JP7579071B2 - 没食子酸含有組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、プロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物の製造方法に関する。
没食子酸(分子式：C7H6O5、別名：3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸)は、還元力が強く、還元剤、写真の現像剤に用いられている。また、鉄塩の形成により着色する性質があるためインクの製造等にも用いられている。さらに、没食子酸からは没食子酸エステル等の数多くの誘導体が得られ、それらは食品分野、電子材料分野等の様々な分野において広く用いられている。
没食子酸の製造は、以前より、植物ヌルデの五倍子より抽出したタンニンをアルカリや酸、酵素を利用して加水分解することで製造されているが、残存タンニン含量が高い場合があること、製造コストが高いこと等の理由から、工業的に有利に製造する方法が検討されている。最近では、微生物を利用して、芳香族カルボン酸やグルコース等の安価な原料から没食子酸を製造する方法が報告されている（特許文献１、２）。
特許文献１では、微生物の培養により製造した没食子酸含有水溶液を一度冷却して粗結晶を得た後、再度その粗結晶を再溶解して結晶を析出させることにより低鉄含有量の没食子酸含有組成物を得ている。
また、特許文献２では、大腸菌によりグルコースを原料にして得た発酵培養液から、貧溶媒晶析によって没食子酸を得たことが報告されている。
また、特許文献２では、大腸菌によりグルコースを原料にして得た発酵培養液から、貧溶媒晶析によって没食子酸を得たことが報告されている。
しかしながら、微生物培養液中にはプロトカテク酸（分子式：C7H6O4）が副生成物として含まれ、晶析後の結晶中にもプロトカテク酸が混在することが判明した。
従って、本発明は、微生物培養液から、晶析操作によってプロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物を製造する方法を提供することに関する。
従って、本発明は、微生物培養液から、晶析操作によってプロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物を製造する方法を提供することに関する。
本発明者は、鋭意検討を行ったところ、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液を所定の条件下で冷却して結晶を析出させると、プロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物が得られることを見出した。
すなわち、本発明は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を、０．９℃/min以下で冷却晶析させる工程（Ａ）を含む、没食子酸含有組成物の製造方法を提供するものである。
本発明の方法によれば、微生物を利用して、プロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物を得ることができる。
〔没食子酸含有組成物の製造方法〕
本発明の没食子酸含有組成物の製造方法は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を、０．９℃/min以下で冷却晶析させる工程（Ａ）を含むものである。
本発明の没食子酸含有組成物の製造方法は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を、０．９℃/min以下で冷却晶析させる工程（Ａ）を含むものである。
（没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ））
本明細書において、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）は、微生物の培養液由来の水溶液であることが工業的生産性の観点から好ましい。
本明細書において、微生物は、野生株、突然変異株又は各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換、欠失等の変異が生じた変異株のいずれでもよく、また、公知の人為的な改変を付すことにより没食子酸産生能を付与したものであってもよい。
没食子酸を産生する能力を有する微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、シノリビゾウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属、ラルストニア(Ralstonia)属等の微生物が挙げられる。
本明細書において、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）は、微生物の培養液由来の水溶液であることが工業的生産性の観点から好ましい。
本明細書において、微生物は、野生株、突然変異株又は各種遺伝子操作によって、塩基配列の挿入、置換、欠失等の変異が生じた変異株のいずれでもよく、また、公知の人為的な改変を付すことにより没食子酸産生能を付与したものであってもよい。
没食子酸を産生する能力を有する微生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、シノリビゾウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属、ラルストニア(Ralstonia)属等の微生物が挙げられる。
没食子酸を産生する能力を有する微生物の培養に用いられる培地は、培養原料として該微生物が資化し得る炭素源、無機窒素源又は有機窒素源、その他必要な有機微量栄養源を含んでいることが好ましい。培養に用いられる培地として、例えば、CGXII培地やCGCF培地等が挙げられる（国際公開第２０１４／００７２７３号）。
炭素源としては、例えば、糖類（グルコース、スクロース、マルトース等）、有機酸、デキストラン、可溶性デンプン、メタノール等が挙げられる。
無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、トリプトン、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。
