CN115819599B - 一种利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法。具体通过筛选获得可提高Cablivi表达量的信号肽，结合优化的提取方法，即特定步骤、参数的周质空间提取步骤，来实现纳米抗体Cablivi在大肠杆菌系统中的高效表达。通过对18种信号肽进行筛选，获得DsbA信号肽可显著提高大肠杆菌系统纳米抗体Cablivi表达量，结合优化的渗透压冲击法对周质纳米抗体进行提取，提取的纳米抗体Cablivi产量可达17.6 mg/L。本发明的方法为后续纳米抗体Cablivi的大肠杆菌工业化生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法，特别涉及利用包含DsbA信号肽的重组大肠杆菌分泌表达，以及周质空间提取纳米抗体Cablivi。
背景技术
纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。Cablivi（CAPLACIZUMAB）是全球首个纳米抗体药物，也是首个专门治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（aTTP）的药物。然而现有技术缺少大规模发酵生产Cablivi纳米抗体的有效方法。
大肠杆菌作为传统生物学模式生物之一，因其易于培养，遗传背景透彻，是实验室和工业生产表达异源蛋白的首选宿主。考虑到工业应用上的简便和高效，目前多采用在大肠杆菌中表达纳米抗体的方法。大肠杆菌的细胞壁虽然较薄但结构复杂，外膜与细胞膜之间存在周质间隙。根据表达的部位，将外源蛋白表达形式分为三种：(1)胞外分泌表达；细菌将异源蛋白分泌到培养基中，但仅适用于小分子蛋白，且在实验室中不利于纯化；(2)胞质表达；其表达量较大，但细菌胞内为还原性环境，含有二硫键的蛋白质往往不能正确折叠并形成二硫键，最终容易大量形成无生物功能的包涵体；虽然有些研究从变性复性的角度尝试恢复包涵体蛋白质的活性，但其工艺繁琐复杂，复性率低，难以进行大批量的处理；(3)周质表达；周质空间呈现氧化性环境，当中含有促进蛋白质折叠的分子伴侣和帮助二硫键正确形成的酶，不仅利于蛋白质中二硫键的形成还可以增加蛋白质的溶解性；另外，在周质空间当中蛋白酶含量较低，杂蛋白少，不仅有利于异源蛋白的稳定存在和下游纯化，而且能减少异源蛋白对于宿主菌的毒性和代谢负担。当外源蛋白，尤其是抗体相关的蛋白分泌至大肠杆菌周质空间后，需要采用定向释放的技术对周质蛋白进行提取。在周质蛋白提取过程中，内膜破损会导致胞浆内核酸、脂质以及杂蛋白等物质释放出来，严重干扰后期目的蛋白的分离纯化。因此周质蛋白提取方法的关键是在不破坏大肠杆菌细胞的前提下，最终使大肠杆菌中内膜和外膜之间的蛋白定向释放至提取液中。至今尚无研究报道关于如何通过优化周质空间提取步骤，来提高大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi产量。
目前大约有40％蛋白质药物是通过大肠杆菌表达系统生产，提高外源蛋白在大肠杆菌中的表达量对于降低工业生产成本有较大的实际意义。采用不同信号肽的重组大肠杆菌，其目标蛋白表达量有明显不同。本领域亟需提供一种适用于大肠杆菌表达纳米抗体Cablivi的信号肽，以有利于高效表达。
现有技术公开了一些纳米抗体的发酵分泌表达方法。例如CN108103068B（公开日2021年5月4日）公开了一种制备抗癌胚抗原的纳米抗体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)扩增癌胚抗原纳米抗体的编码基因；(2)将步骤(1)获得的编码基因连接于表达载体pKLAC2；(3)将步骤(2)获得的载体转导入宿主细胞乳酸克鲁维酵母中；(4)诱导步骤(3)获得的宿主细胞，收获表达的抗癌胚抗原的纳米抗体。CN110256564A（公开日2019年9月20日）公开了，公开了一种PD-L1抗原免疫羊驼制备PD-L1纳米抗体的方法，设计合成引物2条，通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物换载酶切，目的片段与载体连接，转化，筛选克隆；蛋白鉴定表达；构建抗体库；选用M13噬菌体展示系统展示VHH抗体文库，该系统由pMECS噬菌粒载体、E .coli TG1和M13KO7辅助噬菌体组成。CN111748571B（公开日2022年5月3日）公开了一种将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法，通过基因工程的方法，对枯草芽孢杆菌进行改造，得到可用于生产纳米抗体的多功能稳定的平台，同时也可进一步将工程化后的枯草芽孢杆菌制为芽孢保存备用。可见，上述现有技术没有公开如何构建重组大肠杆菌用于高效分泌表达并提取纳米抗体，特别是针对纳米抗体Cablivi。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何实现纳米抗体Cablivi大肠杆菌的高效表达，采用的技术手段是筛选获得可提高Cablivi表达量的信号肽，结合优化的提取方法，即特定步骤、参数的周质空间纳米抗体Cablivi提取方法。通过对18种信号肽进行筛选，获得DsbA信号肽可显著提高纳米抗体Cablivi表达量，结合优化的渗透压冲击法对周质纳米抗体进行提取，其提取的纳米抗体Cablivi产量可达17.6 mg/L。
本发明的一方面，提供一种利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）构建包含纳米抗体Cablivi目标基因的重组大肠杆菌，包括以pET20b为表达载体，利用载体上自带的PelB信号肽构建携带编码纳米抗体Cablivi目标基因的重组表达载体，将重组表达载体转化至大肠杆菌，获得所述重组大肠杆菌；
