[go: up one dir, main page]

JP7579817B2 - Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化 - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化 Download PDF

Info

Publication number
JP7579817B2
JP7579817B2 JP2021577412A JP2021577412A JP7579817B2 JP 7579817 B2 JP7579817 B2 JP 7579817B2 JP 2021577412 A JP2021577412 A JP 2021577412A JP 2021577412 A JP2021577412 A JP 2021577412A JP 7579817 B2 JP7579817 B2 JP 7579817B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequences
target
specific
outputting
target site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021577412A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022540792A (ja
JPWO2021003343A5 (ja
Inventor
リー，ヘン
クルガン，ギャビン
マクニール，マシュー
ワン，ユー
Original Assignee
インテグレーティッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレーティッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by インテグレーティッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレーティッド filed Critical インテグレーティッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレーティッド
Publication of JP2022540792A publication Critical patent/JP2022540792A/ja
Publication of JPWO2021003343A5 publication Critical patent/JPWO2021003343A5/ja
Priority to JP2024188978A priority Critical patent/JP2025014002A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7579817B2 publication Critical patent/JP7579817B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/30—Detection of binding sites or motifs
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/20—Sequence assembly
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics
    • G16B50/30—Data warehousing; Computing architectures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、両方とも２０１９年７月３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７０，４２６号および同第６７／８７０，４７１号、ならびに両方とも２０１９年１２月２３日に出願された同第６２／９５２，６０３号および同第６２／９５２，５９８号に対する優先権を主張し、それらの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
生物学的情報に基づく、改善された精度を有する、二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるためのシステムおよびプロセスを本明細書に記載する。生物学的データを使用して、位置特異的アラインメントスコアリングについてのアラインメント行列に情報を与え、それにより非標準標的部位の正確な同定をもたらす、配列アラインメントプロセスも記載する。
ＣＲＩＳＰＲタンパク質などの標的化ヌクレアーゼの使用によりゲノム編集は転換した。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２パートのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとハイブリダイズされると、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成する。いずれかの手法により、短いプロトスペーサー配列（ガイドＲＮＡまたは「ｇＲＮＡ」）は、相補的な分子中の特異的配列を標的にする。マッチするものを見出すと、これらの酵素は、一方または両方のＤＮＡ（またはＲＮＡ）鎖に切断を導入する。ＤＮＡ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１）を標的にするＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡのハイブリダイゼーション標的に対して、予測通りのゲノム位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。ＤＮＡ ＤＳＢは、細胞内機構によって修復されるが、修復プロセスは、多くの場合、挿入および欠失（インデル）、置換、ならびに他の準最適な対立遺伝子バリアントをもたらす。
影響を受ける集団中のそれぞれの細胞は、隣接細胞から独立して、それ自体を修復しなければならず、特定の結果が、異なる生じた対立遺伝子を含有し得るので、細胞の集団は、標的化される場所に複数の対立遺伝子を含有する可能性がある。加えて、これらのヌクレアーゼの標的化能力は、多くの場合、多少非特異的であり、これは、他のオフターゲットのゲノムの場所において望ましくない変異をもたらす。
オンターゲットおよびオフターゲットの場所の両方における複数の対立遺伝子を特徴付け、定量化することは非常に望ましい。研究者は、多くの場合、ＤＮＡ配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａの次世代配列決定；ＮＧＳ）を使用して、生じた対立遺伝子の多様性を観察する。マルチプレックス化ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、すべての標的化される場所を増幅および富化することができる。生じたアンプリコンを配列決定することができる。複数の対立遺伝子は、専門のソフトウェアを使用して、特徴付け、カウントすることができる。
多くの専門のソフトウェアツールが、ＤＳＢから生じる対立遺伝子バリアントを特徴付けるために開発された。以前のツールとしては、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ［１］、ｃｒｉｓｐＲｖａｒｉａｎｔｓ［２］、およびＡｍｐｌｉｃａｎ［３］が挙げられる。これらのツールは、一般に、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ、ｂｗａ、または特別注文のアラインメントアルゴリズムを使用して、予想されるアンプリコン標的に対してそれぞれの配列リードをアラインメントさせることによって動作する。アルゴリズムは、可能なリード：標的アラインメントのリストを作成する。それぞれのアラインメントは、ヌクレオチドのマッチ、ミスマッチおよび欠損（ギャップ）の数に基づいてスコア化される。最良のスコアリングアラインメントが、下流のデータ処理のために使用される。
アラインメントアルゴリズムは、等しく評価されたクエリ：標的アラインメントを作成する場合があり、これは、クエリが挿入または欠失を含有する場合に起こる可能性が最も高い。等しく評価された選択肢から、アラインメント方法は、すべてを戻すか、または１つの選択肢を選択することになる。選択する場合、一部の方法は、無作為に選択を行う。選択を行うための良好な予測モデルまたは発見的規則のセットなしでは、アラインメントの選抜は、可変であり、これは、正しくないインデルのアノテーション、およびより低い精度の結果をもたらし得る。
生物学的情報に基づく、改善された精度を有する、二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるためのアルゴリズムおよびプロセスが必要とされている。
本明細書に記載の一実施形態は、改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるためのコンピューター実装プロセスであって、複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；試料配列データを分析およびマージし、マージされた配列を出力するステップ；一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有する標的部位配列を発展させ、標的予測結果を出力するステップ；マッパーを使用して、マージされた配列を標的部位配列または任意の標的予測結果によってビニングし、標的リードアラインメントを出力するステップ；ガイド配列および標準の酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来する酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ビニングされた標的リードアラインメントを標的部位と再アラインメントさせ、最終アラインメントを生成するステップ；最終アラインメントを分析し、標準の酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップをプロセッサー上で実行することを含む、プロセスである。一態様において、配列データは、細胞の集団または対象由来の配列を含む。別の態様において、酵素特異的切断部位は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数を含む。別の態様において、所定の配列距離ウィンドウは、酵素特異的であり、１ｎｔ～約１５ｎｔを含む。別の態様において、結果は、編集パーセント、挿入パーセント、欠失パーセントまたはそれらの組み合わせを示す。別の態様において、バリアント標的部位を同定する精度は、同等のプロセスと比較して、約１５～約２０％改善される。
