JP7177053B2 - 歯周炎の治療に使用するための細菌グルタミニルシクラーゼ及びその阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、歯周炎及び関連する状態の治療に使用するための、細菌グルタミニルシクラーゼ及びその阻害剤に関する。

歯周疾患は広く蔓延し、世界中で人口の約30%が罹患しており、個人及び社会にかなりの影響を及ぼし、治療には費用がかかる。歯科治療の費用は、全ての疾患のうち4番目に高く、全ての医療財源のうちの5～10%の間を消費する(Batchelor, P. British Dental Journal 2014、217、405～409)。代表的な人口調査から、歯周疾患が広範囲に及んでおり、その有病率が1997年から増加していることが示されている(Micheelis, W.等. Vierte Deutsche Mundgesundheitsstudie (DMS IV)、Deutscher Arzte-Verlag、Koln、2006)。ドイツの成人人口のうち、52.7%が中程度に重症型、20.5%が重症型の歯周炎に罹患していることが見出された。歯周炎の直接的な治療のための健康保険の支出はドイツにおいて約11億ユーロに達しており(Statistisches Bundesamt、2008)、それには二次疾患にかかる費用は含まれていない。

歯周炎とは、複数の細菌からの誘導によって引き起こされる歯周器官の炎症状態を表す一般用語であり、循環器疾患、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患、及びアルツハイマー病等の様々な全身性疾患と強い関係性がある。

現在確立されている歯周炎の治療法は、ドイツ歯科口腔及び頭蓋下顎学会(German Society Of Dental, Oral And Craniomandibular Sciences)の推奨によれば、一般に、手操作による歯肉縁上及び歯肉縁下のデブリードマン(歯垢の除去)と共に消毒薬の適用(口腔洗浄薬による毎日の消毒)によって行われるが、これによって、全体の口腔バイオフィルムが崩壊し、潜在的病原体による再コロニー形成の機会が提供される。更に、進行した疾患型では全身への広域抗生物質補助療法が適用される。これもバイオフィルムの非選択的破壊を引き起こし、また、特定の作用部位、すなわち歯肉ポケットで十分な治療レベルに到達させるためには、これを長期間にわたって高用量で投与しなければならない。歯周炎の標準的な補助療法は、例えば、ドキシサイクリン(doxyciclin)(経口)を1日に1×200mg/日、更なる18日間に2×100mg/日全身投与することを含む(Wissenschaftliche Stellungnahme: Adjuvante Antibiotika in der Parodontitistherapie, Deutsche Gesellschaft fur Zahn- Mund- und Kieferheilkunde、DZZ 2003)。結果的に、口腔病原体に耐性が発現することが観察されている。更に、患者の腸内の微生物叢が破壊され、それによって代謝支援、免疫調節が失われ、潜在的病原体による再コロニー形成が可能となる。

歯周疾患原性細菌の存在は、歯周炎患者間で異なる。それにもかかわらず、歯肉縁下のプラークに特定の細菌種が発生することが歯周疾患の病因と密接に関係していることが見出されている(Socransky等、Journal of Clinical Periodontology、1998、25、134～144)。

よって、歯周疾患を誘導する病原体を標的化しながら、自然に発生したバイオフィルムの残りを好ましくは実質的に保持する能力がある、歯周炎及び関連する状態の新たな治療の開発に対する高い需要がある。そのような治療は、患者及び医療制度に相当な向上をもたらすはずである。

Batchelor, P. British Dental Journal 2014、217、405～409 Micheelis, W.等. Vierte Deutsche Mundgesundheitsstudie (DMS IV)、Deutscher Arzte-Verlag、Koln、2006 Statistisches Bundesamt、2008 Wissenschaftliche Stellungnahme: Adjuvante Antibiotika in der Parodontitistherapie, Deutsche Gesellschaft fur Zahn- Mund- und Kieferheilkunde、DZZ 2003 Socransky等、Journal of Clinical Periodontology、1998、25、134～144 Huang等、J. Mol. Biol. 2010、401、374～388 Messer, M. Nature 1963、197、1299 Wintjens, R.、Belrhali, H.、Clantin, B.、Azarkan, M.、Bompard, C.、Baeyens-Volant, D.、Looze, Y.、及びVilleret, V. J. Mol. Biol. 2006、357、457～470 Zerhouni等、Biochim. Biophys. Acta 1998、1387、275～290 Schilling等、J. Biol. Chem. 2003、278、49773～49779 Huang等、Proc. Natl Acad. Sci. USA、2005、102、13117～13122 Altschul S.F.等. J Mol Biol. 1990、215(3)、403～10 Schilling, S.、Hoffmann, T.、Wermann, M.、Heiser, U.、Wasternack, C.、及びDemuth, H.-U. Anal. Biochem. 2002、303、49～56 Armitage, A. Ann Periodontol 1999、4、1～6 Tabor, S.及びRichardson, C. C. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985、82、1074～1078 Manoil, C., J. J. Mekalanos及びBeckwith, J. J. Bacteriol. 1990、172(2)、515～518 Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72、248～254 Gill, S. C.及びvon Hippel, P. H. 1989 Anal Biochem 182、319～326 Schilling, S.、Manhart, S.、Hoffmann, T.、Ludwig, H.-H.、Wasternack, C.、及びDemuth, H.-U. Biol. Chem. 2003、384、1583～1592 Yang, J.T.、Wu, C.S.、及びMartinez, H.M. Methods Enzymol. 1986、130、208～269 Pribyl, T.、Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34. Dissertation、2001、Martin-Luther-University Halle-Wittenberg

上記に鑑み、本発明は、歯周疾患を誘導する病原体を標的化する能力がある阻害剤を特定するのに使用することができる、新規治療標的タンパク質の特定、精製、及び単離を目的とする。

本発明の更なる目的は、前記治療標的タンパク質を認識する抗体を提供することである。

本発明の更なる目的は、前記治療標的タンパク質の阻害剤を特定する方法を提供することである。

本発明の更なる目的は、前記治療標的タンパク質の阻害剤、及びそのような阻害剤を含む医薬組成物を提供することである。前記阻害剤は、好ましくは選択的阻害剤、すなわち、標的細菌性病原体を選択的に死滅させる又はそれらの増殖を選択的に阻害しながら、他の細菌及び/又はヒトタンパク質標的に対して実質的に不活性であるべきである。

本発明の更なる目的は、ヒト若しくは動物の体を治療する方法、及び/又はそのような方法に使用するための化合物若しくは医薬組成物を提供することである。

本発明の更なる目的は、好ましくは病原性細菌種を選択的に死滅させる若しくはそれらの増殖を選択的に阻害することによる、細菌感染症の治療法若しくは予防法、及び/又はそのような方法に使用するための化合物若しくは医薬組成物を提供することである。

本発明の更なる目的は、急性、慢性、若しくは再発性歯周疾患の治療法若しくは予防法、及び/又は、そのような方法に使用するための化合物若しくは医薬組成物を提供することである。

上記の目的に応じた治療のための方法では、投与経路は、好ましくは局所投与又は全身投与であるべきであり、該方法は、好ましくは非外科的方法である。

上に明示した問題に対する解決策として、本発明は、細菌グルタミニルシクラーゼ(bacQC)であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、並びに配列番号1、配列番号2、及び配列番号3のいずれか1つと80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、bacQCを提供する。

本発明は更に、上で定義した通りのbacQCを認識する抗体を提供する。

本発明は更に、上で定義した通りのbacQCの阻害剤を特定する方法であって、
(a)bacQCの基質及びbacQCを含む組成物を用意する工程;
(b)候補化合物を用意する工程;
(c)候補化合物を組成物と接触させる工程;
(d)bacQCの触媒活性をモニタリングする工程;
(e)bacQCの触媒活性に及ぼす候補化合物の効果に基づいて、候補化合物をbacQCの阻害剤として分類する工程であって、bacQCの触媒活性を低減させる候補化合物をbacQC阻害剤として分類する工程
を含む方法を提供する。

本発明は更に、以下の式Iによる化合物、

その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩
(式中、Ar、L、R¹、R²、R³、及びR⁴は、添付の特許請求の範囲によって定義される)
を提供する。

本発明は更に、上で定義した通りの化合物と医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。

本発明は更に、ヒト又は動物の体を治療する方法に使用するための;細菌感染症の治療法及び/又は予防法に使用するための;並びに急性、慢性、又は再発性歯周疾患の治療法及び/又は予防法に使用するための、bacQC阻害剤、すなわち、bacQCの阻害剤を特定する上記の方法によって特定された化合物、及び/又は上記の式Iによる化合物、及び/又は上で定義した通りの医薬組成物を提供する。

ヒトQC(hQC、配列番号4)及びP.ジンジバリス(P.gingivalis)(PgQC、配列番号1)由来の推定上の細菌QCのアミノ酸配列アライメント(A)、並びに更なる推定上のQC、P.インターメディア(P.intermedia)(PiQC、配列番号2)及びT.フォーサイシア(T.forsythia)(TfQC、配列番号3))及びP.ジンジバリス(PgQC、配列番号1)のアミノ酸配列アライメント(B)を示す図である。 大腸菌(E.coli)Rosetta(DE3)pLysS中で発現させた、精製した組換え推定細菌QCのSDS-PAGEを示す図である。 PgQC(A)、PiQC(B)、及びTfQC(C)が触媒するH-Gln-AMCの環化についてのラインウィーバー・バークプロットを示す図である。 化合物MWT-S-00431の存在下でのPgQCが触媒するH-Gln-AMCの環化についての、代表的なv/S特性、ラインウィーバー・バーク及びイーディー・ホフステープロットを示す図である。 PgQC活性(A)、PiQC活性(B)、及びTfQC活性(C)のpH依存性を示す図である。 細菌QC活性に及ぼすイオン強度の影響を示す図である。 様々な金属キレート剤:EDTA(A)、ジピコリン酸(B)、及び1,10-フェナントロリン(phenantroline)(C)による細菌QC活性の阻害を示す図である。 組換え細菌QCのUVスペクトルを示す図である。 組換え細菌QCのCD分光分析を示す図である。 組換え細菌QC:PgQC(A)、PiQC(B)、及びTfQC(C)の熱安定性を示す図である。 seqPgQC-'PhoA融合タンパク質を発現する透過処理した大腸菌CC118 pGP1-2細胞におけるPhoA活性を示す図である。 (A)PgQC、並びに(B)TfQC及びPiQCに対するポリクローナル抗血清の特異性を示す図である。

Socransky等(Journal of Clinical Periodontology、1998、25 134～144)によって、緊密に関連するグループであるタネレラ・フォーサイシア(Tannerella forsythia)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、及びトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)からなる、いわゆる「レッドコンプレックス」の歯肉縁下でのプラークの発生は、歯周疾患の臨床的尺度、特にポケットの深さ及びプロービング時の出血に強く関連することが記載された。

更に関連するコンプレックス(いわゆる「オレンジコンプレックス」)には、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)/フソバクテリウム・ペリオドンティカム(Fusobacterium periodonticum)亜種、プレボテーラ・インターメディア(Prevotella intermedia)、プレボテーラ・ニグレッセンス(Prevotella nigrescens)、及びペプトストレプトコッカス・ミクロス(Peptostreptococcus micros)のメンバーが含まれる。「オレンジコンプレックス」のメンバーによる健康な歯周部位のコロニー形成は、歯肉炎の発生と相関することが見出された。「オレンジコンプレックス」の細菌は、「レッドコンプレックス」の細菌によるコロニー形成を更に促進し、それが次に深いポケット及び慢性歯周炎に関係する。

