌクレオチドが、ＮＨＥＪ媒介挿入の大幅な減少をもたらすであろうと予測するであろう。
実施例３
２’－ＭＯＥ修飾は、非相同二重鎖切断での組込みを低下させる
標的切断部位でのブラント組込みに加えて、オフターゲットＣａｓ９切断部位およびｄｓＤＮＡの内因性切断を含む、ゲノム内の任意の他の二重鎖切断で、二重鎖ドナーを潜在的に組み込むことができる。潜在的な非相同ＤＳＢでのドナー組込みにおける２’－ＭＯＥ修飾の影響を評価するために、非修飾または修飾５’末端（非修飾、１×ＭＯＥ、または６×ＰＳ）を有するｄｓＤＮＡドナーをＰＣＲ増幅によって生成し（増幅プライマー配列については表３を参照されたい。配列番号４８～５３）、標的ｇＲＮＡ（ＳＣ１－１６６Ｓ；配列番号２２）またはドナーとの相同性の無い（ＡＡＶＳ１－６７０ＡＳ；配列番号５４；ＨＰＲＴ ３８０８７；配列番号５５）モックの「オフターゲット」ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９と共送達した。
ドナーは、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む４２ｂｐの挿入およびＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座を標的とする５０ｂｐの相同性アームで構成された（ＳＣ１ ５０－４２－５０；配列番号４７）。ドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、１００ｎＭの用量（０．３μｇ）で２μＭのＣａｓ９ Ｖ３（商標）ＲＮＰ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）および２μＭのＡｌｔ－Ｒ（商標）Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（商標）と共に、最終２８μＬの容量で、３×１０５個のＫ５６２細胞に送達された。４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＤＮＡを抽出した。組込み率は、ＥｃｏＲＩ消化を使用したＲＦＬＰによって評価され、各バンドはＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）マシン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）で定量化された。ＨＤＲおよびブラント組込み事象は、相同性アームの重複による５０ｂｐのサイズの相違によって区別できる（図４）。
オンターゲットＣａｓ９部位および両方の「オフターゲット」Ｃａｓ９部位での非修飾ｄｓＤＮＡについては、ブラント組込み率＞９％が観察された。図４を参照されたい。２’－ＭＯＥ修飾ドナーではブラント組込みの減少（＜１％）が観察され、２’－ＭＯＥ修飾が非相同ＤＳＢでのＮＨＥＪ媒介挿入もまた減少させることが実証された。図４を参照されたい。以前に観察されたように、６×ＰＳの修飾はブラント組込みの適度な減少をもたらした。
実施例４
オフターゲット組込みの減少はヌクレアーゼ保護増加の結果ではなく、特定の２’修飾が効率的な減少に必要である
ブラント組込みを減少させる２’－ＭＯＥ修飾の能力が特異的であるか、またはほぼ５’－のヌクレオチドの２’位置での修飾の一般的な機能であるかを決定するために、追加の２’修飾、および５’末端の非鋳型２’－ＭＯＥリボヌクレオチド（配列番号７０～７１）を試験した（ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’－ＯＭｅ、または２’－Ｆ）。（標的ＤＮＡ配列に対して非相同であると定義される非鋳型リボヌクレオチド。）ドナーは、実施例２で前に記載された配列（ＳＣ１ ４０－４２－４０；配列番号２８）、ＥｃｏＲＩ制限部位およびＳｅｒｐｉｎＣ１遺伝子座を標的とする４０ｂｐの相同性アームを含む４２ｂｐ挿入から構成された。ドナーは、前に記載されたようにＰＣＲ増幅によって生成された（表４に列挙された実施例４に固有のプライマー配列；配列番号６０～７１）。
ｄｓＤＮＡドナーは、標的ｇＲＮＡ（ＳＣ１－１６６Ｓ；配列番号２２）またはドナーと相同性の無いｇＲＮＡ（ＴＮＰＯ３；配列番号７２）のいずれかと複合体を形成したＣａｓ９と共送達された。ドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって、２μＭのＣａｓ９ Ｖ３ ＲＮＰを含む２５０ｎＭの用量（０．６μｇ）で、ＨＥＫ－２９３細胞に最終２８μＬの容量で送達された。４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＤＮＡを抽出した。組込み率は、ＥｃｏＲＩを使用したＲＦＬＰによって評価され、各バンドはＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）マシン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）で定量化された。