本明細書に記載の別の実施形態は、生物学的配列をアラインメントさせるためのコンピューター実装プロセスであって、複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；特異的ヌクレアーゼ標的部位の酵素特異的位置特異的スコアリングに基づく行列を使用して、配列データを予測標的配列とアラインメントさせるステップ；アラインメント結果を表またはグラフィックとして出力するステップをプロセッサー上で実行することを含む、プロセスである。一態様において、配列データは、細胞の集団または対象由来の配列を含む。別の態様において、特異的ヌクレアーゼ標的配列は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数に対する標的部位を含む。別の態様において、行列は、位置特異的なギャップ開始および伸長ペナルティを使用する。
本明細書に記載の別の実施形態は、改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるための方法であって、対象由来の細胞の集団または組織からゲノムＤＮＡを抽出すること；マルチプレックスＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡを増幅して、標的部位配列について富化されたアンプリコンを生成すること；アンプリコンを配列決定し、試料配列データを得ること；その後、複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；試料配列データを分析およびマージし、マージされた配列を出力するステップ；一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有する標的部位配列を発展させ、標的予測結果を出力するステップ；マッパーを使用して、マージされた配列を標的部位配列または任意の標的予測結果によってビニングし、標的リードアラインメントを出力するステップ；ガイド配列および標準の酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来する酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ビニングされた標的リードアラインメントを標的部位と再アラインメントさせ、最終アラインメントを生成するステップ；最終アラインメントを分析し、標準の酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップをプロセッサー上で実行することを含む、方法である。一態様において、酵素特異的切断部位は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数を含む。別の態様において、所定の配列距離ウィンドウは、酵素特異的であり、１ｎｔ～約１５ｎｔを含む。別の態様において、結果は、編集パーセント、挿入パーセント、欠失パーセントまたはそれらの組み合わせを示す。別の態様において、バリアント標的部位を同定する精度は、同等のプロセスと比較して、約１５～約２０％改善される。
本特許または本出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴う本出願公開または本特許の写しは、申請および必要な料金の支払により、特許庁によって提供される。
ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓのための全体ワークフロー。編集されたゲノムＤＮＡは、標的化マルチプレックスＰＣＲを使用して、抽出および増幅されて、オンターゲット遺伝子座および予測オフターゲット遺伝子座について富化される。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑにおいて配列決定される。リードペアは、単一断片にマージされ（ＦＬＡＳＨ）、ゲノムにマッピングされ（ｍｉｎｉｍａｐ２）、それらのアラインメントによってビニングされて、アンプリコンの位置が予想される。それぞれのビン中のリードは、切断部位を見出し、位置特異的なギャップ開始／伸長ボーナス行列を作出した後、予想されるアンプリコン配列と再アラインメントされて、それぞれの酵素についての切断部位／予想されるインデルプロファイルにより近いインデルを優先的にアラインメントさせる（ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓコード＋ｐｓｎｗ）。切断部位の上流または下流のウィンドウと交わったインデルは、アノテーションされた。編集パーセントは、インデルを含有するリード／観察された総計の和である。 ＣＲＩＳＰＲＡｌｔＲａｔｉｏｎｓパイプラインの有向非巡回画像。破線のボックスは、パイプライン内のステップを表し、それぞれのステップは、１つまたは複数のソフトウェアツールを含んでいてもよい。線および矢印は、パイプラインを通る情報のフローを示す。２つの重要なステップは、ｍｉｎｉｍａｐ２＿ｏｒｉｇ＿ｒｅａｄｓ（オレンジ色）がｍｉｎｉｍａｐ２［４］を使用して、参照ゲノムに対して配列リードをアラインメントさせることであり、これは、任意のステップである。その後、ｍｉｎｉｍａｐ２は、それらの予想される標的領域に対して配列リードをアラインメントさせるために使用される。ＣＲＩＳＰｙ Ｐｙｔｈｏｎツール（内部開発）は、標的領域に対する切断部位再アラインメントを行うｐｓｎｗの特別注文で改変されたバージョンをコールすることによって、それらの標的領域に対して配列リードを再アラインメントさせる。ＣＲＩＳＰｙは、アラインメントされたリード中の検出されたインデルを特徴付けるのにも関与する。 参照標的にアラインメントされたＭｉｎＩＯＮ配列決定リードデータは、平滑末端挿入（ｂｌｕｎｔ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）を実証する。予想される範囲（灰色の強調）中のドロップは、大きな挿入を示す。灰色の強調の内側の端におけるミスマッチは、観察されたリードデータおよび予想される参照の間のミスマッチを示す。 相同組換え修復（ＨＤＲ）のためにＤＮＡオリゴを鋳型として使用する場合に起こり得る構造バリアントの種類を表す模式図の例。これらの例は、網羅的なものではない。模式図において、青色は、参照配列を表し、緑色は、相同アームを表し、オレンジ色は、所望の挿入配列を表す。（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、二本鎖および一本鎖鋳型オリゴの例である。（１）［完全な修復］ＤＳＢを含有する領域は、一本鎖または二本鎖鋳型オリゴが存在する場合でさえ、導入される任意の構造バリアントなしで、修復される。（２）［ＨＤＲ媒介修復］鋳型オリゴは、ＨＤＲを方向づけ、所望の挿入をもたらす。所望の挿入配列のみが、修復されたＤＮＡ中で観察される。（３）［非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復］鋳型オリゴは、ＤＳＢの後に、平滑末端で挿入される。（４）［重複挿入を伴うＮＨＥＪ修復］鋳型オリゴは、ＤＳＢの後に、複数回、平滑末端で挿入される。実施例３および４は、修復鋳型として使用される二本鎖オリゴにより起こる可能性が最も高く、ドナー配列中に存在する相同アームもゲノムに挿入される。 Ｃａｓ９データにおける編集事象の発生の位置。２７４のＣａｓ９のセットを使用するヌクレアーゼ切断部位からのインデル発生の位置は、ジャーカット細胞株における固有のゲノム標的を編集するのをガイドする。（Ａ）欠失および（Ｂ）挿入位置事象の両方とも、試料内のそれぞれのインデル事象の総％としてそれらを定量化することによって正規化された。＞５０リードおよび＞５％インデルを有する唯一の部位は分析のために使用され、低信頼度のシグナルを制限し、ノイズを除去した。インデルは、切断部位から２０ｂｐウィンドウ以内で定量化された。異常値は、ＤＳＢ活性によって引き起こされると思われない、ジャーカット細胞株中に存在する非参照インデルを有する部位であることが主に見出された。 Ｃａｓ１２ａデータにおける編集事象の発生の位置。１９９のＣａｓ１２ａのセットを使用するヌクレアーゼ切断部位からのインデル発生の位置は、ジャーカット細胞株における固有のゲノム標的を編集するのをガイドする。（Ａ）欠失および（Ｂ）挿入位置事象の両方とも、試料内のそれぞれのインデル事象の総％としてそれらを定量化することによって正規化された。＞５０リードおよび＞５％インデルを有する唯一の部位は分析のために使用され、低信頼度のシグナルのノイズを制限した。インデルは、切断部位から２０ｂｐウィンドウ以内で定量化された。異常値は、ＤＳＢ活性によって引き起こされると思われない、ジャーカット細胞株中に存在する非参照インデルを有する部位であることが主に見出された。 ヌクレアーゼ導入ＤＳＢの近くのギャップ開始／伸長ペナルティのベクトル。配列アラインメントにおいて切断部位の近くのインデルを正に重みを付けるために、我々は、可変のギャップ開始または伸長ペナルティを表す値の位置特異的な行列を使用し、ここで、アレイの長さは、標的（青色太線）中のそれぞれの核酸の整数位置に等しい。ベクトル値（赤色丸および青色ダイアモンド）は、ヌクレアーゼ切断部位（縦の黒色破線）との近接に基づいて変えられる。したがって、切断部位に最も近いインデルは、最も小さなギャップ開始または伸長ペナルティを有する。 真のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集事象を観察するための最適ウィンドウの選択。（Ａ）編集ウィンドウは、インデルを同定するために使用されるＣＲＩＳＰＲ切断部位の周囲のヌクレオチドの距離である。真および偽の編集事象は、それぞれ、（Ｂ）Ｃａｓ９（処理、対、対照のｎ＝２６３のペア）もしくは（Ｃ）Ｃａｓ１２ａ（処理、対、対照のｎ＝３８４のペア）について処理または未処理の細胞の標的化配列決定からのインデル％として計算された。最も真の編集事象は、Ｃａｓ９について４ｎｔのウィンドウ、Ｃａｓ１２ａについて７ｎｔのウィンドウで収集されるが、ウィンドウの拡張は、追加の偽の編集のみをさらに収集する。 