「レッドコンプレックス」及び「オレンジコンプレックス」の細菌は、種々の病原性因子を分泌する。例えば、P.ジンジバリスはジンジパイン等のシステインプロテアーゼを分泌し、P.インターメディアは唾液IgAプロテアーゼを分泌し、T.フォーサイシアはグリコシダーゼを分泌することが見出された。

本発明の発明者らは、驚いたことに、口腔病原体、P.ジンジバリス、T.フォーサイシア、及びP.インターメディアの、セクレトームにシグナルペプチドを有する分泌タンパク質の約80%が、シグナルペプチダーゼによってXaa-Glnペプチド結合で切断されることを見出した。放出されたタンパク質のN末端は、pGlu残基を含有する。これは、外膜を横切る成長タンパク質移行及び前記歯周病原体の増殖に不可欠であると思われるグルタミニルシクラーゼが存在することを暗に示している。

グルタミニルシクラーゼ(QC)(EC 2.3.2.5)は、NH₃を放出しながらタンパク質のN末端グルタミニル残基のピログルタミン酸(pGlu)への環化を触媒し、それによってペプチドのN末端を修飾するアシルトランスフェラーゼである:

これまでに2つの型のQC(I型及びII型)が定義されている。I型QCは、植物中、並びに幾つかの病原性細菌及びヒト寄生虫中に見出された(Huang等、J. Mol. Biol. 2010、401、374～388)。パパイヤQC(pQC)は、最もよく知られているI型QCである。この酵素は、熱帯植物パパイヤ(Carica papaya)のラテックス中で最初に発見された(Messer, M. Nature 1963、197、1299)。この酵素は、広いpH範囲(pH 3.5～11)にわたって触媒活性を呈する。X線結晶解析から、pQCは、中央チャネルが通る5枚羽根のβプロペラからなる帽子箱の形状の分子であることが明らかにされた(Wintjens, R.、Belrhali, H.、Clantin, B.、Azarkan, M.、Bompard, C.、Baeyens-Volant, D.、Looze, Y.、及びVilleret, V. J. Mol. Biol. 2006、357、457～470)。pQCは、亜鉛イオンを含有するが、複素環式キレート剤によって全く阻害されず(Zerhouni等、Biochim. Biophys. Acta 1998、1387、275～290)、したがって、亜鉛は構造的及び安定化機能を有しているに過ぎないと想定されている。pQCは、タンパク質分解による変性、化学変性、及び熱変性に対する耐性が高い(Wintjens等、Zerhouni等)

II型QCは主に、哺乳動物の神経内分泌組織において特定された。II型QCのうち、ヒトQC(hQC)は、最も広範に研究されているものであり、多数の神経ペプチド及びサイトカインの分泌経路におけるそれらの成熟に重要であることが知られている。I型QCとは対照的に、hQCは化学及び熱変性を極めて受けやすい。Schilling等は、2003年に(J. Biol. Chem. 2003、278、49773～49779)、pHが8.5を上回り、6.0を下回るとhQCが有意に不安定であったことを示している。hQCは、α/βトポロジーを取っており(Huang等、Proc. Natl Acad. Sci. USA、2005、102、13117～13122)、複素環式キレート剤による時間依存性阻害によって示唆されるように、金属酵素として特定された。不活性化酵素は、等モル濃度のEDTAの存在下でZn²⁺を添加することによって完全に回復させることができる(Schilling等、2003)。よって、II型QCは金属依存性トランスフェラーゼであり、亜鉛が構造的及び安定化機能を有するに過ぎないI型QCとは対照的に、活性部位に結合した金属(Zn²⁺)が触媒活性に不可欠であることが示唆される。

要約すると、I型QCは、一般に、植物、幾つかの細菌及び原生動物中に見られ;それらはβプロペラ構造を呈し;タンパク質分解、熱、及び酸に対して耐性が高く;最適な触媒活性はpH 3.5～11のときであり;構造的Ca²⁺/Zn²⁺イオンを有する。

対照的に、II型QCは、主に脊椎動物中に見られ;それらはα/βトポロジーを呈し;タンパク質分解、熱、及び酸に対して耐性が低く;最適な触媒活性はpH 6.0～8.0のときであり;触媒的に不可欠なZn²⁺イオンが存在する。よって、II型グルタミニルシクラーゼは、亜鉛依存性アシルトランスフェラーゼである。

本発明の発明者等は、驚いたことに、II型QC(以降「bacQC」)が、口腔病原体、P.ジンジバリス、T.フォーサイシア、及びP.インターメディアに発現することを見出した。

P.ジンジバリス由来のQCタンパク質の一次構造(PgQC、配列番号1)は、ヒトQC(hQC、配列番号4)に対して25%の同一性を有する。更に、P.インターメディア由来のQC(PiQC、配列番号2)及びT.フォーサイシア由来のQC(TfQC、配列番号3)が特定され、これらは、PgQCに対してそれぞれ42%及び49%の同一性を共有する。更なる実験的証拠から、とりわけ、bacQC活性のpH及びイオン強度依存性(実施例4)、金属キレート剤によるQC活性の阻害(実施例5)、CD分光分析によって示されるようにα/βトポロジーであることを示唆する3種のタンパク質全ての折り畳みパターン(実施例6)、及びそれらの熱安定性(実施例7)によって確認されるように、これらの酵素が実際にII型QCファミリーに属していることが示されている。

本発明の発明者等は、bacQCが、「レッドコンプレックス」の3種の歯周炎を引き起こす細菌種のうちの2種及び「オレンジコンプレックス」の少なくとも1種の細菌種に発現し、且つそれらの増殖に不可欠であること、したがって、歯周炎疾患及び状態を治療するための抗菌性を有する治療用阻害剤を開発するための標的として極めて重要であることを見出した。

治療標的タンパク質(bacQC)
本発明は、細菌グルタミニルシクラーゼ(bacQC)であって、配列番号1、配列番号2、配列番号3、並びに配列番号1、配列番号2、及び配列番号3のいずれか1つと80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、bacQCを提供する。本発明によるbacQCは、実施例1に記載するように特定、単離、及び精製することができ、実施例2及び3に更に記載するように、歯周炎を誘導する病原体を選択的に標的化する能力がある阻害剤を特定するために使用することができる。

2つ以上のアミノ酸配列を比較することを目的として、2つのアミノ酸配列間の同一性の程度(「配列同一性」の百分率)を、従来の方法によって、例えば、当技術分野で公知の標準的な配列アライメントアルゴリズム、例えばBLAST等を利用して決定することができる(Altschul S.F.等. J Mol Biol. 1990、215(3)、403～10)。

抗体
本発明は更に、細菌II型グルタミニルシクラーゼ(bacQC)を認識する抗体を提供する。本発明による抗体によって認識されるbacQCは、好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、並びに配列番号1、配列番号2、及び配列番号3のいずれか1つと80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

一実施形態では、該抗体はポリクローナル抗体である。別の実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体である。

更なる一実施形態では、該抗体は、PiQC(配列番号2)、TfQC(配列番号3)、及び/又はhQC(配列番号4)のいずれか1つと比較して、PgQC(配列番号1)に対して高い親和性及び特異性を呈する。別の実施形態では、該抗体は、PiQC(配列番号2)、TfQC(配列番号3)、及び/又はhQC(配列番号4)のいずれか1つと比較して、PgQC(配列番号1)に対して高い親和性及び特異性を呈する。

別の実施形態では、該抗体は、PgQC(配列番号1)、TfQC(配列番号3)、及び/又はhQC(配列番号4)のいずれか1つと比較して、PiQC(配列番号2)に対して高い親和性及び特異性を呈する。

別の実施形態では、該抗体は、PgQC(配列番号1)、PiQC(配列番号2)、及び/又はhQC(配列番号4)のいずれか1つと比較して、TfQC(配列番号3)に対して高い親和性及び特異性を呈する。

更に別の実施形態では、該抗体は、好ましくは、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体である。

阻害剤を特定する方法
本発明は更に、bacQCの阻害剤を特定する方法であって、以下の工程a)～e):
a)bacQCの基質及びbacQCを含む組成物を用意する工程;
b)候補化合物を用意する工程;
c)候補化合物を組成物と接触させる工程;
d)bacQCの触媒活性をモニタリングする工程;
e)bacQCの触媒活性に及ぼす候補化合物の効果に基づいて、候補化合物をbacQCの阻害剤として分類する工程であって、bacQCの触媒活性を低減させる候補化合物をbacQC阻害剤として分類する工程
を含む方法を提供する。

本発明のある実施形態によれば、前記組成物は水溶液であり、好ましくは適切な緩衝剤及び/又は塩成分を含む。前記基質は、好ましくは、グルタミン残基をそのN末端に含む、ペプチド又はペプチド誘導体である。前記基質は、好ましくは標識されており、より好ましくは同位体で標識されており、最も好ましくは蛍光発生基質である。蛍光発生基質は、好ましくは、bacQCによって触媒される反応の過程で変換された後に蛍光強度の変化を生じる。

bacQCの活性をモニタリングするのに適した蛍光発生基質は、Schilling, S.、Hoffmann, T.、Wermann, M.、Heiser, U.、Wasternack, C.、及びDemuth, H.-U. Anal. Biochem. 2002、303、49～56(Schilling等、2002)に記載されるような、H-Gln-AMCである:

候補化合物は、工程a)の組成物の残りの成分を添加する前に、それを添加すると同時に、又はそれを添加した後に接触させることができる。候補化合物は、好ましくは溶液中に、より好ましくはDMSO溶液として用意される。

基質の変換は、例えば、蛍光発生基質の切断によって生じた蛍光体の発光をモニタリングすることによって、経時的にモニタリングされる。bacQCの活性は、アッセイ条件下でのAMCの検量線から決定することができる。

bacQCの触媒活性は、様々な濃度の基質、bacQC、及び/又は候補化合物を使用して決定することができる。bacQCの触媒活性の適切な尺度は、例えば、阻害定数(K_i)、所与の濃度の候補化合物の存在下での50%残存活性(RA)、及び/又はIC₅₀値である。

bacQC阻害剤
本発明は更にbacQC阻害剤を提供し、該bacQC阻害剤は、本発明によるbacQCの阻害剤を特定する方法によって特定された化合物及び/又は以下の態様<1>～<20>のいずれか1つによる化合物である。

<1> 以下の式Iによる化合物、

その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩
(式中、Arは、場合により置換されているアリール、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
Lは、単結合、-CR⁵(R⁶)-、-CR⁵(R⁶)-CR⁷(R⁸)-、及び-C(R⁵)=C(R⁶)-からなる群から選択され;
R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸は、同一であるか又は互いに異なっており、独立に、H、F、Cl、Br、I、OH、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹/R²、R³/R⁴、R⁵/R⁶、及びR⁷/R⁸基の各対において、2つの基は、場合により一緒に結合して炭素環式若しくは複素環式環を形成することができ、又は場合により=Oを表すことができる)。

<2> R¹、R²、R³、及びR⁴が、同一であるか又は互いに異なっており、独立に、H、OH、場合により置換されているC_1～6アルキル、及び場合により置換されているC_1～6ヘテロアルキルから選択される、態様<1>による化合物。

<3> R¹及びR²の各々がHである、態様<1>又は<2>による化合物。

<4> R¹及びR²が一緒に=Oを表す、態様<1>～<3>のいずれか1つによる化合物。

<5> R³及びR⁴が独立に、H、場合により置換されているC_1～6アルキル、及び場合により置換されているC_1～6ヘテロアルキルからなる群から選択される、態様<1>～<4>のいずれか1つによる化合物。