（2）所述重组大肠杆菌的培养和诱导分泌表达，包括将所述重组大肠杆菌在16-37°C的温度条件下培养，随后在16-37°C的温度条件下诱导表达，加入IPTG诱导剂诱导纳米抗体Cablivi的分泌表达，IPTG终浓度为0.1-2 mM；
（3）提取周质空间纳米抗体Cablivi，包括步骤（2）诱导表达结束后，4℃ 5000-8000 g离心 10 min收集离心后的菌体；重悬细胞沉淀于30 mM Tris -HCl pH为8.0的20%（w/v）的蔗糖缓冲液中；加入EDTA，使其终浓度为 1 mM，pH 8；室温下缓慢搅拌 10 min；5000-8000 g 4℃离心 10 min收集细胞；去除上清液，加入0℃的 5 mM MgSO4 冰水溶液中彻底重悬沉淀细胞，在冰上缓慢搅拌悬液 10 min；此时周质蛋白被释放入缓冲液中，5000-8000 g 4℃离心 10 min收集细胞，上清液即为含有纳米抗体Cablivi的蛋白提取液。
进一步地，将步骤（1）中的PelB信号肽替换为PelB-D5信号肽、Kp-SP信号肽、OmpA信号肽、OmpF信号肽、Eol信号肽、PhoA信号肽、StII信号肽、PhoE信号肽、SP1信号肽、Lpp信号肽、TorA信号肽、Fdog信号肽、FhuD信号肽、OmpC信号肽、OmpT信号肽、DsbA信号肽、人工设计的信号肽中的一种。
进一步地，将步骤（1）中的PelB信号肽替换为DsbA信号肽。
进一步地，所述纳米抗体Cablivi的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，Cablivi的核酸DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。
进一步地，所述大肠杆菌为E. coli BL21(DE3)、Origami B(DE3)或Rosetta Blue(DE3)。
进一步地，所述PelB信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述PelB-D5信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.6所示；所述Kp-SP信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.8所示；所述OmpA信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.10所示；所述OmpF信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.12所示；所述Eol信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.14所示；所述PhoA信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQID NO.15所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.16所示；所述StII信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.18所示；所述PhoE信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.20所示；所述SP1信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.22所示；所述Lpp信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.24所示；所述TorA信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.26所示；所述Fdog信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.28所示；所述FhuD信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.30所示；所述OmpC信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.32所示；所述OmpT信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.34所示；所述DsbA信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，其核酸DNA序列如SEQ IDNO.36所示；所述人工设计的信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.38所示。
进一步地，步骤（2）中的培养温度条件为37℃，诱导温度条件为25℃，加入IPTG至终浓度为0.5 mM。
进一步地，步骤（2）包括以0.1-5％的接种量将培养好的种子接种至LB培养基中；采用的培养和诱导发酵条件为：发酵温度20-37℃、诱导培养8-12 h、诱导剂IPTG浓度10-100 mM、诱导时机OD600＝0.6-1.2；所述LB培养基包含10.0 g/L蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，10.0 g/L NaCl，pH 7.0。