ＨＤＲは、様々な修飾によって影響を受けなかったか、わずかにブーストされたが、２’－ＭＯＥ修飾が存在する場合は常に、オンターゲットＤＳＢおよびオフターゲットＤＳＢの両方でブラント組込みが減少した（図５）。対照的に、追加の２’修飾のほとんどは、ブラント組込み率に影響を与えなかったか、増加しなかった。２’－ＯＭｅ修飾は、オンターゲットＤＳＢでのブラント組込み率を減少させたが、２’－ＭＯＥ修飾と同程度ではなかった。図５を参照されたい。２’－ＯＭｅ修飾は、オフターゲットＤＳＢでのブラント組込み率を顕著に減少させなかった。
まとめると、これらのデータは、相同非依存性組込みを減少させる２’－ＭＯＥ修飾の能力は、（ａ）他の安定化修飾は同様の結果をもたらさないことから、ヌクレアーゼ耐性を促進することによる安定性増加の機能ではない、（ｂ）他の２’－修飾が同様の結果をもたらさないことから，ほとんど５’－のリボヌクレオチドの２’－修飾による一般化された機能ではないということを示唆している。
実施例５
相同非依存性組込みを減少させるための遮断グループとしてのヘアピンの使用。
化学修飾に加えて、ｄｓＤＮＡドナーの末端でのＤＮＡヘアピンの使用は、相同非依存性組込みを減らすために使用できる。これらのヘアピン遮断ドナーの生成は、いくつかの方法で達成される（図６Ａ～Ｂ）。小さなＨＤＲ事象（通常、４０ｂｐの相同性アームを有する≦１２０ｂｐの挿入）の場合、両方のＤＮＡ鎖が５’－ＭＯＥヘアピン配列で化学的に合成された。これらのＭＯＥアダプターには、ヘアピン構造の形成を可能にする相補配列が含まれる。ＤＮＡ鎖をアニーリングしてｄｓＤＮＡ ＨＤＲドナーを形成した。より大きなＨＤＲ事象の場合、同様の５’－ＭＯＥヘアピンを含むＤＮＡプライマーが化学的に合成され、望ましいＨＤＲドナーの増幅に使用された。ヘアピン構造内でＭＯＥリボヌクレオチドを使用すると、ヘアピンを通るＤＮＡポリメラーゼの進行が阻害される。両方の合成方法において、ヘアピン遮断ドナーをニックされたＨＤＲ鋳型として使用することもできるし、またはライゲーションして完全に閉じた分子を生成することもできる。
化学的に合成された短いオリゴでのヘアピンの使用は、細胞で機能的に試験された。６６－ｎｔの配列は、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座への６塩基のＧＡＡＴＴＣ挿入を媒介するように設計された。この配列およびそのリバース相補体は、完全に非修飾であるか（表５；配列番号７５～７６）、５’末端で非修飾ヘアピンを含むか（配列番号７７～７８）、５’末端でＭＯＥ修飾ヘアピンを含むか（配列番号７９～８０）、または５’末端で非鋳型ＭＯＥ修飾塩基を含む（配列番号８１～８２）ｓｓＯＤＮとして合成された。ペアのｓｓＯＤＮを１００μＭに希釈し、１：１の比率で混合して、５０μＭの最終二重鎖を生成した。オリゴ混合物を９５℃で１分間加熱し、その後、室温までゆっくりと冷却し、鎖をアニーリングさせた。二重鎖ｄｓＤＮＡドナーは、標的ｇＲＮＡ（配列番号２２）と複合体を形成したＣａｓ９と共送達された。ドナーは、２μＭのＣａｓ９ Ｖ３ ＲＮＰと２μＭのＡｌｔ－Ｒ（登録商標）Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサーを使用して２μＭの濃度で、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって最終２８μＬの容量でＨＥＫ－２９３細胞に送達された。４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してＤＮＡを抽出した。組込み率は、ＥｃｏＲＩを使用したＲＦＬＰによって評価され、各バンドはＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）マシン（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ａｍｅｓ、ＩＡ）で定量化された（図７）。
より短い６６ｂｐの非修飾ｄｓＤＮＡドナーを使用することで、ＮＨＥＪ経路を介した、ＨＤＲ経路と比較して効率的な組込みをもたらした（５５．５％ブラント対２７．６％ＨＤＲ）。ドナーの終端にＤＮＡのみのヘアピンを導入することにより、修復プロファイルが改善された（４２．４％ブラント対３３．０％ＨＤＲ）。ヘアピン内にＭＯＥ修飾を含めると、この機能が５’末端の単一の１×ＭＯＥで観察されたものと同様のレベルに大幅に改善された（ＭＯＥ修飾ヘアピンについては、５８．４％ＨＤＲ対８．９％ブラント；１×ＭＯＥについては、６６．５％ＨＤＲ対６．９％ブラント）。修飾ヘアピンへの追加の最適化（すなわち、ライゲーション、ステムループ長の最適化など）を実装して、この機能をさらに改善することができる。
