JP7397019B2

JP7397019B2 - サイズが減少した自己送達用ＲＮＡｉ化合物

Info

Publication number: JP7397019B2
Application number: JP2021034250A
Authority: JP
Inventors: コヴォロヴァ，アナスタシア; サロモン，ウィリアム; カメンズ，ジョアン; サマルスキー，ドミトリー; ウルフ，トッド，エム．; カルディア，ジェームス
Original assignee: Phio Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Phio Pharmaceuticals Corp
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2023-12-12
Anticipated expiration: 2029-09-22
Also published as: WO2010033247A3; EP2340310A2; WO2010033246A1; CA3027780A1; EP3336188B1; CN108165548B; US8796443B2; US10041073B2; WO2010033248A3; US10815485B2; US20110237522A1; US9303259B2; EP2949752A3; CA2743981C; CA3027780C; JP2018126144A; EP3336188A1; US20120040459A1; CA2743981A1; EP2949752B1

Description

関連出願
本願は、2008年９月２２日に出願された米国仮出願第US 61/192,954号、表題「Chemically Modified Polynucleotides and Methods of Using the Same」、2009年２月４日に出願された同第US 61/149,946号、表題「Minimum Length Triggers of RNA Interference」、および2009年７月８日に出願された同第US 61/224,031号、表題「Minimum Length Triggers of RNA Interference」の、35 U.S.C.§119(e)に基づく利益を主張する。これらの各々の開示は、その全体において本明細書において参考として組み込まれる。

発明の分野
本発明は、RNA干渉（RNAi）の分野に関する。本発明は、より具体的には、送達剤を使用しない、改善されたin vivo送達特性を有する核酸分子、および効率的な遺伝子サイレンシングにおけるそれらの使用に関する。

発明の背景
相補的なオリゴヌクレオチド配列は、有望な治療剤であって、遺伝子の機能を解明する上での有用な研究ツールである。しかし、先行技術のオリゴヌクレオチド分子は、その臨床的開発を妨げる可能性があるいくつかの問題に悩まされており、これは、かかる組成物を用いてのin vivoでの遺伝子発現（タンパク質合成を含む）の意図した効率的な阻害を達成することをしばしば困難にする。

主要な問題は、細胞および組織へのこれらの化合物の送達であった。従来の二本鎖RNAi化合物は、１９～２９塩基長であって、およそ１．５×１０～１５ｎｍのサイズの高度に負に荷電した強固ならせんを形成する。このロッド型の分子は、細胞膜を透過することができず、その結果として、in vitroおよびin vivoの両方において非常に限定された効力しか有さない。その結果として、全ての従来のRNAi化合物は、その組織分配および細胞取り込みを促進するために、何らかの種類の送達ビヒクルを必要とする。これは、RNAi技術の主要な限定要因であると考えられる。

先には、その細胞取り込み特性を改善するために、オリゴヌクレオチドに化学的修飾を適用する試みが存在している。一つのかかる修飾は、オリゴヌクレオチドへのコレステロール分子の結合であった。このアプローチについての第１の報告は、1989年のLetsingerらによるものであった。その後、ISIS Pharmaceuticals, Inc.（Carlsbad, CA）が、オリゴヌクレオチドにコレステロール分子を結合させる上でのより高度な技術を報告した（Manoharan, 1992）。

９０年代後期におけるsiRNAの発見に関して、その送達プロフィールを増強するために、同様の型の修飾がこれらの分子に対して試みられた。僅かに修飾された（Soutschek, 2004）および重く修飾された（Wolfrum, 2007）siRNAに結合したコレステロール分子が、文献において現れた。Yamadaら（2008）はまた、コレステロール媒介性のsiRNAの取り込みをより改善した高度なリンカー化合物の使用について報告した。この努力にも拘わらず、これらの型の化合物の取り込みは、生体液の存在下において阻害され、これがin vivoにおける遺伝子サイレンシングにおける効力を非常に限定させ、臨床的セッティングにおけるこれらの化合物の適用性を限定していると考えられる。

したがって、in vivoにおける送達特性が改善され、臨床的に有意義なオリゴヌクレオチドを設計することにより、先行技術のオリゴヌクレオチドを改善することは、大きな利益となる。

発明の要約
本明細書において記載されるのは、最短の二本鎖領域を有する、非対称な化学修飾された核酸分子、および遺伝子サイレンシングにおけるかかる分子の使用である。本発明に関するRNAi分子は、一本鎖領域および二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域および二本鎖領域の両方において、多様な化学修飾を含み得る。さらに、RNAi分子は、従来のおよび先進的なステロール型分子などの疎水性抱合体に結合してもよい。この新たなクラスのRNAi分子は、in vitroおよびin vivoの両方において、先に記載されたRNAi分子よりも、優れた効力を有する。

本発明の側面は、非対称の核酸分子であって、二本鎖核酸を形成する、１６ヌクレオチドの最短の長さを有するガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含み、二本鎖領域および一本鎖領域を有し、前記二本鎖領域は８～１５ヌクレオチドの長さを有し、前記一本鎖領域は５～１２ヌクレオチドの長さを有し、ここで、前記パッセンジャー鎖は親油性基に結合しており、ここで、前記二本鎖核酸のヌクレオチドのうち少なくとも４０％は修飾されており、およびここで、前記一本鎖領域は、少なくとも２個のホスホロチオエート修飾を有する、前記核酸分子に関する。一部の態様において、ガイド鎖の１位は、５’リン酸化されている。ある態様において、ガイド鎖の１位は、２’Ｏ－メチル修飾および５’リン酸化されている。

本発明の側面は、単離された二本鎖核酸分子であって、miRNA配列に対して相補性を有する、長さ１５～２１ヌクレオチドのより長い鎖と、３’末端において親油性基に結合した長さ８～１５ヌクレオチドのより短い鎖とを含み、ここで、前記より長い鎖と前記パッセンジャー鎖とが二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、前記より長い鎖が長さ２～１３ヌクレオチドの３’一本鎖領域を有し、少なくとも２個のホスホロチオエート修飾を含み、少なくとも５０％のヌクレオチドが修飾されている、前記二本鎖核酸分子に関する。

本発明のさらなる側面は、標的遺伝子に対して相補性を有する長さ１７～２１ヌクレオチドのガイド鎖、３’末端において親油性基に結合した長さ８～１６ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を含む、単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖および前記パッセンジャー鎖が、二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、ここで、前記ガイド鎖は、長さ２～１３ヌクレオチドの３’一本鎖領域を有し、前記一本鎖領域内の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、およびここで、前記二本鎖領域中のＣおよびＵヌクレオチドのうち少なくとも５０％は、少なくとも１つの２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む、前記二本鎖核酸分子に関する。

別の側面において、本発明は、標的遺伝子に対して相補性を有する長さ１７～２１ヌクレオチドのガイド鎖、３’末端において親油性基に結合した長さ１０～１６ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖および前記パッセンジャー鎖が、二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、ここで、前記ガイド鎖は、長さ５～１１ヌクレオチドの３’一本鎖領域を有し、前記一本鎖領域内の少なくとも２個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、およびここで、前記二本鎖領域中のＣおよびＵヌクレオチドのうち少なくとも５０％は、２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾されている、前記二本鎖核酸分子である。

本発明は、別の側面において、標的遺伝子に対して相補性を有する長さ１７～２１ヌクレオチドのガイド鎖、３’末端において親油性基に結合した長さ８～１６ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖および前記パッセンジャー鎖が、二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、ここで、前記ガイド鎖は、長さ６～８ヌクレオチドの３’一本鎖領域を有し、前記一本鎖領域内の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖は、少なくとも２個のホスホロチオエート修飾を含み、ここで、前記二本鎖領域中のＣおよびＵヌクレオチドのうち少なくとも５０％は、２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含み、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む１つの末端を有する、前記二本鎖核酸分子である。

標的遺伝子に対して相補性を有する長さ１７～２１ヌクレオチドのガイド鎖、３’末端において親油性基に結合した長さ８～１６ヌクレオチドのパッセンジャー鎖、を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖および前記パッセンジャー鎖が、二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、ここで、前記ガイド鎖は、３’一本鎖領域を有し、前記一本鎖領域内の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖の１１～１８位中の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｏ－メチル修飾を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖中の全てのヌクレオチドは、２’Ｏ－メチル修飾されており、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む一つの末端を有する、前記二本鎖核酸分子が、本発明の他の側面において提供される。

別の側面において、本発明は、標的遺伝子に対して相補性を有する長さ１７～２１ヌクレオチドのガイド鎖、３’末端において親油性基に結合した長さ８～１５ヌクレオチドのパッセンジャー鎖、を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、、親油性基は、コレステロールおよび長さ５～７または９～１８個の炭素のＣ１７ポリ炭素鎖を有するステロール型分子からなる群より選択され、ここで、前記ガイド鎖および前記パッセンジャー鎖が、二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、ここで、前記ガイド鎖は、３’一本鎖領域を有し、前記一本鎖領域内の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、ここで、前記ガイド鎖の１１～１８位中の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｏ－メチル修飾を有し、ここで、ガイド鎖の２～１０位中の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖中の全てのヌクレオチドは、２’Ｏ－メチル修飾されており、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む１つの末端を有する、前記二本鎖核酸分子である。

本発明のさらに別の側面におけるものは、標的遺伝子に対して相補性を有するガイド配列、３’末端において親油性基に結合したパッセンジャー配列、を有する単離された核酸分子であって、ここで、前記ガイド配列と前記パッセンジャー配列とは、二本鎖領域および一本鎖領域を有する核酸分子を形成し、ここで、前記ガイド配列は、長さ２～１３ヌクレオチドの３’一本鎖領域を有し、前記一本鎖領域内の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、ここで、前記ガイド配列は、５’リン酸修飾を有し、ここで、前記二本鎖領域中のＣおよびＵヌクレオチドのうち少なくとも５０％は、少なくとも１つの２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含み、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む１つの末端を有する、前記核酸分子である。

ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記分子の二本鎖である領域は、８～１４ヌクレオチド長であり、ここで、前記ガイド鎖は、４～１２ヌクレオチド長である一本鎖領域を含み、およびここで、前記ガイド鎖の一本鎖領域は、２～１２ホスホロチオエート修飾を含む、前記二本鎖核酸分子が、本発明の他の側面において提供される。

一部の態様において、ガイド鎖は、６～８個のホスホロチオエート修飾を含む。他の態様において、ガイド鎖の一本鎖領域は、６ヌクレオチド長である。

さらに別の態様において、二本鎖領域は、１３ヌクレオチド長である。任意に、二本鎖核酸分子は、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む１つの末端を有する。

別の側面において、本発明は、
ガイド鎖、ここで、前記ガイド鎖は、１６～２８ヌクレオチド長であり、標的遺伝子に対して相補性を有し、ここで、前記ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、少なくとも２個のリン酸修飾を含み、およびここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、少なくとも１つの２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む、ならびに、
パッセンジャー鎖、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対する相補性を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖は親油性基に結合している、
を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖および前記パッセンジャー鎖は、二本鎖核酸分子を形成する、前記二本鎖核酸分子である。

一部の態様において、前記ガイド鎖または配列の１位におけるヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。他の態様において、ガイド鎖または配列の２～１０位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。さらに別の態様において、ガイド鎖または配列の２～１０位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。ガイド鎖または配列の１１～１８位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有してもよい。一部の態様において、ガイド鎖または配列の１１～１８位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。

さらに別の態様において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、少なくとも４個のリン酸修飾を含む。任意に、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、少なくとも８個のリン酸修飾を含む。一部の態様において、ガイド鎖は、４～１４個のリン酸修飾を含む。他の態様において、ガイド鎖は、４～１０個のリン酸修飾を含む。さらに別の態様において、ガイド鎖の３’末端の６ヌクレオチドは、全てリン酸修飾を含む。リン酸修飾は、ホスホロチオエート修飾であってもよい。

一部の態様において、パッセンジャー鎖上の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。他の態様において、パッセンジャー鎖上の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。一態様において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている。パッセンジャー鎖上の少なくとも２個のヌクレオチドは、他の態様において、ホスホロチオエート修飾されている。

親油性分子は、コレステロールなどのステロールであってよい。
一部の態様において、ガイド鎖は、１８～１９ヌクレオチド長である。他の態様において、パッセンジャー鎖は、１１～１３ヌクレオチド長である。
二本鎖核酸分子は、他の態様において、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む１つの末端を有する。

本発明の別の側面におけるものは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖は、少なくとも２個の化学修飾を有する、前記二本鎖核酸分子である。一部の態様において、少なくとも２個の化学修飾は、少なくとも２個のホスホロチオエート修飾を含む。一部の態様において、二本鎖核酸分子は、平滑であるか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む１つの末端を有する。

本発明の一部の側面におけるものは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖は、５ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖３’領域および１ヌクレオチドまたはそれより短い５’領域を有する。一本鎖領域は、少なくとも２個のホスホロチオエート修飾を含んでもよい。

ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を有する単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１６ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖は、５ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖３’領域を有し、パッセンジャー鎖は、９個より長いＣ１７結合鎖を有するステロール型分子を有する、前記二本鎖核酸分子が、本発明の他の側面において提供される。

デュプレックス（duplex）ポリヌクレオチドが、本発明の他の側面において提供される。ポリヌクレオチドは、
第１のポリヌクレオチド、ここで前記第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドおよび標的遺伝子に対して相補的である；および
第２のポリヌクレオチド、ここで、前記第２のポリヌクレオチドは、前記第１のポリヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド短い、
を有し、ここで前記第１のポリヌクレオチドは、４０～９０％の疎水性塩基修飾、４０～９０％のホスホロチオエートおよび４０～９０％のリボース部分の修飾または任意のこれらの組み合わせからなる群より選択される修飾を含む一本鎖領域を含む。

本発明の別の側面におけるものは、
第１のポリヌクレオチド、ここで、前記第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドおよび標的遺伝子に対して相補的である；および
第２のポリヌクレオチド、ここで、前記第２のポリヌクレオチドは、前記第１のポリヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド短い、
を有するデュプレックスポリヌクレオチドであって、ここで、前記デュプレックスポリヌクレオチドは、前記第１のポリヌクレオチド上のヌクレオチド９、１１、１２、１３または１４と前記第２のポリヌクレオチド上の反対のヌクレオチドとの間にミスマッチを含む、前記デュプレックスポリヌクレオチドである。

本発明の別の側面におけるものは、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法であって、哺乳動物細胞を、請求項１～４１のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子または請求項４３または４４に記載のデュプレックスポリヌクレオチドと接触させることを含む、前記方法である。

対象においてRNAiを誘導する方法が、本発明の他の側面において提供される。方法は、対象に請求項１～４１のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子または請求項４３または４４に記載のデュプレックスポリヌクレオチドの標的遺伝子のmRNAのRNAiを誘導するための有効量を投与することを含む。他の態様において、対象はヒトである。他の態様において、標的遺伝子は、PPIB、MAP4K4またはSOD1である。

他の側面において、ポリヌクレオチドを有する単離された疎水性修飾ポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは二本鎖RNAであって、疎水性分子に結合し、ここで、疎水性分子は、非末端のヌクレオチド塩基、リボースまたは骨格に結合し、およびここで、前記単離された二本鎖核酸分子は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含み、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有する、前記疎水性修飾ポリヌクレオチドが提供される。

一態様において、疎水性分子は、前記二本鎖RNAのガイド鎖に結合している。別の態様において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、少なくとも２個のリン酸修飾を含み、およびここで、前記ガイド鎖は５’リン酸修飾を有し、少なくとも１つの２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む。さらに別の態様において、疎水性分子は、二本鎖RNAのパッセンジャー鎖に結合している。

本発明は、非共有結合的に疎水性分子に複合体化されたポリヌクレオチドを有する単離された疎水性修飾ポリヌクレオチドであって、前記疎水性分子はポリカチオン性分子である、前記疎水性修飾ポリヌクレオチドを提供する。一部の態様において、ポリカチオン性分子は、プロタミン、アルギニンリッチペプチドおよびスペルミンからなる群より選択される。

本発明の別の側面においては、ポリヌクレオチドを有する単離された疎水性修飾ポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは二本鎖RNAであって、疎水性分子にリンカーなしで直接的に複合体化し、ここで、疎水性分子はコレステロールではない。

組成物であって、以下：
疎水性修飾ポリヌクレオチド、ここで、前記ポリヌクレオチドは二本鎖RNAであって、疎水性分子に結合し、ここで、前記二本鎖核酸分子は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含み、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、ここで、ガイド鎖の１位は、５’リン酸化されているかまたは２’Ｏ－メチル修飾を有し、ここで、前記二本鎖核酸のヌクレオチドのうち少なくとも４０％は修飾されており、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、平滑である一つの末端を有するか、または１～２ヌクレオチドの突出を含む、前記疎水性修飾ポリヌクレオチド；
中性脂質混合物；
および任意に、カーゴ分子
を有する前記組成物であって、ここで、前記疎水性修飾ポリヌクレオチドおよび前記中性脂質混合物がミセルを形成する、前記組成物が、本発明の他の側面において提供される。

一部の態様において、パッセンジャー鎖の３’末端は、疎水性分子に結合している。他の態様において、組成物は、無菌である。さらに別の態様において、中性脂質混合物は、DOPC（ジオレオイルホスファチジルコリン）を含む。さらなる態様において、中性脂質混合物は、DSPC（ジステアロイルホスファチジルコリン）を含む。中性脂質混合物は、さらに、コレステロールなどのステロールを他の態様において含む。

さらに別の態様において、組成物は、少なくとも２０％のDOPCおよび少なくとも２０％のコレステロールを含む。疎水性修飾ポリヌクレオチドの疎水性部分は、他の態様において、ステロールである。ステロールは、コレステロール、コレステリルまたは修飾コレステリル残基であってもよい。他の態様において、疎水性修飾ポリヌクレオチドの疎水性部分は、胆汁酸、コール酸またはタウロコール酸、デオキシコール酸、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、イソプレノイド類、ビタミン類、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル類、トリグリセリド、ピレン類、ポルフィリン類、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン類、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、Texas-Red、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例えば、Cy3またはCy5）、Hoechst 33258色素、ソラレン、またはイブプロフェンからなる群より選択される。

さらに別の態様において、疎水性修飾ポリヌクレオチドの疎水性部分は、例えば、プロタミン、アルギニンリッチペプチドおよび／またはスペルミンなどのポリカチオン性分子である。

組成物は、任意に、脂質、ペプチド、ビタミンおよび／または小分子などのカーゴ分子を含む。一部の態様において、カーゴ分子は、非経口栄養からなる群より選択される多様な目的のために利用可能な市販の脂質乳液である。一部の態様において、市販の脂質乳液は、イントラリピッド（intralipid）またはニュートラリピッド（nutralipid）である。他の態様において、カーゴ分子は、７４％を超えるリノール酸を含む脂肪酸混合物、少なくとも６％のカルジオリピンを含む脂肪酸混合物、または少なくとも７４％のリノール酸および少なくとも６％のカルジオリピンを含む脂肪酸混合物である。別の態様において、カーゴ分子は、例えばDOPEなどの膜融合性脂質であり、好ましくは少なくとも１０％の膜融合性脂質である。
一部の態様において、ポリヌクレオチドは、化学修飾を含む。例えば、これは少なくとも４０％修飾されていてもよい。

対象においてRNAiを誘導する方法が、本発明の別の側面において提供される。方法は、対象に、本発明の単離された二本鎖核酸分子またはデュプレックスポリヌクレオチドまたは組成物の、標的遺伝子のmRNAのRNAiを誘導するための有効量を投与することを含み、ここで、前記ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの標的遺伝子に対応する配列の領域を有し、ここで、投与の工程は、全身、静脈内、腹腔内、皮内、局所、鼻内、吸入、経口、粘膜内、局所注射、皮下、経口、気管、または眼内である。
他の態様において、対象は、ヒトである。他の態様において、標的遺伝子は、PPIB、MAP4K4またはSOD1である。

本発明の一部の側面におけるものは、ヘアピン構造を形成する３５ヌクレオチド未満の一本鎖RNAであって、前記ヘアピンは、二本鎖ステムおよび一本鎖ループを含み、前記二本鎖ステムは、前記二本鎖ステムは、５’－末端を有する５’－ステム配列および３’末端を有する３’－ステム配列を有し；前記５’－ステム配列と前記ループの少なくとも一部とは、標的遺伝子の転写物に対して相補的なガイド鎖を形成し、ここで、前記ポリヌクレオチドは、前記標的遺伝子の発現の配列依存的遺伝子サイレンシングを媒介し、ここで、前記一本鎖ループ領域中の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、およびここで、前記二本鎖領域中のＣおよびＵヌクレオチドのうち少なくとも５０％は、２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む、前記一本鎖RNAである。一態様において、ガイド配列の１１～１８位中の全てのＣおよびＵヌクレオチドは２’Ｏ－メチル修飾を有する。

ポリヌクレオチドコンストラクトが、他の側面において提供され、ポリヌクレオチドは、２個の同一な一本鎖ポリヌクレオチドを有し、前記一本鎖ポリヌクレオチドの各々は、５’－末端を有する５’－ステム配列、３’－末端を有する３’－ステム配列、および前記５’－ステム配列と前記３’－ステム配列とを結合させるリンカー配列を含み、ここで：（１）第１の一本鎖ポリヌクレオチドの５’－ステム配列は、第２の一本鎖ポリヌクレオチドの３’－ステム配列とハイブリダイズして第１の二本鎖ステム領域を形成し；（２）前記第２の一本鎖ポリヌクレオチドの５’－ステム配列は、前記第１の一本鎖ポリヌクレオチドの３’－ステム配列とハイブリダイズして第２の二本鎖ステム領域を形成し；および、（３）前記第１および第２の一本鎖ポリヌクレオチドのリンカー配列は、前記第１および第２の二本鎖ステム領域を連結するループまたはバルジを形成し、ここで、前記５’－ステム配列と前記リンカー配列の少なくとも一部は標的遺伝子の転写物に対して相補的なガイド配列を形成し、ここで、前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記標的遺伝子の発現の配列依存的遺伝子サイレンシングを媒介し、ここで、前記一本鎖ループ領域中の各々のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾を有し、およびここで、前記二本鎖領域中のＣおよびＵヌクレオチドのうち少なくとも５０％は、２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む。

一態様において、ガイド配列の１１～１８位中の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｏ－メチル修飾を有する。
一部の態様において、ガイド鎖は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド長である。一部の態様において、パッセンジャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチド長である。一部の態様において、核酸分子は、－２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。

本発明の側面は、化学修飾されている核酸分子に関する。一部の態様において、化学修飾は、５’リン酸、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆＣ（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｆＵ）、５－メチルｆＣ、５－メチルｆＵ、Ｃ－５プロピニル－ｍＣ（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｍＵ）、５－メチルｍＣ、５－メチルｍＵ、LNA（ロックド核酸）、MGB（副溝結合剤）および塩基の疎水性を増大させる他の塩基の修飾からなる群より選択される。１つより多くの化学修飾が、同じ分子中に存在してもよい。一部の態様において、化学修飾は、安定性を増大し、および／または熱力学的安定性（ΔＧ）を改善する。一部の態様において、核酸分子上のＣＵ残基の少なくとも９０％が修飾されている。

一部の態様において、ガイド鎖の１位におけるヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および／または５’リン酸修飾を有する。一部の態様において、ガイド鎖の２～１０位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。ある態様において、ガイド鎖の２～１０位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。一部の態様において、ガイド鎖の１１～１８位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、ガイド鎖の１１～１８位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。一部の態様において、パッセンジャー鎖上の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、パッセンジャー鎖上の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。

一部の態様において、本発明に関連する核酸分子は、一続きの少なくとも４個のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含む。ある態様において、一続きのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長である。一部の態様において、一続きのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、完全に一本鎖ではない。

本発明に関連する核酸分子は、抱合体に結合していてもよい。一部の態様において、抱合体は、ガイド鎖に結合しているが、一方、他の態様においては、抱合体はパッセンジャー鎖に結合している。一部の態様において、抱合体は、疎水性である。一部の態様において、抱合体は、コレステロールなどのステロールである。一部の態様において、本発明に関連する核酸分子は、平滑末端である。

本発明の側面は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む二本鎖核酸分子に関し、ここで、前記分子の二本鎖である領域は、８～１４ヌクレオチド長であり、およびここで、前記分子は－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。

一部の態様において、前記分子の二本鎖である領域は、８、９、１０、１１、１２、１３および１４ヌクレオチド長である。一部の態様において、分子は、－２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。核酸分子は、一部の態様において、化学修飾されている。ある態様において、化学修飾は、５’リン酸、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆＣ（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｆＵ）、５－メチルｆＣ、５－メチルｆＵ、Ｃ－５プロピニル－ｍＣ（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｍＵ）、５－メチルｍＣ、５－メチルｍＵ、LNA（ロックド核酸）、MGB（副溝結合剤）および塩基の疎水性を増大させる他の塩基の修飾からなる群より選択される。１つより多い化学修飾が同じ分子中に存在してもよい。一部の態様において、化学修飾は、安定性を増大させ、および／または熱力学的安定性（ΔＧ）を改善する。一部の態様において、核酸分子上のＣＵ残基の少なくとも９０％が修飾されている。

一部の態様において、ガイド鎖の１位におけるヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および／または５’リン酸修飾を有する。一部の態様において、ガイド鎖の２～１０位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。ある態様において、ガイド鎖の２～１０位における各々のＣおよびＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。一部の態様において、ガイド鎖の１１～１８位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、ガイド鎖の１１～１８位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。一部の態様において、パッセンジャー鎖上の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、パッセンジャー鎖上の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。

本発明に関連する核酸分子は、一続きの少なくとも４個のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含み得る。ある態様において、一続きのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長である。一部の態様において、一続きのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、完全に一本鎖ではない。一部の態様において、核酸分子は抱合体に結合している。一部の態様において、抱合体は、ガイド鎖に結合しているが、一方、他の態様においては、抱合体はパッセンジャー鎖に結合している。一部の態様において、抱合体は、疎水性である。一部の態様において、抱合体は、コレステロールなどのステロールである。一部の態様において、本発明に関連する核酸分子は、平滑末端である。一部の態様において、核酸分子は、５’末端において平滑末端となっている。ある態様において、核酸分子は分子の二本の鎖の間の相補性の領域が開始する５’末端において平滑末端となっている。

本発明の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法に関する。方法は、哺乳動物細胞を、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子と接触させることを含み、ここで、前記ガイド鎖は、１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して相補性を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。

細胞は、in vivoで接触させても、in vitroで接触させてもよい。一部の態様において、ガイド鎖は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド長である。一部の態様において、パッセンジャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチド長である。一部の態様において、核酸分子は、－２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。

本明細書において記載される方法に関連する核酸分子は、化学修飾されていてもよい。一部の態様において、化学修飾は、５’リン酸、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆＣ（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｆＵ）、５－メチルｆＣ、５－メチルｆＵ、Ｃ－５プロピニル－ｍＣ（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｍＵ）、５－メチルｍＣ、５－メチルｍＵ、LNA（ロックド核酸）、MGB（副溝結合剤）および塩基の疎水性を増大させる他の塩基の修飾からなる群より選択される。１つより多い化学修飾が同じ分子中に存在してもよい。一部の態様において、化学修飾は、安定性を増大させ、および／または熱力学的安定性（ΔＧ）を改善する。一部の態様において、核酸分子上のＣＵ残基の少なくとも９０％が修飾されている。

本明細書において記載される哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法は、哺乳動物細胞を、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子と接触させることを含み、ここで、前記分子の二本鎖である領域は、８～１４ヌクレオチド長であり、ここで、前記分子は、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。

一部の態様において、前記分子の二本鎖である領域は、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチド長である。一部の態様において、分子は、－２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。核酸分子は、一部の態様において、化学修飾されている。ある態様において、化学修飾は、５’リン酸、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆＣ（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｆＵ）、５－メチルｆＣ、５－メチルｆＵ、、Ｃ－５プロピニル－ｍＣ（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆＵ（ｐｍＵ）、５－メチルｍＣ、５－メチルｍＵ、LNA（ロックド核酸）、MGB（副溝結合剤）および塩基の疎水性を増大させる他の塩基の修飾からなる群より選択される。１つより多い化学修飾が同じ分子中に存在してもよい。一部の態様において、化学修飾は、安定性を増大させ、および／または熱力学的安定性（ΔＧ）を改善する。一部の態様において、核酸分子上のＣＵ残基の少なくとも９０％が修飾されている。

本発明に関連する核酸分子は、一続きの少なくとも４個のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。ある態様において、一続きのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長である。一部の態様において、一続きのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、完全に一本鎖ではない。一部の態様において、核酸分子は抱合体に結合している。一部の態様において、抱合体は、ガイド鎖に結合しているが、一方、他の態様においては、抱合体はパッセンジャー鎖に結合している。一部の態様において、抱合体は、疎水性である。一部の態様において、抱合体は、コレステロールなどのステロールである。一部の態様において、本発明に関連する核酸分子は、平滑末端である。