进一步地，所述步骤（3）包括步骤（2）诱导表达结束后，4℃ 8000 g离心 10 min收集离心后的菌体；重悬细胞沉淀于30 mM Tris -HCl pH为8.0的20%的蔗糖缓冲液中，使重悬后的大肠杆菌工程菌的OD600为5.0；加入EDTA，使其终浓度为 1 mM，pH 8；加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌 10 分钟；8000 g 4℃离心 10 分钟收集细胞；去除上清液，加入上清液相同体积的0℃的 5 mM MgSO4 冰水溶液中彻底重悬沉淀细胞，在冰上缓慢搅拌悬液 10min；此时周质蛋白被释放到缓冲液中，8000 g 4℃离心 10 min收集细胞，提取的上清液即为含有纳米抗体Cablivi的蛋白提取液。
进一步地，所述方法还包含步骤（4）TCA法或过滤法浓缩纳米抗体Cablivi样品。
进一步地，所述步骤（4）TCA法浓缩纳米抗体Cablivi样品，包括取步骤（3）获得的待处理的样品，按照1：10 体积比加入100%TCA（W/V），震荡15 -30 s；置于冰上至少 15 分钟或置于4℃冰箱1 h；14000 g离心10 min，去除上清，保证上清去除干净；加入适量丙酮，混和，14000 g离心5 min，去除上清，此步骤重复一次；风干沉淀，至管中液体全部去除；加入PBS缓冲液溶解沉淀得到TCA沉淀后的纳米抗体Cablivi蛋白样品。
本发明提供的利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法具有以下优异的技术效果：
1. 本发明提供一种利用重组大肠杆菌高效分泌表达纳米抗体Cablivi的方法，采用更适合目标蛋白纳米抗体Cablivi表达的信号肽，以及特定的提取方法两方面改进来实现；
2. 本发明通过对PelB信号肽、PelB-D5信号肽、Kp-SP信号肽、OmpA信号肽、OmpF信号肽、Eol信号肽、PhoA信号肽、StII信号肽、PhoE信号肽、SP1信号肽、Lpp信号肽、TorA信号肽、Fdog信号肽、FhuD信号肽、OmpC信号肽、OmpT信号肽、DsbA信号肽、人工设计的信号肽，共计18种信号肽进行筛选，最终获得DsbA信号肽可显著提高大肠杆菌系统纳米抗体Cablivi表达量；
3. 本发明在大肠杆菌发酵分泌表达纳米抗体Cablivi后，采用特定步骤、参数的周质空间纳米抗体Cablivi的提取步骤，可提高纳米抗体Cablivi最终蛋白产量；
4. 利用本发明的方法，在摇瓶水平，结合优化的渗透压冲击法对周质纳米抗体进行提取，其提取的纳米抗体Cablivi产量可达17.6 mg/L；
5. 本发明解决了目前纳米抗体Cablivi分泌表达难，且胞内表达水平较低的问题，为后续实现纳米抗体Cablivi商业化大规模生产提供可行方案。
附图说明
图1为本发明大肠杆菌表达纳米抗体Cablivi质粒pET20b-PelB-Cablivi图谱。
图2A-图2B为本发明使用不同信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi表达结果电泳图，其中图2A为使用PelB，Kp-SP，PelB-D5，OmpA，OmpF，Eol，PhoA，StII信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi表达结果电泳图，电泳泳道从左至右依次为：marker，BL21对照，PelB，Kp-SP，PelB-D5，OmpA，OmpF，Eol，PhoA，StII；图2B为使用信号肽PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi表达结果电泳图，电泳泳道从左至右依次为：marker，BL21对照，PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP。
图3为本发明不同信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi蛋白相对表达量柱状图。
图4为本发明使用不同信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi周质蛋白提取后表达结果电泳图，电泳泳道从左至右依次为：marker，BL21对照，PelB，PelB-D5，Kp-SP，OmpA，OmpF，Eol，PhoA，StII，PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，Marker，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP，对照。
图5为本发明使用DsbA信号肽的BL21(DE3)/pET20b-DsbA-Cablivi工程菌提取纳米抗体Cablivi的蛋白凝胶灰度定量电泳图，电泳泳道从左至右依次为：marker，标准蛋白25，标准蛋白50，标准蛋白100，标准蛋白200，标准蛋白300，11-2-50μl，11-2-50μl，，11-2-100μl，11-2-100μl。
图6为本发明不同信号肽表达的纳米抗体Cablivi周质蛋白提取后大肠杆菌细胞内残留目标蛋白电泳图，电泳泳道从左至右依次为：Marker，BL21对照，PelB，PelB-D5，Kp-SP，OmpA，OmpF，Eol，BL21-对照-全菌-2μl，PhoA，marker，StII，PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP，Marker。
具体实施方式
实施例1 不同信号肽表达载体的构建
