JP7616671B2 - 改善された安定性を有するｔｎｆｒ２アゴニスト - Google Patents

Description

本発明は、ＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の３つのＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）からなるポリペプチドに関し、ここでＣ末端およびＮ末端の基準点はコンセンサス配列によって規定されている。ＴＨＤは、ＴＨＤまたはそのバリアントの短い区間のさらなるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸ならびにペプチドリンカーによって連結されている。これらのポリペプチドは改善された安定性を有する。さらに、本発明は、いくつかの本発明のポリペプチドを含むポリペプチド多量体に関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチドまたはポリペプチド多量体をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、核酸分子またはベクターを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、医薬としての使用のための、または過剰増殖性障害、炎症性障害もしくは代謝性障害の予防もしくは処置における使用のための、前記ポリペプチド、ポリペプチド多量体、核酸分子またはベクターに関する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、様々な機能を有する構造的に関連したサイトカインのファミリーである。ＴＮＦリガンドファミリーを規定する構造的な特徴はカルボキシ末端のＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）であり、これは保存されたゼリーロール様の折り畳み三次構造をとる２つのスタックされたβプリーツシートで構成されている（Bodmer et al., 2000, Trends Biochem. Sci. 27, 19-26; Fesik, 2000, Cell 103, 273-282; Locksley et al., 2001, Cell 104, 487-501）。この構造組成はＴＨＤ単量体の三量体への自己会合をもたらし、受容体の結合に必要である。ＴＨＤのカルボキシ末端への局在化のために、膜貫通型および可溶性の両方のＴＮＦリガンドが三量体を構築する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）自体は、多面的な機能を有する多機能性サイトカインである。ＴＮＦは免疫系の主要制御因子であり、炎症および免疫の開始および調整に重要な役割を果たしている。スーパーファミリーのほとんどのリガンドと同様に、ＴＮＦは三量体の２型膜貫通タンパク質（ｔｍＴＮＦ）として合成され、これは可溶性の循環性ＴＮＦホモ三量体（ｓＴＮＦ）にタンパク質分解され得る。興味深いことに、ｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦは、２つの異なるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）であるＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を活性化する能力が異なっている。ＴＮＦＲ１はｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方で活性化されるが、ＴＮＦＲ２はｔｍＴＮＦに依存して頑強に活性化される（Muhlenbeck et al., 2000, J. Biol., Chem. 275, 32208-32213; Wajant et al., 2001, Oncogene 20, 4101-4106）。

ＴＮＦの発現およびシグナル伝達の調節解除は慢性炎症を引き起こし得、自己免疫疾患の発症および組織損傷をもたらし得る（Fischer et al., 2015, Antibodies 4, 48-70; Kalliolias & Ivashkiv, 2016, Nat. Rev. Rheumatol. 12, 49-62）。実際に、ＴＮＦレベルの上昇はいくつかの炎症性疾患（関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬および炎症性腸疾患など）に関連している：ＴＮＦを中和する治療物質は、これらの疾患の処置に使用され成功している（Monaco et al., 2015, Int. Immunol. 27, 55-62）。しかし、驚くべきことに、多発性硬化症患者におけるｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方を遮断する抗ＴＮＦ薬を用いた臨床試験は疾患の増悪をもたらし、中止せざるを得なかった。さらに、承認されたＴＮＦ阻害剤は、日和見感染症、結核の再活性化、自己免疫疾患の発症、リンパ腫の発症に対する感受性の上昇、および脱髄性疾患を含む重篤な副作用を引き起こし得る（Fischer et al., 2015, Antibodies 4, 48-70; Monaco et al., 2015, Int. Immunol. 27, 55-62）。これらの望ましくない臨床反応は、２つの受容体を媒介したＴＮＦの種々の生物学的作用に依存している可能性が高い。

近年の研究は、ＴＮＦ受容体が反対の生物学的反応を誘導することを明らかにした。ＴＮＦＲ１シグナル伝達は炎症および組織変性を促進するが、ＴＮＦＲ２は免疫抑制ならびに組織の恒常性および再生に寄与する（Probert et al., 2015, Neuroscience 302, 2-22）。したがって、ＴＮＦシステムを標的とした次世代の治療手段が開発され、これはｓＴＮＦ－ＴＮＦＲ１の相互作用またはシグナル伝達の遮断、およびＴＮＦＲ２の選択的な活性化を含む（Shibata et al., 2009, Biomaterials 30, 6638-6647; Steed et al., 2003, Science 301, 1895-1898; Dong et al., 2016, PNAS 113, 12304-12309）。ＴＮＦＲ２を媒介した免疫抑制活性は、自己免疫疾患における潜在的な治療応用のために特に関心の対象となっている。ＴＮＦＲ２の免疫抑制性は、免疫応答を抑制するように機能する高度に特殊化されたＴ細胞の亜集団であるＴｒｅｇ細胞の増殖および安定化における顕著な役割に起因する（Chen et al., 2007, J. Immunol. 179, 154-161; Chen et al., 2013, J. Immunol. 190, 1076-1084）。一般的な見解によると、Ｔｒｅｇ細胞は免疫系の自己寛容を制御し、自己免疫疾患の発症の予防を助ける。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞に加えて、制御性活性を有するさらなるＴ細胞亜集団（すなわち、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞）が存在する。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞と同様に、最も強力なＣＤ８＋サプレッサーはＴＮＦＲ２の発現によって特徴付けられる（Ablamunits et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40, 2891-2901）。

Ｔｒｅｇ細胞の増殖および機能に対するＴＮＦＲ２の選択的な活性化の影響を精査するために、本発明者らは最近、ｔｍＴＮＦの活性を模倣した可溶性の多価ＴＮＦＲ２選択的ＴＮＦ誘導体を開発した。これらの分子は、ＴＮＦＲ２に対する選択性をもたらすＴＮＦのＴＨＤにおける変異を組み合わせたＴＮＦの一本鎖誘導体（ｓｃＴＮＦ）（Krippner-Heidenreich et al., 2008, J. Immunol. 180, 8176-8183）、およびｓｃＴＮＦの二量体化または多量体化モジュールへの融合に基づく。これらのモジュールには、九価の分子（最大で９個のＴＮＦＲ２の結合）をもたらす三量体化するテネイシンドメイン（Fischer et al., 2011, PLoS ONE 6:e27621; Fischer et al., 2014, Glia 62, 272-283）、ＩｇＥの二量体化する重鎖ドメイン２（ＥＨＤ２）（Dong et al., 2016, PNAS 113, 12304-12309）、ｐ５３のホモ四量体化ドメイン、ＧＣＮ４（Fischer et al., 2017, Sci. Rep. 7, 6607）、ＶＡＳＰ、およびｓｃＴＮＦの免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端およびＣ末端との融合物が含まれる（PCT/EP2018/058786）。

これらすべての研究において、本発明者らは、ＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）を含むアミノ酸８０～２３３で構成されるＴＮＦサブユニット（ドメイン）を適用し、３つのサブユニットを１２または１６残基の柔軟なリンカーで連結した（Ｌ１：（ＧＧＧＳ）_３（配列番号５３）；Ｌ２：（ＧＧＧＳ）_４（配列番号５４）；Krippner-Heidenreich et al., 2008, J. Immunol. 180, 8176-8183）。その後の研究では、リンカーを、第１および第２のＴＨＤのＣ末端を第２および第３のＴＨＤのＮ末端にそれぞれ連結させるＧＧＧＧＳ（配列番号２６）配列に縮小させた（すべてのＴＨＤは、ヒトＴＮＦのａａ８０～２３３で構成される）（Fischer et al., 2011, PLoS ONE 6:e27621）。

さらに、ヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲ２選択的ｓｃＴＮＦ Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ）（Loetscher et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 26350-26357）、または３つのサブユニットすべてに対応する置換を有する（Krippner-Heidenreich et al., 2008, J. Immunol. 180, 8176-8183）ヒトＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲ１選択的ｓｃＴＮＦ Ｒ３２Ｗ／Ｓ８６Ｔ）（van Ostade et al., 1993, Nature 361, 266-269）に対する受容体選択性を与える変異を導入した。また、ＴＮＦＲ２への選択的な結合のために、機能的に対応する変異（Ｄ２２１Ｎ／Ａ２２３Ｒ）をマウスＴＮＦに導入した（Fischer et al., 2014, Glia 62, 272-283）。変異は、３つのＴＨＤサブユニットのうち１つまたは２つのみに導入され得る（Boschert et al., 2010, Cell Signal. 22, 1088-1096）。

ＴＮＦＲ２選択的なＴＮＦ変異タンパク質を、ＴＮＦ変異体のライブラリーからファージディスプレイによって選択した（Abe et al., 2011, Biomaterials 32, 5498-5504; Ando et al., 2016, Biochem. Biophys. Reports 7, 309-315）。さらに、ＴＨＤ界面の２つの残基をシステイン（Ｓ９５Ｃ／Ｇ１４８Ｃ）に変異させて内部共有結合架橋を導入することによって、改善されたＴＮＦＲ２シグナル伝達を有するＴＮＦ分子を生成した（Ban et al., 2015, Mol. Cell. Ther. 3:7）。

以前に、本発明者らは、オリゴマー化し、共有結合により安定化したＴＮＦＲ２選択的なｓｃＴＮＦがｔｍＴＮＦを模倣しており、ＴＮＦＲ２を効率的に活性化することを実証した。これらのＴＮＦＲ２選択的なＴＮＦ変異タンパク質は、抗炎症反応を誘導し、実験的関節炎の症状を軽減すること、神経細胞およびオリゴデンドロサイトを酸化ストレスから救助すること、ならびにＮＭＤＡ誘発性急性神経変性のマウスモデルにおいて保護的であることが示された（Fischer et al., 2011, PLoS One 6, e27621; Maier et al., 2013, Biochem. Biophys. Res. Commun. 440, 336-341; Fischer et al., 2018, Arthritis Reumatol. 70, 722-735; Dong et al., 2016, PNAS 113, 12304-12309）。

最近、本発明者らは、ＴＮＦスーパーファミリーの一本鎖メンバーの安定性が、３つのサブユニット間のリンカーを短縮し、サブユニット配列を最小のＴＨＤドメインに縮小することによって改善され得ることを実証した（WO 2016/146818）。

本発明者らは、ｓｃＴＮＦにこの戦略（すなわち、第１／第２ドメインのＣ末端と第２／第３ドメインのＮ末端との直接的な連結）を適用することにより、安定性はＴＨＤドメインを位置（８４－２３３）に短縮することによって向上するが、さらなる縮小（８６－２３３）は安定性を低下させたことを見出した。互いに直接連結されたａａ８４－２３３によって形成されるＴＨＤを有するｓｃＴＮＦ誘導体は、動的光散乱法によって決定された熱安定性の１０℃の上昇を示したが、約６倍の生理活性の低下を示した。本発明によって、驚くべきことに、リンカーを伴わずに直接連結された３つのＴＨＤ（ａａ８０－２３３）または４アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧ；配列番号１６）で連結された３つの短縮されたＴＨＤ（ａａ８５－２３３）のいずれかで構成された分子について、ＧＧＧＧＳ（配列番号２６）リンカーで連結された３つのＴＨＤ（ａａ８０－２３３）で構成された参照ｓｃＴＮＦ分子と比較して、生理活性の完全な保持下で熱安定性の上昇（６７℃対６２℃）が観察されたことが示された。

第１の態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の３つのペプチドＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）からなる結合ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、第１および第２のＴＨＤのＣ末端（これは、それぞれの場合においてＣ末端コンセンサス配列Ｖ－Ｆ／Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ａ／Ｉ－Ｘ_１（配列番号１）によって規定される）は、第２および第３のＴＨＤのＮ末端（これは、それぞれの場合においてＮ末端コンセンサス配列Ｐ－Ｖ／Ａ－Ａ－Ｈ－Ｖ／Ｌ（配列番号２）によって規定される）にペプチドＸ_ａ（これは、それぞれの場合において独立して選択され、９～１２アミノ酸、好ましくは９～１１、より好ましくは９～１０の長さを有する）を介してそれぞれ連結しており、好ましくはＸ_ａはアミノ酸配列Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）を含まず；Ｘ_１は非極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦおよびＩからなる群から選択される。

第２の態様において、本発明は、以下である本発明の第１の態様に記載の少なくとも２つのポリペプチドを含むポリペプチド多量体を提供する、
（ａ）ともに連結されており、１～３０アミノ酸、好ましくは７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって好ましくはともに連結されているか；または
（ｂ）（好ましくは、多量体化ドメイン、血清タンパク質、サイトカイン、ターゲティング部分または毒素からなる群から選択される）タンパク質、好ましくは多量体化ドメインに連結されている；
ここで任意で、前記ポリペプチドは、１～３０アミノ酸、好ましくは７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって前記タンパク質に連結されている。

第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたは本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体をコードする核酸分子を提供する。

第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸分子をコードするベクターを提供する。

第５の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の第１の態様に記載のポリペプチド、本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体、本発明の第３の態様に記載の核酸、または本発明の第４の態様に記載のベクターを提供する。

第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチド、本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体、本発明の第３の態様に記載の核酸、または本発明の第４の態様に記載のベクターを活性物質として含む医薬組成物を提供する。

第７の態様において、本発明は、過剰増殖性障害または炎症性障害（好ましくは、がんまたは血液系の悪性腫瘍）、自己免疫障害および代謝性疾患、循環器疾患、神経障害性疾患、ならびに神経傷害の診断、予防または処置における使用のための、本発明の第１の態様に記載のポリペプチド、本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体、本発明の第３の態様に記載の核酸、本発明の第４の態様に記載のベクター、または本発明の第５の態様に記載の医薬組成物を提供する。

以下において本明細書に含まれる図面の内容を記載する。この文脈では、上記および／または下記の発明の詳細な説明も参照のこと。

本発明のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体タンパク質およびその二量体化した複合体の模式的な表現。（Ａ）ｓｃＴＮＦ_Ｒ２およびその二量体複合体ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃの模式的なポリペプチド鎖。ＴＮＦ_Ｒ２サブユニットをペプチドリンカーＬ１を伴って、またはペプチドリンカーを伴わずに遺伝的に融合させ、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２を得た。二量体化ドメインＦｃを、ペプチドリンカーＬ２を用いてｓｃＴＮＦ_Ｒ２のＣ末端に遺伝的に融合させた。（Ｂ）ｓｃＴＮＦ_Ｒ２およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃの三次／四次構造の模式図。（Ｃ）（１）ポリペプチドおよび（３）～（６）ポリペプチド多量体の例の実施態様の模式図。任意で、ポリペプチドはさらなるモジュール２を含み（６）、これは例えば臓器もしくは組織特異的な送達および／または組織関門（血液脳関門など）を介した輸送を可能にする。（２）はリンカーポリペプチドＸ_ａの模式図を示す。（Ｄ）上段のパネル：本発明による例示的なポリペプチド（１２７、１３９および１３８）および参照ポリペプチド。下段のパネル：本発明の例示的なポリペプチド多量体（７４２、７４４）および参照ポリペプチド多量体。

本発明のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体タンパク質およびその二量体化した複合体の比較ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。融合タンパク質をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において産生させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。（Ａ）ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体を非還元条件下および還元条件下において１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色した。１、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１１８）；２、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１２７）；３、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１２９）；４、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１３０）；５、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１３１）；６、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１３８）；７、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１３９）、Ｍ、分子量マーカー。（Ｂ）ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体を非還元条件下および還元条件下において１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色した。１、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１２７）－Ｆｃ（Δａｂ）７４２；２、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１２９）－Ｆｃ（Δａｂ）７４３；３、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１３９）－Ｆｃ（Δａｂ）７４４；４、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１１８）－Ｆｃ（Δａｂ）７４５；Ｍ、分子量マーカー。

本発明のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体およびその二量体化した複合体の天然構造。タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲ、７．８×３００ｍｍカラム（Tosoh Bioscience）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。使用した標準タンパク質の位置を図に示す。

本発明のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体およびその二量体化した複合体の熱安定性。タンパク質を、動的光散乱法によってその変性温度について分析した。検出された融点（凝集点）を点線で示す。

Ｋｙｍ－１細胞に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体のインビトロでの生理活性。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２変異体を、Ｋｙｍ－１細胞に対する生理活性について細胞死誘導に関して分析した。機構的には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体によるＴＮＦＲ２の活性化（これは抗体８０Ｍ２によるＴＮＦＲ２の架橋を必要とする）は三量体ＴＮＦの発現をもたらし、これは次にＴＮＦＲ１の活性化を介してアポトーシスによる細胞死を誘導する。Ｋｙｍ－１細胞を段階希釈および精製されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２の存在下で２４時間培養し、次いでクリスタルバイオレット染色を用いて細胞生存率を測定した。さらに、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体とともにインキュベートする前に、Ｋｙｍ－１細胞上のＴＮＦ受容体２分子を８０Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ）で架橋した（ｎ＝１）。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＴＮＦ－Ｒ２への結合。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＴＮＦ－Ｒ２－Ｆｃ（エタネルセプト）への結合をＥＬＩＳＡで試験した。比較のために、最先端の分子であるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４５の結合曲線を、本発明のタンパク質であるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４２、７４３および７４４と組み合わせて個々の図にプロットした（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。