別の態様において、本発明は、遺伝子サイレンシングのためにsiRNAを選択するための方法を提供し、該方法は、（ａ）標的遺伝子を選択すること、ここで、標的遺伝子は標的配列を含む；（ｂ）候補siRNAを選択すること、ここで、前記候補siRNAは、１６～２９ヌクレオチド塩基対のガイド鎖と８～１４ヌクレオチド塩基対のパッセンジャー鎖とを含み、これらはアンチセンス領域とセンス領域とからなるデュプレックスを形成し、前記候補siRNAの前記アンチセンス領域は、前記標的配列の領域に対して少なくとも８０％相補的である；（ｃ）前記候補siRNAの熱力学的安定性（ΔＧ）を決定すること；ならびに（ｅ）前記熱力学的安定性が－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満である場合に、前記候補siRNAを遺伝子サイレンシングのためのsiRNAとして選択すること、による。

本発明の側面は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子に関し、ここで、前記ガイド鎖は、１８～１９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して相補性を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖は１１～１３ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記二本鎖核酸分子は、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有する。

一部の態様において、ガイド鎖の１位におけるヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および／または５’リン酸修飾を有する。一部の態様において、ガイド鎖の２～１０位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。ある態様において、ガイド鎖の２～１０位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を有する。一部の態様において、ガイド鎖の１１～１８位における少なくとも１つのＣまたはＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、ガイド鎖の１１～１８位における全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。

一部の態様において、ガイド鎖は、一続きの少なくとも４個のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含む。ある態様において、ガイド鎖は、一続きの少なくとも８個のホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含む。一部の態様において、パッセンジャー鎖上の全てのＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、パッセンジャー鎖上の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。一部の態様において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１個のまたは少なくとも２個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている。核酸分子は、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖のいずれかにおいて、抱合体に結合していてもよい。一部の態様において、抱合体は、コレステロールなどのステロールである。

本発明の側面は、
ガイド鎖、ここで、前記ガイド鎖は、１６～２８ヌクレオチド長であり、標的遺伝子に対して相補性を有し、ここで、前記ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、少なくとも２個のリン酸修飾を含み、ここで、前記ガイド鎖は、少なくとも１つの２’Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を含む、ならびに、
パッセンジャー鎖、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～２８ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、ここで、前記パッセンジャー鎖は親油性基に結合している、
を含む単離された二本鎖核酸分子であって、ここで、前記ガイド鎖と前記パッセンジャー鎖は、二本鎖核酸分子を形成する、前記二本鎖核酸分子に関する。

一部の態様において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、少なくとも４個、または少なくとも８個のリン酸修飾を含む。ある態様において、ガイド鎖は、２～１４個または４～１０個のリン酸修飾を含む。一部の態様において、ガイド鎖の３’末端の６ヌクレオチドは全てリン酸修飾を含む。ある態様において、リン酸修飾は、ホスホロチオエート修飾である。

一部の態様において、パッセンジャー鎖上の各々のＣおよびＵヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。ある態様において、パッセンジャー鎖上の全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有する。一部の態様において、パッセンジャー鎖上の少なくとも１個または少なくとも２個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾されている。一部の態様において、親油性分子は、コレステロールなどのステロールである。一部の態様において、ガイド鎖は、１８～１９ヌクレオチド長であり、パッセンジャー鎖は、１１～１３ヌクレオチド長である。

本発明の側面は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子に関し、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖は、少なくとも２個の化学修飾を有する。一部の態様において、２個の化学修飾は、ホスホロチオエート修飾である。

本発明のさらなる側面は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子に関し、ここで、前記ガイド鎖は１６～２９ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補性であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、８～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖は、５ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖３’領域を有する。一部の態様において、一本鎖領域は、少なくとも２個のホスホロチオエート修飾を含む。

本発明のさらなる側面は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子に関し、ここで、前記ガイド鎖は、１８～２１ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補的であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、１１～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖の１位は、２－ＯＭｅまたは５’リン酸修飾を有し、前記ガイド鎖の２～１１位における全てのＣおよびＵは、２－Ｆ修飾されており、前記ガイド鎖の１２～１８位における全てのＣおよびＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、前記パッセンジャー鎖上のＣおよびＵのうち８０％は、２’ＯＭｅ修飾されている。

本発明の別の側面は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子に関し、ここで、前記ガイド鎖は、１８～２１ヌクレオチド長であって、標的遺伝子に対して実質的に相補的であり、ここで、前記パッセンジャー鎖は、１１～１４ヌクレオチド長であって、前記ガイド鎖に対して相補性を有し、およびここで、前記ガイド鎖は、１位において２－ＯＭｅおよび５’リン酸修飾を有し、前記ガイド鎖の２～１１位における全てのＣおよびＵは、２－Ｆ修飾されており、前記ガイド鎖の１２～１８位における全てのＣおよびＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、前記パッセンジャー鎖上のＣおよびＵのうち８０％は、２’ＯＭｅであり、前記パッセンジャー鎖の３’末端は、抱合体に結合している。一部の態様において、抱合体は、ステロール、ステロール型分子、疎水性ビタミン類または脂肪酸から選択される。

本発明の限定の各々は、本発明の多様な態様を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各々の側面において含まれ得ることが理解される。本発明は、その適用において、以下の説明において記載される、または図面において示される成分の構築および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様、および多様な方法において実施されるかまたは行われることが可能である。

図面の簡単な説明
添付の図面は、原寸で描画されることを意図されていない。図面において、多様な図において示される各々の同一またはほぼ同一の成分は、類似の数詞により表わされる。明確化を目的として、全ての成分が全ての図面においてラベルされているわけではない。図面においては以下のとおりである。

図１は、非対称二本鎖RNA分子（adsRNA）の提案される構造を示す模式図である。太線は、RISCローディングと相性がよい修飾パターンを保有する配列を表わす。ストライプの線は、パッセンジャー鎖と相性がよい修飾を保有するポリヌクレオチドを表わす。細線は、細胞の相互作用および取り込みのために最適化された修飾パターンを有する一本鎖ポリヌクレオチドを表わす。図１Ａは、伸展したガイドまたはパッセンジャー鎖を有するadsRNAを表わす。図１Ｂは、多様な長さの細胞に浸透するポリヌクレオチドを有するadsRNAを表わす。図１Ｃは、３’および５’抱合体を有するadsRNAを表わす。図１Ｄは、ミスマッチを有するadsRNAを表わす。

図２は、異なる化学修飾パターンを有する非対称dsRNA分子を表わす模式図である。疎水性を増大させるために用いることができる化学修飾の幾つかの例を示し、これは、４－ピリジル、２－ピリジル、イソブチルおよびインドリルに基づく５位のウリジン修飾を含む。

図３は、細胞への侵入を促進するためにデュプレックスの電荷を遮断するための、dsRNA結合ドメイン、プロタミン（または他のＡｒｇリッチなタンパク質）、スペルジミジンまたは同様の化学構造の使用を表わす模式図である。

図４は、ポリヌクレオチド電荷の遮断のために用いることができる正に荷電した化合物を表わす模式図である。

図５は、一本鎖RISCに侵入するポリヌクレオチドの構造および化学組成の例を表わす模式図である。RISCに侵入する一本鎖を最適化するために、２’ｄ、２’Ｏｍｅ、２’Ｆ、疎水性およびホスホチロオエート修飾を含む１または２以上の修飾の組み合わせを用いてもよい。

図６は、RISC基質阻害剤の構造および化学組成の例を表わす模式図である。効率的な取り込みおよび予めロードされたRISC複合体への効率的な結合を媒介するために、１または２以上の化学修飾の組み合わせを用いてもよい。

図７は、ステロール型分子が結合したポリヌクレオチドの構造を表わす模式図であり、ここで、Ｒは、９個の炭素またはそれより長いポリ炭素テイルを表わす。図７Ａは、adsRNA分子を表わす。図７Ｂは、約１７～３０ｂｐ長のsiRNA分子を表わす。図７Ｃは、RISCに侵入する鎖を表わす。図７Ｄは、基質アナログ鎖を表わす。図７において表わされるように、化学修飾パターンを、所望の機能を促進するために最適化してもよい。

図８は、８個より長いポリ炭素鎖が１７位に結合した天然に存在するフィトステロールの例を表わす模式図である。２５０を超える異なる型のフィトステロールが知られている。

図９は、多様なサイズのポリ炭素鎖が１７位に結合したステロール様構造の例を表わす模式図である。

図１０は、ステロール型分子を含有する脂質乳液の肝臓取り込みおよび血漿クリアランスのパーセンテージが、１７位において結合したポリ炭素鎖のサイズにより直接的に影響を受けることを示す模式図およびグラフである。図の出典は、Martins et al, Journal of Lipid Research (1998)である。

図１１は、ミセル形成を表わす模式図である。図１１Ａは、疎水性抱合体を有するポリヌクレオチドを表わす。図１１Ｂは、リノール酸を表わす。図１１Ｃは、疎水性抱合体を含むポリヌクレオチドと脂肪酸との混合物から形成されるミセルを表わす。

図１２は、脂質の組成の変化が、疎水性に修飾されたおよび／または疎水性に抱合したポリヌクレオチドの薬物動態学的挙動および組織分布に、どのように影響を及ぼし得るかを表わす模式図である。特に、リノール酸およびカルジオリピンが豊富な脂質混合物の使用は、心筋細胞による優先的な取り込みをもたらす。

図１３は、標的MAP4K4の発現のために用いられるRNAiコンストラクトおよび対照の例を示す模式図である。RNAiコンストラクト12083は、配列番号597および598に対応する。RNAiコンストラクト12089は、配列番号599に対応する。

図１４は、本発明に関連するRNAiコンストラクトによるトランスフェクションの後でのMAP4K4発現を示すグラフである。試験されたRNAiコンストラクトは、12083（ニックを入れたもの）、12085（１３ｎｔのデュプレックス）、12089（ステムペアリング（Stem Pairing）がないもの）、および12134（１３ｎｔのminiRNA）であった。トランスフェクションの結果を、トランスフェクションしていない対照試料と比較した。RNAiコンストラクト12083は、配列番号597および598に対応する。RNAiコンストラクト12085は、配列番号600および601に対応する。RNAiコンストラクト12089は、配列番号599に対応する。RNAiコンストラクト12134は、配列番号602および603に対応する。

図１５は、本発明に関連するRNAiコンストラクトによるトランスフェクションの２４時間後のMAP4K4の発現を示すグラフである。試験したRNAiコンストラクトは、11546（MAP4K4 rxRNA）、12083（MAP4K4のニックを入れたコンストラクト）、12134（１２ｂｐのsoloRNA）、および12241（14/3/14 soloRNA）であった。トランスフェクションの結果を、フィラー対照試料と比較した。RNAiコンストラクト11546は、配列番号604および605に対応する。RNAiコンストラクト12083は、配列番号597および598に対応する。RNAiコンストラクト12134は、配列番号602および603に対応する。RNAiコンストラクト12241は、配列番号606および607に対応する。

図１６は、本発明に関連するRNAiコンストラクトによるトランスフェクションの後のMAP4K4発現のサイレンシングに関連するパラメーターを比較するグラフおよびいくつかの表を表わす。rxRNAコンストラクトは、配列番号604および605に対応する。14-3-14 soloRNAコンストラクトは、配列番号606および607に対応する。13/19 duplex（ニックを入れたコンストラクト）は、配列番号597および598に対応する。12-bp soloRNAコンストラクトは、配列番号602および603に対応する。

図１７は、標的SOD1の発現のために用いられるRNAiコンストラクトおよび対照の例を示す模式図である。12084 RNAiコンストラクトは配列番号612および613に対応する。

図１８は、本発明に関連するRNAiコンストラクトによるトランスフェクションの後のSOD1発現を示すグラフである。試験したRNAiコンストラクトは、12084（ニックを入れたもの）、12086（１３ｎｔのデュプレックス）、12090（ステムペアリングがないもの）、および12035（１３ｎｔのMiniRNA）であった。トランスフェクションの結果を、トランスフェクションしていない対照試料と比較した。12084 RNAiコンストラクトは、配列番号612および613に対応する。12086 RNAiコンストラクトは、配列番号608および609に対応する。12035 RNAiコンストラクトは、配列番号610および611に対応する。

図１９は、本発明に関連するRNAiコンストラクトによるトランスフェクションの２４時間後のSOD1の発現を示すグラフである。試験したRNAiコンストラクトは、10015（SOD1 rxRNA）および12084（SOD1のニックを入れたコンストラクト）であった。トランスフェクションの結果を、フィラー対照試料と比較した。10015 RNAiコンストラクトは、配列番号614および615に対応する。12084 RNAiコンストラクトは、配列番号612および613に対応する。

図２０は、１０ヌクレオチド未満の二本鎖領域を有するRNA分子がダイサーにより切断されないことを示す模式図である。

図２１は、RNAにより誘導される遺伝子サイレンシングについての仮説上のRNAiモデルを明らかにする模式図である。

図２２は、非対称のRNAi化合物の化学的最適化を示すグラフである。化学修飾の存在、特に２’ＦのＵＣ、ガイド鎖におけるホスホロチオエート修飾、およびパッセンジャー鎖の完全なＣＵの２’ＯＭｅ修飾は、機能的な化合物の開発をもたらす。脂質媒介性トランスフェクションの後でのMAP4K4のサイレンシングを、特定の修飾を有するRNAi分子を用いて示す。試験したRNAi分子は、１３ヌクレオチド長であるセンス鎖を有し、以下の修飾を含んだ：未修飾；ＣおよびＵの２’ＯＭｅ；ＣおよびＵの２’ＯＭｅおよび３’Ｃｈｌ；rxRNAの２’ＯＭｅパターン；または塩基１を除いて完全な２’ＯＭｅ。さらに、試験したRNAi分子のガイド（アンチセンス）鎖は、以下の修飾を含んだ：未修飾；５’Ｐを有する未修飾；ＣおよびＵの２’Ｆ；８個のＰＳの３’末端を有するＣおよびＵの２’Ｆ；ならびに未修飾（１７ｎｔ長）。rxRNA 12/10デュプレックスおよび陰性対照についての結果もまた示す。

図２３は、本明細書において記載される化学修飾が、HeLa細胞におけるRNAi分子の自力送達のin vitroでの効力を著しく増大させることを示す。化合物の構造および配列は、変更しなかった。分子の化学修飾パターンのみを改変した。２’Ｆ、２’Ｏ－ｍｅ、ホスホロチオエート修飾またはコレステロール抱合体を欠く化合物は、受動的取り込みにおいて完全に不活性であった。これらの型の修飾の４つ全ての組み合わせは、最高レベルの活性をもたらした（化合物12386）。

図２４は、NT Accell修飾siRNA、MAP4K4 Accell siRNA、非Chl nanoRNA（12379）およびsd-nanoRNA（12386）の受動的取り込みトランスフェクションの後の、Hela細胞におけるMAP4K4発現を示すグラフである。

図２５は、以下のパラメーターを含む多様な濃度のRNA分子の受動的取り込みトランスフェクションの後の、Hela細胞におけるMAP4K4発現を示すグラフである：３’Ｃｈｌを有さないNano Lead；Nano Lead；Accell MAP4K4；８個のＰＳテイルを有する２１マーのＧＳ；１２個のＰＳテイルを有する２１マーのＧＳ；および１２個のＰＳテイルを有する２５マーのＧＳ。

図２６は、オリゴヌクレオチド含有物の減少が自力取り込みの効力を増大させることを示すグラフである。同様の化学修飾を、非対称化合物、伝統的なsiRNA化合物および２５マーのRNAi化合物に適用した。非対称の小分子化合物が、最も著しい効力を示した。

図２７は、自力送達のためのホスホロチオエート含有物の重要性を示すグラフである。図２７Ａは、ガイド鎖における少なくとも２～１２のホスホロチオエートの存在が取り込みを著しく改善することを明らかにした体系的スクリーニングの結果を示す。一部の態様において、４～８のホスホロチオエート修飾が好ましいことを見出した。図２７Ｂは、センス鎖におけるホスホロチオエート修飾の存在または不在が効力を変化させなかったことを明らかにする。

図２８は、Accell Media-Ctrl-UTC；MM APOB Alnylam；Active APOB Alnylam；ｃｈｌを有さないnanoRNA；nanoRNA MAP4K4；マウスMAP4K4 Accell Smartpool；DY547 Accell対照；Dy547を有するLuc Ctrl rxRNA；DY547を有するMAP4K4 rxRNA；およびAS Strand Alone（nano）の受動的取り込みトランスフェクションの後の、初代マウス肝細胞におけるMAP4K4の発現を示すグラフである。

図２９は、Accell Media-Ctrl-UTC；MM APOB Alnylam；Active APOB Alnylam；ｃｈｌを有さないnanoRNA；nanoRNA MAP4K4；マウスMAP4K4 Accell Smartpool；DY547 Accell対照；Dy547を有するLuc Ctrl rxRNA；DY547を有するMAP4K4 rxRNA；およびAS Strand Alone（nano）の受動的取り込みトランスフェクションの後の初代マウス肝細胞におけるApoBの発現を示すグラフである。

図３０は、11550 MAP4K4 rxRNA；12544 MM MAP4K4 nanoRNA；12539 Active MAP4K4 nanoRNA；Accell Media；およびUTCの受動的取り込みトランスフェクションの後の初代ヒト肝細胞におけるMAP4K4の発現を示すグラフである。

図３１は、12505 Active ApoB chol-siRNA；12506 MM ApoB chol-siRNA；Accell Media；およびUTCの受動的取り込みトランスフェクションの後の初代ヒト肝細胞におけるApoB発現を示すグラフである。

図３２は、sd-rxRNA^nanoの局在を表わす画像である。

図３３は、Chol-siRNA（Alnylam）の局在を表わす画像である。

図３４は、本発明に関連する第１世代（Ｇ１）のsd-rxRNA^nano分子の模式図であり、修飾のための標的である領域、および分子の異なる領域に関連する機能を示す。

図３５は、sd- rxRNA^nano（Ｇ１）の最適化のためにスクリーニングした修飾パターンを表わす。スクリーニングした修飾は、１９、２１および２５ヌクレオチドの長さのガイド鎖において、０～１８ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾、および、２’ＯＭｅ、５メチルＣおよび／またはリボチミジン修飾による２’Ｆの置き換えを含んだ。スクリーニングしたセンス鎖における修飾は、１１、１３および１９ヌクレオチドのヌクレオチド長のもの、０～４ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾および２’ＯＭｅ修飾を含んだ。

図３６は、最適化のためにスクリーニングしたsd- rxRNA^nanoの修飾を表わす模式図である。

図３７は、RiscフリーのsiRNA；rxRNA；Nano（未修飾）；ＧＳ単独；Nano Lead（Ｃｈｌを有さない）；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、８個のＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、８個のＰＳ、２１ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、１２個のＰＳ、２１ｎｔ）；およびNano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、１２個のＰＳ、２５ｎｔ）のトランスフェクションの後のHek293細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図３８は、ＧＳ単独；Nano Lead；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、８個のＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、８個のＰＳ、２１ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、１２個のＰＳ、２１ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１、１８および１９位における（３）２’ＯＭｅ、１２個のＰＳ、２５ｎｔ）の受動的取り込みトランスフェクションの後のHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図３９は、ガイド鎖単独（ＧＳ：８ＰＳ、１９ｎｔ）；ガイド鎖単独（ＧＳ：１８ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：ＰＳなし、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：２ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：４ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：６ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano Lead（ＧＳ：８ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１０ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１２ＰＳ、１９ｎｔ）；およびNano（ＧＳ：１８ＰＳ、１９ｎｔ）の脂質媒介性トランスフェクションの後のHek293細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図４０は、ガイド鎖単独（ＧＳ：８ＰＳ、１９ｎｔ）；ガイド鎖単独（ＧＳ：１８ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：ＰＳなし、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：２ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：４ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：６ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano Lead（ＧＳ：８ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１０ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１２ＰＳ、１９ｎｔ）；およびNano（ＧＳ：１８ＰＳ、１９ｎｔ）の脂質媒介性トランスフェクションの後のHek293細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図４１は、Nano Lead（Ｃｈｌなし）；ガイド鎖単独（１８ＰＳ）；Nano（ＧＳ：０ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：２ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：４ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：６ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano Lead（ＧＳ：８ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１０ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１２ＰＳ、１９ｎｔ）；およびNano（ＧＳ：１８ＰＳ、１９ｎｔ）の受動的取り込みトランスフェクションの後のHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図４２は、Nano Lead（Ｃｈｌなし）；ガイド鎖単独（１８ＰＳ）；Nano（ＧＳ：０ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：２ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：４ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：６ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano Lead（ＧＳ：８ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１０ＰＳ、１９ｎｔ）；Nano（ＧＳ：１２ＰＳ、１９ｎｔ）；およびNano（ＧＳ：１８ＰＳ、１９ｎｔ）の受動的取り込みトランスフェクションの後のHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図４３は、最適化のためにスクリーニングしたガイド鎖の化学修飾を表わす模式図である。

図４４は、RISCフリーsiRNA；GSのみ（２’ＦＣおよびＵｓ）；GSのみ（２’ＯＭｅＣおよびＵｓ）；Nano Lead（２’ＦＣおよびＵｓ）；nano（ＧＳ：（３）２’ＯＭｅ、１６～１８位）；nano（ＧＳ：（３）２’ＯＭｅ、１６、１７および１９位）；nano（ＧＳ：（４）２’ＯＭｅ、１１、１６～１８位）；nano（ＧＳ：（１０）２’ＯＭｅ、ＣおよびＵｓ）；nano（ＧＳ：（６）２’ＯＭｅ、１および５～９位）；nano（ＧＳ：（３）２’ＯＭｅ、１、１８および１９位）；ならびにnano（ＧＳ：（５）２’ＯＭｅＣｓ）のリバース・トランスフェクション（reverse transfection）の後のHek293細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図４５は、多様な化学修飾パターンの効力を示すグラフである。特に、１および１１～１８位における２－ＯＭｅ修飾は、良好な耐用性を示した。シード（seed）領域における２’ＯＭｅ修飾は、効力の僅かな低下をもたらした（が、なお高効率であった）。シードにおけるリボ修飾は、良好な耐用性を示した。このデータにより、２’Ｆ修飾が減少しているかまたはこれを有さない自己送達化合物の生成が可能になった。２’Ｆ修飾はin vivoでの毒性に関与し得るため、このことは重要である。

図４６は、センス鎖修飾を表わす模式図である。

図４７は、センス鎖の長さの最適化を示すグラフである。１０～１５塩基のセンス鎖の長さが、このアッセイにおいて最適であることを見出した。センス鎖の長さを増大することは、これらの化合物の受動的取り込みの低下をもたらすが、他の化合物については耐用性があるかもしれない。LNA修飾を含むセンス鎖は、LNAを含まない化合物と同様の効率を示した。一部の態様において、LNAまたは他の熱力学的に安定性をもたらす化合物の添加は、有益である場合があり、非機能的配列の機能的配列への変換をもたらす。

図４８は、ガイド鎖単独（２’ＦＣおよびＵ）；Nano Lead；Nano Lead（Ｃｈｌなし）；Nano（ＳＳ：１１ｎｔの２’ＯＭｅＣおよびＵｓ、Ｃｈｌ）；Nano（ＳＳ：１１ｎｔ、完全２’ＯＭｅ、Ｃｈｌ）；Nano（ＳＳ：１９ｎｔ、２’ＯＭｅＣおよびＵｓ、Ｃｈｌ）；Nano（ＳＳ：１９ｎｔ、２’ＯＭｅＣおよびＵｓ、Ｃｈｌなし）の受動的取り込みトランスフェクションの後のHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図４９は、Nano Lead（Ｃｈｌなし）；Nano（ＳＳ、ＰＳなし）；Nano Lead（ＳＳ：２ＰＳ）；Nano（ＳＳ：４ＰＳ）の受動的取り込みトランスフェクションの後のHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図５０は、sd-rxRNA^nanoの第２世代（ＧＩＩ）リード分子を表わす模式図である。

図５１は、sd-rxRNAの存在下におけるMAP4K4のサイレンシングについてのEC50値を示すグラフ、およびDY547標識rxRNA^oriおよびDY547標識sd-rxRNAの局在を表わす画像を表わす。

図５２は、最適化されたsd-rxRNA分子の存在下におけるHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフである。

図５３は、sd-rxRNAの効力の最適化における化学含有物の関連性を表わすグラフである。

図５４は、ステロール型分子の模式図、および多様なリンカー化合物を有するsd-rxRNA化合物が完全に機能的であることを明らかにするグラフを表わす。GII非対称化合物を、TEGおよびアミノカプロン酸リンカーを通して結合したステロール型分子を用いて合成した。いずれのリンカーも、同一の効力を示した。リンカー化合物に依存しない機能性は、本明細書において記載される分子と先に記載された分子との間の顕著な差異を示し、本明細書において記載される分子の、スケールアップおよび合成に関する顕著な利点を提案する。

図５５は、ヒト血清中の化学的に修飾されたsd-rxRNA化合物の、非修飾RNAと比較しての安定性を示す。オリゴヌクレオチドを、７５％血清中で３７℃で、示した数の時間にわたってインキュベートした。分解のレベルを、試料を非変性ゲルに流してSYBGRで染色することにより決定した。

図５６は、オリゴヌクレオチド含有物を最少化することを通してのsd-rxRNAの細胞取り込みの最適化を表わすグラフである。

図５７は、マウスPEC由来マクロファージにおけるsd-rxRNAの自発的細胞取り込みの後でのMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフ、ならびに、sd-rxRNAの局在を示す位相および蛍光画像である。

図５８は、初代マウス肝細胞におけるsd-rxRNA（標的化）およびsd-rxRNA（ミスマッチ）の自発的細胞取り込みの後でのMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフ、ならびに、sd-rxRNAの局在を示す位相および蛍光画像である。

図５９は、処方なしでRPE細胞に送達されたDY547標識sd-rxRNAの局在を表わす画像を表わす。

図６０は、処方なしのsd-rxRNA^nanoで処置されたRPE細胞におけるMAP4K4発現のサイレンシングを示すグラフである

図６１は、高効力のsd-rxRNA化合物の化学的／構造的組成を示すRNAi化合物のグラフおよび模式図を表わす。高効力の化合物は、以下の特徴を有することを見出した：１７～２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖、１０～１５ヌクレオチドのセンス鎖、２～１２のホスホロチオエート修飾、好ましくは６～８のホスホロチオエート修飾を含んだ一本鎖領域、および、ヌクレオチドの大多数が２’ＯＭｅ修飾されているセンス鎖であって、ホスホロチオエート修飾を有するかまたは有さないもの。これらの分子をセンス鎖の３’末端におけるコレステロールなどの疎水性部分に結合させるために、任意のリンカー化学を用いてよい。これらのRNA化合物のバージョンＧＩＩａ－ｂは、２’Ｆ含有物の除去が、効力に影響を有さないことを示す。

図６２は、Wolfrum et. al. Nature Biotech, 2007により公開された化合物と比較して、sd-rxRNA化合物の優れたパフォーマンスを示すRNAi化合物のグラフおよび模式図を表わす。Wolfrumらにおいて記載される世代ＩおよびＩＩの化合物（ＧＩおよびＧＩＩａ）（全てのオリゴがセンス鎖の３’末端に対するコレステロール抱合体を含む）の両方を、従来のsiRNA（１９ｂｐのデュプレックスであって２個の突出を有するもの）に関する同じ配列に適用し、化合物は実質的に不活性であった。これらのデータは、本明細書において記載される化学修飾と非対称分子との組合せの重要性を強調し、高効力のRNA化合物を提供する。

図６３は、sd-rxRNAは細胞内部に蓄積するが、他のより有効性が低い抱合体RNAは細胞表面に蓄積することを示す画像を表わす。

図６４は、sd-rxRNA分子は数分間以内に細胞内へ内部移行するが、他の分子はそうでないことを示す画像を表わす。

図６５は、sd-rxRNA化合物が、従来のコレステロール抱合体siRNA（Soucheckらにより公開されたものなど）と比較した場合に、極めてより良好な細胞および組織取り込み特性を有することを示す画像を表わす。図６５Ａ、Ｂは、RPE細胞における取り込みを比較し、図６５Ｃ、Ｄは、皮膚への局所投与の際の取り込みを比較し、図６５Ｅ、Ｆは、全身投与の際の肝臓による取り込みを比較する。取り込みのレベルは、通常のsiRNA－コレステロール化合物と比較して、sd-rxRNA化合物の方が少なくとも１桁の規模でより高い。

図６６は、局所送達の後でのrxRNA^oriおよびsd-rxRNAの局在を表わす画像を表わす。

図６７は、局所送達の後での、sd-rxRNAおよび他の抱合体RNAの局在を表わす画像を表わす。

図６８は、SPP1遺伝子を標的とする機能的な化合物を同定するためにsd-rxRNAGII化合物を用いて行われたスクリーニングの結果を明らかにするグラフを表わす。複数の有効な化合物を同定し、そのうちで14131が最も有効であった。化合物を、A-549細胞に添加して、SPP1／PPIBの比のレベルを４８時間後にB-DNAにより決定した。