実施例６
２’－ＭＯＥ修飾は、複数の部位および複数の細胞株での望ましい修復結果を改善する。
以下の実験では、全てのガイドを、Ａｌｔ－Ｒ（商標）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体形成したＡｌｔ－Ｒ（商標）ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡとして試験した。ＲＮＰ複合体およびｄｓＤＮＡドナーは、推奨されるプロトコルに従ってＬｏｎｚａヌクレオフェクションを使用して目的の細胞に送達された。
２’－ＭＯＥ修飾が、より高いＨＤＲ率およびブラント組込みの減少により正しい修復をもたらす能力をさらに検証するために、非修飾および１×ＭＯＥ修飾ｄｓＤＮＡドナーを２つの細胞株（ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２）における４つの追加ゲノム遺伝子座（ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１ ６７０、ＡＡＶＳ１ Ｔ２、ＥＭＸ１）で試験した。ドナーは、４２ｂｐの挿入を媒介するように設計されており、４０ｂｐの相同性アーム（配列番号８３～８６）を持っていた。ドナーは、以前に記載されるようにＰＣＲ増幅によって生成された（表６に列挙された実施例６に固有のプライマー配列、配列番号９５～１４２）。ドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の推奨されるプロトコルを使用して、２μＭのＣａｓ９ Ｖ３（商標）ＲＮＰ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）および２μＭのＡｌｔ－Ｒ（商標）Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（商標）を含む２５０ｎＭでの最終容量２８μＬのヌクレオフェクション緩衝液中、示される細胞株に送達された。使用したプロトスペーサー配列は表６に見出される（配列番号１３５～１３８）。４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細胞を溶解した。修復事象は、イルミナＭｉＳｅｑプラットフォームでＮＧＳアンプリコンシーケンシング（ｒｈＡｍｐＳｅｑ（商標））によって定量化され（表６に列挙される遺伝子座特異的シーケンシングプライマー、配列番号１３９～１４６）、そのような教示について参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１６／９１９，５７７号に記載されるＩＤＴの社内データ分析パイプライン（ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓ）を使用してデータ分析が実行された（図８）。
以前に観察されたように、５’修飾は全て、非修飾ｄｓＤＮＡドナーに対してＨＤＲ率が改善された（Ａ）。非修飾ｄｓＤＮＡに対するＨＤＲの改善倍率は部位や細胞株に渡って異なる一方で、ＨＤＲ率の平均改善は、試験した全ての修飾で比較的類似していた（１．２～１．３倍の範囲の改善）。対照的に、ＭＯＥ修飾ドナーは、２×ＰＳおよびビオチンドナー（Ｂ）と比較して、ブラント組込みの大幅な減少を示した。平均して、非修飾ｄｓＤＮＡと比較したブラント組込みの倍数の減少は、１．６（２×ＰＳ）、２．３（ビオチン）、２．９（１×ＭＯＥ）、３．２（１×ＭＯＥ、２×ＰＳ）、および３．３（３×ＭＯＥ）であった。ＨＤＲおよびブラント組込みの改善を各部位（Ｃ、ＨＤＲ：ブラント修復事象の比率として報告）で一緒に評価した場合、ＭＯＥ修飾ｄｓＤＮＡドナーは他の修飾よりも優れていた。非修飾ｄｓＤＮＡに対する平均倍率変化は、２．３（２×ＰＳ）、３．１（ビオチン）、３．６（１×ＭＯＥ）、４．１（１×ＭＯＥ ２×ＰＳ）、および４．３（３×ＭＯＥ）であった。まとめると、これらの結果は、ＭＯＥ修飾がＣＲＩＳＰＲ編集後の正しい修復事象を進めるのに最も効率的であることを実証している。
実施例７
ＨＤＲ率は増加し、ＮＨＥＪ挿入は、大きな挿入を媒介する修飾ｄｓＤＮＡドナーを用いて減少する。