以合成含有Cablivi基因的质粒为模版，以Cablivi-F（序列如SEQ ID NO.39所示）和Cablivi-R（序列如SEQ ID NO.40所示）（具体见表1）引物扩增得到Cablivi基因(所述基因序列如SEQ ID NO.2所示，Cablivi蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将Cablivi基因克隆至质粒pET20b（厂家：奥诺基因；货号：HG-VYN0157），pET20b通过PCR方法进行线性化，以pET20b-F（序列如SEQ ID NO.41所示）和pET20b-R（序列如SEQ ID NO.42所示）（具体见表1）引物扩增得到线性化的载体；通过利用一步克隆的方法，获得pET20b-PelB-Cablivi载体，其中pelB信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.4所示，大肠杆菌表达纳米抗体Cablivi质粒pET20b-PelB-Cablivi图谱如图1所示。再分别以pET20b-PelB-Cablivi质粒为模版，交由公司（天霖生物有限公司, 无锡）合成如下相关信号肽，PelB-D5信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.6所示）、Kp-SP信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.8所示）、OmpA信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.10所示）、OmpF信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.12所示）、Eol信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.14所示）、PhoA信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.16所示）、StII信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.18所示）、PhoE信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.20所示）、SP1信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.22所示）、Lpp信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.24所示）、TorA信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.26所示）、Fdog信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.28所示）、FhuD信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.30所示）、OmpC信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.32所示）、OmpT信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.34所示）、DsbA信号肽（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.36所示）；人工设计的信号肽（Artificial SP）（蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，其核酸DNA序列如SEQ ID NO.38所示）。上述信号肽的具体序列见表2。将上述信号肽基因替换pET20b-PelB-Cablivi质粒中的PelB基因，获得相应重组表达载体。
表1 大肠杆菌表达质粒
表2 本发明使用抗体、信号肽的蛋白氨基酸序列以及基因序列
最终，分别得到pET20b-PelB-Cablivi、pET20b- PelB-D5-Cablivi、pET20b-Kp-SP-Cablivi、pET20b-OmpA-Cablivi、pET20b-OmpF-Cablivi、pET20b-Eol-Cablivi、pET20b-PhoA-Cablivi、pET20b-StII-Cablivi、pET20b-PhoE-CablivipET20b- SP1-Cablivi、pET20b-Lpp-Cablivi、pET20b-TorA-Cablivi、pET20b-Fdog-Cablivi、pET20b-FhuD-Cablivi、pET20b-OmpC-Cablivi、pET20b-OmpT-Cablivi、pET20b-DsbA-Cablivi、pET20b-Artificial SP-Cablivi共18个载体。所有载体经测序验证正确之后，分别转化至大肠杆菌表达宿主E. coli BL21(DE3)，具体条件为：取100 μL BL21(DE3)感受态细胞快速融化后置于冰上，向其中分别加入pET20b-PelB-Cablivi、pET20b-PelB-D5-Cablivi、pET20b-Kp-SP-Cablivi、pET20b-OmpA-Cablivi、pET20b-OmpF-Cablivi、pET20b-Eol-Cablivi、pET20b-PhoA-Cablivi、pET20b-StII-Cablivi、pET20b-PhoE-Cablivi、pET20b-SP1-Cablivi、pET20b-Lpp-Cablivi、pET20b-TorA-Cablivi、pET20b-Fdog-Cablivi、pET20b-FhuD-Cablivi、pET20b-OmpC-Cablivi、pET20b-OmpT-Cablivi、pET20b-DsbA-Cablivi、pET20b-Artificial SP-Cablivi共18个pET20b构建的表达质粒，冰浴30min后置于42℃水浴锅热激45-90 s，快速转移至冰上冷却2min。每管菌液加入500 μL LB培养基，于37℃，220 rpm摇床上活化培养1 h。取50 μL活化后的菌液，涂布于氨苄抗性的LB平板上。将平板置于37℃培养箱，倒置培养10-12 h。挑取单菌落交由测序公司(天霖生物)进行质粒测序，确认表达质粒的转入及目的蛋白基因序列的准确性。