観察された頻度による重複排除されたリードアラインメントのスクリーンショット。総領域範囲は、縦の灰色のバー（上側）の高さによって示され、リードは、横の着色されたバーである。より明るい色のリードは、より高い頻度で観察されたインデルを示す。横の細線は、欠失を示し、縦の紫色の「Ｉ」の記号は、挿入を示し、リード内の着色されたバーは、ミスマッチの塩基を示す。 ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓは、正しいインデルを確実に見出す。それぞれのバーは、正確に戻されたインデルのパーセンテージを報告する。１２，０６０の固有のインデル事象を表す合成的に作成されたデータを使用して、それぞれのサイズのビン（ｘ軸）および６０３の固有のアンプリコンの間で均一に分布した。エラーバーは、標的全体にわたる９５％の信頼区間を表す。 ＣＲＩＳＰＲＡｌｔＲａｔｉｏｎｓは、シミュレーションされた（Ａ）Ｃａｓ９または（Ｂ）Ｃａｓ１２ａ編集による６０３の合成標的における総編集％をより正確に報告する。ドットは、それぞれの標的部位において観察された編集パーセントを表し、横線は、作成された合成データ中のそれぞれの標的において導入されたインデルのパーセントを表す。ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ＰｏｏｌｅｄおよびＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ１Ｐｏｏｌｅｄは、（アンプリコンの正しくないドロップアウトを防止するために）除去された定量化のための必要な最小リード深度で、それぞれのパネルについて、デフォルトのパイプラインパラメータを使用して行われた。
本明細書に記載の一実施形態は、ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓと呼ばれる分析パイプラインである。図１～２を参照されたい。簡潔には、このパイプラインは、ＦＡＳＴＱファイルを取り込み、ＦＬＡＳＨを使用して、マージされたＲ１／Ｒ２コンセンサスを構築する。同時に、すべての予想されるオンターゲットの場所についての配列を記載する標的部位参照が構築される。任意選択で、相同組換え修復（ＨＤＲ）事象の予想される結果を含有する標的が構築される。次に、ｍｉｎｉｍａｐ２（元は、長いリード（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭｉｎＩＯＮによって作成されたもの）の迅速なアラインメントのために開発された）の使用により、マージされた配列リードが標的参照配列とアラインメントされる。次いで、それぞれの標的とアラインメントしているリードが、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアライナーの改変型の使用により、再アラインメントされる。改変されたアライナーにより、ＤＳＢ修復から生じる挿入および欠失の検出を改善することができる。ＤＳＢの場所の所定の距離内のすべての観察されたバリアントは、特徴付けられ定量化される。最後に、結果は、表およびグラフに要約される。さまざまな記載のプログラム、ツールおよびファイルタイプ（および下記に列挙されるもの）は、当業者によく知られており、容易にアクセス可能である。これらのプログラム、ツールおよびファイルタイプが、例示的なものであり、限定を意図するものではないことが理解されるべきである。他のツールおよびファイルタイプを、記載の処理および分析を実践するために使用することができるだろう。
この分析パイプラインにおいて、以前の方法に対する以下の改善が記載される。第１に、ｍｉｎｉｍａｐ２［４］の使用は、短いおよび長いリード配列の両方から作成されたリードのアラインメントを可能にする。第２に、相同組換え修復事象の予想される結果を構成することによって、ＨＤＲ事象を完全に特徴付ける（すなわち、正しく起こる）能力が改善される。第３に、Ｃａｓ特異的ボーナス行列を受け入れることができる改変されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアライナーの使用は、以前の方法に対して、顕著に改善されたインデルの特徴付け、および編集パーセント（％）の定量化を可能にする。第４に、導入された対立遺伝子バリアントのグラフィカルな視覚化が改善される。第５に、以前のツール［５］に記載の予測される修復事象は、観察された修復に対して比較され、修復に関与する分子経路が記載され得る。
一実施態様において、本明細書に記載のプロセスは、以下の有利な使用を有する：
・ＤＳＢから生じるインデルプロファイルの正確な特徴付け。
・ＤＳＢが修復された後にインデルを含有するリードの割合が、編集のパーセンテージを計算するために使用される。この測定基準（編集％）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集における使用のためのｇＲＮＡの有効性を決定するために使用される。
・生じるインデルの正確な特徴付けは、フレームシフトしている変異を含有する細胞の集団中の細胞の染色体のパーセンテージを同定する能力を同様に改善する。フレームシフトしている変異は、影響を受ける遺伝子によってコードされるタンパク質を改変する。
・挿入配列の正確な特徴付け。
・複数のｇＲＮＡ／Ｃａｓ９（すなわち、リボヌクレオタンパク質複合体）の送達または二重のガイド領域改変から生じる複数の変異の正確な特徴付け。
・ＭｉｎＩＯＮなどの長いリードプラットフォームにおいて配列決定されたインデルの分析。加えて、これは、ＤＳＢ修復後に起こる欠失事象の大きな（＞４００ｎｔ）挿入の両方の末端の段階的な特徴付けを可能にする。
・改善された結果の視覚化。
本明細書に記載の一実施形態は、改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるためのコンピューター実装プロセスであって、複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；試料配列データを分析およびマージし、マージされた配列を出力するステップ；一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有する標的部位配列を発展させ、標的予測結果を出力するステップ；マッパーを使用して、マージされた配列を標的部位配列または任意の標的予測結果によってビニングし、標的リードアラインメントを出力するステップ；ガイド配列および標準の酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来する酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ビニングされた標的リードアラインメントを標的部位と再アラインメントすし、最終アラインメントを生成するステップ；最終アラインメントを分析し、標準の酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップをプロセッサー上で実行することを含む、プロセスである。
一実施形態において、編集されたゲノムＤＮＡは、標的化マルチプレックスＰＣＲを使用して、抽出および増幅されて、オンターゲット遺伝子座および予測オフターゲット遺伝子座について富化される。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑにおいて配列決定される。リードペアは、単一断片にマージされ（ＦＬＡＳＨ）、ゲノムにマッピングされ（ｍｉｎｉｍａｐ２）、それらのアラインメントによってビニングされて、アンプリコンの位置が予想される。それぞれのビン中のリードは、切断部位を見出し、位置特異的なギャップ開始／伸長ボーナス行列を作出した後、予想されるアンプリコン配列と再アラインメントされて、それぞれの酵素についての切断部位／予想されるインデルプロファイルにより近いインデルを優先的にアラインメントさせる（ＣＲＩＳＰＡｌｔＲａｔｉｏｎｓコード＋ｐｓｎｗ）。切断部位の上流または下流のウィンドウと交わったインデルは、アノテーションされた。編集パーセントは、インデルを含有するリード／観察された総計の和である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプロセスは、短いおよび長いリード配列の両方から作成されたリードのアラインメントを可能にするｍｉｎｉｍａｐ２［４］を使用する。以前のツールは、典型的には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定装置によって作成されるデータなどの短いリード配列決定データのみを受け入れる。他のものは、長いリード配列決定データを使用して、大きな挿入または欠失を調べているが［６～８］、単独で公に利用可能なツールは存在しないと考えられる。長いリードデータの取り扱いは、部分的に、ｍｉｎｉｍａｐ２アライナーの使用によって可能である。例えば、アラインメントの結果が視覚化され得、これは、ＤＳＢ修復後のＤＮＡ中の平滑末端分子の挿入の同定を示す（図３）。別の実施形態は、小さなインデルが無視される以前に公開されたツール［７］と類似の方法を使用して、実際のインデルとノイズに由来するインデルの間をソートする。
別の実施形態において、ＨＤＲ事象の予想される結果を構築することによって、完全なＨＤＲ事象を特徴付ける能力が改善される。参照ファイルは、ＦＡＳＴＡフォーマットにおいて、それぞれの予想される配列標的、および改変された配列標的を同様に含有する。このファイルを構築することを目的とする第１のステップは、リードがそれぞれの予想される構造バリアントとアラインメントするのを可能にする参照配列インデックスを作出することを含む。例えば、ＤＳＢについて標的化される領域、およびＨＤＲを可能にする二本鎖ＤＮＡドナーオリゴを調べる場合、複数の異なる可能性がある生物学的修復の結果：完全な修復（図４－１）、ＨＤＲ媒介修復（図４－２）、ＮＨＥＪ修復（図４－３）、および重複挿入を伴うＮＨＥＪ修復（図４－４）がある。鋳型断片または三重鋳型挿入などの他の結果も可能である（示さない）。類似の参照ファイル構築手法が、ＵＤｉＴａＳ（商標）［９］などの他のツールによって使用されている。