短い挿入物を用いた研究のフォローアップとして、２つのゲノム遺伝子座（ＳＥＲＰＩＮＣ１およびＥＭＸ１；ドナー配列および増幅プライマーについては表７参照、配列番号１４７～１５４）で３００ｂｐ、５００ｂｐ、または１０００ｂｐの挿入を媒介するｄｓＤＮＡドナーを用いた場合のＨＤＲおよびブラント組込み率を比較するための実験を行った。ドナーは、１００ｂｐの隣接相同性アームを有する望ましい挿入を含むプラスミドのＰＣＲ増幅によって生成された。増幅プライマーは、非修飾配列または指定された修飾のいずれかで設計された。ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座での比較のために長いｓｓＤＮＡ（Ｍｅｇａｍｅｒｓ（商標））を注文した。ドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１００ｎＭで、ＳＥＲＰＩＮＣ１またはＥＭＸ１を標的とする２μＭのＣａｓ９ Ｖ３（商標）ＲＮＰ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）を含む最終容量２８μＬのヌクレオフェクション緩衝液中、３．５×１０５個のＨＥＫ－２９３細胞に送達された。トランスフェクション後の２４時間、細胞をＩＤＴ Ａｌｔ－Ｒ（商標）ＨＤＲエンハンサーＶ２（１μＭ）で処理した。使用したプロトスペーサー配列を表１（配列番号２２）および表７（配列番号１６１）に示す。
４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細胞を溶解した。ＨＤＲおよびブラント組込み率は、ＭｉｎＩＯＮ（商標）プラットフォーム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を使用したロングリードシーケンシングによって評価された。使用した遺伝子座特異的増幅プライマーが列挙されている（表７、配列番号１６２～１６５）。最終シーケンシングライブラリーは、製造業者が推奨するプロトコルに従って、ＰＣＲバーコーディング拡張およびライゲーションシーケンシングキットを使用して調製された。最終データ分析は、ＩＤＴの社内データ分析パイプライン（ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓ）を使用して実行された（図９Ａ）。挿入率は、ＳＥＲＰＩＮＣ１サンプルのアンプリコン長分析によって個別に評価された。単離されたｇＤＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＣ１ ＲＦＬＰプライマー（配列番号４５～４６）を使用してＰＣＲ増幅された。アンプリコンは、バンドの定量化のためにＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）マシンで実行された。挿入事象は、組込み事象について期待されたアンプリコンサイズに基づいて同定された（図９Ｂ）。
１×ＭＯＥ修飾ドナーは、両遺伝子座の大きな挿入を媒介する非修飾ｄｓＤＮＡドナーと比較して、高いＨＤＲ率（ＥＭＸ１では平均２８．６％から３０．９％およびＳＥＲＰＩＮＣ１では平均４４．４％から５３．６％）、低いブラント組込み率（ＥＭＸ１では平均３．２％から１．１％、ＳＥＲＰＩＮＣ１では８．４％から２．５％）をもたらした。ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子座で同じ挿入を媒介する長いｓｓＤＮＡドナーは、非常に低いブラント組込み率（＜１％）をもたらした。長いｓｓＤＮＡドナーは、３００ｂｐ挿入のＨＤＲの最高率を媒介した（修飾ｄｓＤＮＡドナーで７１．３％対５４．９％）。しかしながら、修飾ｄｓＤＮＡドナーは、大きい挿入を有するＨＤＲについて長いｓｓＤＮＡと同等またはそれ以上の性能であった（５００ｂｐ挿入の場合は５５．２％対５３．３％、１０００ｂｐ挿入の場合は５０．８％対２９．４％）。オーソロガスな評価方法を使用した場合、ＳＥＲＰＩＮＣ１サンプルについて同様の傾向が観察された（図９Ｂ）。
実施例８
修飾ｄｓＤＮＡドナーを製造するためのユニバーサルプライミング配列の利用は、ＨＤＲ修復に悪影響を及ぼさない。
ユニバーサルプライミング配列をドナー鋳型に組み込むことの影響を評価するために、ＥＭＸ１およびＳＥＲＰＩＮＣ１で５００ｂｐ挿入を媒介するｄｓＤＮＡドナー（表７、配列番号１４８および１５１を参照）を、遺伝子座特異的プライマーまたはユニバーサルプライマー（表７ 配列番号１５３～１６０；表８ 配列番号１６６～１８１）のいずれかと共に調製した。ドナーに対するユニバーサルプライミング配列の配置が図１０に示される。試験した修飾には、１×ＭＯＥ、３×ＭＯＥ、およびホスホロチオエート修飾を伴うビオチン（［５］に記載されるビオチン５×ＰＳ）が含まれていた。ドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ＳＥＲＰＩＮＣ１またはＥＭＸ１を標的とする２μＭのＣａｓ９ Ｖ３（商標）ＲＮＰ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）を含む最終容量２８μＬのヌクレオフェクション緩衝液中、１００ｎＭで、３．５×１０５個のＨＥＫ－２９３細胞へ送達させた。トランスフェクション後の２４時間、細胞をＩＤＴ Ａｌｔ－Ｒ（商標）ＨＤＲエンハンサーＶ２（１μＭ）で処理した。４８時間後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細胞を溶解した。ＨＤＲおよびブラント組込み率は、ＭｉｎＩＯＮ（商標）プラットフォーム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を使用したロングリードシーケンシングによって評価され、以前の記載のように分析された（図１１）。
