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JP7760115B2 - 新規抗原結合性キメラタンパク質とその方法及び使用 - Google Patents

新規抗原結合性キメラタンパク質とその方法及び使用

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JP7760115B2 JP2020524000A JP2020524000A JP7760115B2 JP 7760115 B2 JP7760115 B2 JP 7760115B2 JP 2020524000 A JP2020524000 A JP 2020524000A JP 2020524000 A JP2020524000 A JP 2020524000A JP 7760115 B2 JP7760115 B2 JP 7760115B2
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Description

本発明は構造生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は新規抗原結合性キメラタンパク質と、Ｘ線結晶構造解析や高解像度クライオＥＭ等の高分子三次元構造解析におけるその使用及び方法、並びに治療、診断又はイメージングツールとしてのその使用に関する。更に具体的には、本発明は足場タンパク質と抗原結合性ドメインの融合体に関し、前記融合体における足場タンパク質は免疫グロブリンドメイントポロジーを分断し、その抗原結合能を維持したリジッドなキメラを形成する。
タンパク質とその複合体は生命のあらゆる局面で非常に重要な役割をもつが、これらの高分子成分の多くの三次元構造解析は依然として難しい。回折に適した品質の結晶の作製は依然として高分子Ｘ線結晶構造解析における大きな障害である。有望なアプローチの一つは結晶化シャペロンの使用である（Ｈｕｎｔｅ ＆ Ｍｉｃｈｅｌ，２００２）。これらの結晶化シャペロンは所与の高分子標的と特異的に結合するように構築された抗体断片又は他のタンパク質として開発されている。このストラテジーの基礎は、第一に、特定のコンフォメーションと結合することにより、標的におけるコンフォメーションの不均一性を最小限にすることであり、第二に、結晶格子内の分子間の一次接触を助長できるタンパク質表面の量を追加することにより、規則性のよい結晶を得る確率を高めることである。結晶化シャペロンアプローチに固有の別の属性は、シャペロンがモデルに基づく初期位相決定情報を提供できるという点である（Ｋｏｉｄｅ，２００９）。ナノボディ(Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ)（Ｒ）は特定のコンフォメーションを安定化させるので、その標的の構造解析、特に結晶構造解析を促進するものとして広く使用されている（Ｐａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｒｏｓｔｉｓｌａｖｌｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。１例はＧＰＣＲ結晶化のコンテクストにおける強力なナノボディ（Ｒ）技術の使用であり、これらのツールが構造研究を推進しそうであることを立証している（Ｍａｎｇｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｔａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
しかし、Ｘ線結晶構造解析には、高品質の精製タンパク質が不可欠であること、比較的大量のタンパク質が必要であること、回折に適した品質の多数のタンパク質の結晶を得るのが難しいことなど、いくつかの固有の欠点がある。高分子複合体を原子レベルの解像度で構造解析するための汎用的な代替技術として単粒子クライオ電子顕微鏡法（クライオＥＭ）が最近開発されている（Ｎｏｇａｌｅｓ，２０１６）。データ解析用の機器と方法は確実に改善されるが、粒子径が小さく、対称性が低く、柔軟性の高い粒子を高解像度まで解析するツールを欠いている。所与の試料の均一性が不可欠であることに加え、三次元再構築の達成可能な最高解像度は個々の粒子の配向パラメーターを高精度に反復して精密化できるかどうかに大きく依存している。特定の領域を空気と水の界面又は基質支持体に優先的に付着させる高分子の表面特性による優先的粒子配向は、クライオＥＭで繰返される問題である。従って、凍結水和試料のノイズの大きい低線量画像で大型の分子を認識することは比較的容易であり、これらの粒子はその配向パラメーターの正確な決定を容易にするために十分な構造特徴をもつ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，１９９５）が、小さい粒子の画像を取得・処理する方法は著しく難しい。一つの基本的な問題を挙げると、画像の信号対雑音比は粒子のサイズと共に低下するというのが主因であるが、ガラス状の氷に包埋した小型のタンパク質又は複合体の画像は正確な画像アラインメントに十分な特徴を含んでいない。融合タンパク質を作製するか又は化学的リンカーをこれらのタンパク質に加えることによりこれらの問題を解決する試みが行われている。例えば、対称性を達成するためのホモオリゴマーとして、標的タンパク質と多量体を形成するグルタミンシンテターゼの最適化ジャンクションを使用し、クライオＥＭでこれらの小型の標的タンパク質のナノメートルレベルの解像を可能にする試みが行われている（Ｃｏｓｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。このような融合体に伴う問題は、フレキシブルリンカーにより作製されるため、剛性を欠き、コンフォメーション均一性が制限されるという点である。よりリジッドな融合体として、ヒト化抗体をサイトカインと融合してヒト化アゴニストとしたものがＺｈａｎｇら（２０１５）により報告されている。このリジッドな融合体は、正しくフォールディングさせるためにウシＦａｂ構造モチーフに基づくコイルドコイル「ストーク」モチーフを使用することにより、作製されている。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）との融合体において、このようなストークモチーフにサイトカインを連結すると、抗体の抗原結合能は低下するが、サイトカインのフォールディングと生物学的活性は維持されるようである。小型のタンパク質の構造をクライオＥＭにより解明するためにＦａｂ（～５０ｋＤａ）等の抗体断片が利用されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｆａｂの使用に伴う一つの欠点を挙げると、Ｆａｂは線状エピトープとも結合するが、その場合には剛性が低下することが知られているので、リジッドな結合と構造解析助長を得るために必要なＦａｂの適正な選択が必要になる。更に、Ｆａｂは（可変領域と定常領域の間の）内部柔軟性があり、サイズがまだ比較的小さく、ナノボディと比較すると作製しにくい。ナノボディは構造解析用にコンフォメーション不均一性を低減するための優れたツールであるが、ナノボディ（１５ｋＤａ）も小型のタンパク質であり、結晶格子内の分子間の一次接触を助長するように大量のタンパク質表面を追加するものではない。また、非常に小さいため、小型のタンパク質の高解像度クライオＥＭに必要なサイズに関連する要件を満たすにはやはり適していない。
Ｈｕｎｔｅ ＆ Ｍｉｃｈｅｌ，２００２ Ｋｏｉｄｅ，２００９ Ｐａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｒｏｓｔｉｓｌａｖｌｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ｍａｎｇｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｓｔａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｎｏｇａｌｅｓ，２０１６ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，１９９５ Ｃｏｓｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３
Ｘ線結晶構造解析又はクライオＥＭによる正確な構造解析には、リジッドなシャペロンの汎用的なプロトタイプソリューションが必要である。従って、フレキシブルリンカーを介するのではなく、リジッドな方法で融合された新規キメラが設計されるならば、コンフォメーションが安定した大型のタンパク質構造を構築するために有利であろう。以上をまとめると、結晶化又は単粒子解析、特にクライオＥＭにより小型のタンパク質又はタンパク質複合体又はタンパク質間の相互作用の構造解析を可能にする次世代シャペロンが明らかに必要とされている。汎用的な方法によりこのようなシャペロンを設計・創製し、標的のコンフォメーション柔軟性を低減させることができるならば有利である。第一に、このようなシャペロンは、高解像度構造を得るように解像度を改善する目的で標的に質量を付加するため及び／又は規定の特徴を付加するための補助ツールとして有用である。その結果、構造に基づく医薬品設計に有利であり、新規化合物の発見と開発に役立つであろう。第二に、このようなシャペロンは、剛性強化を利用した診断又は治療用製品を含め、生物物理学的用途、医療用途及び作物保護用途に用いる新規型の薬剤を提供するために有用である。
本発明は新規機能的抗原結合性キメラタンパク質の設計及び作製とそれらの使用、例えば構造解析における次世代シャペロンとしてのそれらの役割や、治療用及び診断用分子としてのそれらの使用に関する。特に、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメインには、抗原結合性や標的上のコンフォメーションエピトープとの特異的結合という有利な機能的特徴があり、更に免疫グロブリンドメインには、そのフォールディング又は機能性を損なわずに免疫グロブリンドメインのトポロジーを分断するように汎用的な方法で足場タンパク質を免疫グロブリンドメインと融合できるという有利な構造的特徴があるが、これらの特徴を組み合わせることにより、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメインと足場タンパク質を含む抗原結合性キメラタンパク質が設計された。このような抗原結合性キメラタンパク質は、前記抗原結合性ドメインと前記足場タンパク質の遺伝子融合体の発現により得られ、足場又はその断片が抗原結合性ドメインのトポロジーの内側に挿入されるように設計される。得られた新規抗原結合性キメラタンパク質は、それらの融合領域における高い剛性を特徴とし、驚くべきことにそれらの典型的なフォールドと機能性を維持すること、即ち、それらの抗原又は標的タンパク質に対して高い結合親和性を維持することが、意外にも判明した。実際に、抗原結合性ドメインと足場タンパク質から作製された遺伝子融合体は、抗原結合部である相補性決定領域（ＣＤＲ）構造に変動又は変化を生じない。足場タンパク質との融合体を剛性で非柔軟性に設計することは簡単ではないが、本発明はこれを可能とするように抗原結合性ドメインの内側の露出領域に完璧に選択された部位を配置することにより、新規でユニークな型の抗原結合性キメラタンパク質を提供する。その結果、抗原結合性キメラタンパク質は質量を付加し、構造的特徴を追加することにより、高解像度クライオＥＭ及びＸ線結晶構造解析による小型のタンパク質の構造解析を容易にするための新規ツールとなる。実際に、均一な試料の主に大～中サイズの高分子集合体は、クライオＥＭで原子レベルの特性決定が未だに可能ではない。そこで、本発明の抗原結合性キメラタンパク質は、粒子径を増大させ、（足場にも応じて）優先的粒子配向に対処するのに役立ち、断片の良好なアラインメントを可能にし、その結果、サイズの限度を下げ、解像度を上げることができるであろう。従って、考えられるあらゆる抗原又は標的の構造解析用としてこれらの次世代シャペロンを設計及び作製することにより、高解像度構造を得るように解像度を改善する目的で対象とする標的に質量を付加するため及び／又は規定の特徴を付加するための支援ツールとして、抗原結合性キメラタンパク質を適用することが可能になる。そのため、実際に、抗原結合性キメラタンパク質は構造解析のみならず構造に基づく医薬品設計及びスクリーニングにおけるツールとして有利であり、新規生物学的製剤及び低分子薬の発見と開発のための付加価値となる。更に、このようなリジッドな融合体が作製されると、例えば抗原結合性又はＩｇドメイン自体を含む足場等の足場の種類に応じて、抗原結合性キメラを例えば新規リジッド融合体治療用分子として医療分野で有効成分として利用したり、作物保護分野で保護剤を提供するといった新規用途が生まれる。標識した足場又は標識した抗原結合性ドメインを用いて抗原結合性キメラを作製する場合には、例えば標的の非共有結合的プロービングによるインビボイメージングの技術的改善を加速するための新規診断ツールも、本発明に含まれる。
本発明の第１の態様は、抗原結合性ドメインを足場又は融合パートナータンパク質に連結した抗原結合性キメラ又は融合タンパク質に関し、前記足場タンパク質は、前記ドメインの表面に接近可能であるか又は露出されている１個以上のアミノ酸部位において前記抗原結合性ドメインと連結されているため、前記抗原結合性ドメインのトポロジーが分断される。前記抗原結合性キメラタンパク質は更に、前記足場タンパク質に融合されていない抗原結合性ドメインと比較して、その抗原結合機能性を維持することを特徴とする。別の実施形態は、本発明の抗原結合性キメラタンパク質であって、足場タンパク質と抗原結合性ドメインの融合の結果として抗原結合性ドメインの一次トポロジーが分断され、別のタンパク質に融合されていない抗原結合性タンパク質のフォールディングと比較して、前記抗原結合性ドメインのフォールディングを維持することができるものを開示する。
本発明の特定の１実施形態において、前記融合は直接融合とすることもできるし、リンカー又はリンカーペプチドによる融合とすることもでき、前記融合部位は剛性で非柔軟性の融合タンパク質が得られるように完璧に設計されている。前記リンカーはアミノ酸残基数が１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個であることが好ましく、２個がより好ましく、１個が更に好ましく、又は直接融合である（リンカーなし）。別の実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質は、好ましくは抗原結合性ドメインのベータターン（βターン）又はループである露出領域に存在する少なくとも１個以上の接近可能な部位において融合されている。抗原結合性ドメインの表面の１個以上の接近可能部位又は露出部位において足場タンパク質を抗原結合性ドメインに連結した前記抗原結合性キメラタンパク質は、その抗原結合機能性を維持するために、前記接近可能部位又は露出部位が抗原結合性ループ又はＣＤＲループ以外のものであることを更に特徴とする。一つの実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質は、ＩＭＧＴ（Ｒ）国際参考命名法（Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４；図２５）に従って定義した場合に、少なくとも７本の逆平行βストランドと、前記βストランドを繋ぐ少なくとも３個のβターンからなる抗原結合性ドメインを含む。特定の１実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質の前記抗原結合性ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン又はＩｇフォールドを含む。具体的な１実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質の前記ＩｇドメインはＶＨＨに由来し、又は免疫グロブリンシングル可変ドメイン（ＩＳＶＤ）若しくはナノボディに由来することがより好ましい。
特定の１実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質の前記抗原結合性ドメインの露出領域は、ＩＭＧＴ命名法（図２５、Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４に基づく改訂版）に従うと、具体的にβターンＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、ＤＥ又はＥＦに相当する。従って、足場タンパク質は抗原結合性ドメインの内側で、前記抗原結合性ドメインのβストランドＡとβストランドＢを繋ぐ第１のβターン、又は前記抗原結合性ドメインのβストランドＣとβストランドＣ’を繋ぐβターン、又は前記抗原結合性ドメインのβストランドＣ”とβストランドＤを繋ぐβターン、又は前記抗原結合性ドメインのβストランドＤとβストランドＥを繋ぐβターン、又は前記抗原結合性ドメインのβストランドＥとβストランドＦを繋ぐβターンに挿入される（なお、前記βターンはＬｅＦｒａｎｃ ２０１４に基づく改訂版ＩＭＧＴに従って定義される）。具体的な１実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質は、前記抗原結合性ドメインのβストランドＡとβストランドＢを繋ぐβターンＡＢを含む前記ドメインの露出領域における接近可能な部位と足場タンパク質の融合により作製される。
本発明の別の実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質を作製するために使用される足場タンパク質は、循環置換タンパク質であり、より具体的には、前記足場タンパク質のＮ末端とＣ末端の間に循環置換を導入することができる。所定の実施形態において、循環置換足場タンパク質は前記足場タンパク質の別の接近可能な部位で切断され、Ｉｇドメインの接近可能な部位との融合部位を提供する。
別の実施形態は、足場タンパク質が単量体タンパク質である抗原結合性キメラタンパク質に関する。代替実施形態において、足場タンパク質は多量体又はオリゴマーを形成するタンパク質や、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の二十面体構造の一部であるか又はそれを形成するタンパク質のように、対称構造を有する。特定の１実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質は、足場が多量体であり、前記多量体足場の単量体の各々を介してその接近可能な部位でＩｇドメインと連結又は融合されている。別の実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインと足場タンパク質は更に、抗原結合性ドメインと足場タンパク質のいずれかに存在する２個のシステイン残基の間に共有結合的に形成されたジスルフィド結合を介して連結されている。本発明の別の実施形態は、足場タンパク質の総分子量が少なくとも３０ｋＤａである抗原結合性キメラタンパク質に関する。
本発明の特定の１実施形態は、足場タンパク質が抗原結合性ドメインを含む抗原結合性キメラタンパク質に関する。特に、前記足場タンパク質は免疫グロブリンドメイン、より特定的にはＶＨＨ、ＩＳＶＤ又はナノボディを含む。あるいは、前記足場タンパク質は免疫グロブリン様ドメインを含み、より具体的にはモノボディを含む。より具体的には、抗原結合性ドメインと抗原結合性ドメインを含む足場がそれらの抗原標的と特異的に結合する機能性を維持する抗原結合性キメラタンパク質が提供される。具体的な１実施形態において、抗原結合性ドメインを含む前記足場は、足場タンパク質と融合された抗原結合性ドメインとは別の標的と結合する。一つの代替実施形態において、足場タンパク質の抗原結合性ドメインの抗原標的は、前記足場タンパク質と融合された抗原結合性タンパク質ドメインの抗原標的と同一である。更に具体的には、抗原標的は抗原結合性キメラタンパク質の両方の抗原結合性ドメインで同一のタンパク質であるが、抗原標的上のそれらのエピトープは異なる。
別の実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質は標識されたタンパク質である。具体的な１実施形態において、標識は検出可能な標識である。別の実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインは標識された抗原結合性ドメインである。より具体的には、抗原結合性ドメイン若しくは足場タンパク質に融合若しくは連結されているか及び／又はこれらにより提供される前記標識は、新規抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインの抗原標的のインビボ及び／又は非共有結合的検出又は標識を可能にする。特定の１実施形態において、前記標識された抗原結合性キメラタンパク質は毒性標識を含んでいてもよく、治療用途に適用可能である。
本発明の別の態様は、上記抗原結合性キメラタンパク質のいずれかをコードする核酸分子に関する。あるいは、一つの実施形態では、少なくともプロモーターと、抗原結合性キメラタンパク質をコードする前記核酸分子と、転写終結シグナルを含む３’末端領域を含むキメラ遺伝子が提供される。別の実施形態は、前記抗原結合性キメラタンパク質をコードするか、又は前記抗原結合性キメラタンパク質をコードする核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含む発現カセットに関する。他の実施形態は、本発明の抗原結合性キメラタンパク質をコードする前記発現カセット又は核酸分子を含むベクターに関する。特定の実施形態において、前記ベクターは大腸菌での発現、又は酵母、ファージ、細菌若しくはウイルス（表面）ディスプレイに適している。別の実施形態では、本発明の抗原結合性キメラタンパク質を含む宿主細胞を開示する。あるいは、前記抗原結合性キメラタンパク質とその標的抗原を共発現させる宿主細胞を開示する。
本発明の別の態様は、前記抗原結合性キメラタンパク質とその標的タンパク質を含む複合体に関し、前記標的タンパク質は前記抗原結合性キメラタンパク質に特異的に結合している。より特定的には、前記標的タンパク質は前記抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインに結合しており、更に特定的には前記抗原結合性キメラタンパク質のＩｇドメインに結合しており、あるいはより具体的にはＩｇドメインのＣＤＲに結合している。
別の実施形態は、前記抗原結合性キメラタンパク質を含む組成物、又はより具体的には前記抗原結合性キメラタンパク質の医薬組成物を提供する。
本発明の別の実施形態は、本発明の第１の抗原結合性キメラタンパク質と第２の抗原結合性キメラタンパク質から形成される複合体を含む組成物に関し、前記第２の抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインは、前記第１の抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質と特異的に結合するか又はこれを認識する。
別の態様は、標的又は抗原タンパク質の構造解析用としての本発明の抗原結合性キメラタンパク質の使用、又は前記核酸分子、前記キメラ遺伝子、前記発現カセット、前記ベクター、前記複合体若しくは前記組成物の使用に関する。特に、前記標的タンパク質が前記抗原結合性キメラタンパク質に結合したタンパク質である場合の前記抗原結合性キメラタンパク質の使用に関する。具体的に、１実施形態は単粒子クライオＥＭ又は結晶構造解析を含む構造解析における前記抗原結合性キメラタンパク質の使用に関する。
別の実施形態は、足場タンパク質又は抗原結合性ドメインが標識されている前記抗原結合性キメラタンパク質を診断ツール、より具体的にはインビボイメージングに用いる場合の使用を提供する。
代替実施形態は、医薬用としての上記のような前記抗原結合性キメラタンパク質又は本発明で提供される核酸分子、発現カセット、ベクター、複合体若しくは組成物を提供する。
具体的な１実施形態は、本発明の抗原結合性キメラタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。
本発明の最後の態様は、標的若しくは抗原タンパク質又は目的タンパク質の三次元構造の決定方法として、
（ｉ）本発明の抗原結合性キメラタンパク質又は本発明の抗原結合性キメラタンパク質の複合体を含む組成物と、標的タンパク質を準備し、前記標的タンパク質を前記抗原結合性キメラタンパク質又は前記抗原結合性キメラタンパク質の組成物に特異的に結合させた複合体を形成する工程、
あるいは、本発明の複合体を準備する工程と；
（ｉｉ）構造解析に適した条件下で前記混合物又は複合体を提示させ、前記抗原又は標的タンパク質の三次元構造を高解像度で決定する工程を含む方法に関する。
以下の図面は模式図に過ぎず、これらに限定するものではない。図面中、要素によっては説明の目的で寸法を誇張し、縮尺通りでないものもある。
フレキシブルな融合タンパク質とリジッドな抗原結合性キメラタンパク質の比較。（Ａ）１箇所のみの直接融合又はリンカーを使用して抗原結合性ドメインと足場タンパク質のＮ又はＣ末端を融合したフレキシブル融合体又はリンカー。 フレキシブルな融合タンパク質とリジッドな抗原結合性キメラタンパク質の比較。（Ｂ）抗原結合性ドメインと足場タンパク質のリジッド融合体であり、抗原結合性ドメインを足場に連結する少なくとも２箇所の直接融合又はリンカーを介して抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合したもの。 ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンに足場タンパク質の循環置換変異体を挿入した抗原結合性キメラタンパク質のエンジニアリング原理。このスキームは、抗原結合性ドメインを足場に連結する２本のペプチドリンカー又は２本のショートリンカーを介してナノボディ（Ｎｂ）を大型の足場タンパク質にどのようにグラフトできるかを示す。はさみマークは、ナノボディと足場のどの露出ターンに切り込みを入れるべきかを示す。破線は、抗原結合性キメラタンパク質を作製するためにペプチド結合又はショートペプチドリンカーの使用によりＮｂと足場の残りの部分をどのようにコンカテマー化すべきかを示す。ＮｂのＣＤＲ、フレームワーク残基及びβターン領域はＩＭＧＴ（図２５、Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４に基づく改訂版）に従って定義される。 ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにＨｏｐＱの循環置換変異体を挿入した５８ｋＤＧＦＰ結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）ナノボディを足場に連結する２本のペプチド結合又はリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（上）とピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のＨｏｐＱのアドヘシンドメインの循環置換変異体（下）の融合により作製される抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ｂ）ＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）のβストランドＡをβストランドＢに繋ぐ第１のβターン（βターンＡＢ）に、ピロリ菌Ｇ２７株のタイプ１ＨｏｐＱのアドヘシンドメイン（下、ＰＤＢ５ＬＰ２、配列番号１９、ｃＨＯＰＱ）をコードする循環置換遺伝子を挿入した。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列（ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ、配列番号２０）。ナノボディに由来する配列を太字で示す。ＨｏｐＱに由来する配列を下線で示す。循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＮ末端とＣ末端を連結するペプチドをイタリック体で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上への抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの提示のフローサイトメトリー解析。シングルパラメーターヒストグラムは、Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰと融合させた抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２２）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換したＥＢＹ１００酵母細胞（上）の相対蛍光強度を非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（下）と比較して示す。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用して形質転換酵母細胞と非形質転換酵母細胞をＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面上に提示される抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの機能性のフローサイトメトリー解析。Ａｇａ２ｐ及びＡＣＰと融合させたＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２２）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞（上）の相対蛍光強度を非形質転換ＥＢＹ１００酵母細胞（下）と比較したドットプロット図。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用して形質転換酵母細胞と非形質転換酵母細胞をＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。 抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとＧＦＰの複合体の形成のサイズ排除クロマトグラフィーとＳＤＳ－ＰＡＧＥによる解析。ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の安定な複合体の形成を確認するためにＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＰＧカラム（１６／９０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した分析用ゲル濾過実験（Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。（Ａ）複合体形成のＳＥＣによる解析。灰色線：ＧＦＰのみを含む試料を２８０ｎｍ紫外吸収により測定したゲル濾過パターン。黒破線：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとＧＦＰを１：４モル比で含む試料を２８０ｎｍ紫外吸収により測定したゲル濾過パターン。黒線：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとＧＦＰを１：４モル比で含む試料を４８８ｎｍ紫外吸収により測定したゲル濾過パターン。（Ｂ）抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとＧＦＰの安定な複合体の形成のＳＤＳ ｐａｇｅによる確認。ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとＧＦＰを１：４モル比で含む試料をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＰＧカラムにアプライし、該当画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。 ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにＨｏｐＱの循環置換変異体を挿入した５８ｋＤＧＦＰ結合性キメラタンパク質のＸ線結晶構造。（Ａ）非対称単位中のＧＦＰ結合性キメラタンパク質（イラスト表示）１０個の配置。５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）は空間群Ｐ１で結晶化し、非対称単位中の分子数は１０であった。足場として使用したＨｏｐＱのアドヘシンドメイン（ＰＤＢ５ＬＰ２）を赤で示し、ＧＦＰ特異的Ｎｂを緑で示す。（Ｂ）ナノボディを足場（分子Ａ）に連結するペプチドは１．０σで表示した２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップで明白に表される。（Ｃ）非対称単位に含まれる全抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの構造アラインメント。非対称単位中の異なる分子間のＲＭＳＤは０．３～２．７Åである。 足場タンパク質ＨｏｐＱをナノボディに連結するリンカーペプチドの組成と長さを最適化するための酵母ディスプレイベクター。（Ａ）ディスプレイベクターの模式図。ＬＳ：酵母での細胞外分泌を指示する酵母α因子の人工分泌シグナルであるａｐｐＳ４（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ ｅｔ ａｌ．２００９）。Ｎ：抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）。ナノボディ：抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）。Ａｇａ２：Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＡＣＰ：提示された抗原結合性キメラタンパク質の発現レベルをモニターするための直交的標識用アシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。（Ｂ）提示された抗原結合性キメラタンパク質（配列番号３４～３７）の配列ダイバーシティ。ＡｐｐＳ４リーダー配列を標準書体で示し、メガボディｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７とランダムリンカーを太字で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、最後にｃＭｙｃタグを示す。（Ｃ）フォワードＰＣＲプライマー２種（配列番号１２６、配列番号１２７）とリバースＰＣＲプライマー２種（配列番号１２８、配列番号１２９）の等モル混合物を使用し、可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーを導入することにより、合計１８４，０００種のＡＡ配列変異体をコードする抗原結合性キメラタンパク質配列の（各々ライブラリーの２５％に相当する）４個のプールを作製した。 ＧＦＰ特異的ナノボディの（βストランドＡ及びＢを繋ぐ）第１の露出βターンにＹｇｊＫの循環置換変異体を挿入した１００ｋＤａ抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択によるモデル。（Ａ）ＧＦＰ特異的ナノボディ（上）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＹｇｊＫ（下）の融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ｂ）大腸菌Ｋ１２ＹｇｊＫ（ＰＤＢ３Ｗ７Ｓ、配列番号３８）をコードする循環置換遺伝子を融合させ、可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーを使用してＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）のβストランドＡをβストランドＢに繋ぐ第１のβターン（βターンＡＢ）にＹｇｊＫタンパク質を挿入した。（Ｃ）１００ｋＤａ抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３９～４２）。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、Ｙｇｊｋ配列を下線で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーである。Ｃ末端タグは６×ｈｉｓとＥＰＥＡを含む。 ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにＨｏｐＱの循環置換変異体を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質であって、ナノボディを足場に連結する人工ジスルフィド結合により更に剛性化したもの。ＧＦＰ特異的ナノボディ（配列番号１）のβストランドＡをβストランドＢに繋ぐ第１のβターン（ＡＢβターン）にピロリ菌Ｇ２７株のタイプ１ＨｏｐＱのアドヘシンドメイン（下、ＰＤＢ５ＬＰ２、配列番号１９）を挿入した抗原結合性キメラタンパク質の剛性を更に増すために、部位特異的突然変異誘発法を使用し、ナノボディを足場に連結する付加的なジスルフィド結合を構築した。（Ａ）Ｃ３５７とＣ４２５の間に人工ジスルフィド架橋を含む抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの突然変異体（配列番号４８）のモデル。（Ｂ）Ｃ３５８とＣ４８８の間に人工ジスルフィド架橋を含むＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの突然変異体（配列番号４９）のモデル。（Ｃ）Ｃ３５９とＣ４９０の間に人工ジスルフィド架橋を含むＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの突然変異体（配列番号５０）のモデル。（Ｄ）Ｃ１５とＣ５３４の間に人工ジスルフィド架橋を含むＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの突然変異体（配列番号５１）のモデル。 免疫グロブリンを足場に連結する３本のペプチド結合又はショートリンカーを介してナノボディの（βストランドＡ及びＢを繋ぐ）第１の露出βターンに足場タンパク質を挿入した抗原結合性キメラタンパク質のエンジニアリング原理。露出領域若しくはβターンの内側の１箇所以上の接近可能な部位、及び／又はタンパク質の末端の接近可能な部位で３箇所の直接融合又はリンカーによる３箇所の融合を介して抗原結合性ドメインを足場タンパク質に融合することができる。このスキームでは、βターンＡＢとナノボディのＣ末端を使用し、３本のペプチド結合又はショートリンカーを介してＩｇドメインを足場に連結した。はさみマークは、ナノボディと足場のどの露出ターンに切り込みを入れるべきかを示す。破線は、このような抗原結合性キメラタンパク質を作製するためにペプチド結合又はショートペプチドリンカーの使用によりＮｂと足場の残りの部分をどのようにコンカテマー化すべきかを示す。ＮｂのＣＤＲ、フレームワーク残基及びβターン領域はＩＭＧＴ（図２５、Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４に基づく改訂版）に従って定義される。 免疫グロブリンを足場に連結する３本のペプチド結合又はショートリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにＣｕ＋＋結合性タンパク質アズリン（Ａｚｕｒｉｎ）を挿入した抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）３本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）を緑膿菌（シュードモナス・エルギノーサ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のアズリン（下、ＰＤＢ２ＴＳＡ、配列番号５２）に連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質のモデル。銅イオンを青で示す。（Ｂ）ナノボディの第１のβストランド（βストランドＡ）、足場タンパク質（アズリン）のＮ末端部分、免疫グロブリンのＣ末端部分、足場（アズリン）のＣ末端部分の順に配置されている。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５３～６０）。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、アズリン配列を下線で示し、（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーである。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 免疫グロブリンを足場に連結する３本のペプチド結合又はリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディの（βストランドＡ及びＢを繋ぐ）第１の露出βターンに反転型糖質加水分解酵素足場タンパク質ＳｕｓＢを挿入した２回回転対称性をもつ二量体抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）３本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（左上及び右上、配列番号１）をバクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＳｕｓＢの反転型糖質加水分解酵素（下、ＰＤＢ３ＷＦＡ、配列番号６９）に連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質のモデル。ＳｕｓＢは２回回転対称性をもつオブリゲート二量体である。（Ｂ）ナノボディの第１のβストランド（βストランドＡ）、足場タンパク質（ＳｕｓＢ）のＮ末端部分、免疫グロブリンのＣ末端部分、足場のＣ末端部分の順に配置されている。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、ｓｕｓＢ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ｈｉｓとＥＰＥＡを含む。 バクテリオファージＰＰ７に由来する二十面体ＶＬＰへのナノボディのリジッドな提示。（Ａ）ナノボディ（外側の分子）９０コピーを規則的でリジッドなアレイとしてリジッドに提示する二十面体ＶＬＰ（内側の分子）の模式図。野生型二十面体ＰＰ７ウイルスはＰＰ７コートタンパク質の同一の１８０コピーから構成されるＴ＝３シェルをもつが、２個のコートタンパク質をＮ末端からＣ末端の方向に融合し、９０個の共有結合コートタンパク質二量体から構成されるＶＬＰを作製することができる（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。（Ｂ）ＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）を緑膿菌のバクテリオファージＰＰ７の共有結合コートタンパク質二量体の循環置換変異体（下、ＰＤＢ１ＤＷＮ）に連結した抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ｃ）ナノボディとＰＰ７の置換コートタンパク質二量体の連結スキーム。ナノボディのβストランドＡをβストランドＢに繋ぐ第１のβターンに、ＰＰ７のこの共有結合コートタンパク質二量体（配列番号３～６）をコードする循環置換遺伝子を挿入した。（Ｄ）抗原結合性キメラコートタンパク質のアミノ酸配列。ナノボディに由来する残基を太字で示す。（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーである。ＰＰ７コートタンパク質に対応する配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 バクテリオファージＭＳ２に由来する二十面体ＶＬＰへのナノボディのリジッドな提示。（Ａ）ナノボディ（外側の分子）９０コピーを規則的でリジッドなアレイとしてリジッドに提示する二十面体ＶＬＰ（内側の分子）の模式図。野生型ＭＳ２ウイルスはＭＳ２コートタンパク質の同一の１８０コピーから構成される二十面体シェルを形成するが、２個のコートタンパク質をＮ末端からＣ末端の方向に融合し、９０個の共有結合コートタンパク質二量体から構成されるＶＬＰを作製することができる（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。（Ｂ）リゾチーム特異的ナノボディ（上、配列番号７）を大腸菌のバクテリオファージＭＳ２の共有結合コートタンパク質二量体の循環置換変異体（下、ＰＤＢ２ＭＳ２）に連結した抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ｃ）ナノボディとＭＳ２の置換コートタンパク質二量体の連結スキーム。ナノボディのβストランドＡをβストランドＢに繋ぐ第１のβターンに、ＭＳ２のこの共有結合コートタンパク質二量体をコードする循環置換遺伝子を挿入した（配列番号９）。（Ｄ）抗原結合性キメラコートタンパク質のアミノ酸配列。ナノボディに由来する残基を太字で示す。（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーである。ＭＳ２コートタンパク質に対応する配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 抗原結合性ドメインをＡＣＰに連結する２本のペプチド結合又はショートリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにアシルキャリアタンパク質を挿入した抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）２本のペプチドリンカーを介して大腸菌に由来するアシルキャリアタンパク質（下、ＰＤＢ１Ｔ８Ｋ、配列番号８６）にＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）を連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質の三次元モデル。この特定の抗原結合性キメラタンパク質では、野生型ＡＣＰのＮ末端とＣ末端が相互に近接しており、ナノボディをＡＣＰに連結する２本の短いポリペプチド結合を構築するために十分に配置されているため、足場タンパク質の循環置換は不要であった。反応性セリンを左下に示す。（Ｂ）ナノボディの第１のβストランド（βストランドＡ）、ＡＣＰ、ナノボディのＣ末端部分の順に配置されている。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、ＡＣＰ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 双方の免疫グロブリンドメインを連結する３本のペプチド結合又はショートリンカーを介してナノボディを別のナノボディに挿入した抗原結合性キメラタンパク質のエンジニアリング原理。このスキームは、抗原結合性ドメインを相互に連結する３本のペプチド結合又は３本のショートリンカーを介してどのようにナノボディ（Ｎｂ）を別のナノボディと融合できるかを示す。はさみマークは、連結しようとするナノボディのどの露出ターンに切り込みを入れるべきかを示す。破線は、これらの抗原結合性キメラタンパク質を作製するためにペプチド結合又はショートペプチドリンカーの使用により両方のナノボディの残りの部分をどのようにコンカテマー化すべきかを示す。ＮｂのＣＤＲ、フレームワーク残基及びβターン領域はＩＭＧＴ（図２５、Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４に基づく改訂版）に従って定義される。 ナノ２ボディ（Ｎａｎｏ２ｂｏｄｉｅｓ）抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）図１７に従って３本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（ナノボディＢ、配列番号１）をリゾチーム結合性ナノボディ（ナノボディＡ、配列番号７）に連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質の三次元モデル。（Ｂ）ナノボディＡとナノボディＢの連結スキーム。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）。ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、リゾチーム結合性ナノボディ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ナノ２ボディ抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）図１７に従って３本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（ナノボディＢ、配列番号１）をＦｅｄＦ結合性ナノボディ（ナノボディＡ、配列番号１７）に連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質の三次元モデル。（Ｂ）ナノボディＡとナノボディＢの連結スキーム。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８）。ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、ＦｅｄＦ結合性ナノボディ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ナノボディ免疫ライブラリーに由来する抗原結合性キメラタンパク質をファージディスプレイ法又は酵母ディスプレイ法により作製及び選択するために用いる代表的なベクター。本図に示すベクターは、抗原結合性ドメインを足場に連結する２本のペプチド結合又は２本のショートリンカーを介してナノボディを大型の（任意に循環置換された）足場タンパク質と融合した抗原結合性キメラタンパク質をコードする。ＬＳ：リーダー配列。ｐＩＩＩ：繊維状ファージＭ１３の結合タンパク質。Ａｇａ２：酵母細胞表面から突き出たＡｇａ２ｐタンパク質接着サブユニット。ＡＣＰ：提示された抗原結合性キメラタンパク質の発現レベルをモニターするための直交的標識用アシルキャリアタンパク質。抗原結合性ドメインをコードする遺伝子のコレクションから（βストランドＢ～Ｇを含む）Ｃ末端部分をクローニングすることにより、大きな抗原結合性キメラタンパク質ディスプレイライブラリーを構築することができ、このような遺伝子はナノボディの場合には例えば免疫したラマの遺伝子からクローニングでき、あるいは合成ライブラリーから入手できる。 ナノボディ免疫ライブラリーに由来し、酵母ディスプレイ法とそれに続いてＦＡＣＳにより選択したＧＦＰ特異的抗原結合性キメラタンパク質の配列解析。ＧＦＰを免疫したラマの血液試料からクローニングした後にＨｏｐＱと融合させたナノボディから出発して構築した抗原結合性キメラタンパク質ライブラリーから酵母ディスプレイ法とそれに続いてＦＡＣＳにより選択した９種のＧＦＰ特異的抗原結合性キメラタンパク質（配列番号９５～１０３）の多重アミノ酸配列アラインメント。βストランドＢ～βストランドＧを含むナノボディのＣ末端部分のみを示す。 ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＣ及びＣ’を繋ぐβターンにＨｏｐＱの循環置換変異体を挿入した５８ｋＤＧＦＰ結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）βストランドＣ及びＣ’を繋ぐβターンを介して足場をナノボディにグラフトするためのエンジニアリング原理。はさみマークはナノボディと足場のどの露出ターンに切り込みを入れるべきかを示す。破線は、これらの抗原結合性キメラタンパク質を作製するためにペプチド結合又はショートペプチドリンカーの使用によりナノボディと足場の残りの部分をどのようにコンカテマー化すべきかを示す。ＮｂのＣＤＲ、フレームワーク残基及びβターン領域はＩＭＧＴ（図２５、Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４に基づく改訂版）に従って定義される。（Ｂ）２本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（上）をＨｏｐＱ（下）に連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質の三次元モデル。（Ｃ）ナノボディの第３のβストランド（βストランドＣ）、足場の環状化変異体、ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＣ’～Ｇの順に配置されている。（Ｄ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示す。 モノボディＮＳ１のβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにＨｏｐＱの循環置換変異体を挿入した５８ｋＤＧＦＰ結合性キメラタンパク質のモデル。（Ａ）ナノボディを足場に連結する２本のペプチド結合又はリンカーを介してＫ－Ｒａｓ特異的モノボディＮＳ１（上）とピロリ菌のＨｏｐＱのアドヘシンドメインの循環置換変異体（下）を融合することにより作製した抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ｂ）Ｋ－ＲＡＳ特異的モノボディ（上、配列番号１１２）のβストランドＡをβストランドＢに繋ぐ第１のβターン（βターンＡＢ）に、ピロリ菌Ｇ２７株のタイプ１ＨｏｐＱのアドヘシンドメイン（下、ＰＤＢ５ＬＰ２、配列番号１９）をコードする循環置換遺伝子を挿入した。（Ｃ）ＮＳ１とＨｏｐＱから作製した抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列。ナノボディに由来する配列を太字で示す。ＨｏｐＱに由来する配列を下線で示す。循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＮ末端とＣ末端を連結するペプチドをイタリック体で示し、（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーである。 抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ及びＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２とＧＦＰの相互作用をＯｃｔｅｔで解析したキネティック特性決定。ＧＦＰ結合性ナノボディＮｂＧＦＰ２０７（配列番号１）、抗原結合性キメラタンパク質ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）及びＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１４１）とＧＦＰの相互作用をバイオレイヤー干渉法により解析したリアルタイムキネティック解析。ストレプトアビジンをコートしたＯｃｔｅｔ（Ｒ）バイオセンサーを使用してビオチン化ＧＦＰ（０．７５μｇ／ｍＬ）を捕捉し、数種の濃度（６０～２．２２ｎＭの範囲）のＮｂＧＦＰ２０７（Ａ）、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（Ｂ）及びＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（Ｃ）との関連性を調べた。測定した応答（黒線）を単相１：１結合モデル（赤線）に当てはめた。アッセイは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．３，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中で実施した。（Ｄ）キネティック計算値をｎ＝３の独立した実験からの標本平均の平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として示す。 ＬｅＦｒａｎｃ（２０１４）に基づく改訂版ＩＭＧＴによる免疫グロブリン可変領域構造及びトポロジー。（Ａ）ＩＭＧＴストランド及びループ定義（ＬＦｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）による三次元構造リボン図。（Ｂ）水素結合を含む二層のＩＭＧＴコリエドペルル（Ｃｏｌｌｉｅｒ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓ）。二層のＩＭＧＴコリエドペルルは手前側に（ＩＧのＶＨ／ＶＬ界面に位置するシートを形成する）ＧＦＣＣ’Ｃ”ストランドを示し、奥側にＡＢＥＤストランドを示す。水素結合（オンラインで緑色の線であり、ここではＧＦＣＣ’Ｃ”シートのみについて示す）を含むＩＭＧＴコリエドペルルはＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢデータベースに組み込まれたＩＭＧＴ／Ｃｏｌｌｉｅｒ－ｄｅ－Ｐｅｒｌｅｓツールにより実験三次元構造データから作成される（Ｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ，２０１１）。 他の抗原結合性キメラタンパク質と結合して伸長させる抗原結合性キメラタンパク質の模式図。（Ａ）ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱｍｕｔ２（配列番号１３４）又はＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱｍｕｔ３（配列番号１３４）は別のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）と結合してこれを伸長させ、１１６ｋＤａの伸長型抗原結合性キメラタンパク質となる。（Ｂ）ＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊＫ（配列番号１３５）はＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）と結合してこれを伸長させ、分子量１６８ｋＤａの伸長型抗原結合性キメラタンパク質となる。 ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱと複合体化したＮｂ６０の結晶構造であり、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱのｃＨｏｐＱに含まれる足場タンパク質上にＮｂ６０のエピトープが存在していることが分かる。 化学的リンカーユニットの集積体を使用して抗原結合性ドメインを足場タンパク質と連結した抗原結合性キメラタンパク質の模式図。 ポリボディと称する抗原結合性キメラタンパク質とＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの相互作用をＯｃｔｅｔで解析したキネティック特性決定。ＨｏｐＱ特異的ナノボディＮｂ６０（配列番号１３２）、ＨｏｐＱ特異的ＭｂＮｂ６０ ｃＨｏｐＱｍｕｔ２（配列番号１３３）、ＨｏｐＱ特異的ＭｂＮｂ６０ ｃＨｏｐＱｍｕｔ３（配列番号１３４）及びＨｏｐＱ特異的ＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１３５）とＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）の結合をバイオレイヤー干渉法により解析したリアルタイムキネティック解析。ストレプトアビジンをコートしたＯｃｔｅｔ（Ｒ）バイオセンサーを使用してビオチン化ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（０．２５μｇ／ｍＬ）を捕捉した。Ｎｂ６０（Ａ）、ＭｂＮｂ６０ ｃＨｏｐＱｍｕｔ２（Ｂ）、ＭｂＮｂ６０ ｃＨｏｐＱｍｕｔ３（Ｃ）及びＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊｋＥ２（Ｄ）について数種の濃度（１．６７～５００ｎＭの範囲）で結合及び解離等温線をモニターした。全アッセイは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．３，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０及び１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中で実施した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２２）と、酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体の代表例（表２）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。ＭＰ１３３１＿Ａ９メガボディ変異体（Ａ）及びＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（Ｂ）をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット図。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して各酵母クローンの相対ＣｏＡ－６４７蛍光（メガボディ提示レベル）と相対ＧＦＰ蛍光（ＧＦＰ結合）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。（Ｃ）ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２２）と各ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体（表２）の相対ＣｏＡ－６４７及びＧＦＰ蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）計算値のグラフ。 ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱと、酵母ディスプレイ法により選択した４種のＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ変異体を大腸菌で発現させ、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製した後のサイズ排除クロマトグラフィーによる特性決定。酵母ディスプレイ法により選択した１－１アミノ酸ペプチドリンカーを含むＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ変異体を大腸菌で発現させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧカラム（１０／３００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った分取ゲル濾過実験。ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号１３６）クローンは野生型連結変異体に相当し、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＡ５（配列番号１３７）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＡ１２（配列番号１３８）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＢ７（配列番号１３９）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＧ１０（配列番号１４０）は夫々表２のＭＰ１３３１＿Ａ５、ＭＰ１３３１＿Ａ１２、ＭＰ１３３１＿Ｂ７、ＭＰ１３３１＿Ｇ１０クローンに相当する。 ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱと、酵母ディスプレイ法により選択した４種の変異体のＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号１３６）と、酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＡ５、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＡ１２、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＢ７、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＧ１０の４種の変異体（配列番号１３７～１４０）と、ＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱ（配列番号１３１）をサイズ排除により精製し、ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してメガボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグを検出した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。３回実施した実験（ｎ＝３）からの標本平均の平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）としてデータを示す。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体の代表例（表３）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ａ）ＭＰ１３３３＿Ａ２メガボディ変異体をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット図。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して各酵母クローンの相対ＣｏＡ－６４７蛍光（メガボディ提示レベル）と相対ＧＦＰ蛍光（ＧＦＰ結合）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体の代表例（表３）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ｂ）各ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体（表３）の相対ＣｏＡ－６４７及びＧＦＰ蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）計算値のグラフ。 酵母ディスプレイ法により選択した４種のＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体のＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。異なるＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体（配列番号１４１～１４４）であるＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＡ２、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＣ４、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＦ５変異体を含むペリプラズム抽出液をＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱ（配列番号１３１）と比較した。ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルで全試料をインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してメガボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグを検出した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。 大腸菌で発現させ、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２変異体のサイズ排除クロマトグラフィーによる特性決定。（Ａ）大腸菌のペリプラズムで発現させ、分取用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧゲル濾過カラム（１６／２６，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１４１）の解析。（Ｂ）（Ａ）に記載したサイズ排除実験からの画分「ピーク１」におけるＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２メガボディの純度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。精製したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（左レーン：「ピーク１」）の試料を８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにアプライし、分子量マーカー（右レーン：Ｍ）との比較により分子量が約１００ｋＤａであることを確認した。 ナノボディを足場に連結する人工ジスルフィド結合により更に剛性化したＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体の機能的及び生物物理学的特性決定。１０種のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体のＧＦＰ結合解析をＥＬＩＳＡにより解析した。（Ａ）ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）と４種のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣｙｓ１～４変異体（配列番号４８～５１，図１０参照）をサイズ排除により精製し、ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。 ナノボディを足場に連結する人工ジスルフィド結合により更に剛性化したＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体の機能的及び生物物理学的特性決定。１０種のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体のＧＦＰ結合解析をＥＬＩＳＡにより解析した。（Ｂ）ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号１３６）とＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣｙｓ５～１０の４種の変異体（配列番号１４５～１５０）をサイズ排除により精製し、ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してメガボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグを検出した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。３回実施した実験（ｎ＝３）からの標本平均の平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）としてデータを示す。 ナノボディを足場に連結する人工ジスルフィド結合により更に剛性化したＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体の機能的及び生物物理学的特性決定。１０種のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体のＧＦＰ結合解析をＥＬＩＳＡにより解析した。（Ｃ）サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）によりＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ変異体の熱安定性解析を行った。ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号１３６）、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣｙｓ４（配列番号５１）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣｙｓ５（配列番号１４５）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣｙｓ６（配列番号１４６）及びＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣｙｓ１０（配列番号１５０）の各変異体の正規化融点プロファイルのグラフ。融点（Ｔｍ）計算値を表４に示す。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体の代表例（表５）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ａ）ＭＰ１３０４＿Ｂ２メガボディ変異体をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット図。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して各酵母クローンの相対ＣｏＡ－６４７蛍光（メガボディ提示レベル）と相対ＧＦＰ蛍光（ＧＦＰ結合）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体の代表例（表５）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ｂ）各ＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（表５）の相対ＣｏＡ－６４７及びＧＦＰ蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）計算値のグラフ。 酵母ディスプレイ法により選択した８種のＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体のＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。異なるＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（配列番号１５１～１５８）を含む８種のペリプラズム抽出液と、ＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱ（配列番号１３１）を含む１種の抽出液を、ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してメガボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグを検出した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。３回実施した実験（ｎ＝３）からの標本平均の平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）としてデータを示す。 ＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。異なるＭｂＮｂ２０７ ｃＰＰ７ｘ２Ｌキメラタンパク質（配列番号３～６）を含むペリプラズム抽出液を、ＧＦＰ（０．１μｇ／ウェル）を固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してキメラｃＰＰ７二量体のＣ末端に存在するＥＰＥＡタグの検出を行った。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。 バクテリオファージＡＰ２０５に由来する二十面体ＶＬＰへのナノボディのリジッドな提示。（Ａ）ナノボディ（外側の分子）９０コピーを規則的でリジッドなアレイとしてリジッドに提示する二十面体ＶＬＰ（内側の分子）の模式図。（Ｂ）ＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）をアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）細菌の二十面体ＲＮＡバクテリオファージであるＡＰ２０５の共有結合コートタンパク質二量体（下、ＰＤＢ５ＦＳ４）に連結した抗原結合性キメラタンパク質のモデル。（Ｃ）ナノボディとＡＰ２０５のコートタンパク質の連結スキーム。（Ｄ）抗原結合性キメラコートタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１６７）。ナノボディに由来する残基を太字で示す。Ｘは１アミノ酸のショートランダムペプチドリンカーである。ＡＰ２０５コートタンパク質に対応する配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ３７２個のクローンのＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ｘ２ＸＸ二量体（配列番号１６７）を含むペリプラズム抽出液（ＭＰ番号で示す）を、ＧＦＰ（０．１μｇ／ウェル）を固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してキメラＡＰ２０５二量体のＣ末端に存在するＥＰＥＡタグの検出を行った。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。 二量体抗原結合性キメラタンパク質へのナノボディのリジッドな提示。（Ａ）βストランドＡ交換を伴う二量体抗原結合性キメラタンパク質のモデル。ＡＰ２０５単量体は集合して二量体となる。機能的抗原結合性キメラを得るためには、第１の単量体のＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＡが第２の単量体のＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇと結合する必要があり、第２の単量体のＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇが第１の単量体のＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＡと結合し、集合して二量体抗原結合性キメラタンパク質となる必要がある。（Ｂ）２個のＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）を各々ＡＰ２０５のコートタンパク質単量体と連結した同一の二量体抗原結合性キメラタンパク質のモデル（９０°回転）。（Ｃ）ナノボディとＡＰ２０５のコートタンパク質の連結スキーム。（Ｄ）抗原結合性キメラコートタンパク質のアミノ酸配列（配列番号 １７３）。ナノボディに由来する残基を太字で示す。Ｘは１アミノ酸のショートランダムペプチドリンカーである。ＡＰ２０５コートタンパク質に対応する配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ３７２個のクローンのＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ＸＸの二量体（配列番号１７３）を含むペリプラズム抽出液（ＭＰ番号で示す）を、ＧＦＰ（０．１μｇ／ウェル）を固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）を使用してＡＰ２０５二量体のＣ末端に存在するＥＰＥＡタグの検出を行った。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。 ３７２個のクローンのＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ＸＸの二量体（配列番号１７３）を含むペリプラズム抽出液（ＭＰ番号で示す）を、ＧＦＰ（０．１μｇ／ウェル）を固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）を使用してＡＰ２０５二量体のＣ末端に存在するＥＰＥＡタグの検出を行った。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール（ＮａｎｏＴｏｏｌ）変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体の代表例（表９）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ａ）ＭＰ１３０２＿Ｄ１０ナノツール変異体をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット図。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して各酵母クローンの相対ＣｏＡ－６４７蛍光（ナノツール提示レベル）と相対ＧＦＰ蛍光（ＧＦＰ結合）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。（Ｂ）各ＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体（表９）の相対ＣｏＡ－６４７及びＧＦＰ蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）計算値のグラフ。 酵母ディスプレイ法により選択した６種のＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体のＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。６種のＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰ（配列番号１７８～１８３）変異体とＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱ（配列番号１３１）を含むペリプラズム抽出液を、ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してメガボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグを検出した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。３回実施した実験（ｎ＝３）からの標本平均の平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）としてデータを示す。 抗原結合性キメラタンパク質であるナノ２ボディのモデル。（Ａ）図１７に従って３本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（ナノボディＢ、配列番号１）をＦｅｄＦ結合性ナノボディ（ナノボディＡ、配列番号１７）に連結した融合体から構成されるエネルギー的により良好な抗原結合性キメラタンパク質の三次元モデル。（Ｂ）ナノボディＡとナノボディＢの連結スキーム。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１８４～１８５）。ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、ＦｅｄＦ結合性ナノボディ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 代表的なクローンのＥＬＩＳＡによるＧＦＰ及びＦｅｄＦ結合解析。ＧＦＰ（０．５μｇ／ウェル）を固定化したウェル、ＦｅｄＦ（０．５μｇ／ウェル）を固定化したウェル又はコートなしのウェルで半精製ナノ２ボディ試料（配列番号１８６～１９１）をインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）を使用してナノ２ボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグの検出を行った。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７ＣＣ’メガボディ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７ＸＣＣ’メガボディ変異体の代表例（表１１）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ａ）ＭＰ１３２７＿Ｄ５メガボディ変異体をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット図。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して各酵母クローンの相対ＣｏＡ－６４７蛍光（メガボディ提示レベル）と相対ＧＦＰ蛍光（ＧＦＰ結合）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７ＣＣ’メガボディ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７ＸＣＣ’メガボディ変異体の代表例（表１１）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ ＧＦＰと共にインキュベートした。（Ｂ）各ｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７ＣＣ’メガボディ変異体（表１１）の相対ＣｏＡ－６４７及びＧＦＰ蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）計算値のグラフ。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ変異体の代表例（表１２）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－４８８（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７で標識したＫ－ＲＡＳと共にインキュベートした。（Ａ）ＭＰ１３２６＿Ａ１１メガボディ変異体をコードするｐＣＴＣＯＮ２誘導体で形質転換した個々のＥＢＹ１００酵母細胞の相対蛍光強度のドットプロット図。Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して各酵母クローンの相対ＣｏＡ－４８８蛍光（メガボディ提示レベル）と相対Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７蛍光（Ｋ－Ｒａｓ結合）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。 ＥＢＹ１００酵母細胞の表面に提示されるＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ変異体の機能性のフローサイトメトリー解析。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ変異体の代表例（表１２）をＥＢＹ１００細胞上にＡｇａ２ｐとＡＣＰの融合体として提示させた。個々の酵母クローンを別々に誘導し、ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用してＣｏＡ－４８８（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭ Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７で標識したＫ－ＲＡＳと共にインキュベートした。（Ｂ）各ＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ変異体（表１２）の相対ＣｏＡ－４８８及びＤｙｌｉｇｈｔ－６４７蛍光の平均蛍光強度（ＭＦＩ）計算値のグラフ。 結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するドデシン（Ｄｏｄｅｃｉｎ）Ｒｖ１４９８Ａへのナノボディのリジッドな提示。（Ａ）ナノボディ（外側の分子）１２コピーを規則的でリジッドなアレイとしてリジッドに提示するドデシンＲｖ１４９８Ａ（内側の分子）の模式図。（Ｂ）２本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（上、配列番号１）をＲｖ１４９８Ａ単量体（下、配列番号１９２）と連結した融合体から構成される抗原結合性キメラタンパク質の三次元モデル。この特定の抗原結合性キメラタンパク質では、野生型Ｒｖ１４９８ＡのＮ末端とＣ末端が相互に近接しており、ナノボディをＲｖ１４９８Ａに連結する２本の短いポリペプチド結合を構築するために十分に配置されているため、足場タンパク質の循環置換は不要であった。（Ｃ）ナノボディの第１のβストランド（βストランドＡ）、Ｒｖ１４９８Ａ、ナノボディのＣ末端部分の順に配置されている。（Ｄ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１は１アミノ酸長で混合組成のショートペプチドリンカーであり、Ｒｖ１４９８Ａ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ６種の選択されたＭｂＮｂ２０７ Ｄｏｄｅｃｉｎ変異体のＥＬＩＳＡによるＧＦＰ結合解析。６種のＭｂＮｂ２０７ Ｄｏｄｅｃｉｎ変異体（表１３）とＮｂＧＦＰ２０７ナノボディ（配列番号１）を含むペリプラズム抽出液を、ＧＦＰを固定化したウェル又はコートなしのウェルでインキュベートした。ストレプトアビジン－アルカリコンジュゲートと混合したビオチン化抗ＥＰＥＡ（Ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｌｅｃｔ Ｃタグ）抗体を使用してメガボディのＣ末端に存在するＥＰＥＡタグを検出した。４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物基質（ＤＮＰＰ）と共にインキュベーション後に４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定した。３回実施した実験（ｎ＝３）からの標本平均の平均標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）としてデータを示す。 バークホルデリア・セノセパシア（Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）に由来するジスルフィド架橋ホモ二量体へのナノボディのリジッドな提示。（Ａ）２本のペプチドリンカーを介してＧＦＰ特異的ナノボディ（外側の分子、配列番号１）にリジッドに融合された４ＱＹＢ（内側の分子、配列番号２００）のホモ二量体の模式図。（Ｂ）ナノボディの第１のβストランド（βストランドＡ）、４ＱＹＢ、ナノボディのＣ末端部分の順に配置されている。（Ｃ）得られた抗原結合性キメラタンパク質のアミノ酸配列。ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１－２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、４ＱＹＢ配列を下線で示す。Ｃ末端タグは６×ＨｉｓとＥＰＥＡを含む。 ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下又は不在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔのリガンド結合性。ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔとの結合（黒上向き三角）について［３Ｈ］－ジヒドロアルプレノロール（［３Ｈ］－ＤＨＡ）と競合する種々のリガンドを試験し、Ｎｂ８０の存在下（黒四角）、β２ＡＲ－ｗｔ単独（灰色丸）又は無関係のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの存在下（灰色三角）におけるβ２ＡＲ－ｗｔとの結合と比較した放射性リガンド置換アッセイ。天然アゴニストであるエピネフリン（Ａ）とアゴニスト（－）－イソプロテレノール（Ｂ）を夫々競合リガンドとして使用してβ２ＡＲ－ｗｔ受容体で競合アッセイを実施した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍの標準設定を使用して曲線を非線形回帰により競合結合用モデルに当てはめた。
以下、所定の図面を参照しながら特定の実施形態について本発明を説明するが、本発明は以下の説明に制限されず、特許請求の範囲のみに制限される。特許請求の範囲に参照符号を記載する場合には範囲を制限するものと解釈すべきではない。当然のことながら、必ずしも全ての側面又は利点が本発明の特定の実施形態に従って達成されるわけではない。従って、例えば当業者であれば、本願に教示又は示唆され得る他の側面又は利点を必ずしも達成しないとしても、本願に教示する一つの利点又は１群の利点を達成又は最適化する方法で本発明を具体化又は実施できると理解されよう。
本発明はその特徴及び利点と共に構成及び実施方法の両面に関して、添付図面に照らして以下の詳細な説明を参照することにより最良に理解することができる。本発明の側面及び利点は以下に記載する実施形態を参照することにより明白に理解されよう。本明細書の随所で「一つの実施形態」又は「１実施形態」に言及する場合には、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書の随所で種々の状況で「一つの実施形態において」又は「一実施形態において」なる文言が出現する場合には、必ずしも全てが同一の実施形態を指すものではないが、同一の実施形態を指す場合もある。同様に、当然のことながら、本発明の代表的な実施形態の説明において、開示を簡素化すると共に種々の発明の側面の一つ以上を理解し易くする目的で本発明の種々の特徴を単一の実施形態、図面又は記載でまとめている場合がある。しかし、この開示方法は特許請求の範囲に記載する発明が各請求項で明示しているもの以上の特徴を必要とするという意味に解釈すべきではない。むしろ、後記特許請求の範囲から明らかなように、発明の側面は特許請求の範囲に先立って開示する単一の実施形態の全ての特徴よりも少ない特徴にある。
定義
単数名詞に言及する際に例えば「ａ」又は「ａｎ」、「ｔｈｅ」といった不定冠詞又は定冠詞を使用する場合には、特に指定しない限り、複数のその名詞を含む。本明細書と特許請求の範囲において「含む」なる用語を使用する場合には、他の要素又は工程を排除するものではない。更に、明細書と特許請求の範囲において第１、第２、第３等の用語は同様の要素を区別するために使用するものであり、必ずしも経時的又は時間的順序を表すために使用するものではない。当然のことながら、このように使用する用語は妥当な状況下で交換可能であり、本願に記載する発明の実施形態は本願に記載又は図示する以外の順序で実施することが可能である。以下の用語又は定義は単に本発明を理解し易くすることを目的とする。本願で特に定義しない限り、本願で使用する全ての用語は本発明の技術分野の当業者に使用されている意味と同一の意味である。当技術分野の定義と用語について、実施者は特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）を参照されたい。本願に記載する定義は当技術分野における通常の知識を有する者により理解されるよりも狭い範囲に解釈すべきではない。
量、時間の長さ等の測定可能な数値に言及する際に本願で使用する「約」とは、開示する方法を実施するためにこのような変動が適切であるという条件で、指定値の±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更に好ましくは±１％、より一層好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味する。本願で使用する「同様」とは、類似、相似、同等、対応及び～様と同義であり、同一若しくは共通の特性をもつこと、及び／又は定量的に同等結果を示すこと、即ち、最大変動が２０％、１０％、より好ましくは５％、又は更に好ましくは１％以下であることを意味する。
本願で使用する「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」又は「核酸分子」とは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかを問わず、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は分子の一次構造のみを意味する。従って、この用語は２本鎖と１本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。更に、公知型の修飾も含み、例えばメチル化や、天然ヌクレオチドの１個以上を類似体で「キャップ」置換することも含む。「核酸コンストラクト」とは、自然界では共存しない１個以上の機能的単位を含むように作製された核酸配列を意味する。例としては、環状、直線状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（λファージに由来するＣＯＳ配列を含むプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノム等が挙げられる。
「コーディング配列」とは、適切な調節配列の制御下におかれたときにｍＲＮＡに転写及び／又はポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳終止コドンにより区切られる。コーディング配列としては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限定するものではなく、所定の状況ではイントロンも存在する場合がある。
本願で使用する「遺伝子のプロモーター領域」とは、コーディング配列と機能的に連結され、場合によっては適切な誘導条件下に置かれたときに前記コーディング配列の転写を促進するために十分となる機能的ＤＮＡ配列単位を意味する。「機能的に連結」とは、このように表現された成分がそれらに予定された通りに機能できるような関係にあることを意味する。コーディング配列と「機能的に連結された」プロモーター配列は、プロモーター配列に適合可能な条件下でコーディング配列の発現が行われるようにライゲーションされている。本願で使用する「遺伝子」とは、遺伝子のプロモーター領域とコーディング配列の両方を含む。この用語は（考えられるイントロンを含む）ゲノム配列を意味すると共に、スプライシングされたメッセンジャーに由来し、プロモーター配列と機能的に連結されたｃＤＮＡも意味する。「ターミネーター」又は「転写終結シグナル」なる用語は、転写単位の末端のＤＮＡ配列であり、一次転写産物の３’プロセッシング及びポリアデニル化と転写の終結を指示する制御配列を意味する。ターミネーターは天然遺伝子、種々の他の植物遺伝子、又はＴ－ＤＮＡに由来するものとすることができる。付加するターミネーターは例えばノパリンシンターゼ又はオクトピンシンターゼ遺伝子、あるいは別の植物遺伝子に由来するものでよく、あまり好ましくはないが、他のあらゆる真核生物遺伝子に由来するものでもよい。
「キメラ遺伝子」又は「キメラコンストラクト」又は「キメラ遺伝子コンストラクト」とは、ｍＲＮＡをコードする核酸配列とプロモーター又は調節核酸配列を機能的に連結又は会合させた組換え核酸配列であって、会合させた核酸コーディング配列の転写又は発現を調節核酸配列により調節できるようにしたものを意味する。キメラ遺伝子の調節核酸配列は自然界に存在するような会合核酸配列とは機能的に連結されていない。
「発現カセット」は、発現カセットのプロモーターと機能的に連結された目的遺伝子／コーディング配列の発現を行うことが可能なあらゆる核酸コンストラクトを含む。発現カセットは一般に、好ましくは（５’→３’の転写方向に）プロモーター領域と、転写開始領域と機能的に連結されたポリヌクレオチド配列、ホモログ、変異体又はその断片と、ＲＮＡポリメラーゼの停止シグナル及びポリアデニル化シグナルを含む終結配列を含むＤＮＡコンストラクトである。当然のことながら、これらの領域の全てが形質転換させようとする原核細胞や真核細胞等の生体細胞中で機能できなければならない。ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むことが好ましい転写開始領域を含むプロモーター領域と、ポリアデニル化シグナルは、形質転換させる生物細胞に由来するものでもよいし、このような領域が生物細胞中で機能的であるならば、代替源に由来するものでもよい。このようなカセットから「ベクター」を作製することができる。
本願で使用する「ベクター」、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」又は「遺伝子導入ベクター」なる用語は、これを連結した別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を意味するものであり、当業者に公知のあらゆるベクターを含み、あらゆる適切なタイプを含み、限定するものではないが、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージ等のファージベクター、アデノウィルス、ＡＡＶ若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターが挙げられる。発現ベクターはプラスミドとウイルスベクターを含み、一般に所望のコーディング配列と、機能的に連結させたコーディング配列を特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物）又はインビトロ発現システムで発現させるために必要な適切なＤＮＡ配列を含む。発現ベクターはこれを導入した宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、宿主細胞中で機能する複製起点をもつベクター）。他のベクターは宿主細胞に導入後に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。適切なベクターは必要に応じて特定の宿主生物（例えば細菌細胞、酵母細胞）に即してプロモーター、エンハンサー、ターミネーター配列等の調節配列を含む。所定の所望のＤＮＡ断片を構築・増幅するためにはクローニングベクターが一般に使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を含んでいなくてもよい。原核細胞にトランスフェクションするのに使用される発現ベクターの作製も当技術分野で周知であるため、標準技術により実施することができる（当技術分野の定義と用語については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）参照）。
「宿主細胞」は原核細胞でも真核細胞でもよい。これらの細胞に一過的又は安定的にトランスフェクションすることができる。このように発現ベクターを原核細胞及び真核細胞にトランスフェクションするには、当技術分野で公知のあらゆる技術により実施することができ、限定するものではないが、標準細菌形質転換法、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、リポソームによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、ポリカチオンによるトランスフェクション、又はウイルスによるトランスフェクションが挙げられる。全標準技術については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）参照。これに関連して組換え宿主細胞とは、本発明の単離ＤＮＡ分子、核酸分子又は発現コンストラクト若しくはベクターを含むように遺伝子改変された宿主細胞である。ＤＮＡは特定の細胞種に適した当技術分野で公知のあらゆる手段により導入することができ、限定されないが、形質転換法、リポフェクション、エレクトロポレーション又はウイルスによるトランスフェクションが挙げられる。本発明のキメラタンパク質の発現を可能にすることができるＤＮＡコンストラクトはクローニング、ハイブリダイゼーションスクリーニング及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の当技術分野で公知の技術により容易に作製することができる。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製の標準技術と、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を利用する酵素反応の標準技術に加え、種々の分離技術が当業者に公知であり、広く利用されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ｗｕ（編）（１９９３）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１６）には多数の標準技術が記載されている。本発明で使用することができる代表的な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するのに適した細菌宿主細胞としては、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種細胞、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種細胞、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）種細胞、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種細胞、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種細胞、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種細胞、及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種細胞が挙げられる。本発明で使用するのに適した動物宿主細胞としては、昆虫細胞と哺乳動物細胞（最も特定的にはチャイニーズハムスター（例えばＣＨＯ）、及びＨｅＬａ等のヒト細胞株に由来するもの）が挙げられる。本発明で使用するのに適した酵母宿主細胞としては、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えばピキア・パストリス：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）（例えばハンセヌラ・ポリモルファ：Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｏｗｉａ）、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｉｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等に含まれる種が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）及びクルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）が最も広く使用されている酵母宿主であり、便利な真菌宿主である。宿主細胞は懸濁又はフラスコ培養、組織培養、臓器培養等で提供することができる。あるいは、宿主細胞はトランスジェニック動物でもよい。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」なる用語も本願では同義に使用し、アミノ酸残基のポリマーとその変異体及び合成アナログを意味する。従って、これらの用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の化学的アナログ等の合成非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーに適用される。この用語はグリコシル化、リン酸化及びアセチル化等のポリペプチドの翻訳後修飾も含む。アミノ酸配列と修飾に基づき、ポリペプチドの原子質量又は分子質量又は原子量又は分子量は（キロ）ダルトン（ｋＤａ）で表される。「組換えポリペプチド」とは、組換え技術の使用、即ち組換え又は合成ポリヌクレオチドの発現により作製されたポリペプチドを意味する。キメラポリペプチド又はその生物学的に活性な部分が組換え生産されたものであるときには、培養培地を実質的に含んでいないことも好ましく、即ち、培養培地はタンパク質調製物の体積の約２０％未満であることが好ましく、約１０％未満がより好ましく、約５％未満が最も好ましい。「単離」とは、その天然状態において通常では付随する成分を実質的又は本質的に含んでいない材料を意味する。例えば、「単離ポリペプチド」とは、天然状態でその両側に存在する分子から精製されたポリペプチドを意味し、例えば、前記ポリペプチドに隣接する産生宿主に存在する分子から取り出された抗原結合性キメラタンパク質を意味する。単離キメラはアミノ酸化学合成により作製することもできるし、組換え生産により作製することもできる。「異種タンパク質」なる表現は、このタンパク質がこのタンパク質を提示又は発現させるために使用されるものと同一種又は株に由来しないことを意味する場合がある。