図６９は、暴露の数分以内での効率的なsd-rxRNAの細胞取り込みを示すグラフおよび幾つかの画像を表わす。これは、本明細書において記載されるsd-rxRNA化合物の特有の特徴であり、他のRNAi化合物によっては観察されない。Soutschekらの化合物を、陰性対照として用いた。

図７０は、複数の配列による、複数の細胞型における、sd-rxRNA化合物の効率的な取り込みおよびサイレンシングを表わすグラフおよびいくつかの画像を表わす。各ケースにおいて、分岐DNAアッセイを用いて標的遺伝子発現を観察することにより、サイレンシングを確認した。

図７１は、sd-rxRNAが血清の存在下および不在下において活性であることを明らかにするグラフを表わす。血清の存在下において、効力の僅かな低下（２～５倍）を観察した。血清の存在下におけるこの最小限の効力の低下が、本明細書において記載されるsd-rxRNA化合物を、より大きな効力の低下を有する先に記載されているRNAi化合物と区別し、これにより本明細書において記載されるsd-rxRNA分子のin vivoでの効力の根拠を作り出す。

図７２は、本明細書において記載されるsd-rxRNA化合物の一回の皮内注射の後の、効率的な組織への浸透および細胞取り込みを示す画像を表わす。これは、sd-rxRNA化合物の局所送達のためのモデル、ならびに皮膚適用におけるsd-rxRNA化合物の送達および遺伝子のサイレンシングの有効な実証を表わす。

図７３は、皮内注射の後でのsd-rxRNAによる効率的な細胞取り込みおよびin vivoでのサイレンシングを示す画像およびグラフを表わす。

図７４は、sd-rxRNA化合物が、全身投与の後で、血液クリアランスを改善し、in vivoでの肝臓における有効な遺伝子サイレンシングを増大することを示すグラフである。

図７５は、RNAi化合物における５－メチルＣの存在が、脂質媒介性トランスフェクションの効力の増大をもたらすことを示すグラフを表わし、これは、RNAi化合物の含有物中のＣおよびＵの疎水性修飾が有益であり得ることを示す。一部の態様において、最適な安定性および効力を確実にするために、２’リボース修飾塩基に関してこれらの型の修飾を用いてもよい。

図７６は、Guide strand alone；Nano Lead；Nano Lead（コレステロールなし）；Guide strand w/5MeCおよび2’F U Alone；Nano Lead w/GS 5MeC and 2’F U；Nano Lead w/GS riboT and 5 Methyl C；ならびにNano Lead w/Guide dT and 5 Methyl Cの受動的取り込みトランスフェクションの後のHela細胞におけるMAP4K4発現のパーセンテージを示すグラフを表わす。

図７７は、肝臓への全身送達の後のsd-rxRNAおよび他のRNA抱合体の局在を比較する画像を表わす。

図７８は、改善された疎水性特徴を有する５－ウリジル修飾を示す模式図を表わす。sd-rxRNA化合物へのかかる修飾の組み込みは、細胞および組織の取り込み特性を増強し得る。図７８Ｂは、細胞取り込みおよび薬物動態的挙動を改善するために化合物に適用することができる、RNAi化合物の修飾の新しい型を表わす。この型の修飾は、sd-rxRNA化合物に適用した場合、かかる化合物を経口で利用可能にするために寄与し得る。

図７９は、合成された改変ステロール型分子の構造を明らかにする模式図を表わし、ここで、Ｃ１７結合テイルの長さおよび構造が改変されている。いかなる理論によっても拘束されることは望まないが、Ｃ１７結合テイルは、sd-rxRNA化合物のin vitroおよびin vivoでの効力を改善するために寄与し得る。

図８０は、長い側鎖コレステロールへのリトコール酸経路を示す模式図である。

図８１は、５－ウリジルホスホルアミダイト合成への経路を示す模式図を表わす。

図８２は、３’－コレステロール結合のための三官能性ヒドロキシピロリノール（hydroxyprolinol）リンカーの合成を示す模式図を表わす。

図８３は、非対称RNAi化合物のより短い鎖の製造のための固体支持体の合成を示す模式図を表わす。

図８４は、SPPIのsd-rxRNA化合物のセレクションを表わす。SPP1を標的とするSd-rxRNA化合物を、A549細胞に（受動的トランスフェクションを用いて）添加し、SPP1発現のレベルを４８時間後に評価した。SPP1のサイレンシングにおいて有効な幾つかの新規化合物を同定し、そのうちで最も強力であったものは、化合物14131であった。

図８５は、SPP1のサイレンシングにおけるsd-rxRNA化合物14116、14121、14131、14134、14139、14149および14152の効力の独立した評価を示す。

図８６は、CTGFのノックダウンにおいて機能的なsd-rxRNA化合物を同定するためのsd-rxRNA化合物のスクリーニングの結果を示す。

図８７は、CTGFのノックダウンにおいて機能的なsd-rxRNAを同定するためのsd-rxRNA化合物のスクリーニングの結果を示す。

図８８は、非対称化合物の最小の長さを同定するための統計的スクリーニングを示す。１０～１９塩基のパッセンジャー鎖を、１７～２５塩基のガイド鎖にハイブリダイズさせた。このアッセイにおいて、１０塩基の短さのデュプレックス領域を有する化合物が、誘導において有効であることを見出した。

図８９は、センス鎖の配置が、ガイド鎖と比較して、RNAi活性のために重要であることを示す。このアッセイにおいて、平滑末端が最適であったこと、３’突出が耐容性を示したこと、および５’突出が機能の完全な喪失をもたらしたことを見出した。

図９０は、ヌクレオチド２～１７においてのみ標的への相同性を有するガイド鎖が、異なる長さのセンス鎖とハイブリダイズされた場合に、有効なRNAiをもたらしたことを示す。脂質媒介性トランスフェクションを介して、化合物をHela細胞へ導入した。

図９１は、コレステロールの代わりに疎水性実体として用いることができるステロール型分子のパネルを表わす模式図である。一部の例において、より長い鎖を含むステロール型分子の使用が、有意により良好な細胞取り込みおよび組織分布特性を有するsd-rxRNA化合物の生成をもたらす。

図９２は、コレステロールの代わりに疎水性実体として用いることができる疎水性分子のパネルを表わす模式図を表わす。これらのリストは、単に代表例を提供するものであり、実質的な疎水性を有する任意の小分子を用いることができる。

詳細な説明
本発明の側面は、遺伝子サイレンシングに関与する方法および組成物に関する。本発明は、少なくとも部分的に、８～１４ヌクレオチドなどの最短の長さの二本鎖領域を有する非対称核酸分子が、遺伝子発現をサイレンシングする上で有効であるという驚くべき発見に基づく。かかる短い二本鎖領域を有する分子がRNA干渉を媒介する上で有効であることは、以前には示されていない。以前には、１９ヌクレオチドまたはそれより長い二本鎖領域が存在しなければならないと推測されていた。本明細書において記載される分子は、化学修飾を通して、一部の例においては疎水性抱合体の結合を通して、最適化される。

本発明は、少なくとも部分的に、減少した二本鎖領域を有する非対称核酸分子が従来のsiRNAと比較してより有効に細胞により取り込まれるという別の驚くべき発見に基づく。これらの分子は、標的遺伝子のサイレンシングにおいて高度に効率的であり、血清の存在下における高度の活性、効率的な自己送達、多様なリンカーとの適合性、および毒性に関連する化学修飾の存在の減少または完全な不在を含む、以前に記載されたRNAi分子を凌駕する顕著な利点を提供する。

一本鎖ポリヌクレオチドと対照的に、デュプレックスポリヌクレオチドは、細胞に送達することが困難であった。なぜならば、これらは強固な構造および多数の負の電荷を有し、これが膜輸送を困難とするからである。予想外に、本発明のポリヌクレオチドは、部分的に二本鎖であるにも拘わらず、in vivoで一本鎖として認識され、したがって、細胞膜を超えて効率的に送達されることができることを見出した。結果として、本発明のポリヌクレオチドは、多数の例において、自己送達が可能である。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、従来のRNAi剤と同様の様式において製剤化することができるか、あるいは、細胞または対象へ単独で（または非送達型キャリアと共に）送達することができ、自己送達を可能にする。本発明の一態様において、分子の一部分が従来のRNAデュプレックスに類似し、分子の第２の部分が一本鎖である、自己送達型非対称二本鎖RNA分子が提供される。

本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において、単離された二本鎖（double stranded）またはデュプレックスの核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ナノ分子、ナノRNA、sd-rxRNAnano、sd-rxRNAまたは本発明のRNA分子として言及される。

本発明のオリゴヌクレオチドは、一部の側面において、二本鎖領域および５ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖領域とを含む非対称構造と、化学修飾パターンとの組み合わせを有し、親油性または疎水性の分子に抱合される。この新しいクラスのRNAi様化合物は、in vitroおよびin vivoにおいて優れた効力を有する。本明細書において記載されるデータに基づいて、強固なデュプレックス領域のサイズの減少と、一本鎖領域に適用されるホスホロチオエート修飾との組み合わせが、新規であり、かつ観察された優れた効力を達成するために重要であると考えられる。したがって、本明細書において記載されるRNA分子は、構造および組成の両方、ならびにin vitroおよびin vivoでの活性において、異なっている。

好ましい態様において、本発明のRNAi化合物は、デュプレックス領域（効率的なRISC侵入のために必要であり、１０～１５塩基長のもの）および４～１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を含む非対称化合物を含み、１３ヌクレオチドのデュプレックスを有する。６ヌクレオチドの一本鎖領域が、一部の態様において好ましい。新規RNAi化合物の一本鎖領域はまた、２～１２のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾として言及される）を含む。６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、一部の態様において好ましい。さらに、本発明のRNAi化合物はまた、特有の化学修飾パターンを含み、これは、安定性を提供し、RISC侵入と相性がよい。これらの要因の組み合わせが、in vitroおよびin vivoでのRNAi剤の送達のために高度に有用である予想外の特性をもたらした。

安定性を提供しRISC侵入と相性がよい化学的に修飾されたパターンは、センスまたはパッセンジャー鎖、ならびにアンチセンスまたはガイド鎖への修飾を含む。例えば、安定性を確実にし、活性に干渉しない、任意の化学的実体により、パッセンジャー鎖を修飾してもよい。かかる修飾として、２’リボ修飾（Ｏ－メチル、２’Ｆ、２デオキシおよびその他）、ならびにホスホロチオエート修飾などの骨格修飾が挙げられる。パッセンジャー鎖における好ましい化学修飾パターンとして、パッセンジャー鎖中のＣおよびＵヌクレオチドのＯメチル修飾が挙げられる。あるいは、パッセンジャー鎖を完全にＯメチル修飾してもよい。

ガイド鎖を、例えば、またRISC侵入に干渉することなく安定性を確証する任意の化学修飾により修飾してもよい。ガイド鎖における好ましい化学修飾パターンとして、ＣおよびＵヌクレオチドの大多数が２’Ｆ修飾されており、５’末端がリン酸化されているものが挙げられる。ガイド鎖における別の好ましい化学修飾パターンとして、１位の２’Ｏメチル修飾、および１１～１８位におけるＣ／Ｕ、および５’末端の化学的リン酸化が挙げられる。ガイド鎖におけるさらに別の好ましい化学修飾パターンとして、１位の２’Ｏメチル修飾、および１１～１８位におけるＣ／Ｕ、および５’末端の化学的リン酸化、および２～１０位におけるＣ／Ｕの２’Ｆ修飾が挙げられる。

本発明により、驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドの上記の化学修飾パターンは、良好な耐用性を示し、実際に非対称RNAi化合物の効力を改善したことが発見された。例えば、図２２を参照。

本明細書においてまた実験的に示されたのは、RNAiへの修飾の組み合わせが、ポリヌクレオチドと共に用いた場合、RNAiの受動的取り込みにおける最適な効力の達成をもたらすことである。記載される成分のいずれか（ガイド鎖安定化、ホスホロチオエートの伸長、センス鎖安定化および疎水性の抱合体）の除去、またはサイズの減少は、最適より低い効力をもたらし、一部の場合においては、効力の完全な喪失をもたらす。要素の組み合わせにより、HeLa細胞などの細胞への送達の後で完全に活性である化合物の開発がもたらされる（図２３）。この要素の組み合わせが効率的なRNAi分子の自己送達をもたらす程度は、完全に予想外であった。

図２６、２７および４３において示されるデータは、RNAiへの多様な修飾の、安定性および活性を達成する上での重要性を示す。例えば、図２６は、非対称立体配置が、受動的取り込みにおける効力を得る上で重要であることを示す。同じ化学組成を伝統的な立体配置（１９～２１塩基のデュプレックスおよび２５マーのデュプレックス）の化合物に適用する場合、効力は、長さ依存的な様式において、著しく低下する。図２７は、ホスホロチオエート化学修飾の活性に対する影響の体系的スクリーニングを示す。配列、構造、安定性化学修飾、疎水性抱合体を一定に保ち、化合物のホスホロチオエート含有物を変化させた（０から１８ＰＳ結合へ）。ホスホロチオエート結合を含まない化合物および１８のホスホロチオエート結合を含む化合物はいずれも、受動的取り込みにおいて完全に不活性であった。２～１６のホスホロチオエート結合を有する化合物は活性であり、４～１０のホスホロチオエートを有する化合物が最も活性な化合物であった。

下に提示される例におけるデータは、本発明のオリゴヌクレオチドの、多様な細胞型におけるin vitroならびに局所および全身投与によるin vivoでの両方における高い効力を示す。例えば、データは、異なる化学を有する幾つかの競合的RNAi分子が遺伝子をサイレンシングする能力を比較する。sd-rxRNA（本発明のオリゴヌクレオチド）とSoucheckらおよびWolfrumらにおいて記載されたRNAとの比較は、同じ標的領域に適用されたものとして、sd-rxRNA化合物のみが受動的取り込みにおける顕著な機能性を示したことを実証した。本発明の組成物は、１０～５０ｐＭのＥＣ５０値を達成した。このレベルの効率は、Sauthceckらにおいて記載されるものなど従来の化合物、およびAccellによっては得ることができないものである。同様の比較を、in vitro（RPE細胞株）で、局所投与（創傷皮膚）および全身投与（５０ｍｇ／ｋｇ）の際のin vivoで、ならびに他の遺伝子などの、他のシステムにおいても行った（図６５および６８）。各々の場合において、本発明のオリゴヌクレオチドが、より良好な結果を達成した。図６４は、暴露のわずか１分後における、効率的な細胞取り込み、およびその結果として生じるsd-rxRNA化合物によるサイレンシングを示すデータを含む。かかる効力は、この組成物に特有であり、このクラスにおける他の型の分子によっては観察されなかった。図７０は、複数の配列による、複数の細胞型における、sd-rxRNA化合物の効率的な取り込みおよびサイレンシングを示す。sd-rxRNA化合物はまた、血清および他の生体液の存在下または不在下において活性である。図７１は、血清の存在下におけるごく僅かな活性の低下を示す。生物学的に攻撃的な環境において機能するこの能力は、sd-rxRNA化合物を、取り込みが血清の存在下において著しく阻害されるAccellおよびSoucheckらなど、この群において先に記載される他の化合物と、効果的にさらに差別化する。

夥しい量のデータがまた、本発明の化合物のin vivoでの効力を示す。例えば、図７２～７４は、顕著な活性をもたらす本発明の化合物のin vivoでの送達の複数の経路に関する。例えば図７２は、単一の皮内注射による、効率的な組織への浸透および細胞取り込みを示す。これは、sd-rxRNA化合物の局所送達、ならびに、任意の皮膚科的適用におけるsd-rxRNA化合物のための効果的な送達モードおよび遺伝子のサイレンシングのためのモデルである。図７３は、局所的なin vivoでのsd-rxRNA化合物の皮内注射による、効率的な組織への浸透、細胞取り込みおよびサイレンシングを示す。図７４のデータは、sd-rxRNA化合物が、ＩＶ投与により高度に効果的な肝臓取り込みをもたらすことを示す。Souicheckらの分子との比較は、同一の用量レベルでの肝臓取り込みのレベルは、極めて驚くべきものであったことを示し、sd-rxRNA化合物が、Souicheckらの分子よりも少なくとも５０倍高かった。

sd-rxRNAは、一部の例において、新規の型の化合物を用いて化合物の疎水性を改善することにより、さらに改善することができる。例えば、一化合物は、疎水性塩基修飾の使用に関する。修飾が塩基の分配係数の増大をもたらす限りにおいて、任意の位置における任意の塩基を修飾することができる。修飾化合物のための好ましい位置は、ピリミジンの４位および５位である。これらの位置の主要な利点は、（ａ）合成の容易性、および（ｂ）RISC複合体のローディングおよび標的認識のために必須である塩基対形成およびＡ型らせん（A form helix）形成に対する干渉がないこと、である。これらの化合物の例を、図７５～８３に示す。複数のデオキシウリジンが全体的な化合物の効力に干渉することなく存在するsd-rxRNA化合物のバージョンを用いた。組織分布および細胞取り込みにおける主な改善は、疎水性抱合体の構造を最適化することにより得ることができる。好ましい態様の一部において、ステロールの構造を、Ｃ１７結合鎖（C17 attached chain）を変化させる（増大する／減少する）ように修飾する。この型の修飾は、in vivoでの著しい細胞取り込みの増大および組織取り込み特性の改善をもたらす。

本発明は、その適用に関して、以下の説明において記載されるかまたは図面において説明される構築および成分の配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様、および多様な方法において実施されるか行われることが可能である。また、本明細書において用いられる用語および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびそれらの変化形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物、ならびにさらなる項目を包含することを意味する。

したがって、本発明の側面は、ガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含む、単離された二本鎖核酸分子に関する。本明細書において用いられる場合、用語「二本鎖」は、ヌクレオモノマー（ヌクレオモノマー）の少なくとも一部が相補的であり、二本鎖領域を形成するように水素結合されている、１または２以上の核酸分子を指す。一部の態様において、ガイド鎖の長さは、１６～２９ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、ガイド鎖は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド長である。ガイド鎖は標的遺伝子に対して相補性を有する。ガイド鎖と標的遺伝子との間の相補性は、ガイド鎖の任意の部分にわたって存在することができる。本明細書において用いられる場合、相補性とは、ガイド鎖が標的に対してRNAiを媒介できるように十分に相補的である限りにおいて、完全な相補性であっても、より不完全な相補性であってもよい。一部の態様において、相補性とは、ガイド鎖と標的との間の、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のミスマッチを指す。完全な相補性とは、１００％の相補性を指す。したがって、本発明は、遺伝子変異、系統多型、または進化による分岐に起因して予測することができる配列の変化に耐容性を示すことができるという利点を有する。例えば、標的配列と比較して挿入、欠失、および単一の点変異を有するsiRNAもまた、阻害について有効であることが見出されている。さらに、siRNAの全ての部位が標的の認識について同等に寄与するわけではない。siRNAの中心におけるミスマッチは、最も重要であり、本質的に標的RNAの切断を無効化する。アンチセンス鎖に関して、中心の上流または切断部位の上流におけるミスマッチは、耐用性を示すが、標的RNAの切断を著しく低減する。アンチセンス鎖に関して、中心または切断部位の下流におけるミスマッチ、好ましくは３’末端の付近、例えばアンチセンス鎖の３’末端から１、２、３、４、５または６ヌクレオチドに位置するものは、耐用性を示し、標的RNAの切断を、ごく僅かしか低減しない。

いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、一部の態様において、ガイド鎖は、少なくとも１６ヌクレオチドの長さであり、RISC中でアルゴノートタンパク質をアンカーする。一部の態様において、ガイド鎖がRISC中へロードするとき、これは明確なシード領域を有し、標的mRNAの切断は、ガイド鎖の１０～１１位にわたって行われる。一部の態様において、ガイド鎖の５’末端は、リン酸化されているか、またはリン酸化されることができる。本明細書において記載される核酸分子は、最短トリガーRNA（Minimum Length Trigger RNA）として言及される場合もある。

一部の態様において、パッセンジャー鎖の長さは、８～１４ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、パッセンジャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖に対して相補性を有する。パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の相補性は、パッセンジャーまたはガイド鎖の任意の部位にわたって存在してもよい。一部の態様において、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の間には、分子の二本鎖領域内に１００％の相補性が存在する。

本発明の側面は、最小二本鎖領域を有する二本鎖核酸分子に関する。一部の態様において、分子の二本鎖である領域は、８～１４ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、分子の二本鎖である領域は、８、９、１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチド長である。ある態様において、二本鎖領域は、１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の間に１００％の相補性が存在してもよく、またはガイド鎖およびパッセンジャー鎖の間に１または２以上のミスマッチが存在してもよい。一部の態様において、二本鎖分子の一方の末端において、分子は、平滑末端であるか、または１ヌクレオチドの突出を有する。分子の一本鎖領域は、一部の態様において、４～１２ヌクレオチド長である。例えば、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長であってよい。しかし、ある態様において、一本鎖領域はまた、４ヌクレオチド長未満であっても、または１２ヌクレオチド長より長くてもよい。ある態様において、一本鎖領域は、６ヌクレオチド長である。

本発明に関連するRNAiコンストラクトは、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有することができる。一部の態様において、熱力学的安定性（ΔＧ）は、－２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満である。一部の態様において、（ΔＧ）が－２１ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満となった場合、効力の喪失が存在する。一部の態様において、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌより高い（ΔＧ）値は、本発明の側面に適合性である。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、一部の態様において、相対的に高い（ΔＧ）値を有する分子は、相対的に高い濃度において活性になる場合があり、一方、相対的に低い（ΔＧ）値を有する分子は、相対的に低い濃度において活性になる場合がある。一部の態様において、（ΔＧ）値は、－９ｋｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高くてもよい。最小二本鎖領域を有する本発明に関連するRNAiコンストラクトにより媒介される遺伝子サイレンシング効果は、予測し得ない。なぜならば、ほぼ同一の設計であるが熱力学的安定性がより低い分子は、不活性であることが示されているからである（Rana et al. 2004）。

いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本明細書において記載される結果は、dsRNAまたはdsDNAの８～１０ｂｐの伸長が、RISCの成分であるタンパク質またはRISCのコファクターにより構造的に認識されるであろうことを示唆する。さらに、タンパク質成分により感受され得るか、および／または、かかる成分と相互作用するために十分に安定であり得、その結果アルゴノートタンパク質中へロードされ得る、トリガー化合物（triggering compound）のためのフリーエネルギー要求が存在する。最適な熱力学が存在し、好ましくは少なくとも８ヌクレオチドである二本鎖部分が存在する場合、デュプレックスは、認識され、RNAi機構の中にロードされる。

一部の態様において、熱力学的安定性は、LNA塩基の使用を通して増大する。一部の態様において、さらなる化学修飾を導入する。幾つかの非限定的な化学修飾の例として、５’ホスフェート、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－フルオロ、リボチミジン、Ｃ－５プロピニル－ｄＣ（ｐｄＣ）およびＣ－５プロピニル－ｄＵ（ｐｄＵ）；Ｃ－５プロピニル－Ｃ（ｐＣ）およびＣ－５プロピニル－Ｕ（ｐＵ）；５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－メチルｄＣ、５－メチルｄＵメトキシ、（２，６－ジアミノプリン）、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジンおよびＭＧＢ（副溝結合剤）が挙げられる。同じ分子内において１つより多くの化学修飾を組み合わせてもよいことが理解されるべきである。

本発明に関連する分子は、効力の増大および／または毒性の軽減のために、最適化される。例えば、ガイドおよび／またはパッセンジャー鎖のヌクレオチドの長さ、および／またはガイドおよび／またはパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の側面において、RNA分子の効力に影響を及ぼし、一方、２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾を２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾により置き換えることは、一部の側面において、分子の毒性に影響を及ぼす。具体的には、分子の２’Ｆ含有物の減少は、分子の毒性を低下させると予測される。例のセクションは、２’Ｆ修飾が取り除かれた分子を提示し、先に記載されたRNAi化合物に対しての予測される毒性の低下に起因する利点を提供する。さらに、RNA分子中のホスホロチオエート修飾の数は、細胞内への分子の取り込み、例えば、細胞内への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。本明細書において記載される分子の好ましい態様は、２’Ｆ修飾を有さず、なお細胞取り込みおよび組織への浸透における同等の効力により特徴づけられる。かかる分子は、２’Ｆの大量使用により重度に修飾されたAccellおよびWolfrumにより記載される分子などの先行技術に対して顕著な改善を表わす。

一部の態様において、ガイド鎖は、約１８～１９ヌクレオチドの長さであり、約２～１４のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１４ヌクレオチドより多くを含んでもよい。ガイド鎖は、RISC侵入に干渉することなく安定性を増大させる１または２以上の修飾を含んでもよい。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端にあっても、５’末端にあっても、またはガイド鎖全体に広がっていてもよい。一部の態様において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖はまた、２’Ｆおよび／または２’ＯＭｅ修飾を含んでもよく、これは、分子全体を通して位置していてもよい。一部の態様において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’の位置におけるヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾されているか、および／またはリン酸化されている。ガイド鎖中のＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の２～１０位（または異なる長さの鎖における対応する位置）におけるＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。ガイド鎖中のＣおよびＵヌクレオチドはまた、’ＯＭｅ修飾されていてもよい。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の１１～１８位（または異なる長さの鎖における対応する位置）におけるＣおよびＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。一部の態様において、ガイド鎖の最も３’末端におけるヌクレオチドは、未修飾である。ある態様において、ガイド鎖中のＣおよびＵの大部分は、２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の態様において、１位、および１１～１８位におけるＣまたはＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の態様において、１位、および１１～１８位におけるＣまたはＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２～１０位におけるＣまたはＵは２’Ｆ修飾されている。

一部の側面において、最適なパッセンジャー鎖は、約１１～１４ヌクレオチドの長さである。パッセンジャー鎖は、安定性を増大させる修飾を含んでもよい。パッセンジャー鎖における１または２以上のヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。一部の態様において、パッセンジャー鎖における１または２以上のＣおよび／またはＵヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾されているか、またはパッセンジャー鎖におけるＣおよびＵヌクレオチドの全てが２’ＯＭｅ修飾されている。ある態様において、パッセンジャー鎖における全てのヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾されている。パッセンジャー鎖上のヌクレオチド１または２以上はまた、リン酸修飾、例えばホスホロチオエート修飾されていてもよい。パッセンジャー鎖はまた、２’リボ、２’Ｆおよび２デオキシ修飾、または上記のものの任意の組み合わせを含んでもよい。例において示すように、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方における化学修飾パターンは、良好な耐用性を示し、RNA分子の効力および自己送達の増大をもたらすための化学修飾の組み合わせが、本明細書において示される。

本発明の側面は、RNAiについて先に用いられてきた分子と比較した場合に、二本鎖と比較して長い一本鎖領域を有するRNAiコンストラクトに関する。分子の一本鎖領域は、細胞取り込みまたは遺伝子サイレンシングを促進するために修飾されていてもよい。一部の態様において、一本鎖領域のホスホロチオエート修飾は、細胞取り込みおよび／または遺伝子サイレンシングに影響を及ぼす。ガイド鎖のホスホロチオエート修飾されている領域は、分子の一本鎖および二本鎖領域のいずれにおけるヌクレオチドを含んでもよい。一部の態様において、一本鎖領域は、２～１２のホスホロチオエート修飾を含む。例えば、一本鎖領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のホスホロチオエート修飾を含んでもよい。一部の例において、一本鎖領域は、６～８のホスホロチオエート修飾を含む。

本発明に関連する分子はまた、細胞取り込みのために最適化される。本明細書において記載されるRNA分子において、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、抱合体に結合していてもよい。ある態様において、抱合体は疎水性である。疎水性の抱合体は、１０より高い分配係数を有する小分子であってもよい。抱合体は、コレステロールなどのステロール型分子であっても、またはＣ１７に結合した長さが増大したポリ炭素鎖を有する分子であってもよく、抱合体の存在は、脂質トランスフェクション試薬の存在下または不在下においてRNA分子が細胞に取り込まれる能力に影響を及ぼし得る。抱合体は、疎水性リンカーを通して、パッセンジャー鎖またはガイド鎖に結合していてもよい。一部の態様において、疎水性リンカーは、５～１２Ｃの長さであり、および／またはヒドロキシピロリジンに基づく。一部の態様において、疎水性抱合体は、パッセンジャー鎖に結合し、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のいずれかのＣＵ残基は、修飾されている。一部の態様において、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のＣＵ残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、修飾されている。一部の側面において、本発明に関連する分子は、自己送達性（ｓｄ）である。本明細書において用いられる場合、「自己送達（self-delivery）」とは、分子が、トランスフェクション試薬などの付加的な送達ビヒクルを必要とすることなく細胞へ送達される能力を指す。

