JP7589951B2 - プローブ誘導ヘテロ二重鎖の移動度アッセイ - Google Patents

Description

背景
近年、二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）に基づく遺伝子編集技術（ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮ／ＣＲＩＰＳＲなど）の進展により、分子生物学において１塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ：ｂｐ）の違いを検出することへの要求が高まっている。これらのＤＳＢは、標的ゲノム配列での非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ：ＮＨＥＪ）を刺激し、１ｂｐの挿入又は欠損のインデル（ｉｎｄｅｌ）変異を生じさせることができる。研究者はフレームシフトヌル変異をもたらすこれらの１ｂｐのインデル変異に関心がある場合が多い。このような変異をスクリーニング集団から識別するためには、まず多数のジェノタイピング（遺伝子型判定）実験が必要であり、変異が識別されれば、その後の解析のために大規模なホモ接合体及びヘテロ接合体のジェノタイピングが必要となり得る。このような実験は多くの生物で一般的である（ヒト；Ｍａｌｉら，２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ／ マウス；Ｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ ２０１３／ サル；Ｗａｎら，２０１５ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２０１４／ カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３／ ショウジョウバエ（Ｄｏｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；Ｖｅｎｋｅｎら，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．，２０１６ ゼブラフィッシュ（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）；Ｈｗａｎｇら，２０１３ Ｎａｔ ｂｉｏｔｅｃｈ／ Ａｔｈａｌ Ｎ．ベンサミアナ（Ａｔｈａｌ Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）；Ｌｉら，Ｎａｔ ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１３／ ソルガムきび（ｓｏｒｇｈｕｍ ｒｉｃｅ）；Ｊｉａｎｇら，ＮＡＲ ２０１３／ 小麦；Ｕｐａｄｈｙａｙら，Ｇ３ ２０１３）。数個の塩基対の違いを検出する方法は多くの研究によって開発されており、例えば、サンガーシーケンシング又はディープシーケンシング、制限断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ）解析（Ｕｒｎｏｖら、２００５ ｎａｔｕｒｅ）、ＤＮＡ融解解析（Ｄａｈｌｅｍら、２０１２ ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ）、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ（Ｋｉｍら、２００９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ）、Ｃｅｌ－１アッセイ（Ｕｅｔａら、２０１７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐ）、蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｋｉｍら、２０１１ Ｎａｔ ｍｅｔｈｏｄｓ）、及びＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと制限断片長多型とに基づく分析（ＲＧＥＮ－ＲＦＬＰ）（Ｋｉｍら、２０１４ Ｎａｔ Ｃｏｍｎ）などが挙げられる。しかし、それぞれの手法にはメリットとデメリットがある。例えば、サンガーシーケンシングやディープシーケンシングは１ｂｐの分解能でＤＮＡ配列を識別することができるが、コストと時間がかかる。ＲＦＬＰ解析は、区別したい配列の情報が既にわかっていて、かつ既存の制限酵素を用いたアッセイを設計できる場合に１ｂｐの分解能を達成できる。この条件では、ＲＦＬＰは変異体のスクリーニングに適さない。ＤＮＡ融解解析、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ、Ｃｅｌ－１アッセイ、蛍光ＰＣＲ、及びＲＧＥＮ－ＲＦＬＰでは、１ｂｐの分解能がいつも得られるとは限らず、及び／又は特殊な薬品、タンパク質、デバイスが必要である。

ヘテロ二本鎖移動度アッセイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＨＭＡ）はまた、小さな塩基対の違いを検出する方法である（Ｋｕｍｅｄａ及びＡｓａｏ ２００１，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｏｔａら，２０１３ Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ、Ａｎｓａｉら，２０１４ Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ及びＬｉｌｌｅｙ，１９８９ ＮＡＲ）。ＨＭＡは、３つの単純な工程からなる：１）ＰＣＲ、２）変性／再アニーリング、３）電気泳動（図１）。ただし、ＨＭＡの分解能は通常３塩基対以上であるため（Ｏｔａら，２０１３ Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ、Ａｎｓａｉら，２０１４ Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ及びＬｉｌｌｅｙ、１９８９ ＮＡＲ）、通常、ＨＭＡを使用して１ｂｐの違いを区別することは困難である（Ｓｕｇａｎｏら、２０１７）。

本発明は、人工的に挿入又は欠損を導入した合成オリゴＤＮＡ配列、及びプローブとしてＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡ又は短い１本鎖ＤＮＡを用いて、１ｂｐの異なる配列を検出する新規方法を提供するものである。本発明者らは、本明細書において、この方法をプローブ誘導ＨＭＡ（Ｐｒｏｂｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＨＭＡ：ＰＲＩＭＡ（プリマ））と呼ぶ。ＰＲＩＭＡは、多様な生物種のゲノム編集に幅広く応用できる。