タンパク質の「ホモログ」、「ホモログ類」とは、未修飾のこのタンパク質に対してアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入があり、それらの元の未修飾タンパク質と同様の生物学的及び機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を含む。本願で使用する「アミノ酸一致度」なる用語は、複数の配列が比較枠においてアミノ酸ベースで同一である程度を意味する。従って、「配列一致度百分率」は、２つの最適に整列された配列を比較枠において比較し、同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔであり、本願では１文字コードで示す場合もある）が両方の配列に存在する位置数を調べてマッチした位置数を求め、このマッチした位置数を比較枠（即ち枠サイズ）内の合計位置数で割り、得られた数値に１００を掛けて配列一致度百分率を求めることにより計算される。本願で使用する「置換」又は「突然変異」は、１個以上のアミノ酸又はヌクレオチドが親タンパク質又はその断片のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較して夫々別のアミノ酸又はヌクレオチドで置き換えられる結果として生じる。当然のことながら、タンパク質又はその断片はタンパク質の活性に実質的に全く影響を与えない保存的アミノ酸置換を含む場合もある。
「野生型」なる用語は天然源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を意味する。野生型遺伝子は集団に最高頻度で認められる遺伝子であり、従って、恣意的にこの遺伝子の「正常」又は「野生型」形態と言う。他方、「改変」、「突然変異体」又は「変異体」なる用語は野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に配列の修飾、翻訳後修飾及び／又は機能的性質（即ち特性改変）を示す遺伝子又は遺伝子産物を意味する。なお、天然突然変異体を単離することもでき、これらは野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に特性が改変されているという事実により同定される。
「タンパク質ドメイン」とはタンパク質中の別個の機能的及び／又は構造的単位である。通常では、タンパク質ドメインは特定の機能又は相互作用に関与し、タンパク質の全体的な役割に寄与する。ドメインは多様な生物学的コンテクストで存在することができ、異なる機能をもつタンパク質に同様のドメインが存在する場合もある。
タンパク質がその三次元三次構造に折り畳まれる前に、タンパク質二次構造要素（ＳＳＥ）が中間体として一般的には自発的に形成される。タンパク質の２つの最も一般的な二次構造要素はαヘリックスとベータ（β）シートであるが、βターンとオメガループも存在する。βシートは少なくとも２個又は３個の主鎖水素結合により横方向に連結されたベータストランド（βストランドとも言う）から構成され、一般にはねじれた襞状のシートを形成する。βストランドは伸長コンフォメーションで主鎖に沿って一般的には３～１０アミノ酸長のポリペプチド鎖が伸びたものである。βターンはポリペプチド鎖の方向を変えるタンパク質の１種の不規則な二次構造である。ベータターン（βターン、β－ターン、βベンド、タイトターン、リバースターン）はタンパク質及びポリペプチドで非常に一般的なモチーフであり、主にβストランドを繋ぐ役割を果たす。可変ドメインに存在するβターンのＩＭＧＴ（Ｒ）定義については、ＬｅＦｒａｎｃ（２０１４）及び図２５も参照。βターンは一般的に４アミノ酸残基（ｉ、ｉ＋１、ｉ＋２及びｉ＋３と言う）から構成され、残基ｉのＣＯと残基ｉ＋３のＮＨの間に主鎖内水素結合をもつこと、あるいは、残基ｉ及びｉ＋３のＣα原子間の距離が７Å未満であることの２つの方法で定義される。日常使用には水素結合基準が最適であるが、その一因は別個の４分類に分けられるためである。
「タンパク質の循環置換」又は「循環置換タンパク質」なる用語は、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の順序が野生型タンパク質配列に対して変化したタンパク質であり、その結果、連結順は異なるが、全体的な三次元（３Ｄ）形状は同様であるタンパク質構造となったものを意味する。タンパク質の循環置換は、例えばＢｌｉｖｅｎ ａｎｄ Ｐｒｌｉｃ（２０１２）に記載されているように、野生型タンパク質の（Ｎ末端に隣接する）第１の部分の配列が循環置換後のタンパク質の（そのＣ末端付近の）第２の部分の配列に関連付けられるという意味で、巡回置換の数学的認識と類似している。タンパク質をその野生型タンパク質に対して循環置換させるには、野生型タンパク質のＮ末端とＣ末端を「連結」し、タンパク質配列を別の部位で分断し、前記タンパク質の新しいＮ末端とＣ末端を作り出すように、タンパク質配列を遺伝子的又は人工的に操作することにより得られる。本発明の循環置換足場タンパク質は、野生型タンパク質配列のＮ末端とＣ末端を連結し、前記足場タンパク質の接近可能な部位又は露出部位（優先的にはβターン又はループ）で配列を切断又は分断することにより、循環置換足場タンパク質のフォールディングを野生型タンパク質のフォールディングに対して維持又は同様にしたものである。前記循環置換足場タンパク質におけるＮ末端とＣ末端の前記連結は、ペプチド結合により連結してもよいし、ペプチドリンカーを導入してもよいし、野生型タンパク質の元のＮ末端とＣ末端の近くのペプチド領域を欠失させた後に、残りのアミノ酸をペプチド結合させてもよい。
本願で使用する「～に融合」なる用語は、本願では「～に連結」、「～にコンジュゲート」、「～にライゲーション」と同義に使用し、特に、例えば組換ＤＮＡ技術による「遺伝子融合」と、安定した共有結合的連結を生じる「化学的及び／又は酵素的結合」を意味する。
「キメラポリペプチド」、「キメラタンパク質」、「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、又は「非天然タンパク質」なる用語は本願では同義に使用し、同一タンパク質に由来するものでも由来しないものでもよい少なくとも２個の別個のポリペプチド成分を含むタンパク質を意味する。この用語は人造であることを意味する非天然分子も意味する。（本願で定義する）キメラポリペプチドに言及する際に「～と融合された」なる用語と、「共有結合的に連結された」、「連結された」、「結合された」、「ライゲーションされた」、「コンジュゲートされた」等の他の文法的に同等の用語は、２個以上のポリペプチド成分を連結するあらゆる化学的又は組換えメカニズムを意味する。２個以上のポリペプチド成分の融合は配列の直接融合でもよいし、例えばアミノ酸配列又はリンカー配列又は化学的リンカーを介する間接融合でもよい。本願に記載する２個のポリペプチド又は抗原結合性ドメインと足場タンパク質の融合とは、化学的連結により得られる非共有結合的融合を意味する場合もある。例えば、（図２８に示すように）（循環置換）足場タンパク質の部分又は全長にその露出部位又は接近可能な部位で連結又は融合された相補的化学的ユニット又は結合ポケットと結合することが可能な化学的ユニットに対して、抗原結合性ドメインのＡストランドのＣ末端とＢストランドのＮ末端の両方を連結することができる。
本願で使用する「タンパク質複合体」又は「複合体」又は「会合タンパク質」なる用語は、２個以上の高分子が会合した群であって、高分子の少なくとも１個がタンパク質であるものを意味する。本願で使用する「タンパク質複合体」とは一般的には、生理的条件下で形成することができる高分子の会合体を意味する。タンパク質複合体の個々のメンバーは非共有結合的相互作用により連結されている。タンパク質複合体はタンパク質のみの非共有結合的相互作用とすることができ、その場合にはタンパク質－タンパク質複合体と言い、例えばタンパク質２分子、タンパク質３分子、タンパク質４分子等の非共有結合的相互作用である。より具体的には、抗原結合性キメラタンパク質と抗原自体の複合体である。本願で使用する「タンパク質複合体」は、少なくともタンパク質１分子と核酸等の少なくとも他の高分子の非共有結合的相互作用とすることもでき、その場合にはタンパク質－核酸複合体と言い、例えば、タンパク質１分子と核酸１分子、タンパク質２分子と核酸１分子、タンパク質２分子と核酸２分子等の非共有結合的相互作用である。当然のことながら、タンパク質複合体は多量体とすることができる。タンパク質複合体の会合の結果、ホモ多量体又はヘテロ多量体複合体を形成することができる。更に、相互作用は安定的でも一過的でもよい。「多量体」、「多量体複合体」又は「多量体タンパク質」なる用語は、複数の同一又は異種のポリペプチド単量体を含む。ポリペプチドは自己集合し、複数のシングルポリペプチド単量体の自己集合体（即ち「ホモ多量体集合体」）から形成される多量体集合体（即ち、二量体、三量体、六量体、五量体、八量体等）を構成することができる。本願で使用する「複数」とは２以上を意味する。多量体集合体は３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、又はそれ以上のポリペプチド単量体を含む。多量体集合体はあらゆる目的に使用することができ、広範なタンパク質「ナノ材料」を開発するための手段となる。有限のケージ様又はシェル様タンパク質集合体以外に、適切な標的対称アーキテクチャーを選択することにより集合体を設計してもよい。より高次の集合体の設計で本発明の単量体及び／又は多量体集合体を使用することもでき、階層的集合の付随利点が得られる。得られる多量体集合体は優れた剛性と単分散性を備える高度に規則的な材料であり、広範な用途の進化型機能的材料とカスタム設計型分子マシンの基盤を形成することができる。
本願で使用する「定量」、「測定」、「評価」及び「アッセイ」なる用語は同義に使用し、定性的及び定量的測定を含む。
「適切な条件」なる用語は特に温度、運動、他の成分、及び／又は「緩衝液条件」等の環境因子を意味し、ここで「緩衝液条件」とは具体的にはその中でアッセイが実施される溶液の組成を意味する。前記組成は最適なアッセイ性能を得るために適切であることが当業者に認識されているｐＨ緩衝物質、水、塩類溶液、生理的塩類溶液、グリセロール、防腐剤等の緩衝溶液及び／又は溶質を含む。
「結合」とは、直接又は間接を問わずにあらゆる相互作用を意味する。直接相互作用とは、結合パートナー間の接触を意味する。間接相互作用とは、相互作用パートナーが３分子以上の複合体において相互作用するようなあらゆる相互作用を意味する。相互作用は１個以上の架橋分子を介する完全な間接相互作用とすることもできるし、パートナー間の直接接触があるが、１分子以上の別の相互作用により安定化される部分的な間接相互作用とすることもできる。一般に、結合ドメインは免疫グロブリンをベースとするか又は免疫グロブリン様とすることもできるし、限定されないが、微生物タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、毒素、フィブロネクチン、リポカリン、１本鎖逆平行コイルドコイルタンパク質又は反復モチーフタンパク質等のタンパク質に存在するドメインをベースとすることもできる。抗原結合性ドメイン、免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン様ドメイン又は抗体ドメインに関して本願で使用する「特異的に結合する」なる用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか又はこれと結合しない結合ドメインを意味し、「抗原結合性ドメイン」又は「抗原結合性タンパク質」とも言う。例えば、１種の生物種に由来する抗原と特異的に結合する抗体が１種以上の生物種に由来する抗原とも結合する場合がある。しかし、このような種交差反応性があっても、抗体が特異的であるという分類は変わらない。場合により、抗体、タンパク質又はペプチドと第２の化学種の相互作用について「特異的結合」又は「特異的に結合する」なる用語を使用することもでき、その場合には、この相互作用が前記化学種に存在する特定の構造（例えば抗原決定基又はエピトープ）に依存し、例えば、抗原結合性タンパク質がタンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造を認識してこれと結合することを意味する。抗原結合性タンパク質がエピトープ「Ａ」に特異的である場合に、標識した「Ａ」と抗原結合性タンパク質を含む反応にエピトープＡ（即ち遊離した未標識のＡ）を含む分子が存在すると、標識したＡが抗原結合性タンパク質と結合する量は少なくなる。本願で使用する「特異性」なる用語は、結合ドメイン、特に抗原結合性ドメイン、免疫グロブリンドメイン若しくは免疫グロブリン様ドメイン、又はＶＨＨやナノボディ等の免疫グロブリン断片が、ある抗原に対して別の抗原よりも優先的に結合する能力を意味し、必ずしも高親和性を意味しない。抗原結合性タンパク質の他の例としては、合成結合性タンパク質、抗体ミメティック、又はより具体的にはモノボディも挙げられる（例えば総説については、Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１７参照）。このようなモノボディは、全体のフォールドが免疫グロブリンフォールドと似ていることから、ラクダ科動物シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）と同様に標的タンパク質と特異的に結合する結合性タンパク質を含むフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインとして定義される。モノボディは最も広く使用されている非抗体足場であり、そのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインにより免疫グロブリン様フォールドを示し、抗体の可変ドメインと同様に７本の逆平行βストランドが、ドメインの一方の側では抗体のＣＤＲと同様に抗原結合性領域に相当するＦＮ３ループ又はβターンを介し、他方の側では足場タンパク質を融合するための接近可能な部位として機能し得るβターンを介して相互に連結され、本発明の抗原結合性キメラタンパク質を形成する。本願で使用する「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープはエピトープに固有の空間コンフォメーションで３個のアミノ酸を含むことができる。一般に、エピトープは少なくとも４個、５個、６個、７個のこのようなアミノ酸から構成され、より一般には、少なくとも８個、９個、１０個のこのようなアミノ酸から構成される。アミノ酸の空間コンフォメーションの決定方法は当技術分野で公知であり、例えばＸ線結晶構造解析や多次元核磁気共鳴法が挙げられる。本願で使用する「コンフォメーションエピトープ」とは、ポリペプチドの折り畳まれた三次元コンフォメーションに固有の空間コンフォメーションでアミノ酸を含むエピトープを意味する。一般に、コンフォメーションエピトープは、直線状配列では不連続であるが、タンパク質の折り畳み構造では集合するアミノ酸から構成される。一方、コンフォメーションエピトープは（変性状態では存在しない）ポリペプチドの折り畳まれた三次元コンフォメーションに固有のコンフォメーションをとる直線状配列のアミノ酸から構成される場合もある。タンパク質複合体において、コンフォメーションエピトープは１個以上のポリペプチドの直線状配列では不連続なアミノ酸から構成されるが、個々のポリペプチドが折り畳まれてユニークな四次構造で会合すると、これらのポリペプチドは集合する。同様に、コンフォメーションエピトープは本願においては、集合して四次構造に固有のコンフォメーションをとる１個以上のポリペプチドの直線状配列のアミノ酸から構成される場合もある。タンパク質の「コンフォメーション」又は「コンフォメーション状態」なる用語は一般に、タンパク質が任意の時点でとり得る構造の範囲を意味する。当業者に自明の通り、コンフォメーション又はコンフォメーション状態の決定要因は、（修飾アミノ酸を含む）タンパク質のアミノ酸配列で表されるタンパク質の一次構造とタンパク質の周囲の環境を含む。タンパク質のコンフォメーション又はコンフォメーション状態は、タンパク質二次構造（例えば、特にαヘリックス、βシート）、三次構造（例えば、ポリペプチド鎖の三次元フォールディング）、及び四次構造（例えばポリペプチド鎖と他のタンパク質サブユニットの相互作用）等の構造的特徴も意味する。特にリガンド結合、リン酸化、硫酸化、グリコシル化又は疎水性基の結合等のポリペプチド鎖の翻訳後及び他の修飾がタンパク質のコンフォメーションに影響を与える可能性がある。更に、特に周囲溶液のｐＨ、塩濃度、イオン強度及びオスモル濃度等の環境因子や、他のタンパク質及び補因子との相互作用もタンパク質コンフォメーションに影響を与える可能性がある。タンパク質のコンフォメーション状態は、活性や別の分子との結合を測定する機能的アッセイにより決定してもよいし、特にＸ線結晶構造解析、ＮＭＲ又はスピンラベル法等の物理的方法により決定してもよい。タンパク質コンフォメーション及びコンフォメーション状態に関する一般的考察については、Ｃａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０、及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３を参照されたい。
本願で使用する「親和性」なる用語は一般に、標的タンパク質とリガンドの平衡状態をシフトさせ、それらの結合により複合体が形成されるように（本願中で詳細に定義する）リガンドが標的タンパク質と結合する程度を意味する。従って、例えば抗原結合性キメラポリペプチドとリガンドを比較的等しい濃度で併用する場合には、高親和性のリガンドが抗原結合性キメラポリペプチドと結合し、得られる複合体が高濃度となるように平衡状態がシフトする。解離定数Ｋｄはリガンドと標的タンパク質の親和性を表すために広く使用されている。一般的に、解離定数は１０－５Ｍ未満の数値である。解離定数は１０－６Ｍ未満であることが好ましく、１０－７Ｍ未満がより好ましい。解離定数は１０－８Ｍ未満であることが最も好ましい。リガンドとその標的タンパク質の親和性を表す他の方法は、会合定数（Ｋａ）、阻害定数（Ｋｉ）、又は半数最大阻害濃度（ＩＣ５０）若しくは半数最大有効濃度（ＥＣ５０）を測定することによりリガンドの強度を評価する間接的な方法である。当然のことながら、本発明の範囲内において「親和性」なる用語は、標的タンパク質の（コンフォメーション）エピトープと結合するＩｇドメイン、より特定的には前記ＩｇドメインのＣＤＲ領域を介してその標的と結合するためにその「機能性」を維持する抗原結合性キメラタンパク質Ｉｇドメインを含む抗原結合性キメラタンパク質の文脈で使用される。
従って、本発明の文脈において本願で使用する「機能的抗原結合性タンパク質」又は「コンフォメーション選択的抗原結合性ドメイン」なる用語は、その標的タンパク質との結合において任意にコンフォメーション選択的に機能的である前記キメラ抗原結合性タンパク質のＩｇドメインを意味する。標的タンパク質の特定のコンフォメーションと特異的に結合する結合ドメインとは、標的がとり得る他のコンフォメーションよりも高い親和性でコンフォメーションの所定のサブセットにおける標的と結合する結合ドメインを意味する。当業者に自明の通り、標的の特定のコンフォメーションと選択的に結合する結合ドメインは、この特定のコンフォメーションにおいて標的を安定化又は維持する。例えば、活性状態コンフォメーション選択的結合ドメインは活性コンフォメーション状態における標的と優先的に結合し、不活性コンフォメーション状態における標的とは結合しないか又は結合の程度が低くなるため、前記活性コンフォメーション状態に対する親和性が高くなり、あるいはその逆も言える。「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「優先的に結合する」なる用語及びその文法的に同等の用語は本願では同義に使用する。「コンフォメーション特異的」又は「コンフォメーション選択的」なる用語も本願では同義に使用する。
本願で使用する「抗体」なる用語は免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又は抗原と特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む分子を意味する。抗体は天然源又は組換え源に由来する無傷の免疫グロブリンとすることができ、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分とすることができる。抗体は一般的には免疫グロブリン分子の四量体である。本願で使用する「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」なる用語は、抗体鎖の球状領域又は本質的にこのような球状領域から構成されるポリペプチドを意味する。免疫グロブリンドメインは、保存されたジスルフィド結合により任意に安定化された２枚のβシート状に配置された約７～９本の逆平行βストランドの２層サンドイッチから構成されるという抗体分子に特徴的な免疫グロブリンフォールド（本願ではＩｇフォールドと言う）を維持することを特徴とする。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」なる用語は「免疫グロブリン定常ドメイン」と「免疫グロブリン可変ドメイン」（「ＩＶＤ」と略称する。）を含み、後者は当技術分野及び本願の以下の文中で夫々「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称する４個の「フレームワーク領域」から本質的に構成される免疫グロブリンドメインを意味し、これらのフレームワーク領域の間には、当技術分野及び本願の以下の文中で夫々「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称する３個の「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」が配置されている。免疫グロブリン可変ドメインの一般構造又は配列は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４として表すことができる。免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）は、抗原結合部位をもつことにより抗原に対する特異性を抗体に付与する。ＩＭＧＴ分類によると、免疫グロブリン可変ドメイン又はＶドメインは約１００ＡＡを含み、９本の逆平行βストランド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ”、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ）がβターン（ＡＢ、ＣＣ’、Ｃ”Ｄ、ＤＥ及びＥＦ）と３個のループ（又はＣＤＲ）（ＢＣ、Ｃ’Ｃ”及びＦＧ）により連結され、２枚のシートのサンドイッチ［ＡＢＥＤ］［ＧＦＣＣ’Ｃ”］を形成している（図２５、Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４に基づく改訂版）。シートは疎水性相互作用により相互に密に集まって疎水性コアとなり、（第１のシートの）βストランドＢにおける第１の高度に保存されたシステイン（第１番目のＣｙｓ）と（第２のシートの）βストランドＦにおける第２の同等に保存されたシステイン（２番目のＣｙｓ）の間のジスルフィド架橋により相互に連結される。本発明で使用するＩＭＧＴ（Ｒ）定義システムのユニークなナンバリングは、文献に記載されているＣＤＲとは対照的に、正確で明白に区分されたＣＤＲ－ＩＭＧＴを提供する。他のナンバリングについては、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）又はＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７）も参照されたい。Ｖドメインでは、ＣＤＲ１－ＩＭＧＴは２７～３８位を含み、ＣＤＲ２－ＩＭＧＴは５６～６５位を含み、ＣＤＲ３－ＩＭＧＴは１０５～１１７位を含む（Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４）。本発明のＩｇドメインの「露出領域」又は「露出ループ」とは、タンパク質の表面に露出された領域又はポリペプチド鎖を意味する。Ｉｇドメインでは、前記露出領域又はループはβターンが好ましく、Ｌｅｆｒａｎｃ（２０１４）により定義されるようなβターンが最も好ましい。ＩＭＧＴ定義によるとＣＤＲも「ループ」とみなされるが、足場を融合すると抗原結合性が失われ、機能的抗原結合性キメラタンパク質を得られなくなる可能性が非常に高いので、足場を融合するための接近可能な部位をもつ本発明の「露出領域」の好ましい候補とはみなさない。
本発明の「免疫グロブリンドメイン」は、「シングル可変ドメイン」なる用語と同義である「免疫グロブリンシングル可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」と略称する。）も含み、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメインに存在し、このドメインにより形成されている分子を意味する。これは、２個の免疫グロブリンドメイン、特に２個の可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリン又はその断片とは異なる免疫グロブリンシングル可変ドメインを意味する。一般的に、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合には、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与し、即ち、合計６個のＣＤＲが抗原結合部位形成に関与する。上記定義に鑑みると、従来の４本鎖抗体（例えば当技術分野で公知のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ分子）、又はこのような従来の４本鎖抗体に由来するＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合で連結されたＦｖ断片やｓｃＦｖ断片等のＦｖ断片、若しくはダイアボディ（いずれも当技術分野で公知）の抗原結合性ドメインの場合には、抗原の夫々のエピトープとの結合は１個の（単一の）免疫グロブリンドメインにより行われるのではなく、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン等の１対の（会合した）免疫グロブリンドメインにより行われ、即ち、免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対が一緒になって夫々の抗原のエピトープと結合するので、これらの抗原結合性ドメインは通常では免疫グロブリンシングル可変ドメインとみなさない。これに対して、免疫グロブリンシングル可変ドメインは別の免疫グロブリン可変ドメインと対合せずに抗原のエピトープと特異的に結合することができる。免疫グロブリンシングル可変ドメインの結合部位は単一のＶＨ／ＶＨＨ又はＶＬドメインにより形成される。そのため、免疫グロブリンシングル可変ドメインの抗原結合部位は３個以下のＣＤＲにより形成される。従って、単一の抗原結合単位（即ち、単一の抗原結合性ドメインが機能的抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないように、本質的にシングル可変ドメインから構成される機能的抗原結合単位）を形成することができる限り、シングル可変ドメインは軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は適切なその断片でもよいし、重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列又はＶＨＨ配列）又は適切なその断片でもよい。本発明の一つの実施形態において、免疫グロブリンシングル可変ドメインは重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり、より具体的には、免疫グロブリンシングル可変ドメインは従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列とすることができる。例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメインは（シングル）ドメイン抗体（又は（シングル）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列）でもよいし、「ｄＡｂ」若しくはｄＡｂ（又はｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸配列）でもよいし、ナノボディ（本願で定義する通りであり、限定されないが、ＶＨＨが挙げられる）でもよく、他のシングル可変ドメイン又はそのいずれか１種の任意の適切な断片でもよい。特に、免疫グロブリンシングル可変ドメインは（本願で定義する）ナノボディ又は適切なその断片とすることができる。なお、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）（Ｒ）、ナノボディズ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（Ｒ）及びナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）（Ｒ）はＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である。ナノボディの一般説明については、以下の詳細な説明と、例えばＷＯ２００８／０２００７９等の本願に引用する従来技術を参照されたい。
本願に記載する免疫グロブリンドメインは更に「ＶＨＨドメイン」も含み、これらのドメインはＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片及びＶＨＨ抗体とも称され、当初は「重鎖抗体」（即ち、「軽鎖のない抗体」；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８）の抗原結合性免疫グロブリン（Ｉｇ）（可変）ドメインと記載されていた。「ＶＨＨドメイン」なる用語は、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本願では「ＶＨドメイン」と言う。）及び従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本願では「ＶＬドメイン」と言う。）からこれらの可変ドメインを区別するために選択された。ＶＨＨ及びナノボディの詳細な説明については、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説論文（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２，２００１）と、一般的な背景技術として引用する以下の特許出願、即ちＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ名義のＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９及びＷＯ９６／３４１０３；Ｕｎｉｌｅｖｅｒ名義のＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１及びＷＯ０２／４８１９３；Ｖｌａａｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ ｖｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）名義のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６及びＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ Ｎ．Ｖ．及びＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．名義のＷＯ０３／０５０５３１；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ名義のＷＯ０１／９０１９０；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ名義のＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；並びにＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．名義のＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７及びＷＯ０６／１２２８２５、更にＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．名義の他の公開特許出願を参照されたい。これらの文献に記載されているように、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたナノボディ）は、フレームワーク配列の１個以上における１個以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴付けることができる。ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化と他の修飾、部分又は断片、誘導体又は「ナノボディ融合体」、多価コンストラクト（リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む）並びにナノボディとその製剤の半減期を延長するための種々の修飾を含めてナノボディの詳細な説明については、例えばＷＯ０８／１０１９８５とＷＯ０８／１４２１６４を参照されたい。
「ドメイン抗体」は「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」（「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」なる用語はＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅグループ会社により商標として使用されている。）とも称され、例えば、ＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４－４９０，２００３）及びＷＯ０３／００２６０９に記載されており、更にＤｏｍａｎｔｉｓ Ｌｔｄ名義の例えばＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及び他の公開特許出願にも記載されている。ドメイン抗体は本質的にラクダ科以外の哺乳動物、特に、ヒトの４本鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合性ドメインとして即ち夫々ＶＬ又はＶＨドメインと対合せずにエピトープと結合するためには、例えばヒトシングルＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによりこのような抗原結合性について特に選択する必要がある。ドメイン抗体はＶＨＨと同様に分子量が約１３～約１６ｋＤａであり、完全ヒト配列に由来する場合には、例えばヒトで治療に使用するのにヒト化する必要がない。なお、シングル可変ドメインは所定種のサメに由来するものも利用できる（例えば所謂「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば ＷＯ０５／１８６２９参照）。
（ＶＨＨドメインとヒト化ＶＨＨドメインを含む）ドメイン抗体やナノボディ等の免疫グロブリンシングル可変ドメインは産生時にインビボ成熟高分子であるが、得られる免疫グロブリンシングル可変ドメインの夫々の抗原に対する親和性が夫々の親分子と比較して改善されるように、１個以上のＣＤＲのアミノ酸配列に１箇所以上の変異を導入することにより、更に親和性成熟させることができる。本発明の親和性成熟免疫グロブリンシングル可変ドメイン分子は、例えばＭａｒｋｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３，１９９２）、Ｂａｒｂａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３，１９９４）、Ｓｈｉｅｒら（Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５，１９９５）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４，１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３３１０－９，１９９５）、Ｈａｗｋｉｎｓら（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９ ８９６，１９９２）、ＪｏｈｎｓｏｎとＨａｗｋｉｎｓ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）により記載されているような当技術分野で公知の方法により作製することができる。ドメイン抗体やナノボディ等の免疫グロブリンシングル可変ドメインから出発してポリペプチドを設計／選択及び／又は作製するプロセスを、本願では前記免疫グロブリンシングル可変ドメインの「フォーマッティング」とも言い、また、ポリペプチドを構成する免疫グロブリンシングル可変ドメインを、「フォーマッティングされている」又は前記ポリペプチド「のフォーマットに含まれる」と言う。免疫グロブリンシングル可変ドメインをフォーマッティングすることができる方法の例と、例えばグリコシル化を避けるためのこのようなフォーマットの例は本願の開示から当業者に明白に理解されよう。
（ＶＨＨドメインを含む）ドメイン抗体やナノボディ等の免疫グロブリンシングル可変ドメインはヒト化することができ、即ち、最もよく似たヒト生殖細胞系列配列との配列一致度を増すことができる。特に、（ＶＨＨドメインを含む）ナノボディ等のヒト化免疫グロブリンシングル可変ドメインは、上記段落で一般的に定義した免疫グロブリンシングル可変ドメインであるが、（本願に定義するような）ヒト化置換であるか及び／又はヒト化置換に対応する少なくとも１個のアミノ酸残基（特に、少なくとも１個のフレームワーク残基）が存在するものとすることができる。天然ＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を１種以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより、潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後、こうして決定された潜在的に有用なヒト化置換の１種以上（又はその組み合わせ）を（本願に詳細に記載するそれ自体公知のいずれかの方法で）前記ＶＨＨ配列に導入し、得られたヒト化ＶＨＨ配列を試験し、標的に対する親和性、安定性、発現し易さと発現レベル、及び／又は他の望ましい性質について調べることができる。こうして、過度ではない試行錯誤により、当業者は他の適切なヒト化置換（又はその適切な組み合わせ）を決定することができる。更に、上記に基づき、（ＶＨＨドメインを含む）ナノボディ等の免疫グロブリンシングル可変ドメイン（のフレームワーク領域）を部分的にヒト化又は完全にヒト化することができる。なお、免疫グロブリンシングル可変ドメインと広義での本発明の抗原結合性キメラタンパク質は特定の生物資源又は特定の作製方法に制限されない。例えば、免疫グロブリンシングル可変ドメイン、特に、本発明の抗原結合性キメラタンパク質は一般に、（１）天然重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離し、抗原結合性キメラタンパク質を得るように配列を更に操作する方法；（２）抗原結合性キメラタンパク質の前記足場タンパク質に融合したフォーマットにおいて天然ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現させる方法；（３）天然ＶＨＨドメイン及び／又は足場タンパク質を「ヒト化」する方法、又はこのようなヒト化ＶＨＨドメイン及び／又は足場タンパク質及び／又は抗原結合性キメラタンパク質をコードする核酸を発現させる方法；（４）既存抗体との結合を弱めるように天然ＶＨＨドメインを「突然変異」させる方法、又は天然ＶＨＨと比較して既存抗体との結合を弱めた本発明の抗原結合性キメラタンパク質を得るように足場タンパク質融合部位を細心に操作する方法；（５）前記足場タンパク質とのその後の融合に備え、いずれかの動物種、特にヒト等の哺乳動物種に由来する天然ＶＨドメインを「ラクダ化」する方法；あるいは（６）それ自体公知のタンパク質、ポリペプチド又は他のアミノ酸配列を作製するための合成又は半合成技術を使用する方法により得ることができる。既存抗体との結合を弱めたポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１２／１７５７４１及びＷＯ２０１５／１７３３２５参照）を作製するためには、ヒト化工程中に適切な突然変異、特に置換を例えば１１位、１３位、１４位、１５位、４０位、４１位、４２位、８２位、８２ａ位、８２ｂ位、８３位、８４位、８５位、８７位、８８位、８９位、１０３位又は１０８位のうちの少なくとも１箇所に導入することができる。あるいは、抗原結合性キメラタンパク質との結合を妨害するように足場タンパク質との融合を設計することにより、既存抗体との結合に感受性の位置を立体的に遮蔽してもよい。
免疫グロブリンドメインに代わるものとして、Ｉｇスーパーファミリー又は「Ｉｇ様ドメイン」も多くのタンパク質に存在しており、実際に配列と構造が夫々免疫グロブリンドメイン及びＩｇフォールドと非常によく似たドメインを構成するが、免疫グロブリン抗体自体のドメインから区別するためにＩｇ様ドメインと称する。Ｉｇフォールドは抗原認識が特別であるというよりも、相互作用を生じるのに特に優れていることが分かっており、広く使用されている。免疫グロブリン様ドメインは配列パターンに従ってＶ、Ｃ１、Ｃ２及びＩに分類することができる。モノボディは例えば免疫グロブリン様ドメインを含む。
本願で使用する「検出可能なラベル」、「標識」又は「タグ」なる用語は本願に記載する単離又は精製（ポリ）ペプチドの検出、可視化、及び／又は単離、精製及び／又は固定化を可能にする検出可能なラベル又はタグを意味し、当技術分野でこれらの目的に公知のあらゆるラベル／タグを含む意味である。特に好ましいのは、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）（例えば、６×Ｈｉｓ又はＨｉｓ６）、Ｓｔｒｅｐタグ（Ｒ）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（Ｒ）及びＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐタグ（Ｒ）等の親和性タグ；チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）及びＳＵＭＯ等の可溶化タグ；ＦＬＡＧタグ等のクロマトグラフィータグ；Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ及びＨＡタグ等のエピトープタグ；蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等）や蛍光色素（例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、クマリン及びシアニン）等の蛍光ラベル又はタグ（即ちフルオロクロム／フルオロフォア）；ルシフェラーゼ等の発光ラベル又はタグ；並びに（他の）酵素ラベル（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ又はグルコースオキシダーゼ）である。上記ラベル又はタグのいずれかの組み合わせも含む。抗原結合性キメラタンパク質は例えば半減期延長モジュールに融合又は連結してもよいし、半減期延長モジュール自体として機能するものでもよい。このようなモジュールは当業者に公知であり、例えばアルブミン、アルブミン結合性ドメイン、免疫グロブリンのＦｃ領域／ドメイン、免疫グロブリン結合性ドメイン、ＦｃＲｎ結合性モチーフ及びポリマーが挙げられる。特に好ましいポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ヒアルロン酸、ポリシアル酸及びＰＥＧミメティックペプチド配列が挙げられる。単離（ポリ）ペプチドの凝集を防ぐ修飾も当業者に公知であり、例えば、１個以上の疎水性アミノ酸を置換する方法が挙げられ、表面に露出した疎水性アミノ酸を１個以上の親水性アミノ酸で置換する方法が好ましい。一つの実施形態において、単離（ポリ）ペプチド又はその免疫原性変異体又はこれらのいずれかの免疫原性断片は１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個、好ましくは５個、４個、３個又は２個までの疎水性アミノ酸、好ましくは表面に露出した疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されている。このような置換により単離（ポリ）ペプチドの他の特性、例えば、その免疫原性、抗原結合機能性を損なわないことが好ましい。
本発明の目的で「患者」又は「対象」とは、脊椎動物等のあらゆる生物、特にヒト及び別の哺乳動物を含めたあらゆる哺乳動物を意味し、例えば、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ラマ、ブタ、又は非ヒト霊長類（例えばサル）等の動物が挙げられる。げっ歯類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はチンチラが挙げられる。一つの実施形態において、対象はヒト、ラット又は非ヒト霊長類である。対象はヒトが好ましい。一つの実施形態において、対象は疾患若しくは障害をもつか又はその疑いのある対象であり、本願では「患者」とも言う。
本願で使用する「予防する」なる用語は（例えば予防的処置により）疾患又は障害の発症を停止／抑制することを意味する場合がある。この用語は（例えば予防的処置により）疾患又は障害の発症を遅らせること、その症状の頻度を減らすこと、又は随伴症状の重症度を低くすることを意味する場合もある。「治療」又は「治療用」又は「治療する」なる用語は同義に使用することができ、徴候、症状、障害、病態又は疾患の進行又は重症度を遅延、中断、阻止、抑制、停止、軽減又は回復させる治療介入として定義されるが、必ずしも疾患に関連する全ての徴候、症状、病態又は障害の完全な排除を意味するものではない。
詳細な説明
本願では抗原結合性ドメインを含むリジッドに融合されたキメラタンパク質の設計の新規概念を提案する。新規抗原結合性キメラは抗原結合性ドメインと足場タンパク質の融合体の作製により得られ、足場タンパク質は抗原結合性タンパク質のトポロジーを分断するが、意外にも融合体はその典型的なフォールドのままであり、融合していない抗原結合性ドメインと同様に抗原又は標的タンパク質と特異的に結合するように機能する。この概念は、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメインのユニークな性質を利用して足場タンパク質に融合させ、より剛性で非柔軟性の連結を示す新規でユニークな抗原結合性キメラを創製する特定の実施例に基づく。一般的にその天然状態では結合していないポリペプチド成分を結合する古典的な方法は、夫々のアミノ（Ｎ）末端とカルボキシル（Ｃ）末端を直接又はペプチド結合により連結して１本の連続したポリペプチドを形成することにより実施される。これらの融合は多くの場合にはフレキシブルリンカーを介して行われ、又は少なくともフレキシブルに連結され、即ち、融合パートナーは相互に対して安定な位置又はコンフォメーションに配置されない。図１に示すように、Ｎ末端とＣ末端を介してタンパク質を連結する単純な直線状コンカテマー化では融合は容易であるが、不安定で劣化し易いため、場合によっては治療用途に適さない場合がある。他方、本願に記載するリジッドなキメラ／融合タンパク質は、２個以上のタンパク質の一次トポロジーの内側に１個以上の融合点又は連結点があり、少なくとも１個の非柔軟性融合点をもつ（図１）。本発明は本質的に、数個の融合体を作製することにより一方のタンパク質がその融合パートナーに対して回転又は屈曲しないようにした抗原結合性キメラタンパク質を含む。同一キメラの内側に数個の融合体が存在することにより、本発明の新規キメラでは剛性の改善が得られるが、これは融合体がその抗原結合性ドメインフォールディングと、その抗原標的と結合する機能を維持できるように、融合部位を完璧に設計した結果である。タンパク質の剛性は実際にタンパク質（この場合には新規キメラ）の（三次）構造に固有である。公知タンパク質フォールドのトポロジーを変えることにより剛性の強化を得られることが報告されている（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。従って、本発明の抗原結合性キメラタンパク質で創製される融合体の剛性は、標的を「配向」又は「固定」するために十分に強い剛性を提供するが、概ねこの剛性は標的又は抗原自体の剛性よりも低いままであろう。一次トポロジーを分断すると、ドメイン又はタンパク質フォールディングが変化し、三次トポロジーと抗原結合性が大きく変化すると考えられていたため、本発明のリジッドな抗原結合性キメラタンパク質がその抗原結合機能性を維持し続けるという事実は意外な結果である。一次トポロジーのこの分断は抗原結合性に影響を与えないため、抗体とその標的タンパク質に関連する分野に新しい道を開くことが本願で立証された。本発明はタンパク質の非共有結合的ターゲティングを可能にするために、ユニークな次世代融合技術の提供と、高親和性及び／又はコンフォメーション選択的抗原結合能を組合せた新規な組合せに関する。この新規タイプの抗原結合性キメラタンパク質はキメラの作製に使用される足場タンパク質の種類に応じて数種の有用な用途に役立つ。例えば粒子径の制限、優先的配向及び断片のアラインメント制限から小型のタンパク質では高解像度構造が得られないという頻発する問題を解決することにより、多くの利点が得られ、構造生物学で簡単に使用でき、クライオＥＭ及びＸ線結晶構造解析が容易になる。今日ではリジッドシャペロンツールが入手可能であり、構造に基づく医薬品設計や構造に基づく新規化合物のスクリーニング等により、より確実で改善された治療用及び診断用分子を開発するためにこれらのツールを使用することも完全に実現可能であるため、この次世代融合技術を使用することにより、構造生物学における飛躍的前進を予想できる。実際に、これらのツールを抗原又は標的のコンフォメーション選択的認識で使用する場合には、活性コンフォメーション、より具体的には、アゴニスト、部分アゴニスト又はバイアス型アゴニストコンフォメーション等の機能的コンフォメーションで標的を安定化する結合モードでも適用可能である。更に、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）（腫瘍壊死因子／Ｆｃ－ＩｇＧ１）やＮｐｌａｔｅ（Ｒ）（トロンボポエチン／Ｆｃ－ＩｇＧ１）を含む数例の融合タンパク質医薬品が公知であり、ＦＤＡにより承認されている。シングルドメイン抗体の治療用開発において、既存抗体との結合は広く知られている障害であるが、本発明の抗原結合性キメラはこれに対処するユニークな解決手段となり得る。更に、本発明の抗原結合性キメラタンパク質は作物保護産業における生物製剤及び保護剤の分野でも新規な解決手段を提供する。有害生物と病原体の必須分子に特異的なラクダ科動物由来結合ドメインが開発されるならば、野生生物、ミツバチ、生産者及び消費者に与えるリスクを最小限にしながら、高度に特異的な作用モードが得られることは明白である。本発明の抗原結合性キメラから開発されたこのような保護剤は、その費用効果的な大規模製造方法を維持しながら、他の利点も提供する。
Ｎｂは経路選択的アゴニストのスクリーニングを可能にするためにドラッガブルなシグナル伝達コンフォメーションを特異的に安定化すると記載されているが、本発明の抗原結合性キメラタンパク質はこのようなＮｂをベースとする抗原結合性ドメインでも利用できる。
バイオテクノロジーにおけるこのような技術の迅速な進歩に鑑み、本発明は新規なタンパク質治療薬の創製を促し、現在のタンパク質医薬品の性能改善につながると予想できる。