ＭＥＦ－ＴＮＦ－Ｒ２に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＴＮＦ－Ｒ２選択的な結合。ヒトＴＮＦ－Ｒ２（ＭＥＦ－ＴＮＦ－Ｒ２）またはヒトＴＮＦ－Ｒ１（ＭＥＦ－ＴＮＦ－Ｒ１）のいずれかを安定に遺伝子導入したマウス胎仔線維芽細胞を、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の結合についてフローサイトメトリーによって試験した。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体はＭＥＦ－ＴＮＦ－Ｒ２に選択的に結合し、ＭＥＦ－ＴＮＦ－Ｒ１への結合は検出できなかった（ｎ＝１）。

Ｋｙｍ－１細胞に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のインビトロでの生理活性。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のインビトロでの生理活性を、Ｋｙｍ－１細胞に対して分析した。細胞を段階希釈および精製されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の存在下で２４時間培養し、次いでクリスタルバイオレット染色を用いて細胞生存率を測定した（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体によるＮＦ－κＢの活性化。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体によるインビトロでのＮＦ－κＢ活性化を、ヒトＴＮＦ受容体２を安定に遺伝子導入したＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２）においてルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて分析した。実験および対照のレポータープラスミドでの遺伝子導入の１６時間後に、連続的に滴定したｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体を用いて細胞を６時間刺激し、次いで細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定した（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝４）。

ヒト血漿中におけるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の安定性。３７℃の５０％ヒト血漿中での０日間（対照）、３日間または８日間のインキュベーション後のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の完全性を、フローサイトメトリーにおいてＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞に結合する能力によって試験した。無傷のタンパク質の割合（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝４）を、インキュベートしていない対照（１００％）に正規化したＥＣ_５０値の逆数から算出した。統計解析を、二元配置分散分析およびダネットの事後検定によって行った。結果を、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．＝有意差なしとしてまとめた。

実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントの比較ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。融合タンパク質をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において産生させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２変異体を非還元条件下（Ｂ）および還元条件下（Ａ）において１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色した。Ｍ、分子量マーカー。

実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃタンパク質の比較ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。融合タンパク質をＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において産生させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ変異体を非還元条件下および還元条件下において１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クーマシーで染色した。Ｍ、分子量マーカー。

実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃタンパク質の天然構造。タンパク質を、ＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲ、７．８×３００ｍｍカラム（Tosoh Bioscience）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。使用した標準タンパク質の位置を図に示す。

実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントの熱安定性。タンパク質を、動的光散乱法によってその変性温度について分析した。検出された融点（凝集点）を点線で示す（ｎ＝２）。

実施例１１の二量体ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃタンパク質の熱安定性。タンパク質を、動的光散乱法によってその変性温度について分析した。検出された融点（凝集点）を点線で示す（ｎ＝１）。

実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントのＴＮＦ－Ｒ２への結合。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体タンパク質のＴＮＦ－Ｒ２－Ｆｃ（エタネルセプト）への結合をＥＬＩＳＡで試験した（平均値±技術的重複の範囲、ｎ＝１）。

実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃタンパク質のＴＮＦ－Ｒ２への結合。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ変異体タンパク質のＴＮＦ－Ｒ２－Ｆｃ（エタネルセプト）への結合をＥＬＩＳＡで試験した（平均値±技術的重複の範囲、ｎ＝１－２）。

Ｋｙｍ－１細胞に対する実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントのインビトロでの生理活性。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体を、Ｋｙｍ－１細胞に対する生理活性について細胞死誘導に関して分析した。機構的には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体によるＴＮＦＲ２の活性化（これは抗体８０Ｍ２によるＴＮＦＲ２の架橋を必要とする）は三量体ＴＮＦの発現をもたらし、これは次にＴＮＦＲ１の活性化を介してアポトーシスによる細胞死を誘導する。Ｋｙｍ－１細胞を段階希釈および精製されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２の存在下で２４時間培養し、次いでクリスタルバイオレット染色を用いて細胞生存率を測定した。さらに、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体とともにインキュベートする前に、Ｋｙｍ－１細胞上のＴＮＦ受容体２分子を８０Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ）で架橋した（ｎ＝３－８±ＳＤ）。

Ｋｙｍ－１細胞に対する実施例１１の二量体ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃタンパク質のインビトロでの生理活性。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２Ｆｃ変異体を、Ｋｙｍ－１細胞に対する生理活性について細胞死誘導に関して分析した。機構的には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ変異体によるＴＮＦＲ２の活性化は三量体ＴＮＦの発現をもたらし、これは次にＴＮＦＲ１の活性化を介してアポトーシスによる細胞死を誘導する。Ｋｙｍ－１細胞を段階希釈および精製されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２の存在下で２４時間培養し、次いでクリスタルバイオレット染色を用いて細胞生存率を測定した。さらに、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体とともにインキュベートする前に、Ｋｙｍ－１細胞上のＴＮＦ受容体２分子を８０Ｍ２抗体（１μｇ／ｍｌ）で架橋した（ｎ＝３－４±ＳＤ）。

本発明を以下で詳細に説明する前に、本発明は本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、これらは様々であり得ることが理解されるはずである。また、本明細書において使用される用語は特定の実施態様のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、これは添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるはずである。特に定義されていない限り、本明細書において使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。

好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されているように定義される。

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲のあらゆる箇所において、文脈が他を必要としない限り、単語「含む」および「含んでいる」などの変化形は、記載された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を意味するが、あらゆる他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外を意味しないことが理解される。以下の章では、本発明の種々の態様がより詳細に規定されている。このように規定された各態様は、明確に反対に示されていない限り、あらゆる他の態様と組み合わされ得る。特に、任意である、好ましい、または有利であると示されている特徴は、任意である、好ましい、または有利であると示されているあらゆる他の特徴と組み合わされ得る。

いくつかの文書が、本明細書の文章のあらゆる箇所で引用されている。本明細書で引用されている各文書（あらゆる特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、上記または下記にかかわらず、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明によるこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用されている文書のいくつかは、「参照によって組み込まれる」として特徴付けられている。そのような組み込まれた参考文献の定義または教示と、本明細書に記載の定義または教示との間で矛盾がある場合には、本明細書の文章が優先される。

以下では、本発明の要素が説明されている。これらの要素は、具体的な実施態様とともに記載されている；しかし、これらはさらなる実施態様を作成するために任意の様式および任意の数で組み合わされ得ることが理解されるはずである。様々に記載された実施例および好ましい実施態様は、本発明を明示的に記載された実施態様のみに限定するように解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された実施態様に任意の数の開示された要素および／または好ましい要素を組み合わせた実施態様を支持および包含するように理解されるべきである。さらに、本願の記載されたあらゆる要素の任意の順列および組合せが、文脈が他を示していない限り、本願の記載によって開示されているとみなされるべきである。

定義
以下では、本明細書で頻繁に使用される用語のいくつかの定義を示す。これらの用語は、その使用の各場合において、本明細書の残りの部分ではそれぞれ定義された意味および好ましい意味を有する。

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を指示していない限り、複数の指示対象を含む。

数値に関連して使用される場合、用語「約」は、示された数値よりも５％小さい下限を有し、示された数値よりも５％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。

本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。ペプチドはタンパク質と同一の化学（ペプチド）結合を有するが、一般に長さがより短い。最も短いペプチドは、ペプチド結合によって結合した２つのアミノ酸からなるジペプチドである。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなども存在し得る。ペプチドは環状ペプチドでない限り、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する。本発明で使用可能なペプチド（ペプチド誘導体、ペプチドバリアント、ペプチドフラグメント、ペプチドセグメント、ペプチドエピトープ、およびペプチドドメインを含む）は、化学修飾によってさらに修飾され得る。これは、そのような化学修飾されたペプチドが、天然に存在する２０種のタンパク質を構成するアミノ酸以外の他の化学基を含み得ることを意味する。そのような他の化学基の例として、限定されないが、グリコシル化されたアミノ酸およびリン酸化されたアミノ酸が含まれる。ペプチドの化学修飾は、親ペプチドと比較して有利な特性（例えば、安定性の増強、生物学的半減期の上昇、または溶解性の上昇のうち１つ以上）を与え得る。

用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合で連結したアミノ酸の任意のポリマーを指す。ポリペプチドは単一鎖であり得、または共有結合（例えばジスルフィド結合）および／または非共有結合によって結合している２以上の鎖で構成され得る。得られる化学物質（例えば、成分Ｂに連結させた成分Ａ）の活性が完全に失われない限り、ペプチド結合または側鎖残基の修飾が可能である。この用語は、ポリペプチドの長さを限定するものとして解釈されない。

本明細書の文脈で使用される用語「タンパク質」は、二次構造および三次構造をとる１以上のポリペプチドを含む分子を指し、さらに、いくつかのポリペプチド（すなわちいくつかのサブユニット）から構成され、四次構造を形成するタンパク質を指す。タンパク質は非ペプチド性の基が結合している場合があり、これは補欠分子族または補因子と呼ばれ得る。

本発明の文脈中で記載される用語「Ｃ末端」（カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端鎖、Ｃ末端またはＣＯＯＨ末端としても知られている）は、遊離のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）によって終結しているアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端である。タンパク質がメッセンジャーＲＮＡから翻訳される場合、Ｎ末端からＣ末端に作成される。用語「Ｎ末端」（アミノ末端、ＮＨ_２末端、Ｎ末端またはアミン末端としても知られている）は、遊離のアミン基（－ＮＨ_２）を有するアミノ酸によって終結しているタンパク質またはポリペプチドの開始点を指す。ペプチド配列を記載するための慣例は、Ｎ末端を左に配置し、Ｎ末端からＣ末端に配列を記載することである。

本明細書における用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質のＴＮＦホモロジードメイン」（ＴＨＤ）は、すべての腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、以前はＴＮＦαまたはＴＮＦアルファとして知られていた）リガンドファミリーメンバーによって共有されるタンパク質ドメインを指す。相同性は、共通の祖先からの進化系統を意味する。ホモロジードメインは、タンパク質鎖の他の部分とは独立に進化、機能および存在し得る所定のタンパク質の配列および（三次）構造の保存された部分である。これは、特定のタンパク質ファミリーのすべてのメンバーによって共有される構造的特徴である。各ドメインは小型の三次元構造を形成し、多くの場合、独立して安定であり得、フォールドし得、生物活性に重要であり得る。本発明の意味におけるＴＨＤのＣ末端はＣ末端コンセンサス配列：Ｖ－Ｆ／Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ａ／Ｉ－Ｘ_１（配列番号１）によって規定され、Ｎ末端はＮ末端コンセンサス配列：Ｐ－Ｖ／Ａ－Ａ－Ｈ－Ｖ／Ｌ（配列番号２）によって規定され、ここでＸ_１は非極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦおよびＩからなる群から選択される。所定のＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の配列に基づいて、上記で規定されたＣ末端およびＮ末端ホモロジー配列を用いて、当業者は所定のＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質についてＴＨＤを決定し得る。ＴＮＦファミリーのメンバーの間で個々のＴＨＤの位置および長さは大幅に異なるが、適切なソフトウェアツールを用いた多重配列アラインメントによって同定される保存されたアミノ酸残基の存在によって規定され得る（Bodmer et al., 2002）。さらに重要なことに、結晶構造は（例えばＴＮＦファミリーリガンドのホモ三量体化に関与する）アミノ酸残基間の別個の相互作用を明らかにし得る。このような種類の情報は、Bodmer et al., 2002に記載されているＴＮＦスーパーファミリーの所定のメンバーのＴＨＤを改善するのに有用であり得る。さらに、設計されたタンパク質バリアントのタンパク質溶解性または生理活性（受容体の結合および活性化など）などの機能的な側面は、個々のＴＨＤの重要なアミノ酸残基または最小の長さに関する重要なヒントを提供し得る。ＴＨＤという用語は、天然に存在するＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の配列に基づくポリペプチドおよび各ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの受容体に特異的に結合する能力を保持するそのバリアントを含む。好ましくは、そのようなＴＨＤバリアントは野生型ＴＨＤの少なくとも５０％の親和性を有し、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％の親和性を有する。

ＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質は、（例えば、プログラム細胞死（アポトーシス）、分化、細胞生存および免疫制御を引き起こし得る）一群の多機能性サイトカインを含む。ＴＮＦは特定の受容体によって認識され、腫瘍退縮、敗血症性ショックおよび悪液質に関連づけられる単球由来のサイトカインである。ＴＮＦリガンドファミリーの一部として、配列、機能および構造の類似性に基づいて１９種のタンパク質が同定されている。これらのサイトカインはすべて、特定の受容体によって認識されるホモ三量体（またはＬＴアルファ／ベータの場合にはヘテロ三量体）複合体を形成するようである。以下のタンパク質はＴＮＦリガンドファミリーのメンバーである：アポトーシスを誘導するサイトカインであるＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦＳＦ１０）；Ｂ細胞の発生および活性化に重要であると考えられているサイトカインであるＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５＝腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー５）；共刺激されたＴ細胞の増殖を誘導し、細胞溶解性Ｔ細胞の生成を増強するＴ細胞活性化において役割を果たすサイトカインであるＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）；Ｔ細胞の増殖を誘導するサイトカインであるＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）；細胞死に関与する細胞表面タンパク質であるＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）；Ｔ細胞の刺激に寄与する誘導性Ｔ細胞表面分子である４－１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）；Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を共刺激する細胞表面タンパク質であるＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）；抗増殖活性を有し、免疫制御に重要な役割を果たすタンパク質であるＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）。ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのさらなるメンバーには、ＥＤＡ；ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）；ＣＤ１５３（ＴＮＦＳＦ８）；ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１）；ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）；ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）；ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）；ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）；ＶＥＧＩ（ＴＮＦＳＦ１５）；ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）が含まれる。ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列に関するさらなる情報は、例えばＧｅｎｂａｎｋなどの公的にアクセス可能なデータベースから取得され得る。ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは同族の受容体と相互作用する（例えば、ＴＮＦとＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２、ＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）およびＯＰＧ）。リガンドは、各受容体のオリゴマー化および活性化を媒介する。ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーとそのリガンドとの相互作用は、ＴＮＦおよびＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーの生物学的活性型であるＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質ホモ三量体の３つのＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質単量体のうち２つの間の空間における受容体の結合によって特徴付けられる。

本明細書中で使用される用語「コンセンサス配列」は、２以上の配列間の配列アラインメントにおいて各位置に見出される（ヌクレオチドまたはアミノ酸のいずれかの）最も頻度の高い残基の計算された順序を指す。これは、関連する配列を互いに比較し、類似の配列モチーフを計算する多重配列アラインメントの結果を表す。保存された配列モチーフはコンセンサス配列として示され、これは同一のアミノ酸（すなわち、比較された配列間で同一のアミノ酸）、保存されたアミノ酸（すなわち、比較されたアミノ酸配列間で変動しているが、すべてのアミノ酸が特定の機能的または構造的なアミノ酸の群（例えば極性または中性）に属しているアミノ酸）、および可変アミノ酸（すなわち、比較された配列間で明らかな関連性を示さないアミノ酸）を示している。

ＴＨＤのＣ末端およびＮ末端のコンセンサス配列は、それぞれＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列内に位置し、ＴＮＦリガンドファミリーメンバー間で特に保存されている配列である。これらの配列は、三量体化に関与するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの部分を表している。したがって、２つのコンセンサス配列は、他のＴＮＦリガンドファミリーメンバーには存在しない場合がある追加のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含み得る所定のＴＮＦリガンドファミリーメンバー内のＣ末端およびＮ末端の基準点として役立つ。したがって、コンセンサス配列の使用は、本発明のポリペプチドに存在するＴＮＦリガンドファミリーメンバーのフラグメントのＮ末端およびＣ末端として特定の位置を参照することなく、種々のＴＮＦリガンドファミリーメンバーの同一の領域を参照することを可能にする。

本明細書における用語「多量体化ドメイン」は、本発明の少なくとも２つの同一または異なるタンパク質またはポリペプチド分子（単量体）間の近接近を媒介し、したがって非共有結合または共有結合によって結合した構造的に類似または異なる複数の単量体の多量化を可能にするタンパク質－タンパク質相互作用を可能にするタンパク質またはポリペプチド、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントまたは一部を指す。多量体化は、共有結合または非共有結合している複数の高分子（タンパク質など）によって形成された高分子複合体の形成をもたらす。本発明の２つ、３つまたは４つのポリペプチド分子の多量体化を可能にする多量体化ドメインは、それぞれ二量体化、三量体化または四量体化ドメインと呼ばれる。