図における配列は、図面の説明の後に別途言及される。

図１は、ＨＭＡ（ａ）、ｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｂ）、ＰＲＩＭＡ（ｃ）の概要を示す。ＨＭＡは、１ｂｐの違いによるヘテロ二重鎖移動度のシフトを有する検出可能なピークを生成することが困難である（ａ）。一方、ｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｂ）とＰＲＩＭＡ（ｃ）とは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ：ＷＴ）と１ｂｐのインデル配列とからヘテロ二重鎖のピークを生成することができる。ＷＴ；野生型、ｍｔ；変異型、Ｈｏｍｏ；ホモ接合体、Ｈｅｔｅｒｏ；ヘテロ接合体、ｓｓｓ；短い一本鎖（ｓｈｏｒｔ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ）。１ｂｐの挿入／欠損の変異点を表す。塗りつぶされていない三角と塗りつぶされた三角は、それぞれ野生型と変異型からのヘテロ二重鎖のピークを示す。電気泳動図上の丸は、ホモ二重鎖のピークと区別のつかないヘテロ二重鎖のピークとが混在していることを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図１は、ＨＭＡ（ａ）、ｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｂ）、ＰＲＩＭＡ（Ｃｃ）の概要を示す。ＨＭＡは、１ｂｐの違いによるヘテロ二重鎖移動度のシフトを有する検出可能なピークを生成することが困難である（ａ）。一方、ｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｂ）とＰＲＩＭＡ（ｃ）とは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ：ＷＴ）と１ｂｐのインデル配列とからヘテロ二重鎖のピークを生成することができる。ＷＴ；野生型、ｍｔ；変異型、Ｈｏｍｏ；ホモ接合体、Ｈｅｔｅｒｏ；ヘテロ接合体、ｓｓｓ；短い一本鎖（ｓｈｏｒｔ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ）。１ｂｐの挿入／欠損の変異点を表す。塗りつぶされていない三角と塗りつぶされた三角は、それぞれ野生型と変異型からのヘテロ二重鎖のピークを示す。電気泳動図上の丸は、ホモ二重鎖のピークと区別のつかないヘテロ二重鎖のピークとが混在していることを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図１は、ＨＭＡ（ａ）、ｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｂ）、ＰＲＩＭＡ（ｃ）の概要を示す。ＨＭＡは、１ｂｐの違いによるヘテロ二重鎖移動度のシフトを有する検出可能なピークを生成することが困難である（ａ）。一方、ｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｂ）とＰＲＩＭＡ（ｃ）とは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ：ＷＴ）と１ｂｐのインデル配列とからヘテロ二重鎖のピークを生成することができる。ＷＴ；野生型、ｍｔ；変異型、Ｈｏｍｏ；ホモ接合体、Ｈｅｔｅｒｏ；ヘテロ接合体、ｓｓｓ；短い一本鎖（ｓｈｏｒｔ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ）。１ｂｐの挿入／欠損の変異点を表す。塗りつぶされていない三角と塗りつぶされた三角は、それぞれ野生型と変異型からのヘテロ二重鎖のピークを示す。電気泳動図上の丸は、ホモ二重鎖のピークと区別のつかないヘテロ二重鎖のピークとが混在していることを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図２は、配列及びプローブ設計の一例を示す。第１の配列（Ｓ１）、第２の配列（Ｓ２）、及びプローブ（Ｐ）のアライメントである。第１の可変配列トラクトＶ１は５ヌクレオチドの長さを有し、第２の可変配列トラクトは４ヌクレオチドの長さを有する。Ｘ：ヌクレオチドなし（Ｖ１に関して欠損）、Ｃ１：第１の５’共通配列トラクト、Ｃ１’：第２の５’共通配列トラクト（Ｃ１と同一）、Ｃ２：第１の３’共通配列トラクト、Ｃ２’：第２の３’共通配列トラクト（Ｃ２と同一）、ＲＣ１：Ｃ１と逆相補的な配列、ＲＣ２：Ｃ２と逆相補的な配列、黒線：第１及び第２の配列。 図３は、配列及びプローブの設計の一例を示す。第１の配列（Ｓ１）、第２の配列（Ｓ２）、及びプローブ（Ｐ）のアライメントである。第１の可変配列トラクトＶ１は、５ヌクレオチドの長さを有する。Ｘ及びＹ：ヌクレオチドなし（Ｖ１に関して欠損）、Ｃ１：第１の５’共通配列トラクト、Ｃ１’：第２の５’共通配列トラクト（Ｃ１より３ヌクレオチド短い）、Ｃ２：第１の３’共通配列トラクト、Ｃ２’：第２の共通配列トラクト（Ｃ２と同一）、ＲＣ１：Ｃ１と逆相補的な配列、ＲＣ２：Ｃ２と逆相補的な配列、黒線：第１及び第２の配列。 図４は、ｐｒｅＰＲＩＭＡで検出した植物（ａ、ｂ、ｃ）、バクテリア（ｄ）、ヒト（ｃ）のＤＮＡ断片の野生型及び１ｂｐ挿入／欠損変異体のヘテロ二重鎖ピークを示す。矢印で示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図４は、ｐｒｅＰＲＩＭＡで検出した植物（ａ、ｂ、ｃ）、バクテリア（ｄ）、ヒト（ｃ）のＤＮＡ断片の野生型及び１ｂｐ挿入／欠損変異体のヘテロ二重鎖ピークを示す。矢印で示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図４は、ｐｒｅＰＲＩＭＡで検出した植物（ａ、ｂ、ｃ）、バクテリア（ｄ）、ヒト（ｃ）のＤＮＡ断片の野生型及び１ｂｐ挿入／欠損変異体のヘテロ二重鎖ピークを示す。矢印で示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図４は、ｐｒｅＰＲＩＭＡで検出した植物（ａ、ｂ、ｃ）、バクテリア（ｄ）、ヒト（ｃ）のＤＮＡ断片の野生型及び１ｂｐ挿入／欠損変異体のヘテロ二重鎖ピークを示す。矢印で示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図４は、ｐｒｅＰＲＩＭＡで検出した植物（ａ、ｂ、ｃ）、バクテリア（ｄ）、ヒト（ｃ）のＤＮＡ断片の野生型及び１ｂｐ挿入／欠損変異体のヘテロ二重鎖ピークを示す。矢印で示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図５は、１３０ｂｐ（ｂ）及び３００ｂｐ（ｃ）のＰＣＲ断片を用いて、ＨＭＡでＲＤＰ１の０～７ｂｐのギャップ配列を検出したものを示す。 図５は、１３０ｂｐ（ｂ）及び３００ｂｐ（ｃ）のＰＣＲ断片を用いて、ＨＭＡでＲＤＰ１の０～７ｂｐのギャップ配列を検出したものを示す。 図５は、１３０ｂｐ（ｂ）及び３００ｂｐ（ｃ）のＰＣＲ断片を用いて、ＨＭＡでＲＤＰ１の０～７ｂｐのギャップ配列を検出したものを示す。 図６は、１５３ｂｐ（ｂ）及び３００ｂｐ（ｃ）のＰＣＲ断片を用いて、ＨＭＡでＤＭＬ１の０～７ｂｐのギャップ配列を検出したものを示す。 図６は、１５３ｂｐ（ｂ）及び３００ｂｐ（ｃ）のＰＣＲ断片を用いて、ＨＭＡでＤＭＬ１の０～７ｂｐのギャップ配列を検出したものを示す。 図６は、１５３ｂｐ（ｂ）及び３００ｂｐ（ｃ）のＰＣＲ断片を用いて、ＨＭＡでＤＭＬ１の０～７ｂｐのギャップ配列を検出したものを示す。 図７は、ＨＭＡによる０～７ｂｐのギャップ配列の検出を示す。（ａ）ＲＤＰ１、（ｂ）ＤＭＬ１。矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図７は、ＨＭＡによる０～７ｂｐのギャップ配列の検出を示す。（ａ）ＲＤＰ１、（ｂ）ＤＭＬ１。矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図７は、ＨＭＡによる０～７ｂｐのギャップ配列の検出を示す。（ａ）ＲＤＰ１、（ｂ）ＤＭＬ１。矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図７は、ＨＭＡによる０～７ｂｐのギャップ配列の検出を示す。（ａ）ＲＤＰ１、（ｂ）ＤＭＬ１。矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図８は、変異位置がＤＮＡ断片の端に近い場合（ａ，ｂ，ｃ）、ＰＲＩＭＡのプローブは機能せず、プローブ長はヘテロ二重鎖ピークに影響しないこと（ｃ）（ａ、ｂ）を示している。変異位置に近いプライマー対（塗りつぶされた矢印）を用いてもヘテロ二重鎖のピークは形成されない（ａ、ｂ）。一方、変異位置がＤＮＡ断片の中央付近にある場合には、ヘテロ二重鎖のピークが生成される（塗りつぶされていない矢印、ａ、ｃ）。なお、４０ｍｅｒプローブと８０ｍｅｒプローブとでは、有意な違いは検出されなかった（ｃ）。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図８は、変異位置がＤＮＡ断片の端に近い場合（ａ，ｂ，ｃ）、ＰＲＩＭＡのプローブは機能せず、プローブ長はヘテロ二重鎖ピークに影響しないこと（ｃ）（ａ、ｂ）を示している。変異位置に近いプライマー対（塗りつぶされた矢印）を用いてもヘテロ二重鎖のピークは形成されない（ａ、ｂ）。一方、変異位置がＤＮＡ断片の中央付近にある場合には、ヘテロ二重鎖のピークが生成される（塗りつぶされていない矢印、ａ、ｃ）。なお、４０ｍｅｒプローブと８０ｍｅｒプローブとでは、有意な違いは検出されなかった（ｃ）。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図８は、変異位置がＤＮＡ断片の端に近い場合（ａ，ｂ，ｃ）、ＰＲＩＭＡのプローブは機能せず、プローブ長はヘテロ二重鎖ピークに影響しないこと（ｃ）を示している。変異位置に近いプライマー対（塗りつぶされた矢印）を用いてもヘテロ二重鎖のピークは形成されない（ａ、ｂ）。一方、変異位置がＤＮＡ断片の中央付近にある場合には、ヘテロ二重鎖のピークが生成される（塗りつぶされていない矢印、ａ、ｃ）。なお、４０ｍｅｒプローブと８０ｍｅｒプローブとでは、有意な違いは検出されなかった（ｃ）。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図９は、ＰＲＩＭＡによる１０ｂｐ欠損配列から１０ｂｐ挿入配列までの電気泳動パターンを示している。ａ．ＲＤＰ１の配列。ＲＤＰ１の２２５ｂｐの配列をこの解析に使用した。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。使用した１０ｂｐ欠損から１０ｂｐ挿入の配列を以下に示す。ｂ及びｃはＰＲＩＭＡによるポリアクリルアミドゲル画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列からのヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｂに示し、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までをｃに示す。ｄ及びｅはＰＲＩＭＡによるＭｕｌｔｉＮａの画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列によるヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｄに、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までの電気泳動パターンをeに示す。 図９は、ＰＲＩＭＡによる１０ｂｐ欠損配列から１０ｂｐ挿入配列までの電気泳動パターンを示している。ａ．ＲＤＰ１の配列。ＲＤＰ１の２２５ｂｐの配列をこの解析に使用した。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。使用した１０ｂｐ欠損から１０ｂｐ挿入の配列を以下に示す。ｂ及びｃはＰＲＩＭＡによるポリアクリルアミドゲル画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列からのヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｂに示し、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までをｃに示す。ｄ及びｅはＰＲＩＭＡによるＭｕｌｔｉＮａの画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列によるヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｄに、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までの電気泳動パターンをeに示す。 図９は、ＰＲＩＭＡによる１０ｂｐ欠損配列から１０ｂｐ挿入配列までの電気泳動パターンを示している。ａ．ＲＤＰ１の配列。ＲＤＰ１の２２５ｂｐの配列をこの解析に使用した。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。使用した１０ｂｐ欠損から１０ｂｐ挿入の配列を以下に示す。ｂ及びｃはＰＲＩＭＡによるポリアクリルアミドゲル画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列からのヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｂに示し、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までをｃに示す。ｄ及びｅはＰＲＩＭＡによるＭｕｌｔｉＮａの画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列によるヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｄに、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までの電気泳動パターンをeに示す。 図９は、ＰＲＩＭＡによる１０ｂｐ欠損配列から１０ｂｐ挿入配列までの電気泳動パターンを示している。ａ．ＲＤＰ１の配列。ＲＤＰ１の２２５ｂｐの配列をこの解析に使用した。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。使用した１０ｂｐ欠損から１０ｂｐ挿入の配列を以下に示す。ｂ及びｃはＰＲＩＭＡによるポリアクリルアミドゲル画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列からのヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｂに示し、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までをｃに示す。ｄ及びｅはＰＲＩＭＡによるＭｕｌｔｉＮａの画像である。星印はホモ二重鎖のピークを示す。塗りつぶされていない矢印と塗りつぶされた矢印はそれぞれ野生型配列及び変異型配列によるヘテロ二重鎖を示す。１０ｂｐ欠損（ｄｅｌ）から野生型までの電気泳動パターンをｄに、野生型から１０ｂｐ挿入（ｉｎｓ）までの電気泳動パターンをeに示す。 図１０は、ＨＭＡ、ｐｒｅＰＲＩＭＡ、ＰＲＩＭＡを使用したジェノタイピングを示す。（ａ）ＨＭＡによるジェノタイピングのワークフロー。ＨＭＡでは２回分の分析が必要である。１回目の分析では、試料のみで再アニーリングする。ヘテロ二重鎖のピークが形成される場合、このサンプルはヘテロ接合体である。ヘテロ二重鎖のピークがない場合、このサンプルは野生型又は変異型ホモ接合体であることを示す。２回目の分析では、野生型サンプルと再アニーリングする。ヘテロ二重鎖のピークが生成される場合、このサンプルは変異型ホモ接合体であり、生成されない場合、野生型ホモ接合体である。（ｂ）ＰＲＩＭＡ及びｐｒｅＰＲＩＭＡによるジェノタイピングのワークフロー。遺伝子型を検出するために必要な解析は１回のみである。 ジェノタイピングの例をｐｒｅＰＲＩＭＡについては（ｃ）に示し、ＰＲＩＭＡについては（ｄ）に示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 ジェノタイピングの例をｐｒｅＰＲＩＭＡについては（ｃ）に示し、ＰＲＩＭＡについては（ｄ）に示す。星印はホモ二重鎖のピークを示す。 図１１は、ＲＤＰ１遺伝子の２２５ｂｐのＰＣＲ産物と５ヌクレオチド欠損した４０ｍｅｒプローブとを用いたＰＲＩＭＡによるジェノタイピングを示している。 図１２は、植物（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、ヒト（ｃ、ｇ）、バクテリア（ｄ、ｈ）の多くの配列から１ｂｐの違いをＰＲＩＭＡで検出したものを示す。ＭｕｌｔｉＮＡにより電気泳動図パターンを取得し（ａ～ｄ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりゲル画像を取得した（ｅ～ｈ）。 図１２は、植物（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、ヒト（ｃ、ｇ）、バクテリア（ｄ、ｈ）の多くの配列から１ｂｐの違いをＰＲＩＭＡで検出したものを示す。ＭｕｌｔｉＮＡにより電気泳動図パターンを取得し（ａ～ｄ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりゲル画像を取得した（ｅ～ｈ）。 図１２は、植物（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、ヒト（ｃ、ｇ）、バクテリア（ｄ、ｈ）の多くの配列から１ｂｐの違いをＰＲＩＭＡで検出したものを示す。ＭｕｌｔｉＮＡにより電気泳動図パターンを取得し（ａ～ｄ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりゲル画像を取得した（ｅ～ｈ）。 図１２は、植物（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、ヒト（ｃ、ｇ）、バクテリア（ｄ、ｈ）の多くの配列から１ｂｐの違いをＰＲＩＭＡで検出したものを示す。ＭｕｌｔｉＮＡにより電気泳動図パターンを取得し（ａ～ｄ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりゲル画像を取得した（ｅ～ｈ）。 図１２は、植物（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、ヒト（ｃ、ｇ）、バクテリア（ｄ、ｈ）の多くの配列から１ｂｐの違いをＰＲＩＭＡで検出したものを示す。ＭｕｌｔｉＮＡにより電気泳動図パターンを取得し（ａ～ｄ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりゲル画像を取得した（ｅ～ｈ）。 図１２は、植物（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、ヒト（ｃ、ｇ）、バクテリア（ｄ、ｈ）の多くの配列から１ｂｐの違いをＰＲＩＭＡで検出したものを示す。ＭｕｌｔｉＮＡにより電気泳動図パターンを取得し（ａ～ｄ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりゲル画像を取得した（ｅ～ｈ）。 図１３は、ＰＲＩＭＡが塩基の種類（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を区別可能であることを示す。ＰＲＩＭＡがさらにＳＮＰタイピングに使用可能かどうかを検証するため、塩基編集した配列（図ａ）で、２種類のプローブを用いてＰＲＩＭＡを行った（図ａ、ｂ、ｃ）。図ｂでは、ヌクレオチドＡ／ＧとＴ／Ｃは異なるヘテロ二重鎖のピークを生成するため、区別可能である。図ｃでは、Ａ／Ｇ、Ｔ、Ｃは区別可能であった。これらの結果は、ＰＲＩＭＡがＳＮＰタイピングの用途を拡大する可能性を示唆している。図ａ；塗りつぶされていない矢印はプライマーを示し、明るい灰色矢印と濃い灰色矢印は図ｂ（明るい灰色）、図ｃ（濃い灰色）で使用されるプローブを示す。塩基編集点は、黒矢印で示す。図ｂ，ｃは５５３１プローブ（ｂ）及び５４２８プローブ（ｃ）を用いたＰＲＩＭＡによるＳＮＰタイピングである。黒、明るい灰色、濃い灰色、灰色の矢印は、それぞれＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃからのヘテロ二重鎖のピークを示す。 図１３は、ＰＲＩＭＡが塩基の種類（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を区別可能であることを示す。ＰＲＩＭＡがさらにＳＮＰタイピングに使用可能かどうかを検証するため、塩基編集した配列（図ａ）で、２種類のプローブを用いてＰＲＩＭＡを行った（図ａ、ｂ、ｃ）。図ｂでは、ヌクレオチドＡ／ＧとＴ／Ｃは異なるヘテロ二重鎖のピークを生成するため、区別可能である。図ｃでは、Ａ／Ｇ、Ｔ、Ｃは区別可能であった。これらの結果は、ＰＲＩＭＡがＳＮＰタイピングの用途を拡大する可能性を示唆している。図ａ；塗りつぶされていない矢印はプライマーを示し、明るい灰色矢印と濃い灰色矢印は図ｂ（明るい灰色）、図ｃ（濃い灰色）で使用されるプローブを示す。塩基編集点は、黒矢印で示す。図ｂ，ｃは５５３１プローブ（ｂ）及び５４２８プローブ（ｃ）を用いたＰＲＩＭＡによるＳＮＰタイピングである。黒、明るい灰色、濃い灰色、灰色の矢印は、それぞれＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃからのヘテロ二重鎖のピークを示す。 図１３は、ＰＲＩＭＡが塩基の種類（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を区別可能であることを示す。ＰＲＩＭＡがさらにＳＮＰタイピングに使用可能かどうかを検証するため、塩基編集した配列（図ａ）で、２種類のプローブを用いてＰＲＩＭＡを行った（図ａ、ｂ、ｃ）。図ｂでは、ヌクレオチドＡ／ＧとＴ／Ｃは異なるヘテロ二重鎖のピークを生成するため、区別可能である。図ｃでは、Ａ／Ｇ、Ｔ、Ｃは区別可能であった。これらの結果は、ＰＲＩＭＡがＳＮＰタイピングの用途を拡大する可能性を示唆している。図ａ；塗りつぶされていない矢印はプライマーを示し、明るい灰色矢印と濃い灰色矢印は図ｂ（明るい灰色）、図ｃ（濃い灰色）で使用されるプローブを示す。塩基編集点は、黒矢印で示す。図ｂ，ｃは５５３１プローブ（ｂ）及び５４２８プローブ（ｃ）を用いたＰＲＩＭＡによるＳＮＰタイピングである。黒、明るい灰色、濃い灰色、灰色の矢印は、それぞれＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃからのヘテロ二重鎖のピークを示す。 図１４はＰＲＩＭＡでの検出の１ｂｐの違いを示す。ａ：ＲＤＰ１の遺伝子コンストラクション。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。四角は変異の位置を示す。ｂ：ＭｕｌｔｉＮＡを用いたヘテロ二重鎖ピークの検出。星印はホモ二重鎖ピークを示し、矢印はヘテロ二重鎖ピークを示す。ｃ：ポリアクリルアミドゲルを用いたヘテロ二重鎖ピークの検出。星印はホモ二重鎖のピークを示し、矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。マーカー（Ｍ）のサイズは左側に記載される。１ｉｎｓ（１挿入）、野生型、及び１ｄｅｌ（１欠損）の配列から、ＭｕｌｔｉＮＡとＰＡＧＥとで異なるサイズのヘテロ二重鎖ピークが検出された。 図１４はＰＲＩＭＡでの検出の１ｂｐの違いを示す。ａ：ＲＤＰ１の遺伝子コンストラクション。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。四角は変異の位置を示す。ｂ：ＭｕｌｔｉＮＡを用いたヘテロ二重鎖ピークの検出。星印はホモ二重鎖ピークを示し、矢印はヘテロ二重鎖ピークを示す。ｃ：ポリアクリルアミドゲルを用いたヘテロ二重鎖ピークの検出。星印はホモ二重鎖のピークを示し、矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。マーカー（Ｍ）のサイズは左側に記載される。１ｉｎｓ（１挿入）、野生型、及び１ｄｅｌ（１欠損）の配列から、ＭｕｌｔｉＮＡとＰＡＧＥとで異なるサイズのヘテロ二重鎖ピークが検出された。 図１４はＰＲＩＭＡでの検出の１ｂｐの違いを示す。ａ：ＲＤＰ１の遺伝子コンストラクション。塗りつぶされていない矢印はプライマー領域を示し、塗りつぶされた矢印はプローブ領域を示す。四角は変異の位置を示す。ｂ：ＭｕｌｔｉＮＡを用いたヘテロ二重鎖ピークの検出。星印はホモ二重鎖ピークを示し、矢印はヘテロ二重鎖ピークを示す。ｃ：ポリアクリルアミドゲルを用いたヘテロ二重鎖ピークの検出。星印はホモ二重鎖のピークを示し、矢印はヘテロ二重鎖のピークを示す。マーカー（Ｍ）のサイズは左側に記載される。１ｉｎｓ（１挿入）、野生型、及び１ｄｅｌ（１欠損）の配列から、ＭｕｌｔｉＮＡとＰＡＧＥとで異なるサイズのヘテロ二重鎖ピークが検出された。 図１５はＰＲＩＭＡの手順を示す。 図１６は、可変配列トラクトＶを記載するための別のアプローチを示す。 図１７は、欠損プローブ又は挿入プローブと１ｂｐのインデル変異体との比較を示す。期待されるバルジ構造により、変異位置が数ｂｐずれるにもかかわらず、欠損型プローブは挿入型プローブよりも単純で、かつより区別可能なバルジを有することがわかった（図１７）。したがって、５ｂｐの挿入型プローブを使用するよりは、５ｂｐの欠損型プローブを使用して、１ｂｐのインデル位置が数ｂｐ離れている場合でもバルジサイズがＷＴと異なるようにするのが好ましい。これは単一のＣＲＩＳＰＲ実験によって誘導される正確なインデル位置は、数ｂｐの範囲内で変動可能であることが知られているためである（Ｎｉｓｈｉｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３，（２０１６））。野生型及び５ｂｐの位置シフト変異（－２～＋３）を有する１ｂｐのインデル変異体において期待されるバルジ構造を示す。欠損型プローブは、挿入型（ａ）及び欠損型（ｂ）のすべての変異体から区別可能かつ単純なバルジ構造を生成する。一方、挿入型プローブでは、欠損系列（ａ）では「＋１」及び「＋２」のみ、挿入系列（ｂ）では「＋１」のみしか単純なバルジ構造が得られない。ヘテロ二重鎖の図の上側の鎖は、サンプルＤＮＡに由来する。ヘテロ二重鎖の図の下側の鎖は、プローブＤＮＡに由来する。矢印は＋１位置を示す。灰色の線は空の（ｎｕｌｌ）ヌクレオチドを示す。塗りつぶされた矢印は挿入型プローブの５ｂｐの挿入ヌクレオチドを示す。塗りつぶされていない矢印は挿入系列の１ｂｐの挿入ヌクレオチドを示す。アスタリスクは、野生型と異なるバルジ構造が期待される場合を示す。 図１７は、欠損プローブ又は挿入プローブと１ｂｐのインデル変異体との比較を示す。期待されるバルジ構造により、変異位置が数ｂｐずれるにもかかわらず、欠損型プローブは挿入型プローブよりも単純で、かつより区別可能なバルジを有することがわかった（図１７）。したがって、５ｂｐの挿入型プローブを使用するよりは、５ｂｐの欠損型プローブを使用して、１ｂｐのインデル位置が数ｂｐ離れている場合でもバルジサイズがＷＴと異なるようにするのが好ましい。これは単一のＣＲＩＳＰＲ実験によって誘導される正確なインデル位置は、数ｂｐの範囲内で変動可能であることが知られているためである（Ｎｉｓｈｉｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３５３，（２０１６））。野生型及び５ｂｐの位置シフト変異（－２～＋３）を有する１ｂｐのインデル変異体において期待されるバルジ構造を示す。欠損型プローブは、挿入型（ａ）及び欠損型（ｂ）のすべての変異体から区別可能かつ単純なバルジ構造を生成する。一方、挿入型プローブでは、欠損系列（ａ）では「＋１」及び「＋２」のみ、挿入系列（ｂ）では「＋１」のみしか単純なバルジ構造が得られない。ヘテロ二重鎖の図の上側の鎖は、サンプルＤＮＡに由来する。ヘテロ二重鎖の図の下側の鎖は、プローブＤＮＡに由来する。矢印は＋１位置を示す。灰色の線は空の（ｎｕｌｌ）ヌクレオチドを示す。塗りつぶされた矢印は挿入型プローブの５ｂｐの挿入ヌクレオチドを示す。塗りつぶされていない矢印は挿入系列の１ｂｐの挿入ヌクレオチドを示す。アスタリスクは、野生型と異なるバルジ構造が期待される場合を示す。