また、無機塩（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等）、ビタミン類、抗生物質（テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）等を含んでいてもよい。
微生物の培養は、該微生物が増殖し、没食子酸を産生することを可能にする条件であれば一般的な方法を適用することができる。例えば、前々培養、前培養ではLB培地やCGXII培地等が、本培養ではCGCF培地等を用いることができる。培養温度は、好ましくは２０℃以上４０℃以下であり、更に好ましくは３０℃以上３５℃以下である。
培養時の培養液のｐＨとしては、好ましくはｐＨ４以上ｐＨ８以下であり、更に好ましくはｐＨ５以上ｐＨ７以下である。
微生物の培地に対する接種量は、好ましくは０．１％（v/v）以上1５％(v/v)以下であり、更に好ましくは０．５％(v/v)以上５％(v/v)以下である。
微生物の培養期間は、微生物の増殖に応じて適宜設定することができるが、好ましくは０．５日以上１０日以下であり、更に好ましくは１日以上５日以下である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。例えば、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽であり、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよい。
炭素源としては、例えば、糖類（グルコース、スクロース、マルトース等）、有機酸、デキストラン、可溶性デンプン、メタノール等が挙げられる。
無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、トリプトン、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。
また、無機塩（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等）、ビタミン類、抗生物質（テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）等を含んでいてもよい。
微生物の培養は、該微生物が増殖し、没食子酸を産生することを可能にする条件であれば一般的な方法を適用することができる。例えば、前々培養、前培養ではLB培地やCGXII培地等が、本培養ではCGCF培地等を用いることができる。培養温度は、好ましくは２０℃以上４０℃以下であり、更に好ましくは３０℃以上３５℃以下である。
培養時の培養液のｐＨとしては、好ましくはｐＨ４以上ｐＨ８以下であり、更に好ましくはｐＨ５以上ｐＨ７以下である。
微生物の培地に対する接種量は、好ましくは０．１％（v/v）以上1５％(v/v)以下であり、更に好ましくは０．５％(v/v)以上５％(v/v)以下である。
微生物の培養期間は、微生物の増殖に応じて適宜設定することができるが、好ましくは０．５日以上１０日以下であり、更に好ましくは１日以上５日以下である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。例えば、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽であり、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよい。
このような培養により、没食子酸を含む微生物培養液が得られる。当該培養液には、没食子酸の他にプロトカテク酸が混在する。また、他の夾雑成分、微生物菌体、未利用の培養原料が混在するため、例えば、遠心分離、膜分離、吸着分離等の分離操作を行って、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液を取得する。
没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、培養工程の培養時間及び本発明の効果を享受し易い点から、好ましくは１×１０-4以上、より好ましくは１×１０-3以上、更に好ましくは３×１０-3以上であり、また、高い没食子酸含有率の没食子酸結晶を得る観点から、好ましくは３×１０-1以下、より好ましくは１．５×１０-1以下、更に好ましくは１×１０-1以下、更に好ましくは２×１０-2以下である。そして、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、好ましくは１×１０-4以上３×１０-1以下、より好ましくは１×１０-3以上１．５×１０-1以下、更に好ましくは３×１０-3以上１．５×１０-1以下、更に好ましくは３×１０-3以上２×１０-2以下である。
没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、培養工程の培養時間及び本発明の効果を享受し易い点から、好ましくは１×１０-4以上、より好ましくは１×１０-3以上、更に好ましくは３×１０-3以上であり、また、高い没食子酸含有率の没食子酸結晶を得る観点から、好ましくは３×１０-1以下、より好ましくは１．５×１０-1以下、更に好ましくは１×１０-1以下、更に好ましくは２×１０-2以下である。そして、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、好ましくは１×１０-4以上３×１０-1以下、より好ましくは１×１０-3以上１．５×１０-1以下、更に好ましくは３×１０-3以上１．５×１０-1以下、更に好ましくは３×１０-3以上２×１０-2以下である。
また、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）における没食子酸の含有量は没食子酸の飽和溶解度以下であれば良く、生産性の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは２質量％以上、更に好ましくは２．５質量％以上である。また、スラリーの流動性等の観点から、好ましくは１５質量％以下、より好ましくは１２質量％以下、更に好ましくは１１質量％以下である。そして、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）における没食子酸の含有量は、好ましくは１質量％以上１５質量％以下、より好ましくは２質量％以上１２質量％以下、更に好ましくは２．５質量％以上１１質量％以下である。