ＨＤＲおよびブラント組込み率は、ユニバーサルプライミング配列と共にまたは無しで生成されたｄｓＤＮＡドナーで比較的類似していた。ユニバーサルプライミング配列の無いドナーの場合、ＨＤＲの改善およびブラント率の減少は、様々な修飾で同様であった。この傾向の主な例外は、ＳＥＲＰＩＮＣ１部位の３×ＭＯＥ修飾であるが、ここで、ブラント挿入は非修飾ｄｓＤＮＡと比較してまだ減少したが、ＨＤＲは１×ＭＯＥまたはＢｉｏｔｉｎ５×ＰＳと同じ程度には改善されなかった（非修飾：４５．１％ＨＤＲ、９．０％ブラント；１×ＭＯＥ：５５．２％ＨＤＲ、２．３％ブラント、３×ＭＯＥ：４４．５％ＨＤＲ、１．２％ブラント）。対照的に、ユニバーサルプライミング配列で製造された修飾ドナーでは、性能にはるかに大きな違いが観察された。興味深いことに、ユニバーサルプライミング部位がドナー配列に含まれる場合、両方の部位の非修飾ｄｓＤＮＡドナーの組込み率が低くなった（ＥＭＸ１：２８．８％対２４．８％ＨＤＲ、ＳＥＲＰＩＮＣ１：４５．２％対３４．４％ＨＤＲ）。両方の部位で、１×ＭＯＥ修飾により、ユニバーサル配列を含むドナーに組み込まれた場合にＨＤＲ率が最大に改善した。
１×ＭＯＥ修飾ドナーからのＨＤＲ読み取りのさらなる分析は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ［７］（ＩＧＶ、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で行われた。正しいＨＤＲ配列を含む参照アンプリコン（図１２Ａ）または望ましい挿入およびユニバーサルプライミング配列の両方を含む参照アンプリコン（図１２Ｂ）のいずれかに対してＨＤＲ読み取りをアラインメントした場合、ＨＤＲ読み取りにおいてユニバーサル配列の取り込みの証拠は観察されなかった。したがって、ユニバーサル配列は、機能的な性能に悪影響を与えることなく、修飾ｄｓＤＮＡドナーの製造プロセスに組み込むことができる。
実施例９
ヒト細胞株でＧＦＰ融合体を生成するためのユニバーサルプライミング配列で製造された修飾ｄｓＤＮＡドナーの使用。
タンパク質タグ付けなどの応用における修飾ｄｓＤＮＡドナー鋳型の機能性能を評価するために、ＧＦＰタグ付きＧＡＰＤＨ（Ｃ末端融合）、ＣＬＴＡ（Ｎ末端融合）、およびＲＡＢ１１ａ（Ｎ末端融合）が生成されるようにドナーを設計した。ドナーは、非修飾または１ｘＭＯＥ修飾プライマーのいずれかを使用して、以前に記載したようにユニバーサルプライミング配列と共に製造された。使用したガイドおよびドナー配列を表９に列挙する。ドナーは、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ＧＡＰＤＨ、ＣＬＴＡ、またはＲＡＢ１１ａに標的化する２μＭ Ｃａｓ９ Ｖ３（商標）ＲＮＰ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）を含む最終容量２８μＬヌクレオフェクション緩衝液中、５０ｎＭで、３．５×１０５個のＫ５６２細胞に送達された。トランスフェクション後、細胞を２つのウェルにプレーティングした。１セットのウェルにつき、細胞をトランスフェクション後２４時間、ＩＤＴ Ａｌｔ－Ｒ（商標）ＨＤＲエンハンサーＶ２（１μＭ）で処理した。細胞を７日間継代し、その時点でＨＤＲ率をフローサイトメトリーで評価した。簡単に説明すると、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１～２×１０６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。生存率染色の分析の直前、細胞懸濁液に最終濃度４μｇ／ｍｌでＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を添加した。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で細胞を分析し、ＧＦＰ発現レベルを評価した（図１２）。