第１の態様において、本発明は抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合した抗原結合性キメラタンパク質に関し、前記足場タンパク質は、前記抗原結合性ドメインフォールドにおける接近可能な少なくとも１個以上のアミノ酸部位で融合することにより、前記抗原結合性ドメインのトポロジーを分断するように前記抗原結合性ドメインと連結されている。前記抗原結合性キメラタンパク質は更に、その天然又は野生型形態において前記足場タンパク質と融合していない抗原結合性ドメインと比較した場合に、その抗原結合機能性を同様に維持することを特徴とする。従って、一つの実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質はコンフォメーション選択的結合ドメインである。１実施形態は、足場タンパク質が抗原結合性ドメインをそのトポロジーにおいて「分断／遮断」するように、抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合した抗原結合性キメラタンパク質を提供する。一般に、タンパク質の「トポロジー」とは、三次元空間における規則的な二次構造の相互に対する向きを意味する。タンパク質フォールドは主にポリペプチド鎖トポロジーにより決まる（Ｏｒｅｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。従って、最も基本的なレベルにおいて、「一次トポロジー」はタンパク質フォールド認識モチーフに関与し、従って、二次及び三次タンパク質／ドメインフォールディングに関与する二次構造要素（ＳＳＥ）の繋がりとして定義される。つまり、タンパク質構造の観点では、真のトポロジー又は一次トポロジーはＳＳＥの繋がりであり、即ち、タンパク質鎖のＮ末端とＣ末端を手に持ってまっすぐにひっぱることができると想像するならば、どのようなタンパク質フォールドであってもトポロジーは変化しない。この場合、タンパク質の一次構造及び三次構造との類推からタンパク質フォールドを三次トポロジーと言う（Ｍａｒｔｉｎ，２０００も参照）。このため、足場タンパク質融合体を導入することにより、本発明の抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインはその一次トポロジーを分断されるが、意外にも前記抗原結合性ドメインはその三次構造を維持し、その機能的抗原結合能を維持することができた。
「足場タンパク質」とは、本願に記載する別のタンパク質、特に抗原結合性ドメインとの融合を可能にする構造をもつあらゆる型のタンパク質を意味する。このような「足場」、「ジャンクション」又は「融合パートナー」タンパク質は、抗原結合性ドメインの融合点として切断するための少なくとも１個の接近可能な部位を提供するようにその三次構造に少なくとも１個の露出領域をもつことが好ましい。足場ポリペプチドを使用して抗原結合性ドメインと結合させることにより、抗原結合性キメラタンパク質はドッキングしたコンフィギュレーションとなり、質量を増し、対称性を提供し、及び／又はラベルを提供し、及び／又は付加的な抗原結合部位を追加し、及び／又は半減期を延長し、及び／又は免疫原性を低下させ、及び／又は機能性を改善するか若しくは抗原結合性ドメインに追加する。つまり、使用する足場タンパク質の種類に応じて、得られる抗原結合性キメラタンパク質の異なる目的が予想される。どのようなタンパク質でもよいという点で足場タンパク質の種類と性質は重要ではなく、本発明の抗原結合性キメラタンパク質のように前記抗原結合性ドメインと融合した足場タンパク質は、その構造、サイズ、機能又は存在に応じて種々の利用分野で有用であろう。足場タンパク質の構造は最終的なキメラ構造に影響を与えるため、当業者は足場を選択する際に足場タンパク質に関する公知構造情報を利用し、妥当な予測を考慮すべきである。足場タンパク質の例を本願の実施例に示すが、本発明の抗原結合性キメラタンパク質を作製するために足場タンパク質として利用可能なタンパク質は限定されず、このようなタンパク質は特に酵素、膜タンパク質、受容体、アダプタータンパク質、シャペロン、転写因子、核タンパク質、抗原結合性タンパク質自体（例えば、特にナノボディ）である。好ましい１実施形態において、前記足場タンパク質の三次元構造は公知であるか、又は当業者により予測可能であるため、抗原結合性ドメインを融合するために接近可能な部位は前記当業者が決定できる。
新規キメラタンパク質は、ジャンクションがキメラタンパク質構造の内側でフレキシブルなルーズで弱いリンク／領域とならないようにユニークな方法で融合されている。２個のポリペプチドを連結又は融合する簡便な手段は、第１のポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを、第２のポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドと機能的に連結した組換え核酸分子から融合タンパク質として古典的な公知方法で発現させる方法である。一方、本発明の組換え核酸分子では、前記抗原結合性キメラタンパク質を発現させる遺伝子融合体の設計に前記足場による抗原結合性ドメインのトポロジーの分断も考慮する。従って、一つの実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質は抗原結合性ドメインをコードする遺伝子の部分と、足場タンパク質をコードする遺伝子の部分を組換えることにより形成されるキメラ遺伝子にコードされ、前記コードされた足場タンパク質は、少なくとも２箇所以上の直接融合又はコードされたペプチドリンカーによる融合を介して前記ドメインの１個以上の接近可能な部位で、コードされた抗原結合性ドメインの一次トポロジーを分断する。従って、融合させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記タンパク質間に剛性で非柔軟性のリンク、連結又は融合を提供する抗原結合性キメラタンパク質を提供するように断片化又は組換えされる。新規キメラは、抗原結合性ドメインの一次トポロジーが分断されるように足場タンパク質を抗原結合性ドメインと融合することにより作製され、即ち抗原結合性ドメインのアミノ酸配列は接近可能な部位で分断され、足場タンパク質の接近可能なアミノ酸と連結されるため、場合によってはこのアミノ酸配列も分断される。ジャンクションは分子内に形成され、換言するならばアミノ酸配列内の内部に形成される（実施例及び図面参照）。従って、本発明の組換え融合体は、単にＮ末端又はＣ末端で融合しているだけでなく、少なくとも１個の内部融合部位を含むキメラとなり、これらの部位は直接又はリンカーペプチドを介して融合されている。抗原結合性キメラタンパク質を作製するために循環置換足場を適用する場合には、Ｎ末端とＣ末端を連結した後に、足場タンパク質の配列内のその三次構造における接近可能な部位に対応する別の部位でアミノ酸配列を切断又は分離し、抗原結合性ドメイン部分のアミノ酸配列と融合することにより、前記足場タンパク質のアミノ酸配列を変化させる。循環置換を得るための前記Ｎ末端とＣ末端の連結は直接融合でもよいし、リンカーペプチドを介してもよいし、Ｎ末端とＣ末端の近傍の領域の短い欠失後に両端をペプチド結合してもよい。
「接近可能な部位」、「融合部位」又は「融合点」又は「連結部位」又は「露出部位」なる用語は本願では同義に使用し、いずれもタンパク質配列の構造的に接近可能なアミノ酸部位を意味し、タンパク質の表面の位置又は表面に露出した位置が好ましい。当業者はこれらの部位を決定することができよう。抗原結合性ドメインの抗原結合部位は例えばＩｇドメインのＣＤＲ等の露出領域を意味することが多い。しかし、抗原結合性ドメインを足場タンパク質に融合するためにこれらの部位を分断すると、抗原結合能が低下する可能性があり、本発明の抗原結合性キメラタンパク質には不適切であるため、本願では接近可能な融合部位として適用するものではない。従って、本願に記載する「ループ」又は「βターン」としての「接近可能な部位」及び「露出領域」とは、抗原結合部位又は領域以外、従ってＣＤＲ以外の部位及び領域を意味する。タンパク質のＮ末端又はＣ末端も大半の場合にはタンパク質三次元構造の「ルーズ」な末端であるため、表面から接近可能である。抗原結合性ドメインにおける少なくとも１個の他の接近可能な部位を融合に使用する場合には、この接近可能な部位に分断／挿入が起こり、トポロジーが分断され、この接近可能な融合部位により新規キメラに剛性が提供されるため、このような場合に限り、タンパク質のＮ末端又はＣ末端も本発明のキメラにおける接近可能な部位とみなすことができる。つまり、接近可能な部位はタンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端部位を含むことができるが、Ｎ末端又はＣ末端から構成される接近可能な部位からの融合のみによりキメラを形成することはできない。抗原結合性ドメインの少なくとも１個以上の部位を足場タンパク質との融合に使用し、従来の公知ドメインフォールドのトポロジーを分断させる。従って、一つの実施形態において、前記少なくとも１個の接近可能な部位は、この少なくとも１個が１個である場合には前記ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端部位以外のものであり、及び／又は前記ドメインのＮ末端若しくはＣ末端部位を含まない。特定の１実施形態において、少なくとも１個の部位は前記ドメインのＮ末端又はＣ末端アミノ酸以外のものである。別の実施形態において、足場タンパク質と融合させるために少なくとも２個以上の部位を使用する場合には、接近可能な部位は抗原結合性ドメインのＮ末端又はＣ末端部位とすることができる。足場タンパク質はその三次構造から見える接近可能な部位も介して融合されており、その場合、一つの実施形態において、前記少なくとも１個の部位は足場タンパク質のＮ末端又はＣ末端以外のものであり、代替実施形態において、前記少なくとも１個の部位は前記足場のＮ末端又はＣ末端である。
ある種の実施形態において、抗原結合性キメラは前記抗原結合性ドメインの露出領域における分断部に融合された前記足場タンパク質のＮ末端断片と、前記抗原結合性ドメインのＣ末端に融合された前記足場タンパク質のＣ末端断片を含む。
本発明のある種の実施形態において、融合は直接融合又はリンカーペプチドによる融合とすることができ、前記融合部位は剛性で非柔軟性の融合タンパク質となるように完璧に設計される。選択される接近可能な部位の位置に加え、リンカーペプチドの長さと種類も、得られるキメラタンパク質の剛性に寄与する。本発明の文脈内で、抗原結合性キメラタンパク質を構成するポリペプチドは相互に直接融合されるか、ペプチド結合による連結により融合されるか、又は間接的に融合され、間接連結ではショートペプチドリンカーを介する連結により２個のポリペプチドを会合させる。好ましい「リンカー分子」、「リンカー」又は「ショートポリペプチドリンカー」は最大１０アミノ酸長、より一般には４アミノ酸長のペプチドであり、３アミノ酸長が一般的であるが、接近可能な部位で融合ジャンクションに望ましい剛性を提供するためには、２アミノ酸長とすることが好ましく、１アミノ酸が更に好ましい。適切なリンカー配列の非限定的な例については実施例のセクションに記載するが、これらはランダムに選択することができ、構造ドメイン間に一定の距離を保つと共に、融合パートナーにそれらの個々の機能（例えば抗原結合性）を維持するようにリンカーを選択することに成功した。リジッドリンカーの使用に関する実施形態において、これらはαヘリックス構造をとることにより又は複数のプロリン残基を含むことによりユニークなコンフォメーションを示すことが一般に知られている。フレキシブルリンカーも適切であると思われ、１～４アミノ酸長に抑えると好ましいが、多くの状況において、リジッドリンカーはフレキシブルリンカーよりも更に効率的に機能的ドメインを分離する。
一つの実施形態において、抗原結合性ドメインの接近可能な部位はドメインフォールドの露出領域に位置する。前記露出領域は固定度の低いアミノ酸の連なりとみなされ、主にタンパク質の表面と構造の稜線に位置する。露出領域はタンパク質構造のループ又はβターンとして存在することが好ましい。
特定の１実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質は、主にβシートとして存在する少なくとも７本の逆平行βストランドと、露出領域ともみなされる少なくとも３個のβターンからなる抗原結合性ドメインを含む。一つの実施形態において、少なくとも７本の逆平行βストランドと少なくとも３個のβターンからなる前記抗原結合性ドメインは、特にモノボディの抗原結合性ドメイン等の免疫グロブリン様ドメインを含む。モノボディはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を分子足場として使用して作製される合成結合性タンパク質である。天然ＦＮ３足場は９４アミノ酸から構成され、分子量は約１０ｋＤａであり、抗体のシングル可変ドメインのサイズと同等である。これらはヒトフィブロネクチンの構造をベースとし、より具体的には、その１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインをベースとする。このドメインは抗体可変ドメインと同様の構造であり、各側に７本のβストランドと３個の露出ループをもつ。別の特定の実施形態において、前記抗原結合性キメラタンパク質は免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインである抗原結合性ドメインを含む。免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインは、約１２５アミノ酸から成るグリークキートポロジーをもつ２枚のβシート状に配置された７～９本の逆平行βストランドの２層サンドイッチから構成される型のタンパク質ドメインである。免疫グロブリンの可変（Ｖ）サブユニットと定常（Ｃ）サブユニットは２層を形成するβストランドの数と規則性が異なり、Ｃドメインは４本のストランドが一方のβシートを形成し、３本のストランドが第２のシートを形成するように配置された７本のβストランドから構成され、Ｖドメインは７本ではなく９本のβストランドを含む。Ｖドメインの残りの２本のストランドは一方のβシートの辺に挿入され、抗原認識部位の形成に直接関与する第２の超可変部を構成するので、機能的に重要である。本発明の抗原結合性キメラタンパク質を得るために抗原結合性ドメインのトポロジーを分断することにより、意外にも、得られたキメラタンパク質では免疫グロブリン又は免疫グロブリン様フォールドが維持され、標的タンパク質又は抗原と結合するその機能性も維持された。
足場タンパク質を融合させる抗原結合性ドメイン又はＩｇドメインを含むタンパク質に関して、抗原結合性又はＩｇドメインの抗原又は標的の種類はどのようなものでもよい。従って、標的の種類は本発明には重要ではなく、夫々抗原結合性ドメイン又はＩｇ若しくはＩｇ様ドメインの抗原結合部位又はＣＤＲと特異的に結合するあらゆるエピトープを有効な標的タンパク質とみなすことができる。標的は非限定的な１例を挙げると、単量体タンパク質、別の高分子構造、多量体、タンパク質複合体、又は一過的なタンパク質間相互作用とすることができる。標的はどのような機能性をもつものでもよく、限定されないが、例えば、酵素、ＧＰＣＲ等の膜タンパク質、イオンチャネルのみならず、特に、核内受容体及び他の受容体タンパク質も前記抗原結合性ドメインの標的とすることができる。あるいは、標的の資源はどのような起源でもよく、限定されないが、例えば特にヒト、哺乳動物又は動物に加え、細菌、ウイルス、昆虫に由来するものが挙げられる。
一つの実施形態において、抗原結合性ドメイン又はＩｇ／Ｉｇ様ドメインの抗原は、前記抗原結合性ドメイン又はＩｇ／Ｉｇ様ドメインと融合して抗原結合性キメラタンパク質を形成する足場タンパク質以外のものである。本発明に記載するように抗原結合性ドメイン又はＩｇドメインと融合又は連結するために足場タンパク質を使用する場合には、新規抗原結合性キメラタンパク質はその単量体の天然又は融合形態に存在する足場タンパク質と特異的に結合しないことがより好ましい。あるいは、本願には抗原結合性キメラタンパク質の組成物を開示し、前記組成物は本願に記載する第１の抗原結合性キメラタンパク質と第２の抗原結合性キメラタンパク質を含み、前記第２の抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインは前記第１の抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質と特異的に結合する。抗原結合性キメラタンパク質がそれ自体の足場と結合して凝集又は連鎖反応するのを避けるために、前記第２の抗原結合性キメラタンパク質の足場は前記第１の抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質と異なる。「異なる」とは、本願において本発明の目的では、第２の抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質のアミノ酸突然変異、欠失、挿入若しくは置換又は修飾の結果として、第２の抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインが第２の抗原結合性キメラタンパク質の前記足場タンパク質部分と結合しなくなることを意味する。別の実施形態は、その抗原又は標的タンパク質と結合させた複合体における抗原結合性キメラタンパク質の前記組成物に関する。
代替実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質は、ｉ）免疫グロブリン又はＩｇ様ドメインの保存されたＮ末端アミノ酸配列と、ｉｉ）足場タンパク質と、ｉｉｉ）ｉ）の前記保存されたＮ末端アミノ酸配列をもたない免疫グロブリンドメイン配列を含むリジッドな融合タンパク質として表され、ｉ）とｉｉｉ）はｉｉ）の前記足場タンパク質とコンカテマー化されている。好ましい１実施形態において、前記リジッドな融合タンパク質はＦＲ１領域の保存されたＮ末端ドメインである保存されたＮ末端アミノ酸配列を含み、この配列は配列番号１に示すような残基からなる保存されたコンセンサス配列、又は１１～１５残基長（例えば、配列番号１の残基１１～１５のＮ末端部分の末端、即ち第１のβターンの近傍）のその相同配列を含む。
別の実施形態において、抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインはヘリカル二次構造を含む。特に、前記抗原結合性ドメインは抗体ミメティックとしての抗原結合性ドメインの部分であるアルファボディでもよいし、免疫グロブリンとは非常に異なる構造をもつが、リジッドヘリカルリンカーの設計により同様にリジッドにできるように設計されているため、抗原結合性キメラタンパク質を作製するために本願に記載するような融合に利用可能なαヘリックスを含む抗体ミメティックであるＤＡＲＰｉｎでもよい。しかし、抗体ミメティックの抗原結合性は合成により創製されるか又は予想される結合部位であり、天然には存在しないものであるため、例えばシングルドメイン抗体のインビボ成熟抗原結合部位と比較して利用性が劣る可能性がある。更に、トポロジーを妨害するためにβターンを含む融合体と比較して、前記ヘリカル構造又はコイルドコイルを使用してリジッドな融合体を作製する方法は複雑になる可能性がある。
Ｉｇドメインの「露出領域」の最も簡単な具体例は露出ループであり、βシートサンドイッチ三次元構造の稜線に配置された露出ループであるβターンが好ましい。
他の実施形態において、前記抗原結合性ドメインの露出領域はＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，２０１４）により定義されるようなβターンを含み、前記足場タンパク質は、ａ．前記抗原結合性ドメインのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターン、又はｂ．前記抗原結合性ドメインのβストランドＣ及びＣ’を繋ぐβターン、又はｃ．前記抗原結合性ドメインのβストランドＣ”及びＤを繋ぐβターン、又はｄ．前記抗原結合性ドメインのβストランドＤ及びＥを繋ぐβターン、又はｅ．前記抗原結合性ドメインのβストランドＥ及びＦを繋ぐβターンである免疫グロブリン（可変）ドメインの前記露出領域に挿入又は融合されている。好ましい１実施形態において、接近可能な部位はＩｇドメインのＡ及びＢβストランドを繋ぐＡＢβターンの露出領域に位置する。あるいは、接近可能な部位はＩｇドメインのＣ及びＣ’βストランドを繋ぐＣＣ’βターンにより規定される露出領域に位置する。別の実施形態はＣ”Ｄβターン又はＥＦβターンに接近可能な部位をもつ露出領域を含む。
実際に、これらは夫々βストランドＡ及びＢ、Ｃ及びＣ’、Ｃ”及びＤ、又はＥ及びＦを繋いで典型的なサンドイッチのβシートを構成し、免疫グロブリンフォールドを提供する表面ループである。ＩｇドメインのＣＤＲが標的タンパク質のエピトープと結合するその能力を維持するように、接近可能な部位は露出領域、ループ又はβターンに位置することが最も好ましい。ＣＤＲ自体を露出領域とみなすこともできるので、理論的には接近可能な部位となる。しかし、抗原結合性キメラタンパク質が機能的になり、従って、抗原結合性となるのは、標的タンパク質を結合できているときだけであり、ＣＤＲのアミノ酸を接近可能な部位として融合に使用する場合にはその可能性はない。
別の実施形態において、前記抗原結合性ドメインは免疫グロブリン様ドメインを含み、例えば、より特定的にはモノボディの免疫グロブリン様ドメインを含み、足場タンパク質はＩｇドメインについて上述した選択肢と同様に、Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）で注釈付けられた構造に従って定義すると、より特定的にはモノボディの前記Ｉｇ様ドメインのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターン、又は前記Ｉｇ様ドメインのβストランドＣ及びＤを繋ぐβターン、又は前記Ｉｇ様ドメインのβストランドＥ及びＦを繋ぐβターンに挿入される。前記命名法はＶＨＨ Ｉｇ－フォールドアノテーションに基づいて採用した。
別の実施形態において、足場タンパク質は循環置換を含む。好ましい１実施形態において、足場タンパク質の前記循環置換は足場タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に導入され、足場タンパク質のＮ末端とＣ末端の間が最も好ましい。別の実施形態は少なくとも２本の逆平行βストランドを含む足場タンパク質を提供する。
一つの実施形態では、その構造の露出領域に対応するその配列中のその切断された接近可能な部位で循環置換足場タンパク質と融合させ、ＡＢβターンに対応するその配列中の切断された接近可能な部位でＩｇドメイン又は抗原結合性ドメイン一次トポロジーを分断することにより、（２本のペプチド結合又は２本のショートリンカーを介して）免疫グロブリン又は抗原結合性ドメインを足場に連結する融合タンパク質が得られる（但し、前記露出部位又は接近可能な部位はＮ末端又はＣ末端以外のものである）。従って、（図２に示すように）足場タンパク質の循環置換をＮ末端とＣ末端に導入する特定の実施形態では、（図８に示すように）一体としての抗原結合性タンパク質断片と足場タンパク質配列を組換え融合することができる。特定の１実施形態では、抗原結合性ドメイン又はＩｇドメインの内側、好ましくはβストランドＡの末端とβストランドＧの末端でＡＢβターンの接近可能な部位の近傍に配置されたシステイン残基により形成される強化用のジスルフィド架橋を更に作製することにより、前記キメラはその剛性が強化されている。一つの実施形態では、抗原結合性キメラタンパク質の剛性を改善するために抗原結合性ドメインと足場を更にジスルフィド結合により連結する。これらの部位は、（例えば配列番号１の残基１１～１５付近の）Ａβストランドの最後のアミノ酸であることが最も好ましく、前記残基をシステインに置き換え、Ｉｇドメインの最後のアミノ酸の１個もシステインに突然変異させる（図１０参照）。
別の実施形態において、（２本のペプチド結合又は２本のショートリンカーを介して）免疫グロブリンを足場に連結する前記融合タンパク質は、その配列中に位置するその構造の（Ｎ末端又はＣ末端以外の）露出領域におけるその切断された接近可能な部位で循環置換足場タンパク質と融合させ、そのＣＣ’βターンにおける切断された接近可能な部位でＩｇドメイントポロジーを分断することにより得られる。従って、（図２２に示すように）Ｎ末端とＣ末端を連結することにより足場タンパク質の循環置換を導入する特定の１実施形態では、（図８に示すように）一体としてのＩｇタンパク質断片と足場タンパク質配列を組換え融合することができる。
別の実施形態において、本願に記載する足場タンパク質はオブリゲート二量体若しくは多量体（例えば１２量体であり、ホモオリゴマーでもヘテロオリゴマーでもよい）、及び／又はコートタンパク質、ウイルス様粒子タンパク質、又はその断片である。コートタンパク質又はウイルス様粒子タンパク質は多量体を形成しており、自己集合して対称構造となり、融合したＩｇドメインが前記対称構造の表面に提示される。
別の実施形態では、そのＮ末端アミノ酸で足場タンパク質と融合させ、そのＡＢβターンにおける切断された接近可能な部位で抗原結合性ドメイン又はＩｇ／Ｉｇ様ドメイントポロジーを分断することにより、（３本のペプチド結合又は３本のショートリンカーを介して）免疫グロブリンを足場に連結する融合又はキメラタンパク質が得られる。前記足場タンパク質も、ＩｇドメインのβストランドＢとの融合を可能にするＡＢβターン部位と再連結するために切断される構造的に接近可能な部位をその配列中に必要とする。Ｉｇドメインの第２の接近可能な部位は限定するものではないが、例えばそのＣ末端アミノ酸により提供され、足場タンパク質の残りの部分と更に融合される（図１１参照）。従って、足場タンパク質を抗原結合性ドメイン又はＩｇ／Ｉｇ様ドメインの２箇所の異なる接近可能な部位に融合する特定の実施形態では、２断片としての抗原結合性トメイン又はＩｇドメインタンパク質断片と足場タンパク質配列を組換え融合する必要がある。特定の１実施形態において、３本のペプチド結合又はショートリンカーを介して免疫グロブリンを足場に連結する前記キメラ融合タンパク質は、Ｉｇドメインの内側に配置されたシステイン残基により形成される強化用のジスルフィド架橋を更に作製することにより、その剛性が強化されている。特定の１実施形態において、前記足場タンパク質は対称性をもたせるために、オブリゲート二量体又は多量体であり、あるいはコートタンパク質又はウイルス様粒子又はその断片とすることもできる。
具体的な１実施形態において、（３本のペプチド結合又はショートリンカーを介して）免疫グロブリンを足場に連結する融合タンパク質はヘテロ二量体を形成する２個の足場タンパク質を含む。前記融合タンパク質は、その配列中に位置するその構造の（Ｎ末端又はＣ末端以外の）露出領域におけるその切断された接近可能な部位で第１の循環置換足場タンパク質と融合させ、そのＡＢβターンにおける切断された接近可能な部位でＩｇドメイントポロジーを分断した後、そのＣ末端で同一の接近可能な部位と融合させ、βストランドＢと再連結してＩｇドメインに戻すことにより得られる。Ｉｇドメインの第２の接近可能な部位はそのＣ末端アミノ酸により提供され、最終的に第２の足場タンパク質のＮ末端と融合され、第２の足場タンパク質は第１の足場タンパク質と二量化し、剛性が強化される。特定の１実施形態では、足場タンパク質の循環置換をＮ末端とＣ末端に導入する。従って、第１の足場タンパク質の循環置換をＮ末端とＣ末端に導入する具体的な実施形態では、（ＡＢβターンの内側で切断された）Ｉｇ配列のＮ末端部分とＣ末端部分の間に挿入されたＩｇタンパク質断片と、第１の足場タンパク質の循環置換配列を一体として組換え融合することができ、第２の足場タンパク質のＮ末端をＩｇドメイン配列のＣ末端と融合する。こうして、多量体足場タンパク質は前記多量体足場の単量体の各々を介してその接近可能な部位でＩｇドメインと連結又は融合される。
特定の１実施形態において、（３本のペプチド結合又はショートリンカーを介して）抗原結合性ドメインを足場に連結する融合タンパク質の足場タンパク質は第２の抗原結合性ドメインを含む。前記融合タンパク質は、（第２の）抗原結合性ドメインを含む足場タンパク質とそのＮ末端アミノ酸で融合させ、そのＡＢβターンにおける切断された接近可能な部位で（第１の）抗原結合性ドメイントポロジーを分断することにより得られる。前記（第２の）抗原結合性ドメインを含む足場タンパク質は、特定の１実施形態ではＩｇドメインを含み、具体的に（第１の）抗原結合性ドメインのβストランドＢとの融合を可能にするＡＢβターン部位に再連結するために切断されるβストランドＧのＣ末端の近傍でその配列内に構造的に接近可能な部位を提供する。その場合、（第１の）抗原結合性ドメインの第２の接近可能な部位はそのＣ末端アミノ酸により提供され、最終的に（第２の）抗原結合性Ｉｇドメインを含む足場タンパク質の残りの部分と融合される（図１７参照）。従って、この特定の実施形態では、（第２の）抗原結合性ドメインを含む足場タンパク質配列を２断片としての（第１の）抗原結合性タンパク質断片と組換え融合する必要がある。この実施形態に記載するような相互に融合される２個の抗原結合性ドメインは、一つの特定の実施形態では、２個の同一の抗原結合性ドメインとして開示され、又は同一の標的タンパク質の異なるエピトープと結合する異なる抗原結合性ドメインとして開示され、又は異なるタンパク質を標的とする２個の抗原結合性ドメインとして開示される。しかし、Ｉｇドメインである抗原結合性タンパク質のＣＤＲと結合したエピトープは、得られる抗原結合性キメラの部分である他のＩｇドメインに存在すべきではなく、あるいは、新規に形成された抗原結合性キメラ自体に存在すべきではない。特定の１実施形態において、前記Ｉｇドメインは２個のナノボディであり、より具体的な実施形態では、２個の同一のＮｂであり、又は同一の標的タンパク質の異なるエピトープと結合する異なるＮｂであり、又は異なるタンパク質を標的とする２個のＮｂである。しかし、Ｎｂと結合したエピトープは、得られる抗原結合性キメラの部分である他のＮｂに存在すべきではなく、あるいは、新規に形成された抗原結合性キメラ自体に存在すべきではない。
所定の実施形態において、本発明の足場タンパク質は単量体タンパク質である。他の実施形態において、足場タンパク質は対称性を提供するタンパク質であり、例えば多量体足場タンパク質や、コートタンパク質又はウイルス様粒子に自己集合するタンパク質である足場タンパク質である。多量体足場タンパク質はオリゴマー化により対称性を提供し、オリゴマー化はヘテロオリゴマー化でもホモオリゴマー化でもよく、オブリゲートでもよいし、持続的でも一過的でもよい。得られる対称性はどのような型の対称性でもよく、限定されないが、例えば環状、立方体、二面体、六面体、八面体、二十面体等が挙げられる。特に、「二十面体」なる用語は２０個の面をもつ多面体幾何形状を意味する二十面体から得られる型の対称性を意味する。「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」、「二十面体ＶＬＰタンパク質」、「コートタンパク質」、又は「二十面体ＶＬＰを形成するタンパク質」なる用語は、ウイルスに由来するが、非感染性であり、（二十面体）対称性を提供する多量体構造であるＶＬＰに自己集合することが可能なタンパク質を意味する。例えばバクテリオファージは二十面体構造の頭部をもつ。更に、ウイルス粒子の作出用の逆遺伝学システムが確立されているいずれかの二十面体ウイルスを使用して異種タンパク質の全部又は一部を含むキメラ表面タンパク質を提示させることは容易に可能である。キメラ表面タンパク質は、本発明により提供されるような異種抗原結合性ドメインと融合されたウイルス表面又はコートタンパク質を含む。足場として利用するには、リンカー配列又はペプチド結合を介してウイルスコートタンパク質を融合すればよい。場合により、リンカー及び／又はリンカーと融合した抗原結合性ドメインを収容し易くするためにウイルスコートタンパク質を部分的に欠失させる。ウイルスタンパク質が粒子を再被覆する能力を欠失により損なうか否かは、組換え発現させたウイルスタンパク質をウイルス粒子の存在下でインキュベートし、再被覆されたウイルス粒子の形成を観察することにより評価することができる。
本発明の別の態様は、抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合した新規抗原結合性キメラタンパク質に関し、前記足場タンパク質は前記ドメインのトポロジーを分断し、足場タンパク質の総質量又は分子量は少なくとも３０ｋＤａであるため、キメラを抗原結合性ドメインの標的に結合することによる質量付加は有意となり、前記キメラに非共有結合的に結合させたときの標的の三次元構造解析を可能にするために十分となるであろう。別の実施形態において、足場タンパク質の総質量又は分子量は少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３５ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも４５ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、又は少なくとも６０ｋＤａである。この特定のサイズ又は質量増加の結果、画像の信号雑音比の低下が抑制されるであろう。第２に、キメラはクライオＥＭ及びＸ線結晶構造解析を使用して十分に高い解像度に達するように、小型のタンパク質又は結晶化しにくいタンパク質の正確な画像アラインメントに十分な特徴を提供することにより、構造ガイドとなるであろう。
本発明の別の態様は、抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合した新規抗原結合性キメラタンパク質に関し、前記足場タンパク質は前記ドメインのトポロジーを分断し、足場タンパク質は更に抗原結合性ドメインを含み、特定の１実施形態において、前記足場タンパク質はＶＨＨ、ナノボディ、又は抗体自体であるＩｇドメインを含む。従って、新規抗原結合性キメラタンパク質を得るための前記融合の結果、少なくとも２個の抗原結合部位をもつ抗原結合性キメラタンパク質が得られ、抗原結合性部分が相互に融合される結果としてリジッドなキメラが得られ、夫々の標的と結合するそれらの機能が維持される。前記少なくとも２個の抗原結合部位は１個の標的の同一のエピトープ又は異なるエピトープを標的とすることができるため、親和性及び／又は有効性が増す。あるいは、本発明に従って融合された前記２個の抗原結合性ドメインを含む前記キメラの２個の抗原結合部位は異なる標的タンパク質と結合することができるため、ただ１個のリジッドなキメラを使用して２個のタンパク質を標的とすることが可能になる。キメラのこのユニークな特徴は、例えば密接しているために他の方法では到達しにくい標的に対してリジッドな構造が必要になる場合に、二重特異性抗体を治療に使用する際の解決手段となる。
抗原結合性ドメイン及び／又は抗原結合性ドメインを含む足場タンパク質も本発明の範囲に含まれ、前記抗原結合性ドメインは「多価」形態であり、２個以上のＩｇドメイン等の（一価）抗原結合性ドメインを化学的結合又は組換えＤＮＡ技術により相互に結合することにより形成される。多価コンストラクトの非限定的な例としては、「二価」コンストラクト、「三価」コンストラクト、「四価」コンストラクト等が挙げられる。多価コンストラクト内に含まれる免疫グロブリンドメインは同一でも異なっていてもよい。特に、本発明の免疫グロブリンドメイン又は本発明の足場タンパク質を構成するＩｇドメインは「多重特異性」形態であり、少なくとも１個が異なる特異性をもつ２個以上の免疫グロブリンドメインを連結することにより形成される。多重特異性コンストラクトの非限定的な例としては、「二重特異性」コンストラクト、「三重特異性」コンストラクト、「四重特異性」コンストラクト等が挙げられる。更に詳しく説明すると、本発明のあらゆる（本願に定義する）多価又は多重特異性免疫グロブリンドメインは同一の抗原上の２個以上の異なるエピトープ、例えば、標的の２個以上の異なるエピトープに対して適切に特異的であることができ、あるいは、２個以上の異なる抗原に対して特異的であってもよく、例えば標的のエピトープと標的の天然結合パートナーのエピトープに対して特異的であってもよい。特に、本発明の一価免疫グロブリンドメインは、本発明の多価又は多重特異性免疫グロブリンシングル可変ドメインにより付与される親和性よりも低い親和性で標的と結合するように選択される。特定の１実施形態において、本発明のこのような多価又は多重特異性Ｉｇドメインは、Ｉｇドメインの少なくとも１個のそのトポロジーを分断することにより、Ｉｇドメインと足場タンパク質として相互に融合することができる。あるいは、そのＮ末端及び／又はＣ末端を介して本発明の多価又は多重特異性Ｉｇドメインを従来通りに融合し、更に一体として適用し、これを融合するＩｇドメインの分断又は多価若しくは多重特異性Ｉｇドメイン自体のＩｇドメインの分断により、別のＩｇドメイン及び／又は別の足場に融合してもよい。
別の実施形態は、非免疫グロブリンであるが、別の型のタンパク質と結合することが分かっているタンパク質であるため、同様に治療用ターゲティングに利用できると考えられる足場タンパク質を提供する。
代替態様において、本発明の抗原結合性キメラタンパク質は修飾アミノ酸を含む。別の実施形態は修飾形態で存在するか、及び／又は他の部分を含む（又は他の部分と融合した）足場タンパク質に関する。代替実施形態は修飾形態で存在するか、及び／又は他の部分を含む前記抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインに関する。修飾の例と、修飾することができる本発明のタンパク質ドメイン内の（即ち、タンパク質主鎖上でもよいが、側鎖上が好ましい）アミノ酸残基の例、このような修飾を導入するために使用することができる方法及び技術、更にこのような修飾の潜在的用途と利点は当業者に自明である。例えば、このような修飾は（例えば共有結合的連結により又は別の適切な方法で）１個以上の官能基、残基又は部分を結合剤の中又は上に導入する方法を含むことができる。このような官能基とその導入技術の例は当業者に自明であり、一般に、当技術分野で言及されている全官能基及び技術と、医薬用タンパク質の修飾、特に抗体又は抗体断片（ＳｃＦｖとシングルドメイン抗体を含む）の修飾についてそれ自体公知の官能基及び技術を含むことができ、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）を参照されたい。同じく当業者に自明の通り、このような官能基は例えば足場タンパク質に直接（例えば共有結合的に）連結してもよいし、任意に適切なリンカー又はスペーサーを介して連結してもよい。
抗原結合性キメラタンパク質に潜在的治療価値がある場合に、医薬用タンパク質の半減期を延長するため及び／又は免疫原性を低下させるために最も広く使用されている技術の一つは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）即ちｍＰＥＧ）等の適切な薬理学的に許容されるポリマーの結合を含む。一般に、抗体及び抗体断片（限定されないが、（シングル）ドメイン抗体とＳｃＦｖを含む）に当技術分野で使用されているペグ化等のあらゆる適切な型のペグ化を使用することができ、例えばＣｈａｐｍａｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，５３１－５４５（２００２）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ著，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５３－４５６（２００３）；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｃｈｅｓｓ著，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，２，（２００３）及びＷＯ０４０６０９６５を参照されたい。タンパク質の種々のペグ化試薬も例えばＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，米国から市販されている。特にシステイン残基を介して部位特異的ペグ化を使用することが好ましい（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１６，１０，７６１－７７０（２００３）参照）。例えば、この目的には、足場タンパク質に天然に存在するシステイン残基にＰＥＧを結合してもよいし、ＰＥＧの結合用の１個以上のシステイン残基を適切に導入するように足場タンパク質を修飾してもよいし、ＰＥＧの結合用の１個以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を足場のＮ末端及び／又はＣ末端に融合してもよく、いずれも当業者にそれ自体公知のタンパク質工学技術を使用する。本発明の新規抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質には、分子量が５０００超、例えば１０，０００超で２００，０００未満、例えば１００，０００未満、例えば２０，０００～８０，０００の範囲のＰＥＧを使用することが好ましい。別の修飾としては、通常ではあまり好ましくないが、Ｎ結合型又はＯ結合型グリコシル化が挙げられ、通常では本発明の抗原結合性キメラタンパク質を発現させるために使用する宿主細胞に応じて翻訳時及び／又は翻訳後修飾の一部として行われる。前記抗原結合性キメラタンパク質の半減期を延長するための別の技術としては、二機能性コンストラクト（例えば、標的１に対する１個の抗原結合性ドメインと、足場タンパク質の内側に存在し、アルブミン等の血清タンパク質に対する１個の抗原結合性ドメイン）を構築する方法や、足場タンパク質を介するか又は足場タンパク質として抗原結合性キメラタンパク質とペプチド（例えばアルブミン等の血清タンパク質に対するペプチド）の融合体を更に構築する方法が挙げられる。
本発明の別の態様は抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合した新規抗原結合性キメラタンパク質に関し、前記足場タンパク質は前記ドメインのトポロジーを分断し、前記足場タンパク質は修飾タンパク質、即ち標識されたタンパク質である。あるいは、前記抗原結合性ドメインは標識されたタンパク質である。更に別の修飾としては、標識した抗原結合性キメラタンパク質の所期用途に応じて１個以上の検出可能なラベル又は他のシグナル発生基若しくは部分を導入する方法が挙げられる。適切なラベルと、その結合、使用及び検出技術は当業者に自明であり、限定するものではないが、例えば、蛍光ラベル（例えばＩＲＤｙｅ８００、ＶｉｖｏＴａｇ８００、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド及びフルオレスカミン、更にＥｕ又はランタノイド系に属する他の金属等の蛍光金属）、リン光ラベル、化学発光ラベル又は生物発光ラベル（例えばルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、蓚酸エステル、ジオキセタン又はＧＦＰ及びそのアナログ）、放射性同位体、金属、金属キレート若しくは金属カチオン、又はインビボ、インビトロ若しくはインサイチュ診断及びイメージングで使用するのに特に適した他の金属若しくは金属カチオン、並びに発色団及び酵素（例えばマレイン酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ－５－ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α－グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ）が挙げられる。他の適切なラベルも当業者に自明であり、例えばＮＭＲ又はＥＳＲ分光法を使用して検出可能な部分が挙げられる。本発明のこのような標識された抗原結合性キメラタンパク質は、特定のラベルの選択に応じて例えば（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等のそれ自体公知のイムノアッセイを含む）インビトロ、インビボ又はインサイチュアッセイや、インビボ診断及びイメージング目的に使用することができる。当業者に自明の通り、別の修飾としては、例えば上記に挙げた金属又は金属カチオンの１種をキレート化するためにキレート基を導入する方法が挙げられる。適切なキレート基としては、限定されないが、例えば２，２’，２”－（１０－（２－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－２－オキソエチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリイル）三酢酸（ＤＯＴＡ）、２，２’－（７－（２－（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ）－２－オキソエチル）－１，４，７－トリアゾナン－１，４－ジイル）二酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。更に別の修飾としては、ビオチン－（ストレプト）アビジン結合対等の特異的結合対の一方の片割れである官能基の導入が挙げられる。このような官能基は結合対の他方の片割れと結合させた別のタンパク質、ポリペプチド又は化合物と抗原結合性キメラタンパク質を連結するために使用することができ、即ち結合対の形成により使用することができる。例えば、本発明の抗原結合性キメラタンパク質をビオチンと結合し、アビジン又はストレプトアビジンと結合させた別のタンパク質、ポリペプチド、化合物又は担体と連結することができる。例えば、このようなコンジュゲート抗原結合性キメラタンパク質は、例えば検出可能なシグナル発生剤をアビジン又はストレプトアビジンに結合させた診断システムでレポーターとして使用することができる。このような結合対は、例えば薬学的目的に適した担体を含む担体に本発明の抗原結合性キメラタンパク質を結合するために使用してもよい。非限定的な１例はＣａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ，８，４，２５７（２０００）に記載されているリポソーム製剤である。本発明の抗原結合性キメラタンパク質に治療活性剤を連結するためにこのような結合対を使用してもよい。更に、毒性ラベルや放射性核種をペイロードとして使用することも前記抗原結合性キメラタンパク質の範囲に含まれる。最後に、足場タンパク質に連結又は融合した「ラベル」又は「タグ」を使用すると、Ｉｇドメインの標的タンパク質を非共有結合的に標識できるという利点がある。
本発明の別の態様は、本発明の前記抗原結合性キメラタンパク質をコードする核酸分子に関する。前記核酸分子は前記抗原結合性ドメインのコーディング配列と前記足場タンパク質、及び／又はその断片を含み、前記ドメインのトポロジーの分断は、前記ドメイン配列が足場タンパク質配列（又は循環置換配列又はその断片）の挿入を含み、Ｎ末端抗原結合性ドメイン断片とＣ末端抗原結合性ドメイン断片が前記核酸分子内で足場タンパク質配列又はその断片により分離されるという事実に反映される。
別の実施形態では、少なくともプロモーターと、抗原結合性キメラタンパク質をコードする前記核酸分子と、転写終結シグナルを含む３’末端領域を含むキメラ遺伝子について記載する。別の実施形態は、本発明の前記抗原結合性キメラタンパク質をコードする発現カセット、又は前記抗原結合性キメラタンパク質をコードする核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含む発現カセットに関する。前記発現カセットは、所定の実施形態では、標的の最適なバインダーについて選択するためのＩｇドメインの大きなセットを含む免疫ライブラリーとしての汎用フォーマットで適用される。
他の実施形態は、本発明の抗原結合性キメラタンパク質をコードする前記発現カセット又は核酸分子を含むベクターに関する。特定の実施形態では、大腸菌発現用ベクターにより抗原結合性キメラタンパク質を産生させ、それらの標的の存在下又は不在下で精製することができる。
代替実施形態は、本発明の抗原結合性キメラタンパク質、又は本発明の抗原結合性キメラタンパク質をコードする核酸分子若しくは発現カセット若しくはベクターを含む宿主細胞に関する。特定の実施形態において、前記宿主細胞は更に前記抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインと特異的に結合する抗原又は標的タンパク質を共発現する。
別の実施形態はリガンドスクリーニング、医薬品スクリーニング、タンパク質捕捉及び精製、又は生物物理学的研究用としての前記宿主細胞、又は前記細胞から単離された膜調製物、又は前記細胞から単離されたタンパク質の使用を開示する。
前記ベクターを提供する本発明は、更に汎用融合ベクターでの高スループットクローニングの選択肢を含む。前記汎用ベクターについては、前記ベクターが酵母、ファージ、細菌又はウイルスにおける表面提示に特に適している他の実施形態で記載する。更に、前記ベクターは異なるＩｇドメインの大きなセットと共にこのような汎用ベクター又は発現カセットを含む免疫ライブラリーを選択及びスクリーニングするのに利用され、保存されたＩｇドメイン及び足場タンパク質の同一のＮ末端をライブラリーにより提供される残りのＩｇドメイン配列と融合する。従って、新規抗原結合性キメラタンパク質を特定の標的についてスクリーニングするために作製された前記ライブラリーにおける配列の相違は、Ｉｇドメイン配列の相違により提供され、より特定的には前記ＩｇドメインライブラリーのＣＤＲ領域の相違により提供される。
本発明の別の実施形態は本発明の抗原結合性キメラタンパク質の生産方法として、（ａ）抗原結合性キメラタンパク質の発現を誘導する条件下で本発明のベクター、発現カセット、キメラ遺伝子又は核酸配列を含む宿主を培養する工程と、（ｂ）任意工程として、発現されたポリペプチドを回収する工程を含む方法に関する。
一つの実施形態において、本発明のベクターは抗原結合性キメラタンパク質の集合、好ましくは免疫ライブラリーを細胞集団の細胞外表面に提示させることを含む方法で使用するのに適している。表面ディスプレイ法はＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，（２００５；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，１１０５－１６）に総説されており、細菌ディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、（バクテリオ）ファージディスプレイ法が挙げられる。細胞集団は酵母細胞が好ましい。各種酵母表面ディスプレイ法はいずれも、ライブラリーにコードされた各抗原結合性キメラタンパク質をコードするプラスミドを導入した酵母細胞の細胞外表面にこのタンパク質をしっかりと連結する手段を提供する。従来記載されている大半の酵母ディスプレイ法は酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用しているが、例えばピキア・パストリスＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の他の酵母種を使用してもよい。より具体的には、ある種の実施形態において、酵母株はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｏｗｉａ）及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）から成る群から選択される属に由来する。ある種の実施形態において、酵母種はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、及びカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）から成る群から選択される。大半の酵母発現用融合タンパク質は、細胞表面タンパク質の表面発現に重要な役割を果たして酵母の生存に不可欠であるＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカー型タンパク質をベースとする。このようなタンパク質の１例であるα－アグルチニンはＡＧＡ１にコードされるコアサブユニットから構成され、ジスルフィド架橋を介してＡＧＡ２にコードされる小型の結合サブユニットに連結されている。核酸ライブラリーにコードされたタンパク質をＡＧＡ１のＮ末端領域又はＡＧＡ２のＣ末端若しくはＮ末端領域に導入することができる。どちらの融合パターンでも、酵母細胞表面にポリペプチドが提示されるであろう。
本願に開示するベクターは原核宿主細胞にタンパク質を表面提示させるのにも適していると思われる。この目的に適した原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物等の真正細菌が挙げられ、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ））及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）等の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に加え、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やバシラス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば１９８９年４月１２日付け公開ＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｎｉｓ ４１Ｐ）等のバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。好ましい大腸菌クローニング宿主の１例は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）等の他の株も適切である。これらの例は例示であり、制限するものではない。宿主細胞が原核細胞であるとき、適切な細胞表面タンパク質の例としては、適切な細菌外膜タンパク質が挙げられる。このような外膜タンパク質としては、線毛と鞭毛、リポタンパク質、氷核タンパク質及びオートトランスポーターが挙げられる。異種タンパク質提示に使用される細菌タンパク質の例としては、ＬａｍＢ（Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，５（１１）：３０２９－３７（１９８６））、ＯｍｐＡ（Ｆｒｅｕｄｌ，Ｇｅｎｅ，８２（２）：２２９－３６（１９８９））及びインチミン（Ｗｅｎｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７４（３０）：２１０３７－４３，（１９９９））が挙げられる。その他の外膜タンパク質の例としては、限定されないが、ＦｌｉＣ、プルラナーゼ、ＯｐｒＦ、ＯｐｒＩ、ＰｈｏＥ、ＭｉｓＬ及びシトリシンが挙げられる。表面提示に使用されている細菌膜タンパク質の広範なリストはＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１（１）：４５－５２（２００３）、Ｊｏｓｅ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６９（６）：６０７－１４（２００６）、及びＤａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１７（４）：４７４－８０（２００７）に詳細に記載されている。