別の実施形態において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの改変バージョンは、予想されるリードの標的に対してそのリードを再アラインメントさせるために使用される。本明細書に記載の方法は、インデルを含有するアラインメントの精度を増加させる（アラインメントのＣＩＧＡＲストリングにおけるアノテーションとして）。これは、以前の方法に対して、インデルの特徴付けおよび編集％の定量化を顕著に改善する。ｍｉｎｉｍａｐ２およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ手法などのＤＮＡ配列決定アライナーは、ギャップを開始し、伸長するための固定されたペナルティを使用して、インデルのアラインメントを検討する。この方法は、インデルとのアラインメントが、それらを予測ＤＳＢと重複または近くに位置させることが好都合であるように、位置特異的なギャップ開始および伸長ペナルティを使用して（「ｐｓｎｗ」と呼ばれるツールにおいて可能）、リードをそれらの標的と再アラインメントさせることによって、改善される。この位置特異的な行列は、編集するために使用される特異的なＣａｓ酵素の正確に特徴付けられたインデルのプロファイルを反映するセットである（図５～６）。したがって、インデルベースのアラインメントは、予測される標的切断部位で、またはその近くで、最も好都合である（可変スコアリング戦略；図７）。この方法は、インデル、特に、参照配列中の反復領域において生じるものの正確な再アラインメントを可能にする。この手法は、最も生物学的に可能性の高い結果を同定する能力を改善する。
最近開発されたツール（ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２［１１］）は、切断部位の詳しいアラインメント戦略を使用する。しかしながら、本明細書に記載のプロセスは、Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２ａ部位での実際の編集データによって調整され、Ｃ＋＋において実施されるアラインメントの間にフルギャップ開始／伸長行列を使用して、切断部位の詳しいアラインメント方法を実施する。対照的に、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２は、切断部位において単一のボーナスのみを可能にし、Ｐｙｔｈｏｎにおいて実施される方法を使用する。
別の実施形態において、本明細書に記載のプロセスは、ヌクレアーゼ切断部位の近くのインデル、ならびに切断部位または固定された距離内で交差するタグインデルを収集する。いくつかの公開されたアカウントは、１～２ｎｔの固定された距離を示唆するが、これらの選択を支持するデータは、限定されている。本明細書に記載の実施形態の開発において、切断部位の周囲の最適な距離（すなわち、ウィンドウサイズ）は、処理されたＣａｓ９－ＲＮＰおよび対形成された未処理対照試料のセットを使用して研究された。Ｃａｓ９について４ｎｔのウィンドウ、またはＣａｓ１２ａについて７ｎｔのウィンドウが、最も高い感受性を提供し、許容される特異性を提供したことが観察された（図４）。Ｃａｓ１２ａについてのより大きなウィンドウの要件は、作用機構に起因する可能性があり、Ｃａｓ１２ａは、５ｂｐ離れて２つの一本鎖の切断を生成することによって（「スティッキー」末端を残して）、二本鎖切断を実施する［１２］。したがって、本明細書に記載のプロセスは、標的ウィンドウサイズおよび酵素的作用機構に情報を与える生物学的データを有する他のヌクレアーゼ（例えば、ＣａｓＸ）［１３］に拡張され得る。
別の実施形態において、対立遺伝子バリアントのグラフィカルな視覚化が改善される。アラインメントステップの下流で、記載の方法に特有のいくつかの他の分析が行われる。改善された視覚化を作成するために、リードは、アラインメント後のＣＲＩＳＰＲ編集ウィンドウ内の同定されたインデル配列の同定に基づいて、重複排除される。重複排除されたリードは、ＢＡＭファイルに書き戻され、リードの元の集団内のそれぞれの重複排除されたリードの頻度が、関連ＢＡＭタグに書き込まれる。ファイルがインデックス化された後、重複排除されたリード中のインデルおよびそれらの関連する頻度が、一般に利用可能なＩＧＶツール［１０］を使用して、視覚化され得る（図９）。
別の実施形態において、以前のツール［５］に記載の予測される修復事象は、観察された修復に対して比較され、修復に関与する分子経路を決定するために使用され得る。本明細書に記載のシステムはまた、観察されたインデルプロファイルを予想されるインデルプロファイルに対して比較する能力を加え、これは、実験的な処理がＤＮＡ修復の細胞内機構を改変したかどうかについての迅速な識別を可能にする。
本明細書に記載のシステムおよび方法の実用性は、６０３のｇＲＮＡ：アンプリコンのペアの合成セットを作成することによって実証される。それぞれの標的で、４０００のリードペア（２×１５０ｂｐ）が、シミュレーションされたＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｖ３プラットフォームのエラープロファイルを用いて合成的に作成される。リードの半分では、ランダムなインデルが、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａについての観察された編集プロファイルから作成されたモデルに基づいて導入される（図４～５）。合成データは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲＡｌｔＲａｔｉｏｎｓシステム、ならびに以前に公開されたＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ１およびＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ツール［１１］を使用して分析される。本明細書に記載の方法を実施することによって、インデルを正しく特徴付ける能力が、約１５～２０％改善される（図１０）。本明細書に記載のアルゴリズムは、それが複数の同等のスコア化されたアラインメントが可能である標的における、最良のアラインメントの生物学的に情報に基づいた選択を提供するので、精度を増加させた。加えて、本明細書に記載の方法は、改変ＤＮＡ分子のパーセンテージをより正確に計算する（図１１）。本明細書に記載のプロセスおよび戦略は、ＤＳＢ修復後に導入されたインデルの特徴付けおよび定量化に対する重要な増強である。
本明細書に記載の別の実施形態は、生物学的配列をアラインメントさせるためのコンピューター実装プロセスであって、複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；特異的ヌクレアーゼ標的部位の酵素特異的位置特異的スコアリングに基づく行列を使用して、配列データを予測標的配列とアラインメントさせるステップ；アラインメント結果を表またはグラフィックとして出力するステップをプロセッサー上で実行することを含む、プロセスである。一態様において、配列データは、細胞の集団または対象由来の配列を含む。別の態様において、特異的ヌクレアーゼ標的配列は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数に対する標的部位を含む。別の態様において、行列は、位置特異的なギャップ開始および伸長ペナルティを使用する。
本明細書に記載の別の実施形態は、改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるための方法であって、対象由来の細胞の集団または組織からゲノムＤＮＡを抽出すること；マルチプレックスＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡを増幅して、標的部位配列について富化されたアンプリコンを生成すること；アンプリコンを配列決定し、試料配列データを得ること；その後、複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；試料配列データを分析およびマージし、マージされた配列を出力するステップ；一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有する標的部位配列を発展させ、標的予測結果を出力するステップ；マッパーを使用して、マージされた配列を標的部位配列または任意の標的予測結果によってビニングし、標的リードアラインメントを出力するステップ；ガイド配列および標準の酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来する酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ビニングされた標的リードアラインメントを標的部位と再アラインメントさせ、最終アラインメントを生成するステップ；最終アラインメントを分析し、標準の酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップをプロセッサー上で実行することを含む、方法である。
本明細書に記載のさまざまな構成要素およびプロセス、ならびに示されない構成要素またはプロセスの多くの異なる配置は、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、可能である。実施形態または態様が、さまざまなハードウェア、ソフトウェアもしくは電子的構成要素の組み合わせを含んでいてもよく、またはそうでなければ、それらによって実行されてもよいことが理解されるべきである。例えば、さまざまなマイクロプロセッサーおよび特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）が、各種の言語のソフトウェアと同様に、利用され得る。また、サーバーおよびさまざまなコンピューターデバイスが使用され得、１つまたは複数の処理ユニット、１つまたは複数のコンピューター可読媒体、１つまたは複数の入力／出力インターフェース、および構成要素を接続するさまざまな接続部（例えば、システム・バス）を含むことができる。