<6> R³がメチルである、態様<5>による化合物。

<7> R⁴が、H及びメチルからなる群から選択される、態様<5>又は<6>による化合物。

<8> R³及びR⁴の各々がメチルである、態様<7>による化合物。

<9> R³及びR⁴の各々がHである、態様<1>～<7>のいずれか1つによる化合物。

<10> R¹及びR²が一緒に結合して炭素環式又は複素環式環を形成する、態様<1>による化合物。

<11> R³及びR⁴が一緒に結合して炭素環式又は複素環式環を形成する、態様<1>～<5>のいずれか1つによる化合物。

<12> R¹及びR²又はR³及びR⁴が一緒に結合して、以下の式IIによって表される複素環基を形成する、態様<10>又は<11>による化合物。

<13> Lが単結合である、態様<1>～<12>のいずれか1つによる化合物。

<14> Lが、-CR⁵(R⁶)-、-C(R⁵)=C(R⁶)-、及び-CR⁵(R⁶)-CR⁷(R⁸)-からなる群から選択される、態様<1>～<12>のいずれか1つによる化合物。

<15> R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸が、同一であるか又は互いに異なっており、独立に、H、OH、場合により置換されているC_1～6アルキル、及び場合により置換されているC_1～6ヘテロアルキルからなる群から選択される、態様<14>による化合物。

<16> R⁵、R⁶、R⁷、及びR⁸の各々がHである、態様<15>による化合物。

<17> Arが、アリール、アルコキシアリール、カルボキシアリール、シアノアリール、ハロアリール、ヒドロキシアリール、アルコキシヘテロアリール、シアノヘテロアリール、ハロヘテロアリール、ヘテロアリールアリール、ヒドロキシヘテロアリール、及びカルボキシヘテロアリールからなる群から選択され、それらの各々が場合により置換されていてもよい、態様<1>～<16>のいずれか1つによる化合物。

<18> Arが、1,3-ベンゾジオキソール-5-イル、2,3-ジクロロフェニル、2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル、3-クロロ-5-メトキシフェニル、3-クロロフェニル、3-フルオロフェニル、3-メトキシフェニル、3,4,5-トリフルオロフェニル、3,5-ジクロロフェニル、4-(ベンジルオキシ)フェニル、4-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェン-1-イル、4-ブトキシフェニル、4-クロロフェニル、4-フルオロ-3-メトキシフェニル、4-フルオロフェニル、4-メトキシフェニル、ビフェニル-3-イル、ナフタレン-2-イル、及びフェニルからなる群から選択される、態様<1>～<17>のいずれか1つによる化合物。

<19> 前記置換アリールが、以下の構造Ar-I～Ar-VIの1つによって表される、態様<1>～<17>のいずれか1つによる化合物

(式中、
R¹²は独立に、H、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹³は独立に、H、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁴は独立に、H、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁵は独立に、H、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁶は独立に、H、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹²～R¹⁶の任意の2つの基は、場合により一緒に結合して炭素環式又は複素環式環を形成することができ;
R¹²～R¹⁶の少なくとも1つはHではない)。

<20> 前記置換アリールが、以下の構造Ar-VII～Ar-XIVの1つによって表される、態様<1>～<17>のいずれか1つによる化合物

(式中、
R¹²は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹³は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁴は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁵は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁶は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
R¹⁷は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
各R¹⁸は独立に、H、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;nは、0、1、2、3、4、5、及び6から選択され;
R¹²～R¹⁸の任意の2つの基は、場合により一緒に結合して炭素環式又は複素環式環を形成することができる)。

「アルキル」という表現は、本明細書で使用される場合、特に限定しない限り、C_1～12アルキル基、適切にはC_1～8アルキル基、例えばC_1～6アルキル基、例えばC_1～4アルキル基を示す。アルキル基は、直鎖又は分枝であってよい。適切なアルキル基として、例えば、メチル、エチル、プロピル(例えば、n-プロピル及びイソプロピル)、ブチル(例えば、n-ブチル、イソ-ブチル、sec-ブチル、及びtert-ブチル)、ペンチル(例えばn-ペンチル)、ヘキシル(例えばn-ヘキシル)、ヘプチル(例えばn-ヘプチル)、及びオクチル(例えばn-オクチル)が挙げられる。「アルキル」という用語は、シクロアルキル基も含む。「シクロアルキル」という表現は、特に限定しない限り、C_3～10シクロアルキル基(すなわち、3～10個の環炭素原子)、より適切にはC_3～8シクロアルキル基、例えばC_3～6シクロアルキル基を示す。代表的なシクロアルキル基として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。環炭素原子の最も適切な数は3～6である。

「ヘテロアルキル」という表現は、特に限定しない限り、1個又は複数の炭素原子、好ましくは1、2、又は3個が、N、S、及びOから選択されるヘテロ原子によって置き換えられているアルキル基を指す。

「カルボシクリル」及び「炭素環式」という表現は、特に限定しない限り、全ての環原子が炭素であり、3～12個の間の環炭素原子、適切には3～10個の間の炭素原子、より適切には3～8個の間の炭素原子を含有する、任意の環系を示す。カルボシクリル基は、飽和又は部分的に不飽和であってもよいが、芳香族環を含まない。カルボシクリル基の例として、単環式、二環式、及び三環式環系、特に、単環式及び二環式環系が挙げられる。他のカルボシクリル(carbocylcyl)基として、架橋環系(例えばビシクロ[2.2.1]へプテニル)が挙げられる。カルボシクリル基の具体例は、シクロアルキル基である。カルボシクリル基の更なる例は、シクロアルケニル基である。

「アリール」という表現は、特に限定しない限り、C_6～12アリール基、適切にはC_6～10アリール基、より適切にはC_6～8アリール基を示す。アリール基は、少なくとも1個の芳香族環(例えば、1個、2個、又は3個の環)を含有する。1個の芳香族環を有する典型的なアリール基の例は、フェニルである。2個の芳香族環を有する典型的なアリール基の例は、ナフチルである。

「ヘテロシクリル」及び「複素環式(heterocyclyc)」という表現は、特に限定しない限り、1個又は複数(例えば、1、2、又は3個)の環原子が、N、S、及びOから選択されるヘテロ原子によって置き換えられているカルボシクリル基を指す。ヘテロシクリル基の具体例は、1個又は複数(例えば、1、2、又は3個、特に1又は2個、とりわけ1個)の環原子が、N、S、又はOから選択されるヘテロ原子によって置き換えられているシクロアルキル基(例えば、シクロペンチル、又はより特定するとシクロヘキシル)である。1個のヘテロ原子を含有する代表的なヘテロシクリル基として、ピロリジン、テトラヒドロフラン、及びピペリジンが挙げられ、2個のヘテロ原子を含有する代表的なヘテロシクリル基として、モルホリン及びピペラジンが挙げられる。ヘテロシクリル基の更なる具体例は、1個又は複数(例えば、1、2、又は3個、特に1又は2個、とりわけ1個)の環原子が、N、S、及びOから選択されるヘテロ原子によって置き換えられているシクロアルケニル基(例えば、シクロヘキセニル基)である。そのような基の例は、ジヒドロピラニル(例えば、3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル-)である。

「ヘテロアリール」という表現は、特に限定しない限り、1個又は複数(例えば、1、2、3、又は4個、適切には、1、2、又は3個)の環原子が、N、S、及びOから選択されるヘテロ原子によって置き換えられているアリール残基、或いは、N、S、及びOから選択される1個又は複数(例えば、1、2、3、又は4個、適切には1、2、又は3個)の環原子を含有する5員芳香族環を示す。1個のヘテロ原子を有する代表的な単環式ヘテロアリール基として、5員環(例えば、ピロール、フラン、チオフェン);及び6員環(例えば、ピリジン、例えば、ピリジン-2-イル、ピリジン-3-イル、及びピリジン-4-イル)が挙げられる。2個のヘテロ原子を有する代表的な単環式ヘテロアリール基として、5員環(例えば、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、例えば、イミダゾール-1-イル、イミダゾール-2-イル、イミダゾール-4-イル);6員環(例えば、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン)が挙げられる。3個のヘテロ原子を有する代表的な単環式ヘテロアリール基として、1,2,3-トリアゾール及び1,2,4-トリアゾールが挙げられる。4個のヘテロ原子を有する代表的な単環式ヘテロアリール基として、テトラゾールが挙げられる。代表的な二環式ヘテロアリール基として、インドール(例えば、インドール-6-イル)、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン(benzthiophene)、キノリン、イソキノリン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾチアゾール、キナゾリン、及びプリンが挙げられる。

「アルコキシアリール」、「カルボキシアリール」、「シアノアリール」、「ハロアリール」、「ヒドロキシアリール」、及び「ヘテロアリールアリール」という表現は、特に限定しない限り、少なくとも1個のアルコキシ、カルボキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、及びヘテロアリール基によってそれぞれ置換されているアリール残基を示す。

「アルコキシヘテロアリール」、「カルボキシヘテロアリール」、「シアノヘテロアリール」、「ハロヘテロアリール」、及び「ヒドロキシヘテロアリール」という表現は、特に限定しない限り、少なくとも1個のアルコキシ、カルボキシ、シアノ、ハロ、及びヒドロキシ基によってそれぞれ置換されているヘテロアリール残基を指す。

例えば、「アルコキシ」、「ハロアルキル」という表現における「アルキ(アルコ)」という表現は、「アルキル」の定義に従って解釈されるべきである。代表的なアルコキシ基として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ(例えば、n-プロポキシ)、ブトキシ(例えば、n-ブトキシ)、ペントキシ(例えばn-ペントキシ)、ヘキソキシ(例えばn-ヘキソキシ)、ヘプトキシ(例えばn-ヘプトキシ)、及びオクトキシ(例えばn-オクトキシ)が挙げられる。代表的なハロアルキル基として、フルオロアルキル、例えばCF₃が挙げられ、代表的なハロアルコキシ基として、フルオロアルキル、例えばOCF₃が挙げられる。

「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、フッ素(F)、塩素(Cl)、臭素(Br)、及びヨウ素(I)を含む。

「場合により置換されている」という用語は、C_1～6アルキル、C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、並びにC_1～5ヘテロアリール基（これらの各々は、1個又は数個のハロゲン原子及び/又はヒドロキシル基によって置換されていてもよい）、ハロゲン原子、シアノ基、並びにヒドロキシル基から独立に選択される1個又は数個の基による任意の置換を指す。

立体異性体
特許請求する化合物の全ての可能な立体異性体が本発明に含まれる。

本発明による化合物が少なくとも1つのキラル中心を有する場合、それに応じて化合物は鏡像異性体として存在し得る。化合物が2つ以上のキラル中心を有する場合、化合物は、加えてジアステレオ異性体として存在し得る。そのような全ての異性体及びそれらの混合物が本発明の範囲に包含されることが理解されるべきである。

本発明による化合物を調製する方法が立体異性体の混合物を生じる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィー等の従来の技法によって分離されてもよい。化合物は、ラセミ体で調製されてもよく、又は個々の鏡像異性体が、エナンチオ特異的合成若しくは分割のいずれかによって調製されてもよい。化合物は、例えば、(-)-ジ-p-トルオイル-d-酒石酸及び/若しくは(+)-ジ-p-トルオイル-l-酒石酸等の光学活性な酸と塩を形成した後に分別結晶及び遊離塩基の再生を行うか、又はキニン、キニジン、キノトキシン、シンコトキシン(cinkotoxine)、(S)-フェニルエチルアミン、(1R,2S)-エフェドリン、(R)-フェニルグリシノール、(S)-2-アミノブタノール等の光学活性な塩基と塩を形成した後に分別結晶及び遊離酸の再生を行うことによってジアステレオ異性体の対を形成すること等の標準的技法によって、化合物の成分である鏡像異性体に分割されてもよい。化合物はまた、ジアステレオ異性体のエステル又はアミドを形成した後にクロマトグラフ分離及びキラル補助剤の除去を行うことによって分割されてもよい。或いは、化合物は、キラルHPLCカラムを使用して分割されてもよい。