発明の概要
本発明の第１の態様は、電気泳動により第１の核酸配列を第２の核酸配列から区別するための方法に関するものであり、
前記第１の核酸配列Ｓ１は、
－ 第１の５’共通配列トラクトＣ１、及び
－ 任意に、Ｃ１へ３’方向ですぐ隣接する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドの第１の可変配列トラクトＶ１；及び
－ Ｃ１の３’方向に位置する第１の３’共通配列トラクトＣ２；
を含み、
前記第２の核酸配列Ｓ２は、
－ 第２の５’共通配列トラクトＣ１’、及び
－ 任意に、Ｃ１’へ３’方向ですぐ隣接する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドの第２の可変配列トラクトＶ２；及び
－ Ｃ１’の３’方向に位置する第２の３’共通配列トラクトＣ２’；
を含み、かつ
－ 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１は、前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’と同一であるか、又は
Ｃ１’はＣ１より３’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつＣ１’は、Ｃ１／Ｃ１’の５’末端からＣ１と同一であり；かつ
－ 前記第１の３’共通配列トラクトＣ２は、前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’と同一であるか、又は
Ｃ２’は、前記第１の３’共通配列トラクトＣ２より５’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつＣ２’は、Ｃ２／Ｃ２’の３’末端からＣ２と同一であり；かつ
ただし、Ｓ１及びＳ２は、それらの配列トラクトＣ１－Ｖ１－Ｃ２及びＣ１’－Ｖ２－Ｃ２’に関して、１、２、３、４、５、６、７、８又は９ヌクレオチドだけ長さが互いに異なることを条件とし、
前記方法は：
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列をプローブ配列Ｐと接触させることであり、ここで前記プローブ配列が、５’から３’方向において、前記３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的な配列ＲＣ２、及び前記５’共通配列トラクトＣ１に逆相補的な配列ＲＣ１からなること、
それによって、前記第１及び第２の核酸配列への前記プローブ配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１のプローブハイブリッド及び第２のプローブハイブリッドを形成すること、及び
その後、前記第１のプローブハイブリッド及び前記第２のプローブハイブリッドを電気泳動に供し、前記第１のプローブハイブリッド及び前記第２のプローブハイブリッドの電気泳動移動度を検出すること、
を含む。