本発明の文脈における「アミノ酸リンカー」は、複合体の２つの部分または成分（例えばポリペプチドおよび多量体化ドメイン）を立体的に分離するアミノ酸配列を指す。通常、このようなリンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の最小長を有し、少なくとも１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、または１５アミノ酸またはそれ以下の最大長を有する１～１００アミノ酸からなる。本発明におけるペプチドリンカーの示されている好ましい最小長および最大長は、そのような組合せが数学的に意味をなす場合に組み合わされ得、例えばそのようなリンカーは１～１５、１～３０、１～６０、６～３０、７～１５、１２～４０または２５～７５または１～１００アミノ酸からなり得る。アミノ酸リンカーはまた、連結している２つのタンパク質間に柔軟性を与え得る。このような柔軟性は一般にアミノ酸が小さい場合に増大する。したがって、柔軟なアミノ酸リンカーは、小型のアミノ酸（特にグリシンおよび／またはアラニン）および／または親水性アミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミンなど）の含有量の増加を含む。好ましくは、ペプチドリンカーのアミノ酸の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上が小型のアミノ酸である。アミノ酸リンカーはまた、Ｎグリコシル化コンセンサス配列を含み得る。アミノ酸リンカーのグリコシル化は、そのリンカーの安定性を上昇させることが知られている（Imperialia and O’Connor, Curr Opin Chem Biol. 1999 Dec;3(6):643-9）。好ましくは、コンセンサス配列はＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／ＴｈｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｃｙｓであり、ここでＸはいずれの場合においてもＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、より好ましくはコンセンサス配列はＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒである。本発明のポリペプチド多量体に使用され得るさらなるアミノ酸リンカーが当分野で公知である。そのような適切なリンカーは、Chen et al（Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct; 65(10):1357-69）およびKlein et al（Protein Eng Des Sel. 2014 Oct;27(10):325-30）において見出され得る。

本発明の文脈において、用語「半減期延長ドメイン」は、薬学的に活性な部分の血清／血漿半減期を延長する結合部分を指す（すなわち、半減期延長ドメインの一部である場合、薬学的に活性な部分は延長された血清／血漿半減期を示す）。結合部分は、限定されないが、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。

本発明における用語「標的」または「標的分子」は、他の分子が特定の結合親和性を有するか、または他の分子が特異的に結合する天然に存在する細胞構造または分子構造を指す。「特異的に結合する」とは、結合部分（例えば、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチド多量体、または抗体）が、第２の標的の解離定数（Ｋ_ｄ）よりも低い解離定数で第１の標的に結合する場合に、別の標的との結合と比較して特異的であるように標的（受容体またはエピトープなど）により強く結合することを意味する。標的はその標的に特定の親和性で結合するリガンドによって認識され得、したがって各標的に結合するリガンドが生物学的効果をもたらす。好ましくは、結合部分が特異的に結合する標的の解離定数（Ｋ_ｄ）は、結合部分が特異的に結合しない標的の解離定数（Ｋ_ｄ）よりも１０倍を超えて、好ましくは２０倍を超えて、より好ましくは５０倍を超えて、さらにより好ましくは１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍または１０．０００倍を超えて低い。

本明細書において、（「Ｍ」と省略されることがある「ｍｏｌ／Ｌ」において測定される）用語「Ｋ_ｄ」は、結合部分（例えば本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体）と標的分子（例えば受容体）との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すことが意図される。そのような親和性は好ましくは３７℃で測定される。適切なアッセイには、表面プラズモン共鳴測定（例えばＢｉａｃｏｒｅ）、水晶振動子マイクロバランス測定（例えばＡｔｔａｎａ）、バイオレイヤー干渉法（例えばＯｃｔｅｔ）および競合アッセイが含まれる。

本明細書において、用語「バリアント」は、その長さまたは配列における１以上の変化によって、由来するペプチドまたはタンパク質と比較して異なるペプチドまたはタンパク質として理解されるべきである。タンパク質バリアントが由来するポリペプチドは、親ポリペプチドとしても知られる。用語「バリアント」は、親分子の「フラグメント」または「誘導体」を含む。通常、「フラグメント」は親分子よりも長さまたはサイズが小さく、「誘導体」は親分子と比較して配列において１以上の差異を示す。また、親タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、ビオチン化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化、またはタンパク質分解）も包含される。通常、バリアントは人工的に（好ましくは遺伝子技術の手段によって）作成されるが、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは野生型タンパク質またはポリヌクレオチドである。しかし、天然に存在するバリアントもまた、本明細書における用語「バリアント」に包含されることが理解されるはずである。さらに、本発明において使用可能なバリアントは、バリアントが親分子の少なくとも１つの生物活性を示す（すなわち機能的に活性である）場合、親分子のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に作製されたバリアントに由来し得る。

通常、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域（本明細書ではＣＨまたはＣＨと略される）から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（またはＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）と呼ばれる３つの部分にさらに細分され得る。Ｆｃ（フラグメント結晶化可能）領域は２つの重鎖定常領域を含み、Ｆａｂ（フラグメント、抗原結合）領域は抗体の各重鎖および軽鎖から１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬまたはＣＬと略される）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子（免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む）への結合を媒介し得る。

本明細書における用語「抗体フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。用語「抗体フラグメント」に包含される結合フラグメントの例には、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、単一ドメイン抗体、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（免疫グロブリン新規抗原受容体）、ｄｉ－ｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢＩＴＥ）、二重親和性再標的（ＤＡＲＴ）分子、トリプルボディ、代替スキャフォールドタンパク質、およびそれらの融合タンパク質が含まれる。

用語「Ｖ_Ｌ領域」および「Ｖ_Ｈ領域」は、抗体のＶ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域（すなわち、それぞれ免疫グロブリンの軽鎖のＮ末端可変領域および免疫グロブリンの重鎖のＮ末端可変領域）を指す。個々のＶ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域は、３つの超可変領域（相補的決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）および４つのフレームワーク領域（フレームワーク（ＦＲ）領域１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）からそれぞれ構成されている。所定の配列内の各サブ領域を特定することは当分野で通例であり、例えばＮＣＢＩのＩｇＢｌａｓｔによって達成され得る。重鎖および軽鎖の可変領域は、共に抗体の結合領域を形成する。免疫グロブリンではＶ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域は異なるポリペプチド鎖上に位置しているが、組換え抗体誘導体では同じ鎖上に位置し得る。Ｖ_Ｌ領域とＶ_Ｈ領域の相互作用は、本発明のポリペプチドが各標的抗原と相互作用することを可能にする。

本明細書中で使用される用語「二重特異性抗体」は、異なる抗原に結合し得る融合タンパク質または二価抗体を指す。二重特異性抗体は、抗体のフラグメント（すなわち可変フラグメント）を含む２つの単一のタンパク質鎖から構成される。二重特異性抗体は、同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む（Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）。２つの可変ドメインを連結する短いペプチドを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、したがって２つの抗原結合部位を作成する。二重特異性抗体は、同一の抗原（単一特異性）または異なる抗原（二重特異性）を標的とし得る。

本明細書中で使用される用語「核酸」は、あらゆる公知の形態の生命に重要なポリマーもしくはオリゴマー高分子または巨大な生体分子を含む。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含む核酸は、ヌクレオチドとして知られる単量体から作られる。天然に存在するＤＮＡ分子のほとんどは、二重らせんを形成するように互いに巻き付いている２つの相補的なバイオポリマー鎖からなる。ＤＮＡ鎖は、ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドとしても知られている。各ヌクレオチドは、窒素を含む核酸塩基ならびにデオキシリボースまたはリボースと呼ばれる単糖およびリン酸基から構成される。天然に存在する核酸塩基には、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはシトシン（Ｃ）が含まれる。ヌクレオチドは、あるヌクレオチドの糖と次のヌクレオチドのリン酸との間の共有結合により鎖内で互いに結合しており、これは交互に繰り返される糖－リン酸骨格をもたらす。糖がデオキシリボースである場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースである場合、ポリマーはＲＮＡである。通常、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合によって形成される。本発明の文脈において、用語「核酸」は、限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびそれらの混合物（例えば、（１つの鎖内における）ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドなど）、ならびにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む。核酸は遺伝子全体またはその一部からなり得、核酸はｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡであり得る。

本明細書中で使用される用語「ベクター」は発現コンストラクトとも呼ばれ、通常、細胞中でのタンパク質発現のために設計されたプラスミドまたはウイルスである。ベクターは特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用され、その遺伝子によってコードされるタンパク質を産生するためにタンパク質合成のための細胞の機構を使用し得る。発現ベクターは、エンハンサー領域およびプロモーター領域として機能し、発現ベクター上に保有された遺伝子の効率的な転写をもたらす制御配列を含むように設計される。うまく設計された発現ベクターの目的は、相当量の安定なメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質の産生である。適切なベクターの例には、限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が含まれる。

本明細書において、用語「医薬組成物」は、組織の状態または疾患の同定、予防または処置のために使用される物質および／または物質の組合せを指す。医薬組成物は、疾患を予防および／または処置するために患者への投与に適切であるように製剤化される。さらに、医薬組成物は、治療用途に適した組成物を作成する活性物質と不活性または活性な担体との組合せを指す。医薬組成物は、その化学的および物理的特性に応じて、経口、非経口、局所、吸入、直腸、舌下、経皮、皮下または膣の適用経路のために製剤化され得る。医薬組成物には、固体、半固体、液体、経皮治療システム（ＴＴＳ）が含まれる。固体組成物は、錠剤、コーティングされた錠剤、粉末、顆粒、ペレット、カプセル、発泡性錠剤または経皮治療システムからなる群から選択される。また、溶液、シロップ、輸液、抽出液、静脈内投与用溶液、注入用溶液、または本発明のキャリアシステムの溶液からなる群から選択される液体組成物も含まれる。本発明の文脈において使用され得る半固体組成物には、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ローション、ゲル、グロビュール、バッカル錠および坐剤が含まれる。

用語「活性物質」は、生物学的に活性な（すなわち、医薬的価値を与える）医薬組成物または製剤中の物質を指す。医薬組成物は、互いに組み合わせて、または独立に作用し得る１以上の活性物質を含み得る。活性物質は、中性または塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩には、遊離アミノ基で形成される塩（塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸および酒石酸などに由来する塩など）および遊離カルボキシ基で形成される塩（限定されないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどに由来する塩など）が含まれる。

用語「疾患」および「障害」は本明細書において互換的に使用され、異常状態（特に病気または傷害などの異常な病状）を指し、細胞、組織、臓器または個体はもはやその機能を効率的に果たすことができない。通常、必ずではないが、疾患は、そのような疾患の存在を示す特定の症状または徴候に関連している。したがって、そのような症状または徴候の存在は、疾患に罹患した細胞、組織、臓器または個体を示し得る。これらの症状または徴候の変化は、そのような疾患の進行を示し得る。疾患の進行は通常、疾患の「悪化」または「改善」を示し得るそのような症状または徴候の増加または減少によって特徴付けられる。疾患の「悪化」は、細胞、組織、臓器または個体／患者がその機能を効率的に果たす能力の減少によって特徴付けられ、疾患の「改善」は、細胞、組織、臓器または個体／患者がその機能を効率的に果たす能力の増加によって通常特徴付けられる。

本願における用語「過剰増殖性障害」は、細胞の細胞分裂が正常組織と比較して増加している障害を指す。このような障害は、細胞の異常増殖（産生）（すなわち過剰産生）によって特徴付けられる。増殖性障害は腫瘍性疾患を含む。腫瘍性疾患は良性または悪性の腫瘍を含み得、悪性の腫瘍性疾患はがんと呼ばれる。過剰増殖性障害という用語には、がんおよび前がん性障害が含まれる。がんは、間葉系由来（すなわち結合組織（肉腫））および上皮組織（がん）の増殖性障害を含む。肉腫の一般的な例は、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫および線維肉腫、ならびに消化管の肉腫（ＧＩＳＴ）である。がんの例は、皮膚、精巣、肝臓、消化管（食道、胃、膵臓および大腸など）、上咽頭、膀胱、子宮頸部、卵巣、尿道および膀胱のがん；前立腺および他の泌尿生殖器がん、肺、腎臓、内分泌系組織（甲状腺および下垂体など）、奇形がん、ならびに脳のがんである。血液系の悪性腫瘍は、リンパ腫または白血病に分類される。炎症は腫瘍周辺の微小環境を調整し、がん細胞の増殖、生存および移動に寄与し、悪性疾患を促進する可能性がある。

炎症は原理的に、免疫細胞、血管および多数の分子メディエーターに関与する保護的な免疫血管反応である。炎症の目的は、細胞傷害の最初の原因を排除し、壊死細胞および元の傷害および炎症プロセスから損傷した組織を除去し、組織修復を開始することである。本発明の文脈において使用される用語「炎症性障害」は、生理的な炎症反応が身体に潜在的に有害な効果に変化している状況を指す。正常組織に損傷を引き起こす炎症性障害は、限定されないが、自己免疫障害および神経変性疾患を含む。

本明細書中で使用される用語「代謝性障害」は、身体が生理機能を実行するために必要な物質を処理（すなわち代謝）する方法に影響を与える疾患または障害を指す。代謝性障害の例には、限定されないが、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、および循環器疾患が含まれる。

本明細書で互換的に使用される用語「糖尿病」または「真性糖尿病」は、血液中の糖（グルコース）のレベルの上昇によって特徴付けられる疾患を指す。糖尿病は、インスリン（血糖を調節するために膵臓によって産生される化学物質）が少なすぎること、インスリンに対する抵抗性、またはその両方によって引き起こされ得る。好ましい実施態様において、糖尿病は２型糖尿病（すなわち、インスリンに対する抵抗性）である。

本明細書中で使用される用語「肥満」は、対象が除脂肪体重に対して過剰な体脂肪を有する状態を指す。好ましい実施態様において、肥満は、３０ｋｇ／ｍ^２を超えるＢＭＩ（肥満度指数）として定義される。

本明細書中で使用される用語「メタボリックシンドローム」は、ＷＨＯによると、耐糖能異常、耐糖能障害（ＩＧＴ）もしくは糖尿病（ＤＭ）、および／またはインスリン抵抗性を、以下に列挙される要素のうち２つ以上とともに有する個人において生じる：
１．動脈圧の上昇、すなわち≧１４０／９０ｍｍのＨｇ
２．血漿トリグリセリドの上昇（≧１５０ｍｇ／ｄｌ）および／または低いＨＤＬ－Ｃ（男性では＜３５ｍｇ／ｄｌ、および女性では＜３９ｍｇ／ｄｌ）
３．中心性肥満（すなわち、ウエスト／ヒップ比（ＷＨＲ）が男性では＞０．９、および女性では＞０．８５）および／または肥満度指数（ＢＭＩ）＞３０ｋｇ／ｍ^２
４．微量アルブミン尿、すなわち、尿中アルブミン排泄速度≧２０μｇｍ／分またはアルブミン／クレアチン比≧３０μｇｍ／ｍｇ。

用語「循環器障害」、「循環器疾患」および／または「心血管疾患」は本明細書で互換的に使用され、本明細書で定義されるように、全身性（または本態性）高血圧、肺高血圧（例えば、肺動脈高血圧、新生児の肺高血圧）、うっ血性心不全、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、血栓症、血管開存性が低下した状態（例えば、経皮経管冠動脈形成術後）、末梢血管疾患、（特に糖尿病とともに生じる）腎疾患、狭心症（安定狭心症、不安定狭心症、および異型（プリンツメタル）狭心症を含む）、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、混合型脂質異常症、および血流の改善が末端器官の機能の改善をもたらすあらゆる状態を含む。

用語「神経変性疾患」は本明細書で互換的に使用され、本明細書で定義されるように、アルツハイマー病、ＨＩＶ関連認知症、片頭痛、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、タウオパチー、ピック病、パーキンソン病、神経障害、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、フリートライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、クールー、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、およびバッテン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、神経障害性疼痛、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、バロー病、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ－Ｉ関連脊髄症、視神経脊髄炎、視神経萎縮、非動脈炎性前部虚血性視神経症、シルダー病、横断性脊髄炎、横断性脊髄炎、脳卒中、てんかん、糖尿病性神経障害を含む。

「ＥＣ_５０」値は、物質の５０％効果濃度(half maximal effective concentration)を指し、したがって、ベースラインと特定の曝露時間後の最大値の中間の反応を誘導する前記物質の濃度の尺度である。したがって、段階的用量反応曲線のＥＣ_５０は、最大効果の５０％が観察される物質の濃度を表す。通常、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド多量体は、５０ｎＭ～１ｐＭ、より好ましくは１０ｎＭ～１０ｐＭ、さらにより好ましくは１ｎＭ～５０ｐＭ（すなわち、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１ｐＭ）のＴＮＦＲ２受容体への結合のＥＣ_５０値を示す。

「薬学的に許容され得る」とは、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって承認されていること、または米国薬局方、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）もしくは動物（特にヒト）における使用のための一般的に認められた他の薬局方に記載されていることを意味する。

本明細書における用語「担体」は、治療物質とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または溶剤を指す。このような医薬担体は、水および油（ピーナッツ油、大豆油、鉱物油およびゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油を含む）中の生理食塩水などの滅菌液であり得る。生理食塩水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に好ましい担体である。生理食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、（特に注射用溶液のために）液体担体として利用され得る。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが含まれる。必要に応じて、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、および徐放性製剤などの形態をとり得る。組成物は、従来の結合剤および担体（トリグリセリドなど）とともに坐剤として製剤化され得る。本発明の化合物は、中性または塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩には、遊離アミノ基で形成される塩（塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸および酒石酸などに由来する塩など）および遊離カルボキシ基で形成される塩（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどに由来する塩など）が含まれる。適切な医薬担体の例は、E. W. Martin による"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。患者への適切な投与のための形態を提供するために、このような組成物は（好ましくは精製された形態の）治療有効量の化合物を適切な量の担体とともに含む。製剤は投与方法に適合させるべきである。