多形結晶形、溶媒和物、水和物
更に、化合物の個々の結晶形のあるものは多形体として存在してもよく、そういうものとして本発明に含まれることが意図される。加えて、化合物のあるものは、水(すなわち、水和物)又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよく、そのような溶媒和物も本発明の範囲内に包含されることが意図される。化合物(それらの塩も含めて)は、それらの水和物の形態で得ることもでき、又はそれらの結晶化に使用される他の溶媒を含むことができる。遊離化合物とそれらの塩、水和物、又は溶媒和物の形態の化合物との間の密接な関係を鑑みて、化合物が本文脈で言及されるときはいつも、対応する塩、溶媒和物、又は多形体もまた、それらがその状況下で可能であるか又は適当である限り意図される。

互変異性体
本明細書で使用される場合、「互変異性体」という用語は、隣接する単結合及び二重結合の間のプロトンの移動を指す。互変異性化過程は可逆性である。本明細書に記載する化合物は、化合物の物性の範囲内のあらゆる可能な互変異性化を受けることがある。

医薬的に許容される塩
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、ヒトへの使用と獣医学的使用の両方を包含する。例えば、「医薬的に許容される」という用語は、獣医学的に許容される化合物又はヒトの医薬品及び健康管理に許容される化合物を包含する。

医薬品に使用するのに適した式Iの化合物の塩、水和物、及び溶媒和物、並びにそれらの生理学的機能性誘導体は、対イオン又は結合した溶媒が医薬的に許容されるものである。しかし、医薬的に許容されない対イオン又は結合した溶媒を有する塩、水和物、及び溶媒和物は、例えば、他の化合物及びそれらの医薬的に許容される塩、水和物、及び溶媒和物を調製する際に中間体として使用されるために、本発明の範囲内である。

本発明による適切な塩には、有機及び無機の酸又は塩基のいずれかと形成されたものが含まれる。医薬的に許容される酸付加塩として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、スルファニル酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アリールスルホン酸(例えば、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、又はナフタレンジスルホン酸)、サリチル酸、グルタル酸、グルコン酸、トリカルバリル酸、桂皮酸、置換桂皮酸(例えば、4-メチル及び4-メトキシ桂皮酸を含めた、フェニル、メチル、メトキシ、又はハロ置換桂皮酸)、アスコルビン酸、オレイン酸、ナフトエ酸、ヒドロキシナフトエ酸(例えば、1-又は3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸)、ナフタレンアクリル酸(例えば、ナフタレン類-アクリル酸)、安息香酸、4-メトキシ安息香酸、2-又は4-ヒドロキシ安息香酸、4-クロロ安息香酸、4-フェニル安息香酸、ベンゼンアクリル酸(例えば、1,4-ベンゼンジアクリル酸)、イセチオン酸、過塩素酸、プロピオン酸、グリコール酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、パモ酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸、及びトリフルオロ酢酸から形成されたものが挙げられる。医薬的に許容される塩基性塩として、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム及びカリウムのもの、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム及びマグネシウムのもの、並びに有機塩基との塩、例えば、ジシクロヘキシルアミン及びN-メチル-D-グルカミンが挙げられる。

本発明の化合物の全ての医薬的に許容される酸付加塩形態は、本発明の範囲に包含されることが意図される。

医薬組成物
本発明による医薬組成物は、上に記載する通りの化合物と医薬的に許容される賦形剤とを含む。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、特許請求する化合物を治療的有効量で含む製品だけでなく、特許請求する化合物の組合せから直接的又は間接的に生じるあらゆる製品も包含することが意図される。本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、ガレヌス製剤用の、例えば、液体経口調製物用(懸濁剤、エリキシル剤、及び液剤等);及び/又は固体経口調製物用(例えば、散剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、及び錠剤等)の、担体、結合剤、崩壊剤、及び/又は適切な更なる添加剤を指す。混合物に添加し得る担体には、必要で不活性な医薬賦形剤が含まれ、これらとして、適切な懸濁化剤、滑沢剤、風味剤、甘味料、防腐剤、コーティング剤、顆粒化剤、染料、及び着色料が挙げられるが、これらに限定されない。

治療用途
本発明は、bacQC阻害剤化合物、すなわち、本発明によるbacQCの阻害剤を特定する方法によって特定された化合物、及び/若しくは上記の態様<1>～<20>のいずれか1つによる化合物、又はヒト若しくは動物の体を治療する方法に使用するための上に記載する通りの医薬組成物を提供する。本開示はまた、ヒト又は動物の体を治療する方法であって、それを必要とする被験体に治療的有効量の前記化合物又は組成物を投与することを含む方法を提供する。

本発明は更に、細菌感染症の治療法又は予防法に使用するための、bacQC阻害剤化合物又は上に記載する通りの医薬組成物を提供する。本開示はまた、細菌感染症の治療法又は予防法であって、それを必要とする被験体に治療的有効量の前記化合物又は組成物を投与することを含む方法を提供する。細菌感染症は、好ましくは、II型細菌グルタミニルシクラーゼ(bacQC)を発現する細菌によって引き起こされる。より好ましくは、細菌感染症は、ポルフィロモナス、プレボテーラ、及びタネレラ属からなる群から選択される細菌によって引き起こされ、好ましくは、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテーラ・インターメディア、及びタネレラ・フォーサイシア種からなる群から選択される細菌によって引き起こされる。

本発明による方法に使用されるbacQC阻害剤化合物又は医薬組成物は、バイオフィルム中の、ポルフィロモナス、プレボテーラ、及びタネレラ属からなる群から選択される細菌、好ましくはポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテーラ・インターメディア及びタネレラ・フォーサイシア種からなる群から選択される細菌を、好ましくは選択的に死滅させるか、又は選択的にそれらの増殖を阻害し、その一方でバイオフィルム中の残りの細菌を、好ましくは本質的に影響を受けないままにする(すなわち、相当に少ない程度に死滅させる又はそれらの増殖を阻害する)。前記バイオフィルムは、好ましくはコンプレックスバイオフィルム、より好ましくは天然に存在するバイオフィルム、更により好ましくは天然に存在する口腔バイオフィルムである。

本発明は更に、急性、慢性、又は再発性の歯周疾患又は状態の治療法又は予防法に使用するための、bacQC阻害剤化合物又は医薬組成物を提供する。歯周疾患及び状態の主なカテゴリーは、デンタルプラーク（歯垢）起因性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身疾患の徴候としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周組織の膿瘍、歯内病変関連歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染症のグループに分類される。本発明において、急性、慢性、又は再発性歯周疾患は、好ましくは、デンタルプラーク起因性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身疾患の徴候としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周組織の膿瘍、歯内病変関連歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染症からなる群から選択される。本開示はまた、好ましくは、デンタルプラーク起因性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身疾患の徴候としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周組織の膿瘍、歯内病変関連歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染症からなる群から選択される急性、慢性、又は再発性歯周疾患の治療法又は予防法であって、それを必要とする被験体に治療的有効量の本発明によるbacQC阻害剤化合物又は医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。更なる急性、慢性、又は再発性歯周疾患は、例えば、Armitage, A. Ann Periodontol 1999、4、1～6に記載されている。

本発明の一実施形態では、本発明による阻害剤化合物又は医薬組成物は、好ましくは、上に記載する方法のいずれかに使用され、ここで、投与経路は局所投与であり、及び/又は、該方法は非外科的方法である。別の実施形態では、本発明による阻害剤化合物又は医薬組成物は、好ましくは、上に記載する方法のいずれかに使用され、ここで、投与経路は全身投与であり、及び/又は、該方法は非外科的方法である。

「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、処置、治療、予防、観察、又は実験の対象である又は対象となっている、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。

「治療的有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、組織系、動物、又はヒトにおいて、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医によって求められる生物学的又は治療的応答を引き出す(治療している疾患又は障害の症状の緩和を含む)、活性化合物又は薬剤の量を意味する。

(実施例1)
推定上の細菌グルタミニルシクラーゼ(bacQC)の特定及び調製
a)特定
口腔病原体、P.ジンジバリス、T.フォーサイシア、及びP.インターメディアのセクレトームのバイオインフォマティクス分析(http://www.oralgen.lanl.gov/)から、シグナルペプチドを有する分泌タンパク質の約80%が、シグナルペプチダーゼによってXaa-Glnペプチド結合で切断されることが示された。放出されたタンパク質のN末端は、pGlu残基を含有する。これは、外膜を横切る成長タンパク質移行及び歯周病原体の増殖に不可欠であると思われるグルタミニルシクラーゼが存在することを暗に示している。

図1は、ヒトQC(hQC、配列番号4)及びP.ジンジバリス(PgQC、配列番号1)由来の推定上の細菌QCのアミノ酸配列アライメント(A)、並びに更なる推定上のQC、P.インターメディア(PiQC、配列番号2)及びT.フォーサイシア(TfQC、配列番号3)及びP.ジンジバリス(PgQC、配列番号1)のアミノ酸配列アライメント(B)を示す。推定上のPgQCは、ヒトQCに対して25%の同一性を有する。更に、推定上のTfQCは、PgQCに対して49%の同一性を呈し、P.インターメディア由来のQCは、PgQCに対して42%の同一性を有する。灰色の下線を引いたシステイン残基は、PgQCには欠けているhQC中のジスルフィド架橋を反映する。ヒトQC中の太字の配列は、高度に保存されたII型QCの残基を反映する。灰色の配列は、PgQC及びhQCの推定上のシグナル配列を表示する。更に、典型的な金属結合モチーフであるAsp-Glu-Hisは、下線を引いた太字で表す。推定上の金属結合モチーフは、TfQC及びPiQC(B、太字)にも特定された。このアライメントは、EMBL-EBInetのClustal Omegaプログラムを使用して作成した;(*)は、完全に保存された単一の残基を有する位置を示し、(:)は、グループ間での強く類似した性質の保存を示し、(.)は、グループ間での弱く類似した性質の保存を示す(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)。

BLAST分析から、P.ジンジバリスにおいて推定上のQCタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)が明らかになった(WP_005874301)。この推定上のQCタンパク質の一次構造は、ヒトQCに対して25%の同一性を示す。更に、推定上のQCタンパク質は、口腔病原体、P.インターメディア(WP_014709208)及びT.フォーサイシア(WP_014225037)のゲノムにおいても特定され、これらはP.ジンジバリス由来の推定上のQCに対して42%又は49%の同一性を共有する(図1)。アミノ酸アライメントによって示されるように、ヒト及び他のII型QCにおいてジスルフィド結合を形成する保存システイン残基が3つ全ての推定上の細菌QCにおそらく存在しないことから、ヒトQCの保存残基は、細菌QCでは異なるように思われる。しかし、高度に保存されたII型QCの金属結合モチーフ、Asp144、Glu184(Asp)、及びHis322(Wintjens等、2006)は細菌の推定上のQCに存在すると思われ、これらが触媒中心に相当し得ると思われる。これらのタンパク質の一次構造は、これらのタンパク質が実際のQCであることの指標となり得る。

b)調製
図2は、大腸菌Rosetta(DE3)pLysS中で発現させ、後で詳細に記載するように精製した、精製組換え推定細菌QCのSDS-PAGEを示す。そのために、30μgの精製タンパク質を12% SDS-PAGEにかけ、クーマシー染色によって可視化させた。レーン1は未染色PageRuler Broad Range(Thermofisher Scientific社)、レーン2はHisPgQC、レーン3はHisPiQC、及びレーン5はHisTfQCである。3つ全ての推定上の細菌QCは、理論的分子量≒37KDaを有する。