また、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）におけるプロトカテク酸の含有量は、プロトカテク酸/没食子酸比の低い没食子酸含有組成物を得る観点から、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．９質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。また、培養工程での反応時間の観点から、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．０００５質量％以上、更に好ましくは０．００１質量％以上である。そして、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）におけるプロトカテク酸の含有量は、好ましくは０．０００１質量％以上１質量％以下、より好ましくは０．０００５質量％以上０．９質量％以下、更に好ましくは０．００１質量％以上０．８質量％以下である。
（冷却晶析）
没食子酸含有組成物の析出は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を冷却することで行うことができる。本発明では、当該水溶液（ａ）を、冷却開始温度から冷却終了温度までの平均冷却速度が０．９℃/min以下の条件で冷却する。
没食子酸含有組成物の析出は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を冷却することで行うことができる。本発明では、当該水溶液（ａ）を、冷却開始温度から冷却終了温度までの平均冷却速度が０．９℃/min以下の条件で冷却する。
（平均冷却速度）
本明細書において、平均冷却速度は、冷却開始温度と冷却終了温度の差（℃）を、冷却開始温度から冷却終了温度に至るまでに要した時間（min）で割ることで定義される。
平均冷却速度は、結晶へのプロトカテク酸の混在を抑えて、プロトカテク酸／没食子酸比の低い没食子酸含有組成物を得る観点から、０．９℃／min以下であって、好ましくは０．５℃／min以下、より好ましくは０．３℃／min以下、更に好ましくは０．１℃／min以下であり、また、サイクルタイムの観点から、好ましくは０．００５℃／min以上、より好ましくは０．０１℃／min以上、更に好ましくは０．０２℃／min以上である。そして、平均冷却速度は、０．９℃／min以下であって、好ましくは０．００５℃／min以上０．５℃／min以下、より好ましくは０．０１℃／min以上０．３℃／min以下、更に好ましくは０．０２℃／min以上０．１℃／min以下である。
本明細書において、平均冷却速度は、冷却開始温度と冷却終了温度の差（℃）を、冷却開始温度から冷却終了温度に至るまでに要した時間（min）で割ることで定義される。
平均冷却速度は、結晶へのプロトカテク酸の混在を抑えて、プロトカテク酸／没食子酸比の低い没食子酸含有組成物を得る観点から、０．９℃／min以下であって、好ましくは０．５℃／min以下、より好ましくは０．３℃／min以下、更に好ましくは０．１℃／min以下であり、また、サイクルタイムの観点から、好ましくは０．００５℃／min以上、より好ましくは０．０１℃／min以上、更に好ましくは０．０２℃／min以上である。そして、平均冷却速度は、０．９℃／min以下であって、好ましくは０．００５℃／min以上０．５℃／min以下、より好ましくは０．０１℃／min以上０．３℃／min以下、更に好ましくは０．０２℃／min以上０．１℃／min以下である。
（水溶液（ａ）を昇温する工程（Ｐ１））
没食子酸は温度が高い場合に溶解度が高い性質を有するため、本発明では、冷却前に没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を昇温する工程（Ｐ１）により、溶解している没食子酸濃度を高めてから冷却を行うのが好ましい。
昇温温度、すなわち冷却前の没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）の温度（冷却を開始する温度）は、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上、更に好ましくは８０℃以上であり、また、水の蒸発の観点から、好ましくは１００℃以下、より好ましくは９０℃以下、更に好ましくは８５℃以下である。そして、昇温温度は、好ましくは６０℃以上１００℃以下、より好ましくは７０℃以上９０℃以下、更に好ましくは８０℃以上８５℃以下である。
没食子酸は温度が高い場合に溶解度が高い性質を有するため、本発明では、冷却前に没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を昇温する工程（Ｐ１）により、溶解している没食子酸濃度を高めてから冷却を行うのが好ましい。
昇温温度、すなわち冷却前の没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）の温度（冷却を開始する温度）は、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上、更に好ましくは８０℃以上であり、また、水の蒸発の観点から、好ましくは１００℃以下、より好ましくは９０℃以下、更に好ましくは８５℃以下である。そして、昇温温度は、好ましくは６０℃以上１００℃以下、より好ましくは７０℃以上９０℃以下、更に好ましくは８０℃以上８５℃以下である。
（冷却温度）
冷却終了温度は、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３０℃以下であり、また、水の凝固の観点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは５℃以上、更に好ましくは１０℃以上である。そして、冷却終了温度は、好ましくは０℃以上５０℃以下、より好ましくは５℃以上４０℃以下、更に好ましくは１０℃以上３０℃以下である。
冷却終了温度は、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３０℃以下であり、また、水の凝固の観点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは５℃以上、更に好ましくは１０℃以上である。そして、冷却終了温度は、好ましくは０℃以上５０℃以下、より好ましくは５℃以上４０℃以下、更に好ましくは１０℃以上３０℃以下である。
（晶析装置）