更に、徹底的なスクリーニング選択を可能にするために、ベクターを酵母及び／又はファージディスプレイ法に適用した後に、夫々ＦＡＣＳとパニングを実施することができる。酵母細胞への抗原結合性キメラの提示を例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の分解能と組み合わせることにより、好ましい選択方法が得られる。酵母ディスプレイ法では、シングルセルの表面に各抗原結合性タンパク質を例えば～５０，０００コピーのＡｇａ２ｐタンパク質との融合体として提示させる。ＦＡＣＳによる選択には、異なる蛍光色素で標識し、選択手順を決定する。次に、使用した蛍光タンパク質の混合物で抗原結合性キメラを提示する酵母ライブラリーを染色することができる。その後、二色ＦＡＣＳを使用し、特定の酵母細胞上に提示される各抗原結合性キメラの特性を分析し、別々の細胞集団を解析することができる。目的タンパク質を標的とするのに非常に適した抗原結合性キメラを提示する酵母細胞が結合するので、二色ＦＡＣＳで対角線に沿って選別することができる。例えば一過的なタンパク質間相互作用を特異的に標的とする抗原結合性キメラタンパク質をスクリーニングする場合又はコンフォメーション選択的結合が望ましい場合には、このような選択法にベクターを使用するのが最も好ましい。同様に、ファージディスプレイ法用ベクターを適用し、抗原結合性キメラをバクテリオファージ上に提示させるのに使用した後、パニングを実施する。提示は例えば抗原結合性キメラを前記遺伝子ベクター内でファージコートタンパク質ＩＩＩと融合することによりＭ１３粒子上で実施することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２０００；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ．５６９９：３７１－３７８）。所定のコンフォメーションと特異的に結合する抗原結合性タンパク質及び／又は一過的なタンパク質間相互作用の選択には、例えば、相互作用するプロトマーの１個のみを固相に固定化する。その後、ファージ提示された抗原結合性キメラのパニングによるバイオ選択を過剰量の残りの可溶性プロモーターの存在下で実施する。任意に、固相に固定化した架橋複合体又はタンパク質でパニングラウンドを開始することができる。
本発明の別の態様は、前記抗原結合性キメラタンパク質又は抗原結合性キメラタンパク質の組成物と抗原又は標的タンパク質を含む複合体に関し、前記標的タンパク質は前記抗原結合性キメラタンパク質又は前記抗原結合性キメラタンパク質の組成物に特異的に結合している。より特定的には、前記標的タンパク質は前記抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインに結合しており、更に特定的には、前記抗原結合性ドメインがＩｇドメインである実施形態では、前記抗原結合性キメラタンパク質のＩｇドメインのＣＤＲに結合している。一つの実施形態は本願に記載する複合体であって、前記抗原結合性ドメインがコンフォメーション選択的結合ドメインであるものを開示する。より特定的には、前記抗原結合性ドメインが前記標的タンパク質を機能的なコンフォメーションで安定化する複合体を開示する。より具体的には、前記機能的なコンフォメーションは特にアゴニストコンフォメーションを含むものでよいし、部分アゴニストコンフォメーションを含むものでもよいし、バイアス型アゴニストコンフォメーションを含むものでもよい。あるいは、本発明の複合体であって、抗原結合性ドメインが標的タンパク質を機能的なコンフォメーションで安定化させるもの、前記機能的なコンフォメーションが不活性なコンフォメーションであるもの、又は前記機能的なコンフォメーションがインバースアゴニストコンフォメーションを含むものを開示する。
本発明の他の態様は前記抗原結合性キメラタンパク質を含む組成物に関する。本発明の「組成物」は、凍結乾燥した抗原結合性キメラタンパク質を収容する第１の容器と、凍結乾燥したタンパク質の再懸濁用溶液を収容する第２の容器を含むキットの形態で提供することができる。タンパク質粉末には、凍結乾燥中にタンパク質を安定化させるためにスクロース、デキストラン、ソルビトール及びアミノ酸等の１種以上の凍結乾燥保護剤を添加することができる。あるいは、組成物は抗原結合性キメラタンパク質の懸濁液又は溶液を収容した単一容器として提供される。どちらの溶液も１種以上の賦形剤を含有することができる。溶液は一般的には水性である。従って、精製水が主要な賦形剤を形成することができる。例えば、通常では所望の最終濃度とするように注射用水（ＷＦＩ）でタンパク質を希釈する。溶液は一般的には緩衝液を含む。従って、他の賦形剤としては、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物及び水酸化ナトリウム等の緩衝剤及びｐＨ調節剤が挙げられる。場合によっては、別の賦形剤としてキサンタンガム等の増粘剤を加えてもよい。界面活性剤、特に、ポリソルベート８０等の非イオン性界面活性剤も加えてもよい。他の賦形剤としては、スクロース、ソルビトール、無機塩類、アミノ酸及びビタミン類が挙げられる。
本発明は更に本発明の１種以上の化合物、特に抗原結合性キメラタンパク質と、薬学的に許容される基剤又は希釈剤を含有する「医薬組成物」にも関する。これらの医薬組成物は所望の薬理学的効果を必要とする患者に投与することによりこのような効果を達成するために利用することができる。本発明は薬学的に許容される基剤と、薬学的有効量の本発明の化合物又はその塩から成る医薬組成物を含む。化合物の薬学的有効量は、治療する特定の病態に効果を生じるか又は影響を与える量であることが好ましい。一般に、「治療有効量」、「治療有効用量」及び「有効量」とは、１種以上の所望の結果を達成するために必要な量を意味する。当技術分野における通常の知識を有する者であれば、力価、従って、「有効量」が本発明の化合物の種類と構造により変動し得ることを理解されよう。当業者は前記化合物の力価を容易に評価することができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的又は他の点で有害ではない材料を意味し、即ち、このような材料は望ましくない生物学的作用を生じたり、この材料を含有する医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、前記化合物と共に個体に投与することができる。薬学的に許容される基剤は、この基剤に起因する如何なる副作用も有効成分の有益な作用を損なわないように、有効成分の有効な活性に一致する濃度において患者に比較的非毒性で無害である基剤とすることが好ましい。適切な基剤又は添加剤は一般的には以下の非網羅的リストに含まれる化合物、即ち、分子量が大きく、代謝の遅い高分子の１種以上を含み、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子である。このような成分及び手順としては、各々本願に援用する以下の文献に記載されているものが挙げられる：Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８，５２（５），２３８－３１１）、Ｓｔｒｉｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ（“Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｍａｒｋｅｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９９）－Ｐａｒｔ－１”ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９，５３（６），３２４－３４９）、及びＮｅｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７，５１（４），１６６－１７１）。
本願で使用する「賦形剤」なる用語は医薬組成物中に存在することができ、有効成分以外のものである全ての物質を含むものであり、塩類、結合剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝物質、安定化剤、着香剤又は着色剤等が挙げられる。「希釈剤」、特に「薬学的に許容される溶媒」としては、水、塩類溶液、生理的塩類溶液、グリセロール、エタノール等の溶媒が挙げられる。湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、防腐剤等の補助物質をこのような溶媒に添加してもよい。
本発明の抗原結合性キメラタンパク質と薬学的に許容される基剤は速放型、遅放型及び時限放出型製剤を含むいずれかの有効な従来の剤形を使用して当技術分野で周知の薬学的に許容される基剤と共に投与することができ、当技術分野における通常の知識を有する者に広く知られている経路のいずれか等の適切な経路により投与することができる。治療用として、本発明の医薬組成物は標準技術に従ってあらゆる患者に投与することができる。
経口投与用には、化合物をカプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、メルト剤、散剤、溶液剤、懸濁剤又は乳剤等の固体又は液体製剤に製剤化することができ、医薬組成物の製造分野で公知の方法に従って製造することができる。固体単位用量製剤はカプセル剤とすることができ、例えば界面活性剤、滑沢剤、並びにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチ等の不活性充填剤を加えた通常のハードシェル又はソフトシェルゼラチン型とすることができる。別の実施形態では、結合剤（例えばアラビアガム、コーンスターチ又はゼラチン）、投与後に錠剤の分解と溶解を補助するための崩壊剤（例えばジャガイモデンプン、アルギン酸、コーンスターチ、グアーガム、トラガカントガム、アラビアガム）、錠剤顆粒化の流動性を改善し、錠剤材料が錠剤ダイ・ポンチの表面に接着するのを防ぐための滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛）、錠剤の美的品質を高め、患者に許容し易くするための色素、着色剤及び着香剤（例えばペパーミント、ウィンターグリーン油又はチェリーフレーバー）と共に、ラクトース、スクロース及びコーンスターチ等の従来の錠剤基剤を使用して本発明の化合物を錠剤化することができる。経口液体剤形で使用するのに適した賦形剤としては、リン酸二カルシウムと、水及びアルコール（例えばエタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコール類）等の希釈剤が挙げられ、薬学的に許容される界面活性剤、懸濁化剤又は乳化剤を添加してもよいし、添加しなくてもよい。種々の他の材料をコーティングとして使用してもよいし、他の方法で製剤単位の物理的形態を変えるために使用してもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤はシェラック、糖又はその両方をコーティングしてもよい。水性懸濁剤の製造には分散性粉末及び顆粒が適している。その場合には、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１種以上の防腐剤との混合物として有効成分が提供される。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤の例は上記の通りである。その他の賦形剤として、例えば上記甘味剤、着香剤及び着色剤も加えてもよい。
医薬組成物は滅菌注射用水性懸濁剤の形態でもよい。このような懸濁剤は適切な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアガム）を使用して公知方法に従って製剤化することができ、分散剤又は湿潤剤はレシチン等の天然ホスファチドでもよいし、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、又は脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）でもよい。滅菌注射用製剤は非毒性で非経口投与に許容される希釈剤又は溶剤で調剤した滅菌注射溶液剤又は懸濁剤でもよい。利用することができる希釈剤及び溶剤は例えば水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液及び等張ブドウ糖液である。更に、滅菌不揮発性油は溶媒又は懸濁媒として従来から利用されている。この目的には、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含むあらゆる無刺激性の不揮発性油を利用できる。更に、オレイン酸等の脂肪酸も注射用製剤で使用することができる。
別の態様は、標的タンパク質の構造解析における本発明の抗原結合性キメラタンパク質の使用又は核酸分子、キメラ遺伝子、発現カセット、ベクター、複合体若しくは組成物の使用に関する。特に、標的タンパク質の構造解析における抗原結合性キメラタンパク質の使用であって、前記標的タンパク質が前記抗原結合性キメラタンパク質に特異的に結合しているタンパク質である場合に関する。本願で使用する「構造を解析する」又は「構造解析」なる用語はタンパク質の原子配置又は原子座標を決定することを意味し、多くの場合にはＸ線結晶構造解析又は低温電子顕微鏡法（クライオＥＭ）等の生物物理学的方法により実施される。具体的に、１実施形態は単粒子クライオＥＭ又は結晶構造解析を含む構造解析における使用に関する。本発明の抗原結合性キメラタンパク質を構造生物学で使用すると、結晶化助剤として利用するため、即ち結晶接触としての役割を果たし、対称性を増すために非常に有利であり、更には大型の構造を解析するのに非常に有用となるクライオＥＭでリジッドツールとして利用するためにも有利でもあるが、主として、今日検討されているサイズの障壁を軽減するために非常に有利であり、また、対称性を増すためにも非常に有利である。
構造決定にクライオＥＭを使用すると、Ｘ線結晶構造解析等の伝統的なアプローチに勝るいくつかの利点がある。特に、クライオＥＭは解析対象の試料に要求される純度、均一性及び品質の要件が厳しくない。重要な点として、クライオＥＭは構造決定に適した結晶を形成しない標的に適用することができる。精製又は未精製タンパク質を単独で用いるか又は抗原結合性キメラタンパク質等の他のタンパク質性分子若しくは核酸等の非タンパク質性分子との複合体として用いた懸濁液をクライオＥＭによるイメージングのためにカーボングリッドに滴下することができる。支持膜付きグリッドを通常は液体エタン中で急速凍結させ、懸濁液中の粒子を凍結水和状態で保存する。より大きな粒子を低温固定によりガラス状にすることができる。ガラス状にした試料をクライオウルトラミクロトームで（一般的には厚さ４０～２００ｎｍの）薄い切片に切断することができ、切片をイメージングのために電子顕微鏡グリッドにマウントすることができる。～３．３Åの高い解像度が得られるように平行照射とより良い顕微鏡アライメントを使用することにより、画像から得られたデータの品質を改善することができる。このような高解像度では、全原子構造のアビニシオ（ａｂ ｉｎｉｔｉｏ）モデル構築が可能である。一方、選択された標的タンパク質又は密接に関連する標的タンパク質と、選択された異種タンパク質又は近いホモログに関する原子レベルの解像度の構造データを制約比較モデリング用に入手可能な場合には、もっと低い解像度のイメージングで十分であると思われる。データ品質を更に改善するためには、イメージングに使用したと同一条件下で記録したカーボン膜画像のフーリエ変換において１／３Å-１を上回るような目に見えるコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）のリングが現れるように、顕微鏡を注意深く軸合わせすることができる。その後、ＣＴＦＦＩＮＤ等のソフトウェアを使用して各顕微鏡写真の焦点外れ値を求めることができる。
本発明の別の態様は、標的タンパク質又は目的タンパク質の三次元構造の決定方法として、
（ｉ）本発明の抗原結合性キメラタンパク質又は組成物と標的されたタンパク質を準備して複合体を形成し、ここで、前記標的タンパク質は、前記抗原結合性キメラタンパク質又は組成物に特異的に結合されている工程、
又は本発明の複合体を準備する工程と；
（ｉｉ）構造解析に適した条件下で前記混合物又は複合体を提示させ、前記標的タンパク質の三次元構造を高解像度で決定する工程を含む方法に関する。
具体的な１実施形態において、前記構造解析はＸ線結晶構造解析により実施される。別の実施形態において、前記三次元解析はクライオＥＭを含む。より具体的には、クライオＥＭ解析の手法の１例は以下の通りである。選択した最高性能のグロー放電処理済みグリッド（カーボン膜を貼った銅グリッドであるＣ－Ｆｌａｔ，１．２／１．３ ２００メッシュ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；金Ｒ１．２／１．３ ３００メッシュＵｌｔｒａＡｕＦｏｉｌグリッド：Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ等）に試料（例えば目的標的との複合体における選択したメガボディタンパク質）を滴下後にブロッティングした後、液体エタンにプランジ凍結する（Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（ＦＥＩ）又は他の選択したプランジャー）。選択した検出器（１例としてＦａｌｃｏｎ ３ＥＣ直接検出器）を取付けた３００ｋＶ電子顕微鏡（１例として選択した位相板をＫｒｉｏｓ ３００ｋＶに挿入したもの）でグリッド１枚のデータを取得する。予想されるメガボディ－抗原複合体サイズに適した適正な倍率で電子カウントモードにて顕微鏡写真を取得する。取得した顕微鏡写真を更に画像処理する前に手動チェックする。選択したソフトウェア（例えばＲＥＬＩＯＮ、ＳＰＨＩＲＥパッケージ）によりドリフト補正、電子線誘起モーション、ドース重み付け、ＣＴＦフィッティング及び位相シフト推定を適用する。選択したソフトウェアにより粒子を抽出し、二次元分類に使用する。二次元クラスを手動検査し、偽陽性を除去する。データ取得設定に応じて粒子をビニングする。適正なローパスフィルターを適用することにより初期三次元参照モデルを作成し、多数（１例として６個）の三次元クラスを作成する。元の粒子を三次元精密化に使用する（必要に応じてソフトマスクを使用する）。フーリエシェル相関（ＦＳＣ）＝０．１４３を基準に使用することにより再構成解像度を推定する。ＳｃｉｐｉｏｎでＭｏｎｏＲｅｓを実行することにより局所解像度を計算することができる。再構成したクライオＥＭマップをＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ及びＣｏｏｔソフトウェアにより解析することができる。ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａを使用して設計モデルを初期フィッティングさせ、選択したソフトウェア（ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ、ＰｙＭＯＬ又はＣｏｏｔ）により解析することができる。
本発明の方法の別の利点として、構造解析は従来方法では高純度タンパク質でしか可能でないが、抗原結合性キメラタンパク質の使用により純度要件が緩和される。このような抗原結合性タンパク質は特にナノボディの場合、複合体混合物内でそのエピトープとの結合により目的タンパク質を特異的に抽出するであろう。こうして標的タンパク質をトラップし、凍結し、クライオＥＭにより解析することができる。
前記方法は代替実施形態では、標的タンパク質が一過的なタンパク質－タンパク質複合体である三次元解析にも適している。更に、その構造解析を可能にするように一過的なタンパク質間相互作用を標的として安定化させるために標的の三次元構造を決定する方法で前記キメラ抗原結合性分子を適用することもできる。
別の実施形態は、同一の標的タンパク質の異なるエピトープと結合する抗原結合性キメラタンパク質のパネルを選択又はスクリーニングするための方法として、（ｉ）前記標的タンパク質と結合する抗原結合性キメラタンパク質の免疫ライブラリーを設計する工程と、（ｉｉ）表面酵母ディスプレイ法、ファージディスプレイ法又はバクテリオファージ法により抗原結合性キメラタンパク質を選択し、前記標的の数個のエピトープと結合するタンパク質を含む抗原結合性キメラタンパク質パネルを得る工程を含み、それにより、例えばクライオＥＭで別々の画像として前記標的タンパク質の数個のコンフォメーションを解析できるようにする方法に関する。
別の実施形態において、本発明の前記方法及び前記抗原結合性キメラタンパク質は構造に基づく医薬品設計及び構造に基づく医薬品スクリーニングに使用される。構造に基づく医薬品設計の反復プロセスは最適化リードがフェーズＩ臨床試験に入る前に複数のサイクルで進められることが多い。第１サイクルは標的タンパク質又は核酸のクローニング、精製及び構造決定を含み、構造決定はＸ線結晶構造解析、ＮＭＲ又はホモロジーモデリングの３種の主要な方法のうちの１種により行われる。コンピューターアルゴリズムを使用し、データベースからの化合物又は化合物断片を構造の選択した領域に配置する。標的の所定の構造コンフォメーションを固定又は安定化させるために本発明の抗原結合性キメラタンパク質を使用することができる。選択された化合物を標的部位とのその立体的及び静電的相互作用に基づいて採点・等級付けし、最良の化合物を生化学的アッセイで試験する。第２サイクルでは、第１サイクルからの有望なリードのうちでインビトロ阻害が少なくともマイクロモルレベルであるリードとの複合体における標的の構造決定により、力価を増すために最適化することができる化合物上の部位が判明する。この時点でも、本発明の抗原結合性キメラタンパク質を利用すると、所定のコンフォメーション状態における前記標的の構造解析が容易になる。その他のサイクルとしては、最適化リードの合成、新しい標的とリードの複合体の構造決定、及びリード化合物の更なる最適化が挙げられる。医薬品設計プロセスの数サイクル後に、最適化化合物は通常では結合の著しい改善を示し、多くの場合には標的に対する特異性についても著しい改善を示す。ライブラリースクリーニングはヒット化合物に繋がり、更に構造情報と構造活性相関解析の創薬化学が不可欠であるリード化合物の開発に繋がる。
別の実施形態において、本発明の方法で使用される前記抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインはナノボディＩｇドメインを含むため、提示された抗原結合性キメラについてナノボディを使用して選択すると、主にコンフォメーションエピトープとのバインダーが判明するので、前記方法には、正しく折り畳まれた標的タンパク質の平均画像のみが得られるという利点もある。
別の実施形態は（コンフォメーション選択的）化合物の同定方法として、
ｉ）標的タンパク質と、前記標的タンパク質と特異的に結合する本発明の抗原結合性キメラタンパク質を準備する工程と、
ｉｉ）試験化合物を準備する工程と、
ｉｉｉ）前記試験化合物と前記標的タンパク質の選択的結合を評価する工程を含む方法に関する。
特に好ましい１実施形態によると、コンフォメーション選択的化合物の上記同定方法はリガンド結合アッセイ又は競合アッセイにより実施され、更に好ましくは放射性リガンド結合アッセイ又は競合アッセイにより実施される。コンフォメーション選択的化合物の上記同定方法は比較アッセイで実施するのが最も好ましく、より具体的には比較リガンド競合アッセイ、更に具体的には実施例のセクションに詳細に説明する比較放射性リガンド競合アッセイで実施する。
試験対象の化合物はあらゆる低分子化合物、又はタンパク質、糖、核酸若しくは脂質等の高分子とすることができる。一般的に、試験化合物は低分子化合物、ペプチド、抗体 又はその断片となるであろう。当然のことながら、場合によっては、試験化合物は試験化合物のライブラリーでもよい。特に、アゴニスト、アンタゴニスト若しくはインバースアゴニスト及び／又はモジュレーター等の治療用化合物の高スループットスクリーニングアッセイも本発明を構成する。高スループットの目的には、アロステリック化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体ライブラリー、断片ベースのライブラリー、合成化合物ライブラリー、天然化合物ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー等の化合物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリーを使用することができる。このようなライブラリーの作製・スクリーニング方法は当業者に公知である。試験化合物を任意に検出可能なラベルに共有結合的又は非共有結合的に連結してもよい。適切な検出可能なラベルとその結合、使用及び検出技術は当業者に自明であり、限定されないが、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段又は化学的手段により検出可能なあらゆる組成物が挙げられる。有用なラベルとしては、磁気ビーズ（例えばダイナビーズ）、蛍光色素（例えば全てのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質等）、放射性ラベル（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、及び比色ラベル（例えば金コロイドや、着色ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のビーズ）が挙げられる。このようなラベルの検出手段も当業者に周知である。即ち、例えば、放射性ラベルは写真フィルムやシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは光検出器を使用して発光照度を検出することにより検出することができる。酵素ラベルは一般的に、酵素に基質を添加し、酵素が基質に作用することにより生成される反応生成物を検出することにより検出され、比色ラベルは単に着色ラベルを可視化することにより検出される。他の適切な検出可能なラベルについては、本発明のキメラポリペプチドに関する本発明の第１の態様に関連して上述した通りである。従って、具体的な実施形態によると、上記スクリーニング方法のいずれかで使用される試験化合物は上記に定義したようなポリペプチド、ペプチド、低分子、天然物、ペプチドミメティック、核酸、脂質、リポペプチド、炭水化物、抗体又はこれに由来するいずれかの断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインを含む断片、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ、ラクダ科動物重鎖抗体に由来する可変ドメイン（ＶＨＨ又はナノボディ）、サメ抗体に由来する新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ））、タンパク質足場として、アルファボディ、プロテインＡ、プロテインＧ、アンキリンリピートドメインから設計された分子（ＤＡＲＰｉｎｓ）、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、アンチカリン、ノッティン、人工的に作製したＣＨ２ドメイン（ナノ抗体）を含む群から選択される。好ましい一つの実施形態において、高スループットスクリーニング法は多数の潜在的治療用リガンドを含むコンビナトリアル化合物又はペプチドライブラリーを準備する工程を含む。その後、このような「コンビナトリアルライブラリー」又は「化合物ライブラリー」を本願に記載するような１種以上のアッセイでスクリーニングし、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を同定する。「化合物ライブラリー」とは、高スループットスクリーニングで通常では最後に使用される保存された化合物の集合である。「コンビナトリアルライブラリー」とは、多数の化学的「構成要素」を組み合わせることにより、化学的合成又は生物学的合成により生成された種々の化合物の集合である。コンビナトリアルライブラリーの作製とスクリーニングは当業者に周知である。こうして同定された化合物は従来の「リード化合物」として利用することもできるし、それ自体を潜在的又は実際の治療薬として使用することもできる。
別の態様は、前記足場タンパク質が標識されたタンパク質である前記抗原結合性キメラタンパク質の診断ツールとしての使用、又はより具体的にはインビボイメージング用の使用を提供する。
最後の態様は、医薬用としての前記抗原結合性キメラタンパク質又は核酸、ベクター、複合体若しくは組成物を提供する。本願で使用する「医薬」なる用語は治療、即ち、疾患又は障害の予防又は治療に使用される物質／組成物を意味する。本発明によると、「疾患」又は「障害」なる用語はあらゆる病的状態、特に、本願に定義する疾患又は障害を意味する。
以上、本発明による人工細胞と方法に関して特定の実施形態、具体的な構造並びに材料及び／又は分子について記載したが、当然のことながら、本発明の範囲と趣旨から逸脱しない限り、形態及び内容に種々の変更又は改変を加えてもよい。以下の実施例は特定の実施形態をより詳しく説明するためのものであり、本願を制限するものとみなすべきではない。本願は特許請求の範囲のみに制限される。
概要
抗原結合性ドメインと足場タンパク質から構成され、２本若しくは３本のショートリンカー又は２箇所若しくは３箇所の直接結合を介して抗原結合性ドメインを足場タンパク質に連結したリジッドな抗原結合性キメラタンパク質を設計した。足場の性質に応じて、これらのリジッドな抗原結合性キメラタンパク質は種々の用途に利用される。
一例として、本願に記載する「抗原結合性キメラタンパク質」は「メガボディ」（Ｍｂ又はＭｇｂ）とも言い、ナノボディ、ＶＨＨ又はモノボディを含む免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリン様ドメインを足場タンパク質、特に大型の単量体足場にグラフトしたものである。これらの抗原結合性キメラ又は本願で具体的に使用するようなメガボディは（より小型の）タンパク質のタンパク質構造を決定するための手段となり、Ｘ線結晶構造解析及びクライオＥＭ用途を含む数種の用途に役立つ。Ｍｂは標的のコンフォメーション柔軟性を低減させ、結晶接触を形成し易い表面を広げると共に、付加的な位相決定情報を提供することにより、次世代結晶化シャペロンとして機能する。更に、革新的な補助ツールとしてのこれらのキメラにより、クライオＥＭを使用して高解像度構造を得る際のサイズの障壁が軽減された。特定のメガボディ抗原結合性キメラタンパク質をその標的と混合することにより、それらの特異的相互作用の結果として「質量」付加が得られ、グリッド上でガラス状の氷に包埋した粒子に規定の特徴が追加されるため、正確な画像アラインメントが容易になり、三次元再構成の解像度が改善される。Ｍｂ等のこのような抗原結合性キメラタンパク質を使用すると、コンフォメーションエピトープと１対１の比で選択的に結合するので、粒子分類が容易になり、分類された粒子の構造／コンフォメーション均一性が改善され、三次元再構成の解像度が改善されるという利点もある。重要な点として、相互に似ているが、同一タンパク質上の異なるエピトープと結合する異なるＭｂのセットを使用／併用すると、同一の高分子複合体から異なる粒子を作製することができる。
このアプローチの概念実証として、図２に従ってＧＦＰ特異的ナノボディの（βストランドＡ及びＢを繋ぐ）第１の露出βターンにＨｏｐＱの接着ドメイン（ピロリ菌に由来するペリプラズムタンパク質ＰＤＢ５ＬＰ２）をコードする遺伝子の循環置換変異体（ｃＨｏｐＱ）を挿入した（実施例１）。このキメラを分泌タンパク質として大腸菌のペリプラズムで発現させ、ｍｇ量で均一になるまで精製した（実施例２）。次に、このキメラ抗体がＧＦＰと結合することを確認し、Ｘ線結晶構造解析によりその構造を解析した（実施例３）。同一の足場を使用し、タンパク質複合体を安定化させる抗原結合性キメラタンパク質（実施例４）、ＧＰＣＲと結合する抗原結合性キメラタンパク質（実施例５）、及びイオンチャネルと結合する抗原結合性キメラタンパク質（実施例６及び実施例２２）も作製した。更に、実施例５では、コンフォメーション選択的な安定化が得られ、メガボディを構成するＮｂ又は抗原結合性ドメインの全ての機能的性質が維持されることが判明した。リンカー長とリンカー組成の異なる２本の短いポリペプチド結合を介して他の機能的ＨｏｐＱをベースとするメガボディを設計するためにインビトロ進化技術も使用した（実施例７）。他の大型の足場タンパク質もメガボディを作製するために使用できることを示すために、次に長さと組成の異なる２本の短いポリペプチド結合を介してＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンに大腸菌の８６ｋＤＡペリプラズムタンパク質であるＹｇｊＫ（ＰＤＢ３Ｗ７Ｓ）をコードする遺伝子の循環置換変異体を挿入した（実施例８）。メガボディを剛性化するためにリンカーペプチドの１個とナノボディのＣ末端の間にジスルフィド結合を構築できることも示した（実施例９）。より複雑な連結スキームによりＮｂを足場に連結した他のリジッドな抗体キメラも作製した。インビトロ進化を使用し、長さと組成の異なる３本の短いポリペプチド結合を介してＧＦＰ特異的ナノボディをアズリン（ＰＤＢ２ＴＳＡ）に融合した。アズリンはＸ線結晶構造解析で異常散乱による位相決定に使用される銅含有シングルドメインタンパク質である（実施例１０）。得られた抗原結合性キメラタンパク質（本願ではメガボディと称する）は、Ｘ線結晶構造解析と単粒子クライオＥＭによるタンパク質又は複合体の構造試験を可能にすることが分かった。同様に、構造対称性を保ちながら抗原結合性ドメインを多量体足場にリジッドに連結できるため、構造対称性をもつ多量体抗原結合性キメラタンパク質又は多量体メガボディが得られる。この原理を証明するために、ナノボディを足場に連結する３本のショートポリペプチドリンカーを介してバクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）の反転型糖質加水分解酵素ホモ二量体であるＳｕｓＢ（ＰＤＢ３ＷＦＡ）にリゾチーム結合性Ｎｂをグラフトした（実施例１１）。このような２回回転対称性をもつホモ二量体ＭｂはクライオＥＭ又はＸ線結晶構造解析で対称性制約を利用できるため、高解像度でのタンパク質構造の決定が容易になる。別の例では、ＰＰ７のコートタンパク質又は天然循環置換ＰＰ７であるＡＰ２０５にリジッドに融合したＮｂから構成される抗原結合性キメラタンパク質からナノボディを提示するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製した。ＰＰ７は緑膿菌の二十面体バクテリオファージである。ＰＰ７に由来するＶＬＰはその合成を行うｍＲＮＡを封入しているため、抗原特異的Ｎｂの親和性選択された配列に必要な遺伝子型／表現型関係が成立する。従って、９０個のＮｂをその表面に高度に対称な配置で提示する堅牢なＶＬＰを設計するためにインビトロ進化技術を適用した（実施例１２～１５）。これらのナノボディを提示するＶＬＰはクライオＥＭにより小型のタンパク質の構造を解析するための優れたツールである。
免疫グロブリン等の抗原結合性ドメインは診断、イメージング又は他の生物物理学的用途で使用するためにフルオロフォア、色素、イオン又は金属で標識することができる足場にリジッドにグラフトすることもできる。実施例１０では、Ｘ線結晶構造解析で異常散乱による位相決定に使用される銅含有シングルドメインタンパク質であるアズリン（ＰＤＢ２ＴＳＡ）にＧＦＰ特異的ナノボディを融合した。更に、ＧＦＰ結合性ナノボディをアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）にもリジッドにグラフトした（実施例１６）。ＡＣＰは１工程の酵素反応で共有結合的フルオロフォアにより直交的に標識することができるタンパク質である。
３本のショートペプチドリンカーを介して免疫グロブリンドメインを同一のＩｇドメイン又は異なるＩｇドメイン（又は異なる治療用足場）とリジッドに融合し、夫々二価又は二重特異性の抗原結合性キメラタンパク質を作製することもできる（ナノ２ボディ、Ｎ２ｂ、実施例１７及び１８）。二価又は二重特異性の抗原結合性キメラタンパク質はＸ線結晶構造解析又はクライオＥＭでシャペロンとして使用できるだけでなく、生物物理学的用途、イメージング、診断及び治療に多くの用途がある。
βストランドＡは全てのＮｂに共通する高度に保存されたＮ末端配列に含まれる（Ｈａｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）ので、網羅的なインビボ成熟ナノボディレパートリーを（本願でメガボディ、ナノツール又はナノ２ボディと称するもの等の抗原結合性キメラタンパク質を含む）リジッドな抗原結合性キメラタンパク質ライブラリーとして簡便にクローニングし、バインダーについて標準方法によりスクリーニングすることができる。その後、ファージディスプレイ法，酵母ディスプレイ法又はウイルスディスプレイ法により機能的抗原結合性キメラタンパク質を選択する（実施例１９）。
ＨｏｐＱの接着ドメインをコードする遺伝子の循環置換変異体（ピロリ菌に由来するペリプラズムタンパク質；本願で「ｃＨｏｐＱ」と称する循環置換変異体）をＧＦＰ特異的ナノボディの（βストランドＣ及びＣ’を繋ぐ）第２の露出βターンに挿入したリジッドな抗原結合性キメラタンパク質も作製し（実施例２０）、更に、モノボディ等の合成免疫グロブリン様抗原結合性タンパク質から構成される抗原結合性キメラタンパク質も作製した（実施例２１）。
更に、設計・作製した抗原結合性キメラタンパク質のいくつかをＧＰＣＲ、イオンチャネル及び受容体型チロシンキナーゼ等の扱いにくい膜結合型複合体の構造解析に適用した（実施例２２）。
別の実施例では、ｃＨｏｐＱ足場タンパク質と結合するメガボディから誘導される抗原結合性キメラタンパク質又はメガボディを作製することにより、足場サイズを更に大きくするように抗原結合性キメラタンパク質の所定の組成物又は「ポリボディ」が形成されることを実証した（実施例２３）。
実施例２４はＮｂの第１のβストランドＡＢに挿入したドデシンタンパク質から多量体抗原結合性キメラタンパク質を作製できることを示す。最後に、分子量と対称性を高めた別のフォーマットの抗原結合性キメラタンパク質を作製するための足場タンパク質としてジスルフィド架橋ホモ二量体も試験した（実施例２５）。
［実施例１］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質の設計と作製。
メガボディ等のリジッドな抗原結合性キメラタンパク質を得る第１の概念実証として、図２に従ってナノボディを足場に連結する２本のペプチド結合を介してナノボディを大型の足場タンパク質にグラフトし、リジッドメガボディを作製した。
本実施例に記載する５８ｋＤａメガボディは、図２及び３に従って連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンドメインは配列番号１に示すようなＧＦＰ結合性ナノボディである。足場タンパク質はピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）Ｇ２７株のＨｏｐＱと称されるアドヘシンドメイン（ＰＤＢ：５ＬＰ２、配列番号１９）である（Ｊａｖａｈｅｒｉ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＨｏｐＱのＮ末端とＣ末端を連結し、ｃＨｏｐＱと称するＨｏｐＱの循環置換変異体を作製し、その配列中の任意の別の位置で配列の切断を行った。ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱコンストラクトを設計するために、全部分をペプチド結合によりアミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体ｃＨｏｐＱを作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＧ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ（ＵＳ９５１８０８４Ｂ２；配列番号２０９）の順で相互に連結した（配列番号２０）。
正しく折り畳まれた機能的タンパク質としてＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）を発現させることができることを実証するために、このタンパク質を酵母表面に提示させ（Ｂｏｄｅｒ，１９９７）、このメガボディを提示する酵母細胞とコグネイト抗原（ＧＦＰ）との特異的結合をフローサイトメトリーにより試験した。ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを酵母上に提示させるために、標準方法を使用して多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させたメガボディ（配列番号２２）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ、フレキシブルペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｃＭｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームを構築した。このオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、酵母株ＥＢＹ１００に導入した。
このプラスミドを導入したＥＢＹ１００酵母細胞を増殖させ、ガラクトースリッチ培地で一晩誘導し、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体の発現と分泌を誘起した。ＡＣＰの直交的染色のために、蛍光標識ＣｏＡアナログ（ｃｏＡ－６４７、２μＭ）と触媒量のＳＦＰシンターゼ（１μＭ）の存在下で細胞を１時間インキュベートした。増殖条件をグルコースリッチ培地からガラクトースリッチ培地に変えることにより酵母の表面へのＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの発現が誘導されることが確認された（図４）。表面提示レベルはフローサイトメトリーにより容易に定量的に分析することができる。これらの実験では、誘導させた酵母細胞を洗浄し、フローサイトメトリーに供し、メガボディを提示しないが、同様に直交的に染色した酵母細胞とＣｏＡ６４７蛍光レベルを比較することにより各細胞のＭｂ提示レベルを測定した。ＣｏＡ６４７蛍光シグナルレベルの高い識別可能な酵母細胞は、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを発現する培養液でしか検出されなかったことから、メガボディを酵母の表面に効率的に提示させ、直交的に染色することができると判断された（図４）。
提示されたメガボディの機能性を分析するために、コグネイト抗原（ＧＦＰ）とのその結合をフローサイトメトリーにより試験した。上記のように、ＥＢＹ１００酵母細胞を誘導し、ＣｏＡ６４７で直交的に蛍光染色し、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ－Ａｇａ２ｐ－ＡＣＰ融合体の提示をモニターした。これらの直交的に染色した酵母細胞を次に１００ｎＭ ＧＦＰの存在下で１時間インキュベートした（Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これらの細胞を洗浄後、ＧＦＰの結合量は酵母の表面へのＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの発現レベルに直線的に相関するはずであるが、提示されたＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱに検出可能な量のＧＦＰが結合していることが確認された。実際に、二次元フローサイトメトリー解析の結果、ＧＦＰ（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）はメガボディ提示レベルが有意である（ＣｏＡ６４７蛍光レベルが高い）酵母細胞としか結合しないことが確認された（図５）。一方、同様に染色されているが、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを発現しない野生型酵母細胞とＧＦＰは結合しない。これらの実験から結論すると、良好に折り畳まれた機能的な抗原結合性（ＧＦＰ結合性）キメラタンパク質としてＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを酵母表面に発現させることができる。
［実施例２］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質の発現、精製及び特性決定。
次に、この５８ｋＤａ ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを大腸菌のペリプラズムで発現させ、これを均一になるまで精製し、その性質を調べることにした。ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）等のメガボディを大腸菌のペリプラズムで発現させるために、標準方法を使用し、任意のナノボディの高度に保存されたβストランドＡとβストランドＢを繋ぐ第１のβターンにＨｏｐＱ（の循環置換変異体）を挿入した任意の所望のメガボディの発現を可能にするクローニングベクター（ｐＭＥＳＤ２と称する）を作製した。このベクターはｐＭＥＳ４（Ｐａｒｄｏｎ，２０１４）の誘導体であり、以下のポリペプチド、即ち大腸菌のペリプラズムへのメガボディの分泌を指示するＤｓｂＡリーダー配列、ナノボディの非常に高度に保存されたＦＲ１部分に相当するＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ、ｃＨｏｐＱと称するＨｏｐＱの循環置換変異体、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ、最後にアンバー終止コドンをコードするオープンリーディングフレームを含む。任意のナノボディのＣ末端部分（βストランドＢからβストランドＧまで）をＳａｐＩ断片としてこのベクターにクローニングすることができる。
ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを大腸菌のペリプラズムで発現させ、この組換えタンパク質を均一になるまで精製するために、βストランドＢ～Ｇに由来するＮｂＧＦＰ２０７をコードするＤＮＡ断片（配列番号１２１のヌクレオチド５２～３７８）を（配列番号１２２及び配列番号１２３のプライマーを使用して）ＰＣＲにより増幅し、大腸菌のペリプラズムでＰｌａｃプロモーターの転写制御下にＨｉｓタグとＥＰＥＡタグを付けたＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの発現を行うｐＭＥＳＤ２ベクターにＳａｐＩ断片としてクローニングした。
ＷＫ６細菌細胞（ＷＫ６はｓｕ-非抑制株である）をＴＢ培地６Ｌ中で３７℃にて増殖させ、細胞が対数増殖期に達したらＩＰＴＧにより誘導した。ＨｉｓタグとＥＰＥＡタグを付けたＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱのペリプラズム発現を２８℃で一晩続けた。細胞を遠心により回収し、浸透圧ショック法を使用して組換えＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱをペリプラズムから遊離させた（Ｐａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。次に遠心により組換えメガボディを細胞質から分離し、ＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ ５ｍＬプレパックカラムで清澄化上清から回収した。次に５００ｍＭイミダゾールをアプライすることによりＮｉＮＴＡ樹脂からタンパク質を溶出させ、カットオフ値３ｋＤａのＮＭＷＬフィルター（Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｌｉｍｉｔ）を使用して遠心により濃縮した。濃縮した試料を次にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ１６／９０サイズ排除カラムにアプライし、見かけの分子量が約６０ｋＤａの可溶性タンパク質として組換えメガボディ２４ｍｇを回収した。
次に精製組換えＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの機能的性質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。メガボディを４倍モル量のＧＦＰと共に３０分間４℃でインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ＰＧ１６／９０カラムにアプライした。精製ＧＦＰ単独を同一のサイズ排除カラムに別個にアプライした（図６）。２８０ｎｍ（任意のタンパク質による吸収）と４８８ｎｍ（ＧＦＰによる吸収）の紫外吸収を測定することにより種々のタンパク質の溶出をモニターした。図６に示す溶出スペクトルによると、メガボディと過剰のＧＦＰを含む混合物は２個の対称なピーク（青と赤の吸光度プロファイル）で溶出する。最初に溶出するピーク（最大分子量）は４８８ｎｍで吸収し、ＧＦＰを含んでいることを示す。２番目のピークは同一溶出体積のＧＦＰ単独（緑色の吸光度プロファイル）で溶出し、同じく４８８ｎｍで吸収する。対応する溶出画分のＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動によると、メガボディと過剰のＧＦＰを含む混合物の最初の溶出ピークはメガボディとＧＦＰを含んでおり、２番目のピークはＧＦＰのみを含んでいることが確認される。これらの全データを総合すると、精製組換えＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱはＧＦＰと複合体を形成し、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離しにくくなることが分かる。更に、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとＧＦＰの特異的結合のリアルタイムキネティック解析をバイオレイヤー干渉法により実施した。ストレプトアビジンをコートしたＯｃｔｅｔ（Ｒ）バイオセンサーを使用してビオチン化ＧＦＰを捕捉し、種々の濃度のＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとの関連性を調べた。図２４に示すデータから実証されるように、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを使用した場合のＧＦＰに対する親和性はＮｂＧＦＰ２０７単独を使用した場合の親和性と同様であった（図２４Ｂ）。
［実施例３］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質のＸ線結晶構造解析による構造決定。
実施例１及び２に記載したように、５８ｋＤａキメラＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを発現させ、精製することができたので、このメガボディを結晶化させ、その構造をＸ線結晶構造解析により解析することにした。
ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱを実施例２に記載したように複合体としてＳＥＣ（図６）により精製し、４８ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、静滴０．１μＬに母液０．１μＬを添加し、多数の市販のスパースマトリックス結晶化スクリーン（ＪＳＣＧ／Ｐｒｏｐｌｅｘ／ＰＥＧｉｏｎ／Ｗｉｚａｒｄ１２／Ｍｏｒｐｈｅｕｓ）に供した。ＪＳＣＧスクリーンＡ２条件（０．１Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ５．５、２０％ｗ／ｖ ＰＥＧ３０００）で得られた小さな結晶をシーディング最適化アプローチで使用した。ＪＳＣＧ Ａ２結晶からシーディングした０．２Ｍクエン酸アンモニウム、１７％ＰＥＧ３３５０、１０％グリセロール、４８ｍｇ／ｍＬ Ｍｂ２０７中で良好に回折する結晶が得られた。Ｄｉａｍｏｎｄ（英国）のＩ３線源でデータを取得し、構造を２．６Åの解像度まで精密化した（表１）。
メガボディはＰ１で結晶化し、非対称単位当たりの分子数は１０であった。非対称単位中の異なる分子間のＲＭＳＤは０．３～２．７Åであることから、ナノボディはナノボディを足場に連結する２本のペプチド結合を介して足場にリジッドに連結されていると判断される（図７）。
［実施例４］タンパク質複合体を安定化させるナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質の発現と精製。
第２の抗原結合性キメラタンパク質の例として、β２アドレナリン受容体－Ｇｓタンパク質複合体のＧβサブユニットとＧαサブユニットの界面に結合するＮｂ３５のβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質を発現させ、精製することにした（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ａ）。
ＭｂＮｂ３５ ｃＨｏｐＱと称する５８ｋＤａメガボディは図２及び３に従って連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンドメインはβ２アドレナリン受容体－Ｇｓタンパク質複合体のＧβサブユニットとＧαサブユニットの界面に結合するナノボディであり（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ａ）、ＣＤＲ１が主にＧβと相互作用し、長いＣＤＲ３ループが配列番号２４に示すようなＧβサブユニット及びＧαサブユニットの両方と相互作用する。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、ナノボディのストランドＢ～Ｇ（配列番号２４の残基１６～１２８）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号２５）。
ＭｂＮｂ３５ ｃＨｏｐＱを大腸菌のペリプラズムで発現させ、この組換えタンパク質を均一になるまで精製するために、βストランドＢ～Ｇに由来するＮｂ３５をコードするＤＮＡ断片を（配列番号１２２及び配列番号１２３のプライマーを使用して）ＰＣＲにより増幅し、大腸菌のペリプラズムでＰＬａｃプロモーターの転写制御下にＨｉｓタグとＥＰＥＡタグを付けたｃＨｏｐＱＮｂ３５メガボディ（配列番号２５）の発現を行うｐＭＥＳＤ２ベクターにＳａｐＩ断片としてクローニングした。