宿主株及び培地
クローニング手順には、大腸菌株DH5α又はXL-1 blue(Stratagene社)を使用した。タンパク質発現には、大腸菌Rosetta(DE3)pLysS(Novagen社)を使用した。アルカリホスファターゼ活性アッセイは、CC118 pGP1-2株で行った(Tabor, S.及びRichardson, C. C. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985、82、1074～1078; Manoil, C., J. J. Mekalanos及びBeckwith, J. J. Bacteriol. 1990、172(2)、515～518)。全ての大腸菌株は、Luria-Bertani培地中で、示す通りに20℃、30℃、又は37℃で増殖させた。抗生物質(アンピシリン[50～125mg/リットル]、クロラムフェニコール[15～30mg/リットル]、及びカナマイシン[25mg/リットル])を適宜添加した。固体培地を調製するために、1.5%のアガー(Roth社)を対応するブロスに添加した。

細菌QCをコードするプラスミドベクターの分子クローニング
全てのクローニング手順は、標準的な分子生物学技法を適用して行った。タンパク質発現のために、PgQC(配列番号1、P.ジンジバリス由来の推定上のQC)、PiQC(配列番号2、P.インターメディア由来の推定上のQC)及びTfQC(配列番号3、T.フォーサイシア由来の推定上のQC)のオープンリーディングフレーム(ORF)を、ベクターpET28a(+)(Novagen社)中への直接クローニングに不可欠なNheI/NdeI制限部位を導入するためにEurofins Genomics社から購入した合成DNA配列をPCRにおけるテンプレートとして使用して、増幅した。PgQC-'PhoA融合タンパク質を構築するために、予測されるシグナル配列を有する推定上のpgQCを、_seqpgQC NdeI(フォワード)及び_seqpgQC XhoIリバースのプライマー対を使用して、NheI/XhoI制限部位を介してpET26b(+)中にサブクローニングした。更に、_seqpgQC RBS NotI(フォワード)及び_seqpgQC XbaI(リバース)のプライマー対を使用して、pET26b(+)ベクターのリボソーム結合部位を含む本来のシグナル配列を有するpgQCを増幅して、phoA発現ベクターpECD637中にクローニングした。クローニング用の全てのプライマーは、Metabion社から購入し、Table 1(表1)に記載した。

His Tag融合タンパク質又は'PhoA融合タンパク質としての細菌QCの発現
発現ベクターpET28a(+)::pgQCで大腸菌Rosetta(DE3)pLysSを形質転換した。細菌を、カナマイシン(25μg/ml)及びクロラムフェニコール(15μg/ml)を含有するLuria-Bertani培地中37℃で、OD600約0.6の細胞密度に達するまで増殖させた。培養物を0.4mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドで誘導し、2%(v/v)の容量のエタノールを添加し、続いて20℃で16時間インキュベートした。培養物を、4℃及び3900gで30分間遠心分離することによって収集し、細胞ペレットを-20℃で保管した。

_seqPgQC-'PhoA融合タンパク質を発現させるために、ヘルパープラスミドpGP1-2と共に組換えベクターpECD637::_seqpgQCでCC118(例えばphoA遺伝子が欠損している)を形質転換した。培養物を30℃で一晩接種した。更に、一晩培養物を新たなLuria-Bertani培地中で希釈して最終光学濃度(OD600)を約0.4とし、続いて42℃で20分間インキュベートして、_seqPgQC-'PhoA融合タンパク質の発現を誘導した。次いで、培養物を30℃で更に2時間接種した。最後に、分光光度計(BioRad社)を使用して光学濃度OD600を決定し、PhoA活性を決定するために、200μlの培養物を4℃及び16000gで15分間遠心分離することによって収集した。

細菌QCの精製
500mlの培養物の細胞ペレットを、50mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH 8.0)、10μg/ml DNase、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルミックス(complete mini錠、EDTA非含有、Roche社)からなる20mlの緩衝液に再懸濁させた。細胞をFrench Press(Thermo Scientific社、Waltman、MA、USA)に3～4回通すことによって破砕した。細胞破片を、4℃及び30000gで30分間遠心分離することによって除去した。上清を平衡化緩衝液で1:2に希釈し、5mlのHisTrapカラム(GE Healthcare社)にかけた。カラムを150mMのNaClを含有する50mM Tris-HCl(pH 8.0)で平衡化した。数カラム容量の平衡化緩衝液及び少なくとも20mMイミダゾールで洗浄した後、イミダゾールが250mMの最終濃度に達するまで多段階の勾配を使用してタンパク質を溶出したが、純粋なタンパク質の大部分は既におよそ100mMイミダゾールで溶出していた。全てのbacQC含有画分をプールし、Vivaspin 20(Sartorius AG社)で濃縮し、50mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH 8.0)で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラム(GE Healthcare社)に加えた。精製物をSDS-PAGEによって分析し、タンパク質含有量を、NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientifc社)を使用する280nmでの吸収、又はBradfordの方法若しくはGill及びvon Hippelの方法(Bradford, M. M. 1976 Anal Biochem 72、248～254; Gill, S. C.及びvon Hippel, P. H. 1989 Anal Biochem 182、319～326)に従って決定した。最後に、精製した組換え融合bacQCタンパク質を、液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保管するか、又はグリセロールを50%の最終濃度まで添加し、-20℃で保管した。20mM Tris-HCl、150mM NaCl、2.5mM CaCl₂(pH 8.0)の存在下で、1mgの融合タンパク質当たり1ユニットのトロンビン(Thrombin cleavage Capture Kit、Novagen社)を使用し、続いて4℃で16時間インキュベートして、N末端融合タンパク質のHis Tagを除去した。トロンビンをStreptavidin Agarose(Thrombin cleavage Capture Kit、Novagen社)との結合を通して除去し、HisTagのないbacQCタンパク質をスピンろ過によって回収した。HiPrep(26/10)を使用する更なる脱塩段階の後、bacQC画分をプールし、Vivaspin 20(Sartorius AG社)で濃縮した。最後に、50mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH 8.0)中の組換えbacQCを液体窒素中で急速冷凍し、-80℃で保管するか、又はグリセロールを50%の最終濃度まで添加し、-20℃で保管した。PiQCは、PgQCと同様に発現させ、精製した。TfQCは、PgQCと同様に発現させ、HiTrap Talonカラム(GE Healthcare社)を使用して精製した。

結論:全ての推定上の細菌QCを、大腸菌Rosetta(DE3)pLysS中でN末端His Tag融合タンパク質としてシグナル配列なしで発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製して均質にした。16～40mgの純粋な組換えHis-Tag融合タンパク質を、およそ500mlの誘導大腸菌培養物から単離した。その後、融合タンパク質のHis-tagをトロンビンによって切断し、続いてこれらの推定上の細菌QCの酵素的な特徴付けを行った。

(実施例2)
グルタミニルシクラーゼ活性の蛍光定量アッセイ
QC活性は、H-Gln-AMCを基質として使用して評価した(以前にSchilling等(2002)に記載された通り)。

アッセイは、変動する濃度の蛍光発生基質及び0.5Uピログルタミニルアミノペプチダーゼを含む、50mM Tris-HCl、50mM NaCl(pH 8.0)からなる。30℃で10分間インキュベートした後、bacQCを添加して反応混合物の最終容量を125μlにすることによって反応を開始した。励起/発光波長は380/460nmであった。bacQC活性は、アッセイ条件下での蛍光体AMCの検量線から決定した。全ての決定は、96ウェルマイクロタイタープレート(Fisher Scientific社)中、30℃で、FluoStar Optima(BMG Labtech社)を使用して行った。速度論的データは、GraFitソフトウェア(バージョン7、Erithacus software社、Horley、UK)を使用して評価した。

図3は、PgQC(A)、PiQC(B)、及びTfQC(C)が触媒するH-Gln-AMCの環化についてのラインウィーバー・バークプロットを示す。挿入図は、得られたラインウィーバー・バーク評価の傾きの二次プロットを示す。bacQC活性の測定は、50mM Tris-HCl(pH 8.0)及び50mM Tris-HCl中30℃で行った。速度論的データは、GraFitソフトウェア(バージョン7、Erithacus software社、Horley、UK)を使用して評価した。細菌QCの酵素パラメータを決定したが(Table 2(表2))、これらはhQCのものとは異なっている(Schilling, S.、Manhart, S.、Hoffmann, T.、Ludwig, H.-H.、Wasternack, C.、及びDemuth, H.-U. Biol. Chem. 2003、384、1583～1592)。

結論:H-Gln-AMCを基質として用いる蛍光定量アッセイを使用して、精製した組換えタンパク質を酵素活性について試験した。基質としてのH-Gln-AMCはこれらの細菌タンパク質によって回転(turned)されたことからRFUが増加し、したがって反応速度が増加した(図3)。基質としてのH-Gln AMCに対する親和性は、PgQC及びPiQCの場合、この基質に対するhQCの親和性より10倍ほど低い。TfQCのK_m値は、実際に、hQCのK_m値より20倍高い。更に、細菌タンパク質の効率はhQCの効率と同様であると思われ、ここでPiQCは、PgQC又はTfQCと比較して2倍高いターンオーバー数を有する。

(実施例3)
グルタミニルシクラーゼ活性の阻害剤アッセイ
阻害剤試験に関して、試料組成物は、推定上の阻害化合物を添加した以外、上に記載したものと同じであった。これにより、1%又は2%(v/v)DMSOが反応混合物中に存在していた。阻害定数は、1/4K_mから2K_mまで変動する様々な濃度のH-Gln-AMCを使用して決定した。細菌QCの最終濃度は、25nM～50nMの範囲であった。阻害定数は、GraFitソフトウェア(バージョン7、Erithacus software社、Horley、UK)を使用して、一連のプログレス曲線を競合阻害の一般方程式に当てはめることによって評価した。

図4は、(黒丸)1μM、(白四角)0.5μM、(黒四角)0.25μM、(白三角)0.125μM、及び(黒三角)0.063μMのMWT-S-00431の存在下でのPgQCが触媒するH-Gln-AMCの環化(A)についての代表的なv/S特性、ラインウィーバー・バーク及びイーディー・ホフステープロットを示す。(白丸)は、阻害剤を含まない反応を表す。決定は、50mM Tris-HCl、50mM NaCl(pH 8.0)、及び1%(v/v)DMSO中30℃で行った。Table 3(表3)に示す速度論的パラメータが得られた。

結論:PgQCは、化合物MWT-S-00431によって阻害される。この物質は、103.7±3.31nMのK_iを呈する。

更に、以下の化合物を実施例10に後述する通りに合成した。上記の阻害剤アッセイを使用して、PgQC(実施例1に記載する通りに単離し、精製したもの)の阻害についての平均残存活性(RA)及び平均K_i値を測定した。これらをTable 4(表4)に示す。RAは、濃度cのそれぞれの化合物の存在下で測定したPgQCの平均残存QC活性を指す。K_iは、上に記載する通りに測定した平均K_i値を指し、標準(K_i)は、K_iの標準偏差を指す。

(実施例4)
細菌QC活性のpH及びイオン強度依存性
様々なpH範囲、及び更に様々な濃度の塩化ナトリウムでのQC活性を、上に記載する通りに蛍光定量的にアッセイした。pH依存性を調査するために、0.05M 酢酸、0.05M MES、0.1M Tris及び0.05M NaClからなる、6.0～8.5のpH範囲の3成分緩衝液を使用した。この緩衝液は、幅広いpH範囲にわたる一定のイオン強度をもたらす。全てのbacQC活性の決定は、一次速度則条件下、すなわち、1/10K_mでの基質濃度で行った。よって、この結果は、特異性定数k_cat/K_mのpH依存性を表す。酸又は塩基条件下では補助酵素ピログルタミルアミノペプチダーゼの安定性が低減するために、bacQCのpH依存性は、pH 6を下回る又はpH 9を上回ると決定できない。得られた速度論的データは、GraFitソフトウェア(バージョン7、Erithacus software社、Horley、UK)を使用して、3つの変曲点の数学的モデル(ベル形曲線)に適用することによって評価した。bacQC活性のイオン強度依存性を調査するために、0～500mMの範囲の様々な塩化ナトリウム濃度を活性アッセイに適用し、アッセイ条件下で残存bacQC活性を決定した。