本方法は、２つの核酸配列の間の小さな変異を検出することを目的としている。例えば、この方法は、標的核酸配列で非相同末端結合を誘導することができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、それにより参照配列と比較して１塩基対（ｂｐ）の挿入又は欠損を生成して核酸配列を編集した後に適用することができる。

一般的なアプローチでは、参照配列の配列及び１ｂｐ変異の周辺で編集された配列を標準的なＰＣＲ法によって増幅することで、前記第１の核酸配列Ｓ１（例えば、参照配列のＰＣＲ産物のセンス鎖）と前記核酸配列Ｓ２（例えば、参照配列と比較して１ｂｐ変異を有する編集配列のＰＣＲ産物のセンス鎖）を提供する（図２）。

続いて、これらＰＣＲ産物を変性させ、プローブ配列Ｐとともにインキュベートする。このプローブ配列は、共通配列トラクトと呼ばれる２つの領域で配列Ｓ１にアニーリングされる。つまり、プローブ配列はＳ１及びＳ２の共通配列トラクトに対してアンチセンス（逆相補的）である。５’共通配列トラクト及び３’共通配列トラクトは、例えば、変異部位の周りの５ヌクレオチド（ｎｔ）の配列トラクトなどの可変配列トラクトと呼ばれる可変領域に隣接する。核酸配列Ｓ１とプローブ配列のハイブリダイゼーション時に、５ｎｔの可変配列トラクトが突出することになる。

配列Ｓ２についても同様である。また、ここでもプローブ配列は５’共通配列トラクト及び３’共通配列トラクトにハイブリダイズすることになる。配列Ｓ１と比較して、可変配列トラクトは１塩基長く（１ｂｐ挿入の場合）、又は１塩基短い（１ｂｐ欠損の場合）。したがって、６ｎｔ（挿入）又は４ｎｔ（欠損）が突出することになる。

Ｓ１－Ｐ－ハイブリッド（第１のプローブハイブリッド）及びＳ２－Ｐ－ハイブリッド（第２のプローブハイブリッド）をポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高分解能電気泳動装置（例えばＭｕｌｔｉＮＡ又はＱＩＡｘｃｅｌ）等の電気泳動に供する場合、第１の可変配列トラクトと第２の可変配列トラクトとが形成するバルジ（突出）のサイズが異なることにより第１のプローブハイブリッドの電気泳動移動度は、第２のプローブハイブリッドの電気泳動移動度と相違する。

また、プローブ配列が突出することも可能である。例えば、参照配列Ｓ１は、第１の５’共通配列トラクト、第１の３’共通配列トラクト、及び例えば５ｎｔ長の可変配列トラクトを含み得る。編集された核酸配列Ｓ２は、参照配列Ｓ１と比較して数塩基対（例えば、８ｂｐ）の欠損を含み得る。

したがって、編集配列Ｓ２の５’共通配列トラクトＣ１’は、参照配列Ｓ１の共通配列トラクトＣ１より３ｎｔ短い（図３）。

Ｃ１及びＣ２に逆相補的な配列からなるプローブ配列Ｐとハイブリダイゼーションすると、可変配列トラクトＶ１が５ｎｔのバルジを形成することになる。プローブが編集配列Ｓ２とハイブリダイズする場合、プローブが３ｎｔのバルジを形成することになる。ここでも、電気泳動に供した場合、Ｓ１－Ｐ－ハイブリットの電気泳動移動度は、Ｓ２－Ｐ－ハイブリッドの電気泳動移動度と異なる。

発明の詳細な説明
用語と定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当技術分野（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。標準的技術が、分子的、遺伝的、生化学的手法（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２編（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及び化学的手法に用いられる。

