JP7743531B2 - Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法に関する。

Ｌ－リジンは、人間や動物の体内で合成されない必須アミノ酸であって外部から供給されなければならず、一般的に、細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産される。Ｌ－リジンの生産は、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－リジン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－リジンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して、優れたＬ－リジン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法が開発されている。

韓国登録特許第１０－０８３８０３８号および第１０－２１３９８０６号によれば、Ｌ－リジンの生産に関連する酵素を含むタンパク質を暗号化する遺伝子の塩基配列またはアミノ酸配列を変更してその遺伝子の発現を増加させたり不要な遺伝子を除去することにより、Ｌ－リジン生産能を向上させることができる。また、韓国公開特許第１０－２０２０－００２６８８１号には、Ｌ－リジンの生産に関与する酵素を暗号化する遺伝子の発現を増加させるために、遺伝子の既存のプロモーターを強い活性を有するプロモーターに変更する方法を開示している。

このようにＬ－リジン生産能を増加させる多様な方法が開発されているが、Ｌ－リジンの生産に直接間接的に関連づけられた酵素、転写因子、輸送タンパク質などタンパク質の種類が数十余種に達するため、このようなタンパク質の活性変化によるＬ－リジン生産能の増加の有無に関して依然として多くの研究が必要なのが現状である。

韓国登録特許第１０－０８３８０３８号 韓国登録特許第１０－２１３９８０６号 韓国公開特許第１０－２０２０－００２６８８１号

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リジンの生産方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株を用いてＬ－リジン生産能が向上した新しい変異株を開発するために研究した結果、Ｌ－リジン生合成経路に関与するアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化するａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列のうち特定位置のアミノ酸を置換した場合、Ｌ－リジンの生産量が増加することを確認することにより、本発明を完成した。

本発明の一態様は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が強化されてＬ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を提供する。

本発明で使用された「アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ－ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、Ｌ－リジン生合成経路の三番目の段階に関与する酵素としてＮＡＤＰＨを用いて、アスパルチルホスフェート（４－ａｓｐａｒｔｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からアスパルテートセミアルデヒド（ａｓｐａｒｔａｔｅ ４－ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を生成する反応を触媒する酵素を意味する。

本発明の一具体例によれば、前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デザーティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ドサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ウテレキー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウム・スタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・パケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム・マリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウム・フレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・カニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウム・アムモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・レナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・カスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいし、これに限定されるものではない。

本発明で使用された「活性が強化」は、目的とする酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質を暗号化する遺伝子の発現が新たに導入されたり増大して野生型菌株または変形前の菌株に比べて発現量が増加することを意味する。このような活性の強化は、遺伝子を暗号化するヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物が持っているタンパク質の活性に比べて増加した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現増加または翻訳増加などで細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて高い場合、これらの組み合わせも含む。

本発明の一具体例によれば、前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性の強化は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子に位置特異的変異を誘発するものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるか、または配列番号２の塩基配列で表されるものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性の強化は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子のアミノ酸配列内の１０～１００番目のアミノ酸領域のうち１つ以上のアミノ酸が置換されたものであってもよい。

より具体的には、本発明における遺伝子変異は、１０～１００番目のアミノ酸領域のうち１個以上のアミノ酸、好ましくは２０～９０番目、３０～８０番目、３０～５０番目、または６０～８０番目のアミノ酸領域のうち１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸が連続的または非連続的に置換されたものであってもよい。

本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化するａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列において３５番目のサイトをアラニン（ａｌａｎｉｎｅ、Ａｌａ）からグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｌｙ）に、３９番目のサイトをセリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）からグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｇｌｕ）に、７８番目のサイトをアラニン（Ａｌａ）からバリン（ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）に置換して、ａｓｄ遺伝子の新しいアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号３のアミノ酸配列で表されるａｓｄ遺伝子を含むものであってもよい。

また、本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化するａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列において３５番目のサイトをアラニン（Ａｌａ）からグリシン（Ｇｌｙ）に、３８番目のサイトをアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ａｒｇ）からロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）に、３９番目のサイトをセリン（Ｓｅｒ）からグルタミン酸（Ｇｌｕ）に、７８番目のサイトをアラニン（Ａｌａ）からバリン（Ｖａｌ）に置換して、ａｓｄ遺伝子の新しいアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号５のアミノ酸配列で表されるａｓｄ遺伝子を含むものであってもよい。