本発明の側面は、RNAiにおける使用のために分子を選択することに関する。本明細書において記載されるデータに基づいて、８～１４ヌクレオチドの二本鎖領域を有する分子を、RNAiにおける使用のために選択することができる。一部の態様において、分子は、その熱力学的安定性（ΔＧ）に基づいて選択される。一部の態様において、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の（ΔＧ）を有する分子が選択される。例えば、（ΔＧ）値は、－１３、－１４、－１５、－１６、－１７、－１８、－１９、－２１、－２２、または－２２ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満であってもよい。他の態様において、（ΔＧ）値は、－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌより高くてもよい。例えば、（ΔＧ）値は、－１２、－１１、－１０、－９、－８、－７、または－７ｋｋａｌ／ｍｏｌより高くてもよい。ΔＧは、当該分野において公知の任意の方法を用いて計算することができることが理解されるべきである。一部の態様において、ΔＧは、Mfoldインターネットサイト（http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi）を通して利用可能なMfoldを用いて計算する。ΔＧを計算するための方法は、以下の参考文献において記載され、それらから参考として組み込まれる：Zuker, M. (2003) Nucleic Acid Res., 31(13):3406-15; Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. and Turner, D. H. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-940; Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7287-7292; Duan, S., Mathews, D. H., and Turner, D. H. (2006) Biochemistry 45:9819-9832; Wuchty, S., Fontana, W., Hofacker, I. L., and Schuster, P. (1999) Biopolymers 49:145-165。

本発明の側面は、最小の二本鎖領域および／または－１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の（ΔＧ）を有する本明細書において記載される核酸分子を、遺伝子サイレンシングのために使用することに関する。RNAi分子は、in vivoまたはin vitroで投与することができ、遺伝子サイレンシング効果は、in vivoまたはin vitroで達成することができる。

ある態様において、ポリヌクレオチドは、５’－および／または３’末端の突出を含む。ポリヌクレオチドの一方の末端におけるヌクレオチド突出の数および／または配列は、ポリヌクレオチドの他方の末端と同じであっても異なっていてもよい。ある態様において、突出ヌクレオチドの１または２以上は、ホスホロチオエートまたは２’－ＯＭｅ修飾などの化学修飾を含んでもよい。

ある態様において、ポリヌクレオチドは、未修飾である。他の態様において、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている。さらなる態様において、修飾は、ガイド配列の５’末端から２つ目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｈまたは２’－修飾されたリボース糖を含む。「２つ目のヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの５’末端から２つ目のヌクレオチドとして定義される。
本明細書において用いられる場合、「２’－修飾されたリボース糖」は、２’－ＯＨ基を有さないリボース糖を含む。「２’－修飾されたリボース糖」は、（未修飾の基準のDNAヌクレオチドにおいて見出される）２’－デオキシリボースを含まない。例えば、２’－修飾されているリボース糖は、２’－Ｏ－アルキルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、またはこれらの組み合わせであってもよい。

ある態様において、２’－修飾されているヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド（例えばＣ／Ｕ）である。２’－Ｏ－アルキルヌクレオチドの例として、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドまたは２’－Ｏ－アリルヌクレオチドが挙げられる。
ある態様において、上記の５’末端修飾を有する本発明のminiRNAポリヌクレオチドは、特定された５’末端修飾を有さない類似のコンストラクトと比較した場合に、有意（例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超えて）により低い「オフ・ターゲット（off-target）」遺伝子サイレンシングを示し、したがって、RNAi試薬または治療の全体的な特異性を著しく改善する。

本明細書において用いられる場合、「オフ・ターゲット」遺伝子サイレンシングとは、例えばアンチセンス（ガイド）配列と、意図しない標的mRNA配列との間の偽の配列相同性に起因する、意図しない遺伝子サイレンシングを指す。
本発明のこの側面によれば、特定のガイド鎖修飾が、RNAi活性を著しく低下させることなく（またはRNAi活性を全く低下させることなく）、さらにヌクレアーゼ安定性を増大し、および／またはインターフェロン誘導を低下させる。

RNAiコンストラクトがヘアピンを含む一部の態様において、５’ステム配列は、ポリヌクレオチドの５’末端における２番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドなどの２’－修飾されたリボース糖を含み、一部の態様においては、他に修飾ヌクレオチドを含まない。かかる修飾を有するヘアピン構造は、前記の一において２’－Ｏ－メチル修飾を有しない類似のコンストラクトと比較して、標的特異性を増強するか、またはオフ・ターゲットサイレンシングを低減し得る。
特定の５’ステム配列の修飾と３’ステム配列の修飾との特定の組み合わせは、標的遺伝子の発現を阻害する能力の増強、血清安定性の増強、および／または標的特異性の増大などにより部分的に表わされる、さらなる予想外の利点をもたらし得る。

ある態様において、ガイド鎖は、ガイド鎖の５’末端における２番目のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含むか、または他に修飾ヌクレオチドを含まない。

他の側面において、本発明のminiRNA構造は、microRNA機構により、配列依存的な遺伝子サイレンシングを媒介する。本明細書において用いられる場合、用語「microRNA」（「miRNA」）はまた、当該分野において、「小分子RNA（small temporal RNA）」（「stRNA」）としても言及され、遺伝子的に（例えば、ウイルス、哺乳動物または植物ゲノムにより）コードされる小さい（１０～５０ヌクレオチドの）RNAであって、RNAサイレンシングを志規するかまたは媒介することができるものを指す。「miRNA障害」とは、miRNAの異常な発現または活性により特徴づけられる疾患または障害を指すべきである。

microRNAは、マウス、昆虫および哺乳動物において、発達または癌などの重要な経路において、標的遺伝子を下方調節することに関与する。microRNA機構を通した遺伝子サイレンシングは、特異的であるがなお不完全なmiRNAとその標的メッセンジャーRNA（mRNA）との塩基対形成により達成される。標的mRNA発現のmicroRNA媒介性の下方調節において、多様な機構を用いることができる。

miRNAは、約２２ヌクレオチドの非コードRNAであって、植物および動物の発達の間に、転写後または翻訳のレベルにおいて、遺伝子発現を調節することができるものである。miRNAの一つの共通の特徴は、それらがプレmiRNA（pre-miRNA）と称される約７０ヌクレオチドの前駆体RNAステムループから、恐らくはRNase III型酵素であるダイサーまたはそのホモログにより、切り取られることである。天然に存在するmiRNAは、in vivoで内因性遺伝子により発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体（プレmiRNAまたはプリmiRNA（pri-miRNA））から、ダイサーまたは他のRNAseによりプロセッシングされる。miRNAは、in vivoで二本鎖デュプレックス（double-stranded duplex）として一過性に存在することができるが、一方の鎖のみが遺伝子サイレンシングを指揮するためにRISC複合体に取り込まれる。

一部の態様において、細胞取り込みおよびmiRNAの阻害において有効なsd-rxRNA化合物のバージョンが記載される。本質的に、化合物は、RISC侵入性のバージョンに類似するが、大きな鎖の化学修飾パターンが、切断を遮断してRISC作用の効果的な有効な阻害剤として作用するように、最適化されている。例えば、化合物は、先に記載するＰＳ含有物で完全にまたは殆どＯメチル修飾されていてもよい。これらの型の化合物について、５’リン酸化は、必要でない。二本鎖領域の存在は、細胞取り込みおよび効率的なRISCローディングを促進するので、好ましい。

小分子RNAを配列特異的調節剤として用いる別の経路は、RNA干渉（RNAi）経路であり、これは、細胞における二本鎖RNA（dsRNA）の存在に対する進化的に保存された応答である。dsRNAは、ダイサーにより、約２０塩基対（ｂｐ）のデュプレックスの小分子干渉RNA（siRNA）へと切断される。これらの小分子RNAは、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と称される多タンパク質エフェクター複合体へと集合させられる。siRNAは、次いで、完全な相補性を有する標的mRNAの切断をガイドする。

バイオジェネシス、タンパク質複合体および機能の一部の側面は、siRNA経路とmiRNA経路との間で共有される。対象となる一本鎖ポリヌクレオチドは、siRNA機構においてdsRNAを模倣するか、miRNA機構においてmicroRNAを模倣する。
ある態様において、修飾RNAiコンストラクトは、同じ配列を有する未修飾RNAiコンストラクトと比較して、改善した血清および／または脳脊髄液中の安定性を有し得る。
ある態様において、RNAiコンストラクトの構造は、ヒト、マウスおよび他のげっ歯類、ならびに他の非ヒト哺乳動物からの初代細胞を含む哺乳動物の初代細胞などの初代細胞において、インターフェロン応答を誘導しない。ある態様において、RNAiコンストラクトはまた、無脊椎生物において標的遺伝子の発現を阻害するために用いることができる。

対象となるコンストラクトのin vivoでの安定性をさらに増大させるために、ヘアピン構造の３’末端を、保護基により遮断してもよい。例えば、反転（inverted）ヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはアミンＯ－修飾ヌクレオチドなどの保護基を用いることができる。反転ヌクレオチドは、反転デオキシヌクレオチドを含んでもよい。反転脱塩基部分は、３’，３’結合または５’，５’結合のデオキシ脱塩基部分などの、反転デオキシ脱塩基部分を含んでもよい。

本発明のRNAiコンストラクトは、標的遺伝子によりコードされる任意の標的タンパク質の合成を阻害することができる。本発明は、細胞において、in vitroまたはin vivoのいずれかで、標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。したがって、本発明のRNAiコンストラクトは、標的遺伝子の過剰発現により特徴づけられる疾患を有する患者を処置するために有用である。

標的遺伝子は、細胞にとって内因性であっても外因性（例えば、ウイルスにより、または組み換えDNA技術を用いて、細胞に導入されたもの）であってもよい。かかる方法は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量におけるRNAの細胞内への導入を含んでもよい。例えば、かかるRNA分子は、組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的なガイド鎖を含む。

本発明はまた、本発明の核酸を発現するベクター、および、かかるベクターまたは当該核酸を含む細胞に関する。細胞は、in vivoのまたは培養中の、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
哺乳動物は、さらに、対象となるRNAiコンストラクトと薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物に関する。

本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、対象となるRNAiコンストラクトのうちの任意のものと接触させることを含む。
方法は、in vitroで、ex vivoで、またはin vivoで、例えば、培養中のヒト細胞などの培養中の哺乳動物細胞において行うことができる。
標的細胞（例えば哺乳動物細胞）は、脂質（例えばカチオン性脂質）またはリポソームなどの送達試薬の存在下において、接触させてもよい。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、対象となるRNAiコンストラクトを発現するベクターと接触させることを含む。

本発明の一側面において、約１６～約３０ヌクレオチドの範囲のサイズである第１のポリヌクレオチドと、約２６～約４６ヌクレオチドの範囲のサイズである第２のポリヌクレオチドとを含む、より長いデュプレックスポリヌクレオチドが提供され、ここで、前記第１のポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）は、前記第２のポリヌクレオチド（センス鎖）および標的遺伝子の両方に対して相補的であり、両方のポリヌクレオチドは、デュプレックスを形成し、ここで、前記第１のポリヌクレオチドは、長さが６塩基より長い一本鎖領域を含み、択一的な（alternative）化学修飾パターンにより修飾されており、および／または細胞送達を促進する抱合体部分を含む。この態様において、パッセンジャー鎖のヌクレオチドの約４０～約９０％、ガイド鎖のヌクレオチドの約４０～約９０％、第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域のヌクレオチドの約４０～約９０％が、化学修飾ヌクレオチドである。

一態様において、ポリヌクレオチドデュプレックス中の化学修飾ヌクレオチドは、上で詳細に議論されたものなどの、当該分野において公知の任意の化学修飾ヌクレオチドであってよい。特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾されたものおよび２’デオキシヌクレオチドからなる群より選択される。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の「疎水性修飾」から生じる。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドはホスホロチオエートである。さらなる別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、２’デオキシ、疎水性修飾およびホスホロチオエートの組み合わせである。これらの群の修飾が、リボース環、骨格およびヌクレオチドの修飾を指す場合、一部の修飾ヌクレオチドは、３つの修飾の型全ての組み合わせを含むことも可能である。

別の態様において、化学修飾は、デュプレックスの多様な領域にわたって同じではない。特定の態様において、第１のポリヌクレオチド（パッセンジャー鎖）は、多数の多様な化学修飾を、多様な部位において有する。このポリヌクレオチドについて、ヌクレオチドの９０％までが、化学修飾されていてもよく、および／または導入されたミスマッチを有していてもよい。

別の態様において、第１のまたは第２のポリヌクレオチドの化学修飾として、限定されないが、５’位のウリジンおよびシトシンの修飾（４－ピリジル、２－ピリジル、インドリル、フェニル（Ｃ_６Ｈ_５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；ナフチルなど）が挙げられ、ここで、化学修飾は、ヌクレオチドの塩基対形成能力を変化させる場合がある。ガイド鎖について、本発明のこの側面の重要な特徴は、アンチセンスの５’末端に対する化学修飾の位置および配列である。例えば、ガイド鎖の５’末端の化学的リン酸化は、通常、効力のために有益である。センス鎖のシード領域（５’末端に対して２～７位）におけるＯ－メチル修飾は、一般に、良好な耐用性を示さないが、一方、２’Ｆおよびデオキシは、良好な耐用性を示す。ガイド鎖の中間部分およびガイド鎖の３’末端は、適用される化学修飾の型において、より許容的である。デオキシ修飾は、ガイド鎖の３’末端においては、耐用性を示さない。

本発明のこの側面の特有の特徴は、塩基に対する疎水性の修飾の使用を含む。本発明の一態様において、疎水性修飾は、好ましくは、ガイド鎖の５’末端付近に位置し、他の態様においては、それらはガイド鎖の中間に局在し、他の態様においては、それらはガイド鎖の３’末端に局在し、さらに別の態様において、それらは、ポリヌクレオチドの全長を通して分布する。同じ型のパターンを、デュプレックスのパッセンジャー鎖に適用することが可能である。
分子の他方の部分は、一本鎖領域である。一本鎖領域は、７～４０ヌクレオチドの範囲であると予測される。

一態様において、第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域は、約４０％～９０％の疎水性塩基修飾、約４０％～９０％のホスホロチオエート、約４０％～９０％のリボース部分、および前述のものの任意の組み合わせからなる群より選択される修飾を含む。
ガイド鎖（第１のポリヌクレオチド）のRISC複合体中へのローディングの効率は、重度に修飾されたポリヌクレオチドについて変化する場合があるので、本発明の一態様においては、効率的なガイド鎖のローディングを促進するために、デュプレックスポリヌクレオチドは、ガイド鎖（第１のポリヌクレオチド）上のヌクレオチド９、１１、１２、１３または１４と、センス鎖（第２のポリヌクレオチド）上の反対のヌクレオチドとの間のミスマッチを含む。

より詳細な本発明の側面は、以下のセクションにおいて記載される。
デュプレックスの特徴
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々の相補的な核酸鎖により形成することができる。デュプレックス形成は、標的遺伝子を含有する細胞の内側で起きても外側で起きてもよい。

本明細書において用いられる場合、用語「デュプレックス（duplex）」は、相補的な配列に水素結合している二本鎖（double-stranded）核酸分子の領域を含む。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列、および標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含み得る。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列に対応し、例えば、標的遺伝子配列と同一であるか、または標的遺伝子の阻害をもたらすために十分に同一（例えば、ほぼ少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一または８０％同一）である。

ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端においても突出する一本鎖配列を有さない、すなわち、平滑末端である。他の態様において、個々の核酸分子は、異なる長さのものであってもよい。言い換えると、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖でない。例えば、２つの別々の核酸分子が用いられる場合、分子の一方、例えばアンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長くてもよい（分子の一部を一本鎖とする）。同様に、単一の核酸分子が用いられる場合、分子のいずれの末端の部分が一本鎖のままであってもよい。

一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチおよび／またはループまたはバルジを含むが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％～９５％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％～９８％にわたって二本鎖である。ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個までのミスマッチを含む。

修飾
本発明のヌクレオチドは、糖部分、ホスホジエステル結合および／または塩基を含む、多様な位置において修飾することができる。
糖部分は、天然の未修飾糖、例えば単糖（ペントース、例えばリボース、デオキシリボースなど）、修飾糖および糖アナログを含む。一般に、可能なヌクレオモノマーの修飾、特に糖部分のものとして、例えば、ヒドロキシル基の１または２以上の、ハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基での置き換え、またはヒドロキシル基の、エーテル、アミン、チオールなどとしての官能化が挙げられる。

一つの特に有用な修飾ヌクレオモノマーの群は、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである。かかる２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、「メチル化されている」として言及される場合があり、対応するヌクレオチドは、非メチル化ヌクレオチドからアルキル化により、または直接的にメチル化ヌクレオチド試薬から、作られる。修飾ヌクレオモノマーは、未修飾ヌクレオモノマーと組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、メチル化および非メチル化ヌクレオモノマーの両方を含んでもよい。

一部の例示的な修飾ヌクレオモノマーとして、糖または骨格が修飾されたリボヌクレオチドが挙げられる。修飾リボヌクレオチドは、５’位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５’－（２－アミノ）プロピルウリジンおよび５’－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７－デアザ－アデノシン；ならびにＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンなどの、天然に存在しない塩基を（天然に存在する塩基の代わりに）含んでもよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、Ｈ、アルコキシ（もしくはＯＲ）、Ｒもしくはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２など）、またはＣＮ基で置き換えられた２’－ＯＨ基を有していてもよく、ここで、Ｒは、低級アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。

修飾リボヌクレオチドはまた、修飾基、例えばホスホロチオエート基により置き換えられた、隣接するリボヌクレオチドに連結するホスホジエステル基を有してもよい。より一般的には、多様なヌクレオチド修飾を組み合わせてもよい。
アンチセンス（ガイド）鎖は、標的遺伝子の少なくとも一部に対して実質的に同一であり得るが、少なくとも塩基対形成に関連して、配列は、有用であるために、例えば標的遺伝子の表現型の発現を阻害するために、完全に同一である必要はない。一般に、より高い相同性は、より短いアンチセンス遺伝子の使用を埋め合わせるために用いられ得る。一部のケースにおいて、アンチセンス鎖は、一般に、標的遺伝子に対して（アンチセンス方向において）実質的に同一である。

２’－Ｏ－メチル修飾RNAの使用はまた、細胞ストレス応答を最少化することが望ましい状況においても有益であり得る。２’－Ｏ－メチルヌクレオモノマーを有するRNAは、未修飾RNAを認識すると考えられる細胞機構によって認識され得ない。２’－Ｏ－メチル化された、または部分的に２’－Ｏ－メチル化されたRNAは、標的RNA阻害を維持しつつ、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答を回避し得る。これは、例えば、インターフェロンまたは他の細胞ストレス応答を回避するために、インターフェロン応答を誘導する短いRNAi（例えばsiRNA）配列、および、インターフェロン応答を誘導し得るより長いRNAi配列の両方において、有用であり得る。

全体として、修飾糖として、Ｄ－リボース、２’－Ｏ－アルキル（２’－Ｏ－メチルおよび２’－Ｏ－エチルを含む）、すなわち、２’－アルコキシ、２’－アミノ、２’－Ｓ－アルキル、２’－ハロ（２’－フルオロを含む）、２’－メトキシエトキシ、２’－アリルオキシ（－ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’－プロパルギル、２’－プロピル、エチニル、エテニル、プロペニルならびにシアノなどが挙げられる。一態様において、糖部分は、記載されるように（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)）、ヘキトースであってもよく、オリゴヌクレオチド中に組み込まれてもよい。例示的なヌクレオモノマーは、例えば、米国特許第5,849,902号において見出すことができ、これは本明細書において参考として組み込まれる。

用語「アルキル」は、飽和脂肪族基を含み、これは、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、６個またはそれより少ない（例えば、直鎖についてはＣ_１－Ｃ_６、分枝鎖についてはＣ_３－Ｃ_６）、より好ましくは４個またはそれより少ない、炭素原子をその骨格中に有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、３～８個の炭素原子をその環構造中に有し、より好ましくは５または６個の炭素を環構造中に有する。用語Ｃ_１－Ｃ_６は、１～６個の炭素原子を含むアルキル基を含む。

さらに、他に特定されない限りにおいて、用語、アルキルは、「未置換のアルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキル部分を指す。かかる置換基として、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸（phosphate）、ホスホナート（phosphonato）、ホスフィナート（phosphinato）、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸（sulfate）類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられる。シクロアルキルは、例えば上記の置換基により、さらに置換されてもよい。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例えば、フェニルメチル（ベンジル））である。用語「アルキル」はまた、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を含む。用語「ｎ－アルキル」は、直鎖（すなわち、非分枝）の未置換のアルキル基を意味する。

用語「アルケニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも１つの二重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルケニル」は、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、６個またはそれより少ない炭素原子をその骨格中に有する（例えば、直鎖についてはＣ_２－Ｃ_６、分枝鎖についてＣ_３－Ｃ_６）。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造中に３～８個の炭素原子、より好ましくは環構造中に５または６個の炭素を有してもよい。用語、Ｃ_２－Ｃ_６は、２～６個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。

さらに、他に特定されない限りにおいて、用語、アルケニルは、「未置換のアルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルケニル部分を指す。かかる置換基として、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられる。

用語「アルキニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも１つの三重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルキニル」は、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、６個またはそれより少ない炭素原子をその骨格中に有する（例えば、直鎖についてはＣ_２－Ｃ_６、分枝鎖についてＣ_３－Ｃ_６）。用語、Ｃ_２－Ｃ_６は、２～６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。

さらに、他に特定されない限りにおいて、用語、アルキニルは、「未置換のアルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキニル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲンｓ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。

炭素の数が他に特定されない限りにおいて、「低級アルキル」は、本明細書において用いられる場合、上で定義される、しかし１～５個の炭素原子をその骨格構造中に有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば、２～５個の炭素原子の鎖長を有する。

用語「アルコキシ」は、酸素原子に共有結合している置換および未置換のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が挙げられる。置換アルコキシ基の例として、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフィイドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸、アルキルスルフミル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの、独立して選択される基により置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例として、限定されないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどが挙げられる。

用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄およびリンである。
用語「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、（適切なカウンターイオンと共に）－ＯＨまたは－Ｏ－を有する基を含む。
用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。用語「全ハロゲン化」は、一般に、全ての水素がハロゲン原子により置き換えられている部分を指す。

用語「置換される」は、当該部分に配置され得、当該分子がその意図する機能を行うことを可能にする、独立して選択される置換基を含む。置換基の例として、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｃ（ハロゲン）_３、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＨ（ハロゲン）_２、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＯＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｓ（Ｏ）_１－２ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｓ（Ｏ）_０－２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＣＯ_２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ’’）_０－３ＯＲ’基；ここで各Ｒ’およびＲ’’は、各々独立して、水素、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ２～Ｃ５アルキニルもしくはアリール基であるか、またはＲ’およびＲ’’は、一緒になって、ベンジリデン基もしくは－（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_２－基である、が挙げられる。

用語「アミン」または「アミノ」は、窒素原子が少なくとも１個の炭素またはヘテロ原子に共有結合している化合物または部分を含む。用語「アルキルアミノ」は、窒素が少なくとも１つのさらなるアルキル基に結合している基および化合物を含む。用語「ジアルキルアミノ」は、窒素原子が、少なくとも２つのさらなるアルキル基に結合している基を含む。

用語「エーテル」は、２個の異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含有化合物または部分を含む。例えば、この用語は、「アルコキシアルキル」を含み、これは、別のアルキル基に共有結合した酸素原子に共有結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。

用語「塩基」は、公知のプリンおよびピリミジン複素環式塩基、デアザプリン、ならびにそのアナログ（ヘテロ環置換アナログ、例えば、アミノエトキシフェノキサジンを含む）、誘導体（例えば、１－アルキル－、１－アルケニル－、ヘテロ芳香族－および１－アルキニル誘導体）および互変異性体を含む。プリンの例として、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリン、およびキサンチン、ならびにそのアナログ（例えば、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニンまたは７－ジアザキサンチン）および誘導体が挙げられる。ピリミジンは、例えば、チミン、ウラシル、およびシトシン、ならびにそれらのアナログ（例えば、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－（１－プロピニル）ウラシル、５－（１－プロピニル）シトシンおよび４，４－エタノシトシン）を含む。好適な塩基の他の例として、２－アミノピリジンおよびトリアジン類などの非プリニルおよび非ピリミジニル塩基が挙げられる。

好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、RNAヌクレオチドである。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、置換RNAヌクレオチドである。したがって、オリゴヌクレオチドは、置換RNAヌクレオチドを含む。

用語「ヌクレオシド」は、糖部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合した塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例として、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドはまた、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基または保護基を含んでもよいアミノ酸またはアミノ酸アナログに結合した塩基を含む。好適な保護基は当該分野において周知である（P. G. M. WutsおよびT. W. Greene、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第２版、Wiley-Interscience、New York、1999年を参照）。
用語「ヌクレオチド」は、リン酸基またはリン酸アナログをさらに含むヌクレオシドを含む。

本明細書において用いる場合、用語「結合（linkage）」は、天然に存在する、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する未修飾ホスホジエステル部分（－Ｏ－（ＰＯ^２－）－Ｏ－）を含む。本明細書において用いられる場合、用語「置換結合（substitute linkage）」は、ネイティブなホスホジエステル基の、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する任意のアナログまたは誘導体を含む。置換結合として、ホスホジエステルアナログ、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびＰ－エチオキシホスホジエステル（P-ethyoxyphosphodiester）、Ｐ－エトキシホスホジエステル、Ｐ－アルキルオキシホスホジエステル、メチルホスホナート、およびリンを含有しない結合、例えばアセタールおよびアミドが挙げられる。かかる置換結合は、当該分野において公知である（例えば、Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。ある態様において、ホスホロチオエート結合などの非加水分解性結合が好ましい。

ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、疎水性に修飾されたヌクレオチドまたは「疎水性修飾」を含む。本明細書において用いられる場合、「疎水性修飾」は、（１）塩基の全体的な疎水性が著しく増大し、および／または（２）塩基がなお通常のワトソン－クリック相互作用に類似するものを形成することができるように修飾された塩基を指す。幾つかの非限定的な塩基修飾の例として、フェニル、４－ピリジル、２－ピリジル、インドリル、およびイソブチル、フェニル（Ｃ_６Ｈ_５ＯＨ）などの５位のウリジンおよびシチジン修飾；トリプトファニル（Ｃ_８Ｈ_６Ｎ）ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；およびナフチルが挙げられる。

ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’および５’末端を含む（環状オリゴヌクレオチドを除く）。一態様において、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端は、例えば、３’または５’結合を改変することにより（例えば、米国特許第5,849,902号およびWO 98/13526）、ヌクレアーゼから実質的に保護されていてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含有させることにより耐性であり得る。用語「ブロッキング基」は、本明細書において用いられる場合、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに、保護基または合成のためのカップリング基のいずれかとして結合することができる置換基（例えば、ＯＨ基以外のもの）を指す（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３）、グリコール（－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）ホスホナート（ＰＯ_３ ^２－）、ホスホン酸水素（hydrogen phosphonate）、またはホスホルアミダイト）。「ブロッキング基」はまた、「エンドブロッキング基」または「エクソヌクレアーゼブロッキング基」を含み、これは、修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエクソヌクレアーゼ耐性構造を含むオリゴヌクレオチドの５’および３’末端を保護する。

例示的なエンドブロッキング基は、キャップ構造（例えば、７－メチルグアノシンキャップ）、反転（inverted）ヌクレオモノマー、例えば、３’－３’または５’－５’末端の反転（inversion）によるもの（例えば、Ortiagao et al. 1992. Antisence Res. Dev. 2:129を参照）、メチルホスホナート、ホスホルアミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体）などを含む。３’末端のヌクレオモノマーは、修飾糖部分を含んでもよい。３’末端のヌクレオモノマーは、３’－Ｏを含み、これは任意に、オリゴヌクレオチドの３’－エクソヌクレアーゼ分解を防止するブロッキング基により置換されていてもよい。例えば、３’－ヒドロキシルは、３’→３’ヌクレオチド間結合を通して、ヌクレオチドに対してエステル化されていてもよい。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシまたはイソプロポキシ、好ましくはエトキシであってよい。任意に、３’末端において３’→３’結合したヌクレオチドは、置換結合により結合していてもよい。ヌクレアーゼ分解を低減するために、5' most 3'→5'結合（5' most 3'→5' linkage）は、修飾された結合、例えば、ホスホロチオエートまたはＰ－アルキルオキシホスホトリエステル結合であってもよい。好ましくは、２つの5' most 3'→5'結合は修飾された結合である。任意に、５’末端のヒドロキシ部分は、リン含有部分、リン含有部分、例えば、リン酸、ホスホロチオエートまたはＰ－エトキシリン酸とエステル化されていてもよい。

末端（３’または５’末端）、ループ領域またはminiRNAの任意の他の部分に結合することができる別の型の抱合体は、ステロール、ステロール型分子、ペプチド、小分子、タンパク質などを含む。一部の態様において、miniRNAは、１つより多い抱合体（同じまたは異なる化学的性質のもの）を含んでもよい。一部の態様において、抱合体は、コレステロールである。

