JP2001517086A

JP2001517086A - Ｖｎｔｒ対立遺伝子の抽出および利用

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Publication number: JP2001517086A
Application number: JP54208898A
Authority: JP
Inventors: グレッグ・ファース
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2001-10-02
Also published as: CN1257551A; AU725963B2; US20020058250A1; GB2338553B; KR20010005544A; CA2283651A1; IL131610A0; AU6737698A; GB2338553A; HUP0000668A3; GB9922203D0; NO994441D0; HUP0000668A2; NO994441L; IS5188A

Abstract

(57)【要約】本発明は、VNTR対立遺伝子の抽出のため、そして複数の個体からの複合ゲノムの同時の比較による複数の座における遺伝形質に関する多形マーカーの付随する検出のための新規な方法である。産物は、形質に関して有益な対立遺伝子の全体の表示（Total Representation of Alleles Informative for a Trait：TRAIT）をデザインされる。これらの対立遺伝子は、直接遺伝マーカーとして用いるかまたは媒体として用いることにより、配列変異の正確な局在を必須としてよい。

Description

【発明の詳細な説明】ＶＮＴＲ対立遺伝子の抽出および利用用語および略語の解説アダプターヌクレオチド配列であって、通常はアニールされた相補オリゴヌクレオチドを含み、特異的増幅を可能にするDNA断片であってそれらの断片の操作を可能にするDNA断片に連結される AFLP 増幅された断片長の多形性(amplified fragment length polymorphism）対立遺伝子任意の一つの座における幾つかの可能な別の配列の変異体の一つアンプリマーアダプタープライマーおよび内部プライマーを用いた増幅により生成した産物または産物のプール DNA デオキシリボ核酸 DNAフィンガープリント特定のDNAサンプルからの一連のDNA断片の表示 GMS ゲノミックミスマッチスキャニング個体（individual）調査のためのあらゆる種の被験者のメンバーヘテロ二重鎖異なる個体、個体または集団のセットに由来する２つの対立遺伝子の二重鎖ヘテロ接合体二倍体細胞中の対の染色体各々の同じ座における対立遺伝子が異なるホモ二重鎖であること、対立遺伝予の二重鎖は同じ個体、個体または集団のセットに由来するホモ接合体二倍体細胞の対の染色体の同じ座の対立遺伝子が同一であること遺伝子座（locus）染色体上の特定の位置ミスマッチ反対の塩基と安定な水素結合を形成しない二重鎖中の一つまたは複数の塩基 NASBA 核酸配列に基づく増幅 PCR ポリメラーゼチェインリアクション RAPD ランダムに増幅されたDNAマーカー RDA 代表的相違分析 RFLP 制限断片長の多形性形質（trait）識別する特性または物理学上、化学上または生物学上それ自身を証明する特徴 TRAIT 形質に関しで有益な対立遺伝子の全体の表示（Total Representation of Alleles Informative for a Trait） VNTR 可変数のタンデムリピート、また単一配列繰り返し（連続するかまたは短い非繰り返し配列により遮断されてよい２つ以上のヌクレオチドの全ての繰り返しを包含し、ミニサテライトおよびマイクロサテライトを含む）とも呼ばれる発明の分野本発明の分野は、複合体ゲノム中の多形性変異の検出であり、全ての生物の遺伝形質の研究の主な支えである。多遺伝子性の形質は一遺伝子性の形質よりはるかに重要であるから、複数の個体の複合ゲノム内においての幾つかの有益な多形性の概念における単離を可能にする方法は、遺伝形質の調査のための極限の強力な手段を提供するはずである。本発明は、以前に用いられた他の全ての技術とは、（ｉ）迅速且つ容易なDNAからのVNTRsの集団生成を許容すること；（ii）連鎖しており且つ形質に有益な多形性を生じること；（iii）ゲノム中で起こるとおり、多形性対立遺伝子を再生して保存すること；（iv）他のポリメラーゼチェインリアクションに基づく技術の特徴である問題を打ち消すこと；間違った開始、反応汚染および偽の生成物の生成を含む；（ｖ）密接に関連した個体の家族に限られた調査の要求を打ち消すこと；（vi）多遺伝子性形質の分析を許容すること；（vii）DNA出発物質のための質素な要求を有することにより根本的に異なる。本発明は、よって、バイオメディカル分野の労働者が、有利または有害な一遺伝子性または多遺伝子性の形質により共に分離する多形性に関して迅速且つ忠実に単一または複合のゲノムをスクリーンすることにおける、大きな前進を示す。医学、獣医学、法医科学、農学、動物農業およびバイオテクノロジーの前進に関して莫大な可能性が有り、社会的または経済的に重要な遺伝疾患または形質により共に分離する多形性マーカーの生成による。本発明は、全ての関連生物のための変異分析を促進するようにも機能する。序論 DNAは４つのモノヌクレオチドユニットの繰り返しからなる二本鎖直鎖ポリマーである。これらのユニットが並ぶ配列はゲノムと呼ばれる遺伝コードを生じる。種内の全ての個体のゲノムは本質的に類似であるが、個性を付与する微妙な変異が存在する。一つより多い配列変異が存在してよいゲノムの位置は多形性と呼ばれ、その配列の各変異は対立遺伝子を象徴する。配偶子形成胚細胞における多形性は次の子孫の世代により遺伝される。個体のゲノムにおける多形性の組み合わせを研究することにより、唯一のコード（フィンガープリント）を割り当てることができ、そしてその個体の祖先を決定することができる。さらに、特定の遺伝形質または遺伝疾患と連鎖して共に分離すること（co-segregating）がわかった多形は他の個体におけるその形質または疾患の遺伝スクリーニングのマーカーとして使用してよい。複合ゲノム中の有利または有害な形質の研究は、その経済的、医学的そして社会的含蓄のために、重要な興味の主題であった。複合ゲノム中の核酸配列の比較並びにそれらの配列のサブセットに独特の違いの単離を許容するプロトコルの確立は、この分野の研究の根本的な要求である。多くのプロトコルが、核酸配列の比較並びに個体間のそれらの配列の間の相違の単離のために動物および植物において用いられてきた。これらのプロトコルは、制限断片多形性(RFLP)、ランダム増幅された多形性(RAPD)、増幅断片長多形性 (AFLP)、代表的相違分析(RDA)、ゲノムミスマッチスキャニング(GMS)、および可変数タンデムリピートの連鎖分析（VNTR）を含む。これらのプロトコルは、ゲノム中の全DNA配列の変化のサブセットをアッセイすることにより多形性を検出する。RFLP，AFLPおよびRDAにより検出される多形性は制限断片サイズの変化を反映するゲル電気泳動によりフィンガープリントラダーの生成に依存する。RAPD多形性は、プライマー結合部位における変化、およびプライマー結合部位間の距離の違いによりもたらされる。GMS多形性は、２つの関連ある個体に由来する制限断片を含むヘテロハイブリッド分子内の配列の変化によりもたらされる。連鎖の分析は、可変数のタンデムリピート（VNTRs）の長さの変化および興味の有る形質内の一つの対立遺伝子の共分離（co-segregation）の検出を含む。 RFLP RFLP分析は、制限エンドヌタレアーゼによる核酸配列の分割およびゲル電気泳動によるその結果の断片の分離に依存する。断片は、膜にブロットして、標識プローブにハイブリダイズさせることにより、断片の長さの変化の検出を可能にする。この技術は単一の単離された遺伝子座または遺伝子断片の研究において使用してよいが、調査が単離された配列に限定されない場合にはそれは不十分である。さらなる制限は、生じたごく少数の多形性が有益であり、DNA出発物質に関する高い要求が存在し、そして方法が労働集中的であることである。 RAPD RAPDは、ゲノミックフィンガープリンティングおよび多様性の研究、特に植物種のために、共通に用いられるPCRに基づく多形性マーカー技術である。この技術は、ゲノミックDNAの配列と5'から3'方向に向かって任意プライマーとの間に十分な相同性がある場合にゲノムの領域の増幅を生じる単一の「任意プライマー」の使用を含む。増幅された産物は、ゲル電気泳動により分離する。この方法の微妙な変化は、任意プライマーPCR（AP-PCR）およびDNA増幅フィンガープリンティング（DAF）を含む。しかしながら、異なる分析のための任意プライミングおよびPCRによるDNA増幅の原理は全てに共通である。RFLPに比した利点は、これらの方法がより迅速であり、DNAに関する要求が低いこと、そして配列の予めの認知を要求しないことである。RFLPと共通の制限は、各分析が２つの個体のゲノムを比較できるのみであることである。幾つかの遺伝子座はこの方法により付随的に評価され得るが、多形性の検出はゲル電気泳動によるバンドパターンの変化の観察を必要とし、そして同様な電気泳動移動度の異なる対立遺伝子の重なりのエラーをこうむる。多くのバンドが弱いかもしれず、解釈し難く、そして繰り返しの実験において一致した結果を達成し難い。大多数のPCR技術と共通なのは、各反応条件における微妙な変化、試薬の汚染、および不一致のバンドパターンの生成により結果がエラーしがちである。信頼性のこの欠如は、個々の「型決定(typ ing)」におけるそのような技術の有用性を制限する。 AFLP AFLP分析（EP，A，0534858；Zabeau M et al.）は、DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化およびアダプターへの生成制限断片の連結を含む。アダプター配列に相補なプライマーの使用により、制限断片がPCRにより増幅されて、ゲル電気泳動により産物が分離されて、バンドパターンの違いが多形性を明らかにする。マイクロサテライトAFLP（WO 96/22388；Kuiper M et al.）は、この技術の修飾であり、少なくとも一方が単一の配列繰り返しを切断する、２つまたはそれ以上の制限酵素を用いてDNAを分割してアダプターに連結した断片にする。断片はアダプター配列の相補なプライマーを用いて増幅する。RAPDと共通なのは、いくつかの遺伝子座がこの方法により付随的に評価できるが、多形性の検出がゲル電気泳動によりバンドパターンの変化の観察を必要とし、そして同様な電気泳動移動度の異なる対立遺伝子の重なりのエラーをこうむることである。AFLPフィンガープリント上のバンドを数える能力は、そのいくつかが極めて弱くて且つ解釈困難であってよい多数のバンドの生成により、あやうくされる。さらに、この技術は上記のPCRに基づく全ての技術に共通のエラーをしがちであり、そして複数の複合ゲノムを同時に分析する不可能性を被る。これは、真の多形性を反映しない、バンドの生成、鋳型DNAの不完全な制限によりひどくなる。AFLPおよびRAPD分析は、よって、多くの同じ制限を共有する。さらなる問題は、AFLPsはゲノムを通して一様に分散するよりもセントロメア付近にかたまることが報告されることである。結果的に、この方法は、興味のある配列の相違がセントロメアから離れて位置すれば、興味のある配列の相違により共に分離する多形性の生成を許容しないかもしれない。この問題は、連鎖分析のような技術に比較して多形性の速度が低下することに反映される。さらに、AFLPに由来する実験データの複雑さは分析するゲノム目的物の増大した複雑さにより誇張されるようになる。結果的に、AFLP分析により幾つかの植物種のゲノムを調査することが可能であったが、高等真核生物種の相対的に複雑なゲノムはこの技術の有用性能力を超えるかもしれない。 RDA RDAは、DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化、断片のアダプターへの連結および PCRによる増幅を含む。比較されるゲノムとの相違は、相違する領域が優勢であるような減法ハイブリダイゼーションとキネティック富裕化の連続回転により選択される。この技術は、反応汚染および偽の産物の生成を通して間違った結果になりがちである。さらに、RDAの根本的な要求は、密接に関連した個体の家族の利用可能性であり、そのいくつかは興味のある形質を証明する。密接に関連したかまたは高度に近親繁殖のゲノム以外のものにRDAを実施する場合には、相違の多重度は簡潔且つ有用な分析に関してより大きい。 GMS GMSは、２つの関連した個体の祖先による同定の領域をマップする技術である。ゲノミックサンプルは増幅されないから、完全ゲノムを、DNAに関して高度な要求を有する単一のハイブリダイゼーションにおいて比較する。予めのマップ情報の要求、慣用マーカーまたはゲル電気泳動が不要なのはその長所である。しかしながら、この方法は２つの関連した個体のみのゲノムへの使用に制限される。２つのゲノムの制限断片をハイブリダイズさせるが、ヘテロハイブリッド分子が、それぞれ完全メチル化および非メチル化分子のみを分割するDpnIおよびMboI による消化に対するそれらの耐性を通して識別できるように、その一方がメチル化される。ミスマッチを欠く相同鎖を含むヘテロハイブリッドを選択して使用することにより、マップされたクローンのアレイを釣り上げる。この技術において使用されるミスマッチ蛋白質は点変異を解析してよいが、この系の制限を越える、より実質的なミスマッチを含む点変異多形は検出されない。よって、RFLP，AF LP，RAPDおよびRDAと共に、GMSは低い有益な情報力を有するかもしれない二元性多形を解析する傾向がある。上記技術の全てにおいて、多形を検出するために、プライマー結合部位またはエンドヌクレアーゼ制限部位においてかまたはそれらの間でヌクレオチド配列の相違があることが必須である。これはこれらの方法の主な制限を強調するが、なぜならば、多くの例において、遺伝形質を生じる変異がプライマー結合または制限酵素消化における変化により検出されうる配列の相違を創製しないからである。結果として、興味のある形質に関連する多形性はこれらの技術を用いて同定されない。GMSは、制限部位に付帯し且つ他の方法の制限のいくつかを容赦する（s pared）多形性を検出する。しかしながら、VNTR多形性と対照的に、これらの技術全てにより検出される多形性の多くは有益ではない。連鎖（linkage）分析連鎖分析は間接の分子遺伝戦略であり、形質が存在する場合に多形性VNTRsの遺伝と家族内の興味のある形質との系統的比較を含む。多くの種類のVNTRが存在し、ミニサテライトおよびマイクロサテライトを含み、全ての特徴は単一配列の要素の反復である。それらは各要素が繰り返される回数における変化により多形性であり、長さに変化を有する複数の対立遺伝子を生じる。幾つかの別の対立遺伝子がいずれか一つの遺伝子座において存在してよいから、プライマー結合または制限酵素消化における変化に基づく多形性とは対照的に、VNTR多形性対立遺伝子は高度に有益である傾向がある。結果として、特定のVNTR対立遺伝子と形質の共分離（co-segregation）が証明される場合、対立遺伝子はその形質のためのマーカーとして用いてよいか、または形質の分子遺伝学の基礎の同定を促進するために媒体（vehicle）として用いてよい。マイクロサテライトは全ての真核生物のゲノムを通して至るところに分散している。結果として、マイクロサテライトを用いた連鎖分析は、遺伝スクリーニング法の高い多形性検出速度に関連する。事実、系統的マイクロサテライト分析は、普通の癌の特定の種類の理解においての多大な前進のために既に必須であった。連鎖分析は、したがって、異なる分析の他の関連法に比して利点を有し、その結果は極めて再現性がある。しかしながら、連鎖分析は、極めて時間を消費し、労働集約的であり、そして高価である。さらに、多くの分析を個別に実施するので、DNAに関する全体の要求は極めて高い。これは、ゲノムの物理マップがゲノム全体に一様に分散した有益なマイクロサテライトの選択に利用できないなら、特に真実である。連鎖の証明は、実験データの分析のための精巧な統計プログラムおよび強力なコンピューターソフトウエアを必要とする。この技術は一遺伝子性の欠陥に良好に適合されるが、複遺伝子性形質に要求される統計分析が特に複雑だからである。不幸なことに、複数要素の遺伝形質は一遺伝子性の欠陥,よりもはるかに優勢であり、それにより連鎖分析を、遺伝形質のほとんどの調査に関して煩わしい技術となす。複合ゲノム中で疾患と共に分離する多形の単離（isolation）のための理想的なプロトコルの特徴は、（ｉ）幾つかの個体の複合ゲノムからの多形を同時に且つ忠実に単離する能力（ii）多遺伝子性形質の分析を許容する、幾つかの多形を同時に単離する能力（iii）点変異によりもたらされるような微妙な相違を含む、全ての真核生物種における配列相違を伴って共に分離する多形の高い検出速度（iv）興味のある形質を研究するための、密接に関連した個体の大きな家族に関しての要求がないこと（ｖ）ゲノムの物理マップまたはゲノミック種の以前の知識に関する要求がないこと（vi）分析のために核酸サンプルの量を倹約する要求（vii）高価な専門家実験室用の装置またはコンピューターソフトウエアに関する要求がない、使用における単純さ（viii）動物および植物界にわたる広い応用の能力（ix）精密、正確且つ忠実な堅固な性能を含むはずである。現在利用可能な技術のいずれもがこれらの理想的な特徴の殆どを満たさない。全ては、幾つかの制限の少なくとも一つにより妥協し、高価であること；スピードの欠如；大量のDNAの要求；低い多形検出速度；点変異のような小さな配列の配列の変化を検出することの不可能性；人工物および偽の結果の高い危険性を伴う忠実性の欠如；共存の幾つかの複合ゲノムを分析することの不可能性；複数の座における同時多形解析の不可能性；分析のための密接に関連するゲノムのための本質的な要求；配列の予めの知識に関する要求；そして高価な装置およびコンピューターソフトウエアに関する要求を伴う分析の複雑性を含む。さらに、密接に関連した個体の大きな家族に依存するこれらの技術は、連鎖において矛盾が存在する場合にはさらに妥協されて、その結果、父性試験は、分析される各家族の個体の完全性を確立するために本質的に予備的な調査となるかもしれない。本発明本発明はゲノミックまたは合成のDNAからVNTRsをまとめて生成する新規な方法に関し、そのフランキング配列と共に各対立遺伝子を保持する。これらの対立遺伝子を用いることによりゲル電気泳動によるフィンガープリントを生成してよく、または個体の遺伝子型決定のためのプロトコルにおいて、あるいは遺伝形質と共に分離する多形マーカーの単離のためのプロトコルにおいて、出発物質として用いてよい。後者は、特定の形質を発現する（manifesting）全ての個体に共通の対立遺伝子のプールを生じるために、ミスマッチ識別により達成してよい。さらに、形質が存在しない場合のこれらの選択された対立遺伝子と個々の対立遺伝子のミスマッチ識別は、溶液中においてかまたはアレイに固定して、特定の形質に連鎖しそして有益な対立遺伝子を用いたVNTRsの精製を可能にする。最終産物は、よって、形質に関して有益な対立遺伝子の全体の表示（Total Representation of Alleles Informative for a Trait：TRAIT）と呼ぶ。一つの側面において、本発明は、興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAのVNTRs対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の混合物を作成する方法を提供し、該方法は、工程：ａ）興味のある種のゲノミックDNAを断片に分割し、ｂ）各断片の各末端にアダプターを連結し、それにより酵素鎖反応を妨害するために各3'末端がブロックされている場合のアダプター末端化（terminated）断片の混合物を形成し、ｃ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型としてアダプタープライマーとVNTRプライマーと共に用いることにより5'フランキングVNTRアンプリマーの混合物を創製し、ｄ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型としてアダプタープライマーとVNTRアンチセンスプライマーと共に用いることにより3'フランキングVNTRアンプリマーの混合物を創製し、ｅ）そして、興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAを鋳型として、並びに5'フランキングVNTRアンプリマーの混合物および3'フランキングVNTRアンプリマーの混合物をプライマーとして用いることにより、対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の所望の混合物を作成することからなる。