没食子酸含有組成物の析出は、撹拌翼を有する反応槽を用いて、撹拌しながら行うことが好ましい。撹拌翼は、いずれの形状でもかまわないが、特に結晶の混合を良好にするため、パドル翼、タービン翼、プロペラ翼、アンカー翼、大翼径パドル翼、マックスブレンド翼であることが好ましい。
撹拌の周速は、スラリーの固結を防止する観点から、好ましくは０．２m/s以上、より好ましくは０．３m/s以上、更に好ましくは０．５m/s以上であり、また、大粒径の没食子酸含有組成物を均一に晶析させる観点から、好ましくは１０m/s以下、より好ましくは５m/s以下、更に好ましくは３m/s以下である。
没食子酸含有組成物の析出は、撹拌翼を有する反応槽を用いて、撹拌しながら行うことが好ましい。撹拌翼は、いずれの形状でもかまわないが、特に結晶の混合を良好にするため、パドル翼、タービン翼、プロペラ翼、アンカー翼、大翼径パドル翼、マックスブレンド翼であることが好ましい。
撹拌の周速は、スラリーの固結を防止する観点から、好ましくは０．２m/s以上、より好ましくは０．３m/s以上、更に好ましくは０．５m/s以上であり、また、大粒径の没食子酸含有組成物を均一に晶析させる観点から、好ましくは１０m/s以下、より好ましくは５m/s以下、更に好ましくは３m/s以下である。
（水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程（Ｐ２））
本発明では、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、冷却前に没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程（Ｐ２）を行うことが好ましい。
没食子酸含有組成物を析出させる際の没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）のｐＨは、特に制限されないが、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくはｐＨ４．５以下、より好ましくはｐＨ４．０以下、更に好ましくはｐＨ３．５以下であり、また、装置腐食の観点から、好ましくはｐＨ１．５以上、より好ましくはｐＨ２．０以上、更に好ましくはｐＨ２．５以上である。そして、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）のｐＨは、好ましくはｐＨ１．５以上ｐＨ４．５以下、より好ましくはｐＨ２．０以上ｐＨ４．０以下、更に好ましくはｐＨ２．５以上ｐＨ３．５以下である。
水溶液のｐＨの調整には、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸を用いることができる。
本発明では、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を昇温する工程（Ｐ１）、前記水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程（Ｐ２）、前記水溶液（ａ）を、０．９℃/min以下で冷却晶析させる工程（Ａ）をこの順で行うことが、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から好ましい。
本発明では、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、冷却前に没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程（Ｐ２）を行うことが好ましい。
没食子酸含有組成物を析出させる際の没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）のｐＨは、特に制限されないが、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくはｐＨ４．５以下、より好ましくはｐＨ４．０以下、更に好ましくはｐＨ３．５以下であり、また、装置腐食の観点から、好ましくはｐＨ１．５以上、より好ましくはｐＨ２．０以上、更に好ましくはｐＨ２．５以上である。そして、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）のｐＨは、好ましくはｐＨ１．５以上ｐＨ４．５以下、より好ましくはｐＨ２．０以上ｐＨ４．０以下、更に好ましくはｐＨ２．５以上ｐＨ３．５以下である。
水溶液のｐＨの調整には、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸を用いることができる。
本発明では、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を昇温する工程（Ｐ１）、前記水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程（Ｐ２）、前記水溶液（ａ）を、０．９℃/min以下で冷却晶析させる工程（Ａ）をこの順で行うことが、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から好ましい。
（没食子酸含有組成物の分取、洗浄）
冷却により析出した没食子酸含有組成物は、回分式遠心濾過、連続式遠心濾過、フィルタープレス等の固液分離操作により分取することができる。固液分離操作の際、必要に応じて没食子酸含有組成物の洗浄を行ってもよい。洗浄に使用する溶媒としては、例えば、水、エタノール、アセトン、トルエン等が挙げられる。分取した没食子酸含有組成物の体積に対する溶媒の体積の比は、不純物の少ない没食子酸含有組成物を得る観点から、好ましくは１．０以上、より好ましくは２．０以上、更に好ましくは３．０以上であり、また、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくは５．０以下、より好ましくは４．５以下、更に好ましくは３．５以下である。
冷却により析出した没食子酸含有組成物は、回分式遠心濾過、連続式遠心濾過、フィルタープレス等の固液分離操作により分取することができる。固液分離操作の際、必要に応じて没食子酸含有組成物の洗浄を行ってもよい。洗浄に使用する溶媒としては、例えば、水、エタノール、アセトン、トルエン等が挙げられる。分取した没食子酸含有組成物の体積に対する溶媒の体積の比は、不純物の少ない没食子酸含有組成物を得る観点から、好ましくは１．０以上、より好ましくは２．０以上、更に好ましくは３．０以上であり、また、没食子酸含有組成物の収率を高める観点から、好ましくは５．０以下、より好ましくは４．５以下、更に好ましくは３．５以下である。