实施例 2 大肠杆菌诱导周质表达纳米抗体Cablivi
重组大肠杆菌高效分泌表达纳米抗体Cablivi的方法，包括如下步骤：挑取少量甘油管保存的上述实施例1制备的重组大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET20b-PelB-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-PelB-D5-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-Kp-SP-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-OmpA-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-OmpF-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-Eol-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-PhoA-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-StII-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-PhoE-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b- SP1-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-Lpp-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-TorA-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-Fdog-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-FhuD-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-OmpC-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-OmpT-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b-DsbA-Cablivi、BL21(DE3)/pET20b- Artificial SP-Cablivi接种于LB培养基(含氨苄青霉素，终浓度为100μg/mL)，置于37℃摇床中过夜培养。将活化后的菌液按0.2%的体积比例接种至50 mL的LB培养基中(含氨苄青霉素，终浓度为100 μg/mL)，于37℃、220rpm条件下培养至OD600为2.0-3.0。将培养物离心收集菌体，菌体利用LB重悬，重悬菌液至OD600为1.0(含氨苄青霉素，终浓度为100 μg/mL)，往其中加入IPTG至终浓度为0.5 mM，于25℃、220 rpm诱导表达8-10 h后，即获得诱导表达后菌株。
诱导表达后大肠杆菌表达纳米抗体样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白LoadingBuffer （SDS，DTT和溴酚蓝）按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。点样，合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳40 min，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。使用不同信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi表达结果电泳图如图2A-图2B所示，其中图2A为使用PelB，Kp-SP，PelB-D5，OmpA，OmpF，Eol，PhoA，StII信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi表达结果电泳图，电泳泳道从左至右依次为：marker，BL21对照，PelB，Kp-SP，PelB-D5，OmpA，OmpF，Eol，PhoA，StII；图2B为使用信号肽PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi表达结果电泳图，电泳泳道从左至右依次为：marker，BL21对照，PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP。利用不同信号肽菌株诱导表达后均有纳米抗体表达，但表达量有区别，其相对蛋白表达量如图3所示，其中使用DsbA信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi相对蛋白表达量最高。