興味のある種は、植物および動物界からのあらゆる真核生物種であってよい。それらは全く同じ様式により反復配列を示さないが、原核生物種も計画される。種の個々のメンバーは、例えば、植物または微生物または動物例えば哺乳類であってよい。別の側面において、本発明は、興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAの一部を提供するが、その一部とは、選択されたVNTR配列の対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の代表的な混合物から本質的になる(consi sting essentially of)。用語「対立遺伝子の代表的な混合物」は、選択されたVNTR配列の、可能な対立遺伝子の全て、またはこれらの可能な対立遺伝子のほとんどでさえも存在することを必ずしも含蓄しない。特定の対立遺伝子が、例えば上記方法により生成した混合物中に存在するか否かは、工程ａ）において用いられた酵素の性質および他の因子に依存してよい。本発明は、興味のある種のゲノミックDNAの一部も提供し、その一部とは、選択されたVNTR配列の3'フランキング領域の代表的な混合物から本質的になり（co nsisting essentially of)、混合物の各メンバーはその3'末端にアダプターを有する。本発明は、興味のある種のゲノミッタDNAの一部も提供し、その一部とは、選択されたVNTR配列の5'フランキング領域の代表的な混合物から本質的になり（co nsisting essentially of)、混合物の各メンバーはその5'末端にアダプターを有する。本発明は、多形対立遺伝子、例えば選択されたVNTR配列とそれらのフランキング領域の混合物、あるいは幾つかの他の方法例えばAFLP、マイクロサテライト-A FLP、GMSまたはRAPDにおいて生成された混合物を処理するための方法も提供し、該混合物は興味のある形質を証明するものの代表であり、該方法は混合物の鎖を分離してそして次に混合物の鎖を再アニーリングし、そしてあらゆるミスマッチを分離して捨てることからなる。好ましくは、該方法は、上記混合物を、対応する多形対立遺伝子、例えば選択されたVNTR配列とそれらのフランキング領域の混合物とハイブリダイズさせるか、あるいは興味のある形質を証明するものの代表である幾つかの他の方法例えばAFLP、マイクロサテライト-AFLP、GMSまたはRAPD において生成された混合物とハイブリダイズさせ、そしてミスマッチを選択することにより興味のある形質の特徴である多形対立遺伝子の混合物を提供する、付加的な工程を含む。本発明は、上記の方法を実施するためのプロトコルおよび試薬を含むキットも提供する。本発明の特徴的な点は、以下のとおりに示される：（ｉ）選択されたアダプターに連結し且つ選択されたプライマーに相同な配列を含むゲノミックDNA制限断片の二重陽性選択によるゲノムの複雑さの減少；（ii）鋳型内のフランキング配列を伴うVNTRsの再創製を可能にするような、ゲノミック鋳型への選択された富裕化断片の導入であって、対立遺伝子を保持することにより各々の座の有益性を保持する導入；（iii）誤ったプライミング現象、反応汚染および反応条件における微妙な変化を通して起こるあらゆる偽増幅産物を除去するための生成VNTR対立遺伝子のミスマッチ識別；（iv）特定の形質を発現する全ての個体に共通なそれらの合成されたVNTRs対立遺伝子あるいは個体のそのようなグループにおいて支配的なそれら対立遺伝子のみの選択。これは、鎖の解離およびハイブリダイゼーションにより達成されて、個体毎に異なる任意の遺伝子座において対立遺伝子のヘテロ二重鎖を含むミスマッチを生じる。これらの複合体は、ミスマッチ識別により拒絶されうる。形質を発現する個体において共通であるかまたはそのグループにおいて支配的な富裕化された対立遺伝子は、多形対立遺伝子を利用する他のDNAに基づく研究において出発物質として用いられるのに十分な純度である。（ｖ）特定の形質を発現する全ての個体に共通かまたは形質が存在しない場合の個体にも共通なそのようなグループにおいて支配的なそれらの対立遺伝子の拒絶。これは、興味のある特定の形質を発現する個体に共通であるかまたはそのようなグループに支配的な対立遺伝子の鎖解離およびハイブリダイゼーションを、形質が存在しない場合の個体のVNTR対立遺伝子を用いて行い、そして次にミスマッチ識別のさらなるラウンドを実施することにより達成される。この場合、遺伝形質を発現する個体に由来するヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖を含むミスマッチを選択する。これらは、興味のある特定の形質と共に分離する有益な対立遺伝子を伴う多形VNTRsを示す。興味のある形質を発現する個体のDNAsからのこれらのVNT Rs の増幅は、DNAマーカーとして用いてよい有益な対立遺伝子を生じる。本発明は、個体の一つのプールに共通であるが、第２においては不在であるか低レベルでしか存在しない遺伝要素を選択するための方法を提供する。このテーマにおける明白な変化は、個体の一つのプールには不在であるが、該方法の進行の間に、ミスマッチを用いるかまたは用いずに対立遺伝予の二重鎖の賢い選択により第２においては存在する遺伝要素の選択である。単純には、該プロトコルは３つの別々のセクション：VNTR対立遺伝子の生成；ミスマッチ識別；および形質に関して有益な対立遺伝子の選択、において考えられる。本明細書は、本発明の記載を便利にするために多くのダイアグラムを用いて例示される。 VNTR対立遣伝子の生成プロトコルは、一つの個体のゲノミックDNAまたは幾つかの個体のプールされたDNAsから全体としてVNTR対立遺伝子およびそれらのフランキング配列を忠実に生成する方法を記載する。最初の工程は、物理的、化学的または酵素によりゲノミックDNAを断片化することを含み、その目的は全てが増幅可能な長さであるVNT Rsを含むゲノミック断片を得ることである。一つまたは複数の制限酵素の使用は、ゲノミックサンプルの一定の断片化を生じて、好ましい技術を構成する。頻繁に切断する制限酵素の賢い選択によれば、ゲノムまたはゲノムプール内の選択された種の各VNTRの全体としての生成の可能性があるが、事実上は全ての断片が効率良い増幅のために十分小さいからである。注目すべきは、この断片化のためのゲノミックDNAを付与する個体の表現型は重要でないことである。事実、この様式において制限されるゲノムは、興味のある特定の形質の調査のためにそれらの表現型により選択された任意の個体または個体のプールに由来する必要はない。制限断片をアダブターに連結して、断片を増幅するかまたは操作してよい。アダプター中に含まれるより長いオリゴヌクレオチドの配列は、ゲノミックDNAを鋳型として含む増幅反応にプライマーとして加えられる場合に、何の生成物も生じないように、選択する。全ての利用可能な3'末端には物理的、化学的または酵素により末端を導入して、DNAポリメラーゼの影響下でのそれらの切り出しを妨ぐ。それらは、（Ａ）連結前の末端の添加；(Ｂ)連結後の末端の添加；(Ｃ)連結中の末端の添加を含む幾つかの方法の一つにおいて導入してよい。この目的のために適切な利用可能な末端のスペクトルは、限定されないが、ジデオキシヌクレオチド３リン酸を含む。（Ａ）連結前にジデオキシヌクレオチド３リン酸を用いて全ての3'末端を末端基化（terminated）してよい方法は、DNAポリメラーゼの作用を介し、選択されたジデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下でのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む。連結は、次に、各鎖上のジデオキシヌクレオチド３リン酸末端に合わせた適切な5'後退を含むアダプターを用いる。（Ｂ）連結後にジデオキシヌクレオチド３リン酸を用いて全ての3'末端を末端基化してよい方法は、DNAポリメラーゼの作用を介し、選択されたジデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下でのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む。（Ｃ）連結工程の間に連結された3'末端を末端基化できる方法は、その合成の間に短いオリゴヌタレオチド上への適切な3'末端および5'リン酸の取り込みを介し、このオリゴヌクレオチドが酵素例えばT4 DNAリガーゼの影響下でゲノミック断片と共有結合を形成するようにする。再び、適切な末端は、限定されないが、ジデオキシヌクレオチド３リン酸を含み、DNAポリメラーゼの影響下で3'末端の伸長合成を阻害する様々な他の修飾およびデオキシヌクレオチド類似体がある。これらのうち、方法（Ａ）はもっとも信頼性があることがわかったが、アダプターへの連結を達成するあらゆるゲノミック断片が適切な末端を有するように保証されるからである。方法（Ｃ）も、各連結3'端が末端を有するように保証する。しかしながら、方法（Ａ）の場合とは異なり、内部断片連結が起こる。幾つかの断片は一つのDNA鎖がニックを入れられる部位を含みそうなので、これらの部位からの多形を妨害するためには、それらに適切な末端を取り込ませることが好ましい。これは、多くの方法により達成してよく、限定されないが、末端基化されて連結されたゲノミック断片を全てのジデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下においてDNAポリメラーゼとインキュベートすることを含む。アダプター内に含まれるより長いオリゴヌクレオチドを、ポリメリゼーションの可能性のある全ての部位において末端を付加することにより、適切に連結およびブロックされたゲノミック断片を含む増幅反応において、アダプタープライマーとして使用してよい。しかしながら、他のヌクレオチド配列からの「内部」プライミング不在下では、DNAの増幅は不可能である。しかしながら、他のヌクレオチド配列が首尾よくアニールしてアダプターの末端までポリメリゼーションを達成するならば、アダプタープライマー結合部位を創製する。アダプタープライマーの結合はアニールされたヌクレオチド配列の末端までのDNAポリメリゼーションを可能にする。ヌタレオチド配列がプライマーに相当するか、またはプライマー結合部位を含むヌタレオチド配列に相当すれば、アダプタープライマーおよび「内部プライマー」の導入は、首尾よくアダプターに連結されて且つアニールされたヌクレオチド配列に相同なDNAを含む断片のみからの産物の特異的対数増殖を可能にする。選択されたVNTRに相同な配列を含むオリゴヌクレオチドを内部プライマーとして用いるならば、首尾よくアダプターに連結されて標的VNTRを含む断片のみが増幅されうる。これは各VNTRに隣接する「アンプリマー」を生じ、選択された制限酵素のための制限部位により限定されるゲノミック配列と、選択されたVNTRプライマーに相同なVNTR配列を含む。多くの異なる種類のVNTRsが多様な範囲の種において同定された。これらは、とりわけ、ジヌクレオチド繰り返し、トリヌクレオチド繰り返しおよびテトラヌクレオチド繰り返しを含む。(AC)nジヌクレオチド繰り返しは殆どの種において生じるもっとも共通なVNTRを構成するから、このVNTRのためのアンプリマーを生じる適切な配列のプライマーを選択してよい。(AC)nプライマーの導入はVNTRsの隣接部分に相当するアンプリマーを生じ、そして(GT)nプライマーの導入はこれらのVNTRsの他方の隣接部分に相当するアンプリマーを生じる。しかしながら、長い繰り返し長を有するVNTRsは、それらの多大な数のプライマー結合部位のために、短いVNTRsに比してアンプリマープール中で過剰に表される。同様に、長い対立遺伝子は、それらの多大な数のプライマー結合部位のために、短い同じVN TRの短い対立遺伝子に比して過剰に代表する(over represented)。この問題は、それらがフランキング配列の開始部分に並置されないのであれば、アニールされたプライマーのポリメリゼーションを阻害するVNTRプライマー上における縮重3' 末端の導入により打ち消される。全てのVNTRsおよび全ての対立遺伝子の増幅は、よって、それらの繰り返しの長さにより偏らない。（AC）nジヌクレオチド繰り返しの場合、以下のプライマーを用いてよい： (AC)nB（式中、BはC＋G＋T） (CA)nD（式中、DはA＋G＋T） (GT)nH（式中、HはA＋C＋T） (TG)nV（式中、VはA＋C＋G）別法として、他の、VNTR配列のアンプリマーを、この様式において、縮重3'末端を含む適切な標的特異的プライマーの導入により生成してよい。事実、いかなる標的特異的ヌクレオチド結合部位を含むかまたは周囲に有するゲノミック配列を構成するアンプリマーを同じ方法により生成してよい。 (AC)nBジヌクレオチド繰り返しの場合、(AC)nBおよび(CA)nD縮重オリゴヌクレオチドによりブライミングされる反応に由来するアンブリマーをプールしてよい。自明な別法は、(AC)nBおよび(CA)nD縮重オリゴヌクレオチドを共に用いて増幅反応を開始することにより、アンプリマープールを生成してよい。しかしながら、これは、反応を別々に実施するよりも効率が低いかもしれない。同様に、(GT) nHおよび(TG)nVプライミング反応をプールしてよく、あるいはこれらの縮重プライマーの両方を含む反応を実施してよい。即ち、２つのプライマープールを創製してよく、各々は各VNTRの一つの隣接部分のみからの配列に相当する。全VNTRsの２つの隣接配列の一つが各アンプリマープールにおいて生成されるから、完全対立遺伝子長は不在であり、増幅の産物は有益ではない。しかしながら、完全長対立遺伝子並びにそれらのフランキング配列はゲノミックDNAから、アンプリマーをそのゲノミックDNAにハイブリダイゼーションさせてアニールした配列をポリメリゼーションすることにより、全体として忠実に再創製することができる。そのようにして、興味のある特定の形質を発現する個体の完全長の「影響された」VNTRs対立遺伝子は、それら個体のゲノミックDNAsにアンプリマーをハイブリダイゼーションすることにより得てよい。同様に、その形質が不在の場合の個体の相互の反応は、完全長の「野生型」VNTR対立遺伝子およびフランキング配列を、それらが個体のゲノムにおいて生じるように、生成する。即ち、「影響された」DNAに由来する対立遺伝子および「野生型」DNAに由来する対立遺伝子を含むVNTRsの２つのプールを生じさせることができる。ポリメリゼーションの間の鎖のスリップによりもたらされる「休み休み進む（stutter）バンド」の生成の可能性を最小にするためには、高い連続移動性の（highly processive）D NAポリメラーゼがこの応用に好ましい。ハイブリダイゼーションの間のアンプリマー鎖の非特異的対合を通して生じる「クロス−トーク」による偽の産物の生成の可能性を制限するためには、アンプリマーからVNTR繰り返しを除去するのが好ましいが、これらの繰り返し配列はそのようなクロス−トークの殆どに必須になるからである。これは、多くの方法により開始され、限定されないが、（Ａ）3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化；(Ｂ)5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化；(Ｃ)ウラシルを含むプライマーを用いて生成したアンプリマープールのウラシルDNAグリコシラーセによる消化；(Ｄ)RNAプライマーを用いて生成したアンプリマープールのRNaseによる消化を含む。（Ａ）アダプタープライマーの5'末端が代表的な４つのヌクレオチドを有するなら、反対の鎖が同様に授けられる。そのようにして、２つのみのデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下における、3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えばT4 DNAポリメラーゼとの12℃におけるインキュベーションは、アダプタープライマーを相補する3'鎖の顕著な短縮を導かない。しかしながら、VN TRプライマーを相補する3'鎖が欠くデオキシヌクレオチドの存在下で反応が起こるなら、そのVNTRプライマーを相補する3'鎖はT4 DNNAポリメラーゼにより除去される。反応混合物中に存在する第１のデオキシヌタレオチドが遭遇した場合、酵素によるエキソヌクレアーゼ消化は停止する。創製される5'突出部分は一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼにより消化してよく、限定されないがエキソヌクレアーゼVIIを含み、全ての繰り返し配列を除去するようにする。挿絵は(AC)nおよび(GT)nプライムされたアンプリマーのためのシナリオを描写する：トリヌクレオチドVNTRが標的とされた場合には、たった一つのデオキシヌクレオチドの存在下におけるT4 DNAポリメラーゼによる適切な消化が要求される。テトラヌクレオチド繰り返しに関しては、この方法は不適当であり、別の方法が採用されるべきである., （Ｂ）繰り返し配列は5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、例えばT7遺伝子６のエキソヌクレアーゼにより消化してよい。ホスホロチオエート結合はこの酵素の活性を妨げる。４連続の結合は阻害すると信じられる。よって、アダプタープライマーがその5'末端に少なくとも４つのホスホロチオエート結合を有するように合成されたなら、ホスホロチオエート結合により完全に合成されなくても、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼの5'から3'エキソヌクレアーゼ活性に耐性となる。VNTRプライマーをそれらの3'末端において４つのホスホロチオエート結合を有するように合成したなら、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼは繰り返し配列の４つのヌクレオチドを残してVNTRプライマーを消化する。相補配列は一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼにより消化してよく、限定されないがエキソヌクレアーゼＩを含み、各鎖において４つのヌクレオチドとは別に、全ての繰り返し配列をアンプリマーから除去するようにする。そのような短い長さの繰り返し配列は、ハイブリダイゼーションの間に鎖の末端非特異的相互作用による偽の生成物の生成を招きそうにはない。（Ｃ）ウラシルを含むVNTRプライマー、例えば(GU)nHおよび(UG)nVは、ウラシル DNAグリコシラーゼの作用による適当なアンプリマープール中でこれらのプライマーの破壊を可能にする。限定されないがＳ１ヌクレアーゼを含む一本鎖特異的エンドヌクレアーゼとの消化アンプリマーのインキュベーションは、一本鎖スペースを含むVNTRプライマーのさらなる消化を導き、最終的には全ての繰り返しが除去されるように相補配列の除去を導く。（Ｄ）逆転写酵素活性を有するDNAポリメラーゼを用いた、VNTR配列に基づくRNA プライマーによるアンプリマープールの生成は、RNaseの作用によるVNTRプライマーの破壊を許容する。相補配列は、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼにより消化してよい。 VNTR対立遺伝子を全体として忠実に、それら鋳型中で生じるように、生じさせるために、一つまたは複数の個体のゲノミックDNAに消化アンプリマーをハイブリダイズする方法が幾つかある。これらは、（Ａ）断片化されていてもいなくてもよいゲノミックDNAに対する、連続するかまたは同時の何れかによる、アンプリマープールのハイブリダイゼーションおよびポリメリゼーション；（Ｂ）物理学、化学または酵素により断片化されて末端基とされて、アンプリマープールを生じさせるために使用されるアダプターであってもなくてもよいアダプターに連結されたゲノミックDNAへの、各VNTRのたった一つの隣接部分を構成するアンプリマーのハイブリダイゼーションおよびポリメリゼーションを含む。何れの場合も、多くのハイブリダイゼーション促進剤のうちの一つの添加は、ハイブリダイゼーション速度を高める。