図5は、PgQC活性(A)、PiQC活性(B)、及びTfQC活性(C)のpH依存性を示す。H-Gln-AMCの変換についてのPgQC(A)、PiQC(B)、及びTfQC(C)の特異性定数(specific constant)k_cat/K_mは、一次速度則条件下で決定し、ここで基質濃度は1/10K_mであり、したがって[S]≪K_mであった。全ての決定は、0.1M Tris-HCl、0.05 MES、0.05mM 酢酸、及び0.05mM NaClからなる緩衝液中30℃で行った。

結論:細菌QCの酵素活性を様々なpH範囲で決定した。得られた速度プロファイルは、各場合において古典的なベル形曲線に適合した(図5)。PgQC(A)は、弱アルカリ性の範囲で最大活性を呈し、pKa1=6.5±0.035及びpKa2=8.93±0.014である(Table 5(表5))。P.インターメディア(B)及びT.フォーサイシア(T)のbacQCは、中性pH周辺で最大活性を示し、PiQCの場合はpKa1=6.97±0.99及びpKa2=7.92±0.057であり、TfQCの場合はpKa1=7.05±0.016及びpKa2=7.81±0.037である(Table 5(表5))。PgQCは、PiQC及びTfQCより広いpH範囲にわたって高い酵素活性を有し、それはpKa1値とpKa2値の間の距離が広くなっていることによって示される。

図6は、イオン強度が細菌QC活性に及ぼす影響を示す。bacQC活性を、様々な濃度の塩化ナトリウムの存在下で決定した。測定は、50mM Tris-HCl及び500μMまでの塩化カリウム中で行った。全ての反応は、30℃で、上で記載した通りに行った。(黒四角)は残存PgQC活性を示し、(黒三角)は残存PiQC活性を示し、(菱形)は残存TfQC活性を示す。

結論:PgQCとは対照的に、PiQC及びTfQCの酵素活性は塩化カリウム濃度を増加させることによって減少し、500μMの塩化ナトリウムによって残存活性はおよそ50%となった(図6)。これは、唾液中の生理的環境に従う活性アッセイを行うために重要な点である。生理的条件下では唾液中に塩化ナトリウムが存在する。したがって、細菌QCの活性アッセイは、常に50μM 塩化ナトリウムの存在下で行った。

(実施例5)
金属キレート剤による細菌QCの阻害
様々な濃度の1,10-フェナントロリン、ジピコリン酸、又はEDTAの存在下での、低bacQC濃度(4nM)での1/2K_m H-Gln-AMCの時間依存性ターンオーバーは、細菌QCの金属依存性触媒作用の指標を提供するはずである。蛍光定量的活性アッセイは、1,10-フェナントロリン又はジピコリン酸の場合に1%(v/v)DMSOが存在したこと以外、上に記載する通りに行った。最後に、残存bacQC活性を定常状態で決定したが、キレート剤+/-1% DMSOを含まないbacQCは陽性対照とした。

図7は、様々な金属キレート剤:(A)EDTA、(B)ジピコリン酸、及び(C)1,10-フェナントロリン(phenantroline)による細菌QC活性の阻害を示す。250μM H-Gln-AMC及び濃度を増加させたキレート剤を使用して、bacQC活性に及ぼす阻害効果を調査した。およそ5nMのbacQCを添加することによって、反応を開始した。黒いバーは残存PgQC活性を示し、縞模様のバーは残存PiQC活性を表し、白いバーは残存TfQC活性を表示する。全ての決定は、30℃で上に記載する通りに行った。

結論:ヒトQCとのアミノ酸アライメントから、細菌QCの活性中心における推定上の金属結合部位が明らかになった。これによって、細菌QCは、ヒトQCについて以前に記載された通りに(Schilling等、2002)金属依存性酵素として作用することが示唆された。したがって、細菌QC活性は、金属依存性触媒作用を調査するために様々な金属キレート剤の存在下で決定するべきである。図7Aに示されるように、3つ全ての細菌QCに対して強い阻害活性を示すジピコリン酸(B)又はフェナントロリン(C)とは対照的に、EDTAは高濃度であってもbacQC活性に影響しない。フェナントロリンは既に低いmM範囲でQC活性を阻害した。とりわけPiQCはフェナントロリンに対して感受性が高いと思われる。要約すると、QC活性は、金属キレート剤によって引き起こされる金属欠乏によって阻害され、これによって細菌QCが金属酵素であることが示唆される。

(実施例6)
細菌QCのCD分光分析
図8は、組換え細菌QCのUVスペクトルを示す。組換え細菌QCを、10mM NaH₂PO₄、50mM NaCl(pH 8.0)に対して透析した。240nm～340nmの間のUVスペクトルをUV分光計、Specord 210 plus(Analytik Jena社)で測定した。試料の厚さは1cmであった。黒い線は0.525mg/ml PgQCのUVスペクトルを表し、点線は0.209mg/ml PiQCのUVスペクトルを表示し、破線は0.142mg/ml TfQCのUVスペクトルを表示する。

図9は、組換え細菌QCのCD分光分析を示す。His Tagのない精製したbacQCを、10mM NaH₂PO₄、50mM NaCl(pH 8.0)に対して透析し、およそ0.05mg/mlの最終濃度まで希釈した。組換えbacQCのスペクトル分析を、20℃で、0.1cmの光路長の石英キュベットを使用するJasco J-710分光偏光計(Jasco GmbH社、Groβ-Umstadt)を用いて、190～260nmの間で、20回の積算及び1秒間の積分で測定した。スペクトルは、緩衝液のスペクトルを差し引くことによって補正した。二次構造要素の百分率は、Yang等の方法(Yang, J.T.、Wu, C.S.、及びMartinez, H.M. Methods Enzymol. 1986、130、208～269)に基づくJasco社二次構造概算プログラムを使用して算出した。

結論:組換え細菌QCの更なる特徴付けを、CD分光法を適用することによって行った(図9)。CDスペクトルは全ての細菌QCで実質的に同一であり、これによって、PgQC、PiQC及びTfQCの球状ドメイン間の強い類似性が裏付けられる。高いαらせん含量を有するタンパク質のスペクトルは、208nm及び222nmに2つの典型的な極小をそれらの二次構造に呈するが、それらがPgQC、PiQC、及びTfQCにも観察された。加えて、Yang等の方法に従ってαヘリックス、βシート、ターン、及び不規則構造の分量を算出すると、3つ全てのタンパク質の類似した折り畳みパターンが示され、α/βトポロジーが示唆される。

(実施例7)
細菌QCの熱安定性
図10は、組換え細菌QC:PgQC(A)、PiQC(B)、及びTfQC(C)の熱安定性を示す。His Tagのない精製したbacQCを、10mM NaH₂PO₄、50mM NaCl(pH 8.0)に対して透析し、およそ0.05mg/mlの最終濃度まで希釈した。CDスペクトルを、20℃から最大80℃までの温度で、Jasco J-710分光偏光計を用いて200～260nmの間で測定した。測定は、5℃の間隔、30K/時の加熱速度での10回の積算、1秒間の積分、及び試料の厚さ1mmで行った。各測定前に温度を180秒平衡化させた。破線及び点線は、PgQC(A)及びTfQC(C)の場合は40℃及び45℃での温度遷移、PiQC(B)の場合は45℃及び50℃での温度遷移を示す。黒い線は、PgQC(A)及びTfQC(C)の場合は20℃～35℃の温度、PiQC(B)の場合は20℃～40℃の温度を示す。灰色の線は、PgQC(A)及びTfQC(C)の場合は50℃～80℃の温度、PiQC(B)の場合は55℃～80℃の温度を表す。

結論:CDスペクトルを使用して、様々な環境条件に応じて変化した二次構造の分析をすることができる。したがって、温度を20℃から80℃に増加させながら、CDを使用して組換えタンパク質の二次構造の変化を観察した。図10A及び図10Cに示すように、PgQC及びTfQCのスペクトルは40℃の温度から変化し始め、これによって変性の開始点であることが示される。PiQC(図10B)のスペクトルは45℃の温度から変化し始めた。3つ全てのタンパク質は、50℃で完全に変性した。これによって、PgQC及びTfQCについては40℃まで、PiQCについては45℃までの熱安定性が示される。

(実施例8)
_seqQC-'PhoA活性の決定
図11は、_seqPgQC-'PhoA融合タンパク質を発現する透過処理した大腸菌CC118 pGP1-2細胞におけるPhoA活性を示す。_seqPgQC-'PhoA融合タンパク質を作製するために、本来の推定上のシグナル配列を有するPgQCをpECD637中にクローニングした。得られたベクターで大腸菌株CC118 pGP1-2を形質転換した。培養物を42℃で20分間インキュベートすることによって、融合タンパク質の発現を開始した。誘導された培養物のPhoA活性を、以前に記載された通りに決定した(Pribyl, T.、Topologie des CzcCBA-Efflux-Komplexes aus Ralstonia metallidurans CH34. Dissertation、2001、Martin-Luther-University Halle-Wittenberg)。黒いバーは、_seqPgQC-'PhoAを発現する大腸菌細胞のPhoA活性を表し、縞模様のバーは'BlaM-'PhoAを発現する細胞のPhoA活性を表示し、これは陽性対照とし、インサートなしのベクターを発現する細胞は、陰性対照として使用した(空白のバー)。

上に記載するように増殖させた培養物から、発色基質p-ニトロフェニルリン酸(PNPP)を使用してPhoA活性を決定した(Pribyl, 2001)。そのために、既知のOD600を有する200μlの細胞懸濁液を4℃で10分間、13000rpmで収集した。細胞ペレットを0.5mlの10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgSO₄、及び1mM ヨードアセトアミド中で洗浄した。得られた細胞ペレットを1mlの1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM ZnCl₂、及び1mM ヨードアセトアミド中に再懸濁させた。次いで50μlの0.1%(w/v)SDS及び50μlのクロロホルムを混合物に添加し、続いて37℃で5分間インキュベートした。次いで、100μlの基質溶液(1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.4%(w/v)PNPP)を添加することによって反応を開始した。反応混合物を更に37℃でインキュベートし、溶液が黄色に変わるまで行った。次いで120μlの1M KH₂PO₄、0.5M EDTA(pH 8.0)を添加することによって反応を停止した。黄色の呈色を生じるのにかかった時間を特異的酵素PhoA活性と定めた。細胞破片を遠心分離(13000rpm、20分)によって除去し、上清の420nmでの光学濃度を決定した。PhoA活性は、ランベルト・ベールの法則に従って決定した。空のベクターpECD637を有する大腸菌CC118 pGP1-2培養物は陰性対照としたのに対し、pECD619を有する大腸菌CC118 pGP1-2(Pribyl、2001)は陽性対照とした。このプラスミドは、'phoAドメインの下流にショートフォームのβ-ラクタマーゼ('blaM)を含むシグナル配列をコードする。

結論:PgQCのオープンリーディングフレームのin silico分析から、推定上のシグナル配列が明らかになった。これによって、P.ジンジバリスにおけるPgQCの細胞質外の局在化が示される。「本来の」シグナル配列を含むPgQCとアルカリホスファターゼ(PhoA)とのC末端融合物を構築して、PgQCの「天然の」局在化を調査した。アルカリホスファターゼとの融合物は、ペリプラズムに局在するときに限って活性がある。_seqPgQC-'PhoAを発現させると、638.5U/l±50.9という高いホスファターゼ活性がもたらされた(図11)。これによって、PgQCはペリプラズムに局在することが示される。