本明細書の文脈における「ハイブリッド配列又はハイブリダイジング配列を形成することができる」という用語は、ポリヌクレオチドの電気泳動分離に用いられるゲル内で一般的に存在できる条件下で、その標的配列に選択的に結合できる配列に関する。

本明細書の文脈における「ヌクレオチド」という用語は、核酸又は核酸アナログの構成単位に関し、そのオリゴマーは、塩基対形成に基づいてＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーと選択的ハイブリッドを形成することが可能である。この文脈における「ヌクレオチド」という用語は、古典的なリボヌクレオチドの構成単位であるアデノシン、グアノシン、ウリジン（及びリボシルチミン）、シチジン、古典的なデオキシリボヌクレオチドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンを含む。これは、さらに、ホスホチオエート、２’Ｏ－メチルホスホチオエート、「ペプチド核酸」（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＰＮＡ；Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位をペプチド結合でつなぎ、グリシンのα炭素に核酸塩基を結合したもの）又は「ロックド核酸」（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＬＮＡ；２’Ｏ，４’Ｃメチレン架橋ＲＮＡビルディングブロック）などの核酸のアナログを含む。本明細書において、「ハイブリダイジング配列」に言及する場合、かかるハイブリダイジング配列は、上記のヌクレオチドのいずれか、又はそれらの混合物から構成されていてもよい。

本明細書の文脈における「逆相補的」という用語は、参照配列に実質的に相補的、かつハイブリダイズすることができる、５’から３’に表示される配列を有するヌクレオチド配列に関する。例えば、参照配列が５’ＡＡＴＧＣ３’であれば、その逆相補配列は５’ＧＣＡＴＴ３’である。「相補的」は、「逆相補的」と同義に使われることもある。

本明細書の文脈では、「ハイブリダイジング配列」という用語は、ＲＮＡ（リボヌクレオチド）、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）、ホスホチオエートデオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ホスホチオエートリボヌクレオチド、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡヌクレオチドアナログを含むか、又はそれから本質的になるポリヌクレオチド配列が包含される。

詳細な説明
本発明の第１の態様は、電気泳動により第１の核酸配列を第２の核酸配列から区別するための方法に関するものであり、
ここで前記第１の核酸配列の電気泳動移動度は、前記第２の核酸配列の電気泳動移動度から区別できなく、
かつ
前記第１の核酸配列Ｓ１は、
－ 第１の５’共通配列トラクトＣ１、及び
－ 第１の５’共通配列トラクトＣ１に３’方向ですぐ隣接し、かつ第１の３’共通配列トラクトＣ２に５’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの長さであることが可能な第１の可変配列トラクトＶ１；及び
－ Ｃ１の３’方向に位置し、かつＶ１が存在する場合、第１の可変配列トラクトＶ１に３’方向ですぐ隣接する第１の３’共通配列トラクトＣ２；
を含み、
前記第２の核酸配列Ｓ２は、
－ 第２の５’共通配列トラクトＣ１’、及び
－ 任意に、第２の５’共通配列トラクトＣ１’に３’方向ですぐ隣接し、かつ第２の３’共通配列トラクトＣ２’に５’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの長さであることが可能な第２の可変配列トラクトＶ２；及び
－ Ｃ１’の３’方向に位置し、かつＶ２が存在する場合、第２の可変配列トラクトＶ２に３’方向ですぐ隣接する第２の３’共通配列トラクトＣ２’；
を含み、かつ
－ 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１は、前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’と同一であるか、又は
前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’は、前記第１の５’共通配列トラクトＣ１より３’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつ前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’は、Ｃ１／Ｃ１’の５’末端から３’末端の上流の－９～－１位置（５’方向）まで前記第１の５’共通配列トラクトＣ１と同一であり；及び
－ 前記第１の３’共通配列トラクトＣ２は、前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’と同一であるか、又は
前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’は、前記第１の３’共通配列トラクトＣ２より５’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつ前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’は５’末端の下流＋９～＋１位置（３’方向）から５’末端まで前記第１の３’共通配列トラクトＣ２と同一であり；かつ
－ 前記第１の５’共通配列トラクト及び前記第１の３’共通配列トラクトの両方が前記第２の５’共通配列トラクト及び前記第２の３’共通配列トラクトと同一の場合、前記第１及び第２の核酸配列の少なくとも１つは、第１又は第２の可変配列トラクトを含み；かつ
－ 前記可変配列トラクトが存在し、かつＣ１がＣ１’と同一で、かつＣ２がＣ２’と同一の場合、前記第１の可変配列トラクトは前記第２の可変配列トラクトと少なくとも一つの位置で異なり；かつ
－ 特定の実施形態では、前記第１の可変配列トラクト及び／又は前記第２の可変配列トラクトは、少なくとも２ヌクレオチドの長さであり；
ただし、Ｓ１及びＳ２は、それらの配列トラクトＣ１－Ｖ１－Ｃ２及びＣ１’－Ｖ２－Ｃ２’に関して、長さが≦１０ヌクレオチド互いに異なることを条件とし、
前記方法は、
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列をプローブ配列Ｐに接触させ、ここで前記プローブ配列は、５’から３’方向において、前記３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的な配列ＲＣ２、及び前記５’共通配列トラクトＣ１に逆相補的な配列ＲＣ１からなり、それによって、前記第１及び第２の核酸配列への前記プローブ配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１のプローブハイブリッド及び第２のプローブハイブリッドを形成し、その後、前記第１及び第２のプローブハイブリッドを電気泳動に供して、前記第１及び第２のプローブハイブリッドの電気泳動移動度を検出すること、
を含む。

本発明のこの態様の１つの代替の態様によれば、電気泳動によって第１の核酸配列Ｓ１を第２の核酸配列Ｓ２から区別するための方法は、以下のとおりの配列を使用する：
前記第１の核酸配列Ｓ１は、
－ 第１の５’共通配列トラクトＣ１、及び
－ Ｃ１へ３’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの第１の可変配列トラクトＶ１；及び
－ Ｃ１の３’方向に位置する第１の３’共通配列トラクトＣ２；
を含み、
前記第２の核酸配列Ｓ２は、
－ 第２の５’共通配列トラクトＣ１’及び
－ Ｃ１’の３’方向に位置する第２の３’共通配列トラクトＣ２’
を含み、かつ
－ 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１は、前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’と同一であり、かつ
－ 前記第１の３’共通配列トラクトＣ２は、前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’と同一であり、かつ
－ Ｓ１及びＳ２は、その配列トラクトＣ１－Ｖ１－Ｃ２及びＣ１’－Ｃ２’に関して、長さが≦１０ヌクレオチド互いに異なる。
本方法は、第１の核酸配列及び第２の核酸配列をプローブ配列Ｐに接触させ、ここで前記プローブ配列は、５’から３’方向において、３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的な配列ＲＣ２、及び５’共通配列トラクトＣ１に逆相補的な配列ＲＣ１からなり、それによって、第１及び第２の核酸配列へのプローブ配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１のプローブハイブリッド及び第２のプローブハイブリッドを形成し、その後、第１及び第２のプローブハイブリッドを電気泳動に供して、第１及び第２のプローブハイブリッドの電気泳動移動度を検出することを含む。

本発明のこの態様の別の代替の態様によれば、電気泳動によって第１の核酸配列Ｓ１を第２の核酸配列Ｓ２から区別するための方法は、以下のとおりの配列を使用する：
前記第１の核酸配列Ｓ１は、
－ 第１の５’共通配列トラクトＣ１、及び
－ Ｃ１へ３’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの第１の可変配列トラクトＶ１；及び
－ Ｃ１の３’方向に位置する第１の３’共通配列トラクトＣ２；
を含み、
前記第２の核酸配列Ｓ２は、
－ 第２の５’共通配列トラクトＣ１’及び
－ Ｃ１’へ３’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの第２の可変配列トラクトＶ２；及び
－ Ｃ１’の３’方向に位置する第２の３’共通配列トラクトＣ２’；
を含み、かつ
－ 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１は、前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’と同一であり、かつ
－ 前記第１の３’共通配列トラクトＣ２は、前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’と同一であり、かつ
－ Ｓ１とＳ２とは、その配列トラクトＣ１－Ｖ１－Ｃ２及びＣ１’－Ｃ２’に関して、長さが≦１０ヌクレオチドで互いに異なる。
前記方法は、
上記のとおり、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列を、上記に定義されるとおりプローブ配列Ｐと接触させ、それによって、前記第１及び第２の核酸配列への前記プローブ配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、その後、第１及び第２のプローブハイブリッドを電気泳動に供して、第１及び第２のプローブハイブリッドの電気泳動の移動度を検出することを含む。

本発明のこの態様のなおさらなる代替の態様では、定常配列トラクトのペアのＣ１とＣ１’又はＣ２とＣ２’は、それらの「遠方の末端」で異なってもよく、すなわちＣ１がＣ２に最も近接し、かつＣ１’がＣ２’に最も近接する末端の反対側にある末端で異なっていてもよい。

このような代替の実施形態では、Ｃ１’はＣ１よりも３’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつＣ１’はＣ１／Ｃ１’の５’末端からＣ１と同一である。あるいは、Ｃ２’は、第１の３’共通配列トラクトＣ２よりも５’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつＣ２’は、Ｃ２／Ｃ２’の３’末端からＣ２と同一である。