特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においては、そのような促進剤の使用が好ましいかもしれない。ハイブリダイゼーションを促進する方法の数は莫大であり、限定されないが、フェノール排除法、カチオン界面活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTA B)、および容積排除試薬、例えば硫酸デキストランの導入を含む。CTABが選択されたハイブリダイゼーション促進剤であるなら、その沈殿を予防するために、ハイブリダイゼーション混合物中の塩濃度は低いべきである。（Ａ）挿絵は、DNAポリメラーゼによるゲノミック鋳型中のVNTR対立遺伝子の再生成を許容するための、ゲノミックDNAに対する一つのアンプリマープールのハイブリダイゼーションに関して提供される。第２アンプリマープールのハイブリダイゼーションは、アダプタープライマーを全体として用いた全VNTR対立遺伝子の増幅を許容する：（Ｂ）挿絵は、断片化され、末端基とされ、そしてアンプリマープール中に存在するのと同じであってもなくてもよいアダプターに連結されたゲノミックDNA への一つのアンプリマープールのハイブリダイゼーションに関して提供される：アンプリマーからの繰り返し配列の除去は、両アンプリマープールのゲノミックDNAへのあい伴うハイブリダイゼーションを許容するが、非特異的鎖対合を通した偽の生成物の生成の可能性を制限する。偽の生成物の生成は、さらに別々に連続した各隣接部分を構成するアンプリマーをハイブリダイズすることにより減少する。これは、ハイブリダイゼーション間の一本鎖エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼとのインキュベーションによる、ハイブリダイズしなかった鎖の除去を含む、非特異的鎖対合を制御するためのさらなる工程の導入を可能にする。好ましい技術において、各VNTRの一つの隣接部分を含むたった一つのアンプリマープールを、末端基とされた、アダプター連結したゲノミック断片にハイブリダイズさせる。そのようにして、これは、異なるプールのアンプリマー鎖間の非特異的対合のあらゆる可能性を否定する。各アンプリマープールをこの様式においてハイブリダイズさせて別々にポリメリゼーションするなら、各反応において生成された生成物は同一であるべきである。よって、これらの生成物は組み合わせてよい。幾つかの個体のプールされたゲノムへのアンプリマーのハイブリダイゼーションは、それらが含むVNTR対立遺伝子の生成を可能にする。これを特定の形質を発現する個体のプールされたゲノムに実施するなら、そして該形質を欠く個体のそれらにも実施するなら、それらのプールされたゲノム中に存在する「影響された」および「野生型」の対立遺伝子を合成することができる。同じ遺伝子型が与えられた表現型の全ての個体に共通であるように、定義された集団から影響された個体を選択することが好ましい。しかしながら、たとえこれらの個体を、単一の表現型を生じる幾つかの遺伝子型が存在することに関して、異系交配された集団から選択する場合でも、該形質の座と共に分離する対立遺伝子は、野生型個体の相互にプールされたゲノムよりも、影響された個体のプールされたゲノムにおいてより高い頻度で存在する。これらの遺伝子は、ミスマッチ分解および増幅の連続反復により富裕化される。対立遺伝子頻度が人工的に歪められることを妨害するためには、ゲノミックDNAを各プールへ付与する多数の個体を有するのが好ましい。これは、影響されたグループおよび野生型グループにおける対立遺伝子頻度が、２つの相違が形質の連鎖不均衡の結果であって他の因子の結果ではないように誘導された一般的な集団に等しい傾向があることを保証する。しかしながら、影響された個体および野生型の個体の数が制限されるなら、各対の一方のメンバーが影響されて他方が野生型の個体である、適合した兄弟の（sibling）対は、特定の形質に関すること以外の、プールされたゲノムの対立遺伝子頻度とバランスをとるために、いくらか距離をおいて進む。ミスマッチ識別影響された個体および野生型個体から生じたVNTR対立遺伝子を変性して別々の反応において再度アニールされるなら、ミスマッチを含むかまたは含まない二重鎖DNA分子が結果として生じる。VNTR特異的フランキング配列およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のために、同じVNTRのものである対立遺伝子のみが再アニールする。よって、ミスマッチを含む二重鎖はサイズの等しくない同じVNTRの対立遺伝子を含むか、あるいは増幅の偽産物を含む。再アニールする同様なサイズの対立遺伝子は完璧な二重鎖を形成する。ミスマッチを含む分子は、一本鎖DNA上に作用する酵素またはDNA中の立体構造の不規則さを検出することができる酵素により消化してよい。適切な酵素は、限定されないが、Ｓ１ヌクレアーゼおよびT4エンドヌクレアーゼVIIを含む。これらの２つの酵素のうち、T4エンドヌクレアーゼVIIはこの応用においてもっとも信頼性のある効率の良い酵素であることが証明され、そしてハイブリダイゼーション反応からのCTABの持ち込みを寛容に扱いながら、一連のDNAポリメリゼーションにおいて効率.よく消化することがわかってきた。それは、不安定な（staggered）末端を残しでミスマッチ含有分子の両鎖を分割し、各鎖はミスマッチに関して3'を分割される。おそらく、分割は、次の増幅工程の間に非特異的に相互作用するかもしれない末端を創製して偽の生成物の生成をもたらす繰り返し配列内で生じる。この問題を未然に防ぐために、分割された二重鎖からその繰り返し配列を消化してよい。これは多くの方法により達成されてよく、（Ａ）T4エンドヌクレアーゼVII消化の前に、限定されないがα−チオリン酸グループを含む保護末端または3'突出により、全DNA鎖を保護する、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを伴う、3'から5'のエキソヌクレアーゼ、限定されないがエキソヌクレアーゼIIIの作用による；(Ｂ)T4エンドヌクレアーゼVII消化の前に、限定されないがアダプタープライマー内に取り込んだホスホロチオエート結合を含む保護基により、全DNA鎖を保護する、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを伴う、5'から3'のエキソヌクレアーゼ、限定されないがT7遺伝子６エキソヌクレアーゼの作用による、を含む。アダプタープライマー中のホスホロチオエート結合の包含により、アダプタープライマーを含む全分子の5'末端はT7遺伝子６エキソヌクレアーゼの5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性に耐性となる。しかしながら、T4エンドヌクレアーゼVI I分割により創製された5'末端はこの酵素に感受性である。いくつかの分子が、単に一本鎖ニックをもたらすT4エンドヌクレアーゼVIIによる完全な分割を逃れる可能性がある。しかしながら、そのようなニックはT7遺伝子６エキソヌクレアーゼによる消化に感受性であり、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼであるこの酵素を共同して用いれば、ニックが入った鎖のみが消化されるはずである。他方、限定されないが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む一本鎖特異的エンドヌクレアーゼは、両方の鎖が破壊されるように、一本鎖ニックを受ける分子内で、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼの作用により露出される相補一本鎖を分割するはずである。即ち、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼと共同したＳ１ヌクレアーゼのような酵素は、鎖の一方または両方が切断されるかに拘わらず、全てのT4 エンドヌクレアーゼVII消化分子の完全な消化を導く。Ｓ１ヌクレアーゼはこの役割において成功することが証明され、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼにより創製されたアルカリ性条件下で一本鎖DNAの効率よい消化が可能である。しかしながら、幾つかの非特異的なDNA消化がこの酵素により生じるかもしれない。T4エンドヌクレアーゼVIIの作用による一本鎖ニックを受けるそれらの分子はおそらく僅かなので、この方法においておそらくは殆ど作用しない一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを用いるのが好ましいかもしれない。そのような酵素には、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼVIIが含まれる。ミスマッチを欠く分子はこの態勢の消化に耐性であり、増幅により富裕化してよい。増幅の間の鎖のスリップおよびポリメラーゼのエラーによりもたらされる「休み休み進む（stutter）バンド」の生成を最小にするために、増幅循環の数を過剰にすべきではなく、生成物の十分な収量を与える。 T7遺伝子６エキソヌクレアーゼに加えて、エキソヌクレアーゼIIIはDNA分子中のニックにおいて作用する。アダプタープライマー中のホスホロチオエート結合の不在下では、消化時にニック分子中において長い3'突出を完全に創製するはずである。よって、これらの突出を除去する一本鎖特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼの包含は、T4エンドヌクレアーゼVIIがミスマッチ含有二重鎖中の一方の鎖を破壊したのか両方の鎖を破壊したのかに拘わらず、分割された分子の排除を可能にする。しかしながら、ミスマッチ分割に先立って全部のDN A分子の3'末端の保護を含む付加的な工程に関する要求を取り除くためには、T7 遺伝子６エキソヌクレアーゼの使用が好ましいが、この酵素の使用のために要求される5'末端の保護がアダプタープライマーへのホスホロチオエート結合の挿入により容易に達成されるからである。分割された分子を除去できる別の方法は、ハプテン、限定されないがビオチン −16−dUTPを含むハプテンを分割部位に付加して、ハプテンの別の試薬への親和性により分割された分子から物理的に分離することによる。これは、ミスマッチ分割方法前の、全分子の3'末端の末端基化により達成でき、DNAポリメラーゼ存在下でそれらが不活性になるようにする。適当な末端は、限定されないがジデオキシヌクレオチド３リン酸を含み、限定されないがターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含むDNAポリメラーゼにより取り込んでよい。限定されないがターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含むDNAポリメラーゼの存在下での分割された分子とビオチン-16-dUTPとの次のインキュベーションは、末端基化された3'末端を欠くそれらの分子のみのビオチン化を生じる。ストレプトアビジンへの結合を通したビオチン化分子の分離を次に行うことができる。同様な様式において、T4エンドヌクレアーゼVIIにより分割された分子は3'突出を有するので、これらの分子は、一本鎖DNAに親和性を有する一本鎖結合蛋白質または試薬による取得を通して除去できる。T4エンドヌクレアーゼVIIにより創製された突出は、おそらく、この方法による分割分子の効率よい選択のためには小さすぎる。しかしながら、一つまたは複数のデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下で、限定されないがターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含むDNAポリメラーゼとのインキュベーションにより特別に延長でき、DNAポリメラーゼ存在下でそれらを不活性にする適切な末端によりミスマッチ分割前にDNA 分子の全3'末端を末端基化する。 DNA分子の物理的分離は、酵素手段による分離に比してめんどうであり相対的に効率が悪い。さらに、一本鎖ニックを有する分子の除去はおそらくは成功しない。これらの理由のため、DNA種の酵素による識別方法が好ましい。変性、ハイブリダイゼーションおよびミスマッチ分割の数ラウンドの繰り返しは、増幅における全ての偽産物を首尾よく排除する。さらに、それは、各VNTRのもっとも共通な対立遺伝子が残るように全部のVNTRsをホモ接合体に減じさせるか、またはそれは、多くの対立遺伝子が等しい頻度で存在する場合にそれらのVN TRsを排除する傾向がある。変性の温度からのアニーリング温度への迅速な遷移は、同一サイズの対立遺伝子の選択的なアニーリングを阻害するのに必要である。これは、変性の温度からのアニーリング温度への遷移が延長されるならば、起こるかもしれない。ハイブリダイゼーション効率を高めるためにハイブリダイゼーション促進剤を含ませてよい。「影響された」VNTR対立遺伝子並びに「野生型」VNTR対立遺伝子に関して平行して実施されたこの方法は、ホモ接合体への同一の低下およびバランスをとられた対立遺伝子頻度の生成を達成する傾向がある。しかしながら、VNTRsの数に関しては、ミスマッチ分割法の最後における影響されたグループおよび野生型グループ内の対立遺伝子頻度は顕著に異なってくる。興味のある形質がVNTRsの由来する個体の２つのグループを識別する唯一の特徴であるとすれば、野生型グループよりも影響されたグループにおいて過剰に示された対立遺伝子はその形質と共に分離する。これらは、形質のマーカーであり、選択されるべきである。繰り返されたミスマッチ分割のVNTR対立遺伝子頻度への効果は、消化の効率、ポリメラーゼエラーの効果およびハイブリダイゼーションの第２水準のキネティックス（second order kinetics）を無視した基礎的なシナリオと共に例示できる。３つの対立遺伝子が存在する場合のVNTRを以下の通りに考えていただきたい：開始シナリオ対立遺伝子ＡＢＣ対立遺伝子頻度２／４１／４１／４比２１１対立遺伝子を変性させて再アニールさせるなら、ミスマッチを含むかまたは含まない二重鎖分子がもたらされる。完璧な二重鎖を形成する各対立遺伝子の比率は、その対立遺伝子の頻度に依存する。全ミスマッチ含有分子は、理論上T4エンドヌクレアーゼVIIによる消化に感受性であり、排除されるはずである。即ち、第１ラウンドのミスマッチ分割後、残る各対立遺伝子の量と比は以下のとおりになるはずである：対立遺伝子ＡＢＣ残りの量４／16 １／16 １／16 残りの全部６／16 比４１１対立遺伝子頻度４／６１／６１／６第２ラウンドのミスマッチ分割後、対立遺伝子頻度はさらに変化するはずである：対立遣伝子ＡＢＣ残りの量 16／36 １／36 １／36 残りの全部 18／36 比 16 １１対立遣伝子頻度 16／18 １／18 １／18 第３ラウンド後、理論上の対立遺伝子頻度は以下のとおりになるはずである：対立遺伝子ＡＢＣ残りの量 256／324 １／324 １／324 残りの全部 258／324 比 256 １１対立遺伝子頻度 256／258 １／258 １／258 よって、２ラウンド後、一つの対立遺伝子が際立って支配的となる。４ラウンド後には、この対立遺伝子は事実上は独占的に存在する。ミスマッチ分割前にたった一つの対立遺伝子のみが存在する場合の、VNTRに対する、この残されたVNTR 全量の比率は以下のとおりになる：６／16×18／36×258／32：１／１×１／１×１／１＝ 43／288：１同じ様式において、任意のVNTRのもっとも共通な対立遺伝子は、ミスマッチ分割の十分な繰り返しの後には、支配的となる。４ラウンドは、VNTRsをほぼホモ接合体に低下させるのに十分であるが、酵素消化の効率、ポリメラーゼエラーの生成およびハイブリダイゼーションのキネティックスはこれに影響する因子である。影響されたVNTRsおよび野生型VNTRsの対立遺伝子頻度の相違は、不均衡が十分に大きい場合には、各グループにおける別の対立遺伝子の富裕化を導く。そのような対立遺伝子は興味のある形質には有益であるが、これらが形質に拘わらず共通に集団中で支配的であれば、影響されたグループおよび対立遺伝子グループの両方において同一でよい他の富裕化された対立遺伝子から選択されなければならない。異なるシナリオにおけるミスマッチ識別のさらなる例を付録として提供する。形質に関して有益な対立遺伝子の選択興味のある形質に連鎖した対立遺伝子の選択は多くの方法により達成してよい。ミスマッチ分割法の連続繰り返し後も生き残った各VNTR中の対立遺伝子サイズの相違は、相違が検出できるように、長さのわかっているVNTR対立遺伝子のアレイへの個体の各グループからの対立遺伝子のハイブリダイゼーションおよび空間分離（spatial separation）により同定されてよい。事実、ミスマッチ分割法を用いることなく、２つのグループの対立遺伝子頻度に関する情報を生じる様式で、アレイへの定量性ハイブリダイゼーションを達成することができるかもしれない。精巧さの劣る方法は一つの対立遺伝子の他方の対立遺伝子からの差し引きを含むことにより、対立遺伝子頻度の相違を確認する。しかしながら、この方法は、対立遺伝子が一方のグループに存在して他方のグループにおいて対立遺伝子が生存しなかったことに関してVNTRを同定するのみならず、各グループにおいて生き残った対立遺伝子が異なることに関してVNTRを同定せねばならいが、これらシナリオの両方が興味のある形質との連鎖不均衡を示唆するからである。これは、物理学、化学または酵素により達成できる。酵素に基づく選択を選んだなら、酵素の消化が完全に進行できるようにするため、アダプタープライマーを用いたミスマッチ分割方法により富裕化された対立遺伝子を増幅することが好ましい。酵素に基づく選択の適切な方法は、保護末端、限定されないが少なくとも４つのヌクレオチドの3'突出またはα−チオリン酸結合を含む保護末端の、個体の一つのグループの生存対立遺伝子への付加、およびエキソヌクレアーゼIIIを用いた他方のグループからの過剰な生き残り対立遺伝子との差し引きを含む。殆どの状況下において、その形質を欠く個体から生存しそこなった、影響された個体から生存したあらゆる対立遺伝子の同定を必要とする。このため、保護末端の付加を、影響された個体に由来するVNTRsのみに付加すべきである。自明なことに、別の戦略が可能である。3'突出は多くの方法により創製してよく、限定されないが、（Ａ）アダプターの連結、または（Ｂ）DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの非鋳型付加を含む。これらのうち、方法（Ｂ）がより効率よいことがわかり、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ等の酵素を用いて達成してよい。この酵素は、単一のデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下でのインキュベーションにおいて、数百のヌクレオチドの3'突出を生成するかもしれない。α−チオリン酸結合は、限定されないがターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含むDNAポリメラーゼを用いて保護性デオキシヌクレオチド類似体の付加により取り込んでよい。適切な類似体は、α−チオデオキシヌクレオチド３リン酸を含む。これらの類似体はDNA分子の後の消化または操作を阻害するかもしれないので、保護を付与するために3'突出の添加が好ましい。エキソヌクレアーゼIIIの活性に対する保護を付与する好ましさの劣る別の方法は、限定されないがT7遺伝子６のエキソヌクレアーゼを含む5'から3'の活性を有するエキソヌクレアーゼの作用を通し、二重鎖DNA中の5'後退（recess）を創製してよい。DNA分子を増幅するのに使用されるアダプタープライマー内のホスホロチオエート結合の適切な取り込みは、エキソヌクレアーゼIIIへの耐性を付与するのに要求される以上の、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼによる消化が阻害されることを保証する。同様に、5'の後退は、ウラシルDNAグリコシラーゼのような酵素を用いて消化できるアダプタープライマー中への、ウラシル富裕5'末端の取り込みにより創製できる。その結果の分子は、創製された3'突出のためにエキソヌクレアーゼII消化に耐性である。過剰な生存野生型対立遺伝子へのハイブリダイゼーションは全部の影響された対立遺伝子のヘテロ二重鎖形成を保証し、適切なVNTRの対立遺伝子を野生型グループにおいて生存させる。影響されたグループから差し引くために野生型対立遺伝子がないならば、各末端において3'突出を有するホモ二重鎖分子がもたらされる(分子１)。