(実施例9)
PgQC、TfQC、及びPiQCに対する抗体
PgQC、TfQC、及びPiQCそれぞれの、発現及び精製された完全なタンパク質(HisTagのない)を使用したウサギの5段階の免疫化手順、その後の抗血清の精製によって、ポリクローナル抗体を生成した。

図12は、(A)PgQC、及び(B)TfQC及びPiQCに対するポリクローナル抗血清の特異性を示す。(A):PgQCのポリクローナル抗血清を1:10000希釈でウエスタンブロットに使用して、レーン(1)PgQCを発現する大腸菌細胞の粗抽出物;レーン2、5μgの精製HisPgQC、レーン3、0.5μgのHisPgQC、及びレーン4、0.05μgの精製PgQCを検出した。(B):更に、ポリクローナルPgQC抗体を試験して、5μgのPiQC(レーン2)、及び5μgのHisTfQC(レーン3)を検出した。5μgのHisPgQC(レーン1)は、陽性対照とした。PageRuler Plus Prestained(Fermentas社)は分子標準とした。

結論:PgQCに高親和性及び特異性を呈する、PgQCに対するポリクローナル抗体が生成された。このポリクローナル抗体によって、比較的低い親和性でPiQC及びTfQCも検出された。

(実施例10)
合成方法の詳細な説明

方法A:
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン
ヒスタミン二塩酸塩(3.68g;20mmol;1当量)及びパラホルムアルデヒド(1.20g;40mmol;2当量)を水(30ml)に溶解させた。混合物を4時間加熱還流した。揮発性物質を蒸発させ、残留物を減圧乾燥した。この化合物を更に精製することなく使用した。収率: 定量的; ESI-MS m/z: 124,1 [M+H] ⁺; HPLC (勾配C): rt 1,25分 (100 %),¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.95-2.98, 3.42 (t, 2H, ³J=5.9 Hz), 4.28 (s, 2H), 9.02 (s, 1H), 10.13 (br s, 2H), 14.83 (br s, 1H);

方法B:
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g;1mmol;1当量)のアセトニトリル(10ml)中懸濁液をトリエチルアミン(416μl;3mmol;3当量)で処理し、混合物を室温で30分間置いた。それぞれのハロゲン化物、好ましくはアルキルブロミド(1mmol;1当量)を添加し、混合物を室温で更に12時間撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、残留物を水に溶解させた。水層をEtOAcで抽出した(3×20ml)。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、蒸発させた。CHCl₃-MeOH勾配を使用するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製した。

例
メチル(E)-4-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)ブタ-2-エノエート(MWT-S-00138)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び4-ブロモクロトン酸メチル(0.179g)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Bによって合成した。収率: 62 mg (28%); ESI-MS: m/z 222.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配1): 3.49分 (99.4%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.56 (t, 2H, ³J=5.5 Hz), 2.70 (t, 2H, ³J=5.5 Hz), 3.34 (dd, 2H, ³J=5.8 Hz, ⁴J=1.8 Hz), 3.41 (s, 2H), 3.677 (s, 3H), 6.07 (td, 1H, ³J=15.8 Hz, ⁴J=1.8 Hz), 6.90 (td, 1H, ³J=15.7 Hz, ³J= 5.9 Hz), 7.43 (s, 1H), 11.70 (s, 1H)

5-ベンジル-3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00139)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び臭化フェネチル(137μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Bによって合成した。収率: 82 mg (38%); ESI-MS: m/z 214.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配1): 8.56分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.56 (t, 2H, ³J=5.5 Hz), 2.71 (t, 2H, ³J=5.7 Hz), 3.34 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 7.24-7.30 (m, 1H), 7.33-7.36 (m, 4H), 7.40 (s, 1H), 11.65 (br s, 1H)

5-(2-フェニルエチル)-3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00145)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び臭化ベンジル(119μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Bによって合成した。収率: 10 mg (4%); ESI-MS: m/z 228.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 5.41分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.58 (t, 2H, ³J=5.7 Hz), 2.77-2.86 (m, 6H), 3.53 (s, 2H), 7.16-7.21 (m, 1H), 7.24-7.31 (m, 4H), 7.46 (s, 1H)

方法C:
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g;1mmol;1当量)のジメトキシエタン(10ml)中懸濁液をトリエチルアミン(485μl;3.5mmol;3.5当量)で処理し、混合物を室温で30分間撹拌した。この溶液を0℃に冷却し、それぞれのハロゲン化アシル、好ましくは塩化アシル(1mmol;1当量)を滴加した。添加完了後、混合物を室温で12時間撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、残留物を水に溶解させた。水層をEtOAcで抽出した(3×20ml)。有機層をブラインで洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、蒸発させた。生成物を、CHCl₃-MeOH勾配を使用するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

例
(E)-3-フェニル-1-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)プロパ-2-エン-1-オン(MWT-S-00146)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び塩化シンナモイル(167mg)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成した。収率: 17 mg (6.7%); ESI-MS: m/z 254.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 8.56分 (97.3%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.68-2.72 (m, 2H), 3.92 (t, 2H, ³J=5.5 Hz), 4.62 (s, 2H), 7.22-7.30 (m, 1H), 7.37-7,44 (m, 3H), 7.47-7.54 (m, 2H), 7.67-7.75 (m, 2H), 11.67 (br s, 1H)

3-フェニル-1-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)プロパン-1-オン(MWT-S-00147)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及びフェニルアセチルクロリド(132μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成した。収率: 68 mg (26.6%); ESI-MS: m/z 256.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.65分 (94.5%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.56-2.62 (m, 2H), 2.68-2.75 (m, 2H), 2.84-2.92 (m, 2H), 3.65-3.81 (m, 2H), 4.44 (s, 2H), 7.16-7.21 (m, 1H), 7.24-7.30 (m, 4H), 7.44 (s, 1H), 11.63 (br s, 1H)

2-フェニル-1-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)エタノン(MWT-S-00148)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及びヒドロシンナモイルクロリド(148μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成した。収率: 23 mg (9.5%); ESI-MS: m/z 242.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.04分 (95.9%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 3.71-3.86 (m, 4H), 4.48 (s, 2H), 7.18-7.35 (m, 5H), 7.44 (s, 1H), 11.64 (br s, 1H)

フェニル(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00149)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び塩化ベンゾイル(116μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成した。収率: 34 mg (15%); ESI-MS: m/z 228.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.11分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.62-2.71 (m, 2H), 3.60-3.85 (m, 2H), 4.49 (s, 2H), 7.41-7.50 (m, 6H), 11.72 (br s, 1H)

(4-フルオロフェニル)-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00156)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び4-フルオロベンゾイルクロリド(4-Fluorbenzoylchloride)(118μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成した。収率: 43 mg (17.5%); ESI-MS: m/z 246.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.72分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.57-2.72 (m, 2H), 3.43-3.70 (m, 1.4H), 3.76-3.99 (m, 0.6H), 4.25-4.66 (m, 2H), 7.25-7.32 (m, 2H), 7.45-7.57 (m, 3H), 11.91 (br s, 1H)

(4-メトキシフェニル)-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00157)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び4-メトキシベンゾイルクロリド(135μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成し、セミ分取HPLCによって更に精製した。収率: 14 mg (3.8%); ESI-MS: m/z 258.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.88分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.79 (t, 2H, ³J=5.5Hz), 3.69-3.81 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 4.59-4.76 (m, 2H), 6.98-7.05 (m, 2H), 7.44-7.49 (m, 2H), 8.90 (s, 1H), 14.27 (br s, 1H)

(3-メトキシフェニル)-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00158)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び3-メトキシベンゾイルクロリド(141μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成し、セミ分取HPLCによって更に精製した。収率: 19 mg (5%); ESI-MS: m/z 258.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.91分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.69-2.83 (m, 2H), 3.61-3.68 (m, 1.4H), 3.79 (s, 3H), 3.85-4.01 (m, 0.6H), 4.42-4.81 (m, 2H), 6.99-7.04 (m, 2H), 7.07 (ddd, 1H, ³J=8.3, ⁴J=2.6, ⁴J=0.9), 7.4 (t, 1H, ³J=7.9), 8.75-8.96 (m, 1H), 14.22 (br s, 1H)

(3,4-ジクロロフェニル)-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00159)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び3,4-ジクロロベンゾイルクロリド(209mg)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成し、セミ分取HPLCによって更に精製した。収率: 57 mg (18.9%); ESI-MS: m/z 296.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 9.52分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.71-2.84 (m, 2H), 3.56-3.70 (m, 1.4H), 3.84-3.99 (m, 0.6H), 4.44-4.79 (m, 2H), 7.44-7.50 (m, 1H), 7.71-7.80 (m, 2H), 8.74-8.94 (m, 1H), 14.12 (br s, 1H)

(4-クロロフェニル)-(3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00160)
4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(0.196g)及び4-クロロベンゾイルクロリド(128μl)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法Cによって合成した。収率: 89 mg (34%); ESI-MS: m/z 262.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 8.03分 (96.4%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.56-2.71 (m, 2H), 3.45-3.58 (m, 1H), 3.85-3.99 (m, 1H), 4.22-4.61 (m, 2H), 7.46-7.58 (m, 5H), 11.96 (br s, 1H)

(3-クロロフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00425)
ESI-MS: m/z 262.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 8.00分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.59-2.73 (m, 2H), 3.49-3.59 (m, 1H), 3.87-3.97 (m, 1H), 4.29-4.39 (m, 1H), 4.58 (br s, 1H); 7.39-7.41 (m, 1H), 7.49-7.58 (m, 4H); 11.90 (br s, 1H)

(3,4-ジメトキシフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00426)
ESI-MS: m/z 288.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 5.89/6.37分 (100%; 二重ピーク); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.65-2.68 (m, 2H), 3.79-3.83 (m, 8H), 4.49 (br s, 2H); 7.01-7.03 (m, 3H), 7.53 (br s, 1H); 11.88 (br s, 1H)

ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00427)
ESI-MS: m/z 272.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.53分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.65 (br s, 2H); 3.52-3.90 (m, 2H); 4.47 (br s, 2H); 6.09 (s, 2H); 6.94-7.01 (m, 3H); 7.51 (s, 1H); 11.88 (br s, 1H)

[1,1'-ビフェニル]-4-イル(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00428)
ESI-MS: m/z 304.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 10.61分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.68 (s, 2H); 3.63 (br s, 1H); 3.94 (br s; 1H); 4.42-4.60 (m, 2H); 7.40-7.43 (m, 1H); 7.49-7.55 (m, 5H); 7.72-7.78 (m, 4H); 11.91 (br s, 1H)

(3,5-ジメトキシフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00429)
ESI-MS: m/z 288.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.71分 (92.9%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.58-2.68 (m, 2H); 3.54 (br s, 1H); 3.78 (s, 6H); 3.90 (br s, 1H); 4.34 (br s, 1H); 4.56 (br s, 1H); 6.54 (s, 2H); 6.58-6.59 (m, 1H); 7.48-7.53 (m, 1H); 11.88 (br s; 1H)

(3-フルオロフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00430)
ESI-MS: m/z 245.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.64分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.59-2.73 (m, 2H); 3.53 (br s, 1H); 3.92 (br s, 1H); 4.33 (br s, 1H); 4.58 (s, 1H); 7.27-7.36 (m, 3H); 7.48-7.55 (m, 2H); 11.89 (br s, 1H)