实施例3 大肠杆菌周质表达纳米抗体高效提取
采用渗透压冲击法提取实施例2大肠杆菌分泌表达的周质蛋白。具体步骤包括：通过离心收集实施例2诱导表达后的大肠杆菌表达工程菌。随后，重溶细胞沉淀于一定体积的30 mM Tris -HCl pH为8.0的 20%（质量体积比，w/v）的蔗糖中，使重溶后的大肠杆菌工程菌的OD600为5.0。加入一定体积的 0.5 M EDTA, pH 8(终浓度为 1mM)。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌 10 分钟。 8000 g 4℃离心 10 分钟收集细胞。去除上清液，加入上清液相同体积的0℃的 5 mM MgSO4 冰水溶液中彻底重溶沉淀，在冰上缓慢搅拌悬液 10 分钟。此时周质蛋白被释放到缓冲液中。8000 g 4℃离心 10 分钟收集细胞和提取的上清液，这时，目标蛋白提取到回收后的上清液中。
为了通过SDS-PAGE来对于提取周质蛋白进行检测，将利用TCA沉淀方法对提取的上清液（周质组分）进行浓缩，具体操作步骤为：将 1ml 上清液样品移入微离心管中。避免带入任何细胞沉淀。加入 100 µL（1/10 体积）的 100％TCA（三氯乙酸）（W/V）至 1ml 上清液中，振荡 15 秒后。置于冰上至少 15 分钟。 随后14000g 离心 10 分钟。 去除上清浓缩后的蛋白在底部有较少沉淀，去除上清液过程中特别注意不要将沉淀去除，随后，可以进一步离心，通过移液枪去除上清液，上清液如果去除不干净可能会影响沉淀蛋白质的复溶。随后加入 100 µL丙酮，混和，14000 g 离心 5 分钟洗涤沉淀两次，从沉淀中去除丙酮。风干沉淀，将管子打开至少 60 分钟，略微离心。待丙酮完全风干后，加入 100 µL 1×PBS（样品浓缩系数为 10，最终蛋白浓度为初始浓度的10倍）通过振荡混和或超声重溶，即得到浓缩后的蛋白重溶液。
周质空间提取的大肠杆菌表达纳米抗体样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白LoadingBuffer （SDS，DTT和溴酚蓝）按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。 点样，合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳40 min，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。使用不同信号肽的大肠杆菌表达的纳米抗体Cablivi周质蛋白提取后表达结果电泳图如图4所示，利用不同信号肽菌株诱导表达后均有纳米抗体Cablivi表达，图4电泳泳道从左至右依次为：marker，BL21对照，PelB，PelB-D5，Kp-SP，OmpA，OmpF，Eol，PhoA，StII，PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，Marker，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP，对照。其中，BL21(DE3)/pET20b-DsbA-Cablivi工程菌提取得到纳米抗体表达量最高，通过蛋白凝胶灰度定量，结果如图5所示，图5电泳泳道从左至右依次为：marker，标准蛋白25，标准蛋白50，标准蛋白100，标准蛋白200，标准蛋白300，11-2-50μl，11-2-50μl，11-2-100μl，11-2-100μl。经计算，采用DsbA信号肽的大肠杆菌提取的纳米抗体Cablivi产量可达17.6 mg/L。
实施例4 提取后大肠杆菌细胞内残留目标蛋白检测
通过离心收集实施例3提取完周质空间蛋白的大肠杆菌表达工程菌。随后，加入一定体积的 1×PBS（样品浓缩系数为10）通过振荡重悬后的菌体用于提取后胞内剩余纳米抗体的检测。
周质空间提取后大肠杆菌表达纳米抗体样品SDS-PAGE检测。样品与蛋白LoadingBuffer （SDS，DTT和溴酚蓝）按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。 缓慢拔除预制胶的梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。点样，合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳40 min，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3 min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。不同信号肽表达的纳米抗体Cablivi周质蛋白提取后大肠杆菌细胞内残留目标蛋白电泳图如图6所示，。利用不同信号肽菌株诱导表达后均有纳米抗体残留大肠杆菌细胞，其中，电泳泳道从左至右依次为：Marker，BL21对照，PelB，PelB-D5，Kp-SP，OmpA，OmpF，Eol，BL21-对照-全菌-2μl，PhoA，marker，StII，PhoE，SP1，Lpp，TorA，Fdog，FhuD，OmpC，OmpT，DsbA，Artificial SP，Marker。经分析，BL21(DE3)/pET20b- OmpA -Cablivi工程菌残余纳米抗体含量较高，表明OmpA信号肽不利于纳米抗体的分泌到周质空间内表达。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用重组大肠杆菌分泌表达纳米抗体Cablivi的方法，其特征在于，包含如下步骤：