全体的なＨＤＲ率は、試験した部位に渡って様々であり、最適な条件下で達成された最大のＧＦＰ陽性率は１７．２％（ＧＡＰＤＨ）、４４．９％（ＣＬＴＡ）および６４％（ＲＡＢ１１ａ）であった。ＲＮＰ無しでｄｓＤＮＡドナーを受けた細胞ではＧＦＰシグナルは観察されなかった（データは示さず）。ＨＤＲ率は、未処理条件（ＧＡＰＤＨ、ＣＬＴＡ、およびＲＡＢ１１ａの非修飾ｄｓＤＮＡに対してそれぞれ１．６、１．３、および１．２倍の改善）およびＨＤＲエンハンサー処理条件（それぞれの非修飾ｄｓＤＮＡに対して１．４、１．４、および１．１倍の改善）の両方で、修飾ｄｓＤＮＡドナー鋳型を用いて増加した。平均して、１×ＭＯＥ修飾ｄｓＤＮＡドナーを使用すると、全ての条件で非修飾ｄｓＤＮＡドナーに対してＨＤＲ率が１．３倍増加した。比較すると、Ａｌｔ－Ｒ ＨＤＲエンハンサーＶ２を使用すると、全ての部位および条件でＨＤＲ率が平均２．４倍に増加した。修飾ドナーおよびＨＤＲエンハンサーを組み合わせて使用すると、全ての部位でＨＤＲ率が平均３．２倍にブーストされた。まとめると、このことは、ＨＤＲ実験における最適試薬（すなわち、修飾ドナーおよび小分子エンハンサー）の使用の組合せ有用性を実証している。
実施例１０
ｄｓＤＮＡ ＨＤＲ鋳型を製造する時に、ユニバーサルプライミング配列を使用することにより、一貫性が高まり、収量が改善する
ｄｓＤＮＡ ＨＤＲ鋳型の製造プロセスに対するユニバーサルプライミング配列の影響を評価するために、ユニバーサルプライミング配列（表８、配列番号１７２～１８１）または遺伝子特異的プライマー（表１０、配列番号１８８～２３５）を用いて２４種類の配列を様々な修飾と共に、生成した。以前に記載したように、全てのドナーは、目的の配列を含むプラスミド（ｐＵＣＩＤＴ ＡｍｐまたはｐＵＣＩＤＴ Ｋａｎベクター）からの増幅によって生成された。ＰＣＲ増幅は、製造業者の推奨に従ってＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ）を使用し、５０μＬの最終反応容量で２００ｎＭのプライマーおよび１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて行った。サーモサイクリングは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓ１０００サーマルサイクラーを使用し、以下のサイクリング条件で行った：９５℃で３分間のインキュベーション、続いて３６回の増幅サイクル（９５℃で２０秒；６５℃で１０秒；７０℃で２０～３０秒／ｋｂ）。アニーリング温度は、遺伝子特異的プライマー融解温度に従って調整した。ＳＰＲＩビーズクリーンアップに続いて、全ての製品をＦｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析し、イルミナ－Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡライブラリー調製キットを使用したＮＧＳによって配列を検証した。ユニバーサルプライマーまたは遺伝子特異的プライマーからの全体的な増幅効率は、ｎｇ／μＬとして報告される最終収量を測定することによって評価された（図１４Ａ）。
短い（＜５００ｂｐ）および長い（＞５００ｂｐ）アンプリコンの収量の違いにより、ユニバーサルまたは遺伝子特異的プライマーのいずれかを用いた増幅後の全体的な収量を、１２個の短いＨＤＲ鋳型および１２個の長いＨＤＲ鋳型で別々に評価した（図１４Ａ）。全体として、短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの両方にユニバーサルプライマーを使用すると、収量が顕著に高くなった。長いアンプリコンについては、ユニバーサルプライマーを使用すると、クリーンアップ後に平均濃度が１３８．３ｎｇ／μＬ（±１８．０ ＳＤ）となる一方で、遺伝子特異的プライマーを使用すると、平均濃度が７７．８ｎｇ／μＬ（±３２．６ ＳＤ）となった。短いアンプリコンについては、ユニバーサルプライマーを使用すると、クリーンアップ後に平均濃度が４０．９ｎｇ／μＬ（±５．９ ＳＤ）となる一方で、遺伝子特異的プライマーを使用すると、平均濃度が１５．９ｎｇ／μＬ（±６．４ ＳＤ）となった。ユニバーサルまたは遺伝子特異的プライマーで増幅された各配列間の直接比較（図１４Ｂ）により、遺伝子特異的プライマーを使用した場合の収量の大きな変動が明らかになる。対照的に、ユニバーサルプライマーを使用すると、収量が高くなり（短いおよび長いアンプリコンの平均に対して、それぞれ２．９倍および２．０倍の改善）、同様の長さの配列に渡って収量のより高い一貫性となる。より高い収量およびより高い一貫性のため、ユニバーサルプライマーを使用することで、ハイスループットの製造プロセスの開発が、よりよく支援される。

Claims (19)

  1. 二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーであって、
    第１の相同性アーム領域、
    挿入領域、および
    第２の相同性アーム領域を含み、
    ここで、