標的遺伝子特異性を増大させる、またはオフ－ターゲットサイレンシング作用を低減するための別の方法は、ガイド配列の５’末端の２番目のヌクレオチドに対応する位置において、２’修飾（２’－Ｏ－メチル修飾など）を導入することである。これにより、ダイサー耐性ヘアピン構造におけるこの２’－修飾の配置が可能になり、それにより、オフ－ターゲットサイレンシングがより少ないか、オフ－ターゲットサイレンシングを有さない、より良好なRNAiコンストラクトを設計することが可能になる。

一態様において、本発明のヘアピンポリヌクレオチドは、DNAである１つの核酸部分と、RNAである１つの核酸部分とを含むことができる。本発明のアンチセンス（ガイド）配列は、RNA様およびDNA様の領域を含む「キメラオリゴヌクレオチド」であってもよい。

語「RNase H活性化領域」は、オリゴヌクレオチド、例えばキメラオリゴヌクレオチドの、当該オリゴヌクレオチドが結合する標的RNA鎖を切断するRNase Hを動員することができる領域を含む。代表的には、RNase活性化領域は、DNAまたはDNA様ヌクレオモノマーの（少なくとも約３～５、代表的には約３～１２、より代表的には約５～１２、より好ましくは約５～１０の、連続するヌクレオモノマーの）最小コアを含む（例えば、米国特許第5,849,902号を参照）。好ましくは、RNase H活性化領域は、約９個の連続するデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。

語「非活性化領域」は、アンチセンス配列、例えばキメラオリゴヌクレオチドの領域であって、RNase Hを動員または活性化しないものを含む。好ましくは、非活性化領域は、ホスホロチオエートDNAを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非活性化領域を含む。一態様において、非活性化領域は、ヌクレアーゼに対して安定であることができるか、または、標的に対して相補的であることおよびオリゴヌクレオチドにより結合される標的核酸分子と水素結合を形成することにより標的に対する特異性を提供することができる。

一態様において、連続するポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換結合、例えばホスホロチオエート結合により結合している。
ある態様において、ガイド配列を超えるヌクレオチドの殆どまたは全ては（２’修飾されていようがいまいが）ホスホロチオエート結合により結合している。かかるコンストラクトは、その血清タンパク質に対するより高いアフィニティーに起因して、薬物動態学が改善されている傾向がある。ポリヌクレオチドの非ガイド配列部分におけるホスホロチオエート結合は、一般に、一旦ガイド鎖がRISCにロードされた後は、ガイド鎖の活性に干渉しない。

本発明のアンチセンス（ガイド）配列は、「モルホリノオリゴヌクレオチド」を含んでもよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは、非イオン性であり、RNase H非依存的機構により機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの４つの遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン／ウラシル）は、６員のモルホリン環に結合している。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、非イオン性ホスホロジアミデート（phosphorodiamidate）サブユニット間結合により、４つの異なるサブユニット型を結合することにより作られる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、以下を含む多数の利点を有する：ヌクレアーゼに対する完全な耐性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）；予測可能な標的化（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；細胞における確実な活性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）；優れた配列特異性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:151）；最小限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；および簡便な浸透圧または掻爬による送達（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）。モルホリノオリゴヌクレオチドはまた、高用量におけるその非毒性により好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製の議論は、Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187において見出すことができる。

本明細書において記載される化学修飾は、本明細書において記載されるデータに基づき、一本鎖ポリヌクレオチドのRISC中へのローディングを促進すると考えられる。一本鎖ポリヌクレオチドは、RISC中へのローディング、および遺伝子サイレンシングの誘導において活性であることが示されている。しかし、一本鎖ポリヌクレオチドについての活性のレベルは、デュプレックスポリヌクレオチドと比較した場合に、２～４桁の規模で、より低いと考えられる。

本発明は、（ａ）一本鎖ポリヌクレオチドの安定性を著しく増大し、（ｂ）ポリヌクレオチドのRISC複合体への効率的なローディングを促進し、および（ｃ）一本鎖ヌクレオチドの細胞による取り込みを改善する、化学修飾パターンの説明を提供する。図５は、細胞において一本鎖ポリヌクレオチドの効力を達成するために有益であり得る化学修飾パターンの幾つかの非限定的な例を提供する。化学修飾パターンは、リボース修飾、骨格修飾、疎水性ヌクレオシド修飾と、抱合体型修飾との組み合わせを含み得る。さらに、態様の一部において、単一のポリヌクレオチドの５’末端は、化学的にリン酸化されていてもよい。

さらに別の例において、本発明は、RISC阻害性ポリヌクレオチドの機能を改善する化学修飾パターンの説明を提供する。一本鎖ポリヌクレオチドは、基質競合機構を通して、予めロードされたRISC複合体の活性を阻害することが示されている。通常アンタゴマー（antagomer）と称されるこれらの型の分子について、活性には、通常、高濃度が必要であり、in vivoでの送達はあまり効果的ではない。本発明は、（ａ）一本鎖ポリヌクレオチドの安定性を著しく増大し、（ｂ）RISCによるポリヌクレオチドの基質としての効率的な認識を促進し、および／または（ｃ）細胞による一本鎖ヌクレオチドの取り込みを改善する、化学修飾パターンの説明を提供する。図６は、細胞内での一本鎖ポリヌクレオチドの効力を達成するために有益であり得る化学修飾パターンのいくつかの非限定的な例を提供する。化学修飾パターンは、リボース修飾、骨格修飾、疎水性ヌクレオシド修飾と、抱合体型修飾との組合せを含み得る。

本発明により提供される修飾は、全てのポリヌクレオチドに対して適用可能である。これは、一本鎖RISC侵入性ポリヌクレオチド、一本鎖RISC阻害性ポリヌクレオチド、多様な長さ（１５～４０ｂｐ）の従来のデュプレックス化ポリヌクレオチド、非対称性デュプレックス化ポリヌクレオチドなどを含む。ポリヌクレオチドは、５’末端修飾、リボース修飾、骨格修飾および疎水性ヌクレオシド修飾を含む、多様な化学修飾パターンにより修飾されていてよい。

合成
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野において公知の任意の方法により、例えば、酵素による合成および／または化学合成を用いて、合成することができる。オリゴヌクレオチドは、in vitroで（例えば、酵素による合成および化学合成を用いて）、またはin vivoで（当該分野において周知の組み換えDNA技術を用いて）合成することができる。

好ましい態様において、化学合成は、修飾ポリヌクレオチドのために用いられる。直鎖オリゴヌクレオチドの化学合成は、当該分野において周知であり、溶液または固相の技術により達成することができる。好ましくは、合成は、固相方法によるものである。オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト、亜リン酸トリエステル、Ｈ－ホスホナートおよびホスホトリエステル方法を含む、幾つかの異なる合成手順のいずれかにより、代表的には自動合成方法により、行ってもよい。

オリゴヌクレオチドの合成プロトコルは、当該分野において周知であり、例えば、米国特許第5,830,653号；WO 98/13526；Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soc. 106:6077；Stec et al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908；Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263；LaPlanche et al. 1986. Nucl. Acid. Res. 1986. 14:9081；Fasman G. D., 1989. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989. CRC Press, Boca Raton, Fla.；Lamone. 1993. Biochem. Soc. Trans. 21:1；米国特許第5,013,830号；米国特許第5,214,135号；米国特許第5,525,719号；Kawasaki et al. 1993. J. Med. Chem. 36:831；WO 92/03568；米国特許第5,276,019号；および米国特許第5,264,423号において見出すことができる。

選択される合成方法は、所望のオリゴヌクレオチドの長さに依存し得、かかる選択は、当業者の技術の範囲内である。例えば、ホスホルアミダイトおよび亜リン酸トリエステル法により、１７５またはそれより多いヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを生成することができ、一方、Ｈ－ホスホナート法は、１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドのために良好に機能する。修飾塩基をオリゴヌクレオチドに組み込む場合、および特に修飾ホスホジエステル結合を用いる場合、合成手順は、必要に応じて、公知の手順に従って、変更される。このことに関して、Uhlmannら（1990, Chemical Reviews 90:543-584）は、修飾塩基および修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを作製するための参考文献および概略手順を提供する。オリゴヌクレオチドを作製するための他の例示的な方法は、Sonveaux、1994年、「Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis」；Agrawal、Methods in Molecular Biology 26:1において教示される。例示的な合成方法はまた、「Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach」（Gait, M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984）においても教示される。さらに、修飾ヌクレオチドを有する一部の配列を含む規定の配列の直鎖オリゴヌクレオチドは、幾つかの市販のソースから容易に入手可能である。

オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはゲルクロマトグラフィーおよび高圧液体クロマトグラフィーを含む多数のクロマトグラフィー的方法のいずれにより、精製することができる。ヌクレオチド配列、特に未修飾ヌクレオチド配列を確認するために、オリゴヌクレオチドを、マクサム・ギルバートシークエンシング、サンガーシークエンシング、キャピラリー電気泳動シークエンシング、wandering spotシークエンシングの手順を含む公知の手順のいずれかにより、またはHybond紙に結合させたオリゴヌクレオチドの選択的化学分解を用いることにより、DNAシークエンシングに供してもよい。短いオリゴヌクレオチドの配列は、レーザー脱離質量分析により、または高速原子衝撃により、分析することができる（McNeal, et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:976; Viari, et al., 1987, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 14:83; Grotjahn et al., 1982, Nuc. Acid Res. 10:4671）。シークエンシング方法はまた、RNAオリゴヌクレオチドについても利用可能である。

合成されたオリゴヌクレオチドの品質を、オリゴヌクレオチドを、例えばBergot and Egan. 1992. J. Chrom. 599:35の方法を用いて、キャピラリー電気泳動および分解性強アニオンHPLC（denaturing strong anion HPLC：SAX-HPLC）により試験することにより評価することができる。

他の例示的な合成技術は当該分野において周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis（M J Gait Ed, 1984; Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；またはシリーズであるMethods in Enzymology（Academic Press, Inc.)を参照）。

ある態様において、目的のRNAiコンストラクトまたは少なくともその一部は、目的のコンストラクトをコードする発現ベクターから転写される。この目的のために、任意の当該分野において認識されたベクターを用いることができる。転写されたRNAiコンストラクトを、所望の修飾（未修飾センス鎖を修飾されたものにより置き換えることなど）を行う前に、単離し、精製することができる。

送達／キャリア
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物は、１または２以上の細胞または細胞ライセートと接触させられ（すなわち、接触させられる、または本明細書においては投与または送達されるとして言及される）、これに取り込まれる。用語「細胞」は、原核および真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、およびより好ましくは哺乳動物細胞を含む。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、ヒト細胞と接触させられる。

本発明のオリゴヌクレオチド組成物を、in vitroで、例えば、試験管または培養ディッシュ中で（対象へ導入してもしなくともよく）、またはin vivoで、例えば哺乳動物対象などの対象において、細胞と接触させてもよい。オリゴヌクレオチドは、エンドサイトーシスにより遅い速度で細胞に取り込まれるが、エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは、一般に隔絶され、例えば標的核酸分子へのハイブリダイゼーションのために利用することができない。一態様において、細胞による取り込みを、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿により促進することができる。しかし、これらの手順はin vitroまたはex vivoでのみ有用であり、便利ではなく、一部の場合においては細胞毒性と関連する。

別の態様において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、DMSO、グリセロールもしくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な当該分野において認識された方法により、またはトランスフェクションにより、例えばカチオン性、アニオン性、または中性脂質組成物もしくはリポソームを用いて、当該分野において公知の方法を用いて（例えば、WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424；米国特許第4,897,355号；Bergan et al. 1993. Nucleic Acid Research. 21:3567を参照）、増強することができる。増強されたオリゴヌクレオチドの送達はまた、ベクター（例えば、Shi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan. 19:9; Reichhart J M et al. Genesis. 2002. 34(1-2):1604, Yu et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:6047; Sui et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5515を参照）、ウイルス、ポリアミンまたはポリリジン、プロタミンまたはＮｉ、Ｎ１２－ビス（エチル）スペルミンなどの化合物を用いるポリカチオン抱合体（例えば、Bartzatt, R. et al.1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 11:133; Wagner E. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4255を参照）の使用により媒介することができる。

ある態様において、本発明のminiRNAは、US 2005/0281781 A1、WO 2006/007372およびWO 2007/050643（全て本明細書において参考として組み込まれる）において記載されるもののような、多様なベータ－グルカン含有粒子を用いて送達することができる。ある態様において、ベータ－グルカン粒子は、酵母から誘導される。ある態様において、ペイロード捕捉分子は、少なくとも約１０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００ｋＤａ、５００ｋＤａなどの分子量を有するものなどのポリマーである。好ましいポリマーとして（限定することなく）、カチオン性ポリマー、キトサン、またはＰＥＩ（ポリエチレンイミン）などが挙げられる。

かかるベータ－グルカンに基づく送達システムは、経口送達のために製剤化することができ、ここで、経口で送達されるベータ－グルカン／miniRNAコンストラクトは、マクロファージまたは他の関連する食細胞により貪食され得、これらは、次いで、選択されたin vivoの部位においてminiRNAコンストラクトを放出し得る。代替的に、またはさらに、miniRNAは、特定のマクロファージ標的遺伝子の発現を変化させることができる。

オリゴヌクレオチドの取り込みのための随意のプロトコルは、多数の要因に依存し、最も重要であるものは、用いられる細胞の型である。取り込みにおいて重要である他の要因として、限定されないが、オリゴヌクレオチドの性質および濃度、細胞のコンフルエンス、細胞を入れる培養の型（例えば、懸濁培養であるか、またはプレーティングされているか）、および細胞を培養している培地の型が挙げられる。

カプセル化剤
カプセル化剤は、ビヒクル中にオリゴヌクレオチドを補足する。本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドは、キャリアまたはビヒクル、例えば、リポソームまたはミセルと結合していてもよいが、他のキャリアを用いることもできることは、当業者により理解される通りである。リポソームは、脂質二重層からなるビヒクルであって、生体膜と類似する構造を有する。かかるキャリアは、細胞による取り込みを促進するため、またはオリゴヌクレオチドを標的化するため、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態学または毒性学的特性を改善するために、用いられる。

例えば、本発明のオリゴヌクレオチドをまた、その中に活性成分が分散してまたは脂質層に接着した水性濃縮層からなる小体中に多様に存在して含有される医薬組成物であるリポソーム中にカプセル化して、投与してもよい。オリゴヌクレオチドは、溶解性に依存して、水性層および脂質層の両方に存在しても、一般にリポソーム懸濁液（liposomic suspension）と称されるものの中に存在してもよい。疎水性層は、一般に、必ずではないが、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、リン酸ジアセチルなどの多かれ少なかれイオン性の界面活性剤、ステアリルアミン、またはホスファチジル酸、または疎水性の性質の他の材料を含む。リポソームの直径は、一般に約１５ｎｍ～約５マイクロメートルの範囲である。

薬物送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、幾つかの利点を提供する。リポソームは、細胞内安定性を増大し、取り込み効率を増大し、生物学的活性を改善する。リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似する様式において配置された脂質からなる、中空の球体ビヒクルである。これらは、水溶性化合物を封入する内部の水性の空間を有し、直径０．０５～数マイクロメートルの範囲のサイズである。幾つかの研究が、リポソームが核酸を細胞へ送達することができること、および核酸が生物学的に活性であり続けることを示している。例えば、リポフェクチンまたはLIPOFECTAMINE（商標）2000などの本来は研究用ツールとして設計された脂質送達ビヒクルは、完全な核酸分子を細胞に送達することができる。

リポソームを用いることの具体的な利点として、以下が挙げられる：非毒性であり組成物において生分解性であること；長期の循環半減期を示すこと；および、組織に標的化するためにその表面に認識分子を容易に結合させることができること。最後に、液体懸濁液または凍結乾燥製品のいずれにおいても、リポソームに基づく医薬のコスト効率の良い製造は、受容可能な薬物送達システムとしてのこの技術のバイアビリティーを実証している。

一部の側面において、本発明に関連する製剤は、天然に存在する、または化学的に合成された、または修飾された飽和および不飽和脂肪酸残基のクラスについて選択してもよい。脂肪酸は、トリグリセリド類、ジグリセリド類、または個々の脂肪酸の形態において存在してもよい。別の態様において、非経口栄養のために薬理学において現在用いられている脂肪酸および／または脂質の乳液の、よく検証された混合物の使用を利用してもよい。

リポソームベースの製剤は、オリゴヌクレオチドの送達のために広範に用いられる。しかし、市販の脂質またはリポソーム製剤の殆どは、少なくとも１つの正に荷電した脂質（カチオン性脂質）を含む。この正に荷電した脂質の存在は、高レベルのオリゴヌクレオチドのローディングを得るために、およびリポソームの膜融合特性を増強するために、必須であると考えられている。最適な正に荷電した脂質の化合物を同定するための、幾つかの方法が行われ、公開されている。しかし、カチオン性脂質を含有する市販のリポソーム製剤は、高レベルの毒性により特徴づけられる。in vivoでの限定された治療インデックスにより、正に荷電した脂質を含有するリポソーム製剤が、RNAサイレンシングを達成するために必要とされる濃度よりもごく僅かに高い濃度において、毒性（すなわち、肝臓の酵素の増大）と関連することが明らかとなっている。

先行技術のリポソームの毒性を有さない新たなリポソーム製剤が、本発明により開発された。これらの新たなリポソーム製剤は、効率的なオリゴヌクレオチドの送達のため、および特に本発明のRNA分子の送達のための、中性脂質ベースの製剤である。組成物は、中性ナノトランスポーター（nanotransporter）として言及される。なぜならば、これらは、非荷電性の脂質混合物中への量的なオリゴヌクレオチドの組み込みを可能にするからである。本発明の中性ナノトランスポーター組成物中のカチオン性脂質の毒性レベルの欠失は、重要な特徴である。

中性ナノトランスポーター組成物は、オリゴヌクレオチドの中性脂質製剤中への効率的なローディングを可能にする。組成物は、分子の疎水性が増大する様式において修飾された（例えば、疎水性分子が、疎水性分子に、オリゴヌクレオチド末端または末端でないヌクレオチド、塩基、糖もしくは骨格において、（共有的にまたは非共有的に）結合されている）オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、中性脂質製剤と混合されている（例えば、少なくとも２５％のコレステロール、および２５％のDOPCまたはそのアナログを含む）。別の脂質などのカーゴ分子もまた、組成物中に含めることができる。この組成物は、製剤の一部がオリゴヌクレオチド自体へ構築される場合、中性脂質粒子中におけるオリゴヌクレオチドの効率的なカプセル化を可能にする。

本発明に関連する幾つかの予測されなかった観察の一つは、本発明のオリゴヌクレオチドが、カチオン性脂質を含まない脂質混合物中へ効率的に組み込まれ得ること、および、かかる組成物が、治療用オリゴヌクレオチドを細胞へ機能的な様式において効率的に送達し得ることであった。別の予測されなかった観察は、脂肪酸混合物（脂質混合物）が、ホスファチジルコリンベースの脂肪酸、およびコレステロールなどのステロールからなる場合に、高レベルの活性が観察されたことであった。例えば、中性脂肪酸混合物の一つの好ましい製剤は、少なくとも２０％のDOPCまたはDSPCおよび少なくとも２０％のコレステロールなどのステロールからなる。わずか１：５の脂質対オリゴヌクレオチドの比ですら、非荷電性製剤中でのオリゴヌクレオチドの完全なカプセル化を得るために十分であることが示された。先行技術は、非荷電性製剤によるわずか１～５％のオリゴヌクレオチドのカプセル化を示し、これは、所望の量のin vivo効力を得るために十分ではない。中性脂質を使用する先行技術と比較して、細胞へのオリゴヌクレオチド送達のレベルは、極めて予想外であった。

５０～１４０ｎｍの範囲のサイズの安定な粒子は、疎水性オリゴヌクレオチドを好ましい製剤と複合体化することにより形成された。製剤は、それ自体では、代表的には、小さい粒子を形成せず、むしろ集塊物を形成し、これは、疎水性修飾オリゴヌクレオチドを転換することにより、安定な５０～１２０ｎｍの粒子へと移行することに言及することは興味深い。

本発明の中性ナノトランスポーター組成物は、疎水性修飾ポリヌクレオチド、中性脂質混合物、および任意にカーゴ分子を含む。「疎水性修飾ポリヌクレオチド」は、本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドを当該ポリヌクレオチドの修飾の前よりも疎水性にする少なくとも１つの修飾を有する、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、sd-rxRNA）である。修飾は、疎水性分子をポリヌクレオチドに結合（共有的または非共有的に）させることにより達成することができる。一部の例において、疎水性分子は、親油性基であるか、または親油性基を含む。

用語「親油性基」は、脂質に対してその水に対するアフィニティーより高いアフィニティーを有する基を意味する。親油性基の例として、限定されないが、コレステロール、コレステリルまたは修飾コレステリル残基、アダマンチン、ジヒドロテステロン（dihydrotesterone）、長鎖アルキル、長鎖アルケニル、長鎖アルキニル、オレイル－リトコール酸、コレン酸、オレオイル－コレン酸、パルミチル酸、ヘプタデシル酸、ミリスチル酸、胆汁酸、コール酸またはタウロコール酸、デオキシコール酸、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド類、ビタミンＥなどのビタミン類、飽和または不飽和のいずれかの脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル類、ピレン類、ポルフィリン類、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン類、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、Texas-Red、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例えば、Cy3またはCy5）、Hoechst 33258色素、ソラレン、またはイブプロフェンが挙げられる。コレステロール部分を（例えばコレスタン中のもののように）減少させても、または置換しても（例えばハロゲンにより）よい。１分子における異なる親油性基の組み合わせもまた可能である。

疎水性分子は、ポリヌクレオチドの多様な位置において結合させることができる。上記のとおり、疎水性分子は、ポリヌクレオチドの５’末端の３’などのポリヌクレオチドの末端の残基に結合していてもよい。あるいは、これは、ポリヌクレオチドの内部のヌクレオチドまたは枝上のヌクレオチドに結合していてもよい。疎水性分子が、例えばヌクレオチドの２’位に、結合していてもよい。疎水性分子はまた、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの複素環式塩基、糖または骨格に結合していてもよい。

疎水性分子は、リンカー部分によりポリヌクレオチドに連結していてもよい。任意に、リンカー部分は、非ヌクレオチド性のリンカー部分である。、非ヌクレオチド性のリンカーとは、例えば、脱塩基残基（ｄスペーサー）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカンジオールである。スペーサーユニットは、好ましくは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により結合している。リンカーユニットは、分子中に１回のみ現れても、または、例えばホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホナートまたはアミン結合などを介して、数回組み込まれてもよい。

代表的な抱合プロトコルは、配列の１または２以上の位置においてアミノリンカーを保有するポリヌクレオチドの合成を含むが、リンカーは必要ではない。アミノ基は、次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を用いて、抱合される分子と反応させられる。抱合反応は、まだ固体支持体に結合しているポリヌクレオチドを用いて、または溶液相中でのポリヌクレオチドの切断の後に、行うことができる。HPLCによる修飾ポリヌクレオチドの精製は、代表的には、結果として純粋な材料を生じる。

一部の態様において、疎水性分子は、ミセル中へ組み込まれるために十分な疎水性を提供する、ステロール型抱合体、フィトステロール抱合体、コレステロール抱合体、側鎖の長さが変更されたステロール型抱合体、脂肪酸抱合体、任意の他の疎水性基抱合体、および／または内部ヌクレオシドの疎水性修飾である。

本発明の目的のために、用語「ステロール」またはステロイドアルコール類は、Ａ環の３位においてヒドロキシル基を有するステロイドのサブグループを指す。これらは、アセチル－コエンザイムＡからＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ経路を介して合成される両親媒性脂質である。全体的な分子は、極めて扁平である。Ａ環上のヒドロキシル基は、極性である。脂肪族鎖の残りは、非極性である。通常、ステロールは、１７位において８炭素鎖を有すると考えられる。

本発明の目的のために、用語「ステロール型分子」は、ステロイドアルコール類を指し、これは、ステロールと構造が類似する。主要な差異は、環の構造、および２１位に結合する側鎖の炭素の数である。
本発明の目的のために、用語「フィトステロール」（また、植物ステロールとも称される）は、植物において天然に存在する植物化学物質である、一群のステロイドアルコール類である。２００種を超える既知のフィトステロールが存在する。
本発明の目的のために、用語「ステロールの側鎖」は、ステロール型分子の１７位において結合する側鎖の化学組成を指す。標準的な定義において、ステロールは、８炭素鎖を１７位に保有する４環構造に限定される。本発明において、従来のものよりも長いおよび短い側鎖を有するステロール型分子が記載される。側鎖は、分子であっても、二重の骨格を含んでいてもよい。

したがって、本発明において有用なステロールは、例えば、コレステロール、ならびに、１７位に２～７個または９個の炭素より長い側鎖が結合しているユニークなステロールを含む。特定の態様において、ポリ炭素テイルの長さは、５～９個の炭素の間で変化する。図９は、血漿クリアランス、肝臓の取り込みおよびポリ炭素鎖の長さの間に相関が存在することを示す。かかる抱合体は、特に肝臓への送達において、顕著により優れたin vivo効力を有し得る。これらの型の分子は、従来のコレステロールに抱合したオリゴよりも５～９倍低い濃度において機能することが期待される。

あるいは、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ペプチド、または疎水性分子として機能する正に荷電した化学物質に結合していてもよい。タンパク質は、プロタミン、dsRNA結合ドメイン、およびアルギニンリッチペプチドからなる群より選択することができる。例示的な正に荷電した化学物質として、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、およびプトレシンが挙げられる。

別の態様において、疎水性分子抱合体は、疎水性修飾、ホスホロチオエート修飾、および２’リボ修飾を含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの最適な化学修飾パターンと組み合わされた場合に（本明細書において詳細に記載されるように）、さらに高い効力を示し得る。

別の態様において、ステロール型分子は、図８に示されるものなどの天然に存在するフィトステロールであってもよい。ポリ炭素鎖は、９個より長くても、直鎖であっても、分枝鎖であっても、および／または二重結合を含んでもよい。ポリヌクレオチド抱合体を含む一部のフィトステロールは、多様な組織へのポリヌクレオチドの送達において、顕著により強力かつ活性であり得る。一部のフィトステロールは、組織優先性を示し得、したがって、RNAiを特異的に特定の組織へ送達するための手段として用いられる。

疎水性修飾ポリヌクレオチドは、中性脂肪酸混合物と混合されて、ミセルを形成する。中性脂肪酸混合物は、疎水性修飾ポリヌクレオチドと共にミセルを形成することができる生理学的ｐＨにおいて、またはその付近において、正味の中性または僅かに正味の陰性の電荷を有する、脂質の混合物である。本発明の目的のために、用語「ミセル」は、非荷電性脂肪酸とリン脂質との混合物により形成される、小さいナノ粒子を指す。中性脂肪酸混合物は、毒性を引き起こさない量において存在する限りにおいて、カチオン性脂質を含んでもよい。好ましい態様において、中性脂肪酸混合物は、カチオン性脂質を含まない。カチオン性脂質を含まない混合物とは、全脂質のうちの１％未満、好ましくは０％が、カチオン性脂質であるものである。用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨにおいて、またはその付近において、正味の正の電荷を有する、脂質および合成脂質を含む。用語「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨにおいて、またはその付近において、正味の負の電荷を有する、脂質および合成脂質を含む。

中性脂質は、強力であるが共有結合ではない引力により、本発明のオリゴヌクレオチドに結合する（例えば、静電気、ファンデルワールス、パイ・スタッキング（pi-stacking）などの相互作用）。
中性脂質混合物として、天然に存在する、または化学合成された、または修飾された、飽和および不飽和脂肪酸残基のクラスから選択される製剤が挙げられる。脂肪酸は、トリグリセリド、ジグリセリドまたは個々の脂肪酸の形態において存在し得る。別の態様において、薬理学において非経口栄養のために現在用いられている脂肪酸のよく確認された混合物および／または脂質乳液を利用してもよい。

中性脂肪酸混合物は、好ましくは、コリンをベースとする脂肪酸およびステロールの混合物である。濃リンをベースとする脂肪酸として、例えば、DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPCおよびDEPCなどの合成のホスホコリン誘導体が挙げられる。DOPC（化合物登録番号4235-95-4）は、ジオレオイルホスファチジルコリンである（ジエライドイルホスファチジルコリン、ジオレオイル－ＰＣ、ジオレオイルホスホコリン、ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルコリンとしても知られる）。DSPC（化合物登録番号816-94-4は、ジステアロイルホスファチジルコリンである（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンとしても知られる）。

中性脂肪酸混合物中のステロールは、例えば、コレステロールであってもよい。中性脂肪酸混合物は、完全にコリンベースの脂肪酸およびステロールからなっても、またはこれは任意にカーゴ分子を含んでもよい。例えば、中性脂肪酸混合物は、少なくとも２０％または２５％の脂肪酸および２０％または２５％のステロールを有してもよい。