実施態様
以下の章では、本発明の種々の態様がより詳細に規定されている。このように規定された各態様は、明確に反対に示されていない限り、あらゆる他の態様と組み合わされ得る。特に、好ましいか、または有利であると示されているあらゆる特徴は、好ましいか、または有利であると示されているあらゆる他の特徴と組み合わされ得る。

第１の態様において、本発明は、ＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の３つのペプチドＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）からなる結合ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、第１および第２のＴＨＤのＣ末端（これは、それぞれの場合においてＣ末端コンセンサス配列Ｖ－Ｆ／Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ａ／Ｉ－Ｘ_１（配列番号１）によって規定される）は、第２および第３のＴＨＤのＮ末端（これは、それぞれの場合においてＮ末端コンセンサス配列Ｐ－Ｖ／Ａ－Ａ－Ｈ－Ｖ／Ｌ（配列番号２）によって規定される）にペプチドＸ_ａ（これは、それぞれの場合において独立して選択され、９～１２アミノ酸、好ましくは９～１１、より好ましくは９～１０の長さを有する）を介してそれぞれ連結しており、好ましくはＸ_ａはアミノ酸配列Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）を含まず；Ｘ_１は非極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦおよびＩからなる群から選択される。

本発明をもたらした研究において、連結ペプチドＸ_ａの短縮は熱安定性を著しく向上させたが、同時に生物活性を著しく低下させたことが示された。驚くべきことに、本発明者らは、生物活性（各受容体、好ましくはＴＮＦＲ２への結合など）を維持しつつ、著しく向上した安定性をもたらすペプチドＸ_ａのサイズの狭い範囲を特定した。

したがって、本発明のポリペプチドは、本明細書で開示される動的光散乱法によって測定される少なくとも６３℃、少なくとも６４℃、少なくとも６５℃、少なくとも６６℃、少なくとも６７℃、より好ましくは少なくとも６５℃、少なくとも６６℃、最も好ましくは少なくとも６６℃の熱安定性を有することが好ましい。

本発明のポリペプチドは、ＴＮＦＲ２受容体の活性化に関して特定の生理活性を有することがさらに好ましい。この生理活性の好ましい例は、実施例５に記載されるようにＫｙｍ－１細胞上のＴＮＦＲ２受容体の活性化である。好ましくは、本発明のポリペプチドは、好ましくは抗体８０Ｍ２を用いたＴＮＦＲ２架橋を伴うＫｙｍ－１細胞上でのＴＮＦＲ２受容体の活性化のＥＣ_５０値が、４００ｐＭ未満、３５０ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、より好ましくは３００ｐＭ未満である。

Ｃ末端およびＮ末端コンセンサス配列は、本発明のポリペプチドに必然的に含まれるＴＮＦファミリーメンバーのＴＨＤの領域の末端の基準点を与えるという目的を果たす。これは、ＴＮＦファミリーメンバーＴＮＦアルファおよびＬＴアルファの好ましい例によって例示される。配列番号５において、ヒトＴＮＦアルファの配列が開示されている。Ｃ末端配列は配列番号５のアミノ酸２２６～２３１に対応するＶＹＦＧＩＩ（配列番号３）であり、Ｎ末端配列は配列番号５のアミノ酸８８～９２に対応するＰＶＡＨＶ（配列番号４）である。配列番号５５において、ヒトＬＴアルファの配列が開示されている。Ｃ末端配列は配列番号５５のアミノ酸１９８～２０３に対応するＶＦＦＧＡＦ（配列番号５６）であり、Ｎ末端配列は配列番号５５のアミノ酸６３～６７に対応するＰＡＡＨＬ（配列番号５７）である。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、ペプチドＸ_ａはＸ_Ｃ－Ｘ_Ｌ－Ｘ_Ｎからなり、ここで
Ｘ_Ｃは、Ａ、Ａ－Ｌ、Ｌ、好ましくはＡおよびＡ－Ｌ、より好ましくはＡ－Ｌからなる群から選択される；
Ｘ_Ｌは存在しないか、または１～１１アミノ酸、好ましくは１～１０アミノ酸、より好ましくは１～９アミノ酸、最も好ましくは４～８アミノ酸からなるアミノ酸リンカーである；
Ｘ_Ｎは存在しないか、またはＫ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）、Ｔ－Ｋ、Ｓ－Ｔ－Ｋ、Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１１）、Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１２）、Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１３）、Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１４）、Ｌ－Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１５）、好ましくはＳ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）、Ｓ－Ｄ－Ｋからなる群から選択される。

本発明の第１の態様のより好ましい実施態様において、ペプチドＸ_ａはＸ_Ｃ－Ｘ_Ｌ－Ｘ_Ｎからなり、ここで
Ｘ_Ｃは、Ａ、Ａ－Ｌ、Ｌ、好ましくはＡおよびＡ－Ｌ、より好ましくはＡ－Ｌからなる群から選択される；
Ｘ_Ｌは存在しないか、または１～１１アミノ酸、好ましくは１～１０アミノ酸、より好ましくは１～９アミノ酸、最も好ましくは４～８アミノ酸からなるアミノ酸リンカーである；
Ｘ_Ｎは存在しないか、またはＫ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、Ｔ－Ｋ、Ｓ－Ｔ－Ｋ、Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１１）、Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１２）、Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１３）、Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１４）、Ｌ－Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１５）、好ましくはＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｓ－Ｄ－Ｋ、より好ましくはＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）およびＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）からなる群から選択される。

ペプチドＸ_ａは３つの成分Ｘ_Ｃ、Ｘ_ＬおよびＸ_Ｎからなるが、成分Ｘ_ＬおよびＸ_Ｎのうち少なくとも１つが存在するという条件で、Ｘ_ＬおよびＸ_Ｎは存在してもしなくてもよい。Ｘ_Ｃは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＣ末端に由来するアミノ酸を含む。Ｘ_Ｌは、アミノ酸リンカーである。好ましくは、アミノ酸リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。Ｘ_Ｎは、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのＴＨＤのＮ末端に由来するアミノ酸を含み、好ましくは、Ｘ_Ｎはアミノ酸配列Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）を含まない。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドの３つのＴＨＤは、そのアミノ酸配列が同一である。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、第１および第２のＴＨＤのＣ末端は、それぞれの場合においてＣ末端配列Ｖ－Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ｉ－Ｉ（配列番号３）によって規定され、第２および第３のＴＨＤのＮ末端は、それぞれの場合においてＮ末端配列Ｐ－Ｖ－Ａ－Ｈ－Ｖ（配列番号４）によって規定される。これらのＣ末端およびＮ末端配列は、ヒトＴＮＦアルファに由来する。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、ＴＨＤは、配列番号５のアミノ酸８８～２３１からなる連続したアミノ酸配列を含み、これは任意で、以下からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｔ、Ｄ１４３Ｓ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ１４６Ｈ、Ｅ１４６Ｋ、Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｑ８８Ｎ／Ｔ８９Ｓ／Ａ１４５Ｓ／Ｅ１４６Ａ／Ｓ１４７Ｄ、Ｑ８８Ｎ／Ａ１４５Ｉ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｓ１４７Ｄ、Ｌ２９Ｖ／Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｎ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｑ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｋ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｔ、Ａ１４５Ｒ／Ｅ１４６Ｔ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ｅ１４６Ｎ／Ｓ１４７、Ｓ９５Ｃ／Ｇ１４８Ｃ、Ｋ６５Ａ、Ｋ６５Ｗ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｔ、Ｑ６７Ｙ、Ｌ７５Ｈ、Ｌ７５Ｗ、Ｄ１４３Ｗ、Ｄ１４３Ｖ、Ｄ１４３Ｖ／Ｆ１４４Ｌ／Ａ１４５Ｓ、Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、Ｄ１４３Ｖ／Ａ１４５Ｓ、Ｌ２９Ｖ、Ｌ２９Ｔ、Ｌ２９Ｓ、Ｌ２９Ａ、Ｌ２９Ｇ、Ｒ３１Ｈ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｌ、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３２Ｅ、Ｓ１４７Ｌ、Ｓ１４７Ｒ、Ｓ１４７Ｐ、Ｓ１４７Ｔ、Ｓ１４７Ａ、Ｑ１４９Ｅ、Ｑ１４９Ｎ、Ｅ１４６Ｄ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｓ、Ｅ１４６Ｇ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｐ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｙ、Ａ１４５Ｖ、およびＡ１４５Ｗ、好ましくはＤ１４３ＮおよびＡ１４５Ｒから選択される。

上記に開示された変異は、ＴＮＦＲ２の細胞外部分への結合の特異性を上昇させる。好ましくは、変異は、ＴＮＦＲ１に対する結合親和性を低下させるが、ＴＮＦＲ２に対する親和性を本質的に維持し、それによりＴＮＦＲ２に対する特異性を上昇させる（すなわち、ＴＮＦＲ２への結合のＫｄは、ＴＮＦＲ１への結合のＫｄよりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１．０００倍、好ましくは少なくとも５．０００倍高い）。

これらの変異は当分野で公知であり、Loetscher et al (JBC, vol 268, no 35, pp. 26350-26357, 1993; 表１参照)、Abe et al (Biomaterials 32 (2011) 5498-5504; 表１参照)、Ando et al (Biochemistry and Biophysics Reports, 7; 2016; 309-315; 表２参照)、およびBan et al (Molecular and Cellular Therapies (2015) 3:7)に開示されている。好ましくは、ポリペプチドは、これらの変異のうち５、４、３、２または１個、より好ましくは２または１個、最も好ましくは１個を含んでいる。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_Ｃは、ＡまたはＡ－Ｌから選択され、
Ｘ_Ｌは存在しないか、または１～１１アミノ酸、好ましくは１～１０アミノ酸、より好ましくは１～９アミノ酸、最も好ましくは４～８アミノ酸の長さを有するグリシンおよび／またはセリンリンカーであり、
Ｘ_Ｎは存在しないか、またはＫ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、およびＳ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）から選択され；より好ましくは、Ｋ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、およびＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_Ｃは、ＡまたはＡ－Ｌから選択され、
Ｘ_Ｌは、Ｇ、Ｓ、Ｇ－Ｇ、Ｓ－Ｇ、Ｇ－Ｓ、Ｇ－Ｇ－Ｇ、Ｓ－Ｇ－Ｇ、Ｇ－Ｓ－Ｇ、Ｇ－Ｇ－Ｓ、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号１７）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号１８）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号１９）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２０）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２１）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２２）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２３）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号２４）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号２５）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号２６）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２７）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２８）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２９）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号３０）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号３１）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号３２）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３３）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号３５）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号３６）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号３７）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号３８）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３９）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号４０）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号４１）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号４２）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号４３）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号４４）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号４５）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号４６）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号４７）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号４８）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号４９）、およびＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号５０）、好ましくは、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号２６）、およびＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）、より好ましくは、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）およびＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）から選択され；
Ｘ_Ｎは存在しないか、またはＫ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、およびＳ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）から選択され；より好ましくは、Ｋ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、およびＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される。

好ましい実施態様において、ＸＬは、１～１１アミノ酸、好ましくは１～１０アミノ酸、より好ましくは１～９アミノ酸、最も好ましくは４～８アミノ酸の長さを有し、グリシンとセリンの含有量が３：１であるグリシン／セリンリンカーである。言い換えれば、３つのグリシンにつき、１つのセリンが存在する。好ましくは、各セリンは３つのグリシンによって別のセリンから分離されている。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_Ｌは存在せず、Ｘ_ＮはＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）、Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号５１）、およびＲ－Ｓ－Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号５２）、好ましくはＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）およびＳ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）から選択され；より好ましくは、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬはＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）であり、Ｘ_ＮはＳ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬはＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）であり、Ｘ_ＮはＫおよびＤ－Ｋから選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬはＧであり、Ｘ_ＮはＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、好ましくはＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬはＧ－Ｇであり、Ｘ_ＮはＴ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、好ましくはＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬはＧ－Ｇ－Ｇであり、Ｘ_ＮはＰ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、好ましくはＴ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、
Ｘ_ＣはＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬはＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）であり、Ｘ_ＮはＳ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、好ましくはＰ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）から選択される。

本発明の第１の態様の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、動的光散乱法によって決定される、６２℃よりも高い、６３℃よりも高い、６４℃よりも高い、６５℃よりも高い、６６℃よりも高い、６７℃よりも高い、６８℃よりも高い、好ましくは６５℃よりも高い、６６℃よりも高い、または６７℃よりも高い、最も好ましくは６６℃よりも高い、または６７℃よりも高い凝集開始温度（Ｔ_ｍ）を有する。凝集開始温度（Ｔ_ｍ）は、好ましくは本明細書の実施例４に開示されているように動的光散乱法によって決定される。温度上昇に応じた凝集の開始は、タンパク質の変性の指標である。タンパク質（本発明のポリペプチドなど）の凝集開始温度が高いほど、タンパク質はより熱的に安定である。用語「変性温度」および「凝集温度」は、本明細書において同義的に使用される。

第２の態様において、本発明は、以下である本発明の第１の態様に記載の少なくとも２つのポリペプチドを含むポリペプチド多量体を提供する、
（ａ）ともに連結されており、１～３０アミノ酸、好ましくは７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって好ましくはともに連結されているか；または
（ｂ）（好ましくは、多量体化ドメイン、血清タンパク質、サイトカイン、ターゲティング部分または毒素からなる群から選択される）タンパク質、好ましくは多量体化ドメインに連結されている；
ここで任意で、前記ポリペプチドは、１～３０アミノ酸、好ましくは７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって前記タンパク質に連結されている。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、本発明の第１の態様のポリペプチドは互いに連結されて鎖状構造を形成しており、ここでポリペプチドはそのアミノ末端またはカルボキシ末端によって互いに直接連結されている。アミノ酸リンカーが存在する場合、リンカーはポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に結合している。好ましい実施態様において、鎖状構造は、本発明の第１の態様の少なくとも１つのポリペプチドに結合したタンパク質をさらに含む。そのようなタンパク質の好ましい例は、多量体化ドメイン、血清タンパク質、サイトカイン、ターゲティング部分または毒素である。

本発明のポリペプチド多量体は、本発明のポリペプチドと同様に、生物活性を保持しつつ、安定性（特に熱安定性）が向上している。リンカーが存在しない場合、本発明の第１の態様のポリペプチドは、多量体化ドメインに直接連結されている。

したがって、本発明のポリペプチド多量体は、本明細書で開示されるように動的光散乱法によって測定される、７１℃よりも高い、少なくとも７２℃、少なくとも７３℃、少なくとも７４℃、好ましくは少なくとも７２℃、少なくとも７３℃、少なくとも７４℃、少なくとも７５℃、少なくとも７６℃、少なくとも７７℃、または少なくとも７８℃、より好ましくは少なくとも７４℃の熱安定性（Ｔ_ｍ）（すなわち凝集開始温度）を有することが好ましい。凝集開始温度が高いほど、ポリペプチド多量体はより熱的に安定である。

本発明のポリペプチド多量体の安定性の別の好ましい例は、実施例１０に開示されているように、３７℃のヒト血漿中での３日間のインキュベーション後の安定性である。好ましくは、３７℃のヒト血漿中での３日間のインキュベーション後の、実施例１０におけるＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞中のＴＮＦＲ２への結合についての本発明のポリペプチド多量体のＥＣ_５０は、ヒト血漿中でのインキュベーション前のＥＣ_５０と比較して１５％、１２％、１０％、好ましくは１０％よりも大きく減少していない。

本発明のポリペプチド多量体の安定性の別の好ましい例は、実施例１０に開示されているように、３７℃のヒト血漿中での８日間のインキュベーション後の安定性である。好ましくは、３７℃のヒト血漿中での３日間のインキュベーション後の、実施例１０におけるＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞中のＴＮＦＲ２への結合についての本発明のポリペプチド多量体のＥＣ_５０は、ヒト血漿中でのインキュベーション前のＥＣ_５０と比較して１５％、１２％、１０％、好ましくは１０％よりも大きく減少していない。

本発明のポリペプチド多量体は、ＴＮＦＲ２受容体の活性化に関して特定の生理活性を有することがさらに好ましい。

したがって、本発明のポリペプチド多量体は、実施例７に開示されているように、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）上に発現したＴＮＦＲ２への結合によって評価される、１００ｐＭ未満、好ましくは８０ｐＭ未満、より好ましくは７０ｐＭ未満のＥＣ_５０の生理活性を有することが好ましい。好ましくは、本発明のポリペプチド多量体は、実施例７の条件下でＴＮＦＲ１に結合しない。

この生理活性の別の好ましい例は、実施例８に開示されているように、Ｋｙｍ－１細胞上のＴＮＦＲ２への結合であり、ここでＥＣ_５０は２００ｐＭ未満、１５０ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、７５ｐＭ未満、好ましくは１００ｐＭ未満または７５ｐＭ未満、より好ましくは７５ｐＭ未満である。