（没食子酸含有組成物の乾燥）
没食子酸含有組成物の乾燥方法は、水分を除去することができれば特に制限されないが、例えば、棚段乾燥機、コニカルドライヤー、パドルドライヤー、ナウターミキサー、流動層乾燥機、真空撹拌乾燥機、ディスクドライヤー等の通常の乾燥機を使用することができる。没食子酸含有組成物の着色を抑制する観点から、好ましくは真空撹拌乾燥である。
乾燥温度は、好ましくは－３０℃以上、より好ましくは－２０℃以上、更に好ましくは－１０℃以上であり、また、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、更に好ましくは７０℃以下である。
なお、乾燥後の没食子酸含有組成物は必要に応じて、篩を通す等の処理を行ってもよい。
没食子酸含有組成物の乾燥方法は、水分を除去することができれば特に制限されないが、例えば、棚段乾燥機、コニカルドライヤー、パドルドライヤー、ナウターミキサー、流動層乾燥機、真空撹拌乾燥機、ディスクドライヤー等の通常の乾燥機を使用することができる。没食子酸含有組成物の着色を抑制する観点から、好ましくは真空撹拌乾燥である。
乾燥温度は、好ましくは－３０℃以上、より好ましくは－２０℃以上、更に好ましくは－１０℃以上であり、また、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、更に好ましくは７０℃以下である。
なお、乾燥後の没食子酸含有組成物は必要に応じて、篩を通す等の処理を行ってもよい。
〔没食子酸含有組成物〕
本発明方法により得られる没食子酸含有組成物は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）におけるプロトカテク酸含有率よりプロトカテク酸の含有率が低い。没食子酸含有組成物における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、没食子酸含有組成物の利用性の観点から、好ましくは０．０５以下であり、より好ましくは０．０３以下、更に好ましくは０．０１以下である。
また、プロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物は、プロトカテク酸を含有しない没食子酸と比較して結晶が針状化することから溶解性が向上する。没食子酸含有組成物における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、没食子酸含有組成物の溶解性の観点から、好ましくは０．００１以上であり、より好ましくは０．００３以上である。そして、没食子酸含有組成物における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、好ましくは０．００１以上０．０５以下であり、より好ましくは０．００３以上０．０３以下、更に好ましくは０．００３以上０．０１以下である。
本発明方法により得られる没食子酸含有組成物は、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）におけるプロトカテク酸含有率よりプロトカテク酸の含有率が低い。没食子酸含有組成物における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、没食子酸含有組成物の利用性の観点から、好ましくは０．０５以下であり、より好ましくは０．０３以下、更に好ましくは０．０１以下である。
また、プロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物は、プロトカテク酸を含有しない没食子酸と比較して結晶が針状化することから溶解性が向上する。没食子酸含有組成物における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、没食子酸含有組成物の溶解性の観点から、好ましくは０．００１以上であり、より好ましくは０．００３以上である。そして、没食子酸含有組成物における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸の含有量／没食子酸の含有量〕は、好ましくは０．００１以上０．０５以下であり、より好ましくは０．００３以上０．０３以下、更に好ましくは０．００３以上０．０１以下である。
没食子酸含有組成物の平均結晶粒径は、没食子酸含有組成物の溶解性の観点から、短径が好ましくは８μｍ以下であり、より好ましくは６μｍ以下であり、更に好ましくは４μｍ以下である。本明細書において、結晶観察には位相差顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ８０ｉ、ニコン社製）を使用し、結晶短径の測定には画像統合ソフトウェアＮＩＳ－ＥｌｅｍｅｎｔｓＤを使用する。
プロトカテク酸低含有率の没食子酸含有組成物は、それ自体の使用の他、各種誘導体を製造するための原料として有用である。
［没食子酸及びプロトカテク酸の含有量の測定法］
測定対象の試料を乾燥し、乾燥した試料１５ｍｇを０．０８５Ｎの硫酸水溶液５０ｍＬに溶解させ、液体クロマトグラフィーにて各成分の濃度の定量を行った。また培養液中の没食子酸及びプロトカテク酸は０．０８５Ｎの硫酸水溶液で２００倍に希釈してから液体クロマトグラフィーで定量を行った。
（分析条件）
液体クロマトグラフィーの分析条件は、カラム:L-column ODS、溶離液Ａ：０．１Ｍ KH2PO4・０．１％(v/v)H3PO4水溶液、溶離液Ｂ：７０％(v/v)メタノール水溶液、溶離液切り替え：５－２０minにＡ液/Ｂ液=１００／０から０／１００にグラジェントをかけて分離、検出器：DAD、カラム温度：４０℃、注入液量：５μLである。
測定対象の試料を乾燥し、乾燥した試料１５ｍｇを０．０８５Ｎの硫酸水溶液５０ｍＬに溶解させ、液体クロマトグラフィーにて各成分の濃度の定量を行った。また培養液中の没食子酸及びプロトカテク酸は０．０８５Ｎの硫酸水溶液で２００倍に希釈してから液体クロマトグラフィーで定量を行った。
（分析条件）
液体クロマトグラフィーの分析条件は、カラム:L-column ODS、溶離液Ａ：０．１Ｍ KH2PO4・０．１％(v/v)H3PO4水溶液、溶離液Ｂ：７０％(v/v)メタノール水溶液、溶離液切り替え：５－２０minにＡ液/Ｂ液=１００／０から０／１００にグラジェントをかけて分離、検出器：DAD、カラム温度：４０℃、注入液量：５μLである。
［ｐＨの測定法］