本発明で使用された「生産能が向上した」は、親菌株に比べてＬ－リジンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になったり、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株または野生型から変異した菌株であってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記親菌株は、リジンの生産に関与する遺伝子（例えば、ｌｙｓＣ、ｚｗｆおよびｈｏｍ遺伝子）の配列に変異が誘発された変異株として、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２０２１年４月２日付の受託番号ＫＣＣＭ１２９６９Ｐとして寄託されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（以下、「コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株」という）であってもよい。

本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化するａｓｄ遺伝子のアミノ酸変異を含むことにより、親菌株に比べて増加したＬ－リジン生産能を示し、特に、親菌株に比べて、Ｌ－リジンの生産量が３％以上、具体的には３～４０％、さらに具体的には５～３０％増加して、菌株培養液１ｌあたり６５～９０ｇのＬ－リジンを生産することができ、好ましくは、６７～８０ｇのＬ－リジンを生産することができる。

本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、親菌株にアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子のアミノ酸配列が一部置換された変異体を含む組換えベクターにより実現できる。

本発明で使用された「一部」は、アミノ酸配列、塩基配列またはポリヌクレオチド配列の全部ではないことを意味し、１～３００個、好ましくは１～１００個、より好ましくは１～５０個であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明で使用された「変異体」は、Ｌ－リジンの生合成に関与するアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列内の１０～１００番目のアミノ酸領域のうち１つ以上のアミノ酸が置換された変異体を意味する。

本発明の一具体例によれば、前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列内の３５番目、３９番目および７８番目のアミノ酸が置換された変異体は、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号４の塩基配列を有するものであってもよい。

また、本発明の一具体例によれば、前記アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列内の３５番目、３８番目、３９番目および７８番目のアミノ酸が置換された変異体は、配列番号５のアミノ酸配列または配列番号６の塩基配列を有するものであってもよい。

本発明で使用された「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」は、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子の発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明で使用された「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムに関係なく複製可能であったり、ゲノムそのものに縫い込まれる。この時、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定の塩基配列である複製起点を含むことができる。

前記形質転換は、宿主細胞に応じて好適なベクター導入技術が選択されて目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせによって行われる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。

前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。

また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例として、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。

本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換え交差によってコリネバクテリウム属微生物のような宿主細胞内に置換される。

本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株であってもよい。

また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法を提供する。

前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば、培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加されるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常、２０℃～４５℃、例えば、２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続可能であり、例えば、１０～１６０時間であってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップは、培養方法に応じて当該分野にて公知の好適な方法を用いて培地から生産されたＬ－リジンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、リジンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。

本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－リジンを回収するステップは、Ｌ－リジンを精製する工程を含むことができる。

本発明によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化する遺伝子の発現を増加または強化させることにより、親菌株に比べてＬ－リジンの生産収率を向上させることができる。

本発明の一実施例によりａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列のうち３５番目のアミノ酸をアラニンからグリシンに、３９番目のアミノ酸をセリンからグルタミン酸に、７８番目のアミノ酸をアラニンからバリンに置換されたａｓｄ遺伝子を含むｐＣＧＩ（ａｓｄ Ａ３５Ｇ／Ｓ３９Ｅ／Ａ７８Ｖ）ベクターの構造を示す図である。 本発明の一実施例によりａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列のうち３５番目のアミノ酸をアラニンからグリシンに、３８番目のアミノ酸をアルギニンからロイシンに、３９番目のアミノ酸をセリンからグルタミン酸に、７８番目のアミノ酸をアラニンからバリンに置換されたａｓｄ遺伝子を含むｐＣＧＩ（ａｓｄ Ａ３５Ｇ／Ｒ３８Ｌ／Ｓ３９Ｅ／Ａ７８Ｖ）ベクターの構造を示す図である。

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるのではない。

実施例１．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（ＨＩＴ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ^ＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＨ６１８）を使用した。

前記コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇおよび牛肉（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）で３０℃の温度で培養した。

前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇおよび酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。

抗生剤カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）およびストレプトマイシンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用し、ＤＮＡシーケンシング分析はマクロジェン（株）に依頼して分析した。