この生理活性の別の好ましい例は、実施例９に開示されているように、ＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞におけるＮＦ－κＢの活性化であり、ここでＥＣ_５０は３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満または５ｐＭ未満、より好ましくは５ｐＭ未満である。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、ポリペプチドをタンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）に連結するアミノ酸リンカーは、５～５０、５～４５、７～４０、７～３５、７～３０、７～２５、７～２０、７～１５、７～１２、９～１１アミノ酸、好ましくは７～１５、７～１２、９～１１、より好ましくは７～１２または９～１１、最も好ましくは９～１１アミノ酸の長さを有する。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドをタンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）に連結するアミノ酸リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドをタンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）に連結するアミノ酸リンカーは、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号５）である。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドをタンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）に連結するアミノ酸リンカーは、Ｎグリコシル化のためのコンセンサス配列を含む。

好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、タンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）のＮ末端に（任意で本発明の第２の態様のアミノ酸リンカーによって）連結されている。

好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは、タンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）のＣ末端に（任意で本発明の第２の態様のアミノ酸リンカーによって）連結されている。

好ましい実施態様において、本発明の少なくとも１つのポリペプチドはタンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）のＮ末端に連結されており、少なくとも１つのポリペプチドはタンパク質（好ましくは多量体化ドメイン）のＣ末端に連結されており、任意でこれらの各連結は本発明の第２の態様のアミノ酸リンカーを互いに別々に含む。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、多量体化ドメインは二量体化ドメインである。

好ましい二量体化ドメインは、（限定されないが、抗体、抗体重鎖、Ｆｃ領域、ＩｇＭの重鎖ドメイン２（ＣＨ２）（ＭＨＤ２）、ＩｇＥの重鎖ドメイン２（ＣＨ２）（ＥＨＤ２）、ＩｇＧの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＤの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、ＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ならびにＣＨ１およびＣＬドメインを含む）抗体由来の二量体化ドメインである。抗体由来の好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域、そのバリアントまたはフラグメントである。二量体化ドメインとして使用可能なＦｃ領域は、好ましくは以下のアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに由来する。

さらに好ましい二量体化ドメインは、ＦｃＲおよび／またはＣ１ｑ結合を有しない免疫グロブリンＦｃ領域変異体である。ＦｃＲおよび／またはＣ１ｑ結合を有しない免疫グロブリンＦｃ領域変異体の好ましい例は、ＦｃΔａｂ、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ－ＧＰ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２σ、アグリコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ１（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／ＬＰ３３１Ｓ）、ＩｇＧ２ｍ４、およびＩｇＧ４ ＰｒｏＡｌａＡｌａである。Ｆｃ領域変異体のさらにより好ましい例は、Ｆｃγ受容体Ｉ結合およびＣ１ｑ結合を持たないＦｃΔａｂである（Armour et al; Eur. J. Immunol. 1999, 29:2613-2624）。

他の二量体化または多量体化ドメインには、ｂａｒｎａｓｅ－ｂａｒｓｔａｒ、Ｃ４ｂｐ、ＣＤ５９、コラーゲン由来のペプチド、ロイシンジッパーモチーフ、ミニ抗体およびＺＩＰミニ抗体、ＧＳＴ、不活性ヒト絨毛性ゴナドトロピンのαおよびβサブユニット、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ｐ５３およびそのフラグメント、ホスファターゼ、ストレプトアビジン、サーファクタントタンパク質Ｄ、テネイシン、テトラネクチン、ドックアンドロック（ＤＮＬ）モチーフ、ならびにウテログロビンが含まれる。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、多量体化ドメインは三量体化ドメインである。

好ましい三量体化ドメインは、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子、およびＴｒｉＢｉミニボディ、より好ましくはＴＮＣである。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、多量体化ドメインは四量体化ドメインである。

好ましい四量体化ドメインは、ｐ５３の四量体化ドメイン、ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、ＶＡＳＰ（血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）の四量体化ドメイン、タンデム二重特異性抗体、およびジダイアボディ(di-diabody)である。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、ポリペプチドが連結するタンパク質は、組織、臓器または細胞型に特異的なリガンドである。好ましくは、リガンドは、臓器、組織または細胞型に特異的なターゲティング部分である。より好ましくは、ターゲティング部分は、免疫系の細胞（例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；共刺激リガンド）、中枢神経系の細胞（例えばミクログリア細胞）、心筋（心臓前駆細胞を含む）、大腸、皮膚、炎症組織、または膵臓細胞に特異的である。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、ポリペプチド多量体は、組織、臓器または細胞型に特異的なリガンドをさらに含む。好ましくは、リガンドは、臓器、組織または細胞型に特異的なターゲティング部分である。より好ましくは、ターゲティング部分は、免疫系の細胞（例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；共刺激リガンド）、中枢神経系の細胞（例えばミクログリア細胞）、心筋（心臓前駆細胞を含む）、大腸、皮膚、炎症組織、または膵臓細胞に特異的である。好ましくは、ターゲティング部分は、ポリペプチドが連結するタンパク質に加えて、ポリペプチド多量体に存在する。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、ターゲティング部分は、トランスフェリン受容体、ＣＤ９８、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＲＰ１、インスリン受容体、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、ジフテリア毒素受容体、排出ポンプ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＧＬＵＴ１、ＬＡＴ１、ＴＭＥＭ１１９、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ３、およびＲＶＧ－２９の受容体から選択される標的に結合している。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、ポリペプチドが連結するタンパク質は、サイトカイン（好ましくは、ＩＬ－２またはＴＧＦβ）、または半減期延長ドメイン（好ましくは、アルブミン結合部分、免疫グロブリン結合部分、ＰＥＧ模倣ポリペプチド、ＰＥＧ化またはＨＥＳ化(HESylation)）である。

本発明の第２の態様の好ましい実施態様において、ポリペプチド多量体は、サイトカイン（好ましくは、ＩＬ－２またはＴＧＦβ）、または半減期延長ドメイン（好ましくは、アルブミン結合部分、免疫グロブリン結合部分、ＰＥＧ模倣ポリペプチド、ＰＥＧ化またはＨＥＳ化）をさらに含む。好ましくは、サイトカイン、半減期延長ドメインまたは免疫グロブリン結合部分は、ポリペプチドが連結するタンパク質に加えて、ポリペプチド多量体に存在する。

第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたは本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体をコードする核酸分子を提供する。核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはそれらのハイブリッドであり得る。好ましくは、核酸はまた、適切な発現系において本発明の第１の態様および第２の態様に記載のポリペプチドの発現を可能にする配列を含む。核酸は、各発現系についてコドン最適化され得る。

第４の態様において、本発明は、本発明の第３の態様に記載の核酸分子をコードするベクターを提供する。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体は、本発明の第３の態様に記載の導入された核酸分子によってコードされ、ベクターの導入により細胞内に発現されることが好ましい。好ましくは、ベクターは、適切な宿主細胞系において核酸によってコードされたポリペプチドの転写および発現を与える。好ましくは、発現ベクターは、細菌、酵母、バキュロウイルス、植物、ウイルスおよび哺乳類の発現ベクターからなる群から選択され、より好ましくは、発現ベクターは細菌発現ベクターまたは無細胞発現ベクターである。

第５の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の第１の態様に記載のポリペプチド、本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体、本発明の第３の態様に記載の核酸、または本発明の第４の態様に記載のベクターを提供する。

第６の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチド、本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体、本発明の第３の態様に記載の核酸、または本発明の第４の態様に記載のベクターを活性物質として含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容され得る担体および／または適切な賦形剤をさらに含む。医薬組成物は、固体、液体、半固体または経皮治療システムからなる群から選択される。本発明の医薬組成物は、本発明の第１の態様のポリペプチドおよび／または第２の態様のポリペプチド多量体を１つ以上含むことが想定される。

第７の態様において、本発明は、過剰増殖性障害、炎症性障害、自己免疫障害および代謝性疾患、循環器疾患、神経障害性疾患、ならびに神経傷害の予防または処置における使用のための、本発明の第１の態様に記載のポリペプチド、本発明の第２の態様に記載のポリペプチド多量体、本発明の第３の態様に記載の核酸、本発明の第４の態様に記載のベクター、または本発明の第５の態様に記載の医薬組成物を提供する。

好ましい過剰増殖性障害は、がんまたは血液系の悪性腫瘍である。

本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体によって予防または処置される特に好ましいがんは、消化管、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜、卵巣、精巣、皮膚のがん、浸潤性口腔がん、小細胞および非小細胞肺がん、ホルモン依存性乳がん、ホルモン非依存性乳がん、移行上皮がん、扁平上皮がん、神経性悪性腫瘍（神経芽細胞腫、神経膠腫を含む）、星状細胞腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、血管腫、内分泌性腫瘍(endocrinological tumor)、血液腫瘍（白血病、リンパ腫、ならびに他の骨髄増殖性疾患およびリンパ増殖性疾患を含む）、上皮内がん、過形成病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、血管増殖性疾患およびウイルス誘発性増殖性疾患、ケラチノサイトおよび／またはＴ細胞の過剰増殖によって特徴付けられる皮膚疾患である。本発明の化合物で処置され得る特に好ましい疾患は、固形腫瘍（特に、肺、乳房、膵臓、結腸直腸、卵巣、前立腺、および胃のがんおよび腺がん）である。

本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体によって予防または処置される好ましい炎症性疾患には、限定されないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（また、ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患）、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性膵炎、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー病／バロー同心性硬化症、ベーチェット病、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性閉塞性肺疾患、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、接触性皮膚炎、頭部動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破壊性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん性皮膚全身性硬化症、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、薬剤誘発性ループス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎（または特発性肺線維症）、胃炎、胃腸類天疱瘡（Gastrointestinal pemphigoid）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹（妊娠性類天疱瘡としても知られる）、汗腺膿瘍、Ｈｕｇｈｅｓ－Ｓｔｏｖｉｎ症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄性疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病を参照）、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎（若年性関節リウマチとしても知られる）、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルポイド肝炎（自己免疫性肝炎としても知られる）、エリテマトーデス、マジード症候群、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、モルフェア、ムッハ・ハーベルマン病（急性痘瘡状苔癬状粃糠疹としても知られる）、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、メニエール病、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（また、デビック病）、神経性筋強直症、眼部瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス、ミオクローヌス(yoclonus)症候群、オード(Ord's)甲状腺炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌関連性小児自己免疫性神経精神疾患）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、Ｐａｒｒｙ Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、毛様体扁平部炎、パーソネージ・ターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎(Perivenous encephalomyelitis)、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、ＡＰＳの別の形態であるシュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、全身硬直症候群、スチル病（若年性関節リウマチを参照）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スイート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（エリテマトーデスを参照）、高安動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られる）、血小板減少症、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つの種類のうちの１つ）、混合性結合組織病とは異なる未分化結合組織病、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれる。過敏症には、限定されないが、アレルギー（喘息、アナフィラキシーまたはアトピーなど）；細胞傷害抗体依存性疾患（自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症、リウマチ性心疾患、胎児赤芽球症、グッドパスチャー症候群、膜性腎症、バセドウ病、重症筋無力症など）；免疫複合体病（血清病、アルサス反応、関節リウマチ、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、外因性アレルギー性肺胞炎（過敏性肺炎）など）、接触性皮膚炎などの細胞免疫応答、ツベルクリン反応、慢性移植片拒絶、および多発性硬化症が含まれる。

本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体によって予防または処置される特に好ましい神経変性疾患には、アルツハイマー病、ＨＩＶ関連認知症、片頭痛、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、タウオパチー、ピック病、パーキンソン病、神経障害、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、フリートライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、クールー、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、およびバッテン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、神経障害性疼痛、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、バロー病、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ－Ｉ関連脊髄症、視神経脊髄炎、視神経萎縮、非動脈炎性前部虚血性視神経症、シルダー病、横断性脊髄炎、横断性脊髄炎、脳卒中、てんかん、糖尿病性神経障害が含まれる。

本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体によって予防または処置される特に好ましい循環器疾患には、限定されないが、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、混合型脂質異常症、冠動脈心疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、心筋症、血管炎、炎症性心疾患、虚血性心疾患、うっ血性心不全、心臓弁膜症、高血圧、心筋梗塞、糖尿病性心疾患、塞栓症、動脈瘤、高血圧性心疾患、仮性動脈瘤、脳卒中、および不整脈が含まれる。

本発明のポリペプチドまたはポリペプチド多量体によって予防または処置される特に好ましい代謝性疾患には、限定されないが、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、およびインスリン抵抗性が含まれる。

実施例１：本発明のタンパク質の遺伝子工学
ヒトＴＮＦＲ２選択的ＴＮＦ（ＴＮＦ_Ｒ２）変異体ドメインを、ＴＮＦＲ２に対して排他的な特異性を示すため、分子の生物活性をＴＮＦ受容体２に制限する変異Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒを含むヒトＴＮＦの外部ドメインから設計した（Loetscher et al., 1993, J. Biol. Chem. 268, 26350-26357）。ｓｃＴＮＦ誘導体を生成するために使用されるＴＮＦＲ２選択的ＴＮＦ（ＴＮＦ_Ｒ２）変異体ドメインは、可変のＮ末端開始位置に起因する種々の長さによって特徴付けられる。詳細には、本発明のタンパク質は、ａａ残基８０、８２、８４、８５、８６および８８にそれぞれＮ末端開始位置を有し、ａａ２３３（Ｃ末端）で終了するヒトＴＮＦ_Ｒ２変異体ドメインを含む（表１を参照；ＵｎｉＰＲｏｔＫＢエントリーＰ０１３７５に由来するヒトＴＮＦ配列）。これらのドメインの一本鎖誘導体（ｓｃＴＮＦ_Ｒ２）を、３つのＴＮＦ_Ｒ２変異体ドメインを１つのポリペプチド鎖に融合させることによって作製した。この遺伝子融合物は、２つのペプチドリンカーを用いて３つのＴＮＦドメインを連結するか、またはペプチドリンカーを用いずにＴＮＦドメインを直接融合するかのいずれかによって達成された。参照分子１１８に存在するように、５ａａ残基からなるグリシン－セリンペプチドリンカーＬ１（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２６）と組み合わせた、ａａ位置８０におけるＴＮＦ_Ｒ２変異体のＮ末端開始位置を、最先端であるとみなした（Fischer et al., 2011, PLoS One, e27621）。詳細には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体のＴＮＦドメインを、ＧＧＧＧＳ（配列番号２６）（ＴＮＦのａａ８０から始まる、バリアント１１８［配列番号６５］）、ＧＧＧＧ（配列番号１６）（ＴＮＦのａａ８５から始まる、バリアント１３９［配列番号６８］）、またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３４）（ＴＮＦのａａ８８から始まる、バリアント１３８［配列番号６９］）からなるペプチドリンカーＬ１と融合させた。対照的に、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体１２７［配列番号６６］、１３０［配列番号７０］、１２９［配列番号６７］および１３１［配列番号７１］において、種々の長さの３つのＴＮＦＲ２特異的ＴＮＦドメイン（表１、図１を参照）を、連結ペプチドリンカーを伴わずに直接融合させた（ＴＮＦのａａ８０から始まるバリアント１２７、ＴＮＦのａａ８２から始まるバリアント１３０、ＴＮＦのａａ８４から始まるバリアント１２９、ＴＮＦのａａ８６から始まるバリアント１３１）。ＴＮＦ－Ｒ２選択的なヒトｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体は、３つのＴＮＦ ＴＨＤの三価の配置を示す（すなわち、３つのＴＮＦＲ２結合部位を形成している）。

最先端のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体バリアント１１８および選択されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体バリアント（１２７、１２９、１３９）を、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号５）からなるペプチドリンカーＬ２を介してＦｃ（Δａｂ）二量体化領域のＮ末端に連結した（このＦｃ領域は、Ｆｃエフェクター機能（Ｆｃγ受容体および補体成分Ｃ１への結合など）の欠失のための変異を含む；Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624）。これらの六価の融合タンパク質（すなわち、６つのＴＮＦＲ２結合部位を示すタンパク質）を、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１１８）－Ｆｃ（Δａｂ）（７４５）［配列番号７２］、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１２７）－Ｆｃ（Δａｂ）（７４２）［配列番号７３］、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１２９）－Ｆｃ（Δａｂ）（７４３）［配列番号７４］、およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１３９）－Ｆｃ（Δａｂ）（７４４）［配列番号７５］と表す（表２、図１を参照）。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２およびすべての複合体の全体的なコドン使用頻度を、哺乳類細胞における発現に適応させた。上清へのタンパク質の分泌を促進するために、Ｉｇκリーダー配列をコンストラクトのＮ末端に融合させた。タンパク質の精製を容易にするために、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体においてＮ末端にＨｉｓタグを導入したが、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体では省略した。詳細には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）変異体のコーディングＤＮＡ配列を哺乳類発現ベクターにクローニングし、単独の６×Ｈｉｓタグ付き一本鎖タンパク質６×Ｈｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（ｐＴＴ５ベクター）または非タグ付きＦｃ融合タンパク質ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）（ｐＳｅｃＴａｇベクター）としての組換え産生を可能にした。
表１：最先端の分子ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１１８および本発明のｓｃＴＮＦ_Ｒ２タンパク質。