上記のとおり、配列Ｓ１及びＳ２は、例えば、参照配列及び編集配列に対して標準的なＰＣＲ法を行うことにより得ることができる。したがって、第１の核酸配列と第２の核酸配列とは、ＰＣＲ産物に共通する長さを有することになる。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び第２の核酸配列Ｓ２の長さは、４０ヌクレオチド～３５００ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び第２の核酸配列Ｓ２の長さは、６０ヌクレオチド～３５００ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び第２の核酸配列Ｓ２の長さは、８０ヌクレオチド～３５００ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び第２の核酸配列Ｓ２の長さは、１００ヌクレオチド～３５００ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び第２の核酸配列Ｓ２の長さは、１５０ヌクレオチド～３５０ヌクレオチドの間、特に１５０ヌクレオチド～２５０ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び第２の核酸配列Ｓ２の長さは、１８０ヌクレオチド～２２０ヌクレオチドの間である。

第１の核酸配列Ｓ１及び第２の核酸配列Ｓ２は、共通の配列トラクトを含む。プローブ配列とインキュベートする場合、プローブ配列は共通配列トラクトにハイブリダイズする。

本発明によれば、第１の核酸配列Ｓ１及び第２の核酸配列Ｓ２は、それらの５’末端が共通の配列トラクトで始まり、それらの３’末端が共通配列トラクトで終わることができる。このように、変異部位周辺のバルジ領域を除けば、プローブはＳ１とＳ２の全長にわたってハイブリダイズする。このような実施形態は「ｐｒｅ－ＰＲＩＭＡ」とも呼ばれる。

あるいは、第１の核酸配列Ｓ１及び第２の核酸配列Ｓ２は、それらの５’末端及び３’末端が共通の配列トラクトで開始されていなくてもよい。この場合、プローブは、５’共通配列トラクトに５’方向（上流側）ですぐ隣接する配列にはハイブリダイズせず、かつ３’共通配列トラクトに３’方向（下流側）ですぐ隣接する配列にはハイブリダイズしない。このような実施形態は「ＰＲＩＭＡ」とも呼ばれる。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１は、第１の５’共通配列トラクトＣ１へ５’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチド、及び第１の３’共通配列トラクトＣ２へ３’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチドを含み、かつ第２の核酸配列Ｓ２は、第２の５’共通配列トラクトＣ１’へ５’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチド、及び第２の３’共通配列トラクトＣ２’へ３’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチドを含む。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１は、第１の５’共通配列トラクトＣ１へ５’方向ですぐ隣接する少なくとも３５ヌクレオチド、及び第１の３’共通配列トラクトＣ２へ３’方向ですぐ隣接する少なくとも３５ヌクレオチドを含み、かつ第２の核酸配列Ｓ２は、第２の５’共通配列トラクトＣ１’へ５’方向ですぐ隣接する少なくとも３５ヌクレオチド、及び第２の３’共通配列トラクトＣ２’へ３’方向ですぐ隣接する少なくとも３５ヌクレオチドを含む。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１は、第１の５’共通配列トラクトＣ１に５’方向ですぐ隣接する少なくとも４７ヌクレオチド、特に５０ヌクレオチド、及び第１の３’共通配列トラクトＣ２に３’方向ですぐ隣接する少なくとも４７ヌクレオチド、特に５０ヌクレオチドを含み、かつ第２の核酸配列Ｓ２は、第２の５’共通配列トラクトＣ１’に５’方向ですぐ隣接する少なくとも４７ヌクレオチド、特に５０ヌクレオチド、及び第２の３’共通配列トラクトＣ２’に３’方向ですぐ隣接する少なくとも４７ヌクレオチド、特に５０ヌクレオチドを含む。

プローブ配列は、ＰＣＲ又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることができる。共通配列トラクトで開始及び終了しないＳ１及びＳ２配列（「ＰＲＩＭＡ」）に対してこの方法を実行する場合、プローブ配列は通常、オリゴヌクレオチド合成によって得られる。このプローブは、第１の５’共通配列トラクトＣ１及び第１の３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的である。

特定の実施形態では、プローブの全長は、１８～８０ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の５’共通配列トラクトＣ１と第１の３’共通配列トラクトＣ２との合計の全長は、１８～８０ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第２の５’共通配列トラクトＣ１と第２の３’共通配列トラクトＣ２との合計の全長は、１８～８０ヌクレオチドの間である。

共通配列トラクトで開始及び終了するＳ１及びＳ２配列（「ｐｒｅ－ＰＲＩＭＡ」）に対して本方法を実行する場合、プローブ配列は通常ＰＣＲにより得られる。このプローブは、第１の５’共通配列トラクトＣ１及び第１の３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的である。

特定の実施形態では、プローブの全長は、１８～３５００ヌクレオチドの間、特に４０～８０ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第１の５’共通配列トラクトＣ１と第１の３’共通配列トラクトＣ２との合計の全長は、１５０～３００ヌクレオチドの間である。

特定の実施形態では、第２の５’共通配列トラクトＣ１と第２の３’共通配列トラクトＣ２との合計の全長は、２００～２５０ヌクレオチドの間である。

電気泳動移動度の違いを容易に識別できるようにするためには、安定したバルジ領域が形成されるようにプローブを設計することが必要である。つまり、変異部位の上流と下流とで、プローブ配列は５’及び３’の共通配列トラクトに安定してハイブリダイズする必要がある。

特定の実施形態では、第１の５’共通配列トラクトＣ１の長さと第１の３’共通配列トラクトＣ２の長さの間の比は１：７～７：１の間であり、第１の５’共通配列トラクトＣ１の最小長及び第１の３’共通配列トラクトＣ２の最小長は５ヌクレオチド、特に１０ヌクレオチド、より特に２０ヌクレオチドである。

特定の実施形態では、第１の５’共通配列トラクトＣ１の長さと第１の３’共通配列トラクトＣ２の長さの間の比は３：５～５：３の間であり、第１の５’共通配列トラクトＣ１の最小長及び第１の３’共通配列トラクトＣ２の最小長は５ヌクレオチド、特に１０ヌクレオチド、より特に２０ヌクレオチドである。

特定の実施形態では、第１の５’共通配列トラクトＣ１の長さと第１の３’共通配列トラクトＣ２の長さの間の比は１：１であり、第１の５’共通配列トラクトＣ１の最小長及び第１の３’共通配列トラクトＣ２の最小長は５ヌクレオチド、特に１０ヌクレオチド、より特に２０ヌクレオチドである。

特に、配列Ｓ１又はＳ２のうちの一方において、他方のそれぞれの配列Ｓ２又はＳ１に対して１ｂｐの欠損又は挿入を検出するためには、４～６ヌクレオチドの間のバルジ領域が適切である。例えば、５ヌクレオチドの長さを有するバルジ（例えば、参照配列とプローブのハイブリッドにおいて）は、４ヌクレオチドの長さを有するバルジ（例えば、１ｂｐ欠損を有する編集配列とプローブとのハイブリッドにおいて）と、又は６ヌクレオチドの長さを有するバルジ（例えば、１ｂｐ挿入を有する編集配列とプローブとのハイブリッドにおいて）と区別することが可能である。バルジは、Ｓ１、及びＳ２の可変配列トラクトによって形成することができる。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１及び第２の可変配列トラクトＶ２は、互いに独立して、４～１０ヌクレオチドの間の長さを有する。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１及び第２の可変配列トラクトＶ２は、互いに独立して、４～６ヌクレオチドの間の長さを有する。

配列Ｓ１とＳ２は、長さが異なることができ、例えばＳ２はＳ１と比較して欠損又は挿入を示す。あるいは、又はさらには、Ｓ１とＳ２は、塩基配列が異なっていてもよく、例えば、ＡＴＧＣＴＴＣはＡＴＧＴＣＴＣと異なる。また、例えばＳ１がＳ２と、ＡＴＣＧＴＴＣとＡＴＧＣＴＴＣのように置換で異なるなど、組成の違いも発生してもよい。このような違いを検出するために、変異部位が共通配列トラクトにより隣接される可変配列トラクト内にあるようにプローブを設計することができる。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１は、長さにおいて第２の可変配列トラクトＶ２とは異なり（欠損／挿入）、及び／又は第１の可変配列トラクトＶ１の塩基配列及び／又は組成は、第２の可変配列トラクトＶ２の塩基配列及び／又は組成と少なくとも１か所で異なる（置換）。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１は、第２の可変配列トラクトＶ２と長さが異なり（欠損／挿入）、及び／又は第１の可変配列トラクトＶ１の組成は、第２の可変配列トラクトＶ２の組成と少なくとも１か所で異なる（置換）。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１は、第２の可変配列トラクトＶ２と長さが異なる（欠損／挿入）。

特定の実施形態では、第１の可変配列Ｖ１トラクトの長さは、第２の可変配列トラクトＶ２の長さと≦１０ヌクレオチドで異なる。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１の長さは、第２の可変配列トラクトＶ２の長さと≦２ヌクレオチドで異なる。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１の長さは、第２の可変配列トラクトＶ２の長さと１ヌクレオチドで異なる。

特定の実施形態では、第１の可変配列トラクトＶ１の組成は、第２の可変配列トラクトＶ２の組成と２か所で、特に１か所で異なる。

上記のとおり、本方法は、ＰＣＲによって得られた配列に対して実施することができる。この場合、第１の核酸配列Ｓ１及び第２の核酸配列Ｓ２及び／又はプローブ配列は、２本鎖である。