VNTRの生存対立遺伝子が２つのグループ間で異なるならば、ミスマッチを含むヘテロ二重鎖分子がもたらされる(分子２)。２つのグループにおける等しいサイズの生存対立遺伝子はミスマッチのないヘテロ二重鎖分子を生じる(分子３)。ハイブリダイゼーションによりもたらされる別の種のDNAは、ミスマッチを含んでも含まなくてもよい野生型対立遺伝子のホモ二重鎖（分子４）およびハイブリダイズしない一本鎖分子を含む。一本鎖DNA上に作用するかまたはDNA中の立体構造の不規則性に作用する酵素、限定されないがT4エンドヌクレアーゼVIIによるこれらの異なる種類の分子の消化は、分割部位における3'突出の生成を伴ってミスマッチを含むそれらの二重鎖の分割をもたらす。エキソヌクレアーゼIIIによる次の消化は、各末端において3'突出を含まない一本鎖の全二重鎖または二重鎖の断片を与える。エキソヌクレアーゼIIIによる感受性分子の消化は完全に進む傾向があるので、一本鎖エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いたさらなる消化は全部の一本鎖DNA種を排除して生存分子上の3'突出を除去する。よって、標的分子のみが消化から生き残る。エキソヌクレアーゼＩはこの仕事に適合するが、標的分子を回収する手段として平滑末端クローニングを選択する場合に、除去されなければならない一本鎖ヌクレオチド3'突出をしばしば残す。完全なホモ二重鎖に関しては、有益な対立遺伝子はホモ二重鎖中に存在して、クローニングおよび配列決定により同定してよい。エキソヌクレアーゼIIIおよびエキソヌクレアーゼＩによる消化を逃れたT4エンドヌクレアーゼVII分割断片に関しては、該断片の、断片化して末端基化されたアダプター連結ゲノミックDN Aへのハイブリダイズ、次いで前記の様式による増幅により、完全長のVNTRsを得ることができる。有益な対立遺伝子は、それらのフランキング配列からデザインされた VNTR特異的プライマーを用いてこれらのVNTRsに関して興味のある形質を発現する個体の遺伝子型を決定することにより同定してよい。この差し引き方法は、様々な異なる方法において生じさせてよいVNTRsの対立遺伝子の他に、他の対立遺伝子に等しく適合されることは明らかである。そのようにして、DNAプールの組成における相違を同定するためのこの方法は、一つのプールに存在するが他方においては同じ形態で存在しないかもしれない他の種の多形配列並びに他の種のDNAの選択のために、より広範囲に応用されてよい。この方法は、多遺伝子性並びに一遺伝子性の遺伝形質の調査のためにその適合性において唯一である。おそらくは遺伝形質の研究において顕著な衝撃を与え、この分野の研究に現在関連する困難、時間および支出を顕著に減じる。好ましい態様（ｉ）調査中の種であるが必ずしもその調査における個体ではない個体のゲノミックDNAの制限酵素を用いた断片化。（ii）ジデオキシヌクレオチド３リン酸存在下におけるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる全3'末端の末端基化。（iii） T4リガーゼ存在下におけるインキュベーションによるアダプターへの末端基化断片の連結、続く一本鎖ニックの停止。（iv） ddNTPsからの連結産物の精製と、 a）アダプタープライマーおよび(AC)nBプライマー（式中、B＝G＋T＋C）; ｂ）アダプタープライマーおよび(CA)nDプライマー（式中、D＝A＋G＋T）; ｃ）アダプタープライマーおよび(GT)nHプライマー（式中、H＝A＋T＋C）; ｄ）アダプタープライマーおよび(TG)nVプライマー（式中、V＝G＋A＋C）; を含む反応における増幅。増幅産物は、選択されたアダプターにうまく連結されたゲノミック断片によりもたらされ、選択されたプライマーに対して相補性を有するVNTRを含む。（ｖ） (AC)nBおよび(CA)nDプライミング産物のdATPおよびdCTPの存在下におけるT4DNAポリメラーゼによる消化、続くエキソヌクレアーゼVIIによる消化による全VNTR配列および過剰VNTRプライマーの除去。（vi） (GT)nHおよび(TG)nVプライミング産物のdGTPおよびdTTPの存在下におけるT4DNAボリメラーゼによる消化、続くエキソヌクレアーゼVIIによる消化による全VNTR配列および過剰VNTRプライマーの除去。サイズによる選択を実施して、最適な範囲の分子量の産物を得てよい。（vii）過剰な組み合わされた(AC)nBおよび(CA)nDプライミング産物または過剰な組み合わされた(GT)nHおよび(TG)nVプライミング産物の何れかと興味のある特定の形質を発現する個体に由来する十分な量のゲノミックDNAsとのハイブリダイゼーション。（viii）全てのアニールされた3'末端の鎖伸長合成を達成するためのハイブリダイズした産物とTaq DNAポリメラーゼとのインキュベーション。（ix）アダプタープライマーの添加およびTaq DNAポリメラーゼ存在下における温度循環による「ゲノミック鋳型」からのVNTR対立遺伝子の生成。（ｘ）生成されたVNTR対立遺伝子の精製、および続くストリンジェント条件下における鎖解離および再アニーリング。（xi）増幅における偽産物へのVNTR対立遺伝子のハイブリダイゼーション、または興味のある特定の形質を発現する調査中の個体間で異なるVNTR対立遺伝子のハイブリダイゼーションによりもたらされるミスマッチ含有二重鎖分子のT4エンドヌタレアーゼVIIによる消化。（xii）分割された分子からVNTR配列を除去するかまたはそれらを完全に排除するための、T7遺伝子６のエキソヌクレアーゼ並びにＳ１ヌクレアーゼによるさらなる消化。（xiii） Taq DNAポリメラーゼ存在下における温度循環による生存DNA分子の増幅。（xiv）生存DNA分子のハイブリダイゼーション、消化および増幅の反復。これは、興味のある特定の形質を発現する全ての個体に共通なVNTR対立遺伝子、またはそのようなグループにおいて支配的なVNTR対立遺伝子において反応を豊富にして増幅におけるあらゆる偽産物を除去する。（xv） dNTP存在下におけるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとのインキュベーションによる、特定の形質を発現する個体のグループの選択された対立遺伝子への3'突出の付加。（xvi）完全または一部（ｉ）から（xiv）に類似性を有する方法においてそれらのゲノミックDNAsから生成された、形質が不在の場合の、個体の過剰なVNTR対立遺伝子への、3'突出を有する特定の形質を発現する個体グループの選択された VNTR対立遺伝子のハイブリダイゼーション。（xvii） T4エンドヌクレアーゼVIIによるミスマッチ含有二重鎖分子の消化。（xviii） 3'突出による保護を欠く二重鎖分子内の鎖を排除するためのエキソヌクレアーゼIIIによるさらなる消化。（xix）一本鎖DNAを除去するための、エキソヌタレアーゼIIIによる除去または不活性化後の、エキソヌクレアーゼＩによるさらなる消化。これは、特定の形質に連鎖したVNTRs以外の全ての分子の排除をもたらす。完全なVNTRsに関しては、有益な対立遺伝子が存在する。エキソヌクレアーゼIIIおよびエキソヌクレアーゼＩによる消化から生ぎ残った分割されたVNTRsに関しては、断片化され、末端基とされ、アダプター連結されたゲノミックDNAへのハイブリダイゼーションおよびTaq DNAポリメラーゼによる鎖伸長合成後に、形質に連鎖した有益な対立遺伝子を包含するために、影響された個体の遺伝子型決定を可能にするフランキング配列からVNTR特異的プライマーをデザインしてよいように、完全VNTR配列を得てよい。第２の態様（ｉ）断片化されて連結されたゲノミックDNAのアダプタープライマーおよびV NTRプライマーを用いた増幅、特定の形質を発現する個体のゲノミック「鋳型」D NAへの生成された産物のハイブリダイゼーション、およびそれら鋳型DNAsからの個々のVNTR対立遺伝子の生成の工程以外の手段によりVNTR対立遺伝子を生じさせてよい。これらは、限定されないが以下を含む：ａ）個々の反応における各VNTRのフランキング領域に特異的なプライマーを用いたゲノミックDNAまたは合成DNAからのVNTRsの増幅；ｂ）複合系を用いたゲノミックDNAまたは合成DNAからのVNTRsの増幅、それによる、アダプター付加されたVNTR特異的プライマーを全体として用いた複合VNTRs の増幅の許容；ｃ）アダプターが消化されたDNAに連結されてVNTR対立遺伝子の増幅に用いられてよいように、VNTR配列内または近傍を分割するエンドヌクレアーゼを用いたゲノミックDNAまたは合成DNAからのVNTRsの増幅；ｄ）形質が不在の場合の対立遺伝子を用いた差し引き法による特定の形質を発現する個体からのVNTRsのプールの生成を含む。（ii）生成したVNTR対立遺伝子の精製と、続くストリンジェント条件下での鎖解離および再アニーリング。（iii）増幅における偽産物へのVNTR対立遺伝子のハイブリダイゼーション、または興味のある特定の形質を発現する調査中の個体の間で異なるVNTR対立遺伝子のハイブリダイゼーションによりもたらされるミスマッチ含有二重鎖のT4エンドヌクレアーゼVIIによる消化。（iv）消化された二重鎖DNA分子および一本鎖DNA種が排除されるような、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼ存在下におけるハイブリダイズした対立遺伝子のインキュベーション。（ｖ）消化に耐性のミスマッチ不含二重鎖の増幅による富裕化。（vi）ミスマッチ不含二重鎖のハイブリダイゼーション、消化および選択の反復。これは、興味のある特定の形質を発現する全ての個体に共通なVNTR対立遺伝子において反応を豊富にして増幅におけるあらゆる偽産物を除去する。（vii）完全または一部（ｉ）から（vi）に類似性を有する方法においてそれらのゲノミックDNAsから生成された、形質が不在の場合の、個体のVNTR対立遺伝子への、特定の形質を発現する全個体に共通な選択されたVNTR対立遺伝子のハイブリダイゼーション。（viii）ミスマッチ含有二重鎖のT4 DNAエンドヌクレアーゼVIIを用いた消化、続くエキソヌクレアーゼIIIおよびエキソヌクレアーゼＩを用いた連続のインキュベーション。（ix） 5'突出を欠くそれらの生き残り分子の混合物からの選択。これらの完全なVNTRsまたはVNTRの断片を、興味のある特定の形質に連結する(linked to)。完全なVNTRsの、興味のある形質に関する有益な対立遺伝子は、配列決定により確立できる。VNTR断片に関しては、断片化されて、末端基とされてアダプターを連結したゲノミックDNAへのハイブリダイゼーション、そしてTaq DNAポリメラーゼによるインキュベーションにより、完全長の配列が生成できる。有益な対立遺伝子は、様々な方法、限定されないがフランキング配列からデザインされたVNTR特異的プライマーを用いて興味のある形質を発現する個体を遺伝子型決定すること等により、確立してよい。当業者は、溶液中またはアレイ上の何れかにおいて、ミスマッチを含まない二重鎖からミスマッチを含む二重鎖を識別するいくつかの方法が存在することを認識する。上記態様において記載した方法は、これらの方法のほんの一つを代表する。当業者は、等しくうまく適合されたあらゆる種類のVNTRであり、限定されないが、ジヌクレオチド繰り返し、例えば、(CA)nおよび(GT)n、トリヌクレオチド繰り返し、例えば、(AAT)n，(AGC)n，(AGG)n，(CAC)n，(CCG)nおよび(CTT)n、およびテトラヌクレオチド繰り返し、例えば、(CCTA)n，(CTGT)n，(CTTT)n，(TAGG)n ，((TCTA)nおよび(TTCC)nを含むことを認識する。さらに、本発明は、限定されないが、反復モチーフの(AT)，(CC)，(CT)および(GA)リッチ地域を含む単純な生物のマイクロサテライトに適用してよい。当業者は、VNTRsの対立遺伝子以外の多形対立遺伝子を本発明と共に用いて、増幅における偽の産物を含まず且つ特定の形質を発現する全ての個体に共通な対立遺伝子を生成して良いことを認識する。これらの多形対立遺伝子は、全ての可能な対立遺伝子の固定化アレイ、またはそのサブセット、または形質が不在の場合の個体に由来する対立遺伝予のプールにハイブリダイズさせてよい。ミスマッチ識別により、形質に連鎖しており有益である対立遺伝子が同定されうる。当業者は、未知の表現型または遺伝型の、単一またはそれ以上の個体のゲノムからの対立遺伝子が忠実に増幅されてよく、ミスマッチ識別により増幅の偽産物を除去し、そして、対立遺伝子の固定化アレイまたは溶液中の対立遺伝子のプールにハイブリダイズしてよく、完全な状態で遺伝子型または表現型をその個体に割り当てることを認識する。当業者は、ミスマッチ識別がT4エンドヌクレアーゼVII以外の酵素または化学を使用して実施してよいことを認識する。これらの別法は、限定されないが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、変異検出蛋白質(例えば、Mut S) 、オスミウムテトロキシドおよびヒドロキシルアミンを含む。当業者は、増幅された多形配列がそれら自身貴重であり、遺伝形質とVNTRsの共分離を識別するプロトコル以外のプロトコルにおいて使用してよいことを認識し、限定されないが、遺伝子型決定、マッピング、位置のクローニング(positio nal cloning)、形質座の定量、祖先および進化の研究、手段の研究、系統遺伝学、そしてVNTRsおよびそれらを分離する配列のインビトロ並びにインビボの研究を含む。当業者は、本発明を用いることにより、VNTRが体細胞変異に関与するなら、非遺伝性の体細胞遺伝を同定してよいことを認識する。当業者は、末端基とされてアダプターを連結したゲノミック断片を用いて、それらがハイブリダイズする公知または未知のあらゆるヌクレオチド配列に相同な配列を有するゲノムのその領域を再創製または増幅してよいことを認識する。当業者は、この方法が、増幅における偽の産物を排除するように、PCR産物からコンセンサス配列を精製する手段を代表することを認識する。当業者は、この方法が、一つまたは複数の種類のDNA分子の任意のプールからコンセンサス配列を精製する手段を代表することを認識する。本発明は、それらが由来する座における多形性変異（variation）を反映しないゲノミック断片が生じるので、以前の全ての技術とは根本的に異なる。さらに、これらの断片は特定の調査において個体から生じさせる必要はないが、適切な種の任意の個体から生じさせてよい。しかしながら、調査のための個体被験者のゲノミック「鋳型」DNAへのこれらの断片のハイブリダイゼーションおよびミスマッチ識別は、そのゲノミック鋳型内で対立遺伝予の忠実な増幅を許容するが、一方で、他のPCRに基づく方法の特徴である偽産物の生成の問題を克服する。ゲノミック断片が単一の個体に由来するのなら、各VNTRに隣接する配列内の多形性変異は打ち消されるが、なぜならば、それらは調査中の全ての個体に同一になるからである。本発明は、そのフランキング配列と共に各VNTRs対立遺伝子を保持するから、これらの対立遺伝子は高度に有益なままでいる。この側面において、本発明は唯一である。さらに、、VTRsを生成するこの新規な方法は迅速であり、安価であり、配列の予めの知識を必要とせず、そして精巧な装置に関する要求がなく、それは、VNTRsの単離に現在必要とされる時間とお金の大きな投資を取り除く莫大な重要性である。結果として、何も単離されないような種内のVNTRの利用可能性に依存した技術の応用が、以前にこれが実行できないとされたところで、可能になる。素早く、効率よく、安価にそして忠実性をもって全ての種から多数のVNTRsを生じる能力は、バイオメディカルの分野の労働者への本発明の顕著な貢献である。要約すると、本発明は、DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化、アダプターへの断片の連結、および選択されたVNTRに対して配列相同性を有するプライマーの導入による、選択されたエンドヌクレアーゼ制限酵素部位およびVNTRを隣接して含むそれらの断片のみを増幅することを包含する。これらの断片は、各VNTRの対立遺伝子の代表ではなく、調査される任意の特定の個体から生成される必要はない。これらの断片と調査中の個体のゲノミックDNAとのハイブリダイゼーションは、それらがゲノム中で起こるように、フランキング配列を有する完全なVNTR対立遺伝子を再創製する。これは、それ自身、限定されないがDNAフィンガープリンティングおよび連鎖分析を含む、VNTRsの利用可能性に依存した目的のための、全ての種におけるVNTRsを、素早く、効率よく、安価にそして忠実性よく生成するためのバイオメディカル分野の労働者の能力における主要な段階を構成する。ミスマッチ識別法の導入は、全てのPCRに基づく技術の損害である、反応汚染および反応条件における微妙な変化によるミスプライミングおよび偽産物の生成の問題を克服し、そして特定の形質を発現する調査中の全ての個体に共通でない対立遺伝子の排除を可能にする。ミスマッチ技術の第２のラウンドは、形質を発現しない個体のゲノム中に存在する有益でない対立遺伝子を除去する。この方法は、形質に関して有益な対立遺伝子の全体の表示（Total Representation of Alle les Informative for a Trait：TRAIT）と呼ばれる。本発明は、よって、AFLP， GMS，RDAおよびRAPDの分析のスピード、および連鎖分析の高い多形検出速度を含む、以前の方法を越える顕著な利点を含むが、密接に関連した個体からのDNAに関する要求および父系試験に関する要求を排除する。本発明は、反応汚染および反応条件における微妙な変化によるミスプライミングおよび偽産物の生成を含む、PCRに基づく技術の特徴である基本的な問題も克服する。さらに、高価な装置または精巧な統計上のコンピューターソフトウエアに関する要求がない。この分析は、連鎖され且つ有益な対立遺伝子を生じ、形質を欠くそれらの個体において不在であるかまたは低頻度に存在する興味のある形質を発現する個体において独占的または高頻度で存在する。この側面において、本発明は、全ての他の方法を越える優秀性において揺るがない。本発明は、複数の個体からの単一または複数のゲノムの同時の比較による複数座における多形の付随の検出を可能にし、そして以前に採用されてきた他の全ての技術とは根本的に異なる。本発明は、遺伝形質と共に分離する多形性に関する複数のゲノムのスクリーニングに加えて、素早く、効率よく、安価にそして忠実よくあらゆる種のゲノムからVNTRsを生じさせるためのバイオメディカル分野の労働者の能力において主要な前進を示す。この方法の応用は、よって、遺伝疾患または全ての生物における有利な一遺伝子性または多遺伝子性形質の遺伝子スクリーニングのためのマーカーの開発を促進する。如何にして本発明を応用するかについての実施例以下の例示は、本発明の範囲に対する如何なる限定も、あるいは本発明が応用されてよい別の様式への如何なる限定も推論することなく、本発明を如何に応用してよいかについての実施例を示す。実験データ実施例１ (CA)₁₃および(GU)₁₃を用いたアンプリマーの調製２μgのDNAを３μlのRsaIにより全体積10μlにて消化した： 8.5μl ゲノミッタDNA（３μg DNAに等しい） 10μl 10×反応バッファー３μl RsaI（10u/μl；Promega）78.5 μl dH₂O 100μl 反応物は、37℃において一晩インキュベートしたのち、70℃において20分間インキュベーションにより熱不活性化した。DNAはミクロ濃縮により（Microcon-10 0；Amicon）バッファーから分離した。10μlの体積を回収した。アダプターを構成する２nmolesの48マーおよび２nmolesの12マーオリゴヌクレオチドを組み合わせた： 15.9μl 48マー（２nmolesと等量） 13.7μl 12マー（２nmolesと等量） 10μl 10×リガーゼバッファー（NEB） 48.4 μl dH₂O 88μl 混合物は50℃に加熱して、10℃に１時間冷却した。 88μlのアニールされたアダプターに対して、10μlの消化されたDNAを加え、そしてゲノミック断片へのアダプターの連結を実施した： 88μl アニールされたアダプター／リガーゼバッファー（ATPを含む） 10μl DNA 2 μl T4 DNAリガーゼ（400NEBu/μl） 100μl 反応物は、16℃に、おいて一晩インキュベートし、次に70℃における20分間のインキュベーションに。より熱不活性化した。アダプターを連結したDNA断片をミクロ濃縮により（Microcon-100；Amicon）バッファーおよび非連結アダプターから分離した。12μlの体積のDNAを回収した。