表２：参照ｓｃＴＮＦモジュール（＃１１８）を含むｓｃＴＮＦ－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質および本発明のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ分子の命名法。

実施例２：本発明のタンパク質の産生および精製
すべてのタンパク質（実施例１参照）を、Ｆ１７培地（Life Technologies）中で３７℃および５％ＣＯ_２において振盪条件下で増殖させたＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（ＮＲＣ－ＢＲＩ）中に産生させ、この細胞にはポリエチレンイミン（Polysciences）を用いてプラスミドＤＮＡを一過性に遺伝子導入した。翌日に０．５％トリプトンＮ１（Organotechnie）を細胞培養物に添加し、細胞をさらに５日間培養した。次いで上清を回収し、セルフリーで遠心分離し、そこから組換えタンパク質を単離した。

６×Ｈｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体を、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。簡潔に述べると、上清をＮｉ－ＮＴＡアガロース（Macherey-Nagel）とともにローラーミキサー上において４℃で１６時間バッチインキュベートした後、クロマトグラフィーカラムに回収した。結合していないタンパク質を、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を用いて除去した。結合したタンパク質をＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）を用いて溶出し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した（メンブレンカットオフ１４ｋＤａ、Roth）。

ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。上清をProtein A Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）またはToyopearl AF-rProtein A-650F（Tosoh）ととともにローラーミキサー上において４℃で１６時間バッチインキュベートし、クロマトグラフィーカラムに回収した。結合していないタンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて除去した。結合したタンパク質をプロテインＡ溶出緩衝液（１００ｍＭ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ３．５）を用いて溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０を添加することによって直ちに中和し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した（メンブレンカットオフ１４ｋＤａ、Roth）。表３は、アフィニティークロマトグラフィー工程後に得られた実施例１に記載のタンパク質のタンパク質量の例を示す。

透析したタンパク質をゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー）によってさらに精製した。タンパク質調製物をＡＫＴＡ ＦＰＬＣ装置（GE Healthcare）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare）上で分離し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて溶出した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの分光測定により決定し、個々の吸光係数を用いて算出した。

タンパク質調製物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびそれに続くクーマシー染色によって分析した（図２）。実施例１における精製したタンパク質５μｇまたは３μｇを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、４Ｍ尿素、１％ＳＤＳ、１５％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で還元条件下（５％２－メルカプトエタノール存在下）および非還元条件下（２－メルカプトエタノール非存在下）において変性させ、１０％または１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質の可視化のために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅステイン（Expedion）中でインキュベートした。
表３：組換え発現およびアフィニティー精製後のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）分子の収量。

１）Ni-NTA IMAC後
２）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後

実施例３：天然条件下での本発明のタンパク質の分子完全性および純度
実施例１におけるタンパク質の純度およびオリゴマー化状態を、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに特徴付けた。約２０μｇのタンパク質を、ＳＥＣ緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ６．７）で平衡化したＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲ、７．８×３００ｍｍカラム（Tosoh Bioscience）に適用し、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２および複合体は予想されるサイズにおいて単一の主要なピークとして溶出し、これはタンパク質の正確な構築および高い純度を示していた（図３を参照）。

実施例４：本発明のタンパク質の熱安定性
実施例１におけるタンパク質の熱安定性を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ装置を用いた動的光散乱法によって分析した。タンパク質をＰＢＳで１５０μｇ／ｍｌに希釈し（総量１．１ｍｌ）、石英キュベットに移した。以前に報告された参照バリアントｓｃＴＮＦ_Ｒ２１１８は、６２℃の変性（凝集の開始）温度を示した（図４、表４を参照）。さらに、このタンパク質の最初の部分的な変性は、４９℃の温度で既に観察されていた。対照的に、改変されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体１２７、１２９および１３９は、それぞれ６７℃（１２７、１３９）および７２℃（１２９）の大幅に上昇した融点を示した。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体１３８の融点は参照バリアントと比較して変化しないままであり（６２℃）、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体１３０および１３１はわずかに低下した熱安定性を示した。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントをＦｃ（Δａｂ）領域と融合させた後、参照ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体１１８を含むバリアント７４５は７１℃の融点を示した（図４、表５）。注目すべきことに、熱安定性が向上したｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体（１２７、１２９および１３９）を含むｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体７４２、７４３および７４４は、バリアント７４５と比較して明らかに高い融点を示した。例えば、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアント１２７を含むｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）バリアント７４２およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアント１３９を含むｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）バリアント７４４はともに７４℃の融点を示した。要約すると、特定のｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体（例えば、バリアント１２７および１３９）のより高い熱安定性は、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の全体的なより高い熱安定性をもたらした。

タンパク質：
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２分子１１８、１２７、１２９、１３０、１３１、１３８および１３９をＮｉ－ＮＴＡ－ＩＭＡＣおよびゲル濾過によって精製し、１ｘＰＢＳ緩衝液（８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に溶出した。タンパク質は１ｘＰＢＳ中に以下の濃度で存在していた：２３０μｇ／ｍｌ（１１８）、３００μｇ／ｍｌ（１２７）、４８０μｇ／ｍｌ（１２９）、２３０μｇ／ｍｌ（１３０）、２６０μｇ／ｍｌ（１３１）、１１０μｇ／ｍｌ（１３８）、および４５０μｇ／ｍｌ（１３９）。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質７４５、７４２、７４３および７４４をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過によって精製し、１ｘＰＢＳ緩衝液中に溶出した。タンパク質は１ｘＰＢＳ中に以下の濃度で存在していた：８００μｇ／ｍｌ（７４５）、１２００μｇ／ｍｌ（７４２）、３２０μｇ／ｍｌ（７４３）、および１７００μｇ／ｍｌ（７４４）。

ＤＬＳ測定：
動的光散乱法による凝集温度の分析のために、タンパク質を１５０μｇ／ｍｌの濃度にカルシウムおよびマグネシウムを含まないＤＰＢＳ（Gibco、カタログ番号１４１９０１４４；８．０６ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．６７ｍＭ ＫＣｌ、１３７．９ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～７．３）で希釈した。タンパク質１３８を希釈せずに分析した。１．１ｍｌの希釈したタンパク質溶液を、あらかじめ５ｘ１ｍｌ ＤＰＢＳで平衡化したＡｃｒｏｄｉｓｃ１３ｍｍシリンジフィルター、０．２μｍ（Pall Corporation, part number 4602）により粒子を含まないように濾過し、あらかじめ１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、かつ脱イオン水およびＤＰＢＳで十分に洗浄した円形の開口部を有するＰＣＳ８５０１ガラスキュベット（Malvern Panalytical）に移した。次いで、キュベットを、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙソフトウェア５．００によって制御された、予熱されたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ ＺＥＮ３６００、シリアル番号ＭＡＬ５０１０１５(Malvern Panalytical)の測定チャンバー内に設置した。測定をマニュアルモードにおいて以下のソフトウェア設定で行った：
・物質：タンパク質、ＲＩ １．４５；吸収、０．００
・分散剤：ＩＣＮ ＰＢＳタブレット；温度、２５℃；粘度、０．８８８２ｃＰ；ＲＩ、１．３３
・セルの種類：ＰＣＳ８５０１
・トレンドシーケンス(Trend sequence)：開始温度、２５℃；終了温度、８５℃；温度間隔、１．０℃；融点のチェックなし
・サイズ測定：平衡化時間、２分；測定回数、２；測定間の遅延、０秒；測定設定の最適化なし；測定時間、自動；高度な位置決め方法自動減衰選択(Advanced, Positioning method automatic attenuation selection)；データ処理、分析モデルの複数の限定的なモード(Analysis model multiple narrow modes)（高解像度）。

各温度で測定した２つのｋｃｐｓ値の平均値を算出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４．０（GraphPad Software Inc.）を用いて温度に対してプロットした。凝集温度を、商ｋｃｐｓ_Ｔ／ｋｃｐｓ_{（Ｔ－５）}が少なくとも係数２．０に達する温度Ｔと定義した。
表４：動的光散乱法によって決定したｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体の変性温度。

表５：動的光散乱法によって決定したｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の変性温度。

表６：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１１８のＤＬＳ測定

表７：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１２７のＤＬＳ測定

表８：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１２９のＤＬＳ測定

表９：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１３０のＤＬＳ測定

表１０：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１３１のＤＬＳ測定

表１１：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１３８のＤＬＳ測定

表１２：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１３９のＤＬＳ測定

表１３：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４５のＤＬＳ測定

表１４：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４２のＤＬＳ測定

表１５：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４３のＤＬＳ測定

表１６：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４４のＤＬＳ測定

実施例５：８０Ｍ２抗体を用いたＴＮＦ－Ｒ２共活性化を伴う、および伴わないＫｙｍ－１細胞に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体のインビトロでの生理活性
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体の基本的な生理活性を、Ｋｙｍ－１細胞を用いたインビトロでのアッセイにおいて分析した。Ｋｙｍ－１上のＴＮＦＲ２の刺激は内在性ＴＮＦの発現をもたらし、これはＴＮＦＲ１を介したシグナル伝達の活性化により細胞のアポトーシスを誘導する。注目すべきことに、純粋な三価ｓｃＴＮＦ_Ｒ２はＴＮＦＲ２の活性化に関してほとんど不活性であることが示されており、生理活性のために（例えば、自身は非アゴニストである抗ＴＮＦＲ２抗体８０Ｍ２を用いることによる）ＴＮＦＲ２架橋をさらに必要とする。実験のために、１５，０００Ｋｙｍ－１細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養し、段階希釈したタンパク質とともに３通りでさらに２４時間インキュベートした。ＴＮＦＲ２架橋の条件下において、２通りで滴定したタンパク質を添加する３０分前に、１μｇ／ｍｌ ８０Ｍ２抗体（Hycult Biotech）を細胞に添加した。細胞生存率をクリスタルバイオレット染色によって決定した。データを、処理していない対照および陽性対照（１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）に対して正規化した。８０Ｍ２と組み合わせて、すべてのｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントはＫｙｍ－１細胞の細胞死を誘導した。しかしながら、いくつかの変異体（例えば１２９）は、参照ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１１８と比較して低下した活性を示した（図５、表１７）。
表１７：抗体８０Ｍ２によるＴＮＦ－Ｒ２架橋と組み合わせたｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体のＫｙｍ－１細胞に対する生理活性のＥＣ_５０値。

実施例６：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の固定化されたＴＮＦ－Ｒ２への結合
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＴＮＦＲ２－Ｆｃ（エタネルセプト）への結合をＥＬＩＳＡによって分析した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを２００ｎｇ／ウェルのエタネルセプトでコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中において４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中の２％スキムミルクでブロックし、洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体を２通りで滴定し、プレート上で室温において２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄した。受容体に結合した複合体をマウス抗ｈｕＴＮＦα Ｆ６Ｃ５（Novus、１μｇ／ｍｌ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、１：１０，０００）で検出した後、それぞれＰＢＳＴで広範に洗浄した。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体は、サブナノモル濃度範囲のＥＣ_５０値を伴ってＴＮＦ－Ｒ２－Ｆｃへの用量依存的な結合を示した（図６、表１８）。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４２、７４３および７４４は、最先端のｓｃＴＮＦ_Ｒ２分子１１８を含むｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４５バリアントと同等の結合挙動を示した。
表１８：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＴＮＦ－Ｒ２－Ｆｃへの結合のＥＣ_５０値（平均値±Ｓ．Ｄ、ｎ＝３）。

実施例７：細胞上のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＴＮＦ－Ｒ２選択的結合
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の、ヒトＴＮＦＲ１（ＭＥＦ－ＴＮＦＲ１）またはヒトＴＮＦＲ２（ＭＥＦ－ＴＮＦＲ２）を安定に遺伝子導入したマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）への結合をフローサイトメトリーによって分析した（Krippner-Heidenreich et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 44155-44163）。そのために、細胞をトリプシン処理し、氷冷したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で１回洗浄した。試料毎に２００，０００個の細胞を、段階希釈したｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体とともに１００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液中で４℃において２時間インキュベートした。次に、結合していないタンパク質をＦＡＣＳ緩衝液での２回の洗浄工程によって除去した後、抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）－Ｒ－フィコエリスリン抗体（Sigma-Aldrich、１：５００）で４℃において１時間検出した。ＦＡＣＳ緩衝液での２回の最終的な洗浄工程の後、細胞を５８５／４０ｎｍフィルターを備えたＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０により分析した。すべてのｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）分子（７４５、７４２、７４３および７４４）は、ＭＥＦ－ＴＮＦＲ２への用量依存的な結合を示した（図７、表１９）。しかしながら、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体７４２および７４４は、（約６０ｐＭのＥＣ_５０値を有する）最先端のｓｃＴＮＦ_Ｒ２分子１１８を含むｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４５バリアントと同じＥＣ_５０値を示し、分子ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４３はＭＥＦ－ＴＮＦＲ２への（約２．８倍低下した）より弱い結合を示した（１６８ｐＭのＥＣ_５０値）。さらに、ＭＥＦ－ＴＮＦＲ１に対してｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の結合は検出できず、これは分子のＴＮＦＲ２に対する選択性を示していた。
表１９：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＭＥＦ－ＴＮＦＲ２－Ｆｃへの結合のＥＣ_５０値。

実施例８：Ｋｙｍ－１細胞に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のインビトロでの生理活性
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のインビトロでの生理活性を、抗体８０Ｍ２の添加によるＴＮＦＲ２架橋を省略したことを除いて実施例５に記載の実験設定と同様の実験設定においてＫｙｍ－１細胞に対して分析した（六価のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質はＴＮＦＲ２架橋を必要としない）（図８、表２０）。Ｋｙｍ－１細胞に対して、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４２は、最先端のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアント１１８を含む参照分子ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４５と同等の生理活性を示した。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４４は、（約４倍）低下した生理活性を示した。しかしながら、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４３の生理活性は、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４５と比較して大きく（約２２８倍）低下していた。これらの知見は、短すぎるペプチドリンカーによる構造特性が、タンパク質フォールディングおよび受容体の活性化に負の影響を与えることを示している。
表２０：Ｋｙｍ－１細胞に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の生理活性のＥＣ_５０値（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。

実施例９：ＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞におけるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体によるＮＦ－κＢ活性化
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体によるインビトロでのＮＦ－κＢ活性化を、ヒトＴＮＦ受容体２を安定に遺伝子導入したＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２）においてルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて分析した。このために、９６ウェル毎に１５，０００個の細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で培養した。２４時間後に培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ、PenStrep）を交換し、細胞にリポフェクタミン２０００（Thermo、４μｌ／１μｇのＤＮＡ）を用いてｐＮＦ－κＢ Ｌｕｃホタルルシフェラーゼ実験レポータープラスミド（６６ｎｇ／ウェル）（Agilent Technologies）およびｐＲＬ－ＴＫウミシイタケルシフェラーゼ対照プラスミド（３３ｎｇ／ｗｅｌｌ）（Promega）を一過性に遺伝子導入した。１６時間培養した後、遺伝子導入した細胞を２通りで滴定したｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質で刺激した。６時間刺激した後、培地をフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ／５％ＦＢＳ（３５μｌ／ウェル）に交換し、Ｓｐａｒｋ（登録商標）マイクロプレートリーダー（Tecan）を用いた発光検出と組み合わせてＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）によりルシフェラーゼ活性を測定した。ｐＮＦ－κＢにより制御されるホタルルシフェラーゼ活性を、個々のウェルにおいて対照のウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。ＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞におけるＮＦ－κＢ活性は、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の濃度に依存してＳ字形の用量反応を示した（図９）。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体の生理活性を反映する４回の独立した実験から算出されたＥＣ_５０値（表２１）は、タンパク質７４５、７４２および７４４について統計的に有意な差を示さなかった（Ｐ＞０．０５、テューキーの事後検定を伴う一元配置分散分析）。しかしながら、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４３は、ＮＦ－κＢ活性化に関して最先端のタンパク質７４５と比較して統計的に有意な（ｐ＜０．０１）より低い（約９５倍低下した）生理活性を示した。
表２１：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）複合体のＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞に対するＮＦ－κＢ活性化のＥＣ_５０値（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）。