本発明の目的のために、用語「脂肪酸」は、脂肪酸の従来の説明に関する。これらは、個々の実体またはジグリセリドおよびトリグリセリドの形態において存在し得る。本発明の目的のために、用語「脂質乳液」は、食事において十分な脂質を得ることができない対象に静脈内で投与される安全な脂質製剤を指す。これは、大豆油（または他の天然に存在するオイル）と卵のリン脂質との乳液である。脂質乳液は、一部の不溶性麻酔剤の製剤のために用いられている。本開示において、脂質乳液は、イントラリピッド（Intralipid）、リポシン（Liposyn）、ニュートリピッド（Nutrilipid）などの市販の製剤の一部、特定の脂肪酸が濃縮されている改変された市販の製剤、または完全にde novoで処方された脂肪酸とリン脂質との組合せであってもよい。

一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、脂質、例えば、上記の脂質または脂質組成物の一つを含む混合物と、約１２時間～約２４時間の間接触させる。別の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、脂質、例えば、上記の脂質または脂質組成物の一つを含む混合物と、約１～約５日間接触させる。一態様において、細胞を、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日間～約３０日間接触させる。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約５～約２０日間、接触状態に置く。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約７～約１５日間、接触状態に置く。

製剤の５０％～６０％は、任意に、任意の他の脂質または分子であってもよい。かかる脂質または分子は、本明細書において、カーゴ脂質またはカーゴ分子として言及される。カーゴ分子は、限定することなく、イントラリピッド（intralipid）、小分子、膜融合ペプチドもしくは脂質を含み、または、他の小分子を、細胞取り込み、エンドソームによる放出または組織分布特性を変化させるために添加してもよい。かかる特性が望ましい場合、カーゴ分子に耐性を示す能力は、これらの粒子の特性の改変のために重要である。例えば、一部の組織特異的代謝物の存在は、組織分布プロフィールを著しく変化させる場合がある。例えば、多様な飽和レベルを有するより短いまたはより長い脂質鎖が濃縮されているイントラリピッド（intralipid）型製剤の使用は、これらの型の製剤の組織分布プロフィール（およびそれらのローディング）に影響を及ぼす。

本発明により有用であるカーゴ脂質の一例は、膜融合脂質である。例えば、双性イオン脂質DOPE（化合物登録番号4004-5-1、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）は、好ましいカーゴ脂質である。

イントラリピッド（Intralipid）は、以下の組成からなり得る：１０００ｍＬが、以下を含む：精製大豆油９０ｇ、精製卵リン脂質１２ｇ、無水グリセロール２２ｇ、注射用水（１０００ｍＬへの十分量）。ｐＨを、水酸化ナトリウムで、約ｐＨ８に調整する。エネルギー含量／Ｌ：４．６ＭＪ（１９０ｋｃａｌ）。浸透圧（約）：３００ｍＯｓｍ／水１ｋｇ。別の態様において、脂質乳液は、５％のベニバナ油、５％の大豆油、乳化剤として添加される１．２％までの卵リン脂質、および注射用水中の２．５％のグリセリンを含む、リポシン（Liposyn）である。これはまた、ｐＨ調整のために水酸化ナトリウムを含んでもよい。ｐＨ８．０（６．０～９．０）。リポシン（Liposyn）は、２７６ｍＯｓｍｏｌ／リットル（実測値）の浸透圧を有する。

カーゴ脂質のアイデンティティー、量および比のバリエーションは、これらの化合物の細胞による取り込みおよび組織分布の特徴に影響を及ぼす。例えば、脂質テイルの長さおよび飽和性のレベルは、肝臓、肺、脂肪および心筋細胞への異なる取り込みに影響を及ぼす。ビタミン類または異なる形態のステロールなどの特別な疎水性分子の添加は、特定の化合物の代謝に関与する特別な組織への分布に有利に働き得る。複合体は、異なるオリゴヌクレオチド濃度において形成され、より高い濃度は、より効率的な複合体形成に有利に働く（図２１～２２）。

別の態様において、脂質乳液は、脂質の混合物に基づく。かかる脂質として、天然の化合物、化学合成された化合物、精製脂肪酸または任意の他の脂質が挙げられる。さらに別の態様において、脂質乳液の組成は、完全に人工的なものである。特定の態様において、脂質乳液は、７０％を超えて、リノール酸である。さらに別の特定の態様において、脂質乳液は、少なくとも１％のカルジオリピンである。リノール酸（ＬＡ）は、不飽和オメガ－６脂肪酸である。これは、１８－炭素鎖および２個のシス二重結合を有するカルボン酸からなる無色の液体である。

本発明のさらに別の態様において、疎水性修飾ポリヌクレオチドの組織分布を変化させるための手段として、脂質乳液の組成の変更を用いる。この方法論は、特定の組織へのポリヌクレオチドの特異的送達をもたらす（図１２）。

別の態様において、７０％を超えるリノール酸（Ｃ１８Ｈ３２Ｏ２）および／またはカルジオリピンを含むカーゴ分子の脂質乳液を、RNAiを心筋に特異的に送達するために用いる。

イントラリピッド（intralipid）などの脂質乳液は、先に、一部の非水溶性薬物（プロポフォール（Propofol）（Diprivanとして再処方されている）など）のための送達用製剤として用いられてきた。本発明の特有の特徴は、（ａ）修飾ポリヌクレオチドを疎水性化合物と組み合わせ、それによりこれが脂質ミセル中に組み込まれることができるというコンセプト、および（ｂ）可逆性キャリアを提供するためにこれを脂質乳液と混合すること、を含む。血流中への注射の後で、ミセルは通常、アルブミン、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびその他の血清タンパク質と結合する。この結合は、可逆性であり、最終的に、脂質は細胞により吸収される。ミセルの一部として取り込まれるポリヌクレオチドは、次いで、細胞の表面近くに送達される。その後、ステロール型送達を含むがこれらに限定されない多様な機構を通して、細胞による取り込みが起こり得る。

複合体化剤
複合体化剤は、強力であるが共有結合ではない引力（例えば、静電気、ファンデルワールス、パイ・スタッキングなどの相互作用）により、本発明のオリゴヌクレオチドに結合する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増大するために、複合体化剤と複合体化してもよい。複合体化剤の一例として、カチオン性脂質が挙げられる。カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞へ送達するために用いることができる。しかし、上記のとおり、カチオン性脂質を含まない製剤が、一部の態様において好ましい。

用語「カチオン性脂質」は、極性および非極性ドメインの両方を有する脂質および合成脂質であって、生理学的ｐＨにおいてまたはその付近において正に荷電することができ、核酸などのポリアニオンに結合して核酸の細胞中への送達を促進するものを含む。一般に、カチオン性脂質として、飽和および不飽和アルキル、ならびに脂環式のエーテル類およびアミンのエステル類、アミド類、またはこれらの誘導体が挙げられる。カチオン性脂質の直鎖および分枝アルキルおよびアルケニル基は、例えば、１～約２５個の炭素原子を含む。好ましい直鎖または分枝アルキルまたはアルケン基は、６個またはそれより多い炭素原子を有する。脂環式基として、コレステロールおよび他のステロイド基が挙げられる。カチオン性脂質は、例えば、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、Ｆ-、酢酸、トリフルオロ酢酸、硫酸、亜硝酸および硝酸を含む多様なカウンターイオン（アニオン）と共に調製することができる。

カチオン性脂質の例として、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（PAMAM）スターバーストデンドリマー、リポフェクチン（DOTMAとDOPEとの組合せ）、リポフェクターゼ（Lipofectase）、LIPOFECTAMINE（商標）（例えば、LIPOFECTAMINE（商標）2000）、DOPE、サイトフェクチン（Cytofectin）（Gilead Sciences、Foster City、Calif.）、およびユーフェクチン（Eufectins）（JBL、San Luis Obispo、Calif.）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、塩化Ｎ－［１－（２，３－ジオレオロキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（DOTMA）、硫酸Ｎ－［１－（２，３－ジオレオロキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチル（DOTAP）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）、２，３，－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（DOSPA）、臭化１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム；および臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（DDAB）から製造することができる。カチオン性脂質、例えばＮ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－塩化トリメチルアンモニウム（DOTMA）はホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増大することが見出された（Vlassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。オリゴヌクレオチドは、例えば、ポリ（Ｌ－リジン）またはアビジンと複合体化してもよく、脂質は、この混合物中、例えば、ステアリル－ポリ（Ｌ－リジン）に含まれても含まれなくてもよい。

カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するために当該分野において用いられてきた（例えば、米国特許第5,855,910号；同第5,851,548号；同第5,830,430号；同第5,780,053号；同第5,767,099号; Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1を参照）。今回のオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するために用いることができる他の脂質組成物は、請求される方法と組み合わせて用いてもよい。上で列記されるものに加えて、例えば米国特許第4,235,871号；米国特許第4,501,728号；同第4,837,028号；同第4,737,323号において教示されるものを含む他の脂質組成物もまた、当該分野において公知である。

一態様において、脂質組成物は、剤、例えば、オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションを増強するためのウイルスタンパク質（Kamata, et al., 1994. Nucl. Acids. Res. 22:536）をさらに含んでもよい。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第5,736,392号において教示されるようなオリゴヌクレオチド、ペプチドおよび脂質を含む組成物の一部として、細胞と接触させられる。血清耐性である改善された脂質もまた記載されている（Lewis, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3176）。カチオン性脂質および他の複合体化剤は、エンドサイトーシスを通して細胞中へ運搬されるオリゴヌクレオチドの数を増大するために作用する。

別の態様において、オリゴヌクレオチドの取り込みを最適化するために、Ｎ－置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を用いてもよい。ペプトイドは、トランスフェクションのためのカチオン性脂質様化合物を作製するために用いられてきた（Murphy, et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1517）。ペプトイドは、標準的な方法（例えば、Zuckermann, R. N., et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10646; Zuckermann, R. N., et al. 1992. Int. J. Peptide Protein Res. 40:497）を用いて合成することができる。カチオン性脂質とペプトイドとの組合せであるリプトイド（liptoid）もまた、目的のオリゴヌクレオチドの取り込みを最適化するために用いることができる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。リプトイドは、ペプトイドオリゴヌクレオチドを産生して、アミノ末端のサブモノマーをそのアミノ基を介して脂質にカップリングすることにより合成することができる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。

正に荷電したアミノ酸を高活性カチオン性脂質を作製するために用いることができることは、当該分野において公知である（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 93:3176）。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、親油性部分に結合した多数のアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはオルニチン残基を含む（例えば、米国特許第5,777,153号を参照）。

別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、約１～約４個の塩基性残基を有するペプチドを含む。これらの塩基性残基は、例えば、ペプチドのアミノ末端、Ｃ末端、または内部領域に位置することができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン（これはまた非極性であるとも考えられる）、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸の他にも、ペプチドの他の残基の大多数または全てを、非塩基性アミノ酸、例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン以外のアミノ酸から選択してもよい。好ましくは、長い中性の側鎖を有する中性アミノ酸が優性であることが用いられる。

一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、１または２以上のガンマカルボキシグルタミン酸残基、またはγ－Ｇｌａ残基を有する天然または合成のポリペプチドを含む。これらのガンマカルボキシグルタミン酸残基により、ポリペプチドが、互いに、および膜表面に、結合することが可能になる。言い換えると、一連のγ－Ｇｌａを有するポリペプチドは、RNAiコンストラクトが、それが接触した膜が何であれそれに固着することを助けるための汎用送達モダリティーとして用いることができる。これは、少なくとも、RNAiコンストラクトが血流からクリアランスされることを遅延し、それらが標的にホーミングするチャンスを増強し得る。

ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、中性タンパク質中に存在してもよい（例えば、プロトロンビンは１０個のγ－Ｇｌａ残基）。あるいは、これらは、精製された、組み換え的に精製された、または化学合成されたポリペプチド中に、カルボキシル化により、例えばビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを用いて、導入してもよい。ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、連続的であっても非連続的であってもよく、ポリペプチド中のかかるガンマカルボキシグルタミン酸残基の総数および位置は、異なるレベルのポリヌクレオチドの「固着性（stickiness）」を達成するために調節／微調整することができる。

一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させられる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および脂質、例えば上記の脂質または脂質組成物の一つを含む混合物と、約１２時間～約２４時間接触させる。別の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および脂質、例えば上記の脂質または脂質組成物の一つを含む混合物と、約１日～約５日間接触させる。一態様において、細胞を、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日間～約３０日間までもの長さにわたり接触させる。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約５～約２０日間接触させたままでおく。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約７～約１５日間接触させたままでおく。

例えば、一態様において、オリゴヌクレオチド組成物を、サイトフェクチンCSまたはGSV（Glen Research; Sterling, Va.から入手可能）、GS3815、GS2888などの脂質の存在下において、本明細書において記載されるように、長期のインキュベーション期間にわたり、細胞と接触させてもよい。

一態様において、細胞の脂質およびオリゴヌクレオチド組成物を含む混合物とのインキュベーションは、細胞のバイアビリティーを低下させない。好ましくは、トランスフェクション期間の後で、細胞は実質的に生存している。一態様において、トランスフェクションの後で、細胞は、少なくとも約７０％～少なくとも約１００％生存している。別の態様において、細胞は、少なくとも約８０％～少なくとも約９５％生存している。さらに別の例において、細胞は、少なくとも約８５％～少なくとも約９０％生存している。

一態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において「輸送ペプチド」として言及されるオリゴヌクレオチドを細胞中へ輸送するペプチド配列を結合させることにより修飾される。一態様において、組成物は、タンパク質をコードする標的核酸分子に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含み、輸送ペプチドに共有結合している。

語「輸送ペプチド」は、オリゴヌクレオチドの細胞中への輸送を促進するアミノ酸配列を含む。それが結合してる部分の細胞中への輸送を促進する例示的なペプチドは、当該分野において公知であり、例えば、HIV TAT転写因子、ラクトフェリン、ヘルペスVP22タンパク質および線維芽細胞増殖因子２を含む（Pooga et al. 1998. Nature Biotechnology. 16:857; and Derossi et al. 1998. Trends in Cell Biology. 8:84; Elliott and O'Hare. 1997. Cell 88:223）。

オリゴヌクレオチドは、公知の技術（例えば、Prochiantz, A. 1996. Curr. Opin. Neurobiol. 6:629; Derossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253, Vives et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:16010）を用いて輸送ペプチドに結合させることができる。例えば、一態様において、活性化チオール基を保有するオリゴヌクレオチドを、そのチオール基を介して、輸送ペプチド中に存在するシステインに（例えば、例えばDerossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Prochiantz. 1996. Current Opinion in Neurobiol. 6:629; Allinquant et al. 1995. J Cell Biol. 128:919において教示されるようにアンテナペディアホメオドメインの第２と第３とのヘリックスの間のβターン中に存在するシステインに）結合させる。別の態様において、Ｂｏｃ－Ｃｙｓ－（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基を、最後の（Ｎ末端）アミノ酸およびＳＨ基を保有するオリゴヌクレオチドがペプチドにカップリングされ得るように、輸送ペプチドにカップリングしてもよい（Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253）。

一態様において、結合基（linking group）を、ヌクレオモノマーに結合させ、輸送ペプチドをリンカーに共有結合させてもよい。一態様において、リンカーは、輸送ペプチドについての結合部位として、およびヌクレアーゼに対する安定性を提供し得るものの両方として、機能し得る。好適なリンカーの例として、置換または未置換のＣ_１－Ｃ_２０アルキル鎖、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル鎖、Ｃ_２－Ｃ_２０アルキニル鎖、ペプチド、およびヘテロ原子（例えば、Ｓ、Ｏ、ＮＨなど）が挙げられる。他の例示的なリンカーとして、スルホスクシンジイミル－４－（マレイミドフェニル）－酪酸（ＳＭＰＢ）（例えば、Smith et al. Biochem J 1991.276: 417-2を参照）などの二官能性架橋剤が挙げられる。

一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、受容体により媒介されるエンドサイトーシス機構を遺伝子の細胞中への送達のために利用する、分子抱合体として合成される（例えば、Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559およびこれにおいて引用される参考文献を参照）。

標的化剤
オリゴヌクレオチドの送達はまた、オリゴヌクレオチドを細胞受容体へ標的化することによっても改善し得る。標的化部分は、オリゴヌクレオチドに抱合させても、オリゴヌクレオチドに結合したキャリア基（すなわち、ポリ（Ｌ－リジン）またはリポソーム）に結合させてもよい。この方法は、特異的受容体により媒介されるエンドサイトーシスを示す細胞に良好に適する。

例えば、６－ホスホマンノシル化タンパク質に対するオリゴヌクレオチドの抱合体は、マンノース－６－リン酸特異的受容体を発現する細胞により、遊離オリゴヌクレオチドよりも２０倍効率的に内部移行される。オリゴヌクレオチドをまた、細胞受容体に対するリガンドに、生分解性リンカーを用いてカップリングしてもよい。別の例において、送達コンストラクトは、ビオチン化オリゴヌクレオチドと強固な複合体を形成するマンノシル化ストレプトアビジンである。マンノシル化ストレプトアビジンは、ビオチン化オリゴヌクレオチドの内部移行を２０倍増大することが見出された（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。

さらに、特異的リガンドを、ポリリジンベースの送達システムのポリリジン成分に抱合させてもよい。例えば、トランスフェリン－ポリリジン、アデノウイルス－ポリリジン、およびインフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ－２のＮ末端膜融合ペプチド－ポリリジン抱合体は、真核細胞における受容体媒介性DNA送達を著しく増強する。肺胞マクロファージ中のポリ（Ｌ－リジン）に抱合したマンノシル化糖タンパク質が、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増強するために用いられている（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。

悪性細胞は、葉酸およびトランスフェリンなどの必須栄養素に対する高い必要性を有するので、これらの栄養素は、オリゴヌクレオチドを癌細胞に標的化するために用いられる。例えば、葉酸をポリ（Ｌ－リジン）に結合させると、前骨髄球性白血病（HL-60）細胞およびヒトメラノーマ（M-14）細胞において増強されたオリゴヌクレオチド取り込みが観察される（Ginobbi et al. 1997. Anticancer Res. 17:29）。別の例において、マレイル化されたウシ血清アルブミン、葉酸またはプロトポルフィリン三価鉄ＩＸによりコートされたリポソームは、マウスマクロファージ、KB細胞および2.2.15ヒト肝細胞腫細胞において、増強されたオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを示す（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。

リポソームは、肝臓、膵臓、網膜内皮系において、自然に蓄積する（いわゆる受動的標的化）。リポソームを、抗体およびプロテインＡなどの多様なリガンドにカップリングすることにより、これらを、特異的細胞集団に対して能動的に標的化することができる。例えば、プロテインＡ保有リポソームを、マウス主要組織適合複合体によりコードされるＬ細胞上に発現するH-2Kタンパク質に標的化されたH-2K特異的抗体により予め処理してもよい（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。

他のin vitroおよび／またはin vivoでのRNAi試薬の送達は、当該分野において公知であり、目的のRNAiコンストラクトを送達するために用いることができる。例えば、数例を挙げるために、米国特許出願公開第20080152661号、同第20080112916号、同第20080107694号、同第20080038296号、同第20070231392号、同第20060240093号、同第20060178327号、同第20060008910号、同第20050265957号、同第20050064595号、同第20050042227号、同第20050037496号、同第20050026286号、同第20040162235号、同第20040072785号、同第20040063654号、同第20030157030号、WO 2008/036825、WO04/065601およびAU2004206255B2を参照のこと（全て参考として組み込まれる）。

投与
オリゴヌクレオチドの最適な投与または送達の経路は、所望の結果および／または処置される対象に依存して変化し得る。本明細書において用いられる場合、「投与」は、細胞をオリゴヌクレオチドに接触させることを指し、in vitroで、またはin vivoで行うことができる。標的核酸分子から翻訳されるタンパク質の発現を最適に減少させるために、オリゴヌクレオチドの投与量を、例えばRNA安定性の読み出しによりまたは治療応答により測定されるものとして、過度の実験なしに調整することができる。

例えば、核酸標的によりコードされるタンパク質の発現を測定し、投与レジメンをそれに従って調整する必要があるか否かを決定することができる。さらに、細胞におけるまたは細胞により産生されるRNAまたはタンパク質のレベルの増大または減少を、任意の当該分野において認識された技術を用いて測定してもよい。転写が減少したか否かを決定することにより、標的RNAの切断を誘導する上でのオリゴヌクレオチドの有効性を決定することができる。

上記のオリゴヌクレオチド組成物のいずれを、単独で、または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、用いてもよい。本明細書において用いられる場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのかかる媒体および剤は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と適合しない場合を除いて、これを治療用組成物において用いることができる。補足の活性成分もまた、組成物中に組み込んでもよい。

オリゴヌクレオチドは、非経口投与のために、リポソームもしくはポリエチレングリコールで修飾されたリポソーム中へ組み込んでも、またはカチオン性脂質と混合してもよい。さらなる物質、例えば特定の標的細胞上に見出される膜タンパク質に対して反応性の抗体のリポソーム中への組み込みは、特定の細胞型に対するオリゴヌクレオチドの標的化に役立つ。

さらに、本発明は、目的のオリゴヌクレオチドを、例えばRataiczakら（1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11823-11827）において記載されるような、かかるオリゴヌクレオチドの持続注入をもたらす浸透圧ポンプにより投与することを提供する。かかる浸透圧ポンプは、例えばAlzet Inc.（Palo Alto, Calif.）から市販されている。カチオン性脂質キャリア中での局所投与および非経口投与が好ましい。

in vivoでの適用に関して、本発明の製剤を、患者に、選択された投与の経路、例えば、非経口で、経口で、または腹腔内でのものに適応した多様な形態において投与することができる。非経口投与が好ましく、これは、以下の経路による投与を含む：静脈内；筋肉内；間質内（interstitially）；動脈内；皮下；眼内；滑膜内（intrasynovial）；経皮を含む経上皮；吸入を介した肺；眼（ophthalmic）；舌下および口腔内；眼（ophthalmic）を含む局所；経皮；眼（ocular）；直腸；ならびに送気を介した経鼻吸入。

非経口投与のための医薬製剤は、水溶性または水分散性の形態における活性化合物の水性溶液を含む。さらに、好適な油性注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を、投与してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとして、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル類、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含む懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでもよく、任意に、懸濁液はまた、安定化剤を含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、液体の溶液、好ましくはハンクス溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性の緩衝液中で処方されてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、固体の形態において処方されて、使用の直前に再溶解されるか懸濁されてもよい。凍結乾燥形態もまた、本発明において含まれる。

局所投与のための医薬製剤として、経皮貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、スプレー、坐剤、液体または粉末が挙げられる。さらに、従来の医薬用キャリア、水性、粉末または油性の基剤、または増粘剤を、局所投与のための医薬製剤において用いてもよい。

経口投与のための医薬製剤として、散剤または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サケット（sachet）または錠剤が挙げられる。さらに、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散化補助剤または結合剤を、経口投与のための医薬製剤において用いてもよい。

経粘膜または経皮投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤（penetrant）が、製剤中に用いられる。かかる浸透剤は、当該分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体ならびに界面活性剤が挙げられる。経粘膜投与は、鼻用スプレーを通して、または坐剤を用いるものであってもよい。経口投与のためには、オリゴヌクレオチドを、カプセル、錠剤およびトニックなどの従来の経口投与形態に製剤化する。局所投与のためには、本発明のオリゴヌクレオチドを、当該分野において公知であるように、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲルまたはクリームに製剤化する。

薬物送達ビヒクルは、in vitroでの投与のため、全身投与のため、または局所投与のために、選択することができる。これらのビヒクルは、遅延放出リザーバとして機能するように、またはこの含有物を標的細胞に直接的に送達するように、設計することができる。一部の直接送達用薬物ビヒクルの使用の利点は、１回の取り込みごとに複数の分子が送達されることである。かかるビヒクルは、さもなくば血流から急速にクリアランスされるであろう薬物の循環半減期を延長することが示されている。このカテゴリーに分類されるかかる特殊化された薬物送達ビヒクルの幾つかの例は、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体粘着性ミクロスフィアである。

記載されるオリゴヌクレオチドは、対象に全身投与されてもよい。全身吸収とは、全身にわたる分布の後での薬物の血流中への侵入を指す。全身吸収をもたらす投与経路として：静脈内、皮下、腹腔内および鼻内が挙げられる。これらの投与経路の各々は、オリゴヌクレオチドを、アクセス可能な罹患細胞に送達する。皮下投与の後で、治療剤は、局所リンパ節中へ流れ、リンパのネットワークを通って循環中へと進む。循環中への侵入の速度は、分子量またはサイズの関数であることが示されている。リポソームまたは他の薬物キャリアの使用は、オリゴヌクレオチドをリンパ節に局在化する。オリゴヌクレオチドを細胞中へ拡散するように修飾しても、未修飾または修飾オリゴヌクレオチドの細胞中への送達にリポソームが直接的に参加してもよい。

選択される送達の方法は、細胞中への侵入をもたらす。好ましい送達方法として、リポソーム（１０～４００ｎｍ）、ハイドロゲル、制御放出ポリマーおよび他の薬学的に適用可能なビヒクル、ならびにマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション（ex vivoでの処置のため）が挙げられる。

本発明の医薬製剤は、乳液として調製され製剤化されてもよい。乳液は、通常、１つの液体が別の液体中に通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態において分散した、均質な系である。本発明の乳液は、乳化剤、安定化剤、色素、脂質、油、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤などの賦形剤を含んでもよく、抗酸化剤もまた、必要に応じて乳液中に存在してもよい。賦形剤は、水相、油相、またはそれ自体が別の相として、溶液として存在することができる。

本発明の乳液製剤において用いることができる天然に存在する乳化剤の例として、ラノリン、ミツロウ、リン脂質、レシチンおよびアカシアが挙げられる。微細に分割した固体もまた、特に界面活性剤と組み合わせて、粘性の製剤において、良好な乳化剤として用いられてきた。乳化剤として用いることができる微細に分割した固体として、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤性粘土、顔料、ならびに炭素またはステアリン酸グリセリルなどの非極性個体が挙げられる。

乳液製剤において用いることができる保存剤の例として、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。乳液製剤において用いることができる抗酸化剤の例として、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸および二亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤補助剤（antioxidant synergist）が挙げられる。

一態様において、オリゴヌクレオチドの組成物は、マイクロエマルジョン（microemulsion）として製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および両親媒性物質の系であって、単一の光学的等方性および熱力学的安定性の溶液である。代表的には、マイクロエマルジョンは、第一に油を水性界面活性剤溶液中に分散させ、次いで、透明な系を形成するために、十分な量の第４の成分、一般的には中程度の鎖長のアルコールを加えることにより調製する。

マイクロエマルジョンの調製において用いることができる界面活性剤として、限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル類、テトラグリセロールモノラウレート（ML310）、テトラグリセロールモノオレエート（MO310）、ヘキサグリセロールモノオレエート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（PO500）、デカグリセロールモノカプレート（MCA750）、デカグリセロールモノオレエート（MO750）、デカグリセロールセキオレエート（S0750）、デカグリセロールデカオレエート（DA0750）が、単独で、または共界面活性剤（cosurfactant）と組合せて、挙げられる。共界面活性剤、通常はエタノール、１－プロパノールおよび１－ブタノールなどの短鎖アルコールは、界面活性剤のフィルム中に浸透して、その後、界面活性剤分子の間で生み出される空隙により遮断されたフィルムを作り出すことにより、界面の流動性を増大させるために役立つ。

しかし、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用なしで調製することもでき、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョン系が、当該分野において公知である。水相は、代表的には、限定されないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってよい。油相として、限定されないが、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル類、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジおよびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル類、脂肪アルコール類、ポリグリコール化（polyglycolized）グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料が挙げられる。

マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および増強された薬物の吸収の観点から特に重要である。脂質ベースのマイクロエマルジョン（油／水及び水／油の両方）が、薬物の経口でのバイオアベイラビリティ－を増強するために提案されている。

マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化の改善、酵素による加水分解からの薬物の保護、界面活性剤により誘導される膜の流動性および透過性の変化に起因する薬物吸収の増強の可能性、調製の容易性、固体投与形態に対する経口投与の容易性、臨床的効力の改善、ならびに毒性の低減を提供する（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11:1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85:138-143）。マイクロエマルジョンはまた、化粧品および医薬適用の両方における活性成分の経皮送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョンの組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身吸収の増大を促進し、ならびに、胃腸管、膣、口腔および他の投与の領域内における、オリゴヌクレオチドの局所的な細胞による取り込みを改善することが予測される。

一態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚への効率的な送達に影響を及ぼす多様な浸透増強剤を使用する。越えるべき膜を浸透増強剤で処置した場合、非親油性薬物すら、細胞膜を越えることができる。細胞膜を越える非親油性薬物の拡散を増大することに加えて、浸透増強剤はまた、親油性薬物の浸透性を増強するようにも作用する。

本発明において用いることができる５種のカテゴリーの浸透増強剤として、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート性非界面活性剤が挙げられる。投与されるオリゴヌクレオチドの浸透を増強するために利用してもよい他の剤として、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、２－１５ピロールなどのピロール類、アゾン類、リモネンなどのテルペン類、ならびにメントンが挙げられる。