本明細書に記載の組成物、製剤、方法、プロセスおよび適用に対する適切な改変ならびに適応が、任意のその実施形態または態様の範囲から逸脱することなく、行われ得ることが、当業者には明らかであろう。提供される組成物および方法は、例示的なものであって、いずれかの特定の実施形態の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に開示されるすべてのさまざまな実施形態、態様および選択肢は、任意の変形または反復と組み合わせられ得る。本明細書に記載の方法およびプロセスの範囲は、本明細書に記載の実施形態、態様、選択肢、実施例および好適なもののすべての実際のまたは可能性がある組み合わせを含む。本明細書に記載の方法は、任意の構成要素もしくはステップを除外してもよく、本明細書に開示の任意の構成要素もしくはステップを置換してもよく、または本明細書のどこかに開示の任意の構成要素もしくはステップを含んでいてもよい。参照により組み込まれる特許または刊行物のいずれか中の任意の用語の意味が、本開示において使用される用語の意味と矛盾する場合、本開示における用語または表現の意味が支配する。さらにまた、本明細書は、単に例示的な実施形態を開示および記載する。本明細書において引用されたすべての特許および刊行物は、それらの特定の教示について本明細書に参照によって組み込まれる。
以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定および性質決定するためのコンピューター実装プロセスであって、
複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；
試料配列データを分析およびマージし、マージされた配列を出力するステップ；
一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有する標的部位配列を発展させ、標的予測結果を出力するステップ；
マッパーを使用して、マージされた配列を標的部位配列または任意の標的予測結果によってビニングし、標的リードアラインメントを出力するステップ；
ガイド配列および標準の酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来する酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ビニングされた標的リードアラインメントを標的部位と再アラインメントさせ、最終アラインメントを生成するステップ；
最終アラインメントを分析し、標準の酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；
最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップ
をプロセッサー上で実行することを含む、プロセス。
［請求項２］
配列データが、細胞の集団または対象由来の配列を含む、請求項１に記載のプロセス。
［請求項３］
酵素特異的切断部位が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載のプロセス。
［請求項４］
所定の配列距離ウィンドウが、酵素特異的であり、１ｎｔ～約１５ｎｔを含む、請求項１に記載のプロセス。
［請求項５］
結果が、編集パーセント、挿入パーセント、欠失パーセントまたはそれらの組み合わせを示す、請求項１に記載のプロセス。
［請求項６］
バリアント標的部位を同定する精度が、同等のプロセスと比較して、約１５～約２０％改善される、請求項１に記載のプロセス。
［請求項７］
生物学的配列をアラインメントさせるためのコンピューター実装プロセスであって、
複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；
特異的ヌクレアーゼ標的部位の酵素特異的位置特異的スコアリングに基づく行列を使用して、配列データを予測標的配列とアラインメントさせるステップ；
アラインメント結果を表またはグラフィックとして出力するステップ
をプロセッサー上で実行することを含む、プロセス。
［請求項８］
配列データが、細胞の集団または対象由来の配列を含む、請求項７に記載のプロセス。
［請求項９］
特異的ヌクレアーゼ標的配列が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数に対する標的部位を含む、請求項７に記載のプロセス。
［請求項１０］
行列が、位置特異的なギャップ開始および伸長ペナルティを使用する、請求項７に記載のプロセス。
［請求項１１］
改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定し特徴付けるための方法であって、
対象由来の細胞の集団または組織からゲノムＤＮＡを抽出すること；
マルチプレックスＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡを増幅して、標的部位配列について富化されたアンプリコンを生成すること；
アンプリコンを配列決定し、試料配列データを得ること；
その後、
複数の配列を含む試料配列データを受信するステップ；
試料配列データを分析およびマージし、マージされた配列を出力するステップ；
一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有する標的部位配列を発展させ、標的予測結果を出力するステップ；
マッパーを使用して、マージされた配列を標的部位配列または任意の標的予測結果によってビニングし、標的リードアラインメントを出力するステップ；
ガイド配列および標準の酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来する酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ビニングされた標的リードアラインメントを標的部位と再アラインメントさせ、最終アラインメントを生成するステップ；
最終アラインメントを分析し、標準の酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；
最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップ
をプロセッサー上で実行すること
を含む、方法。
［請求項１２］
酵素特異的切断部位が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載のプロセス。
［請求項１３］
所定の配列距離ウィンドウが、酵素特異的であり、１ｎｔ～約１５ｎｔを含む、請求項１に記載のプロセス。
［請求項１４］
結果が、編集パーセント、挿入パーセント、欠失パーセントまたはそれらの組み合わせを示す、請求項１に記載のプロセス。
［請求項１５］
バリアント標的部位を同定する精度が、同等のプロセスと比較して、約１５～約２０％改善される、請求項１に記載のプロセス。
参考文献
1.Pinello, L. et al., “Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso.” Nat Biotechnol. 34(7): 695-697 (2016).
2.Lindsay, H. et al., “CrispRVariants: precisely charting the mutation spectrum in genome engineering experiments,” Nat. Biotechnol. 34(7): 701-703 (2015).
3.Labun, K. et al., “Accurate analysis of genuine CRISPR editing events with ampliCan Kornel,” bioRxiv 249474 (2018); now published in Genome Research 29: 843-847 (2019)
4.Li, H., “Minimap2: Pairwise alignment for nucleotide sequences,” Bioinformatics 34(18): 3094-3100 (2018).
5.Shen, M. W. et al., “Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants,” Nature 563 (7733): 646-651 (2018).
6.Hendel, A. et al., “Quantifying genome-editing outcomes at endogenous loci with SMRT sequencing.” Cell Rep. 7(1): 293-305 (2014).
7.Iyer, S. et al., “Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break,” Nature 568 (7753): 561-565 (2019).
8.Vu, G. T. H. et al., “Endogenous sequence patterns predispose the repair modes of CRISPR/Cas9-induced DNA double-stranded breaks in Arabidopsis thaliana,” Plant J. 92(1): 57-67 (2017).
9.Giannoukos, G. et al., “UDiTaSTM, a genome editing detection method for indels and genome rearrangements,” BMC Genomics 19: 212 (2018).
10. Robinson, J., “Integrated genomics viewer,” Nat. Biotechnol. 29(1), 24-26 (2012).
11. Clement, K. et al., “Analysis and comparison of genome editing using CRISPResso2,” bioRxiv 1-20 (2018). Now published in Nat. Biotechnol. 37(3): 224-226 (2019)
12. Zetsche, B. et al., “Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System,” Cell 163(3): 759-771 (2015).
13. Liu, J. J. et al., “CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors,” Nature 566(7743): 218-223 (2019).
コンピュータコード
ｐｓｎｗを使用したアラインメント中にギャップ開始ボーナスの１Ｄスコアリング行列を作出するために使用されるコード例。
ｐｓｎｗを使用したアラインメント中にギャップ伸長ボーナスの１Ｄスコアリング行列を作出するために使用されるコード例。