ＭｂＮｂ３５ ｃＨｏｐＱも実施例２に記載したように大腸菌のペリプラズムで発現させ、均一になるまで精製した。更に、精製したｃＨｏｐＱＮｂ３５はβ２アドレナリン受容体－Ｇｓタンパク質複合体のＧβサブユニットとＧαサブユニットの界面に選択的に結合する。
［実施例５］ＧＰＣＲ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質の発現と精製。
別の例として、ヒトβ２アドレナリン受容体と結合し、Ｇタンパク質様挙動を示すＮｂ８０のβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱを挿入した別の５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質を発現させ、精製することにした（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ｂ）。このようなナノボディの代替例は例えばＷＯ２０１２／００７５９３（表１、２参照）、ＷＯ２０１２／１７５６４３（表２、３参照）、ＷＯ２０１４／１２２１８３（表１及び２参照）及びＷＯ２０１５／１１０４４９（表２及び３参照）に記載されている。従って、本発明はこれらの引用特許出願に記載されている（前記表に記載されている）前記Ｎｂの配列に基づいて本願に記載するように設計・作製された全ての抗原結合性キメラタンパク質も含む。あるいは、記載するような目的とするＧＰＣＲ複合体タンパク質の特異的安定化を得るには前記ＮｂのＣＤＲで十分であるため、本発明は本願に記載するように設計・作製された抗原結合性キメラタンパク質であって、前記ＧＰＣＲ複合体と結合する抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインのＣＤＲが、前記ＧＰＣＲ複合体に特異的なＮｂに由来するＣＤＲをベースとするものも含む。
ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱと称する５８ｋＤａメガボディは、図２及び３に従って連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンドメインはβ２アドレナリン受容体の細胞質側に結合するナノボディであるＮｂ８０（配列番号２６）である。そのＣＤＲ３の８アミノ酸配列は前記受容体のＴＭセグメント３、５、６及び７に由来するアミノ酸により形成される疎水性ポケットに侵入する。そのＣＤＲ１の４アミノ酸配列はＴＭセグメント５及び６の細胞質末端との付加的な安定化相互作用を提供する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ｂ）。そのＣＤＲ３はβ２ＡＲ－Ｇｓタンパク質複合体におけるＧｓのカルボキシル末端ペプチドと同様の位置を占める（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ａ）。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、Ｎｂ８０のβストランドＢ～Ｇ（配列番号２７の残基１６～１２０）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号２７）。
ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱを大腸菌のペリプラズムで発現させ、この組換えタンパク質を均一になるまで精製するために、βストランドＢ～Ｇに由来するＮｂ８０をコードするＤＮＡ断片を（配列番号１２２及び配列番号１２３のプライマーを使用して）ＰＣＲにより増幅し、実施例４に記載したようにｐＭＥＳＤ２ベクターにＳａｐＩ断片としてクローニングした。このプラスミドは大腸菌のペリプラズムでＰｌａｃプロモーターの転写制御下にＨｉｓタグとＥＰＥＡタグを付けたＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱ（配列番号２７）の発現を行う。
上記実施例のメガボディと同様に、ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱも実施例２に記載したように大腸菌のペリプラズムで発現させ、均一になるまで精製することができる。更に、精製したＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱはβ２ＡＲの活性状態コンフォメーションと選択的に結合してこれを安定化させる。ＷＯ２０１２／００７５９３に記載の実施例と同様に、Ｎｂ８０又はＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ野生型（ｗｔ）受容体の薬理学的性質をβ２ＡＲ－ｗｔ単独の性質及び無関係のメガボディＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔの性質と比較した（図５３）。Ｎｂ８０はアゴニストを結合させたβ２ＡＲと選択的に結合し、Ｇタンパク質様挙動を示し、従って、アゴニスト・β２ＡＲ・Ｎｂ８０複合体において受容体の活性状態コンフォメーションを安定化させるナノボディである（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ヒトβ２アドレナリン受容体と結合し、Ｇタンパク質様挙動を示すＮｂ８０の性質（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ｂ）がＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱで維持されるか否かを放射性リガンドアッセイにより検討した。ＧＦＰと特異的に結合し、β２ＡＲに対する親和性をもたないナノボディであるＮｂＧＦＰ２０７もＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱと共にネガティブコントロールとして使用したが、β２ＡＲに対する親和性を示さなかった（図５３）。
β２ＡＲに対するＮｂ８０又はＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの薬理作用を比較できるように、以下のように放射性リガンドアッセイを実施した。β２ＡＲ野生型（ｗｔ）受容体を発現させるために、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ（Ｒ）バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３５９－０１６）を製造業者の指示に従って使用してｐＦａｓｔＢａｃ１－β２ＡＲｗｔコンストラクト１μｇをＤＨ１０Ｂａｃ（ＴＭ）細胞に形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン７μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、Ｘ－ｇａｌ １００μｇ／ｍｌ及びＩＰＴＧ ４０μｇ／ｍｌを添加した新鮮なＬＢ寒天プレートに播種した。白色コロニーを釣菌し、バクミドを精製し、オープンリーディングフレームの配列をシーケンシングにより確認した。６ウェルプレートフォーマットでトランスフェクション試薬としてセルフェクチン８μｌと共にバクミドＤＮＡ２μｇをＳｆ９細胞にトランスフェクションすることにより組換えバキュロウイルスを作製した。細胞を２７℃でインキュベートし、３日後にＰ１ウイルスを採取した。次にウイルスを連続継代により増幅し、Ｐ３ウイルスを採取した。２～３×１０６個／ｍｌの濃度のＳｆ９細胞にバキュロウイルスを０．５のＭ．Ｏ．Ｉ．で感染させ、細胞に受容体を２７℃で７２時間発現させた。受容体のＮ末端細胞外部分のＦＬＡＧペプチド配列を認識するマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を一次抗体（１：１００）として使用し、抗マウスＤｙＬｉｇｈｔ４０５を二次抗体（１：１００）として使用し、フローサイトメトリーにより受容体の発現と細胞表面局在を評価した。細胞を１０００×ｇで３０分間遠心し、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠、Ｒｏｃｈｅ）を添加したＴＭＥ結合バッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４，１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に得られたペレットを再懸濁することによりこれらの細胞から膜を調製した。Ｕｌｔｒａ ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを最高速度で使用して１０秒のバースト６回で細胞を溶解させた。膜を含む溶解液を次に４℃にて４０，０００×ｇで４０分間遠心し、上清を捨て、１０％サッカロースを添加したＴＭＥ結合バッファーに膜ペレットを再懸濁した。膜をその後の使用時まで－８０℃で保存した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して総膜タンパク質含量を推算した。その後の分析に備えて総膜タンパク質濃度に従ってデータを正規化するために、全試料を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈した。放射性リガンド競合結合アッセイのために、２ｎＭ［３Ｈ］－ジヒドロアルプレノロールの存在下で５μＭ Ｎｂ８０、ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱ、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの存在下又はナノボディの不在下にエピネフリン（天然アゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｅ４２５０）又は（－）－イソプロテレノール塩酸塩（完全アゴニスト、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ６５０４）のいずれかの濃度を１０－１１Ｍ～１０－４Ｍの範囲で増加させながらβ２ＡＲ－ｗｔを発現する膜１０μｇをインキュベートした。１０μＭアルプレノロールの存在下で非特異的結合を測定した。試料を振盪プラットフォームで室温にて２時間インキュベートし、９６ウェルＦｉｌｔｅｒＭａｔｅハーベスター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｃユニフィルター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００５１７４）で濾過することにより、受容体と結合した放射性リガンドを遊離の放射性リガンドから分離した。濾過後、フィルタープレートに保持された膜を氷冷洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４）で洗浄し、フィルターを１時間５０℃で乾燥した。シンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（ＴＭ）－Ｏ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）３５μｌを添加後、フィルターに保持された放射能（ｃｐｍ）をＷａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンターで測定した。データは２回ずつ実施した各実験の平均±ｓ．ｅ．を表す。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して非線形回帰分析によりＩＣ５０値を求めた。
図５３に示すように、ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔの薬理学的性質はＮｂ８０の存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔの薬理学的性質と非常によく似ており、β２ＡＲ－ｗｔ単独又はＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔとは著しく異なることが分かった。β２ＡＲ－ｗｔ単独と比較すると、Ｇタンパク質様挙動（Ｎｂ８０参照）を示すＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔ受容体はアゴニスト（エピネフリン、イソプロテレノール）に対する親和性の増加を示し、ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下の受容体は活性状態コンフォメーションをとることが分かる（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１１ｂ）。対照β２ＡＲ－ｗｔと比較したＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔの天然アゴニストエピネフリンに対する親和性の増加は、β２ＡＲ－ｗｔ単独に対するエピネフリンのＩＣ５０をＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔに対するエピネフリンのＩＣ５０ｈｉｇｈで割り、見かけの力価シフトが
となるようにすることにより、図５３（Ａ）に示す競合結合実験からのＩＣ５０値の比から計算することができる。合成アゴニストであるイソプロテレノールに対するＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔの親和性の増加は、β２ＡＲ－ｗｔに対するイソプロテレノールのＩＣ５０をＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱの存在下におけるβ２ＡＲ－ｗｔに対するイソプロテレノールのＩＣ５０ｈｉｇｈで割り、見かけの力価シフトが
となるようにすることにより、図５３（Ｂ）に示す競合結合実験からのＩＣ５０値の比から計算することができる。この結果、Ｎｂ８０の機能性はＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱフォーマットで維持されることが実証され、更に、β２ＡＲ標的に対するその抗原結合親和性が維持されるため、実際に、このフォーマットはβ２ＡＲ活性状態コンフォメーションを安定化させ、Ｎｂ８０と同様に、コンフォメーション選択的な抗原結合を提供することが実証された。
［実施例６］イオンチャネル結合性ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質の発現と精製。
別の例として、五量体リガンド依存性イオンチャネルＧＡＢＡＡ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１７）と結合するＮｂ２５のβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱを挿入した別の５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質を発現させ、精製することにした。
ＭｂＮｂ２５ ｃＨｏｐＱと称する５８ｋＤａメガボディは図２及び３に従って連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンドメインはＧＡＢＡＡβ３サブユニット（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１７）の細胞外ドメインと結合するナノボディであるＮｂ２５（配列番号２８）である。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、Ｎｂ２５のβストランドＢ～Ｇ（配列番号２８の残基１６～１２５）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号２９）。
ＭｂＮｂ２５ ｃＨｏｐＱを大腸菌のペリプラズムで発現させ、この組換えタンパク質を均一になるまで精製するために、βストランドＢ～Ｇに由来するＮｂ２５をコードするＤＮＡ断片を（配列番号１２２及び配列番号１２３のプライマーを使用して）ＰＣＲにより増幅し、実施例４に記載したようにｐＭＥＳＤ２ベクターにＳａｐＩ断片としてクローニングした。このプラスミドは大腸菌のペリプラズムでＰｌａｃプロモーターの転写制御下にＨｉｓタグとＥＰＥＡタグを付けたＭｂＮｂ２５ ｃＨｏｐＱ（配列番号２９）の発現を行う。
上記実施例のメガボディと同様に、ＭｂＮｂ２５ ｃＨｏｐＱも実施例２に記載したように大腸菌のペリプラズムで発現させ、均一になるまで精製することができる。更に、精製したＭｂＮｂ２５ ｃＨｏｐＱはＧＡＢＡＡβ３サブユニットの細胞外ドメインと結合する。
［実施例７］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃ７ＨｏｐＱを挿入した他の５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
折り畳み能だけでなく、メガボディの安定性と剛性も免疫グロブリンを足場に連結するポリペプチド結合の組成と長さに依存する可能性があるため、特定のメガボディフォーマットを必要に応じて微調整するためにインビトロ進化技術を導入した。実施例１に記載したメガボディから出発し、図２に従って可変長で混合アミノ酸組成の２本のショートペプチドがナノボディを足場に連結する同様の設計のメガボディをコードし、インビトロ選択に利用可能なライブラリーを構築した。
本実施例に記載する５８ｋＤａメガボディは、図２に従って短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１５～１８６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１１～１２６）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号３０～３３）。
実施例１、２及び３に記載したメガボディの機能的変異体であって、ナノボディを足場に連結するリンカーの組成と長さが異なるものを酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、図８に従って多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のメガボディ（配列番号３４～３７）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１５～１８６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１１～１２６）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、実施例１、２及び３に記載したメガボディの１８４，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した（図８参照）。
インビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、抗原ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合性ナノボディを提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
１ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結する代表数のペプチドリンカーの配列を決定した。各リンカータイプ１－１、１－２、２－１及び２－２アミノ酸ショートリンカー変異体の４個の代表的なクローン（表２）はＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ ＧＦＰと結合することが確認された（図３０）。この結果から実証されるように、抗原結合性ドメインと足場タンパク質の種々の短いペプチド連結を、メガボディライブラリーからインビトロ選択により選択することができ、機能的抗原結合性キメラタンパク質として提示させることができる。メガボディの機能的変異体を酵母の表面に提示させることができた（上記）ので、１－１アミノ酸ショートリンカーの４個の代表的なメガボディクローン（表２のＭＰ１３３１＿Ａ５、ＭＰ１３３１＿Ａ１２、ＭＰ１３３１＿Ｂ７及びＭＰ１３３１＿Ｇ１０）を大腸菌のペリプラズムで発現させ、これらのキメラを均一になるまで精製し、その性質を調べることにした。メガボディＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱの４種の変異体（ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＡ５、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＡ１２、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＢ７、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＧ１０）と野生型に短い循環置換（ｃ７；実施例２３参照）を加えたもの（ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ）を本質的に実施例２に記載したように作製した。ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ（配列番号１３６）は抗ＧＦＰ－ナノボディの保存されたＮ末端のβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１８～１８６）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグから作製した。
４種のＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ変異体（配列番号１３７～１４０）は抗ＧＦＰ－ナノボディの保存されたＮ末端のβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、１アミノ酸リンカー（表２）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１８～１８５）、１アミノ酸リンカー（表２）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから作製した。
これらのメガボディ（配列番号１３６～１４０）を実施例２に記載したように大腸菌で発現させ、精製した。濃縮した試料を次にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ１０／３００サイズ排除カラムにアプライし、見かけの分子量が約６０ｋＤａの均一な可溶性タンパク質試料として溶出させた（図３１）。精製した組換えメガボディ（配列番号１３６～１４０）の機能的性質を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析した。精製したＧＦＰをマキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）中０．１μｇ／ウェルの濃度で固定化した。ウェル内の残りのタンパク質結合部位を室温にて２時間ミルクＰＢＳ溶液でブロックした。精製したメガボディ試料を、ＧＦＰをコートしたウェルとコートなしのウェルでインキュベートした。洗浄工程後、メガボディのみに存在するＥＰＥＡタグを特異的に認識するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔビオチン化抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することによりメガボディとＧＦＰの結合を試験した。次いでストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔビオチン化抗体の検出を行った。酵素基質リン酸ｐ－ニトロフェニルを加えた後に４０５ｎｍの吸収を測定した。ＧＦＰを固定化した場合をＧＦＰなしの条件と比較すると、検出されたシグナルは少なくとも１０倍の各メガボディのシグナルを示す。ＥＬＩＳＡ及びＳＥＣデータによると、精製組換えメガボディ（配列番号１３６～１４０）は均一になるまで精製することができ、ＧＦＰと複合体を形成できると判断される（図３１及び３２）。
［実施例８］ＧＦＰ特異的ナノボディの（βストランドＡ及びＢを繋ぐ）第１の露出βターンにｃＹｇｊＫを挿入した１００ｋＤａ抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
代替例として、より大型の足場に連結したナノボディからメガボディを設計した。図２及び９に従って２本のショートペプチドがナノボディを別の足場に連結するメガボディ変異体をコードするライブラリーをインビトロ選択用に構築した。
設計した１００ｋＤａメガボディは、図２に従ってショートポリペプチドリンカーにより連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。使用した代替足場タンパク質は大腸菌の８６ｋＤＡペリプラズムタンパク質であるＹｇｊＫ（ＰＤＢ３Ｗ７Ｓ、配列番号３８）とした。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３８の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号４３）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３８の残基１～４６１）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）の順で相互に連結した（配列番号３９～４２）。
ナノボディを足場に連結するリンカーの組成と長さが異なるＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＱランダムリンカーの機能的変異体（配列番号３９～４２）を酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のメガボディ（配列番号４４～４７）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３８の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号４３）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３８の残基１～４６１）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＱランダムリンカー（配列番号３９～４２）の１８４，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
インビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、抗原ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合性ナノボディを提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
２ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結する代表数のペプチドリンカーの配列を決定した。各リンカータイプ（長さ）１－１、１－２、２－１及び２－２アミノ酸ショートリンカー変異体の１又は２個の代表的なクローン（表３）はＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ ＧＦＰと結合することが確認された（図３３）。この結果から実証されるように、抗原結合性ドメインと足場タンパク質の種々の短いペプチド連結を、メガボディライブラリーからインビトロ選択により選択することができ、機能的抗原結合性キメラタンパク質として提示させることができる。ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＱの機能的変異体を酵母の表面に提示させることができた（上記）ので、各アミノ酸ショートリンカーの代表的なメガボディクローン（表３のＭＰ１３３３＿Ｅ２、ＭＰ１３３３＿Ａ２、ＭＰ１３３３＿Ｃ４及びＭＰ１３３３＿Ｆ５）を１個ずつ大腸菌のペリプラズムで発現させることにした。酵母ディスプレイ法により選択したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＱの４種の変異体を以下のアミノ酸をもつキメラポリペプチドとして作製した。ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１４１）は、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、Ｔｙｒ１アミノ酸リンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３８の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号４３）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３８の残基１～４６１）、Ａｓｐ１アミノ酸リンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから作製した。
リンカーを変え、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＡ２（配列番号１４２）ではＧｌｕ１アミノ酸リンカー、Ｇｌｙ－Ａｓｐ２アミノ酸リンカーとし、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＣ４（配列番号１４３）ではＭｅｔ－Ｔｙｒ２アミノ酸リンカー、Ａｓｎ１アミノ酸リンカーとし、ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＦ５（配列番号１４４）ではＴｒｐ－Ｔｈｒ２アミノ酸リンカー、Ｇｌｙ－Ａｌａ２アミノ酸リンカーとした以外は、他のメガボディについても同様のコンストラクトを得た。
改変型ｐＭＥＳＤ２ベクターを利用してＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体（配列番号１４１～１４４）を実施例２に記載したように大腸菌で発現させた。この新規ベクター（ｐＭＥＳＰ３と称する）は以下のポリペプチド、即ち、大腸菌のペリプラズムへのメガボディの分泌を指示するｐｅｌＢリーダー配列、ＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ、ＹｇｊＫの循環置換変異体、任意のナノボディのＣ末端部分（βストランドＢからβストランドＧまで）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ、最後にアンバー終止コドンをコードするオープンリーディングフレームを含む。
４種のＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体の各々のペリプラズム抽出液を使用し、発現されたメガボディの機能的性質を実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡにより分析した。ＧＦＰを固定化した試料としない試料で検出されたシグナルを比較すると（図３４）、機能的ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋ変異体（配列番号１４１～１４４）のペリプラズム発現が明白に確認された。
実施例２に記載したようにＩＭＡＣ後にＳＥＣを使用し、１－１アミノ酸ショートリンカー変異体に相当するＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１４１）を均一になるまで更に精製した（図３５）。精製したＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１４１）のＧＦＰとの結合キネティクスをＯｃｔｅｔ（Ｒ）により測定し、ＮｂＧＦＰ２０７ナノボディ（配列番号１）及びＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）と比較した（図２４）。結合親和性を計算した処、循環置換ＨｏｐＱ又はＹｇｊＫ足場タンパク質から作製した抗原結合性キメラタンパク質は元のシングルドメイン免疫グロブリンの結合特性を損なわないことが確認された。
［実施例９］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃ／ｃ７ＨｏｐＱを挿入し、足場をナノボディに連結する付加的なジスルフィドにより更に剛性化した５８ｋＤａ抗原結合性キメラタンパク質の設計と作製。
図１０に従って抗原結合性ドメイン（ここでは免疫グロブリンドメイン）を足場に連結する付加的なジスルフィド結合を構築することにより、よりリジッドな抗原結合性キメラタンパク質を更に開発した。具体的には、部位特異的突然変異誘発法を使用し、図２及び１０に従って２本のショートペプチドとジスルフィド結合がナノボディを足場に連結するＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの突然変異体を作製した。
本実施例に記載する５８ｋＤａメガボディは、図２及び１０に従って短いポリペプチド結合とジスルフィド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。足場タンパク質はピロリ菌Ｇ２７株のＨｏｐＱと称されるアドヘシンドメイン（ＰＤＢ：５ＬＰ２、配列番号１９）である。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体（ｃＨｏｐＱ）を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、残基１個をシステインで置き換えたＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、残基１個をシステインで置き換えたナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号４８～５０）。抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、残基１個をシステインで置き換えたＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体（ｃＨｏｐＱ）を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、残基１個をシステインで置き換えたナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから配列番号５１を作製した。
より短いｃ７ＨｏｐＱ循環置換体（ｃ７ＨｏｐＱについては、実施例２３参照）を足場タンパク質として利用して他のコンストラクトを設計した。抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１１）、残基１個をシステインで置き換えたＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１８～１８６）、残基１個をシステインで置き換えたナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグから配列番号１４６～１５０を作製した。抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、残基１個をシステインで置き換えたＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１の残基１９２～４１１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１８～１８６）、残基１個をシステインで置き換えたナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡから配列番号１４５を作製した。
合計１０種のメガボディ変異体（ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣｙｓ１～４（配列番号４８～５１）及びＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣｙｓ５～１０（配列番号１４５～１５０））を実施例２に記載したように大腸菌から発現させ、精製した。これらの精製した組換えメガボディの機能性を実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡにより分析した。ＧＦＰを固定化した試料としない試料で検出されたシグナルを比較すると（図３６）、大腸菌のペリプラズムから精製したＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣｙｓ１～４（配列番号４８～５１）及びＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣｙｓ５～１０（配列番号１４５～１５０）の機能性が明白に確認された。
導入した付加的なジスルフィドがこれらの人工メガボディ変異体の熱安定性に及ぼす効果を測定するために、サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）を実施し、従来記載されているように各メガボディ変異体の融点（Ｔｍ）を計算した（Ｈｕｎｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。具体的には、ゲル濾過精製した各メガボディ変異体０．２ｍｇ／ｍＬを１４０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．３緩衝液中でＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｓｉｇｍａ）と混合した。次に、２０μＬ試料の蛍光を２５～１００℃の温度範囲にてＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６マシンでリアルタイムＰＣＲにより３回測定した。ボルツマン方程式を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより個々のＴｍ値を計算した（表４）。融点は野生型メガボディと比較して夫々ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣ１５－Ｃ５３４（配列番号５１）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ１４－Ｃ５１２（配列番号１４５）、ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ３１６－Ｃ４７２（配列番号１４７）及びＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ３１４－Ｃ４７２（配列番号１４８）で１０．９℃、３．４３℃、４．２９℃及び６．１４℃上昇しており、これらのジスルフィド結合が形成されてメガボディを剛性化していると判断される。
［実施例１０］アズリンにＧＦＰ特異的ナノボディをグラフトした抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
リジッドな抗原結合性キメラタンパク質の別の作製方法は代替連結スキームにより免疫グロブリンをその足場に連結する方法である。具体的には、図１１に示すようにナノボディを足場に連結する３本のポリペプチド結合を介してナノボディを足場タンパク質にグラフトしたメガボディをコードし、インビトロ選択に利用可能なライブラリーを構築した。
本実施例に記載するリジッドな抗原結合性キメラタンパク質は、図１１に従って３本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。使用した足場タンパク質は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の小型の銅含有シングルドメインタンパク質であるアズリンとした（ＰＤＢ２ＴＳＡ、配列番号５２、緑膿菌タンパク質と比較してＭ１２１Ａ突然変異を含む）。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、アズリンのＮ末端部分（配列番号５２の残基３～２２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、アズリンのＣ末端部分（配列番号５２の残基３１～１２８）、６×Ｈｉｓ及びＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号５３～６０）。
３本のショートペプチドがナノボディを足場に連結するこれらの金属結合性メガボディの機能的代表例（配列番号５３～６０）を酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のメガボディ（配列番号６１～６８）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、アズリンのＮ末端部分（配列番号５２の残基３～２２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、アズリンのＣ末端部分（配列番号５２の残基３１～１２８）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、図１２に従って３本のショートペプチドがナノボディをアズリンに連結するメガボディの７７，２８０，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
酵母ディスプレイ法とＦＡＣＳによるインビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をＣｕ＋＋の存在下にガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、抗原ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合性ナノボディを提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
２ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結する代表数のペプチドリンカーの配列を決定した。リンカータイプ１－２－１、２－２－１、１－２－２及び２－２－２アミノ酸ショートリンカー変異体の２個の代表的なクローン（表５）はＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ ＧＦＰと結合することが確認された（図３７）。この結果から実証されるように、３本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたメガボディを、メガボディライブラリーからインビトロ選択により選択することができ、機能的抗原結合性キメラタンパク質として提示させることができる。
ＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎの機能的変異体を酵母表面に提示させることができた（上記）ので、これらの抗原結合性キメラタンパク質を大腸菌のペリプラズムで発現させることにした。酵母ディスプレイ法により選択した８種のＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（表５）を以下のアミノ酸配列、即ち、ＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（配列番号１５１～１５８）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、アミノ酸リンカー（表５）、アズリンのＮ末端部分（配列番号５２の残基３～２２）、アミノ酸リンカー（表５）、抗ＧＦＰナノボディのストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、アミノ酸リンカー（表５）、アズリンのＣ末端部分（配列番号５２の残基３１～１２８）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグを含むキメラポリペプチドとして作製した。
ＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（配列番号１５１～１５８）等のメガボディを大腸菌のペリプラズムで発現させるために、実施例２に記載したｐＭＥＳＤ２ベクターを改変した。この新規ベクター（ｐＭＥＳＰ５と称する）は以下のポリペプチド、即ち、大腸菌のペリプラズムへのメガボディの分泌を指示するｐｅｌＢリーダー配列、ＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ、アズリンのＮ末端部分、任意のナノボディのＣ末端部分（βストランドＢからβストランドＧまで）、アズリンのＣ末端部分、６×Ｈｉｓタグ及びＥＰＥＡタグ、最後にアンバー終止コドンをコードするオープンリーディングフレームを含む。８種のＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（配列番号１５１～１５８）を実施例２に記載したように大腸菌のペリプラズムで発現させた。８種のＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体の各々のペリプラズム抽出液を使用し、発現させたメガボディの機能的性質を実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡにより分析した。ＧＦＰを固定化した試料としない試料に検出されたシグナルを比較すると（図３８）、機能的ＭｂＮｂ２０７ Ａｚｕｒｉｎ変異体（配列番号１５１～１５８）のペリプラズム発現が明白に確認された。この結果から実証されるように、３本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたメガボディを、大腸菌のペリプラズムで機能的に発現させることができる。
［実施例１１］ＧＦＰ特異的ナノボディの第１の露出βターンに反転型糖質加水分解酵素の循環置換変異体を挿入した抗原結合性キメラタンパク質をインビトロ選択により設計・作製し、インビトロ選択により構造対称性をもつホモ二量体メガボディとしたものの設計と作製。
構造対称性をもつ多量体足場タンパク質のサブユニットにＮｂをグラフトすることにより、更に多量体メガボディを設計した。図１１に従ってナノボディを足場に連結する３本の短いポリペプチド結合を介して大型のホモ二量体足場タンパク質の各サブユニットにナノボディをグラフトしたメガボディをコードするライブラリーを構築し、２回回転対称性をもつリジッドなホモ二量体メガボディを酵母ディスプレイ法とＦＡＣＳにより同定した。
本実施例に記載するホモ二量体メガボディ（二量体当たり１９１ｋＤａ）は、図１１に従って３本のショートポリペプチドリンカーにより連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示す抗ＧＦＰナノボディである。使用した足場タンパク質はバクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）のホモ二量体グルカン１，４－α－グルコシターゼであるＳｕｓＢ（ＰＤＢ３ＷＦＡ、配列番号６９）とした。全部分を図１３に従ってアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１４）、セリン、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＳｕｓＢのＮ末端部分（配列番号６９の残基１～６８）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１５～１２５）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＳｕｓＢのＣ末端部分（配列番号６９の残基７６～７１８）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号７０～７７）。
３本のショートペプチドがナノボディをホモ二量体足場の各サブユニットに連結するこれらのホモ二量体メガボディの機能的代表例（配列番号７０～７７）を酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のメガボディ（配列番号７８～８５）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１４）、セリン、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＳｕｓＢのＮ末端部分（配列番号６９の残基１～６８）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１５～１２５）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＳｕｓＢのＣ末端部分（配列番号６９の残基７６～７３８）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、図１１に従って３本のショートペプチドがナノボディをホモ二量体足場の各サブユニットに連結するメガボディの７７，２８０，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
酵母ディスプレイ法とＦＡＣＳによるインビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をＣａ＋＋の存在下にガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合を提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
複数ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、高レベルで提示されると共に抗原と結合する複数のメガボディ変異体においてナノボディをＳｕｓＢに連結するリンカーの長さと組成を分析した処、これらは良好に発現し、細胞から分泌させることができ、機能的なＧＦＰ結合性キメラタンパク質として折り畳むことができると判断された。
これらのホモ二量体メガボディの１個を大腸菌のペリプラズムで発現させ、均一になるまで精製した。精製したタンパク質を結晶化させ、その構造をＧＦＰとの複合体で解析した。
［実施例１２］ＧＦＰ特異的ナノボディの第１の露出βターンにＰＰ７のウイルスコートタンパク質の循環置換変異体を挿入したナノボディ提示型二十面体ウイルス様粒子のインビトロ選択による設計と作製。
クライオＥＭによる三次元構造決定は、入射電子ビームに対して種々に配向した個々の粒子の複数コピーの二次元投影画像に存在する情報の平均化により行われる。二十面体ウイルスの場合、各ビリオンを粒子とみなすことができるが、これらの構造の対称性は非対称単位の多数の同一コピーが各粒子に含まれるような配置であるため、構造を決定するために平均化される単位の有効数は多数倍に増加する。従って、コートタンパク質により付与される対称性に従ってナノボディをリジッドに配列させる二十面体ウイルスは、小型のタンパク質とその複合体の構造をクライオＥＭにより解析するための究極のツールとなるであろう。
本実施例では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合する二十面体バクテリオファージのコートタンパク質にＮｂをグラフトすることにより、ナノボディを提示する二十面体ウイルス様粒子を設計した。大腸菌で過剰発現させると、緑膿菌の二十面体バクテリオファージのＰＰ７のコートタンパク質のコンカテマー化二量体９０コピー又は１８０個のコートタンパク質が自己集合して二十面体ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成できることが分かっている（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらのＶＬＰにおいて、コートタンパク質は一方の単量体のＮ末端が他方の単量体のＣ末端に非常に近接するように対になって絡み合っている。この二量体の露出ループにペプチドを挿入して対応するＶＬＰの表面にこのペプチドを提示できることも実証されている。そこで、ＰＰ７コートタンパク質のコンカテマー化二量体にグラフトしたナノボディから構成され、図２に従って２本のショートペプチドがナノボディを足場に連結するリジッドな抗体キメラをコードするランダムライブラリーを構築した。本実施例に記載する３．９ＭＤａ二十面体ウイルス様粒子は、図１４に従って直接連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分から構成されるキメラポリペプチドから自己集合する。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。使用した足場タンパク質はＰＰ７のコートタンパク質（ＰＤＢ：１ＤＷＮ、配列番号２）の共有結合二量体の循環置換体である。ＰＰ７は緑膿菌の二十面体ＲＮＡバクテリオファージである。全部分をアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、開始コドンにコードされるメチオニン、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１３）、ＰＰ７コートタンパク質（配列番号２の残基１２～１２８）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、グリシン、ＰＰ７コートタンパク質（配列番号２の残基２～１２８）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、グリシン、ＰＰ７コートタンパク質（配列番号２の残基２～８）、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号３～６）。このリジッドな抗原結合性キメラタンパク質は自己集合し、前記ナノボディ９０コピーをその表面に提示する二十面体ＶＬＰ（ナノＶＬＰ）となる（図１４）。