アダプターを連結したDNA断片をジデオキシヌクレオチド３リン酸存在下でTaq DNAポリメラーゼどインキュベートすることにより、次の操作におけるアダプターおよび非連結DNAの3'伸長合成を阻害した： 12μl ミクロ濃縮されたDNA ３μl 10×NH4反応バッファー１μl 50mM MgCl₂ １μl 10mM ddATP １μl 10mM ddCTP １μl 10mM ddGTP １μl 10mM ddTTP １μl Taq DNAポリメラーゼ（5u/μl；Bioline）９μl dH₂O 30μl 反応物を72℃において２時間インキュベートした。末端基とされた3'末端を有するアダブター連結DNAはフェノール／クロロホルム抽出およびミクロ濃縮により精製した。回収された体積は40μlであり、DNA濃度をゲル電気泳動により測定した。75ng/μlの濃度と測定された。 (CA)によりプライミングされたアンプリマーおよび(GU)によりプライミングされたアンプリマーを別々の反応により生成した： 10μl 10×NH4反応バッファー８μl 50mM MgCl₂ 1.5μl 10mM dNTPs １μl 末端基化された3'末端を有するアダプター連結DNA ４μl (CA)または(GU)プライマー（25pmol/μl） 73.5 μl dH₂O 98μl 反応物にミネラルオイルを重層して、95℃において２分間加熱して、その間に、１μlのTaq DNAポリメラーゼ（５u/μl；Bioline）および２μlのアダプタープライマー（50pmole/μl）を加えた。温度循環は以下のとおりに実施した：95℃30秒間；次に72℃45秒間を全部で20 サイクル、次に72℃５分間。 100μlの(CA)プライミング産物に、５μlのエキソヌクレアーゼＩ（10u/μl）を加えて、残余の(CA)プライマーを除去した。この反応物を37℃において30分間インキュベートした。 100μlの(GU)プライミング産物に、10μlのウラシルDNAグリコシラーゼ（１u/ μl；NEB）を加えて、PCR産物に取り込まれたウラシルを消化した。この反応物を37℃において２時間インキュベートした。１μlの10mM dNTPsを加えて、次に２μlのT4 DNAポリメラーゼ（５u/μl；Eplcentre laboratories）を加えて、消化された(GU)配列に相補な突出した(CA)鎖を除去した。この反応物を37℃において５分間インキュベートした。両者のアンプリマープールをフェノール／クロロホルム抽出してミクロ濃縮した(Microcon-100；Amicon)。各プールに関して、回収された体積は500μlであったが、そのうちの５μlを分光分析により分析して、DNA の濃度を測定した。等量の(CA)プライミングアンプリマーと(GU)プライミングアンプリマーを温度循環の前に単一の個体のゲノミック「鋳型」DNAにハイブリダイズさせた。アンプリマーのゲノミック「鋳型」DNAに対する比率を測定するために、様々な量の「鋳型」DNAを用いて、アンプリマーの量を一定に保ちながらいくつかの反応を実施した。「鋳型」ＤＮＡ（ng）０ 0.1 １ 10 100 1000 組み合わせたアンプリマー（ng）１１１１１１５ＭＮａＣｌ（μｌ） 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 ｄＨ₂Ｏ（μｌ）全量5.55μlに各反応物にミネラルオイルを重層して、98℃において５分間インキュベートして、その後に温度を段階的に４時間かけて78℃に低下させた。以下を各ハイブリダイゼーションに加えた：５μl 10×NH4反応バッファー４μl 50mM MgCl₂ 0.75μl 10mM dNTPs 0.5μl アダプタープライマー（50pmole/μl） 34.2μl dH₂O 各反応物をミクロ遠心分離管中で簡単に回転させた。それらを72℃において２分間加熱して、0.5μlのTaq DNAポリメラーゼ（５u/μl；Biollne）を加えた。反応物をさらに10分間72℃においてインキュベートし、その後、温度を95℃に２分間上昇させた。温度循環は以下のとおりに実施した：95℃30秒間；次に72℃１分間を全部で10サイクル。各反応に関して、10サイクル増幅された産物10μlを40μlの反応混合物に加えて、同じ条件下でさらに22サイクル増幅した。最終の増幅産物５μlをアガロースゲル上にて泳動した。100ngのゲノミック「鋳型」DNAを含む反応物がほとんどの増幅産物を生じることがわかり、ゲノミック「鋳型」DNA：アンプリマーの比で100：1に相当する。本発明は、増幅産物のクローニングにより確証された。うまく形質転換された大腸菌２コロニーを培養して、それからのちにプラスミドを回収した。これらのプラスミドを配列決定したところ、マルチプルクローニングサイトにVNTR配列を含むことがわかった。さらなる実験データ以下の実験のために、イヌのゲノミックDNAまたはイヌのゲノミックDNAから増幅されたクローン化VNTR対立遺伝子を用いた。クローン化された対立遺伝子をpU C18のMCSのSmaI部位に連結して、そのプラスミド特異的プライマーの両側の何れかを、プラスミド挿入物の次の増幅のためにデザインした：全ての試薬は、特に断らない限り、Amersham Pharmacia Biotechまたはその子会社から得た。オリゴヌクレオチドは、Genset Corp.フランスから得た。VNTRプライマー(AC) 11B，(CA)11D，(GT)11Hおよび(TG)11Vは、括弧内の配列の11の反復からなり、次の縮重塩基はB＝C＋G＋T，D=A＋G＋T，H=A＋C＋TそしてV=A＋C＋Gであった。実施例２アダプター連結に先立つ末端基化および（ｂ）末端基化に先立つアダプター連結によるアダプターを連結してジデオキシヌクレオチドにより末端基化したゲノミック断片の生成（ａ）５μgのイヌゲノミックDNAをHaelllにより断片化して、消化は12時間以上37℃において完全に進行させた： 4.4μl 1.135μg/μlのゲノミックDNA 10μl 10×制限バッファー２μl 10u/μl HaeIII 84 μl dH₂O 100μl 消化は、反応物のアリコートのエチジウムブロマイド染色１％アガロースゲル上の電気泳動により確認した。 DNAを抽出して(GFX精製カラム)、50μlの５mM Tris pH8.5中に溶出し、そのうちの30μlをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと共に37℃ において３時間インキュベートした： 30μl DNA 30μl ５×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼバッファー 4.5μl 10mM ddGTP 10μl ９u/μlターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 75.5 μl dH₂O 150μl DNAを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部（episod es）間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で35μlを回収した。アダプターを、アニールした２つのオリゴヌクレオチド、24マー（GsCsAsGsGA GACATCGAAGGTATGAAC(式中、ｓはホスホロチオエート結合を示す)）および12マー（TTCATACCTTCG）により調製した： 7.6μl 197pmole/μl 24マー 9.2μl 162mnole/μl 12マー 1.87 μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー 18.7μl 混合物を55℃に加熱して、１時間かけて10℃に冷却した。アダプターを末端基化ゲノミック断片に連結した： 35μl DNA 18.7μl アダプター 4.3μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー 1.5μl 10u/μl T4 DNAリガーゼ 2.5 μl dH₂O 62μl 反応物を16℃において一晩インキュベートして、次に70℃において20分間熱不活性化した。 DNAを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂ Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で54μlを回収した。一本鎖ニックの部位からのプライミングを通して偽の産物の生成を阻害するため、これらはサーモシークエナーゼ（Thermo Sequenase）とのインキュベーションにより末端基化した： 54μl DNA 4.4μl サーモシークエナーゼバッファー 1.4μl 10mM ddATP 1.4μl 10mM ddCTP 1.4μl 10mM ddGTP 1.4μl 10mM ddTTP 0.5μl 32u/μl サーモシークエナーゼ 5.5 μl dH₂O 70μl 混合物にミネラルオイルを重層して、74℃において２時間インキュベートした。 DNAを抽出して(GFX精製カラム)、50μlの５mM Tris pH8.5に溶出した。（ｂ）５μgのイヌゲノミックDNAをMboIにより断片化して、37℃において完全に消化した： 4.4μl 1.135μg/μlのゲノミックDNA 10μl 10×制限バッファー 2.5μl 10u/μl MboI 83 μl dH₂O 100μl 消化は、反応物のアリコートの１％アガロースゲル上の電気泳動並にエチジウムブロマイド染色により確認した。 70℃20分間のインキュベーションの後、DNAを、ミクロ濃縮により(Microcon- 30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で32μlを回収し、その半分をアダプターに連結した。アダプターを、アニールした２つのオリゴヌクレオチド、24マー（GsCsAsGsGA GACATCGAAGGTATGAAC(式中、ｓはホスホロチオエート結合を示す)）および16マー（GATCGTTCATACCTTC）により調製した： 6.3μl 197pmole/μl 24マー 8.5μl 147pmole/μl 16マー 1.65 μl 10×T4リガーゼバッファー 16.5μl 混合物を55℃に加熱して、１時間かけて10℃に冷却した。アダプターをゲノミック断片に連結した： 16μl DNA 16.5μl アダプター 2.4μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー２μl 10u/μl T4 DNAリガーゼ 3.1 μl dH₂O '40μl 反応物を16℃において一晩インキュベートして、次に70℃において20分間熱不活性化した。 DNAを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂ Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で40μlを回収した。アダプター連結した断片をサーモシータエナーゼ（Thermo Sequenase）を用いて末端基化した： 40μl DNA 4.4μl サーモシークエナーゼバッファー 1.4μl 10mM ddGTP 0.5μl 32u/μl サーモシークエナーゼ 24 μl dH₂O 70μl 混合物にミネラルオイルを重層して、74℃において１時間インキュベートした。一本鎖ニック部位からのプライミングによる偽の産物の生成を阻害するために、サーモシークエナーゼとのさらなるインキュベーションおよび残りのddNTPsの添加によりれらを末端基化した： 1.4μl 10mM ddATP 1.4μl 10mM ddCTP 1.4μl 10mM ddTTP 0.3 μl サーモシークエナーゼバッファー 4.8μl 反応物を74℃においてさらに１時間インキュベートした。 DNAを抽出して(GFX精製カラム)、50μlの５mM Tris pH8.5に溶出した。ゲノミック断片のアダプター連結および末端基化の方法（ａ）と（ｂ）を、以下を含む反応物において「内部」プライマーを用いた場合と用いない場合の結果として生じる断片の増幅により比較した：５μｌ５μｌ５μｌ 10×Taq PCRバッファー５μｌ５μｌ５μｌ 10×dNTPs １μｌ１μｌ１μｌ 25pmol/μl 24マー１μｌ１μｌ０μｌ 50pmol/μl (AC)11B 50ng 0ng 50ng GFX抽出DNA 50μlに dH₂O 各反応物にミネラルオイルを重層して、95℃において２分間加熱した。 0.5μlの５u/μl Taq DNAポリメラーゼを各反応物に加え、95℃30秒間、65℃3 0秒間、72℃１分間を25回繰り返して、次に72℃において５分間最終の伸長合成を行った。 7.5μlの各反応物をエチジウムブロマイドにより染色した1.5％アガロースゲル電気泳動に供した。DNAを欠いた陰性対照反応物は生成物を生じなかったのに対して、全成分を含む反応物は様々な分子量の生成物のスメアを生じた。対照的に、DNAを含んだが内部プライマーを含まなかった反応物は生成物を生じることができなかった。これらの結果は、アダプターがゲノミック断片にうまく連結されてDN Aポリメラーゼの存在下で伸長合成できる全ての3'末端が末端基化されたことを確証した。この好ましい方法は連結前の末端基化であったが、なぜなら、（ｉ）うまく連結した全ての断片が末端基化されたことをこれが保証し、そして（ii）内部断片連結の機会がわずかであったためである。末端基化されてアダプターを連結されたゲノミック断片からの5'および3'フランキング配列の増幅以下を含む各VNTRプライマーに関して増幅反応を実施した： 5μl 5μl 10×Taq PCRバッファー 5μl 5μl 10×dNTPs 2μl 2μl 25pmol/μl 24マー 2μl 2μl 25pmol/μl (AC)11Bまたは(CA)11Dまたは(GT)11Hまたは(TG)11V 2μl 0μl 断片化、末端基化、アダプター連結ゲノム（約50ng/μl） 34 μl 36 μl dH₂O 50μl 50μl さらに、VNTRプライマー以外の全成分を含む平行反応を実施した。全ての反応物はミネラルオイルを重層して95℃において２分間加熱した。0.5 μlの５u/μl Taq DNAポリメラーゼを各チューブに加えて、95℃30秒間、65℃45 秒間、72℃45秒間の18回の繰り返しによる温度循環、続く５分間の72℃における最終伸長合成により増幅を達成した。各反応物５μlを1.5％アガロースゲル上で分子量マーカーと共に泳動してからエチジウムブロマイド染色した。全成分を含んだ反応物は約100から500bpの範囲の産物のスメアを生じ、強度および分子量の分布を各反応間で比較した。DNAを欠く反応物およびVNTRプライマーを欠く反応物に相当するレーンは何ら増幅産物を含まなかった。実施例３ T4 DNAポリメラーゼによるVNTR開始PCR産物からの反復配列の消化の効率を評価したクローン化されたVNTR対立遺伝子をTaq DNAポリメラーゼにより増幅して、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で40μlを回収し、その濃度はアガロースゲル電気泳動により130ng/μl、約1.3pmol/μlと判定された。 T4 DNAポリメラーゼの1.5u/μl希釈液をdH₂Oにより調製した。増幅されたDNA をT4 DNAポリメラーゼの濃度を変更しながら0.3pmol/μlの濃度において12℃において消化した： 1.5μl 10×T4 DNAポリメラーゼバッファー 0.75μl 10mM dATP 0.75μl 10mM dCTP 3.5μl DNA ０，0.5，１，２，または４μl 1.5u/μl T4 DNAポリメラーゼ 15μlに dH₂O dNTPsを欠いた平行反応を調製した。反応物は12℃において１時間インキュベートの後、70℃において20分間熱不活性化した。各反応物7.5μlをエチジウムブロマイド染色した2.5％アガロースゲル電気泳動に供した。dNTPs不在下では、全てのDNAが0.05u/μlを越える酵素濃度において消化された。対照的に、何れのT4 DNAポリメラーゼ濃度においてもdNTPs存在下ではDNAの識別可能な損失はなかった。 T7遺伝子６産物によるVNTR開始PCR産物からの反復配列の消化の効率を評価したクローン化されたVNTR対立遺伝子をプラスミド特異的センスプライマーおよび (GT)11Hプライマーを用いてTaq DNAポリメラーゼにより[α-³³P]dATP存在下において増幅した。平行反応は、４つのホスホロチオエート結合の連続を含むかまたは欠くプライマーに関して実施した。ホスホロチオエート結合を含むプライマー対においては、それらはプラスミド特異的プライマーの5'末端および(GT)11Hプライマーの3'末端に位置した。増幅されたDNAは、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。等量の増幅反応物をT7遺伝子６エキソヌクレアーゼにより37℃において15および30分間消化したが、DNAの濃度は0.1pmol/μlに近似させた： 3.6μl DNA ２μl 5×T7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー１μl 10u/μl T7遺伝子６エキソヌクレアーゼ 3.4 μl dH₂O 10μl 対照反応物は酵素不在下で15分間37℃においてインキュベートした。全反応物は５μlのホルムアミド泳動用染料の添加と共に95℃において２分間変性した。各サンプル10μlを８％ポリアタリルアミド変性ゲル上の電気泳動に供した。オートラジオグラフィーフィルム（Biomax MR；Kodak）をゲルに露出して定着および乾燥した。 15分間のインキュベーション後、ホスホロチオエート保護を欠くDNAが完全に消化されたことがわかった。対照的に、ホスホロチオエート結合の存在はDNAを維持して、各分子中の一つの鎖は酵素の消化により短くされたが、いくらかの非特異的なDNAの損失が観察された。 T4エンドヌクレアーゼVIIとＳ１ヌクレアーゼによる消化の効率および特異性を比較した４ヌクレオチドだけそれらの繰り返しの長さが異なる同じVNTRsのクローン化V NTR対立遺伝子を[α-³³P]dATP存在下で別々に増幅した。短い対立遺伝子に由来する生成物を２つのチューブ間で等しく分割した。一方のチューブには、等量の長い対立遺伝子を加えて、混合物を100mM NaClおよび200μM CTAB存在下で98℃ において２分間変性して75℃において150分間アニーリングすることによりハイブリダイズさせた。 DNAのハイブリダイズしたプールとハイブリダイズしなかったプールを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。 T4エンドヌクレアーゼVIIは供給された希釈バッファー中で250u/μlに希釈した。Ｓ１ヌクレアーゼの希釈は、dH₂O中に調製した。ハイブリダイズしたDNAまたはハイブリダイズしなかったDNAの何れかの等量を、Taq DNAポリメラーゼ中の 50u/μl T4エンドヌクレアーゼVIIまたは供給されたバッファー中の様々な濃度のＳ１ヌクレアーゼにより消化した。Ｓ１ヌクレアーゼを反応物に加えることにより、0. 01u/μl，0.03u/μl，0.1u/μlおよび0.3u/μlの最終濃度を与えた。各場合において、酵素を欠いた対照反応物を調製した。反応は37℃において30分間実施した。消化完了に際して、EDTAの添加および熱不活性化により反応を停止した。反応体積の半分のホルムアミド泳動染料をかなりの量加えて、95℃における５分間のインキュベーションにより各反応物を変性した。各サンプル12μlを８％ポリアクリルアミド変性ゲル上の電気泳動に供した。オートラジオグラフィーフィルム（Biomax MR；Kodak）をゲルに露出して定着および乾燥した。 T4エンドヌクレアーゼVIIは、同じVNTRのほぼ等量の２つの別の対立遺伝子のハイブリダイゼーションに由来する全DNAの約半分を分割したことがわかり、分割に際して繰り返し配列内のミスマッチの位置に相当する分割産物の特徴的パターンを創製した。ハイブリダイズしなく、よってミスマッチフリーの二本鎖DNA を含んだ単一の対立遺伝子に由来するDNAは、T4エンドヌクレアーゼVIIにより影響されなかった。対照的に、T4エンドヌクレアーゼVIIを用いて観察された分割産物の特徴的パターンはいかなる反応条件下でもＳ１ヌクレアーゼに関して観察されなかった。T4エンドヌクレアーゼVIIは、この応用において２つの酵素のうちでより良好と考えられた。