オリゴヌクレオチド、特に脂質製剤中のものは、また、医療用デバイス、例えば、血管形成バルーンカテーテルなどのカテーテルを、カチオン性脂質製剤によりコーティングすることによっても投与することができる。コーティングは、例えば、脂質製剤、または脂質製剤と、好適な溶媒、例えば水をベースとする緩衝液、水性溶媒、エタノール、塩化メチレン、クロロフォルムなど、との混合物中に、医療用デバイスを浸漬することにより、達成することができる。一定量の製剤がデバイスの表面に自然に接着し、デバイスをその後適宜患者に投与する。あるいは、脂質製剤の凍結乾燥混合物を、デバイスの表面に特異的に結合させてもよい。かかる結合技術は、例えば、K. Ishihara et al., Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 27, pp. 1309-1314 (1993)において記載され、その開示は、本明細書においてその全体において参考として組み込まれる。

投与されるべき有用な投与量、および特定の投与の形態は、細胞型、in vivoでの使用については年齢、体重および特定の動物および処置されるべきその領域、用いられる特定のオリゴヌクレオチドおよび送達方法、企図される治療および診断用途、ならびに製剤の形態、例えば懸濁液、乳液、ミセルまたはリポソームなどの要因に依存して変化し、これは当業者にとって容易に明らかとなる。代表的には、投与量は、より低い量で投与し、所望の結果が達成されるまで増加させる。オリゴヌクレオチドを送達するために脂質を用いる場合、投与される脂質化合物の量は変化し得、一般に、投与されているオリゴヌクレオチド剤の量に依存する。例えば、脂質化合物のオリゴヌクレオチド剤に対する重量比は、好ましくは約１：１～約１５：１であり、約５：１～約１０：１の重量比がより好ましい。一般に、投与されるカチオン性脂質化合物の量は、約０．１ミリグラム（ｍｇ）～約１グラム（ｇ）まで変化する。一般的なガイダンスのために、代表的には、患者の体重の各１ｋｇ毎に約０．１ｍｇ～約１０ｍｇの特定のオリゴヌクレオチド剤、および約１ｍｇ～約１００ｍｇの脂質組成物が投与されるが、より高い、およびより低い量を用いてもよい。

本発明の剤は、医薬の投与のために好適な生物学的に適合性の形態において、対象に投与されるか、または細胞と接触させられる。「医薬の投与のために好適な生物学的に適合性の形態」とは、当該オリゴヌクレオチドの治療効果があらゆる毒性効果を凌ぐ形態において、オリゴヌクレオチドが投与されることを意味する。一態様において、オリゴヌクレオチドを、対象に投与する。対照の例として、哺乳動物、例えばヒトおよび他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマおよび農耕（farming）（農業（agricultural））用動物；イヌ、ネコおよび他の家庭のペット；マウス、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。

本発明のオリゴヌクレオチドの活性量の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量および時間において、有効量として定義される。例えば、オリゴヌクレオチドの活性量は、細胞の型、用いられるオリゴヌクレオチド、ならびにin vivoでの使用については疾患の状態、個体の年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起するオリゴヌクレオチドの能力などの要因にしたがって変化し得る。細胞中でのオリゴヌクレオチドの治療的レベルの確立は、取り込みおよび外向き流速または分解の速度に依存する。分解の程度を低下させることは、オリゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長する。したがって、化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えばリン酸骨格の修飾を有するものは、異なる用量を必要とする場合がある。

正確なオリゴヌクレオチドの投与量および投与される用量の数は、実験的におよび臨床治験において生み出されるデータに依存する。所望の効果、送達ビヒクル、疾患の兆候および投与の経路などの幾つかの要因が、投与量に影響を及ぼす。投与量は、当業者により容易に決定することができ、目的の医薬組成物に製剤化することができる。好ましくは、処置の期間は、少なくとも疾患の症状の経過全体に及ぶ。

投与レジメンは、最適な治療応答を提供するために調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返して投与してもよく、例えば数回の用量を毎日投与しても、治療の状況の要件により示されるとおりに、比例的に減少させてもよい。当該オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかに拘わらず、当業者は、目的のオリゴヌクレオチドの適切な用量および投与のスケジュールを容易に決定することができる。

核酸を導入する物理的方法として、核酸を含む溶液の注射、核酸により被覆される粒子による衝撃、核酸の溶液中での細胞または生体の浸漬、または核酸の存在下における細胞膜のエレクトロポレーションが挙げられる。ウイルス粒子中にパッケージングされたウイルスコンストラクトは、細胞中への発現コンストラクトの導入および当該発現コンストラクトによりコードされる核酸の転写の両方を達成する。脂質媒介性キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介性輸送などの、核酸を細胞へ導入するための他の当該分野において公知の方法を用いてもよい。このようにして、核酸を、以下の活性の１または２以上を行う成分と共に、導入することができる：細胞による核酸の取り込みを増強する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化する、あるいは標的遺伝子の阻害を増大させる。

核酸は、細胞中へ直接導入しても（すなわち、細胞内で）；または細胞外で、腔、間質の空間中へ、生体の循環中へ導入しても、経口でまたは吸入により導入しても、または細胞もしくは生体を核酸を含む溶液中に浸漬することにより導入してもよい。血管のまたは血管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、核酸を導入することができる部位である。

標的遺伝子を有する細胞は、任意の生物から誘導することができ、または任意の生物に含まれていてもよい。生物は、植物、動物、原虫、細菌、ウイルスまたは真菌であってよい。植物は、単子葉、双子葉または裸子植物であってよい；動物は脊椎動物であっても無脊椎動物であってもよい。好ましい微生物は、農業において、または工業により用いられるものであり、植物または動物に対して病原性であるものである。

あるいは、ベクター、例えば本発明のsiRNAをコードする導入遺伝子を、当該分野において認識された技術を用いて、宿主細胞またはトランスジェニック動物中に操作してもよい。

本発明の剤（またはそれをコードするベクターまたは導入遺伝子）についての別の用途は、真核細胞、または真核の非ヒト生物、好ましくは哺乳動物の細胞または成体、および最も好ましくはヒト細胞、例えばHeLaまたは293などの細胞株、またはげっ歯類、例えばラットおよびマウスにおいて行われる機能分析である。標的特異的RNA干渉を指揮するために十分に標的mRNA配列に対して相補的である好適な本発明の核酸を投与することにより、標的細胞において、例えば細胞培養においてまたは標的生物において、特異的なノックアウトまたはノックダウン表現型を得ることができる。

したがって、本発明のさらなる主題は、標的遺伝子特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型を示す真核細胞または真核の非ヒト生物であって、完全に、または少なくとも部分的に、少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を欠損するものであって、ここで、該細胞または生物は、標的遺伝子の発現を阻害することができるRNAi剤をコードするDNAを含む、少なくとも１つのベクターによりトランスフェクトされている。本発明が、RNAi剤の特異性に起因して、幾つかの異なる内因性遺伝子の標的特異的ノックアウトまたはノックダウンを可能にすることは、注目されるべきである。

細胞または非ヒト生物、特にヒト細胞または非ヒト哺乳動物の遺伝子特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型は、処理の分析（analytic to procedures）において、例えば、遺伝子発現プロフィールおよび／またはプロテオソームなどの複雑な生理学的プロセスの機能的および／または表現型的分析において、用いることができる。好ましくは、分析は、オリゴヌクレオチドベースのチップを用いるハイスループット法により行う。

オリゴヌクレオチド安定性のアッセイ
一部の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、安定であり、すなわち、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼ分解に対して実質的に安定である。オリゴヌクレオチドは、それが内因性の細胞ヌクレアーゼによる攻撃に対して少なくとも約３倍耐性が高い場合に、ヌクレアーゼに対して実質的に耐性であるとして、および、それが対応するオリゴヌクレオチドよりも少なくとも約６倍耐性が高い場合に、高度にヌクレアーゼ耐性であるとして、定義される。これは、当該分野において公知である技術を用いて本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して実質的に耐性であることを示すことにより、実証することができる。

実質的な安定性を実証することができる一方法は、本発明のオリゴヌクレオチドが、細胞に送達された場合に機能すること、例えば、これらが、標的核酸分子の転写または翻訳を低下させることを、例えば、タンパク質レベルを測定することにより、またはmRNAの切断を測定することにより、示すことによる。標的RNAの安定性を測定するアッセイは、トランスフェクションの約２４時間後に行うことができる（例えば、当該分野において公知であるように、ノーザンブロット技術、RNase保護アッセイ、またはQC-PCRを用いて）。あるいは、標的タンパク質のレベルを測定してもよい。好ましくは、目的のRNAまたはタンパク質のレベルを試験することに加えて、対照の、非標的遺伝子（例えば、アクチン、または好ましくは標的と類似する配列を有する対象）のRNAまたはタンパク質のレベルを特異性の対照として測定する。RNAまたはタンパク質の測定は、任意の当該分野において認識された技術を用いて行うことができる。好ましくは測定は、トランスフェクションの約１６～２４時間後に開始して行う（M. Y. Chiang, et al. 1991. J Biol Chem. 266:18162-71; T. Fisher, et al. 1993. Nucleic Acid Research. 21 3857）。

本発明のオリゴヌクレオチド組成物がタンパク質合成を阻害する能力は、当該分野において公知である技術、例えば遺伝子の転写またはタンパク質合成における阻害を検出することにより、測定することができる。例えば、ヌクレアーゼＳ１のマッピングを行ってもよい。別の例において、ノーザンブロット分析を行って、特定のタンパク質をコードするRNAの存在を測定してもよい。例えば、全RNAを、塩化セシウムのクッションの上で調製してもよい（例えば、Ausebel et al., 1987. Current Protocols in Molecular Biology（Greene & Wiley, New York）を参照）。次いで、そのRNAを用いてノーザンブロットを行い、プローブする（例えば上記を参照）。別の例において、例えばPCRを用いて、標的タンパク質により産生される特定のmRNAのレベルを測定することができる。さらに別の例において、ウェスタンブロットを用いて、存在する標的タンパク質の量を測定してもよい。なお別の態様において、タンパク質の量により影響を受ける表現型を検出してもよい。ウェスタンブロットを行うための技術は、当該分野において周知であり、例えば、Chen et al. J. Biol. Chem. 271:28259を参照されたい。

別の例において、標的遺伝子のプロモーター配列をレポーター遺伝子に結合させ、レポーター遺伝子の転写を（例えば、以下に詳細に記載されるように）モニタリングしてもよい。あるいは、プロモーターを標的化しないオリゴヌクレオチド組成物を、標的核酸分子の一部をレポーター遺伝子に、レポーター遺伝子が転写されるように融合させることにより、同定してもよい。オリゴヌクレオチド組成物の存在下においてレポーター遺伝子の発現の変化をモニタリングすることにより、レポーター遺伝子の発現を阻害する上でのオリゴヌクレオチド組成物の有効性を決定することが可能である。例えば、一態様において、有効なオリゴヌクレオチド組成物は、レポーター遺伝子の発現を低下させる。

「レポーター遺伝子」は、検出可能な遺伝子産物を発現する核酸であって、これは、RNAまたはタンパク質である。mRNA発現の検出は、ノーザンブロットにより達成することができ、タンパク質の検出は、当該タンパク質に対して特異的な抗体で染色することにより達成することができる。好ましいレポーター遺伝子を、当該レポーター遺伝子の産物の検出が調節配列の転写活性の測定をもたらすように、調節DNA配列に作動的に連結してもよい。好ましい態様において、レポーター遺伝子の遺伝子産物は、その産物に関連する固有の活性により検出される。例えば、レポーター遺伝子は、色、蛍光または発光に基づく検出可能なシグナルを酵素活性により生じる遺伝子産物をコードしていてもよい。レポーター遺伝子の例として、限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。

当業者は、本発明における使用のために好適な多数のレポーター遺伝子を容易に認識することができる。これらは、限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、ヒト成長ホルモン（hGH）およびベータ－ガラクトシダーゼを含む。かかるレポーター遺伝子の例は、F. A. Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, New York（1989）において見出すことができる。検出可能な産物、例えば、検出可能な酵素活性を有する、または特定の抗体を生じることができる任意の産物をコードする任意の遺伝子を、本方法におけるレポーター遺伝子として用いることができる。

一つのレポーター遺伝子システムは、ホタルルシフェラーゼレポーターシステムである（Gould, S. J., and Subramani, S. 1988. Anal. Biochem., 7:404-408 incorporated herein by reference）。ルシフェラーゼアッセイは、迅速かつ感受性である。このアッセイにおいて、試験細胞のライセートを調製し、ATPおよび基質ルシフェリンと組み合わせる。コードされた酵素であるルシフェラーゼは、迅速なATP依存的な基質の酸化を触媒し、発光生成物を生成する。合計の光出力を測定し、広範囲の酵素の濃度にわたって存在するルシフェラーゼの量に比例させる。

CATは、別の頻繁に用いられるレポーター遺伝子システムである。このシステムの主な利点は、これは広範囲に有効性を確認されており、プロモーター活性の尺度として広く受容されていることである（Gorman C. M., Moffat, L. F., and Howard, B. H. 1982. Mol. Cell. Biol., 2:1044-1051）。このシステムにおいて、試験細胞をCAT発現ベクターによりトランスフェクトし、最初のトランスフェクションの２～３日以内に、候補物質と共にインキュベートする。その後、細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射活性クロラムフェニコールと共にインキュベートする。インキュベーションの後で、アセチル化されたクロラムフェニコールを、薄相クロマトグラフィーにより、非アセチル化形態から分離する。このアッセイにおいて、アセチル化の程度が、特定のプロモーターによるCAT遺伝子の活性を反映する。

別の好適なレポーター遺伝子システムは、hGHの免疫学的検出に基づく。このシステムはまた、迅速かつ使用するのが容易である（Selden, R., Burke-Howie, K. Rowe, M. E., Goodman, H. M., and Moore, D. D. (1986), Mol. Cell, Biol., 6:3173-3179 incorporated herein by reference）。hGHシステムは、発現されたhGHポリペプチドが、細胞抽出物ではなく溶媒中でアッセイされることにおいて有利である。したがって、このシステムは、試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムがhGHには限定されず、むしろ、受容可能な特異性を有する抗体が利用可能であるかまたはこれを準備することができる任意のポリペプチドについての使用のために適しているという原則が、理解されるべきである。

一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を測定し、対照、例えば当該分野において代表的に用いられるRNAi分子（例えば、長さが２５ヌクレオチド未満であって２ヌクレオチド塩基の突出を含むデュプレックスオリゴヌクレオチド）または平滑末端を有する未修飾RNAデュプレックスと比較する。

本発明のsiRNAを用いて達成される標的RNA切断反応は、高度に配列特異的である。配列同一性は、当該分野において公知の配列の比較およびアラインメントアルゴリズムにより決定することができる。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の％同一性を決定するために、配列を、最適な比較目的のためにアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１の配列または第２の配列中にギャップを導入する）。配列の比較のために利用される局所アラインメントアルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムであって、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において修飾されたものである。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。さらに、DharmaconおよびInvitrogenなどの多数の企業が、彼らのウェブサイト上のアルゴリズムへのアクセスを提供する。Whitehead Instituteもまた、フリーのsiRNA選択プログラムを提供している。siRNAと標的遺伝子との間の９０％より高い配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％までもの配列同一性が好ましい。あるいは、siRNAは、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義される。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の例は、Sambrook, J.、E. F. FritschおよびT. Maniatis、1989年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、第9章および11章、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology、1995年、F. M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.、セクション2.10および6.3-6.4において提供され、これらは本明細書において参考として組み込まれる。

治療的使用
遺伝子の発現を阻害することにより、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、タンパク質の発現を伴う任意の疾患を処置するために用いることができる。オリゴヌクレオチド組成物により処置することができる疾患の例として、単に説明するために、癌、網膜症、自己免疫疾患、炎症性疾患（すなわち、ICAM-1関連障害、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病）、ウイルス疾患（すなわち、HIV、Ｃ型肝炎）、miRNA障害、および心血管性疾患が挙げられる。

一態様において、オリゴヌクレオチドによるin vitroでの細胞の処置を、対象から取り除かれた細胞のex vivoでの治療のため（例えば、白血病またはウイルス感染の処置のため）、または対象に由来しないが対象に投与される予定の細胞の処置のため（例えば、対象に移植される予定の細胞における移植抗原の発現の除去）に用いることができる。さらに、in vitroでの細胞の処置を、非治療的セッティングにおいて、例えば遺伝子の機能を評価するため、遺伝子の調節およびタンパク質合成を研究するため、または遺伝子発現またはタンパク質合成を調節するように設計されたオリゴヌクレオチドに対して行われた改善を評価するために、用いることができる。in vivoでの細胞の処置は、タンパク質の発現を阻害することが望ましい特定の臨床的セッティングにおいて有用であり得る。アンチセンス治療が好適であることが報告されている多数の医療条件（例えば、米国特許第5,830,653号を参照）、ならびに呼吸器多核体ウイルス感染症（WO 95/22,553）、インフルエンザウイルス（WO 94/23,028）および悪性腫瘍（WO 94/08,003）が存在する。アンチセンス配列の臨床的使用の他の例は、例えば、Glaser. 1996. Genetic Engineering News 16:1において概説される。オリゴヌクレオチドによる切断のための例示的な標的として、例えば、タンパクキナーゼＣａ、ICAM-1、c-rafキナーゼ、p53、c-myb、および慢性骨髄性白血病において見出されるbcr／abl融合遺伝子が挙げられる。

目的の核酸は、ヒト、非ヒト霊長類、非ヒト哺乳動物、非ヒト脊椎動物、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）、家畜動物、ペット（ネコ、イヌなど）、ツメガエル、魚類、昆虫（ショウジョウバエなど）、および線虫（C. elegans）などのRNAi経路を有する任意の動物において、RNAiに基づく治療において用いられる。

本発明は、対象に本発明の核酸を投与することにより、対象において、異常な、または望ましくない標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患または状態を阻害または予防するための方法を提供する。適切である場合、対象は、第１に、続くRNAi治療に対してより応答性となるように、プライミング剤により処置される。異常な、または望ましくない標的遺伝子の発現または活性により引き起こされるかこれが寄与する疾患についてのリスクを有する対象は、例えば、当該分野において公知の診断または予後診断アッセイのいずれかまたは任意の組み合わせにより同定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害が予防されるように、標的遺伝子の異常の特徴である症状の顕在化に先だって行われても、あるいは、その進行において遅れて行われてもよい。標的遺伝子の異常の型に依存して、例えば、標的遺伝子、標的遺伝子アゴニストまたは標的遺伝子アンタゴニストを対象を処置するために用いることができる。

別の側面において、本発明は、治療を目的として、標的遺伝子発現、タンパク質の発現または活性を調節するための方法に関する。したがって、例示的な態様において、本発明の方法は、標的遺伝子を発現することができる細胞を、標的遺伝子またはタンパク質に対して特異的な（例えば、前記遺伝子によりコードされるmRNAに対して特異的な、または前記タンパク質のアミノ酸配列を特定する）本発明の核酸と、標的タンパク質の発現または活性の１または２以上が調節されるように、接触させることを含む。これらの方法は、in vitroで（例えば、細胞を剤と共に培養することにより）、in vivoで（例えば、剤を対象に投与することにより）、またはex vivoで行うことができる。対象を、第１に、続くRNAi治療に対してより応答性になるように、プライミング剤で処置する。したがって、本発明は、標的遺伝子のポリペプチドまたは核酸分子の異常なまたは望ましくない発現または活性により特徴づけられる疾患または障害に罹患する個体を処置する方法を提供する。標的遺伝子の活性の阻害は、標的遺伝子が異常に制御されていない、および／または低下した標的遺伝子の活性が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。

したがって、本発明の治療剤は、異常なまたは望ましくない標的遺伝子の活性に関連する障害を処置（予防的または治療的に）するために、対象に投与することができる。かかる処置と組み合わせて、薬理ゲノミクス（すなわち、個体のジェノタイプと外来化合物または薬物に対する個体の応答との間の関係の研究）を考慮する。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度のと間の関係を変化させることにより、重篤な毒性または治療の失敗をもたらす可能性がある。したがって、医師または臨床医は、治療剤を投与するか否かを決定する上で、ならびに、投与量および／または治療剤による処置の治療レジメンを調整する上で、関連する薬理ゲノミクス研究において得られる知識を適用することを考慮してもよい。薬理ゲノミクスは、罹患個体における薬物の体内処理（disposition）および異常作用の変化に起因する、薬物に対する応答における臨床的に重要な遺伝的バリエーションに対応する。

本発明の目的のために、範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、および／または、「約」１つの別の特定の値までのものとして、表現される場合がある。かかる範囲が表現される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または、１つの他の特定の値までを含む。同様に、前述の「約」の使用により値が近似値として表わされる場合、特定の値が別の態様を形成することが理解される。さらに、範囲の各々の終点は、他の終点との関係において、および他の終点と独立して、重要である。

さらに、本発明の目的のために、用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１または２以上を指す。例えば、「a protein」または「a nucleic acid molecule」は、これらの化合物の１または２以上、または少なくとも１つの化合物を指す。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１または２以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に用いることができる。また、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、および「有する（having）」も、交換可能に用いることができる。さらに、「～からなる群より選択される」化合物は、それに続くリスト中の化合物の１または２以上を指し、化合物の２または３以上の混合物（すなわち、組み合わせ）を含む。本発明によれば、単離された、または生物学的に純粋な、タンパク質または核酸分子は、天然の環境から取り除かれている化合物である。したがって、「単離された」または「生物学的に純粋な」とは、必ずしも、その化合物が生成されている程度を反映するものではない。本発明の単離された化合物は、その天然のソースから得ても、分子生物学的技術を用いて生成しても、または化学合成により生成してもよい。

本発明を、以下の例によりさらに説明するが、これは、決してさらなる限定として解釈されるべきではない。本願の全体にわたって引用される参考文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願および同時係属の特許出願を含む）の全ての全内容は、本明細書により参考として明示的に組み込まれる。

例
例１：最短トリガーＲＮＡを用いた遺伝子発現の阻害
最短トリガー（Minimum Length Trigger：mlt）RNAのトランスフェクション
mltRNAコンストラクトを、化学合成し（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）、リポフェクタミンRNAiMAX（Invitrogen, Carlsbad, CA）試薬を製造者の指示書に従って用いて、HEK293細胞（ATCC, Manassas, VA）中にトランスフェクトした。簡単に述べると、RNAを１２×の濃度に希釈し、次いで、１２×の濃度のリポフェクタミンRNAiMAXと組み合わせて複合体とした。RNAおよびトランスフェクション試薬を、室温で２０分間複合体化させ、６×の濃度にした。複合体化の間に、HEK293細胞を洗浄し、トリプシン処理し、計数した。細胞を、製造者および先に記載される条件により推奨される濃度まで希釈した。これは１×１０^５細胞／ｍｌであった。RNAとRNAiMAXトランスフェクション試薬との複合体化が完成したら、２０ｕｌの複合体を、９６ウェルプレートの適切なウェルに、３個に分けて、添加した。細胞を各ウェルに添加し（１００ｕｌの容量）、ウェルごとの最終細胞数を１×１０^４細胞／ウェルとした。細胞の容積が、６×の濃度の複合体を、１×まで希釈し、これは、記録される濃度と等しかった（１０～０．０５ｎＭ）。細胞を２４～４８時間、通常の増殖条件下においてインキュベートした。

２４または４８時間のインキュベーションの後で、細胞を溶解し、bDNAハイブリダイゼーション技術を使用するQuantiGeneアッセイ（Panomics, Freemont, CA）を用いて、遺伝子サイレンシング活性を測定した。アッセイを、製造者の指示書に従って行った。

ΔＧの計算
ΔＧは、Mfoldインターネットサイト（http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi）を通して利用可能なMfoldを用いて計算した。ΔＧを計算するための方法は、以下の参考文献において記載され、これらから本明細書において参考として組み込まれる：Zuker, M. (2003) Nucleic Acids Res., 31(13):3406-15; Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. and Turner, D. H. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-940; Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7287-7292; Duan, S., Mathews, D. H., and Turner, D. H. (2006) Biochemistry 45:9819-9832; Wuchty, S., Fontana, W., Hofacker, I. L., and Schuster, P. (1999) Biopolymers 49:145-165。

例２：遺伝子サイレンシングのためのsd-rxRNAnano分子の最適化
最短二本鎖領域を有する非対称二本鎖RNAi分子を、本明細書において開発した。これは遺伝子サイレンシングにおいて高度に有効である。これらの分子は、センスおよび／またはアンチセンス鎖上に多様な化学修飾を含んでもよく、コレステロールなどのステロール様化合物に抱合してもよい

図１～３は、本発明に関連するRNAi分子の模式図を表わす。センスおよびアンチセンス鎖を含む非対称分子において、鎖のいずれかは、より長い鎖であってよい。いずれかの鎖はまた、一本鎖領域を含んでもよい。これらはまた、図１Ｄにおいて示されるように、センスとアンチセンス鎖との間にミスマッチを含んでもよい。好ましくは、二本鎖分子の一方の末端は、平滑末端であるか、または１ヌクレオチドの突出などの短い突出を含む。図２は、センスおよびアンチセンス鎖に対して適用される、２’Ｆ、２’ＯＭｅ、疎水性修飾およびホスホロチオエート修飾を含む化学修飾の型を示す。好ましくは、分子の一本鎖領域は、複数のホスホロチオエート修飾を含む。分子の疎水性は、５－Ｕにおける４－ピリジル、５－Ｕにおける２－ピリジル、５－Ｕにおけるイソブチル、５－Ｕにおけるインドリルなどの化合物を用いて増大させることができる（図２）。プロタミン（または他のＡｒｇリッチペプチド）、スペルミジンなどのタンパク質またはペプチドまたは他の類似の化学構造はまた、デュプレックスの電荷を遮断し、細胞への侵入を促進するために用いることができる（図３）。疎水性の増大は、共有結合性または非共有結合性修飾のいずれかを通して達成することができる。ポリヌクレオチドの電荷の遮断のために用いることができる幾つかの正に荷電した化合物を、図４に示す。

デュプレックス分子におけるガイド鎖などのポリヌクレオチドの化学修飾は、RISC侵入を促進し得る。図５は、デュプレックス分子におけるガイド鎖を表わす一本鎖ポリヌクレオチドを表わし、これは、２’ｄ、２’ＯＭｅ、２’Ｆ、疎水性修飾、ホスホロチオエート修飾を含む多様な化学修飾と、図５において「Ｘ」などとする抱合体の結合とを有し、ここで、Ｘは、PAZドメインに対して高いアフィニティーを有する小分子またはステロール型実体であり得る。同様に、図６は、デュプレックス分子におけるパッセンジャー鎖を表わす一本鎖ポリヌクレオチドと、提案されるRISC基質阻害剤の構造および化学組成とを示す。化学修飾の組み合わせは、予めロードされたRISC複合体への効率的な取り込みおよび効率的な結合を確実にし得る。

図７は、ステロール型分子が結合したポリヌクレオチドの構造を表わし、ここで、Ｒは、９個の炭素またはそれより長いポリ炭素テイルを表わす。図８は、天然に存在する、１７位において８個より長いポリ炭素鎖が結合したフィトステロールの例を表わす。２５０種を超える異なる型のフィトステロールが知られている。図９は、１７位において結合したポリ炭素鎖のサイズが多様なステロール様構造の例を表わす。図９１は、疎水性実体としてコレステロールの代わりに用いることができるステロール型分子のさらなる例を表わす。図９２は、疎水性実体としてコレステロールの代わりに用いることができるステロール型分子のさらなる例を表わす。かかる特徴の最適化は、RNAi分子の取り込み特性を改善し得る。図１０は、Martinsら（J Lipid Research）から採用したデータを表わし、これは、ステロール型分子を含む脂質乳液の肝臓での取り込みおよび血漿でのクリアランスのパーセンテージが、１７位において結合するポリ炭素鎖のサイズにより直接的に影響を受けることを示す。図１１は、疎水性抱合体に結合したポリヌクレオチドと脂肪酸との混合物から形成されるミセルを表わす。図１２は、脂質の組成の変化が、疎水性に修飾されたおよび／または疎水性に抱合体化されたポリヌクレオチドの薬物動態学的挙動および組織分布にどのように影響を及ぼすかを記載する。特に、リノール酸およびカルジオリピンが豊富な脂質混合物の使用は、心筋細胞による優先的取り込みをもたらす。

図１３は、MAP4K4の発現を標的とするように設計されたRNAiコンストラクトおよび対照の例を表わす。図１４および１５は、最短デュプレックス（duplex）領域（約１３ヌクレオチドのデュプレックス領域など）を有するRNAiコンストラクトが、細胞培養においてRNAサイレンシングを媒介する上で有効であることを明らかにする。これらのRNA分子に関連するパラメーターを、図１６に示す。図１７は、SOD1の発現を標的とするように設計されたRNAiコンストラクトおよび対照の例を表わす。図１８および１９は、細胞においてSOD1を標的とするためにこれらのRNAi分子を用いる遺伝子サイレンシング実験の結果を明らかにする。図２０は、１０ヌクレオチド未満の二本鎖領域を有するRNA分子がダイサーにより切断されないことを示す模式図を表わし、図２１は、RNAにより誘導される遺伝子サイレンシングについての理論的RNAiモデルの模式図を表わす。