Claims (8)

  1. 改善された精度で二本鎖ＤＮＡ切断修復部位を同定および性質決定するためのコンピューター実装プロセスであって、
    （ａ）複数の配列を含む標的部位配列について富化されたゲノム試料配列データを受信するステップ；
    （ｂ）標的部位配列について富化されたゲノム試料配列データをマージし、マージされた配列を出力するステップ；
    （ｃ）一本鎖または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドドナーが提供されると、修復事象の予測結果を含有するゲノムについて予測標的部位配列を生成し、予測標的部位配列を出力するステップ；
    （ｄ）マッパーを使用して、ゲノム試料配列データの基としたゲノムにマージされた配列をアラインメントさせることによってビニングし、ビニングされた標的リードアラインメントを出力するステップ；
    （ｅ）ガイド配列および標準のＣａｓ酵素特異的切断部位の位置に基づいて適用される生物学的データに由来するＣａｓ酵素特異的位置特異的スコアリング行列を使用して、ステップ（ｄ）由来のビニングされた標的リードアラインメントを、ステップ（ｃ）由来の予測標的部位配列と再アラインメントさせ、最終アラインメントを生成するステップ；
    （ｆ）最終アラインメントを分析し、標準のＣａｓ酵素特異的切断部位由来の所定の配列距離ウィンドウ内の変異を同定および定量化するステップ；ならびに
    （ｇ）最終アラインメント、分析および定量化の結果のデータを表またはグラフィックとして出力するステップ；
    をプロセッサー上で実行することを含む、プロセス。
  2. ゲノム試料配列データを受信するステップ（ａ）の前に以下のステップが実行される、請求項１に記載のプロセス：
    （ｉ）対象由来の細胞の集団または組織からゲノムＤＮＡを抽出すること；
    （ｉｉ）マルチプレックスＰＣＲを使用して編集されたゲノムＤＮＡを増幅して、標的部位配列について富化されたアンプリコンを生成すること；および
    （ｉｉｉ）アンプリコンを配列決定し、標的部位配列について富化されたゲノム試料配列データを得ること。
  3. ゲノム試料配列データが、細胞の集団または対象由来の配列を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
  4. Ｃａｓ酵素特異的切断部位のＣａｓ酵素が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａまたは他のＣａｓ酵素のうちの１つまたは複数を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。
  5. 所定の配列距離ウィンドウが、Ｃａｓ酵素特異的であり、１ｎｔ～１５ｎｔを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
  6. 結果が、編集パーセント、挿入パーセント、欠失パーセントまたはそれらの組み合わせを示す、請求項１～５のいずれか１項に記載のプロセス。
  7. Ｃａｓ酵素特異的位置特異的スコアリング行列が、位置特異的なギャップ開始および伸長ペナルティを使用する、請求項１～６のいずれか１項に記載のプロセス。
  8. バリアント標的部位を同定する精度が、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ１およびＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２プロセスを含む同等のプロセスと比較して、１５～２０％改善される、請求項１～７のいずれか１項に記載のプロセス。
JP2021577412A 2019-07-03 2020-07-02 Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化 Active JP7579817B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024188978A JP2025014002A (ja) 2019-07-03 2024-10-28 Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962870471P 2019-07-03 2019-07-03
US201962870426P 2019-07-03 2019-07-03
US62/870,426 2019-07-03
US62/870,471 2019-07-03
US201962952603P 2019-12-23 2019-12-23
US201962952598P 2019-12-23 2019-12-23
US62/952,603 2019-12-23
US62/952,598 2019-12-23
PCT/US2020/040621 WO2021003343A1 (en) 2019-07-03 2020-07-02 Identification, characterization, and quantitation of crispr-introduced double-stranded dna break repairs