（1）构建包含纳米抗体Cablivi目标基因的重组大肠杆菌：包括以pET20b为表达载体，使用FhuD信号肽替换载体上自带的PelB信号肽，构建携带编码纳米抗体Cablivi的目标基因的重组表达载体，将重组表达载体转化至大肠杆菌，获得所述重组大肠杆菌；
（2）所述重组大肠杆菌的培养和诱导分泌表达：包括将所述重组大肠杆菌在16-37°C的温度条件下培养，随后在16-37°C的温度条件下诱导表达，加入诱导剂IPTG诱导纳米抗体Cablivi的分泌表达，IPTG终浓度为0.1-2 mM；
（3）提取周质空间纳米抗体Cablivi：包括步骤（2）诱导表达结束后，4℃ 5000-8000 g离心 10 min收集离心后的菌体；重悬细胞沉淀于30 mM Tris –HCl、pH为8.0的20%（w/v）的蔗糖缓冲液中；加入EDTA，使其终浓度为 1 mM，pH 8；室温下缓慢搅拌10 min； 5000-8000g4℃离心 10 min收集细胞；去除上清液，加入0℃的 5 mM MgSO4 冰水溶液，彻底重悬沉淀细胞，在冰上缓慢搅拌悬液 10 min；此时周质蛋白被释放入缓冲液中，5000-8000 g 4℃离心 10 min收集细胞，上清液即为含有纳米抗体Cablivi的蛋白提取液；所述纳米抗体Cablivi的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述FhuD信号肽的蛋白氨基酸序列如SEQID NO.29所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米抗体Cablivi的核酸DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为E. coliBL21(DE3)、E. coliOrigami B(DE3)或E. coliRosetta Blue(DE3)中的一种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述FhuD信号肽的核酸DNA序列如SEQID NO.30所示。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的培养温度条件为37℃，诱导温度条件为25℃，加入IPTG至终浓度为0.5 mM。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）包括以0.1-5％的接种量将培养好的种子接种至LB培养基中；采用的培养和诱导发酵条件为：发酵温度20-37℃、诱导培养8-12 h、诱导剂IPTG浓度10-100 mM、诱导时机OD600＝0.6-1.2；所述LB培养基包含10.0g/L蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，10.0 g/L NaCl，pH 7.0。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）包括步骤（2）诱导表达结束后，4℃ 8000 g离心 10 min收集离心后的菌体；重悬细胞沉淀于30 mM Tris -HCl、pH为8.0的20%的蔗糖缓冲液中，使重悬后的大肠杆菌工程菌的OD600为5.0；加入EDTA，使其终浓度为 1 mM，pH 8；加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌 10 min；8000 g 4℃离心 10 min收集细胞；去除上清液，加入与上清液相同体积的0℃的 5 mM MgSO4 冰水溶液中彻底重悬沉淀细胞，在冰上缓慢搅拌悬液 10 min；此时周质蛋白被释放到缓冲液中，8000 g 4℃离心 10min收集细胞，提取的上清液即为含有纳米抗体Cablivi的蛋白提取液。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包含步骤（4）TCA法或过滤法浓缩纳米抗体Cablivi样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）TCA法浓缩纳米抗体Cablivi样品，包括取步骤（3）获得的待处理的样品，按照1：10 体积比加入100%TCA（W/V），震荡15-30s；置于冰上至少 15 分钟或置于4℃冰箱1 h；14000 g离心10 min，去除上清，保证上清去除干净；加入适量丙酮，混和，14000 g离心5 min，去除上清，此步骤重复一次；风干沉淀，至管中液体全部去除；加入PBS缓冲液溶解沉淀得到TCA沉淀后的纳米抗体Cablivi蛋白样品。
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Denomination of invention: A method for secreting the nanobody Cablivi using recombinant Escherichia coli Granted publication date: 20240116 Pledgee: Bank of China Limited by Share Ltd. Taizhou Gaogang sub branch Pledgor: Jiangsu Yao Hai biopharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2025980027659 |
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