１×Taq PCRバッファー、１×Pfuバッファー（Stratagene）および１×T7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中での30分間および１時間の消化のための様々な濃度の酵素を用いたT4エンドヌクレアーゼVII反応の反復は、この酵素が予測どおりに且つ再現性よく、反応条件範囲にわたって消化したことを確証し、20 0u/μlまでの濃度においての検出可能な非特異的なDNAの消化は明白でなかった。この酵素は、連続するサイズのミスマッチを含むハイブリダイズ分子を分割することがわかった。繰り返し配列中のミスマッチによりもたらされた分割産物の特徴的パターンは、大量のDNAをポリアクリルアミドゲル上で泳動した場合にのみＳ１ヌクレアーゼにより観察された。これは４つのヌクレオチドミスマッチにより観察された。２つのミスマッチを解析するＳ１ヌクレアーゼの能力は劣ることがわかった。 T4エンドヌクレアーゼVIIによるミスマッチ含有二重鎖DNAの分割の効率に対する酵素濃度の効果を評価した対立遺伝子の長さで２ヌクレオチド異なる２つのクローン化VNTR対立遺伝子をプラスミド特異的プライマーを用いて別々に増幅したが、その一方はT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ-³³P]ATPにより標識した。各々の増幅された対立遺伝子は、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのd H₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。小さな対立遺伝子の増幅に由来するDNAの半分は取っておいた。残りの半分には、ほぼ等量の大きな対立遺伝子の増幅DNAを加えた。この混合物を98℃において２分間で変性して100mM NaClおよび200μM CTAB存在下で75℃において２時間アニールさせたところ、温度間の遷移が素早く生じた。ミクロ濃縮を用いた低分子量溶質からのアニールDNAの分離を繰り返した。 T4エンドヌクレアーゼVIIの連続希釈を供給された希釈バッファー中で調製した。非変性の小さな対立遺伝子および変性されてアニールされた対立遺伝子混合物を各々Taq DNAポリメラーゼバッファー中でT4エンドヌクレアーゼVIIを最終濃度０u/μl，50u/μl，100u/μlおよび150u/μlにて用いて消化した：６μl DNA １μl 10×Taq PCRバッファー３μl T4エンドヌクレアーゼVII 10μl 37℃におけるインキュベーションを30分間実施し、その後、５μlのホルムアミド泳動染料の添加と共に95℃に２分間加熱した。10μlの体積を８％ポリアクリルアミド変性ゲル上の電気泳動に供し、その後、ゲルを固定化し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーフィルム（Biomax MR；Kodak）に露出した。非変性の小さな対立遺伝子の消化はほとんど検出されなかった。わずかに観察されものは、増幅の最終サイクルにおけるポリメラーゼエラー部位においての消化または休み休み進む（stutter）バンドのアニーリングの結果として生じたと推測された。アニールされた対立遺伝子混合物に対応するレーンにおいては、消化の特徴パターンがT4エンドヌクレアーゼVII存在下において起こることが観察された。100u/μlにおける消化の量は50u/μlにおけるよりもわずかに高いと思われるが、各酵素濃度における消化の程度はほとんど等しいことがわかった。 Pfuバッファー（Stratagene）およびT7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中において様々な濃度のT4エンドヌクレアーゼVIIを用いて同様な実験を実施した。ミスマッチ含有DNAの効果的な消化は両反応バッファー中で起こることがわかり、消化の程度は、50u/μlから100u/μlの間のT4エンドヌクレアーゼVII濃度において最大になった。ミスマッチを欠く二重鎖DNAは、これらの条件下ではT 4エンドヌクレアーゼVIIに耐性であった。 T7遺伝子６エキソヌクレアーゼ中でのＳ１ヌクレアーゼ消化の効率と特異性を評価したクローン化されたVNTR対立遺伝子をプラスミド特異的プライマーで増幅したが、そのうちの一方はT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ-³³P]ATPで標識した。増幅された産物は、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。回収されたDN Aの体積を分割し：30!tlを二本鎖DNAとして保存して、残りの30μlを98℃２分間の変性により一本鎖とし、続いて氷水上ですぐに冷却した。Ｓ１ヌクレアーゼの希釈は、dH₂O中で調製した。等量の二本鎖DNAまたは一本鎖DNAを、０u/μl，0.1u/μl，0.3u/μl，１u/μlそして3u/μlのＳ１ヌクレアーゼ存在下においてT7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中において37℃において５分間消化した。消化完了に際して、反応は、最終濃度25mMになるまでの 500mM EDTA pH8の添加により停止した。反応物は、５μlのホルムアミド泳動染料を添加して95℃に２分間加熱することにより変性し、その後、アリコートを８％ポリアクリルアミド変性ゲル上の電気泳動に供した。ゲルを固定化し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーフィルム（Biomax MR；Kodak）に露出した。 T7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中における１u/μlの濃度のＳ１ヌクレアーゼが一本鎖DNAの最大の消化を生じたことがわかり、この濃度においては二本鎖DNAの明白な損失はなかった。Ｓ１ヌクレアーゼと共同のT7遺伝子６エキソヌクレアーゼによるDNAの消化の評価 T7遺伝子６エキソヌクレアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼの評価のために、４つのホスホロチオエート結合を有するプラスミド特異的センスプライマーおよび3' 末端に４つのホスホロチオエート結合を有する(AC)11Bプライマーまたはそのような結合を欠く(AC)11Bプライマーの何れかを用いて、クローン化されたVNTR対立遺伝子からDNAを増幅した。増幅産物は、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Ami con)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。各々の場合において回収された体積は40μlと測定された。これらは、ホスホロチオエート結合を伴った場合と伴わなかった場合のVNTRプライマーによりプライミングされた反応に関して、それぞれ約1.3pmol/μlおよび0.35pmol/μlを含んだことがわかった。 T7遺伝子６エキソヌクレアーゼをdH₂O中で10u/μlに希釈した。Ｓ１ヌクレアーゼはdH₂O中で10u/μlに希釈した。約0.1pmol/μlの濃度の各増幅産物をT7遺伝子６エキソヌクレアーゼにより消化した。さらに、ホスホロチオエート結合を含む(AC)11Bプライマーを用いて生じたDNAを、Ｓ１ヌクレアーゼと共同したT7遺伝子６エキソヌクレアーゼにより消化した： PT 結合なし PT 結合あり PT 結合あり 4μl 4μl 4μl ５×T7遺伝子６バッファー 5.7μl 1.6μl 1.6μl DNA 0,2,4,8μl 0,2,4,8μl 0,2,4,8μl 10u/μl T7遺伝予6エキソヌクレアーゼ０μl ０μl ２μl 10u/μl S1ヌクレアーゼ 20μlに20μlに20μlに dH₂O 各反応物を37℃において10分間インキュベートし、その後、１μlの500mM EDT A pH8を各チューブに加えて、70℃において20分間インキュベーションした。各消化物10μlをエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上の電気泳動に供した。酵素を欠く反応に対応するレーンは、予測された分子量の明瞭なバンドを含んだ。一本鎖DNAに相当する低分子量のバンドの出現は、ホスホロチオエート保護を欠いた(AC)11BプライマーによりプライミングされたDNAに関しての１ u/μlの濃度のT7遺伝子６エキソヌクレアーゼにおいて観察された。これを越える濃度においては、事実上全てのDNAは一本鎖であった。対照的に、各末端においてホスホロチオエート結合により保護されたDNAは、いかなるT7遺伝子６エキソヌクレアーゼ濃度においても分子量は顕著に変化しなかったようであるが、濃度の増加に伴うDNAの量の低下は明らかであった。同様に、各末端を保護されたDNAは、Ｓ１ヌクレアーゼと組み合わされたT7遺伝子６エキソヌクレアーゼの消化に耐性であた。約0.1pmol/μlのDNAを含むT7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中の１ u/μlのT7遺伝子６エキソヌクレアーゼ並びに１u/μlのＳ１ヌクレアーゼの濃度がもっとも良好な結果を生じたらしい。同じVNTRの３つの対立遺伝子と共に第２のVNTRの単一の対立遺伝子を含むモデル系用いてミスマッチ識別法を評価した VNTR対立遺伝子の混合物は、同じVNTRの３つの対立遺伝子、(AC)10，(AC)11および(AC)18をそれぞれ２：１：１の比で含むよう調製した。さらに、(AC)11および(AC)18と等しい量の第２VNTRの(CA)16対立遺伝子を混合物に加えた。Pfu DNA ポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、１ngの混合物をPCRにより、センスプライマーが[γ-³³P]ATPにより標識された各プラスミド特異的プライマー60pmolを含む10０μlの反応体積中で増幅した。温度循環は、95℃30秒間、65℃30秒間そして72℃45秒間の17回の反復により実施し、続いて最終伸長合成のため72℃５分間にした。増幅産物は、ミクロ濃縮により（Microcon-30；Amicon）遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により、低分子量溶質から分離した。回収されたDNAは98℃において２分間変性し、次に100mM NaClおよび200μM CATB中で75℃において２時間アニールしたところ、温度の遷移が早くなった。ハイブリダイズしたDNAは、ミクロ濃縮により（Microcon-30；Amicon）遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により低分子量溶質から分離し、全体積36μlにおいて50u/μlの酵素を含むTaq DNAポリメラーゼバッファー中でT4エンドヌクレアーゼVIIにより消化した。消化は37℃において１時間進行させ、その後、反応物は75℃において15分間インキュベートした。消化されたDNAは、ミクロ濃縮により（Microcon-30；Amicon）遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により低分子量溶質から分離した。さらなる消化を、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中の１u/μlのT7遺伝子６エキソヌクレアーゼ並びに１u/μlのＳ１ヌクレアーゼを含む50μl反応物中で37℃において10分間実施した。反応は、２μlの500mM EDTAの添加および75℃10分間の加熱により停止した。ミクロ濃縮を（Microcon-30；Amicon）遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により実施した。体積で48μlを回収し、そのうちの４μlを前記のとおりのPCRにより増幅した。これに続いて、第２ラウンドのミスマッチ識別法を行った。各ラウンドのミスマッチ識別法の前と後の増幅されたDNAのアリコートを８％ポリアクリルアミド変性ゲル上の電気泳動に供した。さらに、各産物の分子量の比較のため、分離して増幅された各対立遺伝子のPCR産物をゲル上で泳動した。 Pfuは各増幅反応において、大量の休み休み進む（stutter）バンドを生じたことがわかった。ミスマッチ識別法の前の混合物中の(AC)10対立遺伝子の量は他の全ての対立遺伝子の約２倍であった。これらのその他はほぼ等量存在した。第１ラウンドのミスマッチ識別法の後、(AC)10対立遺伝子の明らかな富裕化が観察された。これは第２ラウンドのミスマッチ識別法により富裕化されて、(AC)10に相当する極めて強いバンドを生じ、(AC)11および(AC)18対立遺伝子の顕著な減少を生じた。第２VNTRの(CA)15対立遺伝子に相当するバンドは第２ラウンドのミスマッチ識別法の後に観察されたが、富裕化(AC)10対立遺伝子のバンドほど明瞭ではなかった。これは、混合物中の各VNTRの全DNAの変動（inequality）および第２の水準のキネティックスに従うハイブリダイゼーションの結果としての相対的な無効果を反映すると考えられた。この実験は、ミスマッチ識別法が高い頻度を有する同じVNTRの対立遺伝子混合物中で対立遺伝子を富裕化することを確証した。実施例４数匹のイヌのプールされたゲノムを用いてプロトコルを評価した遺伝形質により影響された個体および影響されなかった個体からのDNAサンプル不在下で、劣性形質存在下で予測されるはずのVNTR連鎖不均衡のシナリオを模倣するようにデザインされたモデル系においてプロトコルを確実なものとした。全部で43匹のイヌを、VNTR特異的プライマーを用いて、イヌにおいて以前に単離されたVNTRに関して遺伝子型決定した。VNTRプライマー対は、（CACTTGGGACTT TGGATTGGTCA）センスプライマーおよび（GTCTTTGTTTCCATTCCATTCTTGCTTGC）アンチセンスプライマーからなった。 PCRによる増幅反応を、20ngゲノミックDNAおよび４pmolの各VNTR特異的プライマーを含む10μlの体積中で実施した。各場合において、VNTR特異的センスプライマーを標識して増幅反応マスターミックスに加えた： 1.5μl 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー 2.4μl 50pmol/μl VNTR特異的センスプライマー 4.5μl [γ-³³P]ATP １μl 30u/μl T4ポリヌクレオチドキナーゼの３希釈中１（1 in 3 dilution） 5.6 μl dH₂O 15μl 反応物は37℃において１時間、次に90℃において５分間インキュベートした。 T4ポリヌタレオチドキナーゼ反応物をPCRマスターミックスに加えた： 15μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ反応物 45μl 10×Taq DNAポリメラーゼバッファー 45μl 10×dNTPs 2.4μl 50pmol/μl VNTR特異的アンチセンスプライマー 4.5μl ５u/μl Taq DNAポリメラーゼ 293 μl dH₂O 405μl 各イヌに関して、１μlの20ng/μlゲノミックDNAを、ミネラルオイルを重層したPCRマスターミックス９μlに加えた。各反応物は95℃に予め加熱した温度循環器上に置いて、２分間インキュベートした。次に、温度循環を、95℃30秒間の変性、65℃30秒間のアニーリングおよび72℃30秒間の28回の反復により行い、次に伸長合成のために72℃において５分間おいた。温度循環の完了に際して、５μlのホルムアミド泳動染料を各反応物に加えて、60Ｗにおける８％ポリアクリルアミド変性ゲル上の電気泳動に先立ち変性した。ゲルを10％メタノール／10％氷酢酸中で固定して、乾燥した。オートラジオグラフィーフィルム（Biomax MR；Kodak）をゲルに一晩露出した。各イヌの遺伝子型をVNTRに関して記録した。10匹のイヌが個体の「影響されたプール」を代表し、10匹が「野生型プール」を代表すると選択された。この選択は、劣性形質を模倣してよいシナリオを達成するために、なされた：影響された対立遺伝子頻度（ＡＣ）ｎ１００％（ＡＣ）ｎ＋１０％（ＡＣ）ｎ＋２０％（ＡＣ）ｎ＋３０％（ＡＣ）ｎ＋４０％（ＡＣ）ｎ＋５０％（ＡＣ）ｎ＋６０％（ＡＣ）ｎ＋７０％野生型対立遺伝子頻度（ＡＣ）ｎ１５％（ＡＣ）ｎ＋１０％（ＡＣ）ｎ＋２０％（ＡＣ）ｎ＋３０％（ＡＣ）ｎ＋４３５％（ＡＣ）ｎ＋５２０％（ＡＣ）ｎ＋６０％（ＡＣ）ｎ＋７３０％１匹のイヌのゲノミックDNAからアンプリマーを調製した。100μlの体積において、５μgのゲノミックDNAを20ユニットのHae IIIにより消化して、37℃において12時間にわたって消化を完全に進行させた： 4.4μl 1.135μg/μlゲノミックDNA 10μl 10×制限バッファー２μl 10u/μl Hae III 84 μl dH₂O 100μl エチジウムブロマイド染色した１％アガロースゲル上において、反応物のアリコートの電気泳動により消化を確認した。 DNAを抽出して(GFX精製カラム)、50μlの５mM Tris pH8.5に溶出して、30μ lに含まれる約３μgをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと共に３時間37℃においてインキュベートした： 30μl DNA 30μl ５×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼバッファー 4.5μl 10mM ddGTP 10μl ９u/μlターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 75.5 μl dH₂O 150μl DNAをミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂O の連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で35μlを回収した。２つのオリゴヌクレオチド、24マー（GsCsAsGsGAGACATCGAAGGTATGAAC(式中、s はホスホロチオエート結合を示す)）および12マー（TTCATACCTTCG）により調製した： 7.6μl 197pmole/μl 24マー 9.2μl 162pmole/μl 12マー 1.87 μl 10×T4リガーゼバッファー 18.7μl 混合物を55℃に加熱して、１時間以上10℃に冷却した。アダプターをゲノミック断片に連結した： 35μl DNA 18.7μl アダプター 4.3μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー 1.5μl 10u/μl T4 DNAリガーゼ 2.5 μl dH₂O 62μl 反応物を16℃において一晩インキュベートして、次に70℃において20分間熱不活性化した。 DNAを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間への dH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。体積で54μlを回収した。一本鎖部位からのプライミングにより偽の産物の生成を阻害するために、これらは、サーモシータエナーゼ（Thermo Sequenase）を用いて末端基化した： 54μl DNA 4.4μl サーモシークエナーゼバッファー 1.4μl 10mMddATP 1.4μl 10mMddCTP 1.4μl 10mMddGTP 1.4μl 10mMddTTP 0.5μl 32u/μl サーモシークエナーゼ 5.5 μl dH₂O 70μl 混合物にミネラルオイルを重層して、74℃において２時間インキュベートした。 DNAを抽出して(GFX精製カラム)、50μlの５mM Tris pH8.5に溶出した。 VNTRプライマーおよび24マーのオリゴヌタレオチドをアダプター中に含ませてアダプタープライマーとして使用して、このDNAからアンプリマーを調製した：５μl 10×Taq DNAポリメラーゼバッファー５μl 10×dNTPs ２μl 25pmol/μlアダプタープライマー２μl 25pmol/μl VNTRプライマー［(AC)11B，(CA)11D，(GT)11H，または(TG)11V］２μl 末端基化、アダプター連結DNA断片（約50ng/μl） 34 μl dH₂O 50μl VNTRプライマーを含むがゲノミックDNAは不在の、同様な反応物を調製した。