本明細書において記載されるRNA分子を、そのセンスおよびアンチセンス鎖において、多様な化学修飾に供し、かかる修飾の効果を観察した。RNAi分子を合成して、多様な修飾の試験を通して最適化した。第１世代の最適化において、sd-rxRNAnano分子のセンス（パッセンジャー）およびアンチセンス（ガイド）鎖を、例えば、ＣおよびＵの２’ＯＭｅ修飾、２’Ｆ修飾、ホスホロチオエート修飾、リン酸化およびコレステロールの抱合の組み込みを通して修飾した。分子を、HeLa、初代マウス肝細胞、および初代ヒト肝細胞を含む細胞におけるMAP4K4発現の阻害について、脂質媒介性および受動的取り込みの両方のトランスフェクションを通して、試験した。

図２２は、化学修飾が遺伝子サイレンシングを増強し得ることを明らかにする。特に、パッセンジャー鎖の完全なＣＵＯ’Ｍｅ修飾と組み合わせて、２’ＦＵＣ修飾によりおよび一続きのホスホロチオエート修飾によりガイド鎖を修飾することは、遺伝子サイレンシングにおいて高度に有効である分子をもたらす。化学修飾の、HeLa細胞における自力送達（un-assisted delivery）におけるin vitro効力に対する効果もまた試験した。図２３は、２’Ｆ、２’ＯＭｅ、一続きのホスホロチオエート修飾またはコレステロール抱合体のいずれかを欠失する化合物が受動的取り込みにおいて完全に不活性であったことを明らかにする。４つ全ての型の化学修飾の組み合わせ、例えば化合物12386におけるものは、遺伝子サイレンシングにおいて高度に有効であることを見出した。図２４はまた、遺伝子サイレンシングにおける化合物12386の有効性を示す。

オリゴヌクレオチドの長さの最適化もまた調査した。図２５および２６は、２１ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドが、２５ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドよりも有効であることを明らかにし、これは、RNA分子のサイズの減少が、恐らくはその取り込みを助けることにより、効率を改善し得ることを示す。また、スクリーニングを行い、二本鎖RNA分子のデュプレックス領域のサイズを最適化した。図８８は、１０ヌクレオチドのデュプレックスを有する化合物は、遺伝子サイレンシングを誘導する上で有効であることを明らかにする。ガイド鎖に対するセンス鎖の配置もまた、遺伝子の発現をサイレンシングするために重要であり得る（図８９）。このアッセイにおいて、平滑末端が最も有効であることを見出した。３’突出は耐性を示したが、５’突出は、機能の完全な喪失をもたらした。ガイド鎖は、多様な長さのセンス鎖にハイブリダイズされた場合に、遺伝子サイレンシングにおいて有効であり得る。図９０において提示されるこのアッセイにおいて、化合物を、脂質媒介性トランスフェクションを介してHeLa細胞に導入した。

RNA分子のホスホロチオエート含有物の自力送達のための重要性もまた調査した。図２７は、ガイド鎖における少なくとも２～１２個のホスホロチオエートの存在が、取り込みを達成するために高度に有利であること、および４～８個が好ましい数であるという体系的スクリーニングの結果を表わす。図２７はまた、センス鎖におけるホスホロチオエート修飾の存在または不在は、効力を変化させなかったことも示す。

図２８～２９は、初代マウス肝細胞における遺伝子サイレンシングに対するRNA化合物の受動的取り込みの効果を明らかにする。nanoRNA分子は、特に１μＭの濃度において、高度に有効であったことが見出された（図２８）。図３０および３１は、本発明に関連するRNA化合物がまた、初代ヒト肝細胞においても、受動的取り込みの後での遺伝子サイレンシングにおいて有効であったことを明らかにする。図３２及び３３において示すように、本発明に関連するRNA化合物の細胞内局在を試験し、Cho1-siRNA（Alnylam）分子の局在と比較した。

第１世代のsd-rxRNA分子の概要を図２１に表わす。少なくとも部分的に、効力を増大するためには例えばヌクレオチドの長さおよびホスホロチオエート含有物の最適化を通して、毒性を低減するためには例えばガイド鎖上の２’Ｆ修飾を他の修飾で置き換えることを通して、送達を改善するためには例えばRNA分子をリンカーおよびステロールモダリティーに添加するかまたは抱合させることにより、ならびに、RNA分子を操作する容易性を改善するために、RNA分子中に化学修飾を導入した。図３５は、第１世代の分子においてスクリーニングした化学修飾の一部の模式図を表わす。ガイド鎖のために最適化したパラメーターとして、ヌクレオチドの長さ（例えば１９、２１および２５ヌクレオチド）、ホスホロチオエート含有物（例えば０～１８個のホスホロチオエート結合）、および２’Ｆ基の２’ＯＭｅおよび５ＭｅＣまたはリボチミジンによる置き換えが挙げられる。センス鎖のための最適化したパラメーターとして、ヌクレオチドの長さ（例えば１１、１３および１９ヌクレオチド）、ホスホロチオエート含有物（例えば０～４個のホスホロチオエート結合）、および２’ＯＭｅ修飾が挙げられる。図３６は、スクリーニングしたパラメーターをまとめる。例えば、ヌクレオチドの長さおよびホスホロチオエートテイルの長さを変更し、最適化のためにスクリーニングした。２’ＯＭｅＣおよびＵ修飾の添加についても同様。ガイド鎖の長さおよびホスホロチオエート修飾された一続きのヌクレオチドの長さが、効力に影響を及ぼすことを見出した（図３７～３８）。ホスホロチオエート修飾は、ガイド鎖において良好な耐容性を示し、受動的取り込みに影響を及ぼすことを見出した（図３９～４２）。

図４３は、スクリーニングしたガイド鎖の化学修飾を明らかにする模式図を表わす。図４４および４５は、２’ＯＭｅ修飾がガイド鎖の３’末端において耐用性を示したことを明らかにする。特に、１位および１１～１８位における２’ＯＭｅ修飾は、良好な耐用性を示した。シード領域における２’ＯＭｅ修飾は、耐用性を示したが、僅かな効力の低下をもたらした。シード領域におけるリボ修飾もまた、良好な耐用性を示した。これらのデータは、本発明に関連する分子が、２’Ｆ修飾含有物が減少しているかまたはこれを含まないことの顕著な利点を提案することを示す。２’Ｆ修飾はin vivoで毒性である考えられていることから、このことは有益である。一部の例において、２’Ｆ修飾の２’ＯＭｅによる完全な置換は、効力のいくらかの低下をもたらすことが見出された。しかし、２’ＯＭｅ置換された分子は、なお非常に活性であった。２’Ｆ含有物（１１位、１６～１８位を含み、これは２’ＯＭｅ修飾に変更された）が５０％減少した分子は、完全な２’ＦＣおよびＵ修飾を有する化合物に匹敵する効力を有することを見出した。配置された２’ＯＭｅ修飾は、一部の例において、効力を低下させることが見出されたが、これは、少なくとも部分的に、１位における２’ＯＭｅ修飾（リン酸化学構造（chemical phosphate）を有するもの）により相殺され得る。一部の例において、２’Ｆ修飾の５ＭｅＣおよび／またはリボチミジン置換は、受動的取り込みの効力の低下をもたらしたが、２’Ｆ修飾と比較して、脂質媒介性トランスフェクションにおける効力を増大した。脂質媒介性トランスフェクションについての最適化の結果は、必ずしも常に受動的取り込みについてのものと同じではない。

また、図４６に表わすとおり、センス鎖に対する修飾を、開発して試験した。図４７は、一部の例において、１０～１５塩基のセンス鎖の長さが最適であることを見出したことを明らかにする。図４７において試験された分子について、センス鎖の長さの増大は、受動的取り込みの低下をもたらしたが、センス鎖の長さの増大は、一部の化合物において態様され得る。図４７はまた、センス鎖のLNA修飾が、非LNA含有化合物と類似の効力を示したことを明らかにする。一般に、LNAまたは他の熱力学的安定化化合物の添加は、有益であり、一部の例においては、非機能的な配列の機能的配列への変換をもたらすことが見出されている。図４８はまた、センス鎖の長さの最適化についてのデータを表わし、一方、図４９は、センス鎖のホスホロチオエート修飾が受動的取り込みにとって必要ではないことを示す。

上記の最適化の実験に基づき、第２世代のRNA分子を開発した。図５０に示すとおり、これらの分子は、第１世代のRNA分子と比較して、減少したホスホロチオエート修飾含有物および減少した２’Ｆ修飾含有物を含む。重要なことに、これらのRNA分子は、自発的な細胞による取り込み、および送達ビヒクルなしでの効力を示す（図５１）。これらの分子は、自己送達を達成し得（すなわちトランスフェクション試薬なしで）、自己送達の後で、細胞培養においてナノモル単位の活性を示し得る。これらの分子はまた、脂質媒介性トランスフェクションを用いても送達することができ、トランスフェクションの後でピコモル単位の活性レベルを示す。重要なことに、これらの分子は、高効率の、細胞培養において殆どの細胞により９５％の、取り込みを示し、１００％ヒト血清の存在下において３日間を越えて安定である。これらの分子はまた、高度に特異性であり、免疫誘導を殆どまたは全く示さない。図５２および５３は、本発明に関連するRNA分子の特性に影響を与える上での、化学修飾およびかかる修飾の立体配置の重要性を明らかにする。

リンカー化合物もまた、本発明に関連するRNA分子と組み合わせて試験した。図５４に表わすとおり、ステロール型分子をTEGおよびアミノカプロン酸リンカーを通して結合させて、第２世代のRNA分子を合成した。いずれのリンカーも、同一の効力を示した。リンカー化合物に依存しないRNA分子のこの機能は、スケールアップおよび合成に関するさらなる利点を提案し、これらのRNA分子の機能の機構が、他の先に記載されたRNA分子とは非常に異なることを実証する。

本明細書において記載される化学修飾されたsd-rxRNA分子のヒト血清中での安定性を、図５５に、未修飾RNAと比較して示す。デュプレックス分子を、７５％血清中で３７℃で、示した期間にわたりインキュベートした。試料を非変性ゲルに流してSYBGRで染色することにより、分解のレベルを決定した。

図５６および５７は、sd-rxRNA分子の細胞による取り込みについてのデータを表わす。図５６は、RNA分子の長さを最少化することが、細胞による取り込みのために重要であることを示し、一方、図５７は、マウスPEC誘導マクロファージにおける自発的な細胞による取り込みの後での標的遺伝子のサイレンシングを示すデータを表わす。図５８は、初代細胞における自発的取り込みおよび標的遺伝子のサイレンシングを示す。図５９は、本発明に関連するsd-rxRNA分子の、製剤化なしでのRPE細胞への送達の結果を示す。ヘキストおよびDY547によるイメージングは、sd-rxRNA試料中のRNA分子を表わすシグナルの明確な存在を明らかにするが、一方、競合的抱合体、rxRNAおよび未トランスフェクション対照を含む他の試料においては何らのシグナルも検出可能ではなかった。図６０は、トランスフェクション製剤なしでの、本発明に関連するsd-rxRNA分子で処置したRPE細胞における、２４～４８時間後の標的遺伝子発現のサイレンシングを明らかにする。

図６１は、sd-rxRNA化合物の化学的／構造的組成のさらなる最適化を示す。一部の例において、好ましい特性として、１７～２１ヌクレオチド長であったアンチセンス鎖、１０～１５ヌクレオチド長であったセンス鎖、分子の一本鎖領域中の２～１２ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾、好ましくは一本鎖領域中の６～８ヌクレオチドのホスホロチオエート修飾、およびセンス鎖内の位置の大多数における２’ＯＭｅ修飾であって、ホスホロチオエート修飾を有するまたは有さないものが挙げられる。コレステロールなどの疎水性部分を、センス鎖の３’末端に結合させるために、任意のリンカー化学を用いてもよい。図６１に示すようなバージョンGIIbの分子は、２’Ｆ修飾を有さない。重要なことに、これらは。これらの分子において効力に対して何らの影響も及ぼさなかった。

図６２は、Wolfrum et. al. Nature Biotech, 2007により公開される化合物と比較した、sd-rxRNA化合物の優れたパフォーマンスを示す。本明細書において開発された第Ｉおよび第ＩＩ世代の化合物（ＧＩおよびＧＩＩａ）のいずれも、標的遺伝子の発現を低下させる上での優れた効力を示す。対照的に、Wolfrumらにおいて記載される化合物（全てのオリゴがセンス鎖の３’末端に抱合したコレステロールを含む）を、従来のsiRNAに関して同じ配列（２個の突出を有する１９ｂｐのデュプレックス）に適用した場合、化合物は実質的に不活性であった。これらのデータは、高度に有効なRNA化合物を提供する、本明細書において記載される化学修飾と非対称分子との組合せの重要性を強調する。

図６３は、本明細書において開発されたsd-rxRNA分子の局在を、Soutschek et al. (2004) Nature, 432:173において記載されるものなどの他のRNA分子の局在と比較して示す。sd-rxRNA分子は、細胞内部に蓄積するが、競合抱合体RNAは、細胞の表面上に蓄積する。重要なことに、図６４は、sd-rxRNA分子は数分間以内に内部移行するが、Soutschekらにおいて記載されるものなどの競合分子はそうではないことを示す。図６５は、Soutschekらにおいて記載されるような通常のsiRNA－コレステロールと比較したsd-rxRNA分子の局在を比較する。機能低下皮膚への局所送達の後で、および全身送達の後で（ここでは肝臓への取り込みが観察される）、RNA分子を表わすシグナルが、組織培養RPE細胞中のsd-rxRNA分子について明確に検出される。各々のケースにおいて、通常のsiRNA－コレステロール分子については何らのシグナルも検出されない。sd-rxRNA分子は、したがって、Soutschekらにおいて記載されるものなどの従来のコレステロール抱合siRNAと比較した場合に、顕著により優れた細胞および組織の取り込み特性を有する。取り込みのレベルは、少なくとも１桁の規模でより高く、少なくとも部分的に、化合物のユニークな組み合わせと抱合構造に起因する。先に記載されたRNA分子と比較してより優れたsd-rxRNAの送達はまた、図６６および６７において示される。

本発明に関連する第２世代のRNA分子の分析に基づき、SPP1／PPIB遺伝子を標的化するための機能的分子を同定するためにスクリーニングを行った。図６８において明らかにされるとおり、幾つかの有効な分子が同定され、14131が最も有効であった。化合物をA-549細胞に添加し、次いで、B-DNAにより４８時間後にSPP1／PPIBの比を決定した。

図６９は、暴露の数分間以内の効率的なsd-rxRNAの細胞取り込みを明らかにする。これは、これらの分子のユニークな特徴であり、いかなる他のRNAi化合物によっても観察されない。Soutschekらにおいて記載される化合物を、陰性対照として用いた。図７０は、sd-rxRNAの取り込みおよび遺伝子サイレンシングが、SH-SY5Y神経芽細胞腫誘導細胞、ARPE-19（網膜色素上皮）細胞、初代肝細胞、および初代マクロファージを含む、複数の異なる細胞型において有効であることを明らかにする。各々のケースにおいて、サイレンシングを、分岐DNAアッセイにより標的遺伝子発現を観察することにより確認した。

図７０は、sd-rxRNAが血清の存在下または不在下において活性であることを明らかにする。血清の存在下において効力の僅かな低下（２～５倍）が観察され、血清の存在下におけるこのわずかな効力の低下が、sd-rxRNA分子を、血清の存在下においてより大きな効力の低下を示した先に記載される分子と区別する。このことは、血清の存在下における効力のレベルが、in vivoでの効力のための基礎を造ることを示す。

図７２は、単一の皮内注射の際の、効率的な組織浸透および細胞取り込みを明らかにする。このデータは、本明細書において記載されるsd-rxRNA化合物の、任意の皮膚適用において遺伝子をサイレンシングするための潜在能力を示し、また、sd-rxRNA化合物の局所送達のためのモデルを表わす。図７３はまた、皮内注射の後でのsd-rxRNAによる効率的な細胞取り込みおよびin vivoサイレンシングを示す。サイレンシングは、注射の部位から採取された幾つかの個々の生検におけるMAP4K4のノックダウンのレベルとして、陰性対照を注射した部位から採取された生検と比較して、決定した。図７４は、sd-rxRNA化合物が、改善された血液クリアランスを有し、肝臓において、全身投与の後で、有効なin vivoでの遺伝子サイレンシングを誘導することを明らかにする。Soutschekらにより記載されるRNA分子と比較して、同一の用量における肝臓での取り込みのレベルは、sd-rxRNA分子を用いた場合に少なくとも５０倍高い。取り込みの結果は生産的なサイレンシングをもたらす。sd-rxRNA化合物はまた、改善された血液クリアランス胴体により特徴づけられる。

５－メチルＣ修飾の効果もまた試験した。図７５は、RNAi分子における５－メチルＣの存在が、脂質媒介性トランスフェクションにおける効力の増大をもたらすことを示す。このことは、RNAi分子中のＣおよびＵの疎水性修飾が、有益であり得ることを示唆する。これらの型の修飾はまた、最適な安定性および効力を確実にするために、２’リボース修飾塩基に関して用いることができる。図７６は、ガイド鎖における５－メチルＣおよびリボチミジンの組み込みが、一部の例において効力を低下させる場合があることを示すデータを表わす。

図７７は、sd-rxRNA分子が、肝臓への全身送達において、Soutschekらにおいて記載される分子などの競合分子よりも有効であることを明らかにする。RNA分子を表わすシグナルは、sd-rxRNAを含有する試料において明確に可視可能であり、一方、競合RNA分子を含む試料においてRNA分子を表わすシグナルは可視できない。

疎水性抱合体のsd-rxRNA分子への添加もまた探索した（図７８～８３）。図７８は、改善された疎水性の特徴を有する５－ウリジル修飾を示す模式図を表わす。sd-rxRNA化合物へのかかる修飾の組み込みは、細胞および組織の取り込み特性を増大し得る。図７８Ｂは、細胞による取り込みおよび薬物動態学的挙動を改善するために化合物に適用することができる新規の型のRNAi化合物の修飾を表わす。重要なことに、この型の修飾は、sd-rxRNA化合物に適用された場合に、かかる化合物を経口で利用可能にすることに寄与する。図７９は、合成された改変ステロール型分子の構造を明らかにする模式図を表わし、ここで、Ｃ１７結合テイルの長さおよび構造が改変されている。いかなる理論によっても拘束されることは望まないが、Ｃ１７結合テイルの長さは、sd-rxRNA化合物のin vitroおよびin vivoでの効力を改善するために寄与し得る。

図８０は、長い側鎖のコレステロールへのリトコール酸経路を示す模式図を表わす。図８１は、５―ウリジルホルホルアミダイト合成への経路を示す模式図を表わす。図８２は、３’－コレステロール結合のための３官能性ヒドロキシプロリノールリンカーの合成を示す模式図を表わす。図８３は、より短い非対称RNAi化合物の鎖の製造のための固体支持体の合成を示す模式図を表わす。

SPP1（オステオポンチン）の発現を有効にサイレンシングすることができる化合物を同定するために、スクリーニングを行った。SPP1を標的とする化合物を、A549細胞に（受動的トランスフェクションを用いて）添加し、SPP1発現のレベルを４８時間において評価した。SPP1サイレンシングにおいて有効な幾つかの新規化合物を同定した。SPP1のサイレンシングにおいて有効であった化合物は、14116、14121、14131、14134、14139、14149および14152（図８４～８６）を含む。このアッセイにおいて最も強力な化合物は、14131（図８４）であった。これらのsd-rxRNA化合物のSPP1の発現をサイレンシングする上での効力を、独立して評価した（図８５）。

類似のスクリーニングを、CTGFの発現を有効にサイレンシングすることができる化合物を同定するために行った（図８６～８７）。CTGFのサイレンシングにおいて有効であった化合物は、14017、14013、14016、14022、14025、14027を含んだ。

方法
sd-rxRNAnanoのトランスフェクション
脂質媒介性トランスフェクション
sd-rxRNAnanoコンストラクトを化学合成し（Dharmacon, Lafayette, CO）、リポフェクタミンRNAiMAX（Invitrogen, Carlsbad, CA）を製造者の指示書に従って用いて、HEK293細胞（ATCC, Manassas, VA）中へトランスフェクトした。簡単に述べると、RNAを、Opti-MEM^登録商標1 Reduced Serum Media（Invitrogen, Carlsbad, California）中で１２×の濃度まで希釈し、次いで、１２×の濃度のリポフェクタミンRNAiMAXと組み合わせた。RNAおよびトランスフェクション試薬を、室温で２０分間複合体化させ、６×の濃度にした。複合体化の間に、HEK293細胞を洗浄し、トリプシン処理し、計数した。細胞を、製造者および先に記載される条件により推奨される１×１０^５細胞／ｍｌの濃度まで希釈した。RNAとRNAiMAXトランスフェクション試薬との複合体化が完成したら、２０ｕｌの複合体を、９６ウェルプレートの適切なウェルに、３個に分けて、添加した。細胞を各ウェルに添加し（１００ｕｌの容量）、ウェルごとの最終細胞数を１×１０^４細胞／ウェルとした。細胞の容積が、６×の濃度の複合体を、１×まで希釈した（１０～０．０５ｎＭ）。細胞を２４～４８時間、通常の増殖条件下においてインキュベートした。２４または４８時間のインキュベーションの後で、細胞を溶解し、bDNAハイブリダイゼーション技術を使用するQuantiGeneアッセイ（Panomics, Freemont, CA）を用いて、遺伝子サイレンシング活性を測定した。アッセイを、製造者の指示書に従って行った。

受動的取り込みトランスフェクション
sd-rxRNAnanoコンストラクトを化学合成した（Dharmacon, Lafayette, CO）。トランスフェクションの２４時間前に、HeLa細胞（ATCC, Manassas, VA）を、１×１０^４細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに、通常の増殖条件下において（DMEM、１０％のFBS、ならびに１％のペニシリンおよびストレプトマイシン）播種した。HeLa細胞のトランスフェクションの前に、sd-rxRNAnanoを、Accell siRNA送達用培地（Delivery Media）（Dharmacon, Lafayette, CO）中で０．０１ｕＭ～１ｕＭの最終濃度まで希釈した。通常の増殖培地を、細胞から吸引除去し、適切な濃度のsd-rxRNAnanoを含む１００ｕＬのAccell送達用培地を細胞に適用した。トランスフェクションの４８時間後に、送達用培地を細胞から吸引除去して、さらなる２４時間にわたり通常の増殖培地を細胞に適用した。

４８または７２時間のインキュベーションの後で、細胞を溶解し、QuantiGeneアッセイ（Panomics, Freemont, CA）を製造者の指示書に従って用いて、遺伝子サイレンシング活性を測定した。

このように、本発明の少なくとも１つの態様の幾つかの側面を記載して、多様な改変、修飾および改善が当業者は容易に想起することが理解されるべきである。かかる改変、修飾および改善は、本開示の一部として意図され、本発明の精神および範囲のうちであることが意図される。したがって、前述の記載および図面は、単なる例である。

均等物
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される発明の具体的な態様への多数の均等物を理解するか、またはそれに気付くことができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

特許文献を含む本明細書において開示される全ての参考文献は、その全体において参考として組み込まれる。本願は、同時継続中の2008年７月２４日に出願された米国仮出願第61/135,855号、表題「SHORT HAIRPIN RNAI CONSTRUCTS AND USES THEROF」、および2008年１０月３０日に出願された米国仮出願第61/197,768号、表題「MINIRNA CONSTRUCTS AND USES THEREOF」の、全ての図面および明細書の全ての部分を含む全内容（配列表またはアミノ酸／ポリヌクレオチド配列を含む）を参考として組み込む。

Claims

標的遺伝子に対して相補性を有する、17～25ヌクレオチド長のガイド鎖と、
ガイド鎖に対して相補性を有する、10～19ヌクレオチド長のパッセンジャー鎖と
を含む、単離された二本鎖核酸分子であって、
ただし、ガイド鎖が17ヌクレオチド長であるとき、パッセンジャー鎖は10ヌクレオチド長ではなく、ここで
単離された二本鎖核酸分子が、二本鎖領域および一本鎖領域を含み、
一本鎖領域が、ガイド鎖の3'末端にあり、かつ4～12ヌクレオチド長であり、
一本鎖領域が、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のホスホロチオアート修飾を含み、
単離された二本鎖核酸分子の一端が、平滑であり、ならびに
単離された二本鎖核酸分子のヌクレオチドのうち少なくとも40％が、修飾されている、前記単離された二本鎖核酸分子。
一本鎖領域が、少なくとも6または少なくとも7ヌクレオチド長である、請求項1に記載の単離された二本鎖核酸分子。
一本鎖領域内の各ヌクレオチドが、ホスホロチオアート修飾を有する、請求項1または2に記載の単離された二本鎖核酸分子。
単離された二本鎖分子の修飾されたヌクレオチドのうち少なくとも1個が、2'O-メチル修飾もしくは2'-フルオロ修飾を含むか、および/または
単離された二本鎖分子の修飾されたヌクレオチドのうち少なくとも1個が、疎水性修飾を含む、
請求項1～3のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子。
疎水性抱合体が、二本鎖核酸分子へ結合されている、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子。
疎水性抱合体が、二本鎖核酸分子の3'末端にて結合されている、請求項5に記載の単離された二本鎖核酸分子。
パッセンジャー鎖が、11～16ヌクレオチド長である、請求項1～6のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子。
第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドを含む、単離された非対称の核酸分子であって、ここで
第1のポリヌクレオチドが、17～25ヌクレオチド長であって、かつ第2のポリヌクレオチドおよび標的遺伝子に相補的であり、
第2のポリヌクレオチドが、少なくとも11ヌクレオチド長であって、かつ第1のポリヌクレオチドより少なくとも6ヌクレオチド短く、
第1のポリヌクレオチドが、6、7、8、9、10、11または12ヌクレオチドの3'一本鎖領域を含み、
第1のポリヌクレオチドの一本鎖領域が、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のホスホロチオアート修飾を含み、
非対称の核酸分子はまた、二本鎖領域も含み、
単離された二本鎖核酸分子の一端が、平滑であり、ならびに
二本鎖領域中のCおよびUヌクレオチドのうち少なくとも50％が、2'O-メチル修飾または2'-フルオロ修飾されている、前記単離された二本鎖核酸分子。
一本鎖領域が、6もしくは7ヌクレオチド長であるか、および/または
一本鎖領域内の各ヌクレオチドが、ホスホロチオアート修飾を有する、
請求項8に記載の単離された二本鎖核酸分子。
標的遺伝子に対して相補性を有する、長さが17～21ヌクレオチドのガイド鎖、および
ガイド鎖に対して相補性を有する、長さが10～16ヌクレオチドのパッセンジャー鎖
を含む、単離された二本鎖核酸分子であって、
ただし、ガイド鎖が17ヌクレオチド長であるとき、パッセンジャー鎖は10ヌクレオチド長ではなく、ここで
ガイド鎖およびパッセンジャー鎖が、二本鎖領域および一本鎖領域を有する二本鎖核酸分子を形成し、
ガイド鎖が、長さが4～12ヌクレオチドの3'一本鎖領域を有し、
一本鎖領域が、2～12個のホスホロチオアート修飾を含み、
二本鎖核酸のヌクレオチドのうち少なくとも40％が、修飾されており、
二本鎖核酸分子の一端が、平滑であり、ならびに
少なくとも1個の修飾が、疎水性塩基修飾であるか、および/または二本鎖核酸分子が、疎水性抱合体へ連結されている、前記単離された二本鎖核酸分子。
疎水性塩基修飾が、ピリミジン塩基の疎水性修飾を含むか、あるいは
疎水性塩基修飾が、ピリミジン塩基の疎水性修飾を位置4または5にて含むか、あるいは
疎水性塩基修飾が、ウリジンまたはシチジンの、フェニル修飾、4-ピリジル修飾、2-ピリジル修飾、インドリル修飾、イソブチル修飾、トリプトファニル(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)修飾、メチル修飾、ブチル修飾、アミノベンジル修飾、およびナフチル修飾からなる群から選択される、請求項10に記載の単離された二本鎖核酸分子。
疎水性抱合体が、小分子であるか、あるいは
疎水性抱合体が、ステロール型分子であるか、あるいは
疎水性抱合体が、コレステロールである、
請求項10または11に記載の単離された二本鎖核酸分子。
疎水性抱合体が、リンカーを通して二本鎖核酸分子へ結合されているか、あるいは
疎水性抱合体が、TEGリンカーを通して二本鎖核酸分子へ結合されている、
請求項10～12のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子。
哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法における使用のための、請求項1～13のいずれか一項に記載の単離された二本鎖核酸分子を含む医薬組成物であって、前記方法が、哺乳動物の細胞を、前記単離された二本鎖核酸分子と接触させることを含む、前記方法。