実施例１０：ヒト血漿中のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質の安定性
３７℃での３日および８日のインキュベーション期間後におけるヒト血漿中のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質の安定性を、タンパク質試料のＴＮＦ－Ｒ２を安定に過剰発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２、Richter et al., 2012, Mol. Cell Biol. 32, 2515-2529）への結合によって評価した。詳細には、１ｘＰＢＳ（８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の５．１７μＭ（７４５）、８．０５μＭ（７４２）、２．１１μＭ（７４３）および１１．２５μＭ（７４４）の保存濃度のタンパク質を、ＰＢＳで４００ｎＭの濃度に希釈し、５０％ヒト血漿（最終タンパク質濃度２００ｎＭ）中で３７℃において０日間（対照）、３日間または８日間インキュベートした。インキュベーション後、試料を－８０℃で保存し、フローサイトメトリーにおいてＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２への結合によってタンパク質の完全性を試験する前に解凍した。このために、５０～７０％の培養密度を有するＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞をトリプシン処理し、氷冷したＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で１回洗浄した。試料毎に１５０，０００個の細胞を、３０ｎＭから開始してＦＡＣＳ緩衝液と１：３で段階希釈したｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質とともに１００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液中でＶ底９６ウェルプレートにおいて４℃で１．５時間インキュベートした。次に、結合していないタンパク質をＦＡＣＳ緩衝液での２回の洗浄工程によって除去した。そこで、Ｖ底９６ウェルプレートを５００×ｇで遠心分離し、ウェル内の液体を吸引装置で除去した。ウェルあたり１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、穏やかに上下にピペッティングして細胞ペレットを再懸濁した。結合したタンパク質を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的－Ｒ－フィコエリスリン抗体（Jackson ImmunoResearch、１：５００）により４℃で１時間検出した。ＦＡＣＳ緩衝液での２回の最終的な洗浄工程の後、細胞をフィコエリスリンの検出のために５８６／１５ｎｍフィルターを備えたＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ＶＹＢフローサイトメーターで分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて結合曲線をフィットし、４回の独立した実験から結合のＥＣ_５０値を算出した。インキュベートしていない対照に対するＥＣ_５０値の正規化によって得られた値の逆数から、単一の各実験について無傷のタンパク質の割合を算出した。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質７４２および７４４について無傷のタンパク質の量の低下は観察されなかったが、タンパク質ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質７４５は３日後および８日後において約８０％の残存活性へのわずかな低下を示した。対照的に、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４３は、８日後の約４０％の残存を伴う無傷のタンパク質の時間に依存した大きな低下を示した。これらのデータは、バリアント７４２および７４４が、親のバージョン７４５および改変されたバージョン７４３と比較して、生理的条件下で統計的に有意に改善された安定性を示すことを確認している。
表２２：５０％ヒト血漿中でインキュベートしたｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質のＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞への結合のＥＣ_５０値（ｐＭ）。

実施例１１：本発明のタンパク質のさらなるバリアント
可変のＮ末端開始位置（Ｘ_Ｎ）およびリンカーＸ_Ｌの長さによる種々のリンカー組成によって特徴付けられるＴＮＦＲ２に選択的なさらなるヒトｓｃＴＮＦ誘導体を作製した。詳細には、タンパク質は、ａａ残基８１、８２、８３および８４にそれぞれＮ末端開始位置を有し、ａａ２３３（Ｃ末端）で終了するヒトＴＮＦＲ２変異体ドメインを含む（表１および２を参照；ＵｎｉＰＲｏｔＫＢエントリーＰ０１３７５に由来するヒトＴＮＦ配列）。これらのドメインの一本鎖誘導体（ｓｃＴＮＦ_Ｒ２）を、３つのＴＮＦＲ２変異体ドメインを１つのポリペプチド鎖に融合させることによって作製した。この遺伝子融合物は、２つのペプチドリンカーを用いて３つのＴＮＦドメインを連結するか、またはペプチドリンカーを用いずにＴＮＦドメインを直接融合するかのいずれかによって達成された。詳細には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体のＴＮＦドメインを、それぞれ直接融合させるか（バリアント１４０、配列番号７６）、または１つのグリシンからなるペプチドリンカー（バリアント１４１、配列番号７７；バリアント１４２、配列番号７８）、２つのグリシン（バリアント１４４、配列番号８０ バリアント１４５、配列番号８１）、３つのグリシン（バリアント１４３、配列番号７９；バリアント１４６、配列番号８２）、もしくは４つのグリシン（バリアント１４７、配列番号８３）とともに融合させた（表２３）。ＴＮＦ－Ｒ２選択的なヒトｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体は、３つのＴＮＦ ＴＨＤの三価の配置を示す（すなわち、３つのＴＮＦＲ２結合部位を形成している）。

さらに、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体バリアントを、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号９２）からなるペプチドリンカーＬ２を介してＦｃ（Δａｂ）二量体化領域のＮ末端に連結し、六価のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ融合タンパク質を作製した（このＦｃ領域は、Ｆｃエフェクター機能（Ｆｃγ受容体および補体成分Ｃ１への結合など）の欠失のための変異を含む；Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29, 2613-2624）。これらの六価の融合タンパク質（すなわち、６つのＴＮＦＲ２結合部位を示すタンパク質）を、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１４０）－Ｆｃ（Δａｂ）（タンパク質１４８、配列番号８４）、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１４１）－Ｆｃ（Δａｂ）（タンパク質１４９、配列番号８５）、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１４３）－Ｆｃ（Δａｂ）（タンパク質１５１、配列番号８７）、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１４４）－Ｆｃ（Δａｂ）（タンパク質１５２、配列番号８８）、およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２（１４５）－Ｆｃ（Δａｂ）（タンパク質１５３、配列番号８９）と表す（表２４）。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２およびすべてのＦｃ融合タンパク質の全体的なコドン使用頻度を、哺乳類細胞における発現に適応させた。上清へのタンパク質の分泌を促進するために、Ｉｇκリーダー配列をコンストラクトのＮ末端に融合させた。タンパク質の精製を容易にするために、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体においてＮ末端にＨｉｓタグを導入したが、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質では省略した。詳細には、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）変異体のコーディングＤＮＡ配列を哺乳類発現ベクターにクローニングし、単独の６×Ｈｉｓタグ付き一本鎖タンパク質６×Ｈｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２（ｐＴＴ５ベクター）または非タグ付きＦｃ融合タンパク質ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）（ｐＳｅｃＴａｇベクター）としての組換え産生を可能にした。
表２３：実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアント。

表２４：実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃバリアント

実施例１２：実施例１１のタンパク質の産生および精製
実施例１１のすべてのタンパク質を、Ｆ１７培地（Life Technologies）中で３７℃および５％ＣＯ_２において振盪条件下で増殖させたＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（ＮＲＣ－ＢＲＩ）中に産生させ、この細胞にはポリエチレンイミン（Polysciences）を用いてプラスミドＤＮＡを一過性に遺伝子導入した。翌日に０．５％トリプトンＮ１（Organotechnie）を細胞培養物に添加し、細胞をさらに５日間培養した。次いで上清を回収し、セルフリーで遠心分離し、そこから組換えタンパク質を単離した。

６×Ｈｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体を、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。簡潔に述べると、上清をＮｉ－ＮＴＡアガロース（Macherey-Nagel）とともにローラーミキサー上において４℃で１６時間バッチインキュベートした後、クロマトグラフィーカラムに回収した。結合していないタンパク質を、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を用いて除去した。結合したタンパク質をＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）を用いて溶出し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した（メンブレンカットオフ１４ｋＤａ、Roth）。

ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。上清をProtein A Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）またはToyopearl AF-rProtein A-650F（Tosoh）ととともにローラーミキサー上において４℃で１６時間バッチインキュベートし、クロマトグラフィーカラムに回収した。結合していないタンパク質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて除去した。結合したタンパク質をプロテインＡ溶出緩衝液（１００ｍＭ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ３．５）を用いて溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０を添加することによって直ちに中和し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した（メンブレンカットオフ１４ｋＤａ、Roth）。

透析したタンパク質を調製用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。タンパク質調製物をＡＫＴＡ ＦＰＬＣ装置（GE Healthcare）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（GE Healthcare）上で分離し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて溶出した。タンパク質濃度を２８０ｎｍでの分光測定により決定し、個々の吸光係数を用いて算出した。

タンパク質調製物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびそれに続くクーマシー染色によって分析した（図１１および１２）。実施例１１における精製したタンパク質２．５μｇを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、４Ｍ尿素、１％ＳＤＳ、１５％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で還元条件下（５％２－メルカプトエタノール存在下）および非還元条件下（２－メルカプトエタノール非存在下）において変性させ、１０％または１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質の可視化のために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅステイン（Expedion）中でインキュベートした。

実施例１３：天然条件下での実施例１１のタンパク質の分子完全性および純度
実施例１１におけるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質の純度およびオリゴマー化状態を、分析用ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに特徴付けた。約２０μｇのタンパク質を、ＳＥＣ緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ６．７）で平衡化したＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲ、７．８×３００ｍｍカラム（Tosoh Bioscience）に適用し、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。融合タンパク質は（約１６０ｋＤａの見かけの分子量を伴って）予想されるサイズにおいて単一のピークとして溶出し、これはタンパク質の正確な構築および高い純度を示していた（図１３を参照）。

実施例１４：実施例１１のタンパク質の熱安定性
実施例１１におけるタンパク質の熱安定性を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ装置を用いた動的光散乱法によって分析した。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２分子１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、および１４７は１ｘＰＢＳ（８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に以下の濃度で存在していた：３７０μｇ／ｍｌ（１４０）、３５０μｇ／ｍｌ（１４１）、４５０μｇ／ｍｌ（１４２）、１．１ｍｇ／ｍｌ（１４３）、４３０μｇ／ｍｌ（１４４）、１７０μｇ／ｍｌ（１４５）、３５０μｇ／ｍｌ（１４６）、および４７０μｇ／ｍｌ（１４７）。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、および１５５は１ｘＰＢＳ中に以下の濃度で存在していた：１．５９ｍｇ／ｍｌ（１４８）、２．３５ｍｇ／ｍｌ（１４９）、１．５９ｍｇ／ｍｌ（１５１）、１．５９ｍｇ／ｍｌ（１５２）、および２２０μｇ／ｍｌ（１５３）。

タンパク質を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＤＰＢＳ（Gibco、カタログ番号１４１９０１４４；８．０６ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．６７ｍＭ ＫＣｌ、１３７．９ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～７．３）で総量１．１ｍｌにおいて１００μｇ／ｍｌに希釈し、石英キュベットに移し、以下のように動的光散乱法（ＤＬＳ）によって分析した：１．１ｍｌの希釈したタンパク質溶液を、あらかじめ５ｘ１ｍｌ ＤＰＢＳで平衡化したＡｃｒｏｄｉｓｃ１３ｍｍシリンジフィルター、０．２μｍ（Pall Corporation, part number 4602）により粒子を含まないように濾過し、あらかじめ１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、かつ脱イオン水およびＤＰＢＳで十分に洗浄した円形の開口部を有するＰＣＳ８５０１ガラスキュベット（Malvern Panalytical）に移した。次いで、キュベットを、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙソフトウェア５．００によって制御された、予熱されたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－ＺＳ ＺＥＮ３６００、シリアル番号ＭＡＬ５０１０１５(Malvern Panalytical)の測定チャンバー内に設置した。測定をマニュアルモードにおいて以下のソフトウェア設定で行った：
・物質：タンパク質、ＲＩ １．４５；吸収、０．００
・分散剤：ＩＣＮ ＰＢＳタブレット；温度、２５℃；粘度、０．８８８２ｃＰ；ＲＩ、１．３３
・セルの種類：ＰＣＳ８５０１
・トレンドシーケンス：開始温度、２５℃；終了温度、８５℃；温度間隔、１．０℃；融点のチェックなし
・サイズ測定：平衡化時間、２分；測定回数、２；測定間の遅延、０秒；測定設定の最適化なし；測定時間、自動；高度な位置決め方法自動減衰選択；データ処理、分析モデルの複数の限定的なモード（高解像度）。

各温度で測定した２つのｋｃｐｓ値の平均値を算出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（GraphPad Software Inc.）を用いて温度に対してプロットした。凝集温度を、商ｋｃｐｓ_Ｔ／ｋｃｐｓ_{（Ｔ－５）}が少なくとも係数２．０に達する温度Ｔと定義した。

元のバリアント１１８（図１を参照）と比較して、改変されたｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７は、それぞれ６７℃（バリアント１４５、１４６）、６８℃（バリアント１４１、１４３、１４４、１４７）、および６９℃（バリアント１４０、１４２）の大幅に上昇した融点を示した（図１４、表２５～３３参照）。

Ｘａの長さが１０ａａであるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃバリアントは、バリアント７４２（図１を参照）と同等の７４℃（バリアント１４９、１５２）および７５℃（バリアント１５４）の融点を示した（図１５、表３４～４１）。注目すべきことに、Ｘａの長さが９ａａであるｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質は、７８℃（バリアント１４８、１５３）、７６℃（バリアント１５１）および７５℃（バリアント１５０）の上昇した熱安定性を示した。要約すると、実施例１１のすべてのｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントは、バリアント１１８（図１）に対して上昇した熱安定性を示した。対応するｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃバリアントの熱安定性はバリアント７４５（図１）と比較して有意に上昇しており、９ａａのＸａリンカー長を含むバリアントは１０ａａのＸａリンカー長を含むバリアントよりも安定していた。
表２５：動的光散乱法によって決定したｓｃＴＮＦ_Ｒ２変異体の変性温度。

表２６：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４０のＤＬＳ測定

表２７：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４１のＤＬＳ測定

表２８：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４２のＤＬＳ測定

表２９：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４３のＤＬＳ測定

表３０：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４４のＤＬＳ測定

表３１：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４５のＤＬＳ測定

表３２：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４６のＤＬＳ測定

表３３：６ｘＨｉｓ－ｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４７のＤＬＳ測定

表３４：動的光散乱法によって決定したｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃタンパク質の変性温度。

表３５：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１４８のＤＬＳ測定

表３６：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１４９のＤＬＳ測定

表３７：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１５０のＤＬＳ測定

表３８：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１５１のＤＬＳ測定

表３９：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１５２のＤＬＳ測定

表４０：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１５３のＤＬＳ測定

表４１：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ１５４のＤＬＳ測定

実施例１５：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質の固定化されたＴＮＦ－Ｒ２への結合
ｓｃＴＮＦ_Ｒ２およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質のヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃ（エタネルセプト）への結合をＥＬＩＳＡによって分析した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを２００ｎｇ／ウェルのエタネルセプトでコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）中において４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中の２％スキムミルクでブロックし、洗浄緩衝液ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。ＳｃＴＮＦ_Ｒ２およびｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質を２通りで滴定し、プレート上で室温において２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄した。受容体に結合した複合体をマウス抗ｈｕＴＮＦα Ｆ６Ｃ５（Novus、１μｇ／ｍｌ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich、１：１０，０００）で検出した後、ＨＲＰ基質とともにインキュベートする前にそれぞれＰＢＳＴで広範に洗浄した。

ｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントは、低いナノモル濃度範囲のＥＣ_５０値を伴ってＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃへの類似の用量依存的な結合を示した（図１６、表４２）。ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）融合タンパク質は、サブナノモル濃度範囲のより低いＥＣ_５０値を示し（図１７、表４３）、これは結合活性効果による六価のＦｃ融合タンパク質の結合の増加を示していた。
表４２：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントのヒトＴＮＦＲ２－Ｆｃへの結合のＥＣ_５０値

表４３：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ融合タンパク質バリアントのＴＮＦＲ２－Ｆｃへの結合のＥＣ_５０値

実施例１６：８０Ｍ２抗体を用いたＴＮＦ－Ｒ２共活性化を伴うＫｙｍ－１細胞に対する実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントのインビトロでの生理活性
実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントの基本的な生理活性を、Ｋｙｍ－１細胞を用いたインビトロでのアッセイにおいて分析した。Ｋｙｍ－１上のＴＮＦＲ２の刺激は内在性ＴＮＦの発現をもたらし、これはＴＮＦＲ１を介したシグナル伝達の活性化により細胞のアポトーシスを誘導する。注目すべきことに、純粋な三価ｓｃＴＮＦ_Ｒ２はＴＮＦＲ２の活性化に関してほとんど不活性であることが示されており、生理活性のために（例えば、自身は非アゴニストである抗ＴＮＦＲ２抗体８０Ｍ２を用いることによる）ＴＮＦＲ２架橋をさらに必要とする。実験のために、１０，０００Ｋｙｍ－１細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で２４時間培養し、段階希釈したタンパク質とともに３通りでさらに２４時間インキュベートした。ＴＮＦＲ２架橋のために、３通りで滴定したタンパク質を添加する３０分前に、１μｇ／ｍｌ ８０Ｍ２抗体（Hycult Biotech）を細胞に添加した。細胞生存率をクリスタルバイオレット染色によって決定した。データを、処理していない対照および陽性対照（１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）に対して正規化した。８０Ｍ２と組み合わせて、すべてのｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントはサブナノモル濃度範囲においてＫｙｍ－１細胞の細胞死を誘導した（図１８、表４４）。
表４４：ｓｃＴＮＦ_Ｒ２バリアントのＫｙｍ－１に対する生理活性のＥＣ_５０値。

実施例１７：Ｋｙｍ－１細胞に対する実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質のインビトロでの生理活性
実施例１１のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質のインビトロでの生理活性を、抗体８０Ｍ２の添加によるＴＮＦＲ２架橋を省略したことを除いて実施例１６に記載の実験設定と同様の実験設定においてＫｙｍ－１細胞に対して分析した（六価のｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）タンパク質はＴＮＦＲ２架橋を必要としない）（図１９、表４５）。Ｋｙｍ－１細胞を用いて、ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）バリアント１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４は、参照分子ｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ（Δａｂ）７４２単独またはＴＮＦＲ２架橋抗体８０Ｍ２の存在下におけるｓｃＴＮＦ_Ｒ２１４０に類似した生理活性を示した。
表４５：Ｋｙｍ－１に対するｓｃＴＮＦ_Ｒ２－Ｆｃ変異体の生理活性のＥＣ_５０値