さらに、ゲノミックDNAを含むがVNTRは不在の一つの反応を実施した。全ての反応物にミネラルオイルを重層して、95℃において２分間インキュベートした。５ u/μlのTaq DNAポリメラーゼの0.5μlを各反応物に添加した。増幅は、95℃30秒間、65℃45秒間、72℃45秒間の18サイクルの温度循環、続いて最終の伸長合成のための72℃５分間により達成した。増幅の完了に際し、各反応物５μlを分子量マーカーと共にエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上の電気泳動に供した。鋳型DNAとVNTRプライマーを含む反応を示すレーン内の増幅産物の存在は、アダプター配列へのゲノミック断片の連結が生じたことを確証した。各場合において、これらのレーンの出現は同様であり、約100bpから約500bpの分子量の範囲に分散する増幅産物のスメアが存在した。他の全レーンは増幅産物を欠いた。鋳型DNAを含むがVNTRプライマーを含まない反応が生成物を生じなかった事実は、Taq DNAポリメラーゼ存在下における伸長合成が阻害されるように、全3'末端がうまく末端基化されたことを確証した。 (AC)11Bと(CA)11Dによりプライミングされた反応物を混合した。また、(GT)11 Hと(TG)11Vによりプライミングされた反応物を混合した。両アンプリマープールを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により、低分子量溶質から分離した。回収されたDNAのアガロースゲルゲル電気泳動による定量は、各々が約35ng/μlのアンプリマーDNAを含んだことを示唆する。T4 DNAポリメラーゼ、およびエキソヌタレアーゼVIIを用いて、プールされた(AC)11Bおよび(CA)11Dプライミング産物から反復配列を除去した： 14μl 35ng/μl (AC)11B/(CA)11DでプライミングしたアンプリマーDNA ２μl 10×T4 DNAポリメラーゼバッファー１μl 10mM dATP １μl 10mM dCTP ２μl ４u/μl T4 DNAポリメラーゼの４希釈中１（1 in 4 dilution） 20μl 反応物を12℃において１時間インキュベートし、次に70℃において20分間不活性化した。反応物に対して、１μlの10u/μlエキソヌクレアーゼVIIを加えて37℃において30分間インキュベーンョンして、次に70℃において20分間インキュベーションした。デザインされた、影響されたDNAプールおよび野生型DNAプールを、分光分析により定量した、選択されたイヌの等量のゲノミックDNAを混合することにより調製した。これらをフェノール／クロロホルム抽出し、そして遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により、ミクロ濃縮した(Microcon；Amicon)。ゲノミックDNAの各プールをHaeIIIにより消化して、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて末端基化して、前記と同様の様式によりアダプターに連結した。全3'末端の完全な末端基化はアダプタープライマーを用いてPCRにより確認した。DNAプールはアガロースゲル電気泳動により定量して、ほぼ等しい濃度を含んだことがわかった。最小の体積で、2.5μlの35ng/μlの(AC)/(CA)プライミングされたアンプリマープールをT4 DNAポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼVIIで消化して、0.6M NaCl中で、断片化されて末端基化されてアダプターに連結した「影響された」ゲノミックDNAプール約300ngにハイブリダイズさせた。これは、ミネラルオイル下において98℃において３分間該混合物を変性し、次に10時間にわたり80℃から70 ℃へ温度を徐々に低下させ、そしてさらに10時間最終温度を維持することにより達成した。野生型プールは平行して同様な様式においてハイブリダイズさせた：各ハイブリダイゼーションに加えた： 20μl 10×Taq DNAポリメラーセバッファー 20μl 10×dNTPs 160 μl dH₂O 200μl 各場合において、ハイブリダイズしたDNAを含む全体積を２つの反応チューブに分割した。ミネラルオイル下で、各体積を75℃に加熱した。１μlの５u/μl T aq DNAポリメラーゼを各チューブに加えて、72℃において10分間インキュベーションした。反応物を95℃において３分間変性して、４μlの25pnol/μlアダプタープライマーを加えた。ハイブリダイズしたDNAの増幅は、95℃30秒間、65℃30 秒間、72℃90秒間の30反復の温度循環、次に最終伸長合成のための72℃５分間により達成した。野生型DNAを含む反応物のとおりに、影響されたDNAを含む反応物をプールし、そして８μlの10u/μlエキソヌクレアーゼＩを、増幅されたDNA各200μlの体積に加えた。反応物を37℃において15分間インキュベートした。各反応物に関して、DNAをミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により、低分子量溶質から分離した。各場合において、体積で10μlが回収された。各サンプル内に含まれた対立遺伝子は変性して、ミネラルオイル下で98℃５分間のインキュベーション、続く75℃への迅速な温度低下によりアニールさせた。75℃において、２M NaClおよび10mM CTABをそれぞれ最終濃度50mMおよび500μMになるように加えた。ハイブリダイゼーション反応物は75℃においてさらに16時間インキュベートした。各ハイブリダイゼーション反応物に、150μlの５mM Tris pH8.5を加えた。希釈されたハイブリダイゼーション反応物は、次に、ミクロ濃縮により(Microcon- 30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により、低分子量溶質から分離した。これらは、約10pmolesのDNAを含むと判定された。Taq DNAポリメラーゼバッファー中における50u/μlの濃度のT4エンドヌクレアーゼVIIによる消化を10 0μlの体積で実施した。65℃における15分間のインキュベーションの前に、37℃ 30分間消化を進行させた。各消化物は、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により低分子量溶質から分離した。各場合における回収された体積は３つのチューブに分割し、各々、１×Taq DNAポリメラーゼバッファー中の0 .5u/μlエキソヌクレアーゼＩ、１×T7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中の１u/μl T7遺伝子６エキソヌタレアーゼ、70℃10分間の熱不活性化後の0.5u /μlエキソヌクレアーゼＩ、または１×T7遺伝子６エキソヌクレアーゼバッファー中の１u/μl T7遺伝子６エキソヌクレアーゼ並びに１u/μl Ｓ１ヌクレアーゼの何れかにより消化した。。各反応物中のDNA濃度は、30μlの体積中に含まれた約0.1pmol/μlであった。エキソヌクレアーゼＩ反応は、70℃における10分間の熱不活性化前に37℃において15分間実施した。Ｓ１ヌクレアーゼを含むかまたは含まないT7遺伝子６エキソヌクレアーゼ含有反応は37℃において10分間実施した。各消化方法の完了に際して、DNAを抽出して（GFX精製カラム）50μl dH₂Oに溶出した。各抽出DNAサンプルの４分の３をPCRによりTaq DNAポリメラーゼを用いて増幅した： 37.5μl 消化されたDNA 15μl 10×TaqDNA ポリメラーゼバッファー 15μl 10×dNTPs ６μl 25pmol/μlアダブタープライマー 76.5 μl dH₂O: 150μl 反応物を75μlアリコートに分割して、ミネラルオイルを重層して、95℃における２分間のインキュベーションの後に、0.75μlの５u/μl Taq DNAポリメラーゼを加えた。増幅は、95℃30秒間、65℃30秒間、72℃90秒間の25反復の温度循環、次に最終伸長合成のための72℃５分間により達成した。増幅されたDNA各1:50μlに、６μlの10u/μlエキソヌクレアーゼＩを添加した。反応物を37℃において15分間インキュベートした。各場合のDNAをミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により低分子量溶質から分離した。50mM NaClおよび500μM CATB 中のハイブリダイゼーションを繰り返し、続いて各消化法を繰り返し、続いてその結果のDNAを上記のどおりTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRにより増幅した。各増幅産物のアリコートをエチジウムブロマイド染色した1.5％アガロースゲル電気泳動に分子量マーカーと共に供した。T4エンドヌクレアーゼVIIに続いてエキソヌクレアーゼＩにより消化したDNAに相当するレーン中の増幅産物は、ウエルに対してスメアする高分子量のものであった。対照的に、T7遺伝予６エキソヌクレアーゼに続いてエキソヌクレアーゼＩを用いるか、またはT7遺伝子６エキソヌクレアーゼと共にＳ１ヌクレアーゼを用いるかの何れかにより消化した増幅産物に相当するレーン中の増幅産物は、約200bpから約750bpの分子量範囲の産物を含んだ。各場合における分子量の分散は小さかった。ウエルに向かってのスメアがなかったことは、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼ不在下において観察された増幅偽産物がこの酵素の存在により排除されたことを示唆する。そのようにして、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼは、別の方法により偽のDNA分子と交差ハイブリダイズして生成するはずのT4エンドヌクレアーゼVII分割分子からの繰り返し配列の除去のためのミスマッチ識別法の必須成分であると考えられた。第２ラウンドのミスマッチ識別法によりもたらされた増幅DNAの各150μlの体積に、６μlの10u/μlエキソヌクレアーゼＩを加えて、反応物を37℃において15分間消化した。各場合におけるDNAをミタロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの添加により、低分子量溶質から分離した。「影響された」イヌに相当する反応に関して、約25ngのDNAを含む50μlの体積においてVNTR特異的プライマーを用いてTaq DNAポリメラーゼによりPCR増幅を実施した。28反復の温度循環による増幅を実施して、その後、５μlのアリコートと分子量マーカーを、エチジウムブロマイド染色した２％アガロースゲル上で泳動した。 T4エンドヌクレアーゼVIIおよびエキソヌクレアーゼＩによる消化に相当するレーンに関しては、予測された分子量の産物が極めてかすかであった。さらに、ウエルの近辺において大量の偽産物が観察された。他の全レーンに関しては、高分子量の産物は観察されなかった。さらに、増幅産物は、約130bpの予測分子量の明瞭なバンドとして明確に観察された。 T4エンドヌクレアーゼVIIおよびエキソヌクレアーゼＩによる消化に相当する増幅産物は捨てた。残りの反応物を、一方がT4ポリヌクレオチドキナーゼにより [γ-³³P]ATPで標識された、VNTR特異的プライマーをさらに用いて増幅した。増幅は、各プライマーを10pmoles含む20μlの体積中でTaq DNAポリメラーゼを用いて温度循環35反復によるPCRにより実施した。プールされた「影響された」DNAおよびプールされた「野生型］DNAを40ng含む反応を同じ様式で実施した。各サンプルへの10μlのホルムアミド泳動染料の添加後、増幅産物を90℃において３分間変性した。混合物の６μlアリコートを８％ポリアクリルアミド変性ゲル上の電気泳動に供した。ゲルを固定して乾燥して、オートラジオグラフィーフィルムに露出した。第２ラウンドのミスマッチ識別法を経た影響されたDNAから増幅されたDNAに関して産物が視覚化されたことがわかった。これは、T7遺伝子６エキソヌクレアーゼに続いてエキソヌクレアーゼＩによる消化、およびT7遺伝子６エキソヌクレアーゼと共にＳ１ヌクレアーゼによる消化に相当する両レーンにおいて観察された。各場合において、産物は、ミスマッチ分割に供されなかったプールされた影響されたDNAの増幅によりもたらされる産物に似ていた。第２ラウンドのミスマッチ識別法後に増幅された野生型DNAの場合には、産物が識別できなかった。この実験は、いくつかの個体のプールされたゲノムから忠実にVNTRsが再生され、各場合における対立遺伝子が保存されており、そしてミスマッチ識別法が増幅の偽産物を排除して高い頻度のVNTR対立遺伝子を富裕化するために機能することを確証した。野生型DNAに由来するDNAに関して産物は可視化されなかったが、ポリアクリルアミドゲル上の移動度の高いDNAと共に産物が可視化されるようになるかもしれない。そのようにして、ミスマッチ識別法のさらなる反復は、有益な対立遺伝子の最終選択が達成できるようにして、両DNAプールにおいて対立遺伝子をほぼホモ接合性にまで減じるのに要求されるはずである。実施例５アダプターへの連結に由来する3'突出を有するDNAのエキソヌクレアーゼIIIに対する耐性の証明クローン化されたVNTRをTaq DNAポリメラーゼにより増幅した。増幅されたDNA を、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。回収された体積は、44μlと測定され、その濃度はアガロースゲル電気泳動により測定したところ160ng/μl、約1.6pmol/μlであった。増幅されたDNAはT4 DNAポリメラーゼ消化により平滑末端にした： 42μl DNA 3.25μl 10mM dATP 3.25μl 10mM dCTP 3.25μl 10mM dGTP 3.25μl 10mM dTTP 13μl 10×T4 DNAポリメラーゼバッファー 3.25μl ４u/μl T4 DNAポリメラーゼ 59 μl dH₂O 130μl 反応物を12℃において30分間インキュベートして、次に70℃において20分間熱不活性化した。DNAを、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。30μlの体積が回収された。 1600pmolesの21マーオリゴヌクレオチド（CTCGCAAGGATGGGATGCTCG）を、供給された希釈バッファー中で１/10に希釈したT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した： 3.19μl 21マーオリゴヌクレオチド 1.5μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー１μl 10u/μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ 9.3 μl dH₂O 15μl 反応物を37℃において30分間インキュベートして、次に90℃において10分間熱不活性化した。キナーゼ反応物に、1600pmolesの12マーオリゴヌクレオチド（CA TCCTTGCGAG）を添加した。アダプターを形成するためのオリゴヌクレオチドのアニーリングは、55℃への加熱、次に混合物を１時間かけて10℃に冷却することにより達成した。 T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化されたDNAの半分を取っておいた。アニールされたアダプターに、アダプターが50倍過剰になるように、残りの15μlの平滑末端化DNAを加えた： 15μl 平滑末端化DNA 16.2μl アニールされたアダプター 1.9μl 10×T4 DNAリガーゼバッファー１μl 10u/μl T4 DNAリガーゼ 34μl 連結反応物は一晩かけて16℃においてインキュベートした。連結物は、70℃において20分間熱不活性化して、DNAをミクロ濃縮により(Micr ocon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により、低分子量溶質から分離した。回収された体積は、36μlと測定された。連結したDNAおよび取っておいた15μlの非連結DNAの両者に水を加えて約0.75p moles/μlとした。各々を約0.2pmol/μlまでのDNA最終濃度においてエキソヌクレアーゼIIIにより消化した： 10.7μl DNA ４μl 10×エキソヌクレアーゼIIIバッファー１μl 200u/μl エキソヌクレアーゼIII 24.3 μl dH₂O 40μl 反応物を37℃において５分間インキュベートして、次に70℃において20分間熱不活性化した。各消化物約２pmolesをエチジウムブロマイド染色した２％アガロースゲル上で泳動した。全ての非連結DNAは、ゲル上で何も検出できないようにエキソヌクレアーゼIIIにより完全に消化された。対照的に、いくらかの消化は生じたが、多くの連結DNAが消化には耐性であったことがわかった。消化されたものは、リン酸化アダプターに連結しそこなったと推定された。この実験は、アダプターの連結が、DNA分子がエキソヌクレアーゼIII消化に耐性となるかもしれず、それらのアダプターを欠く分子がこの酵素により完全に消化される、一つの方法であることを確証した。エキソヌクレアーゼIIIを用いた第２プールのDNAにハイブリダイズしたDNAプール内の唯一の配列の選択それらの繰り返しの長さが４ヌクレオチド異なる２つのクローン化VNTR対立遺伝子をTaq DNAポリメラーゼを用いてPCRにより増幅した。増幅されたDNAsは、ミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂Oの連続添加により低分子量溶質から分離し、そしてその結果得られたDNAの濃度をアガロースゲル電気泳動により測定した。小さな対立遺伝子の増幅産物の一部に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたインキュベーションにより3'突出を付加した： 12.5μl 120ng/μl DNA（約1.2pmol/μl） 15μl ５×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼバッファー 1.125μl 10mM dATP 3.3μl ９u/μl ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 43 μl dH₂O 75μl 反応物を37℃において１時間インキュベートした後に、DNAを抽出した(GFX精製カラム)。 3'突出を有する対立遺伝子450ngに：（ｉ）3'突出を欠く小さな対立遺伝子4.5μg；（ii）3'突出を欠く大きな対立遺伝子4.5μg を加えた。各場合に、全体積はミクロ濃縮により最小にした(Microcon-30；Amicon)。これらの混合物を98℃３分間変性して、75℃２時間、0.2M Naclおよび100μM CTAB 存在下でアニールした。各ハイブリダイゼーション反応物に加えたのは： 10μl 10×Taq DNAポリメラーゼバッファー 10μl 500u/μl T4エンドヌクレアーゼVII 80 μl dH₂O 100μl 反応物を37℃において45分間インキュベートした後に、70℃15分間において不活性化した。 DNAはミクロ濃縮により(Microcon-30；Amicon)、遠心分離の挿入部間へのdH₂O の連続添加により低分子量溶質から分離した。各場合において、体積約40μlが回収され、５u/μlエキソヌクレアーゼIIIを含む反応混合物中に希釈した： 40μl DNA 15μl 10×エキソヌクレアーゼIIIバッファー 3.75μl 200u/μl エキソヌクレアーゼIII 91 μl dH₂O 150μl 反応物を37℃において５分間インキュベートした後に、全体積はミクロ濃縮により最小にした(Microcon-30；Amicon)。全回収体積をエチジウムブロマイド染色した1.5％アガロースゲル上の電気泳動に供した。さらに、分子量マーカー、3 '突出を含まない小さな対立遺伝子400ng、および突出を有する小さな対立遺伝子 400ngをゲル上で泳動した。小さな増幅対立遺伝子のサイズは分子量マーカーとの対比により約150bpであると確認された。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとのインキュベーション後、この増幅対立遺伝子の見かけ上のサイズは増加した。