    第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端（第１）のヌクレオチド、５’末端から２番目（第２）のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに対する１以上の２’－ＭＯＥ修飾を含み、
    前記２’－ＭＯＥ修飾が、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、
    前記二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  2. 第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、４０～１５０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  3. 第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである、請求項１または２に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  4. 二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、ユニバーサルプライマー配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  5. 挿入領域が、１００ｂｐより大きい、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  6. 挿入領域が、０．２５ｋｂより大きいか、０．５ｋｂより大きいか、１ｋｂより大きいか、２ｋｂより大きいか、３ｋｂより大きいか、４ｋｂより大きいか、５ｋｂより大きいか、６ｋｂより大きいか、７ｋｂより大きいか、８ｋｂより大きいか、９ｋｂより大きいか、または１０ｋｂより大きい、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  7. 二重鎖ＨＤＲドナーが、５’末端または３’末端のいずれかにヘアピンを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  8. 二重鎖ＨＤＲドナーが、５’末端および３’末端の両方にヘアピンを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナー。
  9. 修飾二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナー、プログラム可能なヌクレアーゼ酵素、およびｇＲＮＡを含む、プログラム可能なヌクレアーゼシステムであって、ｇＲＮＡ分子が、プログラム可能なヌクレアーゼ分子を標的核酸に標的化することができるものであり、
    ここで、前記修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、
    第１の相同性アーム領域、
    挿入領域、および
    第２の相同性アーム領域を含み、
    ここで、
    第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端（第１）のヌクレオチド、５’末端から２番目（第２）のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに対する１以上の２’－ＭＯＥ修飾を含み、
    前記２’－ＭＯＥ修飾が、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、
    前記プログラム可能なヌクレアーゼシステム。
  10. 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガー（ＺＦＮ）、またはクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）の１つまたは複数を含む、請求項９に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
  11. ＣＲＩＳＰＲである、請求項９または１０に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
  12. プログラム可能なヌクレアーゼ酵素がＣＲＩＳＰＲ関連－９（Ｃａｓ９）である、請求項９～１１のいずれか一項に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
  13. １つまたは複数のＨＤＲエンハンサーをさらに含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載のプログラム可能なヌクレアーゼシステム。