本発明はまた、以下の項目に関する：
１．ＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の３つのペプチドＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）からなる結合ドメインを含むポリペプチド、ここで、第１および第２のＴＨＤのＣ末端（これは、それぞれの場合においてＣ末端コンセンサス配列Ｖ－Ｆ／Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ａ／Ｉ－Ｘ_１（配列番号１）によって規定される）は、第２および第３のＴＨＤのＮ末端（これは、それぞれの場合においてＮ末端コンセンサス配列Ｐ－Ｖ／Ａ－Ａ－Ｈ－Ｖ／Ｌ（配列番号２）によって規定される）にペプチドＸ_ａ（これは、それぞれの場合において独立して選択され、９～１２アミノ酸、好ましくは９～１１、より好ましくは９～１０の長さを有する）を介してそれぞれ連結しており、Ｘ_ａはアミノ酸配列Ｓ－Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号１０）を含まず、Ｘ_１は非極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦおよびＩからなる群から選択される。

２．ペプチドＸ_ａがＸ_Ｃ－Ｘ_Ｌ－Ｘ_Ｎからなる、項目１記載のポリペプチド、ここで
Ｘ_Ｃは、Ａ、Ａ－Ｌ、Ｌ、好ましくはＡおよびＡ－Ｌからなる群から選択される；
Ｘ_Ｌは存在しないか、または１～１１、好ましくは１～１０、より好ましくは１～９アミノ酸からなるアミノ酸リンカーである；
Ｘ_Ｎは存在しないか、またはＫ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、Ｔ－Ｋ、Ｓ－Ｔ－Ｋ、Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１１）、Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１２）、Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１３）、Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１４）、Ｌ－Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｈ－Ｓ－Ｔ－Ｋ（配列番号１５）からなる群から選択される。

３．３つのＴＨＤが同一である、先行項目のいずれかに記載のポリペプチド。

４．第１および第２のＴＨＤのＣ末端が、それぞれの場合においてＣ末端配列Ｖ－Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ｉ－Ｉ（配列番号３）によって規定され、第２および第３のＴＨＤのＮ末端が、それぞれの場合においてＮ末端配列Ｐ－Ｖ－Ａ－Ｈ－Ｖ（配列番号４）によって規定される、先行項目のいずれかに記載のポリペプチド。

５．ＴＨＤが配列番号５のアミノ酸８８～２３１からなる連続したアミノ酸配列を含み、これが任意で以下からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、先行項目のいずれかに記載のポリペプチド：Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｔ、Ｄ１４３Ｓ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ１４６Ｈ、Ｅ１４６Ｋ、Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｑ８８Ｎ／Ｔ８９Ｓ／Ａ１４５Ｓ／Ｅ１４６Ａ／Ｓ１４７Ｄ、Ｑ８８Ｎ／Ａ１４５Ｉ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｓ１４７Ｄ、Ｌ２９Ｖ／Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｎ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｑ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｋ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｔ、Ａ１４５Ｒ／Ｅ１４６Ｔ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ｅ１４６Ｎ／Ｓ１４７、Ｓ９５Ｃ／Ｇ１４８Ｃ、Ｋ６５Ａ、Ｋ６５Ｗ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｔ、Ｑ６７Ｙ、Ｌ７５Ｈ、Ｌ７５Ｗ、Ｄ１４３Ｗ、Ｄ１４３Ｖ、Ｄ１４３Ｖ／Ｆ１４４Ｌ／Ａ１４５Ｓ、Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、Ｄ１４３Ｖ／Ａ１４５Ｓ、Ｌ２９Ｖ、Ｌ２９Ｔ、Ｌ２９Ｓ、Ｌ２９Ａ、Ｌ２９Ｇ、Ｒ３１Ｈ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｌ、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３２Ｅ、Ｓ１４７Ｌ、Ｓ１４７Ｒ、Ｓ１４７Ｐ、Ｓ１４７Ｔ、Ｓ１４７Ａ、Ｑ１４９Ｅ、Ｑ１４９Ｎ、Ｅ１４６Ｄ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｓ、Ｅ１４６Ｇ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｐ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｙ、Ａ１４５Ｖ、およびＡ１４５Ｗ（好ましくはＤ１４３ＮおよびＡ１４５Ｒから選択される）。

６．Ｘ_Ｃが、ＡまたはＡ－Ｌから選択され、
Ｘ_Ｌが存在しないか、または１～１１アミノ酸の長さを有するグリシンおよび／またはセリンリンカーであり、好ましくはＧ、Ｓ、Ｇ－Ｇ、Ｓ－Ｇ、Ｇ－Ｓ、Ｇ－Ｇ－Ｇ、Ｓ－Ｇ－Ｇ、Ｇ－Ｓ－Ｇ、Ｇ－Ｇ－Ｓ、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号１７）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号１８）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号１９）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２０）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２１）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２２）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２３）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号２４）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号２５）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号２６）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２７）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２８）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号２９）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号３０）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号３１）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号３２）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３３）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号３５）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号３６）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号３７）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号３８）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３９）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号４０）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号４１）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号４２）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号４３）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号４４）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号４５）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号４６）、Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ（配列番号４７）、Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ（配列番号４８）、Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号４９）、およびＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号５０）、より好ましくはＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）、Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号２６）、およびＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）から選択され；
Ｘ_Ｎが存在しないか、またはＫ、Ｄ－Ｋ、Ｓ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、およびＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される、先行項目のいずれかに記載のポリペプチド。

７．（ｉ）Ｘ_ＣがＡ－Ｌであり、Ｘ_Ｌが存在せず、Ｘ_ＮがＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される；
（ｉｉ）Ｘ_ＣがＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬがＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）であり、Ｘ_ＮがＳ－Ｄ－Ｋ、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、好ましくはＰ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）から選択される；
（ｉｉｉ）Ｘ_ＣがＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬがＧ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ（配列番号３４）であり、Ｘ_ＮがＫおよびＤ－Ｋから選択される；
（ｉｖ）Ｘ_ＣがＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬがＧであり、Ｘ_ＮがＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、好ましくはＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される；
（ｖ）Ｘ_ＣがＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬがＧ－Ｇであり、Ｘ_ＮがＴ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、好ましくはＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）から選択される；または
（ｖｉ）Ｘ_ＣがＡ－Ｌであり、Ｘ_ＬがＧ－Ｇ－Ｇであり、Ｘ_ＮがＰ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）、Ｓ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）、好ましくはＴ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）から選択される、先行項目のいずれかに記載のポリペプチド。

８．動的光散乱法によって決定される６２℃よりも高い凝集開始温度（Ｔ_ｍ）を有する、先行項目のいずれかに記載のポリペプチド。

９．以下である先行項目のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチドを含むポリペプチド多量体、
（ａ）ともに連結されており、１～３０アミノ酸、好ましくは７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって好ましくはともに連結されているか；または
（ｂ）（好ましくは、多量体化ドメイン、血清タンパク質、サイトカイン、ターゲティング部分または毒素からなる群から選択される）タンパク質に連結されており、任意で前記ポリペプチドは、１～３０アミノ酸、好ましくは７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって前記タンパク質に連結されている。

１０．Ａ．ポリペプチド多量体が以下の特性のうち少なくとも１つを有する：
少なくとも７２℃、好ましくは少なくとも７４℃の凝集開始温度（Ｔ_ｍ）；
３７℃のヒト血漿中での８日間のインキュベーション後において、１５％、１２％、１０％、好ましくは１０％よりも大きく減少していないＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞中のＴＮＦＲ２への結合のＥＣ_５０；
１００ｐＭ未満、好ましくは８０ｐＭ未満のＭＥＦ上に発現したＴＮＦＲ２への結合のＥＣ_５０；
２００ｐＭ未満、好ましくは１００ｐＭ未満のＫｙｍ－１細胞上のＴＮＦＲ２への結合のＥＣ_５０；
３０ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満のＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞におけるＮＦ－κＢの活性化のＥＣ_５０；
および／または
Ｂ．多量体化ドメインが、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインであり、好ましくは以下である
（ｉ）二量体化ドメインが、抗体、抗体重鎖、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＭの重鎖ドメイン２（ＣＨ２）（ＭＨＤ２）、ＩｇＥの重鎖ドメイン２（ＣＨ２）（ＥＨＤ２）、ＩｇＧの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＤの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、ＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ_２、ロイシンジッパーモチーフ、ｂａｒｎａｓｅ－ｂａｒｓｔａｒ二量体、ミニ抗体およびＺＩＰミニ抗体、好ましくはＦｃＲおよび／またはＣ１ｑ結合を有しない免疫グロブリンＦｃ領域変異体、より好ましくはＦｃΔａｂ、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ－ＧＰ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２σ、アグリコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ１（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／ＬＰ３３１Ｓ）、ＩｇＧ２ｍ４、ＩｇＧ４ ＰｒｏＡｌａＡｌａ、最も好ましくはＦｃΔａｂからなる群から選択される；
（ｉｉ）三量体化ドメインが、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子、およびＴｒｉＢｉミニボディからなる群から選択される；または
（ｉｉｉ）四量体化ドメインが、ｐ５３の四量体化ドメイン、ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、ＶＡＳＰ（血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）の四量体化ドメイン、タンデム二重特異性抗体、およびジダイアボディ(di-diabody)からなる群から選択される；
および／または
Ｃ．ポリペプチド多量体が、臓器、組織または細胞型に特異的なリガンド、より好ましくはトランスフェリン受容体、インスリン受容体、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、ジフテリア毒素受容体、排出ポンプ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＧＬＵＴ１、ＬＡＴ１、ＴＭＥＭ１１９、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ３、およびＲＶＧ－２９の受容体から選択される標的に結合しているターゲティング部分をさらに含む、項目９記載のポリペプチド多量体。

１１．項目１～８のいずれかに記載のポリペプチドまたは項目９または１０に記載のポリペプチド多量体をコードする核酸分子。

１２．項目１１記載の核酸分子をコードするベクター。

１３．医薬としての使用のための、項目１～８のいずれかに記載のポリペプチド、項目９または１０に記載のポリペプチド多量体、項目１１記載の核酸、または項目１２記載のベクター。

１４．項目１～８のいずれかに記載のポリペプチド、項目９または１０に記載のポリペプチド多量体、項目１１記載の核酸、または項目１２記載のベクターを活性物質として含む医薬組成物。

１５．過剰増殖性障害、炎症性障害、神経変性疾患または代謝性障害（好ましくは、がんまたは血液系の悪性腫瘍）、自己免疫障害、メタボリックシンドローム、循環器疾患、神経障害性疾患、および神経傷害の診断、予防または処置における使用のための、項目１～８のいずれかに記載のポリペプチド、項目９または１０に記載のポリペプチド多量体、項目１１記載の核酸、項目１２記載のベクター、または項目１４記載の医薬組成物。

Claims (17)

1. ＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバータンパク質の３つのペプチドＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）からなる結合ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、第１および第２のＴＨＤのＣ末端（これは、それぞれの場合においてＣ末端配列Ｖ－Ｙ－Ｆ－Ｇ－Ｉ－Ｉ（配列番号３）によって規定される）は、第２および第３のＴＨＤのＮ末端（これは、それぞれの場合においてＮ末端配列Ｐ－Ｖ－Ａ－Ｈ－Ｖ（配列番号４）によって規定される）に、ペプチドＸ_ａ（これは、それぞれの場合において独立して選択され、９～１０アミノ酸の長さを有する）を介してそれぞれ連結しており、
   ここでペプチドＸ _ａ がＸ _Ｃ －Ｘ _Ｌ －Ｘ _Ｎ からなり、ここで
   Ｘｃは、Ａ－Ｌであり；
   Ｘ _Ｌ は存在しないか、またはＧ、Ｇ－Ｇ、Ｇ－Ｇ－Ｇ、およびＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）からなる群から選択され；
   Ｘ _Ｎ は、Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）、Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）、Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）およびＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）からなる群から選択され、
   ここで、前記ＴＨＤが配列番号５のアミノ酸８８～２３１からなる連続したアミノ酸配列を含み、且つ変異Ｄ１４３ＮおよびＡ１４５Ｒを含む、ポリペプチド。
2. ３つのＴＨＤが同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
3. （ｉ）Ｘ _Ｌが存在せず、Ｘ_ＮがＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）である；
   （ｉｉ）Ｘ _ＬがＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ（配列番号１６）であり、Ｘ_ＮがＰ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）である；
   （ｉｉｉ）Ｘ _Ｌ がＧであり、Ｘ _Ｎ がＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）およびＳ－Ｒ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号９）から選択される；
   （ｉｖ）Ｘ _Ｌ がＧ－Ｇであり、Ｘ _Ｎ がＴ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）およびＲ－Ｔ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号８）から選択される；または
   （ｖ）Ｘ _Ｌ がＧ－Ｇ－Ｇである、Ｘ _Ｎ がＰ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号６）およびＴ－Ｐ－Ｓ－Ｄ－Ｋ（配列番号７）から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
4. 動的光散乱法によって決定される６２℃よりも高い凝集開始温度（Ｔ_ｍ）を有する、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド
5. 変異Ｄ１４３ＮおよびＡ１４５Ｒが、それぞれ配列番号５に対してＤ２１９ＮおよびＡ２２１Ｒである、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
6. 請求項１～５のいずれかに記載の少なくとも２つのポリペプチドを含むポリペプチド多量体であって、以下である：
   （ａ）ともに連結されている；または
   （ｂ）多量体化ドメイン、血清タンパク質、サイトカイン、ターゲティング部分および毒素からなる群から選択されるタンパク質に連結されている、ポリペプチド多量体。
7. 前記ポリペプチドが、
   （ａ）１～３０アミノ酸、または７～１５アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによってともに連結されている；または
   （ｂ）１～３０アミノ酸の長さを有するアミノ酸リンカーによって前記タンパク質に連結されている、請求項６に記載のポリペプチド多量体。
8. Ａ．ポリペプチド多量体が以下の特性のうち少なくとも１つを有する：
   少なくとも７２℃の凝集開始温度（Ｔ_ｍ）；
   ３７℃のヒト血漿中での８日間のインキュベーション後において、１５％、１２％または１０％よりも大きく減少していないＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞中のＴＮＦＲ２への結合のＥＣ_５０；
   １００ｐＭ未満のＭＥＦ上に発現したＴＮＦＲ２への結合のＥＣ_５０；
   ２００ｐＭ未満のＫｙｍ－１細胞上のＴＮＦＲ２への結合のＥＣ_５０；
   ３０ｐＭ未満のＨｅＬａ－ＴＮＦ－Ｒ２細胞におけるＮＦ－κＢの活性化のＥＣ_５０ ；
   および／または
   Ｂ．ポリペプチド多量体が臓器、組織または細胞型に特異的なリガンドをさらに含む、
   請求項６または７に記載のポリペプチド多量体。
9. 多量体化ドメインが、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインである、請求項６または７に記載のポリペプチド多量体。
10. 二量体化ドメインが、抗体、抗体重鎖、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＭの重鎖ドメイン２（ＣＨ２）（ＭＨＤ２）、ＩｇＥの重鎖ドメイン２（ＣＨ２）（ＥＨＤ２）、ＩｇＧの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＤの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、ＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ _２ 、ロイシンジッパーモチーフ、ｂａｒｎａｓｅ－ｂａｒｓｔａｒ二量体、ミニ抗体およびＺＩＰミニ抗体からなる群から選択される、請求項９に記載のポリペプチド多量体。
11. （ｉ）三量体化ドメインが、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子、およびＴｒｉＢｉミニボディからなる群から選択される；または
    （ｉｉ）四量体化ドメインが、ｐ５３の四量体化ドメイン、ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、ＶＡＳＰ（血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）の四量体化ドメイン、タンデム二重特異性抗体、およびジダイアボディ(di-diabody)からなる群から選択される、
    請求項９に記載のポリペプチド多量体。
12. 二量体化ドメインが、ＦｃΔａｂ、ＬＡＬＡ、ＬＡＬＡ－ＧＰ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２σ、アグリコシル化ＩｇＧ１、ＩｇＧ１（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／ＬＰ３３１Ｓ）、ＩｇＧ２ｍ４、およびＩｇＧ４ ＰｒｏＡｌａＡｌａからなる群から選択される、請求項１０に記載のポリペプチド多量体。
13. 請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項６～１２のいずれかに記載のポリペプチド多量体をコードする核酸分子。
14. 請求項１３に記載の核酸分子を含むベクター。
15. 医薬としての使用のための、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド、請求項６～１２のいずれかに記載のポリペプチド多量体、請求項１３に記載の核酸分子、または請求項１４に記載のベクター。
16. 請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド、請求項６～１２のいずれかに記載のポリペプチド多量体、請求項１３に記載の核酸分子、または請求項１４に記載のベクターを活性物質として含む医薬組成物。
17. 過剰増殖性障害、炎症性障害、神経変性疾患または代謝性障害、自己免疫障害、メタボリックシンドローム、循環器疾患、神経障害性疾患、および神経傷害の診断、予防または処置における使用のための、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド、請求項６～１２のいずれかに記載のポリペプチド多量体、請求項１３に記載の核酸分子、請求項１４に記載のベクター、または請求項１６に記載の医薬組成物。