400b pから750bpの間の二本鎖DNAに相当するサイズの範囲にわたる産物のスメアが観察されたが、これらの間のはっきりしないバンドの中途にほとんどのDNAが限定された。消化された異なるサイズのハイブリダイズ産物を含むレーンにおいては、約300bpの二本鎖DNAに相当するバンドが、産物の背景のスメアに対して観察された。このバンドは、ミスマッチ含有DNA二重鎖の酵素分割による結果と考えられたが、背景のスメアは3'突出の保護を欠いた分子のエキソヌクレアーゼIII消化によりもたらされた一本鎖DNAであると考えられた。同じサイズのバンドのハイブリダイズ対立遺伝子を含んだレーンにおいては、２つのはっきりとしないバンドが産物の背景のスメアに対して可視化された。もっとも明るいバンドはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとのインキュベーション後の小さな対立遺伝子のバンドと同様な見かけであり、そしてエキソヌクレアーゼII Iにより消化されたヘテロ二重鎖分子からの残りの一本鎖DNAを示すと考えられた。以前のとおり、背景のスメアは、エキソヌクレアーゼIIIによる消化によりもたらされた3'突出を欠く分子の一本鎖DNAによると考えられた。この実験は、異なる繰り返し長さの対立遺伝子と共に、ヘテロ二重鎖に入り込んだ3'突出を有する対立遺伝子が、ヘテロ二重鎖の断片を選択してよいように、T4エンドヌクレアーゼVIIおよびエキソヌクレアーゼIIIにより消化されることを示唆する。付録稀な劣性形質の典型としてよいシナリオを考えていただきたい。影響された個体のグループは同じ対立遺伝子に関してホモ接合体である。野生型グループにおいて、この対立遺伝子は相対的に低い頻度を有する。よって、たとえ大過剰の野生型DNAをミスマッチ識別法から生き残る、影響されたDNAにハイブリダイズさせたとしても、影響されたグループに存在する対立遺伝子は回収される可能性が高い。一つの対立遺伝子が野生型グループよりも高い頻度で影響された個体グループに存在する場合の別のシナリオを考えていただきたい。よって、たとえ大過剰の野生型DNAをミスマッチ識別法から生き残る、影響されたDNAにハイブリダイズさせたとしても、影響されたグループに存在する対立遺伝子Ｅは回収される可能性が高い。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月１９日（１９９９．４．１９）【補正内容】（１）明細書第１０頁を以下のとおりに補正する。「ってよい。別の側面において、本発明は、興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAの一部を提供するが、その一部とは、選択されたVNTR配列の対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の代表的な混合物から本質的になる(consi sting essentially of)。用語「対立遺伝子の代表的な混合物」は、選択されたVNTR配列の、可能な対立遺伝子の全て、またはこれらの可能な対立遺伝子のほとんどでさえも存在することを必ずしも含蓄しない。特定の対立遺伝子が、例えば上記方法により生成した混合物中に存在するか否かは、工程ａ）において用いられた酵素の性質および他の因子に依存してよい。本発明は、興味のある種のゲノミックDNAの一部も提供し、その一部とは、選択されたVNTR配列の3'フランキング領域の代表的な混合物から本質的になり(con sisting essentially of)、混合物の各メンバーはその3'末端にアダプターを有し、および、選択されたVNTR配列の5'フランキング領域の代表的な混合物から本質的になり(consisting essentially of)、混合物の各メンバーはその5'末端にアダプターを有する。本発明は、多形対立遺伝子、例えば選択されたVNTR配列とそれらのフランキング領域の混合物、あるいは幾つかの他の方法例えばAFLP、マイクロサテライト-A FLP、GMSまたはRAPDにおいて生成された混合物を処理するための方法も提供し、該混合物は興味のある形質を証明するものの代表であり、該方法は混合物の鎖を分離してそして次に混合物の鎖を再アニーリングし、そしてあらゆるミスマッチを分離して捨てることからなる。好ましくは、該方法は、上記混合物を、対応する多形対立遺伝子、例えば選択されたVNTR配列とそれらのフランキング領域の混合物とハイブリダイズさせるか、あるいは興味のある形質を証明するものの代表である幾つかの他の方法例えばAFLP、マイクロサテライト-AFLP、GMSまたはRAPD において生成された混合物とハイブリダイズさせ、そしてミスマッチを選択することにより興味のある形質の特徴である多形対立遺伝子の混合物を提供する、付加的」（２）明細書第７９頁〜第８１頁を以下のとおりに補正する。「ングVNTRアンプリマー混合物の両者を連続してかまたは一緒にプライマーとして用いることにより実施する、請求項１乃至４の何れか１項記載の方法。６．興味のある形質を発現する興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAを工程ｅ）において用い、その結果のVNTR対立遺伝子とそれらのフランキング領域の混合物がその興味のある形質を発現する種の代表である、請求項１乃至５の何れか１項記載の方法。７．工程ｆ）において、VNTR対立遺伝子とそれらのフランキング領域の混合物の鎖を分離して、次に再アニールし、そしてあらゆるミスマッチを分離して捨てる、請求項６記載の方法。８．工程ｆ）において、単一のVNTR対立遺伝子およびそのフランキング領域を回収することを繰り返す、請求項７記載の方法。９．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列を興味のある形質を発現しない種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列の混合物とハイブリダイズさせ、そして少なくとも一つのマッチおよび／または少なくとも一つのミスマッチを選択することにより、興味のある形質の特徴である少なくとも一つのVNTR対立遺伝子またはその断片を提供する、請求項６乃至８の何れか１項記載の方法。 10．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列が3'-オーバーラップする末端と共に提供される、請求項９記載の方法。 11．興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAの一部であって、選択されたVNTR配列の対立遺伝子およびそれらの両側のフランキング領域の代表の混合物から本質的になる、上記一部。 12．対立遺伝子の混合物が興味のある形質を発現する種の代表である、請求項 11記載の一部。 13．混合物の各メンバーがその3'-末端およびその5'-末端の各々においてアダプターを有する、請求項11または12記載の方法。 14．興味のある種の一つまたは複数のゲノミックDNAの一部であって、単一のV NTR対立遺伝子およびそのフランキング領域およびその3'-末端およびその5'-末端におけるアダプターから本質的になる上記一部であって、該対立遺伝子は興味のある形質を発現する種の特徴である、上記一部。 15．興味のある種の一つまたは複数のゲノミックDNAの一部であって、選択されたVNTR配列の3'-フランキング領域の代表的混合物から本質的になり、混合物の各メンバーがその3'-末端においてアダプターを有し、そして、選択されたVNT R配列の5'-フランキング領域の代表的混合物から本質的になり、混合物の各メンバーがその5'-末端においでアダプターを有する、上記一部。 16．興味のある形質を発現する種の代表である多形対立遺伝子混合物から本質的になる核酸を処理する方法であって、混合物の鎖を分離して再アニールし、そしてあらゆるミスマッチを分離して捨てることからなる。 17．多形対立遺伝子混合物が、選択されたVNTR配列の対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の混合物である、請求項16記載の方法。 18．単一のVNTR対立遺伝子とそのフランキング領域を回収するために繰り返される、請求項17記載の方法。 19．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列を興味のある形質を発現しない種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列の混合物とハイブリダイズさせ、そして少なくとも一つのマッチおよび／または少なくとも一つのミスマッチを選択することにより、興味のある形質の特徴である少なくとも一つのVNTR対立遺伝子またはその断片を提供する、請求項16乃至18の何れか１項記載の方法。 20．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列が3'-オーバーラップする末端と共に提供される、請求項19記載の方法。 21．工程：ａ）興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAを断片に分割し、ｂ）各断片の各末端にアダプターを連結し、それにより各3'末端がブロックされて酵素による鎖伸長合成を阻害するような、アダプター末端化断片の混合物を形成し、ｃ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型として、アダプタープライマーとVNTRプライマーと共に用いることにより、5'-フランキングVNTRアンプリマーの混合物を創製し、そして／あるいはｄ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型として、アダプタープライマーとVNTRアンチセンスプライマーと共に用いることにより、3'-フランキングVNTR アンプリマーの混合物を創製することからなる、アンプリマー混合物の作成方法。 22．興味のある形質を発現する種の代表である多形対立遺伝子およびそのフランキング配列を含む少なくとも一つの核酸分子；興味のある形質を発現しない種の代表である多形対立遺伝子およびそれらのフランキング配列を含む核酸の混合物をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし；そして少なくとも一つのマッチおよび／または少なくとも一つのミスマッチを選択することにより興味のある形質に連鎖した少なくとも一つの対立遺伝予またはその断片を提供することからなる、興味のある形質に連鎖した対立遺伝子を同定する方法。 23．対立遺伝子がVNTR対立遺伝子である、請求項22記載の方法。 24．興味のある形質を発現する種の代表である少なくとも一つの多形対立遺伝子およびそのフランキング配列が3'-オーバーラップする末端と共に提供される、請求項22または23記載の方法。 25．請求項14記載のゲノミックDNAの一部の診断アッセイにおける使用。 26．VNTR対立遺伝子およびそのフランキング領域、またはVNTR対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の混合物を、VNTR対立遺伝子および／またはそれらのフランキング領域のアレイまたは固定化されたVNTR対立遺伝子および／またはそれらのフランキング領域に対するハイブリダイゼーション条件下で分析する、請求項１乃至10または16乃至20の何れか１項記載の方法。 27．請求項１乃至10、16乃至24または26の何れか１項記載の方法を実施するためのプロトコルおよび試薬を含むキット。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．工程：ａ）興味のある種のゲノミックDNAを断片に分割し；ｂ）各断片の各末端にアダプターを連結し、それにより各3'末端がブロックされて酵素による鎖伸長合成を阻害するような、アダプター末端化断片の混合物を形成し、ｃ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型として、アダプタープライマーとVNTRプライマーと共に用いることにより、5'-フランキングVNTRアンプリマーの混合物を創製し、ｄ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型として、アダプタープライマーとVNTRアンチセンスプライマーと共に用いることにより、3'-フランキングVNTR アンプリマーの混合物を創製し、ｅ）そして、興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAを鋳型として、並びに5'-フランキングVNTRアンプリマーの混合物および／または3'-フランキングVNTRアンプリマーをプライマーとして用いることにより、VNTR対立遺伝子の所望の混合物およびそれらのフランキング領域を作成することからなる、興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAのVNTR対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の混合物を作成する方法。２．工程ｂ）を、各断片の各3'末端を末端基とすることにより酵素による鎖伸長合成を阻害し、そして各断片の各5'末端をアダプターに連結することにより、アダプター末端化断片の混合物を形成することにより実施する、請求項１記載の方法。３．工程ｃ）において、VNTR繰り返し配列を5'-フランキングVNTRアンプリマーから除去し、そして工程ｄ）において、VNTR繰り返し配列を3'-フランキングV NTRアンプリマーから除去する、請求項１または２記載の方法。４．工程ｃ）および／または工程ｄ）において、用いられたアダプターまたはプライマーが少なくとも一つのホスホロチオエート結合を含む、請求項１乃至３の何れか１項記載の方法。５．工程ｅ）を、5'-フランキングVNTRアンプリマー混合物および3'-フランキングVNTRアンプリマー混合物の両者を連続してかまたは一緒にプライマーとして用いることにより実施する、請求項１乃至４の何れか１項記載の方法。６．興味のある形質を発現する興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAを工程ｅ）において用い、その結果のVNTR対立遺伝子とそれらのフランキング領域の混合物がその興味のある形質を発現する種の代表である、請求項１乃至５の何れか１項記載の方法。７．工程ｆ）において、VNTR対立遺伝子とそれらのフランキング領域の混合物の鎖を分離して、次に再アニールし、そしてあらゆるミスマッチを分離して捨てる、請求項６記載の方法。８．工程ｆ）において、単一のVNTR対立遺伝子およびそのフランキング領域を回収することを繰り返す、請求項７記載の方法。９．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列を興味のある形質を発現しない種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列の混合物とハイブリダイズさせ、そして少なくとも一つのマッチおよび／または少なくとも一つのミスマッチを選択することにより、興味のある形質の特徴である少なくとも一つのVNTR対立遺伝子またはその断片を提供する、請求項６乃至８の何れか１項記載の方法。 10．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列が3'-オーバーラップする末端と共に提供される、請求項９記載の方法。 11．興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAの一部であって、選択されたVNTR配列の対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の代表の混合物から本質的になる、上記一部。 12．対立遺伝子の混合物が興味のある形質を発現する種の代表である、請求項 11記載の一部。 13．混合物の各メンバーがその3'-末端およびその5'-末端の各々においてアダプターを有する、請求項11または12記載の方法。 14．興味のある種の一つまたは複数のゲノミックDNAの一部であって、単一のV NTR対立遺伝子およびそのフランキング領域およびその3'-末端およびその５'-末端におけるアダプターから本質的になる上記一部であって、該対立遺伝子は興味のある形質を発現する種の特徴である、上記一部。 15．興味のある種の一つまたは複数のゲノミックDNAの一部であって、選択されたVNTR配列の3'-フランキング領域の代表的混合物から本質的になり、混合物の各メンバーがその3'-末端においてアダプターを有する、上記一部。 16．興味のある種の一つまたは複数のゲノミックDNAの一部であって、選択されたVNTR配列の5'-フランキング領域の代表的混合物から本質的になり、混合物の各メンバーがその5'-末端においてアダプターを有する、上記一部。 17．興味のある形質を発現する種の代表である多形対立遺伝子混合物を処理する方法であって、混合物の鎖を分離して再アニールし、そしてあらゆるミスマッチを分離して捨てることからなる。 18．多形対立遺伝子混合物が、選択されたVNTR配列の対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の混合物である、請求項17記載の方法。 19．単一のVNTR対立遺伝子とそのフランキング領域を回収するために繰り返される、請求項18記載の方法。 20．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列を興味のある形質を発現しない種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列の混合物とハイブリダイズさせ、そして少なくとも一つのマッチおよび／または少なくとも一つのミスマッチを選択することにより、興味のある形質の特徴である少なくとも一つのVNTR対立遺伝子またはその断片を提供する、請求項17乃至19の何れか１項記載の方法。 21．興味のある形質を発現する種の代表の少なくとも一つのVNTR対立遺伝子およびそのフランキング配列が3'-オーバーラップする末端と共に提供される、請求項20記載の方法。 22．工程：ａ）興味のある種の一つまたは複数のメンバーのゲノミックDNAを断片に分割し、ｂ）各断片の各末端にアダプターを連結し、それにより各3'末端がブロックされて酵素による鎖伸長合成を阻害するような、アダプター末端化断片の混合物を形成し、ｃ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型として、アダプタープライマーとVNTRプライマーと共に用いることにより、5'-フランキングVNTRアンプリマーの混合物を創製し、そして／あるいはｄ）アダプター末端化断片の混合物の一部を鋳型として、アダプタープライマーとVNTRアンチセンスプライマーと共に用いることにより、3'-フランキングVNTR アンプリマーの混合物を創製することからなる、アンプリマー混合物の作成方法。 23．興味のある形質を発現する種の代表である少なくとも一つの多形対立遺伝子およびそのフランキング配列；興味のある形質を発現しない種の代表である少なくとも一つの多形対立遺伝子およびそれらのフランキング配列の混合物をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし；そして少なくとも一つのマッチおよび／または少なくとも一つのミスマッチを選択することにより興味のある形質に連鎖した少なくとも一つの対立遺伝子またはその断片を提供することからなる、興味のある形質に連鎖した対立遺伝子を同定する方法。 24．対立遺伝子がVNTR対立遺伝子である、請求項23記載の方法。 25．興味のある形質を発現する種の代表である少なくとも一つの多形対立遺伝子およびそのフランキング配列が3'-オーバーラップする末端と共に提供される、請求項23または24記載の方法。 26．請求項14記載のゲノミックDNAの一部の診断アッセイにおける使用。 27．VNTR対立遺伝子およびそのフランキング領域、またはVNTR対立遺伝子およびそれらのフランキング領域の混合物を、VNTR対立遺伝子および／またはそれらのフランキング領域のアレイまたは固定化されたVNTR対立遺伝子および／またはそれらのフランキング領域に対するハイブリダイゼーション条件下で分析する、請求項１乃至10または17乃至21の何れか１項記載の方法。 28．請求項１乃至10、17乃至25または27の何れか１項記載の方法を実施するためのプロトコルおよび試薬を含むキット。