ｐＨは、７０℃の水溶液（原液）を堀場製作所製F-50を用いて測定した。
ｐＨは、７０℃の水溶液（原液）を堀場製作所製F-50を用いて測定した。
[比較例１]
（没食子酸生産菌の構築）
没食子酸の前駆体であるプロトカテク酸の生産菌であるＮＳＨΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR_Ptu-tkt株（特許第６３２２５７６号）に、エレクトロポレーションによる形質転換を用いて、ＨＦＭ１４５＿Ｌ２００Ｖ＿Ｙ３８５Ｆ（特許第５１４２２６８号）が発現するCorynebacterium glutamicumで機能するプラスミドを導入することで、没食子酸を生産するCorynebacterium glutamicum ＴＹ１０３０株を得た。
（培養方法）
菌体としてCorynebacterium glutamicum ＴＹ１０３０株を用いた。
１０Ｌの培地（下記記載）を３０Ｌ空気撹拌槽に仕込み、ＯＤ６００が２．５となるよう菌体を植菌した。培養は３０Ｌ通気撹拌槽（三ツワフロンテック）を用い、撹拌速度は１００～６５０r/min、通気量は３～３０Ｌ－Air/minの範囲で制御した。糖フィードは６０％（w/w）グルコース水溶液を８ｋｇ調製し、培養開始後５時間より２００ｇ－溶液重量／ｈで行った。ｐＨは１４％アンモニア水により６．５に制御した。培養は３２℃、０．０４ＭＰａの条件で２日間行った。
（培地）
２，５％（w/v） グルコース
１％（w/v） 硫酸アンモニウム
０．５％（w/v） コーンスティープリカー
０．１％（w/v） リン酸水素二カリウム
０．１％（w/v） リン酸二水素カリウム
０．０１２％（w/v） 無水クエン酸
０．０１４４％（w/v） 安息香酸ナトリウム
０．０２５％（w/v） 硫酸マグネシウム
０．２５％（w/v） 消泡剤Ｎｏ．１（花王）
０．００５ ％（w/v） カナマイシン硫酸塩
（没食子酸生産菌の構築）
没食子酸の前駆体であるプロトカテク酸の生産菌であるＮＳＨΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR_Ptu-tkt株（特許第６３２２５７６号）に、エレクトロポレーションによる形質転換を用いて、ＨＦＭ１４５＿Ｌ２００Ｖ＿Ｙ３８５Ｆ（特許第５１４２２６８号）が発現するCorynebacterium glutamicumで機能するプラスミドを導入することで、没食子酸を生産するCorynebacterium glutamicum ＴＹ１０３０株を得た。
（培養方法）
菌体としてCorynebacterium glutamicum ＴＹ１０３０株を用いた。
１０Ｌの培地（下記記載）を３０Ｌ空気撹拌槽に仕込み、ＯＤ６００が２．５となるよう菌体を植菌した。培養は３０Ｌ通気撹拌槽（三ツワフロンテック）を用い、撹拌速度は１００～６５０r/min、通気量は３～３０Ｌ－Air/minの範囲で制御した。糖フィードは６０％（w/w）グルコース水溶液を８ｋｇ調製し、培養開始後５時間より２００ｇ－溶液重量／ｈで行った。ｐＨは１４％アンモニア水により６．５に制御した。培養は３２℃、０．０４ＭＰａの条件で２日間行った。
（培地）
２，５％（w/v） グルコース
１％（w/v） 硫酸アンモニウム
０．５％（w/v） コーンスティープリカー
０．１％（w/v） リン酸水素二カリウム
０．１％（w/v） リン酸二水素カリウム
０．０１２％（w/v） 無水クエン酸
０．０１４４％（w/v） 安息香酸ナトリウム
０．０２５％（w/v） 硫酸マグネシウム
０．２５％（w/v） 消泡剤Ｎｏ．１（花王）
０．００５ ％（w/v） カナマイシン硫酸塩
培養後、濃硫酸で培養液のｐＨを４．０に調整し、遠心分離を行うことで菌体と培養液を分離した。得られた培養液は０．２μｍのメンブレンフィルターを通過させて夾雑成分の分離を行い、水溶液を得た。得られた水溶液中の没食子酸（GAL）濃度は８１．３ｇ／Ｌ、プロトカテク酸（PCA）濃度は６．８ｇ／Ｌであった。当該水溶液における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０８４であった。
没食子酸含有組成物の析出は、翼径１４ｃｍのパドル翼を有する内容積３０００ｍＬのジャケット式反応槽にて、撹拌速度１４０r/minで実施した。
先ず、前述の方法で得た水溶液２２５０ｇを７０℃に昇温した。続いて、６０％硫酸水溶液を使用してｐＨを２．６に調整した。次いで、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が３．０℃/minとなるように水溶液を１５℃に冷却することで結晶を析出させた。
得られた懸濁液を吸引ろ過し、得られたケーク１２５ｍＬに対し５００ｍＬの蒸留水で洗浄後、一晩凍結乾燥することで没食子酸含有組成物を得た。
没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０６７であった。
先ず、前述の方法で得た水溶液２２５０ｇを７０℃に昇温した。続いて、６０％硫酸水溶液を使用してｐＨを２．６に調整した。次いで、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が３．０℃/minとなるように水溶液を１５℃に冷却することで結晶を析出させた。
得られた懸濁液を吸引ろ過し、得られたケーク１２５ｍＬに対し５００ｍＬの蒸留水で洗浄後、一晩凍結乾燥することで没食子酸含有組成物を得た。
没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０６７であった。
[実施例１]
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．３℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０２６であった。
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．３℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０２６であった。
[実施例２]
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．０４℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０１６であった。