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024188978A Division JP2025014002A (ja) 2019-07-03 2024-10-28 Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2022540792A JP2022540792A (ja) 2022-09-20
JPWO2021003343A5 JPWO2021003343A5 (ja) 2023-04-18
JP7579817B2 true JP7579817B2 (ja) 2024-11-08

Family

ID=74065411

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021577412A Active JP7579817B2 (ja) 2019-07-03 2020-07-02 Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化
JP2024188978A Pending JP2025014002A (ja) 2019-07-03 2024-10-28 Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024188978A Pending JP2025014002A (ja) 2019-07-03 2024-10-28 Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化

Country Status (7)

Country Link
US (2) US12254959B2 (ja)
EP (1) EP3994258A4 (ja)
JP (2) JP7579817B2 (ja)
AU (1) AU2020301025A1 (ja)
CA (1) CA3144106A1 (ja)
IL (1) IL289421A (ja)
WO (1) WO2021003343A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3154370A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Jessica WOODLEY Modified double-stranded donor templates
WO2023220701A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Integrated Dna Technologies, Inc. Use of unique molecular identifiers for improved accuracy of long read sequencing and characterization of crispr editing

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170053062A1 (en) 2014-01-27 2017-02-23 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
US20170211142A1 (en) 2015-10-22 2017-07-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US20180068062A1 (en) 2016-08-17 2018-03-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying novel gene editing elements
US20180163265A1 (en) 2014-12-19 2018-06-14 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
JP2018518183A (ja) 2015-06-18 2018-07-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新規ｃｒｉｓｐｒ酵素及び系
JP2019504646A (ja) 2016-02-11 2019-02-21 ホライズン・ディスカバリー・リミテッド 複製的トランスポゾン系