特定の実施形態では、第１の核酸配列Ｓ１は、その逆相補配列にハイブリダイズし、及び／又は第２の核酸配列Ｓ２は、その逆相補配列にハイブリダイズする。

特定の実施形態では、プローブ配列Ｐは、その逆相補配列にハイブリダイズする。

特定の実施形態では、第１のプローブハイブリッド及び第２のプローブハイブリッドは、第１及び第２の核酸配列の融点より高い温度を適用し、その後、プローブ配列の融点より低い温度を適用することによって得られる。

本発明の代替の態様は、電気泳動によって第１の核酸配列を第２の核酸配列から区別するための方法に関し、
ここで前記第１の核酸配列の電気泳動移動度は、前記第２の核酸配列の電気泳動移動度と区別できなく、
かつ（図１６参照）
前記第１の核酸配列は、
－ 第１の可変配列トラクト、
－ 前記第１の可変配列トラクトへ５’方向ですぐ隣接する第１の５’共通配列トラクトＣ１、及び
－ 前記第１の可変配列トラクトへ３’方向ですぐ隣接する第１の３’共通配列トラクトＣ２；
を含み、
前記第２の核酸配列は、
－ 任意に、第２の可変配列トラクト、
－ 前記第２の可変配列トラクトへ５’方向ですぐ隣接する、前記第１の５’共通配列トラクトと同一である第２の５’共通配列トラクトＣ１’、及び
－ 前記第２の可変配列トラクトへ３’方向ですぐ隣接する、前記第１の３’共通配列トラクトと同一である第２の３’共通配列トラクトＣ２’；
を含み、
かつ
－ 前記第１の可変配列トラクトは、前記第２の可変配列トラクトと少なくとも１か所で異なり；かつ
－ 前記第１の可変配列トラクトは、第１の配列トラクトＨ及び／又は第１の配列トラクトＡ並びに任意に第１の配列トラクトＵを含み、前記第１の配列トラクトＨは前記第２の可変配列トラクトの第２の配列トラクトＨ’と同一であり、前記第１の配列トラクトＡはプローブ配列の配列トラクトＲＡと逆相補的であり、かつ配列トラクトＵは前記第１の配列に固有であり、かつ
－ 前記第１の可変配列トラクトが前記配列トラクトＨを含む場合、前記第２の可変配列トラクトは前記配列トラクトＨ’を含み、かつ
－ 前記第２の可変配列トラクトは、前記第２の配列に固有の第２の配列トラクトＵ’を含んでもよく、
前記方法は、
前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列をプローブ配列と接触させ、ここで前記プローブ配列が、５’から３’方向において、前記３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的な配列ＲＣ２、及び前記５’共通配列トラクトＣ１に逆相補的な配列ＲＣ１、並びに任意に配列トラクトＡに対して逆相補的である配列トラクトＲＡ及び／又は第１の可変配列トラクト及び第２の可変配列トラクトのいずれともハイブリダイゼーションしない配列トラクトＰを含む可変配列トラクトＲＶからなり、
それによって、前記第１及び第２の核酸配列と前記プローブ配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１のプローブハイブリッド及び第２のプローブハイブリッドを形成し、かつ
その後、前記第１及び第２のプローブハイブリッドを電気泳動に供し、かつ前記第１及び第２のプローブハイブリッドの電気泳動移動度を検出すること、
を含む。

配列
図には以下の配列が表示される。

実施例１：ヘテロ二重鎖の移動度アッセイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ：ＨＭＡ）のパターン及び分解能
本発明者らは、従来のＨＭＡのバンドパターンを島津製作所製マイクロチップ電気泳動システムであるＭｕｌｔｉＮＡを用いて試験した。野生型配列、及び異なる長さの欠損を持つ変異型配列、すなわち０ｂｐ（野生型）～７ｂｐの欠損配列の変異型配列を別々にＰＣＲで増幅した。その後、野生型のＰＣＲ産物を変異型配列のＰＣＲ産物とそれぞれ混合した。これらの混合物は、変性され、そして再アニーリングされて、ヘテロ二重鎖複合体をもたらす。ギャップが十分に長い場合、一致していないＤＮＡ配列では、塩基のループアウトにより生じるバルジが生じ、移動度シフトを引き起こす（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ及びＬｉｌｌｅｙ，１９８９ ＮＡＲ）。以前に示された結果と同様に、本発明者らは、ヘテロ二重鎖ピークの１ｂｐの差をいずれも検出できなかった（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ及びＬｉｌｌｅｙ，１９８９ ＮＡＲ）。２ｂｐのギャップを有するヘテロ二重鎖ピークも明確ではなかった（Ｏｔａら，２０１３ Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ、Ａｎｓａｉら，２０１４ Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ）。

実施例２：５ｂｐ欠損プローブによるＨＭＡ（ｐｒｅＰＲＩＭＡ）
本発明者らは、１ｂｐの長さの違いを検出することを目的に研究を進めた。本発明者らは、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、バクテリア、又はヒトのいずれか５つの遺伝子を使用して、４ｂｐ（＝１ｂｐの欠損）、５ｂｐ（＝野生型）、及び６ｂｐ（＝１ｂｐの挿入）を区別することが可能かどうかを試験した。実際、本発明者らは、すべての場合において１ｂｐの挿入及び欠損を明確に識別した（図４）。本発明者らは、この技術をｐｒｅＰＲＩＭＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｏｂｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ ＨＭＡ）（プローブ誘導ＨＭＡの先駆的方法）と呼ぶ。

本発明者らは、ＰＣＲ断片のサイズ及び／又は様々な配列の効果をさらに調査した（図５及び６）。約２００ｂｐのサイズの断片は、３～７ｂｐのギャップ断片のうち異なるヘテロ二本鎖ピークを検出するのに効果的に機能した（図７）。短い断片（すなわち、図５ｂ及び図６ａのＲＤＰ１の１３０ｂｐ及びＤＭＬ１の１５３ｂｐ）は、明確な違いを得るのに十分ではなかった。３００ｂｐの断片に由来するヘテロ二重鎖のピークは、本システムでは上部マーカーと重なることがあり、ＭｕｌｔｉＮＡ ｃｈｉｐ５００では解析できない（図５ｃ、図６ｃ）。

さらに本発明者らは、プローブの設計を最適化することを目指した。プローブは、ＰＣＲ断片の端よりもＰＣＲ断片の中央で変異部位と重なるギャップ領域がある方がより良好に機能した（図８）。

実施例３：短い１本鎖ＤＮＡ（ｓｓｓＤＮＡ）プローブを用いたＰＲＩＭＡ
２００ｂｐのＰＣＲ断片の中央部で５ｂｐの欠損を有するプローブを作成するには、２段階のＰＣＲ又はクローニングが必要であるために時間がかかる（Ｂｒａｍａｎ ２００４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ６３４）。それ以外の場合としては、長いオリゴを発注することは可能であるが、コストが比較的高くなる。

これらの障害を克服するために、本発明者らは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）が、塩基がループアウトしたヘテロ二本鎖を生成するのに十分であるかどうかを調査した。結果を図８ｃに示す。ｓｓＤＮＡ（８０ｍｅｒ）は、１ｂｐの異なる配列を識別するのに十分であった。このｓｓＤＮＡプローブを短くして、オリゴヌクレオチド合成のコストを削減することも可能であった。本発明者らは、４０ｍｅｒなどの短いｓｓＤＮＡ（ｓｓｓＤＮＡ）で十分であることを発見した（図８ｃ）。これらの発見から、本発明者らは、この方法を、ｓｓｓＤＮＡを用いたＰＲＩＭＡ（Ｐｒｏｂｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）（プローブ誘導ヘテロ二本鎖移動度アッセイ）と名付けた。ｓｓｓＤＮＡはＤＮＡ断片の中央付近にセットされることがより好ましいこともまた重要である（図８）。

実施例４：ＰＲＩＭＡによるスクリーニング
本発明者らは、ＲＤＰ１の１０個の欠損から１０個の挿入の変異配列を用いてＰＲＩＭＡを試験した（図９）。挿入配列に対して欠損配列のサイズが異なるヘテロ二重鎖のピークが得られた（図９）。これらの結果は、ＰＲＩＭＡが変異体のスクリーニングに機能することが可能であることを示唆している。これは、生物学研究者の幅広い分野において時間と費用とのコストを削減する大きな助けとなり得る。

実施例５：ＰＲＩＭＡによるジェノタイピング
従来のＨＭＡはジェノタイピングに用いられてきたが（Ａｎｓａｉら，２０１４ Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ）、上記でも示したとおりＨＭＡの分解能は低い（図１）。このように分解能が低いため、１ｂｐ違いのヘテロ接合体の遺伝子型を区別することができない。ヘテロ二重鎖の移動度シフトから数ｂｐの違いが検出できる場合さえ、そのわずかな違い（数ｂｐ）では２つのホモ接合体遺伝子型（すなわち野生型と変異型）を区別できないことが多い。研究者らは、これらのホモ接合体の野生型と変異型とを区別するために、ＨＭＡの別のサンプルセットを実行した（図１０ａ）。