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．０４℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０１６であった。
[実施例３]
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．０２℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
このようにして得た没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０２０であった。
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．０２℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
このようにして得た没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０２０であった。
[実施例４]
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．９℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
このようにして得た没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０３８であった。
比較例１において、７０℃から１５℃までの平均冷却速度が０．９℃/minとなるように冷却した以外は比較例１と同様の操作を行った。
このようにして得た没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０３８であった。
結果を表１に示す。
［比較例２］
マイティバイアルNo.8に水と没食子酸試薬（没食子酸一水和物、富士フィルム和光純薬社製）を加え、７０℃にて没食子酸を完全溶解した。得られた水溶液中の没食子酸濃度は７５．５ｇ／Ｌであった。当該水溶液における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０００であった。
マイティバイアルNo.8に水と没食子酸試薬（没食子酸一水和物、富士フィルム和光純薬社製）を加え、７０℃にて没食子酸を完全溶解した。得られた水溶液中の没食子酸濃度は７５．５ｇ／Ｌであった。当該水溶液における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０００であった。
没食子酸含有組成物の析出は、温度制御可能な恒温槽にて、静置条件で実施した。
７０℃から２０℃までの平均冷却速度が０．３℃/minとなるように水溶液を２０℃に冷却することで結晶を析出させた。
得られた懸濁液は０．２μｍのメンブレンフィルターを通過させて結晶成分の分離を行い、得られたろ液における没食子酸とプロトカテク酸の含有量を測定した。当該水溶液における没食子酸とプロトカテク酸の含有量から算出した、没食子酸含有組成物結晶における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０００であった。平均結晶短径は１４．０μｍであった。
７０℃から２０℃までの平均冷却速度が０．３℃/minとなるように水溶液を２０℃に冷却することで結晶を析出させた。
得られた懸濁液は０．２μｍのメンブレンフィルターを通過させて結晶成分の分離を行い、得られたろ液における没食子酸とプロトカテク酸の含有量を測定した。当該水溶液における没食子酸とプロトカテク酸の含有量から算出した、没食子酸含有組成物結晶における没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０００であった。平均結晶短径は１４．０μｍであった。
［実施例５］
比較例２において、没食子酸試薬に加えてプロトカテク酸試薬（プロトカテク酸、富士フィルム和光純薬社製）を加えた以外は比較例２と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７４．３ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は０．５ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．００７であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．００４であった。平均結晶短径は３．３μｍであった。
比較例２において、没食子酸試薬に加えてプロトカテク酸試薬（プロトカテク酸、富士フィルム和光純薬社製）を加えた以外は比較例２と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７４．３ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は０．５ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．００７であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．００４であった。平均結晶短径は３．３μｍであった。
［実施例６］
実施例５において、加えるプロトカテク酸試薬の量をかえた以外は実施例５と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７１．２ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は１．０ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０１４であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．００７であった。平均結晶短径は５．２μｍであった。
実施例５において、加えるプロトカテク酸試薬の量をかえた以外は実施例５と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７１．２ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は１．０ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０１４であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．００７であった。平均結晶短径は５．２μｍであった。