  14. プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復（ＨＤＲ）率を増加させ、相同非依存性組込みを減少させるインビトロまたはエクスビボ方法であって、候補編集標的部位遺伝子座を活性でプログラム可能なヌクレアーゼシステムおよび修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーで標的化する工程を含み、
    ここで、前記修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、
    第１の相同性アーム領域、
    挿入領域、および
    第２の相同性アーム領域を含み、
    ここで、
    第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端（第１）のヌクレオチド、５’末端から２番目（第２）のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに対する１以上の２’－ＭＯＥ修飾を含み、
    前記２’－ＭＯＥ修飾が、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、
    前記方法。
  15. 修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、ユニバーサルプライマー配列を含む、請求項１４に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  16. １つまたは複数のＨＤＲエンハンサーをさらに含む、請求項１４または１５のいずれか一項に記載のインビトロまたはエクスビボ方法。
  17. プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復（ＨＤＲ）率を増加させ、相同非依存性組込みを減少させるための、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーのインビトロまたはエクスビボ使用であって、修飾二重鎖ＤＮＡ ＨＤＲドナーが、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域および任意選択で、１つまたは複数のユニバーサルプライミング配列を含み；第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端（第１）のヌクレオチド、５’末端から２番目（第２）のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに対する１以上の２’－ＭＯＥ修飾を含み、前記２’－ＭＯＥ修飾が、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、前記使用。
  18. 修飾二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーを製造するための方法であって、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域；および任意選択で、１つまたは複数のユニバーサルプライミング配列を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程を含み、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域が、第１の相同性アーム領域および第２の相同性アーム領域の５’末端（第１）のヌクレオチド、５’末端から２番目（第２）のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに対する１以上の２’－ＭＯＥ修飾を含み、前記２’－ＭＯＥ修飾が、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、前記方法。
  19. 修飾二重鎖ＤＮＡ相同性指向修復（ＨＤＲ）ドナーを製造するための方法であって、第１の相同性アーム領域、挿入領域、第２の相同性アーム領域を含む標的核酸配列を１つ以上のユニバーサルプライマーで増幅する工程を含み、ユニバーサルプライミング配列が、５’末端（第１）のヌクレオチド、５’末端から２番目（第２）のヌクレオチド、５’末端から３番目（第３）のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに対する１以上の２’－ＭＯＥ修飾を含み、前記２’－ＭＯＥ修飾が、プログラム可能なヌクレアーゼシステムにおける相同性指向修復効率を改善し、相同非依存性組込みを低減する、前記方法。
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