時間の節約のために２種類の実行を同時に行うことが可能であるが、研究者らはサンプル数の２倍の分析を行わなければならない。

一方、ｐｒｅＰＲＩＭＡとＰＲＩＭＡは１回の実行で遺伝子型を区別することができる（図１１及び図１０）。５ｂｐの欠損配列をプローブとして用いた場合、野生型ホモ接合体又は変異型ホモ接合体に由来するヘテロ二重鎖ピークは、異なる移動度シフトを示すことが観察された。ヘテロ接合体のサンプルは両方のピークを示した（図１０ｃ及び図１０ｄ）。まとめると、ｐｒｅＰＲＩＭＡとＰＲＩＭＡとは、ＨＭＡと比較して、ジェノタイピングにかかるコスト、労力、及び／又は時間を節約することができる。ＰＲＩＭＡはｐｒｅＰＲＩＭＡに比べ、長いプローブを合成する必要がないため、ジェノタイピングに最適な方法として推奨される。

実施例６：ＰＲＩＭＡは多くの配列に適用可能である
本発明者らは、植物、バクテリア、及びヒトのいくつかの配列に対してＰＲＩＭＡが利用可能であるかどうかを試験した。本発明者らは、ＰＲＩＭＡ（及びｐｒｅＰＲＩＭＡ）を用いて、遺伝子型及び材料ごとに異なるサイズのヘテロ二重鎖ピークを検出することに成功した（図１３）。

短い１本鎖ＤＮＡ（ｓｓｓＤＮＡ）プローブ（フォワードプローブ）によるピークパターンがあまり明確に区別できないケースに遭遇した場合に、発明者らは別のｓｓｓＤＮＡ（リバースプローブ）の鎖を試した。同じＰＣＲ断片と同じプローブ領域においてプローブとして相補的な配列を使用して試験した。フォワードプローブ又はリバースプローブを用いてヘテロ二重鎖ピークの移動度の違いを検出した（図１３）。この結果は、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ及びＬｉｌｌｅｙ，１９８９ ＮＡＲのＨＭＡのケースと同等のものである。相補的なプローブにより異なるピークが検出された。通常、これら２つのプローブのうち少なくとも１つにより、遺伝子型の違いによって明確な違いを示した（図１３）。両方の鎖がうまく機能しなかった場合は、プローブの位置を少しシフトさせることを実施した。

実施例７：ＰＲＩＭＡは塩基の種類（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を区別することが可能である
近年のＣＲＩＳＰＲシステムの発展により、ＳｐＣａｓ９のヌクレアーゼ不活性化バージョンを用いた「塩基編集」が可能になった（Ｋｕｍｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ２０１６、Ｎｉｓｈｉｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１６、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕら，２０１８）。ＰＲＩＭＡが塩基の種類を区別するのに使用できるかどうかを試験するために、本発明者らはＰＲＩＭＡを行った（図１３）。本発明者らは同じ位置でＡかＴかを区別することができた（図１３ｂ）。この結果は、ＰＲＩＭＡが、インデルの検出以外にも一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）タイピングに適用できる可能性をさらに広げるものである。ＳＮＰタイピングは、化学的に変異した遺伝子型（植物ではＥＭＳ変異株など）にも有用である。ホモログがＰＲＩＭＡによって区別できる。

方法
ＭｕｌｔｉＮＡ ＤＮＡ－５００キットを使用したＰＲＩＭＡの手順（図１５）
１．ゲノム編集の標的部位に基づくＰＣＲ条件を設定する。
以下の条件を満たすプライマーを設計する。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー位置：（推定）変異位置の約１００ｂｐ上流。
リバースプライマー位置：（推定）変異位置の約１００ｂｐ下流。
これらのプライマーは、生成物サイズが１８０～２２０ｂｐになるように設計することが推奨される。
２．（推定）変異位置周辺の５ｂｐ欠損を含むプローブを設計する。
ＰＲＩＭＡは、短い１本鎖ＤＮＡ（ｓｓｓＤＮＡ）を用いて機能する。４０ｍｅｒのｓｓｓＤＮＡが、工程４の再アニーリングプロセス後に構造変化をもたらすのに十分な長さであることを確認した。プローブ位置５ｂｐの欠損はＰＡＭ配列の－６から始まり－２までであることを推奨する（図１５参照）。
３．ＰＣＲ
工程１のプライマーを用いて、通常のＰＣＲ手順でＰＣＲ断片を調製する。
４．ＰＣＲ産物とプローブの混合物を調製し、再アニーリングする。
９μｌのＰＣＲ産物と工程２で調製した１μｌの１０μＭプローブとを混合する。
次に、変性及び再アニーリング反応を次のとおり実行する：９５℃で５分、毎秒０．１℃で２５℃へ冷却。
５．ヘテロ二本鎖ピークを検出する。
ヘテロ二本鎖ピークは、島津製作所製マイクロチップ電気泳動システムであるＭｕｌｔｉＮＡで検出することができる。この検出工程は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｏｔａら，２０１３ Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ、Ａｎｓａｉら，２０１４ Ｄｅｖ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ、Ｄｅｌｗａｒｔら，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ）又は他の高分解能電気泳動装置（すなわち、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡｘｃｅｌ）によって達成することができる。

Claims (12)

1. 電気泳動により第１の核酸配列を第２の核酸配列から区別するための方法であって、
   前記第１の核酸配列Ｓ１は、
   － 第１の５’共通配列トラクトＣ１、及び
   － Ｃ１へ３’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの第１の可変配列トラクトＶ１；及び
   － Ｃ１の３’方向に位置する第１の３’共通配列トラクトＣ２；
   を含み、
   前記第２の核酸配列Ｓ２は、
   － 第２の５’共通配列トラクトＣ１’、及び
   － 任意に、Ｃ１’へ３’方向ですぐ隣接する、１ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの第２の可変配列トラクトＶ２；及び
   － Ｃ１’の３’方向に位置する第２の３’共通配列トラクトＣ２’；
   を含み、かつ
   － 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１は、前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’と同一であるか、又は
   Ｃ１’はＣ１より３’末端にて１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつＣ１’は、Ｃ１／Ｃ１’の５’末端からＣ１と同一であり、かつ
   － 前記第１の３’共通配列トラクトＣ２は、前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’と同一であるか、又は
   Ｃ２’は、前記第１の３’共通配列トラクトＣ２よりも５’末端で１ヌクレオチド～９ヌクレオチド短く、かつＣ２’は、Ｃ２／Ｃ２’の３’末端からＣ２と同一であり、かつ
   － ただし、Ｓ１及びＳ２は、それらの配列トラクトＣ１－Ｖ１－Ｃ２及びＣ１’－Ｖ２－Ｃ２’に関して、長さが≦１０ヌクレオチド互いに異なることを条件とし、
   前記方法は、
   前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列をプローブ配列Ｐと接触させることであり、ここで前記プローブ配列は、５’から３’方向において、前記３’共通配列トラクトＣ２に逆相補的な配列ＲＣ２、及び前記５’共通配列トラクトＣ１に逆相補的な配列ＲＣ１からなること、
   それによって、前記プローブ配列と前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、第１のプローブハイブリッド及び第２のプローブハイブリッドを形成すること、及び
   その後、前記第１のプローブハイブリッド及び前記第２のプローブハイブリッドを電気泳動に供し、かつ前記第１のプローブハイブリッド及び前記第２のプローブハイブリッドの電気泳動移動度を検出すること、
   を含む、前記方法。
2. 前記第１の核酸配列Ｓ１の長さ及び前記第２の核酸配列Ｓ２の長さは、４０ヌクレオチド～３５００ヌクレオチドの間である、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の核酸配列Ｓ１は、前記第１の５’共通配列トラクトＣ１へ５’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチド、及び前記第１の３’共通配列トラクトＣ２へ３’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチドを含み、かつ前記第２の核酸配列Ｓ２は、前記第２の５’共通配列トラクトＣ１’へ５’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチド、及び前記第２の３’共通配列トラクトＣ２’へ３’方向ですぐ隣接する少なくとも５ヌクレオチドを含む，請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１と前記第１の３’共通配列トラクトＣ２との合計の全長は、１８ヌクレオチド～３５００ヌクレオチドの間である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１の５’共通配列トラクトＣ１の長さと前記第１の３’共通配列トラクトＣ２の長さとの比は、１：７～７：１の間であり、前記第１の５’共通配列トラクトＣ１及び前記第１の３’共通配列トラクトＣ２の最小長は、５ヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１の可変配列トラクトＶ１及び前記第２の可変配列トラクトＶ２は、互いに独立して、４ヌクレオチド～１０ヌクレオチドの間の長さである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１の可変配列トラクトＶ１は、前記第２の可変配列トラクトＶ２と長さが異なり、及び／又は前記第１の可変配列トラクトＶ１の塩基配列及び／又は組成は、前記第２の可変配列トラクトＶ２の塩基配列及び／又は組成と少なくとも１か所で異なる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の可変配列トラクトＶ１の長さは、前記第２の可変配列トラクトＶ２の長さと≦１０ヌクレオチドで異なる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１の可変配列トラクトＶ１の組成は、前記第２の可変配列トラクトＶ２の組成と２か所で異なる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１の核酸配列Ｓ１は、その逆相補配列にハイブリダイズし、及び／又は前記第２の核酸配列Ｓ２は、その逆相補配列にハイブリダイズする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記プローブ配列Ｐは、その逆相補配列にハイブリダイズする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１のプローブハイブリッド及び前記第２のプローブハイブリッドは、前記第１の核酸配列及び前記第２の核酸配列の融点を超える温度を適用し、その後に前記プローブ配列の融点未満の温度を適用することによって得られる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。