ナノＶＬＰに自己集合するこれらの人工ＧＦＰ結合性コートタンパク質の機能的代表例を選択するために、標準方法を使用し、メチオニン、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、循環置換二量体ＰＰ７コートタンパク質、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号３～６）のライブラリーを構築した。これらのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ－ＥｃｏＲＩ断片としてｐＭＥＳＰベクター（ＧｅｎＢａｎｋ ＧＱ９０７２４８であるｐＭＥＳ４からＬｇｕＩ部位を除去した誘導体であるｒｅｆ ＣＡ１２７２９）にクローニングし、ｐｅｌＢシグナルペプチド、いずれかのＮｂ配列、及び遺伝子３を含む全ての検出タグを置き換えた。この新規に創製したライブラリーをｐｃＰＰ７２ＮｂＧＦＰ２０７Ｌと称した。
組換え発現させることができ、インビトロで集合させて二十面体ウイルス様粒子を形成することができる組換えＧＦＰ結合性ＰＰ７コートタンパク質を選択するために、キメラ二量体のライブラリーをプラスミドレベルで構築する。これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換する。ナノＶＬＰに集合することができるキメラ二量体を大腸菌で発現させ、クロマトグラフィー選択に供した。ＩＭＡＣ精製をライブラリーで実施し、キメラ二量体を発現してＶＬＰに集合することができるこれらのクローンを選択した。各集合適格性ＶＬＰはナノボディ－コートタンパク質をコードする核酸をそのシェル内に封入していたので、これらのナノＶＬＰに由来するＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによりクローンを増幅した。抗原結合性キメラタンパク質を発現する数個のクローンをシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、最初のＰＰ７コートタンパク質を次のＰＰ７に連結するペプチドリンカーの配列を決定すると共に、循環置換ペプチドリンカーの配列を決定した。全長コンストラクトを含む個々のクローンを実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡに供し、ＧＦＰと結合するクローンを同定した（図３９）。この結果から実証されるように、ポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と（循環置換）ＰＰ７コートタンパク質の部分からコンカテマー化された抗原結合性キメラタンパク質を、ライブラリーから機能的抗原結合性キメラタンパク質として選択することができる。種々のリンカー変異体の代表的なクローンを表６に示す。
［実施例１３］リゾチーム特異的ナノボディの第１の露出βターンにＭＳ２のウイルスコートタンパク質の循環置換変異体を挿入したナノボディ提示型二十面体ウイルス様粒子のインビトロ選択による設計と作製。
本実施例に記載する３．９ＭＤａ二十面体ウイルス様粒子は、図１５に従ってショートポリペプチドリンカーにより連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分から構成されるキメラポリペプチドから自己集合する。使用した免疫グロブリンはリゾチーム結合性ナノボディ（ＰＤＢ：１ＭＥＬ、配列番号７）である。使用した足場タンパク質はＭＳ２のコートタンパク質（ＰＤＢ：２ＭＳ２、配列番号２）の共有結合二量体の循環置換体とした。ＭＳ２は大腸菌の二十面体ＲＮＡバクテリオファージである。全部分をアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、開始コドンにコードされるメチオニン、ナノボディβストランドＡ（抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、残基１～１２）、ランダムな組成の２アミノ酸の循環置換リンカー、ＭＳ２コートタンパク質（配列番号８の残基１７～１３０に続き、配列番号８の残基２～１３０及び配列番号８の残基２～１４）、リゾチーム結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号７の残基１７～１３３）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号９～１３）。このリジッドな抗原結合性キメラタンパク質は自己集合し、前記ナノボディ９０コピーをその表面に提示する二十面体ＶＬＰとなる（図１５）。
ナノＶＬＰに自己集合するこれらの人工リゾチーム結合性コートタンパク質の機能的代表例を選択するために、標準方法を使用し、メチオニン、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、循環置換二量体ＭＳ２コートタンパク質、リゾチーム結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグをコードするオープンリーディングフレーム（配列番号９～１３）のライブラリーを構築した。これらのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ－ＥｃｏＲＩ断片としてｐＭＥＳＰベクター（ｒｅｆ ＣＡ１２７２９）にクローニングした。この新規に創製したプラスミドライブラリーをｐｃＭＳ２２ｃＡｂＬｙｓ３Ｌと称した。
組換え発現させることができ、インビトロで集合させて二十面体ウイルス様粒子を形成することができる組換えリゾチーム結合性ＭＳ２コートタンパク質を選択するために、ナノＶＬＰのライブラリーをプラスミドレベルで構築する。これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換する。ナノＶＬＰを大腸菌で発現させ、ＶＬＰ集合についてクロマトグラフィー選択に供した。各集合適格性ＶＬＰはナノボディ－コートタンパク質をコードする核酸をそのシェル内に封入していたので、これらのナノＶＬＰは沈降後にサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができ、これらのナノＶＬＰに由来するＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによるシーケンシングの結果、集合について選択することにより遺伝子発現量が増加していることが分かる。リゾチームを使用した親和性選択後、リゾチームと特異的に結合するこれらのナノＶＬＰからＲＮＡを単離し、増幅する。
これらのリゾチーム結合性ＭＳ２コートタンパク質から構成される集合適格性リゾチーム特異的ナノＶＬＰの一部を均一になるまで精製し、リゾチームの存在下と不在下で単粒子クライオＥＭにより解析した。
［実施例１４］ＧＦＰ特異的ナノボディの第１の露出βターンにＡＰ２０５の天然置換ウイルスコートタンパク質を挿入したナノボディ提示型二十面体ウイルス様粒子のインビトロ選択による設計と作製。
本実施例に記載する二量体は、図４０に従ってショートポリペプチドリンカーにより連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分から構成されるキメラポリペプチドから自己集合する。使用した免疫グロブリンはＧＦＰ結合性ナノボディ（配列番号１）である。使用した足場タンパク質はＡＰ２０５のコートタンパク質（ＰＤＢ：５ＦＳ４、配列番号１６６）の共有結合二量体とした。ＡＰ２０５はアシネトバクター属細菌の二十面体ＲＮＡバクテリオファージである。ＡＰ２０５コートタンパク質二量体は他の公知１本鎖ＲＮＡファージでβヘパリンを形成するＮ末端領域を除き、保存されたレビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）コートタンパク質フォールドをとる。ＡＰ２０５はＮ及びＣ末端βストランドにより形成される同一位置に同様の構造をもつため、他のコートタンパク質と比較して循環置換体となる。置換の結果、コートタンパク質末端は集合した粒子の大半の表面露出部分に移動し、長いＮ及びＣ末端融合に対するその耐性の増加が説明される（Ｓｈｉｓｈｏｖｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
全部分をアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、開始コドンにコードされるメチオニン、ナノボディβストランドＡ（抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、残基１～１１）、１アミノ酸のランダムリンカー、ＡＰ２０５コートタンパク質二量体（配列番号１６６の残基４～１２８と配列番号１６６の残基４～１２６）、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１６７）。このような抗原結合性キメラタンパク質の機能的代表例を選択するために、標準方法を使用し、メチオニン、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、二量体ＡＰ２０５コートタンパク質、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ－ＥｃｏＲＩ断片としてｐＭＥＳＰベクター（ｒｅｆ ＣＡ１２７２９）にクローニングする。この新規に創製したプラスミドをｐＭＥＳＡＰ２０５２ＸＸＰＮｂＧＦＰ２０７と称した。組換え発現させることができ、インビトロで正しく集合させることができる抗原結合性キメラ（ＡＰ２０５）タンパク質を選択するために、抗原結合性キメラタンパク質のライブラリーをプラスミドレベルで構築する。これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換する。キメラ二量体として正しく集合するキメラタンパク質を同定するために、個々のクローンを大腸菌で発現させ、実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡに供し、ＧＦＰと結合するクローンについてスクリーニングした（図４１）。ＧＦＰと結合するＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ｘ２ＸＸを発現する数個のクローンをシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結するペプチドリンカーの配列を決定した。この結果から実証されるように、２本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分とウイルスＡＰ２０５コートタンパク質の部分からコンカテマー化された抗原結合性キメラタンパク質を、ライブラリーから機能的抗原結合性キメラタンパク質として選択することができる。１－１アミノ酸ショートリンカー変異体の代表的なクローンを表７に示す。これらの抗原結合性キメラタンパク質の一部は自己集合し、前記ナノボディ９０コピーを表面に提示する二十面体ＶＬＰとなることが分かった。
［実施例１５］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにＡＰ２０５のコートタンパク質を挿入したポリペプチド鎖２本から成る二量体抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
本実施例に記載する二量体は、図４２に従ってショートポリペプチドリンカーにより連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分から構成されるキメラポリペプチドから自己集合する。使用した免疫グロブリンはＧＦＰ結合性ナノボディ（配列番号１）である。使用した足場タンパク質はＡＰ２０５（ＰＤＢ：５ＦＳ４、配列番号１６６）とした。ＡＰ２０５単量体が集合して二量体又はＶＬＰとなるとき、一方の単量体のＮ末端は第２の単量体のＣ末端に接近し、一方の単量体のＣ末端は第２の単量体のＮ末端に接近する。機能的な抗原結合性キメラを獲得するためには、第１の単量体のβストランドＡが第２の単量体のＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇと結合し、第２の単量体のＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇが第１の単量体のβストランドＡと結合し、集合して二量体抗原結合性キメラタンパク質となる必要がある。
全部分をアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、開始コドンにコードされるメチオニン、ナノボディβストランドＡ（抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、残基１～１１）、１アミノ酸のランダムリンカー、ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号１６６の残基４～１２６）、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡの順で相互に連結した（配列番号１７３）。
このような二量体抗原結合性キメラタンパク質の機能的な代表例を選択するために、標準方法を使用し、メチオニン、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ、単量体ＡＰ２０５コートタンパク質、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ－ＥｃｏＲＩ断片としてｐＭＥＳＰベクターにクローニングする。この新規に創製したプラスミドをｐＭＥＳＡＰ２０５１ＸＸＰＮｂＧＦＰ２０７と称した。
組換え発現させることができ、インビトロで正しく集合させることができる二量体抗原結合性キメラタンパク質を選択するために、二量体抗原結合性キメラタンパク質のこれらのライブラリーをプラスミドレベルで構築する。これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換する。二量体として正しく集合するキメラタンパク質を同定するために、個々のクローンを大腸菌で発現させ、実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡに供し、ＧＦＰと結合するクローンについてスクリーニングした（図４３）。ＧＦＰと結合するＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ＸＸの二量体を発現する数個のクローンをシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結するペプチドリンカーの配列を決定した。この結果から実証されるように、２本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分とウイルスＡＰ２０５コートタンパク質の部分からコンカテマー化された二量体抗原結合性キメラタンパク質を、ライブラリーから機能的二量体抗原結合性キメラタンパク質として選択することができる。１－１アミノ酸ショートリンカー変異体の代表的なクローンを表８に示す。
異なる抗原結合性ドメインをもつ２個の抗原結合性キメラタンパク質、例えばＧＦＰ結合性ナノボディとＦｅｄＦ結合性ナノボディを細胞で共発現させるならば、これらはヘテロ二量体キメラタンパク質として集合することができる。
［実施例１６］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにＡＣＰを挿入した抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
本発明者らの最初のメガボディの設計の成功に基づき、診断、イメージング又は他の生物物理学的用途で使用するためにフルオロフォア、色素、イオン又は金属で標識可能な足場にも免疫グロブリンドメインをリジッドにグラフトできるか否かについても試験した。具体的には、ＡＣＰにグラフトしたナノボディから構成され、図２に従って２本のショートペプチドがナノボディを足場に連結するリジッドな抗体キメラ（但し、足場に循環置換を必要としないもの）をコードするランダムライブラリーを構築し、ＣｏＡ及びＳＦＰシンテターゼの蛍光誘導体の使用により特定のセリン（図１６）に直交的に標識することができるリジッドな抗原結合性キメラタンパク質を作製した（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ，２００６）。
本実施例に記載するナノツールは、図２に従って短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。この特定のメガボディでは、野生型ＡＣＰのＮ末端とＣ末端が相互に近接しており、ナノボディをＡＣＰに連結する２本の短いポリペプチド結合を構築するために十分に配置されている（図１６）ので、足場タンパク質の循環置換は不要であった。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。足場タンパク質は大腸菌のアシルキャリアタンパク質（ＰＤＢ：１Ｔ８Ｋ、配列番号８６）であり、ＡＣＰと略称する。全部分を図２に従ってペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１１）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＡＣＰ（配列番号８６の残基２～７６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、前記ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号８７～９０）。
２本のショートペプチドがナノボディをＡＣＰに連結するこれらのナノツールの機能的代表例（配列番号８７～９０）を酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰツールボディ（配列番号９１～９４）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１１）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＡＣＰ（配列番号８６の残基２～７６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、前記ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、図１６に従って２本のショートペプチドがナノボディをＡＣＰ足場に連結するナノツールの７７，２８０，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
酵母ディスプレイ法とＦＡＣＳによるインビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のナノツールを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合を提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するために、グルコースリッチ培地で増幅した。
１ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結する代表数のペプチドリンカーの配列を決定した。１－１、２－１及び２－２アミノ酸ショートリンカー変異体の２個の代表的なクローン（表９）はＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ ＧＦＰと結合することが確認された（図４４）。この結果から実証されるように、２本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分とアシルキャリアタンパク質の部分からコンカテマー化されたナノツールを、メガボディライブラリーから選択することができ、機能的な抗原結合性キメラタンパク質として提示させることができる。ＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツールの機能的変異体を酵母の表面に提示させることができた（上記）ので、これらの抗原結合性キメラタンパク質を大腸菌のペリプラズムで発現させることにした。酵母ディスプレイ法により選択した６種のＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体（表９）、即ちＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰ変異体（配列番号１７８～１８３）を以下のアミノ酸配列、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１１）、アミノ酸リンカー（表９、連結番号１）、ＡＣＰ（配列番号８６の残基２～７６）、アミノ酸リンカー（表９、連結番号２）、前記ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグを含むキメラポリペプチドとして作製した。
これらの変異体を大腸菌で発現させるために、実施例２に記載したｐＭＥＳＤ２ベクターを改変した。この新規ベクター（ｐＭＥＳＰ６と称する）は以下のポリペプチド、即ち、大腸菌のペリプラズムへのナノツールの分泌を指示するｐｅｌＢリーダー配列、ＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ、ＡＣＰ、任意のナノボディのＣ末端部分（βストランドＢからβストランドＧまで）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグ、最後にアンバー終止コドンをコードするオープンリーディングフレームを含む。６種のＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体（配列番号１７８～１８２）を実施例２に記載したように発現させた。次に、６種のＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体の各々のペリプラズム抽出液を使用し、発現させたナノツールの機能的性質を実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡにより分析した。ＧＦＰを固定化した試料としない試料に検出されたシグナルを比較すると（図４５）、機能的ＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰナノツール変異体のペリプラズム発現が明白に確認された。この結果から実証されるように、２本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分とアシルキャリアタンパク質の部分からコンカテマー化されたナノツールを、大腸菌のペリプラズムで機能的に発現させることができる。
［実施例１７］リゾチーム特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにＧＦＰ特異的ナノボディを挿入した抗原結合性キメラタンパク質のファージディスプレイ法を使用したインビトロ選択による設計と作製。
ナノボディ自体を足場タンパク質として適用できるか否か、従って、二価又は二重特異性抗原結合性キメラタンパク質を作製するためにナノボディを同一又は異なるナノボディにもリジッドに融合できるか否かを更に検討した。具体的には、図１７に従ってナノボディを足場に連結する３本のポリペプチド結合を介してナノボディを別のナノボディにグラフトし、リジッドなＮｂ－Ｎｂキメラ（ナノ２ボディ：Ｎａｎｏ２ｂｏｄｙ）を作製した。両方のＮｂのパラトープが夫々の抗原と自由に結合できるように連結を行った。従って、この融合体は、ナノ２ボディの両方のナノボディが同一抗原と結合する場合にはより高いアビディティで結合することができ、ナノ２ボディの各ナノボディが異なる抗原と結合する場合には２個の異なる抗原と結合又は架橋することができる。
本実施例に記載するナノ２ボディ（図１８）は、図１７に従って短いポリペプチド結合により連結された第１のナノボディの部分と別の（異なる）ナノボディの部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。使用した第１のナノボディは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディ（ＮｂＧＦＰ２０７）である。第２のナノボディはニワトリ卵白リゾチーム（ｃＡｂＬｙｓ３、ＰＤＢ１ＭＥＬ、配列番号７）と結合する（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。全部分を図１８に示すようにペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ（配列番号ＥＰ１の残基１～１５）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、グリシン、ＮｂＧＦＰ２０７（配列番号１の残基２～１１８）、ランダムな組成の２アミノ酸のペプチドリンカー、リゾチーム結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号７の残基１６～１３３）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、ＮｂＧＦＰ２０７のＧストランドの最後の部分（配列番号１の残基１１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１４）。
これらのナノ２ボディ（配列番号１４）の機能的代表例を繊維状ファージ上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のナノ２ボディをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。このために、ｐｅｌＢシグナルペプチドを付けたｐＭＥＳＰ１ベクターと、ＤｓｂＡシグナルペプチドを付けたｐＭＥＳＤ１ベクターの両者にβストランドＡを組み込み、２個のナノボディを挿入できるようにし、大腸菌のペリプラズムへの融合タンパク質の分泌を指示するＰｅｌＢリーダー配列、抗ＧＦＰナノボディＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ（配列番号１の残基１～１５）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、グリシン、ＮｂＧＦＰ２０７（配列番号１の残基２～１１８）、ランダムな組成の２アミノ酸のペプチドリンカー、リゾチーム結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号７の残基１６～１３３）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、ＮｂＧＦＰ２０７のＧストランドの最後の部分（配列番号１の残基１１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグ、アンバー終止コドン、ＨＡタグ及びＭ１３ファージのタンパク質３を含むナノ２ボディ（配列番号１５）を作製し、又は大腸菌のペリプラズムへの融合タンパク質の分泌を指示するＤｓｂＡリーダー配列、抗ＧＦＰナノボディＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ（配列番号１の残基１～１５）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、グリシン、ＮｂＧＦＰ２０７（配列番号１の残基２～１１８）、ランダムな組成の２アミノ酸のペプチドリンカー、リゾチーム結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号７の残基１６～１３３）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、ＮｂＧＦＰ２０７のＧストランドの最後の部分（配列番号１の残基１１７～１２６）、６×Ｈｉｓタグ／ＥＰＥＡタグ、アンバー終止コドン、ＨＡタグ及びＭ１３ファージのタンパク質３を含むナノ２ボディ（配列番号１６）を作製した。
［実施例１８］ＦｅｄＦ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにＧＦＰ特異的ナノボディを挿入した抗原結合性キメラタンパク質のファージディスプレイ法を使用したインビトロ選択による設計と作製。
二価又は二重特異性抗原結合性キメラタンパク質を作製するためにナノボディを同一又は異なるナノボディにリジッドに融合できるか否かについても試験した。具体的には、図１７に従ってナノボディを足場に連結する３本のポリペプチド結合を介してナノボディを別のナノボディにグラフトし、リジッドなＮｂ－Ｎｂキメラ（ナノ２ボディ；Ｎ２ｂ）を作製した。両方のＮｂのパラトープが夫々の抗原と自由に結合できるように連結を行った。従って、この融合体は、両方の単量体が同一抗原と結合する場合にはより高いアビディティで結合できるであろうし、各単量体が異なる抗原と結合する場合には２個の異なる抗原と結合できるであろう。
本実施例に記載するナノ２ボディ（図１９）は、図１９に従って短いポリペプチド結合により連結された第１のナノボディの部分と別の（異なる）ナノボディの部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。使用した第１のナノボディは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディ（ＮｂＧＦＰ２０７）である。第２のナノボディはＦ１８線毛アドヘシンＦｅｄＦのレクチンドメイン（ＮｂＦｅｄＦ９、配列番号１７）を認識する（Ｍｏｏｎｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。全部分を図１９に示すようにペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ（配列番号１の残基１～１５）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、グリシン、ＮｂＧＦＰ２０７（配列番号１の残基２～１１８）、ランダムな組成の２アミノ酸のペプチドリンカー、ＦｅｄＦ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１７の残基１６～１２９）、ランダムな組成の３アミノ酸のペプチドリンカー、ＮｂＧＦＰ２０７のＧストランドの最後の部分（配列番号１の残基１１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１８）。
高度に保存されたＮ末端配列と高度に保存されたＣ末端配列が全てのＮｂに共通しているため、インビボ成熟させたナノボディレパートリーを全く同様に簡便にクローニングすることができる。
ＮｂＧＦＰ２０７を第１の結合ドメインとし、ＮｂＦｅｄＦ９を第２の結合ドメインとしたものと、第１及び第２の結合ドメインを逆にしたものとの２種類のナノ２ボディを作製することができる。
スクリーニングを簡略化するためにコンピュータモデリングを使用し、図４６に示すようなエネルギー的に安定なコンストラクト（配列番号１８４～１８５）から出発した。これらのナノ２ボディの機能的代表例を繊維状ファージ上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のナノ２ボディをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。このために、ｐｅｌＢシグナルペプチドを付けたｐＭＥＳＰ１ベクターと、ＤｓｂＡシグナルペプチドを付けたｐＭＥＳＤ１ベクターの両者にβストランドＡを組み込み、２個のナノボディを挿入できるようにし、ナノ２ボディ（配列番号１８４～１８５）を作製した。ｐＭＥＳＰコンストラクトでは、ＰｅｌＢリーダー配列が大腸菌のペリプラズムへの抗原結合性キメラタンパク質の分泌を指示し、ｐＭＥＳＤコンストラクトでは、ＤｓｂＡリーダー配列が大腸菌のペリプラズムへの抗原結合性キメラタンパク質分泌を指示する。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、シグナルペプチド、抗ＧＦＰナノボディＮｂＧＦＰ２０７のβストランドＡ（配列番号１の残基１～１３）、４アミノ酸のペプチドリンカーＴＥＮＨ（配列番号１８４～１８５の残基１４～１７）、ＮｂＧＦＰ２０７（残基５をＶからＱに突然変異させた配列番号１の残基３～１１６）、ランダムな組成の４アミノ酸のペプチドリンカー、ＦｅｄＦ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１７の残基１６～１２８）、３アミノ酸のペプチドリンカーＧＱＥ（配列番号１８４の残基２４９～２５１）又はＧＱＱ（配列番号１８５の残基２４９～２５１）、ＮｂＧＦＰ２０７のＧストランドの最後の部分（配列番号１の残基１１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグ、アンバー終止コドン、ＨＡタグ及びＭ１３ファージのタンパク質３の順で相互に連結した。
インビトロで組換え発現させることができる抗原結合性キメラタンパク質を選択するために、抗原結合性キメラタンパク質のライブラリーをプラスミドレベルで構築する。ＤＮＡ断片をｐＭＥＳＰベクターにクローニングしたライブラリーをｐＭＥＳＰＮＩＩｂＧＦＰ２０７ＸＦｅｄＦ９と称し、ＤＮＡ断片をｐＭＥＳＰベクターにクローニングしたライブラリーをｐＭＥＳＤＮＩＩｂＧＦＰ２０７ＸＦｅｄＦ９と称した。これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換した。正しく集合するキメラタンパク質を同定するために、ＦｅｄＦ上へのファージディスプレイ（Ｐａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）により１又は２ラウンドのインビトロ選択を行った後、ＧＦＰで１ラウンドの選択を行った。選択後、個々のクローンを釣菌し、目的ＤＮＡ断片をＰＣＲに供し、１％アガロースゲルで各クローンのサイズを確認した。正しいサイズのＤＮＡ断片を保持する数個のクローンを配列解析し、種々のナノボディ断片を連結するペプチドリンカーの配列を決定した。正しいクローンを大腸菌で発現させ、ＩＭＡＣを使用して半精製し、ＥＬＩＳＡに供し、ＧＦＰとＦｅｄＦを発現してこれらと結合するクローンを以下のようにスクリーニングした（図４７）。精製したＧＦＰとＦｅｄＦをマキシソープマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）中０．５μｇ／ウェルの濃度で別々に固定化した。ウェル内の残りのタンパク質結合部位を室温にて２時間ミルクＰＢＳ溶液でブロックした。ＩＭＡＣで精製したナノ２ボディ試料を、ＧＦＰをコートしたウェルと、ＦｅｄＦをコートしたウェルと、コートなしのウェルでインキュベートした。洗浄工程後、ナノ２ボディのみに存在するＥＰＥＡタグを特異的に認識するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｃタグビオチン化抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することによりナノ２ボディとＧＦＰの結合を試験した。次いでストレプトアビジン－アルカリホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔビオチン化抗体の検出を行った。酵素基質リン酸ｐ－ニトロフェニルを加えた後に４０５ｎｍの吸収を測定した。検出されたシグナルによると、これらの抗原結合性キメラタンパク質にはＧＦＰとＦｅｄＦを認識できるものがある。この結果から実証されるように、３本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と別のシングルドメイン免疫グロブリンの部分からコンカテマー化されたナノ２ボディを、ライブラリーから機能的抗原結合性キメラタンパク質として選択することができる。４－４－３アミノ酸ショートリンカー変異体の代表的なクローンを表１０に示す。
［実施例１９］酵母ディスプレイ法又はファージディスプレイ法により免疫ライブラリーからＧＦＰ特異的抗原結合性キメラタンパク質を選択するためのディスプレイベクター。
免疫グロブリンフォールドのフレームワークの一部として、（βストランドＡ、及びβストランドＡをＢに繋ぐβターンを形成する残基を含む）Ｎ末端アミノ酸配列は種々のラクダ科動物抗体間で高度に保存されている（Ｈａｒｍｓｅｎ，２０００）。従って、１個の代表的なナノボディを足場に連結するリンカーペプチドの長さと配列が最適化されると、同一リンカーを使用して任意のナノボディのβストランドＡをＢに繋ぐ第１のβターンに特定の足場を挿入し、正しく折り畳まれた安定なメガボディを作製することができる（上記実施例参照）。同様に、種々のラクダ科動物抗体のＣ末端配列も高度に保存されている。従って、１個の代表的なナノボディを足場に連結するリンカーペプチドの長さと配列が最適化されると、同一リンカーを使用してナノボディのＣ末端を足場に連結することができる。
その結果、特に図２又は１１に示す連結スキームに従ってリジッドな抗原結合性キメラタンパク質の大きなライブラリーをクローニングするために、ナノボディのインビボ成熟ライブラリーを簡便に使用することができる。予想される用途に応じて、これらのライブラリーを特定の設計の機能的メガボディ、対称性をもつ多量体メガボディ、ＶＬＰ、ナノツール又はナノ２ボディについてファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法又はウイルスディスプレイ法によりスクリーニングすることができる。この概念を証明するために、図２に従ってナノボディを足場に連結する２本のペプチド結合を介してナノボディ免疫ライブラリーを足場タンパク質ＨｏｐＱにグラフトし、同一の足場にグラフトされた異なるナノボディから集合されるリジッドな抗原結合性キメラタンパク質の大きなレパートリーの提示用のライブラリーを構築した（図２０）。本実施例に記載するメガボディは、図２に従って短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。前記免疫グロブリンはＰａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）に記載されているようにＧＦＰを免疫したラマの血液試料からクローニングされたナノボディである。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、ＧＦＰを免疫したラマに由来するナノボディのβストランドＢ～Ｇの順で相互に連結した。ナノボディをコードする遺伝子をＰａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）に記載されているようにこの免疫した動物からクローニングした。２本のショートペプチドが他のＧＦＰ特異的ナノボディを足場に連結する新規な機能的ＧＦＰ結合性メガボディを酵母上に提示させ、選択するために、ナノボディをコードする遺伝子をプライマーＴＵ６４（配列番号１２４）及びＴＵ６５（配列番号１２５）で増幅し、酵母でＧＡＰ修復相同組換えに使用し、図８に従って多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させたこれらのメガボディ、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、免疫ライブラリーであるメガボディライブラリーに由来するｃＨｏｐＱＮｂ、フレキシブルペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質のＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質Ａｇａ２ｐの直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）、及びｃＭｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、２本のショートペプチドが免疫ライブラリーに由来するナノボディをＨｏｐＱに連結する１０７種の異なるメガボディをコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
酵母ディスプレイ法とＦＡＣＳによるインビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、２００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合を提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の（ＧＦＰ濃度を１００ｎＭ、１０ｎＭ及び１ｎＭに低下させる）選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
複数ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、高レベルで提示されると共にＧＦＰと結合する代表数のメガボディの配列を決定した。ＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ ＧＦＰと結合する９種の異なるＧＦＰ特異的メガボディ（配列番号９５～１０３、図２１も参照）が同定され、免疫ライブラリーに由来するメガボディライブラリーから抗原結合性キメラタンパク質を選択できることが実証された。
［実施例２０］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＣＣ’を繋ぐ第２のβターンにＨｏｐＱの循環置換変異体を挿入した５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
実施例１～１７に例証したように、βストランドＡをＢと繋ぐナノボディの第１のβターンに挿入した足場タンパク質から抗原結合性キメラタンパク質を作製することができる。他のターンでも足場を免疫グロブリンドメインに連結できることを実証するために、ＧＦＰ特異的ナノボディの（βストランドＣ及びＣ’を繋ぐ）第２の露出βターンにｃＨｏｐＱ足場タンパク質を挿入した抗原結合性キメラタンパク質もインビトロ選択により作製した。
本実施例に記載する５８ｋＤａメガボディは、図２２に従って短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例で使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ～Ｃ（配列番号１の１～３９）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１５～１８６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＣ’～Ｇ（配列番号１の残基４６～１２６）、ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１０４～１０７）。
ＨｏｐＱの循環置換体をＧＦＰ特異的ナノボディの第２のβターンに挿入したメガボディの機能的変異体を酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のメガボディ（配列番号１０８～１１１）、即ち、酵母での細胞外分泌を指示するａｐｐＳ４リーダー配列（Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，２００９）、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ～Ｃ（配列番号１の残基１～３９）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１５～１８６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＣ’～Ｇ（配列番号１の残基４６～１２６）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、図２２に示すメガボディの１８４，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
インビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をｃｏＡ－６４７（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＧＦＰと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－６４７蛍光レベルが高い）、抗原ＧＦＰと結合する（ＧＦＰ蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＧＦＰ結合性ナノボディを提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
１ラウンドの選択後、ＣｏＡ－６４７チャネルとＧＦＰチャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結する代表数のペプチドリンカーの配列を決定した。１－１、２－１、１－２及び２－２アミノ酸ショートリンカー変異体の１又は２個の代表的なクローン（表１１）はＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ ＧＦＰと結合することが確認された（図４８）。この結果から実証されるように、シングルドメイン免疫グロブリンの（βストランドＣ及びＣ’を繋ぐ）第２の露出βターンに足場タンパク質を挿入し、２本の短いポリペプチド結合により連結したメガボディを、メガボディライブラリーからインビトロ選択により選択することができ、機能的抗原結合性キメラタンパク質として提示させることができる。
［実施例２１］Ｋ－Ｒａｓ特異的モノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱを挿入した他の５８ｋＤ抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
本実施例では、モノボディ等の合成抗原結合性ドメインをベースとする抗原結合性キメラタンパク質について記載した。Ｈ－ＲＡＳ及びＫ－ＲＡＳ特異的モノボディＮＳ１のβストランドＡ及びＢを繋ぐ第１のβターンにｃＨｏｐＱ足場タンパク質を挿入したメガボディを作製した（Ｓｐｅｎｃｅｒ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ，２０１７）。
本実施例に記載する５８ｋＤａメガボディＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱは、図２に従って短いポリペプチド結合により連結された合成結合性タンパク質（モノボディ）であるＮＳ１の部分と足場タンパク質の部分からコンカテマー化されたキメラポリペプチドである。本実施例において、合成結合性タンパク質は配列番号１１２に示すＨ－Ｒａｓ及びＫ－Ｒａｓ結合性モノボディＮＳ１（Ｓｐｅｎｃｅｒ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ，２０１７）である。モノボディはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインをベースに作製された合成タンパク質である。受容体、キナーゼ、ステロイドホルモン受容体及びモジュラータンパク質ドメインの細胞外ドメインを含む多様な標的と高い親和性で結合するモノボディが単離されている（Ｋｏｉｄｅ，２０１２）。全部分を図２３に示すようにペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、ＮＳ１のβストランドＡ（配列番号１１２の１～１３）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１５～１８６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＮＳ１モノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１１２の残基１６～９４）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１１３～１１６）。
モノボディを足場に連結するリンカーの組成と長さが異なる機能的メガボディＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱを酵母上に提示させ、選択するために、標準方法を使用し、多数のアクセサリーペプチド及びタンパク質と融合させた種々のＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ（配列番号１１７～１２０）、即ち、ＮＳ１のβストランドＡ（配列番号１１２の１～１３）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９３～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１５～１８６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＮＳ１モノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１１２の残基１６～９４）、フレキシブル（ＧＧＳＧ）ｎペプチドリンカー、Ａｇａ１ｐタンパク質とのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐのＡｇａ２ｐ接着サブユニット、提示された融合タンパク質の直交的蛍光染色用のアシルキャリアタンパク質（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，２００５）及びｍｙｃタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのオープンリーディングフレームをガラクトース誘導性ＧＡＬ１／１０プロモーターの転写制御下でｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ，２００６）に挿入し、モノボディＮＳ１と足場ＨｏｐＱから構成されるメガボディの１８４，０００種の異なる変異体をコードする酵母ディスプレイライブラリーを構築した。
インビトロ選択のために、このライブラリーを酵母株ＥＢＹ１００に導入した。形質転換細胞をガラクトースリッチ培地で一晩増殖・誘導させた。ＳＦＰシンターゼ（１μＭ）を使用し、誘導させた細胞をＣｏＡ－４８８（２μＭ）で直交的に染色し、１００ｎＭのＤｙｌｉｇｈｔ－６４７標識Ｋ－ＲＡＳと共にインキュベートした。次に、これらの細胞を洗浄し、２パラメーターＦＡＣＳ解析に供し、高レベルの特定のメガボディを提示し（ＣｏＡ－４８８蛍光レベルが高い）、抗原Ｋ－ＲＡＳと結合する（Ｄｙｌｉｇｈｔ－６４７蛍光レベルが高い）酵母細胞を同定した。高レベルのＫ－ＲＡＳ結合性モノボディを提示する細胞を選別し、酵母ディスプレイ法と２パラメーターＦＡＣＳ解析によるその後の選択ラウンドに供するためにグルコースリッチ培地で増幅した。
１ラウンドの選択後、ＣｏＡ－４８８チャネルとＤｙｌｉｇｈｔ－６４７チャネルで蛍光レベルの高い代表数の細胞をシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、モノボディＮＳ１を足場タンパク質に連結する代表数のペプチドリンカーの配列を決定した。１－１及び２－２アミノ酸ショートリンカー変異体の３個の代表的なクローン（表１２）はＦＡＣＳ実験で１００ｎＭ Ｋ－Ｒａｓと結合することが確認された（図４９）。提示レベルが高く、抗原と結合することから、これらのメガボディは細胞から分泌させることができ、機能的Ｋ－ＲＡＳ結合性キメラタンパク質として提示させることができると判断される。
［実施例２２］ＧＰＣＲ、イオンチャネル及び受容体型チロシンキナーゼ等の扱いにくい膜結合型複合体の構造解析用の抗原結合性キメラタンパク質の設計と作製。
本願に記載するような抗原結合性キメラタンパク質を利用すると、所謂「扱いにくい」標的と特異的に結合するので、それらの精密な構造解析が容易になる。既に実施例４～６で例示したように、５８ｋＤａメガボディを設計・作製し、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質又はイオンチャネルの構造決定で使用した。実施例４では、β２アドレナリン受容体－Ｇｓタンパク質複合体のＧβサブユニットとＧαサブユニットの界面に特異的に結合するＮｂ３５をベースとするＭｂ３５コンストラクトを作製し、実施例５では、ヒトβ２アドレナリン受容体と特異的に結合するＮｂ８０をベースとするＭｂ８０コンストラクトを作製し、実施例６では、五量体リガンド依存性イオンチャネルＧＡＢＡＡ（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１７）と特異的に結合するＮｂ２５をベースとするＭｂ２５コンストラクトを作製した。更に、ＧＡＢＡＡイオンチャネルβ１サブユニット（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１８）の細胞外ドメインと特異的に結合するナノボディＮｂ３８（配列番号１３０）をベースとするＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱも作製し、この膜結合型タンパク質の高解像度構造を決定するのに使用した。ＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱを実施例６に記載したように作製した。本実施例では、Ｎｂ３８（配列番号１３０）の免疫グロブリンドメインを足場タンパク質ｃＨｏｐＱと連結した。全部分をペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディの保存されたＮ末端のβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１４）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＨｏｐＱのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号２１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１４～１８６）、Ｎｂ３８のβストランドＢ～Ｇ（配列番号１３０の残基１６～１２３）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１３１）。
ＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱコンストラクトを大腸菌で発現させ、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーを使用して均一になるまで精製し、最終的に１５ｍｇ／ｍＬの試料を－８０℃で保存した。精製したＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱ（配列番号１３１）を使用し、夫々競合的アンタゴニストであるビククリン、チャネルブロッカーであるピクロトキシン、アゴニストであるＧＡＢＡ及び古典的なベンゾジアゼピンであるアルプラゾラム（Ｘａｎａｘ）とジアゼパム（Ｖａｌｉｕｍ）と結合させた脂質ナノディスクにおける全長ヒトα１β３γ２ ＧＡＢＡＡ受容体の高解像度クライオＥＭ構造を解析した。Ａ型γ－アミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡＲ）を介するイオノトロピックシグナル伝達は哺乳動物神経系で迅速な抑制性神経伝達を担う。従って、ＧＡＢＡＡＲは脳機能のほぼ全ての側面に不可欠であり、重要な医薬品ターゲットである。
あるいは、このような扱いにくい膜結合型複合体の構造解析を容易にするために、前記ナノボディをベースとし、ｃＹｇｊＫ足場を適用することにより、１００ｋＤａ抗原結合性キメラタンパク質を設計・作製する。本実施例では、Ｎｂ３５、Ｎｂ８０、Ｎｂ２５及びＮｂ３８をＹｇｊＫの循環置換体にグラフトすることによりこれを実証した。これらのメガボディクローンを本質的に実施例８に記載したように作製した。ＭｂＮｂ３５ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１９４）は、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、Ｔｙｒ１アミノ酸リンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３８の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号４３）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３８の残基１～４６１）、Ａｓｐ１アミノ酸リンカー、Ｎｂ３５ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号２４の残基１７～１２８）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから作製した。Ｎｂ８０ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号２６の残基１７～１２０）を使用した以外は同様にしてＭｂＮｂ８０ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１９５）を設計・作製し、Ｎｂ２５ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号２８の残基１７～１２５）を使用した以外は同様にしてＭｂＮｂ２５ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１９６）を設計・作製し、Ｎｂ３８ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１３０の残基１７～１２３）を使用した以外は同様にしてＭｂＮｂ３８ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１９７）を設計・作製した。
更に、膜結合型受容体の高解像度構造の決定を可能にするように、トロポミオシン関連キナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）と特異的に結合するＮｂ２２ナノボディ（配列番号１９８）をベースとするＭｂＮｂ２２ ｃＹｇｊｋＥ２も作製した。ＭｂＮｂ２２ ｃＹｇｊｋＥ２も実施例８に記載したように作製した。ＭｂＮｂ２２ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１９９）は、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、Ｔｙｒ１アミノ酸リンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３８の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号４３）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３８の残基１～４６１）、Ａｓｐ１アミノ酸リンカー、Ｎｂ２２ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１９８の残基１７～１２４）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから構成した。本質的に実施例８に記載したように、これらのメガボディ（配列番号１９４～１９５～１９６～１９７～１９９）をペリプラズムで発現させ、均一になるまで精製した。
一例として、トロポミオシン関連キナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）と結合させたヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を結晶化させるための結晶化シャペロンとしてＭｂＮｂ２２ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１９９）を使用し、Ｘ線結晶構造解析によりＴｒｋＢ－ＢＤＮＦ－ｃＹｇｊｋＥ２Ｎｂ２２三元複合体の高解像度構造を解析した。ＢＤＮＦはニューロン生存、シナプス形成、シナプス伝達及びシナプス可塑性を促進することにより回路の発生と機能的調節に関与する神経栄養因子である。ＢＤＮＦはＴｒｋＢと結合することにより作用する（Ｙｏｓｈｉｉ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅ－Ｐａｔｏｎ，２０１０）。
［実施例２３］ｃＨｏｐＱを含む抗原結合性キメラタンパク質のｃＨｏｐＱ足場と特異的に結合し、抗原結合性キメラタンパク質足場と結合して更に伸長させることが可能な抗原結合性キメラタンパク質の設計と作製。
図２６に模式的に示すように、図２の融合に従ってｃＨｏｐＱ特異的ナノボディ（Ｎｂ６０）を足場タンパク質にグラフトした別の抗原結合性キメラタンパク質を作製した。得られた抗原結合性キメラタンパク質の組成物、又は「会合型抗原結合性キメラタンパク質」、又は「ポリボディ」又は「拡大型抗原結合性キメラタンパク質足場」は、この特異的「抗Ｍｂ足場メガボディ」を使用して本発明の抗原結合性キメラタンパク質のサイズを更に大きくすることができる。このような「ポリボディ」は例えば、凝集に繋がる自己相互作用を避けるためにＮｂ６０とｃＨｏｐＱの結合部位とは結合しない突然変異型ｃＨｏｐＱタンパク質を足場タンパク質として含むことができる。ポリボディで使用される足場は、前記自己結合を避けるために本願に記載するｃＹｇｊＫ足場タンパク質等の等の別の足場を構成してもよい。先ず、ｃＨｏｐＱと結合するＮｂ６０（配列番号１３２）を作製し、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）の存在下で結晶化に使用した。結晶構造解析によると、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱにおけるｃＨｏｐＱの３個の残基（Ｔ２８９、Ｎ２９６及びＥ１９７）はＮｂ６０－ｃＨｏｐＱ相互作用の主要因子であることが確認された（図２７）。更に、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ結晶構造の電子密度で完全には見えないループとして常に出現した循環置換領域（ｃ７ＨｏｐＱと称する）を短縮したｃＨｏｐＱをベースとするメガボディ設計の短縮型も提案できる。
ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱはペプチド結合によりアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で相互に連結した以下の部分、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１３）、ＨｏｐＱのＣ末端部分（配列番号１９の残基１９２～４１１）、ＨｏｐＱのＮ末端部分（配列番号１９の残基１８～１８６）、ｃ７ＨｏｐＱ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１３２の残基１６～１３３）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから構成される。一方、ｃ／ｃ７ＨｏｐＱを含むメガボディと結合するが、自己結合（自己重合）しないＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱメガボディを作製するために、ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱの２種類の突然変異体：
・Ｎ２７７Ｋ、Ｔ２７０Ｒ（ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱ ｍｕｔ２、配列番号１３３）
・Ｎ２７７Ｋ、Ｔ２７０Ｒ、Ｅ１９７Ｒ（ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱｍｕｔ３、配列番号１３４）
を使用した。
ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱのこれらの突然変異体を実施例２に記載したように大腸菌のペリプラズムで発現させ、均一になるまで精製した。次に、Ｏｃｔｅｔ測定（図２９）を行った結果、図２４と同様の測定を使用した場合にこれらの２種のＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱ突然変異体メガボディは野生型ｃＨｏｐＱ足場タンパク質を含むメガボディと結合できることが証明された。ビオチン化ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ（配列番号２０）をストレプトアビジンバイオセンサーに固定化した。種々の濃度のＮｂ６０（配列番号１３２）、ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱｍｕｔ２（配列番号１３３）及びＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱｍｕｔ３（配列番号１３４）を固定化ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとの結合について試験した。Ｎｂ６０と２種類のＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱ突然変異体では、ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱとの結合が確認された。
ｃＨｏｐＱ突然変異体に基づくアプローチと同様に、他の足場タンパク質を使用してポリボディ又は抗原結合性キメラタンパク質の組成物を作製することができる。具体的には、大腸菌の８６ｋＤＡペリプラズムタンパク質（ＰＤＢ３Ｗ７Ｓ、配列番号３８）である代替足場タンパク質ＹｇｊＫを使用した（図２６Ｂ）。実施例８に記載したように、ＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊｋＥ２、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の１～１２）、Ｔｙｒ１アミノ酸リンカー、ＹｇｊＫのＣ末端部分（配列番号３８の残基４６４～７６０）、足場タンパク質の循環置換体を作製するためにＹｇｊＫのＣ末端とＮ末端を連結するショートペプチドリンカー（配列番号４３）、ＹｇｊＫのＮ末端部分（配列番号３８の残基１～４６１）、Ａｓｐ１アミノ酸リンカー、Ｎｂ６０ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１３２の残基１７～１３３）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグから構成されるＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊｋＥ２（配列番号１３５）を作製した。
このメガボディを実施例８に記載したように発現させ、精製した。次に、ＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊｋＥ２とＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱの結合を上記のようにＯｃｔｅｔ測定により検証した（図２９）。
［実施例２４］ＧＦＰ特異的ナノボディのβストランドＡＢを繋ぐ第１のβターンにドデシンを挿入した多量体抗原結合性キメラタンパク質のインビトロ選択による設計と作製。
本実施例では、どのようにしてドデシンＲｖ１４９８Ａにも免疫グロブリンドメインをリジッドにグラフトできるかを実証する。古細菌である結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するこの小型のフラボタンパク質は１２個の単量体の集合体である。大腸菌で過剰発現させると、単量体１２コピーが自己集合し、熱安定性の高いドデシンを形成できることが分かっている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ドデシンでは、各単量体のＮ末端が同一単量体のＣ末端と非常に近接している。そこで、ドデシン単量体にグラフトしたナノボディから構成され、図２に従って２本のショートペプチドがナノボディを足場に連結するリジッドな抗原結合性キメラタンパク質をコードするランダムライブラリーを構築した。
本実施例に記載する２５８ｋＤａ ＭｂＮｂ２０７ Ｄｏｄｅｃｉｎ分子は、図５０に従って直接連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分から構成されるキメラポリペプチドから自己集合する。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。使用した足場タンパク質は結核菌のドデシンＲｖ１４９８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：３２０５０４０、配列番号１９２）の単量体とした。全部分をアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、開始コドンにコードされるメチオニン、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１１）、ランダムな組成の１アミノ酸のペプチドリンカー、ドデシンＲｖ１４９８Ａタンパク質（配列番号１９２の残基５～６６）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１７～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号１９３）。この抗原結合性キメラタンパク質は自己集合し、前記メガボディ１２コピーを含むドデシン多量体となる（図５０）。
２本のショートペプチドがナノボディをドデシンに連結するこれらの抗原結合性キメラタンパク質（配列番号１９３）の機能的代表例を選択するために、標準方法を使用し、上記抗原結合性キメラタンパク質（配列番号１９３）をコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ－ＳｐＩ断片としてｐＭＥＳＰベクターにクローニングする。この新規に創製したプラスミドをｐＭＥＳＰドデシンＸＮｂＧＦＰ２０７と称した。組換え発現させることができ、インビトロで正しく集合させることができる抗原結合性キメラＭｂＮｂ２０７ Ｄｏｄｅｃｉｎタンパク質を選択するために、抗原結合性キメラタンパク質のライブラリーをプラスミドレベルで構築した。これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換した。ドデシンとして正しく集合するキメラタンパク質を同定するために、個々のクローンを大腸菌で発現させ、実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡに供し、ＧＦＰと結合するクローンについてスクリーニングした（図５１）。抗原結合性キメラタンパク質を発現し、ＧＦＰと結合する数個のクローンをシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結するペプチドリンカーの配列を決定した。この結果から実証されるように、２本の短いポリペプチド結合により連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分とドデシンからコンカテマー化された抗原結合性キメラタンパク質を、ライブラリーから機能的抗原結合性キメラタンパク質として選択することができる。１－１アミノ酸ショートリンカー変異体の代表的なクローンを表１３に示す。この結果、ナノボディをドデシンＲｖ１４９８Ａの単量体にグラフトしたこれらの抗原結合性キメラタンパク質を大腸菌で機能的に発現させることができると判断される。
［実施例２５］ＧＦＰ特異的ナノボディの第１の露出βターンにジスルフィド架橋ホモ二量体を挿入したメガボディのインビトロ選択による設計と作製。
本実施例では、どのようにして４ＱＹＢと称するホモ二量体にも免疫グロブリンドメインをリジッドにグラフトできるかについて記載する。バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）Ｊ２３１５に由来する機能不明のこの小型のタンパク質は、このタンパク質の報告されている結晶構造（Ｈａｌａｖａｔｙ ｅｔ．ａｌ．未公開データ、ＰＤＢコード４ＱＹＢ）により確認されるように、２個の単量体が単一の分子間ジスルフィド架橋により連結されたホモ二量体である。また、一方の単量体のＮ末端は同一単量体のＣ末端と非常に近接している。そこで、４ＱＹＢ単量体にグラフトしたナノボディから構成され、図２に従って２本のショートペプチドがナノボディを足場に連結するリジッドな抗体キメラをコードするランダムライブラリーを構築した。
本実施例に記載する５１ｋＤａホモ二量体ＭｂＮｂ２０７ ４ＱＹＢは、図５２に従って直接連結されたシングルドメイン免疫グロブリンの部分と足場タンパク質の部分から構成されるキメラポリペプチドから自己集合する。使用した免疫グロブリンは配列番号１に示すＧＦＰ結合性ナノボディである。使用した足場タンパク質はバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５に由来する４ＱＹＢ（ＰＤＢ４ＱＹＢ、配列番号２００）の単量体とした。全部分をアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、即ち、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、４ＱＹＢタンパク質（配列番号２００の残基８～１２１）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグの順で相互に連結した（配列番号２０１～２０４）。このリジッドな抗原結合性キメラタンパク質は自己集合し、前記ナノボディ２コピーを含むジスルフィド架橋ホモ二量体となる（図５２）。
２本のショートペプチドがナノボディを足場に連結するこれらの抗原結合性キメラタンパク質の機能的代表例（配列番号２０１～２０４）を選択し、大腸菌のペリプラズムで発現させるために、標準方法を使用し、上記抗原結合性キメラタンパク質（配列番号２０５～２０８）、即ち、大腸菌のペリプラズムへの融合タンパク質の分泌を指示するＰｅｌＢリーダー配列、抗ＧＦＰナノボディのβストランドＡ（配列番号１の残基１～１２）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、４ＱＹＢタンパク質（配列番号２００の残基８～１２１）、ランダムな組成の１又は２アミノ酸のペプチドリンカー、ＧＦＰ結合性ナノボディのβストランドＢ～Ｇ（配列番号１の残基１６～１２６）、６×Ｈｉｓ／ＥＰＥＡタグをコードするオープンリーディングフレームのライブラリーを構築した。これらのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ－ＳｐＩ断片としてｐＭＥＳＰベクターにクローニングする。この新規に創製したプラスミドをｐＭＥＳＰ４ＱＹＢＸＸＮｂＧＦＰ２０７と称した。
組換え発現させることができ、インビトロで正しく集合させることができるＭｂＮｂ２０７ ４ＱＹＢタンパク質を選択するために、抗原結合性キメラタンパク質のライブラリーをプラスミドレベルで構築する。正しく集合したホモ二量体を同定するために、これらのライブラリーを使用して大腸菌細胞を形質転換する。個々のクローンを大腸菌で発現させ、実施例７に記載したようにＥＬＩＳＡに供し、ＧＦＰと結合するクローンについてスクリーニングした。抗原結合性キメラタンパク質を発現し、ＧＦＰと結合する数個のクローンをシングルコロニーとして増殖させ、ＤＮＡシーケンシングを行い、ナノボディを足場タンパク質に連結するペプチドリンカーの配列を決定した。
配列表
配列番号１：ＧＦＰ特異的ナノボディであるＮｂＧＦＰ２０７＝Ｎｂ２０７。
配列番号２：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＰ７コートタンパク質単量体のバクテリオファージ。
配列番号３～６：ＭｂＮｂ２０７ ｃＰＰ７ｘ２Ｌ二量体。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＰＰ７配列を下線で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）のショートペプチドリンカーであり、タグを小文字で示す。）
配列番号７：ニワトリ卵白リゾチーム特異的ナノボディであるｃＡｂＬｙｓ３（ＰＤＢ１ＭＥＬ）。
配列番号８：大腸菌バクテリオファージコートタンパク質単量体（ＰＤＢ２ＭＳ２）。
配列番号９：ＭｂｃＡｂＬｙｓ３ ｃＭＳ２ｘ２Ｌ二量体。
（ＮｂＧＦＰ２０７ストランドＡとｃＡｂＬｙｓ３の配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＭＳ２配列を下線で示し、タグを小文字で示す。）
配列番号１０～１３：ＭｂｃＡｂＬｙｓ３ ｃＭＳ２ｘ２Ｌ二量体。
配列番号１４：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ｃＡｂＬｙｓ３Ｌナノ２ボディ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、ｃＡｂＬｙｓ３配列を下線で示す。）
配列番号１５：ＰｅｌＢ＿Ｎ２ｂＮｂ２０７ ｃＡｂＬｙｓ３Ｌ＿タグ、アンバー終止コドン（＊）＿タンパク質３ナノ２ボディ。
（ＰｅｌＢリーダー配列を先頭に、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、ｃＡｂＬｙｓ３配列を下線で示し、タグを小文字で示し、アンバー終止コドンを＊で示し、タンパク質３をイタリック体で示す。）
配列番号１６：ＤｓｂＡ＿Ｎ２ｂＮｂ２０７ ｃＡｂＬｙｓ３Ｌ＿タグ、アンバー終止コドン（＊）＿タンパク質３ナノ２ボディ。
（ＤｓｂＡリーダー配列を先頭に、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、ｃＡｂＬｙｓ３配列を下線で示し、タグを小文字で示し、アンバー終止コドンを＊で示し、タンパク質３をイタリック体で示す。）
配列番号１７：Ｆ１８線毛アドヘシンＦｅｄＦ特異的ナノボディのレクチンドメインであるＮｂＦＥＤＦ９（ＰＤＢ４Ｗ６Ｙ）。
配列番号１８：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦＥＤＦ９Ｌナノ２ボディ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、ＮｂＦｅｄＦ９配列を下線で示す。）
配列番号１９：ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリ：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）Ｇ２７株ＨｏｐＱアドヘシンドメインタンパク質（ＰＤＢ５ＬＰ２）。
配列番号２０：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示す。）
配列番号２１：ｃＨｏｐＱ循環置換リンカーペプチド。
配列番号２２：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、メガボディｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号２３：ＤｓｂＡ－ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ。
配列番号２４：β２アドレナリン受容体－Ｇｓタンパク質複合体に特異的なナノボディであるＮｂ３５のＧβ／Ｇαサブユニット。
配列番号２５：ＭｂＮｂ３５ ｃＨｏｐＱ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎｂ３５βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号２６：β２アドレナリン受容体特異的ナノボディであるＮｂ８０。
配列番号２７：ＭｂＮｂ８０ ｃＨｏｐＱ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎｂ８０βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号２８：ＧＡＢＡＡ特異的ナノボディであるＮｂ２５。
配列番号２９：ＭｂＮｂ２５ ｃＨｏｐＱ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎｂ２５βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号３０～３３：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱランダムリンカー。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示す。）
配列番号３４～３７：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱランダムリンカー＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、メガボディｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７ランダムリンカーを太字で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号３８：大腸菌Ｙｇｊｋタンパク質（ＰＤＢ３ＷＦＳ）。
配列番号３９～４２：ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＱランダムリンカー。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、Ｙｇｊｋ配列を下線で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、６×Ｈｉｓ及びＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号４３：ｃＹｇｊｋ循環置換リンカーペプチド。
配列番号４４～４７：ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋランダムリンカー＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、メガボディｃＹｇｊｋＱＮｂＧＦＰ２０７ランダムリンカーライブラリーを太字で示し、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号４８：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣ３５７－Ｃ４２５。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示す。）
配列番号４９：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣ３５８－Ｃ４８８。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示す。）
配列番号５０：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣ３５９－Ｃ４９０。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示す。）
配列番号５１：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＣ１５－Ｃ５３４。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示す。）
配列番号５２：緑膿菌アズリン（ＰＤＢ２ＴＳＡ）Ｍ１２１Ａ突然変異体タンパク質。
配列番号５３～６０：ＭｂＮｂ２０７ ＡｚｕｒｉｎＱランダムリンカー。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、アズリン配列を下線で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーである。）
配列番号６１～６８：ＭｂＮｂ２０７ ＡｚｕｒｉｎＱ連結ライブラリー＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、メガボディアズリンＮｂＧＦＰ２０７ランダムリンカーライブラリーを太字で示し、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号６９：バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）ＳｕｓＢタンパク質（ＰＤＢ３ｗｆａ）。
配列番号７０～７７：ＭｂＮｂ２０７ ＳｕｓＢランダムリンカーメガボディライブラリータンパク質配列。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、ｓｕｓＢ配列を下線で示す。）
配列番号７８～８５：ホモ二量体メガボディＭｂＮｂ２０７ ＳｕｓＢランダムリンカー＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、ｓｕｓＢＮｂＧＦＰ２０７ランダムリンカーメガボディライブラリーを太字で示し、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号８６：大腸菌アシルキャリアタンパク質（ＰＤＢ１Ｔ８Ｋ）。
配列番号８７～９０：ナノツールＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰランダムリンカー。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、ＡＣＰ配列を下線で示す。）
配列番号９１～９４：ナノツールＭｂＮｂ２０７ ＡＣＰランダムリンカー＿Ａｇａ２ｐタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、ナノツールＡＣＰＮｂＧＦＰ２０７ランダムリンカーを太字で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ｃＭｙｃタグを二重下線で示す。）
配列番号９５：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５１＿Ａ７。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５１＿Ａ７のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号９６：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５２＿Ｄ１０。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５２＿Ｄ１０のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号９７：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５１＿Ｄ１０。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５１＿Ｄ１０のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号９８：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５１＿Ａ１０。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５１＿Ａ１０のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号９９：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５１＿Ｄ４。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５１＿Ｄ４のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号１００：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５２＿Ｃ１０。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５２＿Ｃ１０のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号１０１：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５１＿Ｈ６。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５１＿Ｈ６のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号１０２：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２５１＿Ａ５。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２５１＿Ａ５のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号１０３：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱＭＰ１２６３＿Ｃ９。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ナノボディＭＰ１２６３＿Ｃ９のβストランドＡ～Ｇを太字で示す。）
配列番号１０４～１０７：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ＿βターンＣＣ’＿ランダムリンカータンパク質配列。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡ～Ｃを二重下線で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎｂ２０７βストランドＣ’～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１０８～１１１：ＭｂＮｂ２０７ ｃＨｏｐＱ＿βターンＣＣ’＿ランダムリンカー＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、メガボディｃＨｏｐＱＮｂＧＦＰ２０７＿βターンＣＣ’＿ランダムリンカーライブラリーを太字で示し、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号１１２：デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）モノボディＮＳ１（ＰＤＢ５Ｅ５９由来）。
配列番号１１３～１１６：ＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ＿ランダムリンカー。
（ＮＳ１βストランドＡを二重下線で示し、波線の下線で示した（Ｘ）１─２は可変長（１又は２アミノ酸）で混合組成のショートペプチドリンカーであり、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＮＳ１βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１１７～１２０：ＭｂＮＳ１ ｃＨｏｐＱ＿ランダムリンカー＿Ａｇａ２ｐ＿ＡＣＰタンパク質配列。
（ａｐｐＳ４リーダー配列を先頭に、ｃＨｏｐＱＮＳ１＿ランダムリンカーメガボディライブラリーを太字で示し、フレキシブル（ＧＧＧＳ）ｎポリペプチドリンカーをイタリック体で示し、Ａｇａ２ｐタンパク質配列を下線で示し、ＡＣＰ配列を二重下線で示し、ｃＭｙｃタグを小文字で示す。）
配列番号１２１：ＮｂＧＦＰ２０７（ＤＮＡ）＝Ｎｂ２０７。
配列番号１２２：ＴＵ８９フォワードプライマー（ＳａｐＩ切断部位を下線で示す）（ＤＮＡ）。
配列番号１２３：ＥＰ２３０リバースプライマー（ＳａｐＩ切断部位を下線で示す）（ＤＮＡ）。
配列番号１２４：ＴＵ６４プライマー（ＤＮＡ）。
配列番号１２５：ＴＵ６５プライマー（ＤＮＡ）。
配列番号１２６：ＴＵ１３１プライマー（ＤＮＡ）。
配列番号１２７：ＴＵ１３２プライマー（ＤＮＡ）。
配列番号１２８：ＴＵ１３３プライマー（ＤＮＡ）。
配列番号１２９：ＴＵ１３４プライマー（ＤＮＡ）。
配列番号１３０：ＧＡＢＡＡ特異的ナノボディであるＮｂ３８。
配列番号１３１：ＭｂＮｂ３８ ｃＨｏｐＱ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎｂ３８βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１３２：ＨｏｐＱ特異的ナノボディであるＮｂ６０。
配列番号１３３：ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱ Ｎ２７７Ｋ Ｔ２７０Ｒ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎ２７７Ｋ、Ｔ２７０Ｒ突然変異を網掛けで示し、Ｎｂ６０βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１３４：ＭｂＮｂ６０ ｃ７ＨｏｐＱ Ｎ２７７Ｋ Ｔ２７０Ｒ Ｅ１９７Ｒ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、Ｎ２７７Ｋ、Ｔ２７０Ｒ、Ｅ１９７Ｒ突然変異を網掛けで示し、Ｎｂ６０βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１３５：ＭｂＮｂ６０ ｃＹｇｊｋＱＥ２。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、Ｙｇｊｋ配列を下線で示し、１アミノ酸リンカーを波線の下線で示し、６×Ｈｉｓ及びＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１３６：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１３７～１４０：夫々ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱ Ａ５、Ａ１２、Ｂ７及びＧ１０。
配列番号１４１：ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＥ２。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、網掛けで示したＹはショートペプチドリンカーであり、ＹｇｊＫ配列を下線で示し、循環置換リンカーをイタリック体で示し、ＹｇｊＫ配列を下線で示し、網掛けで示したＤはショートペプチドリンカーであり、６×Ｈｉｓ及びＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１４２～１４４：夫々ＭｂＮｂ２０７ ｃＹｇｊｋＡ２、Ｃ４及びＦ５。
配列番号１４５：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ１４－Ｃ５１２。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１４６：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ４０２－Ｃ４７４。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１４７：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ３１６－Ｃ４７２。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１４８：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ３１４－Ｃ４７２。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１４９：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ３１２－Ｃ４５３。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１５０：ＭｂＮｂ２０７ ｃ７ＨｏｐＱＣ３４９－Ｃ４５２。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＨｏｐＱ配列を下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＢ～Ｇを太字で示し、ナノボディを足場に連結するシステインを白抜きで示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１５１～１５８：夫々ＭｂＮｂ２０７ ＡｚｕｒｉｎＡ８、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｇ６、Ｂ８、Ｂ２及びＣ８。
配列番号１５９：ＭｂＮｂ２０７ ｃＰＰ７ｘ２Ａ３（ＭＰ１４０３＿Ａ３）。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、リンカーをイタリック体で示し、ＰＰ７配列を下線で示し、タグを小文字で示す。）
配列番号１６０～１６５：夫々ＭｂＮｂ２０７ ｃＰＰ７ｘ２Ｄ３、Ｇ５、Ｅ６、Ｄ７、Ａ９、Ｂ９（ＭＰ１４０３）。
配列番号１６６：アシネトバクター属ファージコートタンパク質ＮＰ＿０８５４７２．１であるＡＰ２０５。
配列番号１６７：ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ｘ２ＸＸ。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、ランダムリンカーをイタリック体で示し、網掛けで示したＸは（１アミノ酸の）ショートペプチドリンカーであり、ＡＰ２０５配列を下線で示し、タグを小文字で示す。）
配列番号１６８～１７２：夫々ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ｘ２Ｃ５、Ｂ７、Ｂ８、Ｄ３、Ａ４。
配列番号１７３：ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５ＸＸ。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、ランダムリンカーをイタリック体で示し、網掛けで示したＸは（１アミノ酸の）ショートペプチドリンカーであり、ＡＰ２０５配列を下線で示し、タグを小文字で示す。）
配列番号１７４～１８３：夫々ＭｂＮｂ２０７ ＡＰ２０５Ｃ１２、Ａ４、Ｅ８、Ｄ１０、Ａ３、Ａ１０、Ｄ１０、Ｄ２、Ｃ１０、Ｆ１。
配列番号１８４：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９Ｅ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、ＮｂＦｅｄＦ９配列を下線で示し、リンカー配列をイタリック体で示す。）
配列番号１８５：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９Ｑ。
（ＮｂＧＦＰ２０７βストランドＡを二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７を太字で示し、ＮｂＦｅｄＦ９配列を下線で示し、リンカー配列をイタリック体で示す。）
配列番号１８６：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９ＣＡ１４５４３（ＭＰ１４１１＿Ｂ３）。
配列番号１８７：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９ＣＡ１４５４４（ＭＰ１４１１＿Ｃ６）。
配列番号１８８：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９ＣＡ１４５４６（ＭＰ１４３８＿Ａ５）。
配列番号１８９：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９ＣＡ１４５４８（ＭＰ１４３８＿Ｂ１１）。
配列番号１９０：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９ＣＡ１４５５０（ＭＰ１４３８＿Ｄ２）。
配列番号１９１：Ｎ２ｂＮｂ２０７ ＮｂＦｅｄＦ９ＣＡ１４５５２（ＭＰ１４４０＿Ｃ５）。
配列番号１９２：結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ドデシンＲｖ１４９８Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：３２０５０４０）。
配列番号１９３：ＭｂＮｂ２０７ Ｄｏｄｅｃｉｎランダムリンカーメガボディ。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、網掛けで示したＸは混合組成の（１アミノ酸の）ショートペプチドリンカーであり、ドデシンＲｖ１４９８Ａタンパク質配列を下線で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号１９４：ＭｂＮｂ３５ ｃＹｇｊｋＥ２。
配列番号１９５：ＭｂＮｂ８０ ｃＹｇｊｋＥ２。
配列番号１９６：ＭｂＮｂ２５ ｃＹｇｊｋＥ２。
配列番号１９７：ＭｂＮｂ３８ ｃＹｇｊｋＥ２。
配列番号１９８：トロポミオシン関連キナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）特異的ナノボディであるＮｂ２２。
配列番号１９９：ＭｂＮｂ２２ ｃＹｇｊｋＥ２。
配列番号２００：バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）４ＱＹＢタンパク質（ＰＤＢ４ＱＹＢ）。
配列番号２０１～２０４：ＭｂＮｂ２０７ ４ＱＹＢランダムリンカー。
（ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１－２は混合組成の（１又は２アミノ酸の）ショートペプチドリンカーであり、４ＱＹＢタンパク質配列を下線で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号２０５～２０８：ＰｅｌＢ＿ＭｂＮｂ２０７ ４ＱＹＢランダムリンカー。
（ＰｅｌＢリーダー配列を二重下線で示し、ＮｂＧＦＰ２０７配列を太字で示し、（Ｘ）１－２は混合組成の（１又は２アミノ酸の）ショートペプチドリンカーであり、４ＱＹＢタンパク質配列を下線で示し、６×Ｈｉｓタグ、ＥＰＥＡタグを小文字で示す。）
配列番号２０９：親和性タグ（ＵＳ９５１８０８４Ｂ２）。
ＥＰＥＡ
配列番号２１０～２１３：図８Ｃからの配列。
参考文献

Claims (21)

  1. 機能的抗原結合性ドメインを足場タンパク質と融合した抗原結合性キメラタンパク質であって、
    前記抗原結合性ドメインがＶＨＨであり、
    前記足場タンパク質が、融合点を提供するためにその三次構造に少なくとも１個の露出領域を有し、
    前記足場タンパク質が、２箇所以上の直接融合又はリンカーによる融合を介して前記抗原結合性ドメインと融合され、かつ、前記抗原結合性ドメインの露出領域であるβターンに存在する１箇所以上の接近可能な部位で前記抗原結合性ドメインと融合され、
    前記１箇所以上の接近可能な部位が、抗原結合性ループ又はＣＤＲループ以外のものであり、かつ、
    前記足場タンパク質が、前記抗原結合性ドメインのβストランドＡ及びＢを繋ぐβターン、又は、前記抗原結合性ドメインのβストランドＣ及びＣ’を繋ぐβターン、に挿入されており、
    前記βストランドが、ＩＭＧＴ命名法に従って定義され、
    前記融合した足場タンパク質が、前記抗原結合性ドメインの前記１箇所以上の接近可能な部位において前記抗原結合性ドメインの一次トポロジーを分断する、
    前記抗原結合性キメラタンパク質。
  2. 前記足場タンパク質が、循環置換タンパク質である、請求項１に記載の抗原結合性キメラタンパク質。
  3. 前記足場タンパク質が、多量体足場やウイルス様粒子を形成するタンパク質等の対称性をもつタンパク質である、請求項１又は２に記載の抗原結合性キメラタンパク質。
  4. 前記抗原結合性ドメインと前記足場が、ジスルフィド結合によりさらに連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質。
  5. 前記足場タンパク質が、少なくとも３０ｋＤａの総分子量をもつ、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質。
  6. 前記足場タンパク質が、ＶＨＨ等の抗原結合性ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質。
  7. 前記足場タンパク質が、標識されたタンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質をコードする核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
  10. 酵母、ファージ、細菌又はウイルスにおける表面提示用としての請求項９に記載のベクター。
  11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質を含む、宿主細胞。
  12. 前記抗原結合性キメラタンパク質と前記標的抗原が、共発現される、請求項１１記載の宿主細胞。
  13. （ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質と、
    （ｉｉ）標的タンパク質と
    を含む複合体であって、前記標的タンパク質が、前記抗原結合性キメラタンパク質に特異的に結合している、前記複合体。
  14. 請求項１～７のいずれか一項に記載の第１の抗原結合性キメラタンパク質及び第２の抗原結合性キメラタンパク質を含む組成物であって、前記第２の抗原結合性キメラタンパク質の抗原結合性ドメインが、前記第１の抗原結合性キメラタンパク質の足場タンパク質と特異的に結合する、前記組成物。
  15. 請求項８に記載の核酸分子、請求項９又は１０に記載のベクター、請求項１１又は１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の複合体を含む、標的タンパク質の構造解析のための組成物。
  16. 前記構造解析が、単粒子クライオＥＭ又は結晶構造解析を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 標的分子の三次元構造の決定方法であって、
    （ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質若しくは請求項１４に記載の抗原結合性キメラタンパク質の組成物と、標的タンパク質とを準備して、複合体を形成する工程と、ここで、前記標的タンパク質は、前記抗原結合性キメラタンパク質に特異的に結合されている、
    又は請求項１３に記載の複合体を準備する工程と；
    （ｉｉ）構造解析に適した条件下で前記複合体を提示させる工程と、ここで、前記標的タンパク質の三次元構造が、高解像度で決定される工程と
    を含む、前記方法。
  18. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質、請求項８に記載の核酸分子、請求項９又は１０に記載のベクター、請求項１１又は１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の複合体を含む、診断用組成物。
  19. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質、請求項８に記載の核酸分子、請求項９又は１０に記載のベクター、請求項１１又は１２に記載の宿主細胞、又は請求項１３に記載の複合体を含むインビボイメージング用組成物。
  20. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質、又は請求項１４に記載の組成物を含む医薬組成物。
  21. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合性キメラタンパク質又は請求項１４に記載の組成物を含む、ウイルス様粒子。
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