１－１．組換えベクターの作製
菌株にリジン生合成経路に関与するアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性を強化してリジンの生産性を増加させるために、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼの強化を導入した。本実施例で用いた方法は、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを暗号化するａｓｄ遺伝子の発現を増加するために、ａｓｄ遺伝子に特異的な変異を誘発した。ａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列のうち３５番目のアミノ酸をアラニンからグリシンに、３９番目のアミノ酸をセリンからグルタミン酸に、７８番目のアミノ酸をアラニンからバリンに置換し、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノム上でａｓｄ遺伝子３５番目、３９番目、７８番目のアミノ酸を含む部分を中心に左アーム１０００ｂｐの部分と右アーム１７８５ｂｐの部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐＣＧＩ（文献［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０］参照）にクローニングした。前記プラスミドをｐＣＧＩ（ａｓｄ Ａ３５Ｇ／Ｓ３９Ｅ／Ａ７８Ｖ）と名付けた（図１参照）。前記プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表１のプライマーを用いた。

以上のプライマーを用いて、以下の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１ユニットの存在下で３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲを行う条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。

このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の組換えに使用した。

前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によりｐＣＧＩベクターに挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａから選別した。染色体の遺伝子塩基置換（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、それぞれ断片の遺伝子を個別増幅して、オーバーラップＰＣＲで目的ＤＮＡ断片を製造した。遺伝子組換え時のＰＣＲ増幅酵素としてはＥｘ Ｔａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用い、各種制限酵素およびＤＮＡ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素はＮＥＢ製品を使用し、供給されたバッファーおよびプロトコルによって使用した。

１－２．変異株の製造
前記ｐＣＧＩ（ａｓｄ Ａ３５Ｇ／Ｓ３９Ｅ／Ａ７８Ｖ）ベクターを用いて変異菌株のＤＳ４菌株を製造した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上となるように用意して、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株に電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］参照）を用いて１次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株をカナマイシンが２０μｇ／μｌ含まれるＣＭ－寒天プレートに塗抹してコロニーを分離した後、ゲノム上の誘導した位置に適切に挿入されたかをＰＣＲおよび塩基配列分析により確認した。このように分離された菌株を、再度２次組換えを誘導するために、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）を含むＣＭ－寒天液体培地に接種し、一晩以上培養して同一濃度のストレプトマイシンを含む寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニー中でカナマイシンに対する耐性の有無を確認した後、抗生剤耐性のない菌株のうちａｓｄ遺伝子に変異が導入されたかを塩基配列分析により確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］参照）。最終的に変異ａｓｄ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ４）を取得した。

実施例２．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
ａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列のうち３５番目のアミノ酸をアラニンからグリシンに、３８番目のアミノ酸をアルギニンからロイシンに、３９番目のアミノ酸をセリンからグルタミン酸に、７８番目のアミノ酸をアラニンからバリンに置換したことを除けば、実施例１と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造した。
ここで、プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに前記表１のプライマーを用い、作製されたプラスミドｐＣＧＩ（ａｓｄ Ａ３５Ｇ／Ｒ３８Ｌ／Ｓ３９Ｅ／Ａ７８Ｖ）ベクター（図２参照）を用いて変異菌株のＤＳ４－１菌株を製造した。最終的に変異ａｓｄ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ４－１）を取得した。

実験例１．変異株のＬ－リジンの生産性の比較
親菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株と、実施例１および２で製造されたリジン生産変異株のＤＳ４およびＤＳ４－１菌株のＬ－リジンの生産性を比較した。

下記表２のような組成を有するリジン培地１０ｍｌを含む１００ｍｌフラスコにそれぞれの菌株をそれぞれ接種し、３０℃で４８時間、１８０ｒｐｍの条件で振盪培養した。培養終了後、リジン分析はＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ、日本）でＬ－リジンの生産量を測定し、その結果を表３に示した。

前記表３に示しているように、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＳ４およびＤＳ４－１は、リジン生合成経路の強化のために、ａｓｄ遺伝子のアミノ酸配列の特定位置（３５番目、３９番目および７８番目のアミノ酸、または３５番目、３８番目、３９番目および７８番目のアミノ酸）が最適なアミノ酸に置換されることにより、親菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株に比べて、Ｌ－リジンの生産性がそれぞれ約１０．０％、５．７％増加したことが確認された。このような結果を通して、ａｓｄ遺伝子の発現強化がリジン前駆体の供給を強化することにより、菌株のＬ－リジン生産能を向上させることが分かった。

以上、本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

Claims (2)

1. 配列番号３または５で表されるアミノ酸配列を含むアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体を含む、Ｌ－リジンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）。
2. ａ）請求項１に記載の変異株を培地で培養するステップと、
   ｂ）前記変異株または前記変異株が培養された前記培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法。