［実施例７］
実施例５において、加えるプロトカテク酸試薬の量をかえた以外は実施例５と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７５．３ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は３．２ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０４２であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０２３であった。平均結晶短径は１０．９μｍであった。
実施例５において、加えるプロトカテク酸試薬の量をかえた以外は実施例５と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７５．３ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は３．２ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０４２であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０２３であった。平均結晶短径は１０．９μｍであった。
［実施例８］
実施例５において、加えるプロトカテク酸試薬の量をかえた以外は実施例５と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７５．６ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は５．４ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０７１であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０３８であった。平均結晶短径は１０．２μｍであった。
実施例５において、加えるプロトカテク酸試薬の量をかえた以外は実施例５と同様の操作を行った。
得られた水溶液中の没食子酸濃度は７５．６ｇ／Ｌ、プロトカテク酸濃度は５．４ｇ／Ｌで、没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０７１であった。
また、没食子酸含有組成物の没食子酸の含有量に対するプロトカテク酸の含有量の質量比〔プロトカテク酸／没食子酸〕は０．０３８であった。平均結晶短径は１０．２μｍであった。
表１及び表２より明らかなように、没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液を平均冷却速度が０．９℃/min以下という条件で冷却することで、水溶液に比べてプロトカテク酸が低含有率の没食子酸含有組成物が得られることが確認された。また、当該プロトカテク酸が低含有率の没食子酸含有組成物は、プロトカテク酸を含有しない没食子酸と比べて、結晶が針状化することが確認された。
Claims (13)
- 没食子酸及びプロトカテク酸を含む水溶液（ａ）を冷却晶析させる工程（Ａ）を含む、没食子酸含有組成物の製造方法であって、前記水溶液（ａ）の冷却を開始する温度が６０℃以上１００℃以下であり、ｐＨが４．５以下である前記水溶液（ａ）を０．９℃/min以下で冷却晶析させる、製造方法。
- 没食子酸含有組成物における没食子酸含有量に対するプロトカテク酸含有量の質量比が０．０５以下である請求項１記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 没食子酸含有組成物における没食子酸含有量に対するプロトカテク酸含有量の質量比が０．００１以上０．０１以下である請求項１記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 前記水溶液（ａ）における没食子酸含有量に対するプロトカテク酸含有量の質量比が１×１０-4以上３×１０-1以下である請求項１～３のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 前記水溶液（ａ）における没食子酸含有量に対するプロトカテク酸含有量の質量比が１×１０-4以上１．５×１０-1以下である請求項１～３のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 前記水溶液（ａ）における没食子酸含有量に対するプロトカテク酸含有量の質量比が３×１０-3以上２×１０-2以下である請求項１～３のいずれか１項２記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 前記水溶液（ａ）が微生物の培養液由来である請求項１～６のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 前記微生物がコリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する微生物である請求項７記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 冷却を終了する温度が０℃以上５０℃以下である請求項１～８のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
- 工程（Ａ）前に、次の工程（Ｐ１）を含む、請求項１～９のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
工程（Ｐ１） 前記水溶液（ａ）を昇温する工程 - 工程（Ａ）前に、次の工程（Ｐ２）を含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
工程（Ｐ２） 前記水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程 - 工程（Ａ）前に、次の工程（Ｐ１）を行い、続いて次の工程（Ｐ２）を行う、請求項１～９のいずれか１項記載の没食子酸含有組成物の製造方法。
工程（Ｐ１） 前記水溶液（ａ）を昇温する工程
工程（Ｐ２） 前記水溶液（ａ）のｐＨを４．５以下に調整する工程 - 没食子酸含有量に対するプロトカテク酸含有量の質量比が０．００１以上０．０１以下である没食子酸含有組成物結晶。
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