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9809904B2 (en) 2011-04-21 2017-11-07 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods for retrieval of sequence-verified DNA constructs
WO2014093330A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Clearfork Bioscience, Inc. Methods for targeted genomic analysis
AU2013381709A1 (en) 2013-03-15 2015-10-01 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
ES2888976T3 (es) 2014-06-23 2022-01-10 Massachusetts Gen Hospital Identificación no sesgada pangenómica de DSBs evaluada por secuenciación (GUIDE-Seq.)
WO2016030899A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treating amyotrophic lateral scleroses
US10640820B2 (en) 2014-11-20 2020-05-05 Children's Medical Center Corporation Methods relating to the detection of recurrent and non-specific double strand breaks in the genome
CN107208157B (zh) 2015-02-27 2022-04-05 贝克顿迪金森公司 用于条形编码核酸以用于测序的方法和组合物
WO2016205940A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Mcmaster University Biosensor comprising tandem reactions of structure switching, nucleolytic digestion and amplification of a nucleic acid assembly
CN107922949A (zh) 2015-08-31 2018-04-17 安捷伦科技有限公司 用于通过同源重组的基于crispr/cas的基因组编辑的化合物和方法
US20170081679A1 (en) 2015-09-22 2017-03-23 Jie Xu Methods of improving nuclease mediated homologous recombination
DK4144844T3 (da) 2015-10-12 2025-11-24 Dupont Us Holding Llc Beskyttede dna-templates til genmodificering og øget homolog rekombination i celler og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN108291253A (zh) 2015-11-25 2018-07-17 综合基因技术公司 用于变体检测的方法
JP2020510443A (ja) 2016-12-20 2020-04-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 細胞ゲノムにおける、相同組換え修復（ｈｄｒ）の効率を上昇させるための方法
US11981898B2 (en) 2017-06-16 2024-05-14 Applied Stemcell, Inc. Gene editing methods with increased knock-in efficiency
US20190062736A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Board Of Regents, The University Of Texas System In situ and in vivo analysis of chromatin interactions by biotinylated dcas9 protein
US20190119701A1 (en) 2017-09-08 2019-04-25 Life Technologies Corporation Methods for improved homologous recombination and compositions thereof
WO2019110067A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Aarhus Universitet Hybrid nanoparticle
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
CA3094303A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Tokyo Institute Of Technology Antisense oligonucleotide reduced in toxicity
WO2019246553A1 (en) * 2018-06-21 2019-12-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions & methods for monitoring dna repair
WO2020178772A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods of labeling nucleic acids and sequencing and analysis thereof
CA3154370A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Jessica WOODLEY Modified double-stranded donor templates

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170053062A1 (en) 2014-01-27 2017-02-23 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
US20180163265A1 (en) 2014-12-19 2018-06-14 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
JP2018518183A (ja) 2015-06-18 2018-07-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新規ｃｒｉｓｐｒ酵素及び系
US20170211142A1 (en) 2015-10-22 2017-07-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
JP2019504646A (ja) 2016-02-11 2019-02-21 ホライズン・ディスカバリー・リミテッド 複製的トランスポゾン系
US20180068062A1 (en) 2016-08-17 2018-03-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying novel gene editing elements

Also Published As

Publication number Publication date
US20210002700A1 (en) 2021-01-07
JP2022540792A (ja) 2022-09-20
JP2025014002A (ja) 2025-01-28
AU2020301025A1 (en) 2022-01-20
IL289421A (en) 2022-02-01
WO2021003343A1 (en) 2021-01-07
EP3994258A1 (en) 2022-05-11
EP3994258A4 (en) 2022-10-26
US20250218536A1 (en) 2025-07-03
CA3144106A1 (en) 2021-01-07
US12254959B2 (en) 2025-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Höijer et al. CRISPR-Cas9 induces large structural variants at on-target and off-target sites in vivo that segregate across generations
US12146195B2 (en) Methods for lung cancer detection
JP2025014002A (ja) Ｃｒｉｓｐｒで導入された二本鎖ｄｎａ切断修復の同定、特徴付けおよび定量化
EP3699292B1 (en) High-throughput genotyping by sequencing low amounts of genetic material
CA3105659A1 (en) Methods and reagents for characterizing genomic editing, clonal expansion, and associated applications
US12106825B2 (en) Computational modeling of loss of function based on allelic frequency
JP2022505050A (ja) プーリングを介した多数の試料の効率的な遺伝子型決定のための方法および試薬
US20180355380A1 (en) Methods and kits for quality control
Peterson et al. Whole genome analysis for 163 gRNAs in Cas9-edited mice reveals minimal off-target activity
Cai et al. Complex genomic patterns of abasic sites in mammalian DNA revealed by a high-resolution SSiNGLe-AP method
JP2024113001A (ja) デザイナヌクレアーゼを用いる修飾の特徴付け方法
JP7724785B2 (ja) 複雑なゲノム領域を解析するための方法およびシステム
Lamb et al. Complex mutation profiles in mismatch repair and ribonucleotide reductase mutants reveal novel repair substrate specificity of MutS homolog (MSH) complexes
US20230366020A1 (en) Use of unique molecular identifiers for improved accuracy of long read sequencing and characterization of crispr editing
US20240209442A1 (en) Methods and systems for analyzing complex genomic regions
Uppuluri et al. A long-read sequencing strategy with overlapping linkers on adjacent fragments (OLAF-Seq) for targeted resequencing and enrichment
Varapula et al. Recent Applications of CRISPR-Cas9 in Genome Mapping and Sequencing
Uppuluri et al. Linked-Pair Long-Read Sequencing Strategy for Targeted Resequencing and Enrichment
US9637779B2 (en) Antisense transcriptomes of cells
HK40004815B (en) Method and device for acquiring fetal free dna concentration
HK40004815A (en) Method and device for acquiring fetal free dna concentration
HK40050975A (en) Methods and reagents for characterizing genomic editing, clonal expansion, and associated applications

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230407

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230407

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240531

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240828

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240930

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20241028

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7579817

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150