(3,5-ジクロロフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00431)
APCI-MS: m/z 295.9 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 9.23分 (98.3%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.61-2.68 (m, 2H); 3.53 (br s, 1H); 3.91 (br s, 1H); 4.33 (s, 1H); 4.58 (s, 1H); 7.52-7.56 (m, 3H); 7.74-7.75 (m, 1H); 11.95 (br s, 1H)

(3-プロポキシフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00432)
APCI-MS: m/z 286.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 9.23分 (86.6%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 0.98 (t, 3H, ³J=7.3 Hz); 1.74 (六重線, 2H, ³J=6.8 Hz); 2.60-2.71 (m, 2H); 3.54 (br s, 1H); 3.86-3.98 (m, 3H); 4.34 (br s, 1H); 4.57 (br s, 1H); 6.94-7.08 (m, 3H); 7.35-7.39 (m, 1H); 7.50-7.56 (m, 1H); 11.94 (br s, 1H)

[1,1'-ビフェニル]-3-イル(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00433)
APCI-MS: m/z 304.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 10.22分 (99.5%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.60-2.76 (m, 2H); 3.61 (br s, 1H); 3.95 (br s, 1H); 4.41 (br s, 1H); 4.62 (s, 1H); 7.39-7.59 (m, 6H); 7.70-7.73 (m, 3H); 7.78-7.80 (m, 1H); 11.91 (br s, 1H)

(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-6-イル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ-[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00434)
APCI-MS: m/z 286.0 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.52分 (99.6%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.63-2.66 (m, 2H); 3.58-3.91 (m, 2H); 4.28-4.30 (m, 4H); 4.47 (br s; 2H); 6.92-6.94 (m, 3H); 7.51 (s, 1H); 11.87 (br s, 1H)

(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)(3,4,5-トリフルオロ-フェニル)メタノン(MWT-S-00435)
APCI-MS: m/z 282.0 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.65分 (96.9%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.66 (br s, 2H); 3.49-3.59 (m, 1H); 3.89 (br s, 1H); 4.36 (s, 1H); 4.57 (s, 1H); 7.45-7.57 (m, 3H); 11.96 (br s, 1H)

(4-フルオロ-3-メトキシフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00436)
APCI-MS: m/z 276.0 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.10分 (99.7%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.63-2.72 (m, 2H); 3.57 (br s, 1H); 3.88-3.95 (m, 4H); 4.38 (br s, 1H); 4.56 (br s, 1H); 7.00-7.04 (m, 1H); 7.23 (dd, 2H, ⁴J=1.5 Hz, ³J=8.3 Hz); 7.27-7.32 (m, 1H); 7.50-7.58 (m, 1H); 11.89 (br s; 1H)

ナフタレン-2-イル(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00440)
ESI-MS: m/z 278.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 9.20分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.70 (br s, 2H); 3.61 (br s, 1H); 3.98 (br s, 1H); 4.43 (br s, 1H); 4.63 (br s, 1H); 7.44-7.64 (m, 4H); 7.98-8.04 (m, 4H); 11.89 (br s, 1H)

(3-クロロ-5-メトキシフェニル)(1,4,6,7-テトラヒドロ-5H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イル)メタノン(MWT-S-00441)
APCI-MS: m/z 292.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 8.80分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.62-2.71 (m, 2H); 3.53 (br s, 1H); 3.82 (s, 3H); 3.90 (br s, 1H); 4.32 (br s, 1H); 4.57 (br s, 1H); 6.95 (br s, 1H); 7.05 (s, 1H); 7.14 (s, 1H); 7.49-7.54 (m, 1H); 11.87 (br s, 1H)

方法D:
ヒスタミン(1当量)をメタノール(30ml)に溶解させた。それぞれのアルデヒド(1当量)を添加し、混合物を室温で3時間撹拌した。水素化ホウ素ナトリウム(1.5当量)を分割して添加し、反応物を室温で更に3時間撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、残留物を水に溶解させた。水層をEtOAcで抽出した(3×50ml)。合わせた有機層をNa₂SO₄で脱水し、蒸発させた。生成物を更に精製せずに使用した。必要に応じて、CHCl₃-MeOH勾配を使用するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製した。

方法E:
方法Dによって得られたN-ベンジルヒスタミン誘導体(1mmol;1当量)を、メタノール又はエタノール(0.3～0.5M)に溶解させた。それぞれのアルデヒド(1.2mmol;1.2当量)及びトリメチルアミン(1mmol;1当量)を添加し、混合物を一晩加熱還流した。揮発性物質を蒸発させ、残留物を水及び少量の飽和NaHCO₃水溶液に溶解させた。水層をEtOAcで抽出した(3×20ml)。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、蒸発させた。CHCl₃-MeOH勾配を使用するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製した。

方法F:
方法Dによって得られたN-ベンジルヒスタミン誘導体(1当量)をエタノール(2ml)に溶解させた。パラホルムアルデヒド(2当量)及び水酸化カリウム(1当量)を添加し、混合物をマイクロ波中で加熱した(100℃、5分)。揮発性物質を蒸発させ、残留物を水及び少量の飽和NaHCO₃水溶液に溶解させた。水層をEtOAcで抽出した(3×20ml)。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Na₂SO₄で脱水し、蒸発させた。CHCl₃-MeOH勾配を使用するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーによって生成物を精製した。

例
5-ベンジルスピロ[6,7-ジヒドロ-3H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-4,3'-オキセタン](MWT-S-00260)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、ベンズアルデヒド(1.02ml;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階ではオキセタン-3-オン(59μl;1mmol;1当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。収率 (第二段階): 133 mg (52%); ESI-MS: m/z 256.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.93分 (97.2%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.46 (t, 2H, ³J=5.0 Hz), 2.67 (t, 2H, ³J=5.7 Hz), 3.89 (s, 2H), 4.74-4.86 (m, 4H), 7.24-7.29 (m, 1H), 7.33-7.38 (m, 2H), 7.42-7.47 (m, 2H), 7.56 (s, 1H), 11.84 (br s, 1H)

4-フェニル-5-[(3,4,5-トリフルオロフェニル)メチル]-3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00261)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、3,4,5-トリフルオロベンズアルデヒド(1.6g;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階ではベンズアルデヒド(122μl;1.2mmol;1.2当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。収率 (第二段階): 150 mg (43.7%); ESI-MS: m/z 344.3 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 12.71分 (98.3%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.58-2.68 (m, 3H), 2.86-2.93 (m, 1H), 3.52 (d, 1H, J=14.5 Hz), 3.61 (d, 1H, J=14.5 Hz), 4.58 (s, 1H), 7.22-7.29 (m, 3H), 7.31-7.34 (m, 4H), 7.54 (s, 1H), 12.09 (br s, 1H)

5-ベンジル-4-メチル-3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00265)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、3,4,5-トリフルオロベンズアルデヒド(1.6g;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、アセトアルデヒド(112μl;2mmol;2当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。反応は、密封容器内で行った。収率 (第二段階): 60 mg (26.4%); ESI-MS: m/z 228.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 3.79分 (95.3%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 1.29 (d, 3H, ³J=6.1 Hz), 2.35-2.48 (m, 2H), 2.53-2.61 (m, 1H), 2.83-2.96 (m, 1H), 3.49-3.59 (m, 3H), 3.85 (d, 1H, J=13.2 Hz), 7.22-7.27 (m, 1H), 7.29-7.38 (m, 4H), 7.42 (s, 1H), 11.66 (br s, 1H)

5-[(3,4,5-トリフルオロフェニル)メチル]スピロ[6,7-ジヒドロ-3H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-4,3'-オキセタン](MWT-S-00266)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、3,4,5-トリフルオロベンズアルデヒド(1.6g;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、オキセタノン(70μl;1.2mmol;1.2当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。収率 (第二段階): 236 mg (76.3%); ESI-MS: m/z 310.3 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 10.66分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.68 (t, 2H, J=5.7 Hz), 3.90 (s, 2H), 4.68-4.72 (m, 2H), 4.79-4.84 (m, 2H), 7.36-7.42 (m, 2H), 7.56 (s, 1H), 11.86 (br s, 1H)

4-メチル-5-[(3,4,5-トリフルオロフェニル)メチル]-3,4,6,7-テトラヒドロ-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00267)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、3,4,5-トリフルオロベンズアルデヒド(1.6g;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、アセトアルデヒド(112μl;2mmol;2当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。収率 (第二段階): 227 mg (80.7%); ESI-MS: m/z 282.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.95分 (98.5%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 1.28 (d, 3H, J=6.6 Hz), 2.41-2.49 (m, 1H), 2.52-2.63 (m, 2H), 2.88-2.96 (m, 1H), 3.54-3.60 (m, 2H), 3.81 (d, 1H, J=14.9 Hz), 7.27-7.34 (m, 2H), 7.44 (s, 1H), 11.71 (br s, 1H)

5-ベンジル-4-フェニル-3,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-268)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、ベンズアルデヒド(1.02ml;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、ベンズアルデヒド(122μl;1.2mmol;1.2当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。収率 (第二段階): 194 mg (67%); ESI-MS: m/z 290.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 9.68分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.54-2.63 (m, 3H), 2.89-2.96 (m, 1H), 3.43 (d, 1H, J=13.6 Hz), 3.66 (d, 1H, J=13.6 Hz), 4.51 (s, 1H), 7.21-7.26 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 8H), 7.39 (s, 1H), 11.65 (br s, 1H)

4,4-ジメチル-5-[(3,4,5-トリフルオロフェニル)メチル]-6,7-ジヒドロ-3H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00275)
ヒスタミン(1111mg;10mmol;1当量)、3,4,5-トリフルオロベンズアルデヒド(1.6g;10mmol;1当量)、NaBH₄(568mg;15mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、アセトン(735μl;10mmol;10当量)、及びトリエチルアミン(139μl;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びEによって合成した。収率 (第二段階): 88 mg (29.8%); ESI-MS: m/z 296.3 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.89分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 1.32 (s, 6H), 2.43 (t, 2H, ³J=5.5 Hz), 2.62 (t, 2H, ³J=5.7 Hz), 3.64 (s, 2H), 7.27-7.35 (m, 2H), 7.42 (s, 1H), 11.69 (br s, 1H)

5-[[4-(1-ピペリジル)フェニル]メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00320)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、4-(1-ピペリジニル)ベンズアルデヒド(379mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(76mg;2.5mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(71mg;1.3mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 130 mg (34.9%); ESI-MS: m/z 297.5 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 1.44/3.6分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 1.48-1.57 (m, 2H), 1.57-1.65 (m, 4H), 2.52-2.57 (m, 2H), 2-65-2.71 (m, 2H), 3.05-3.13 (m, 4H), 3.28-3.32 (m, 2H), 3.55 (s, 2H), 6.85-6.90 (m, 2H), 7.12-7.18 (m, 2H), 7.39 (s, 1H), 11.63 (br s, 1H)

4-[2-[4-(1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン-5-イルメチル)フェノキシ]エチル]モルホリン(MWT-S-00330)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、4-(2-モルホリノエトキシ)ベンズアルデヒド(471mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(24mg;0.8mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(22mg;0.4mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 21 mg (15.5%); ESI-MS: m/z 343.4 [M+H]⁺; HPLC (勾配1): 1.18分 (77%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.43-2.49 (m, 4H), 2.65-2.71 (m, 4H), 3.55-3.60 (m, 6H), 4.03-4.09 (m, 2H), 6.88-6.92 (m, 2H), 7.22-7.26 (m, 2H), 7.40 (s, 1H), 11.65 (br s, 1H)

5-[(4-ブトキシフェニル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00331)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、4-ブトキシベンズアルデヒド(357mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(54mg;1.8mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(50mg;0.9mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 170 mg (67.3%); ESI-MS: m/z 286.3 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 8.88分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 0.95 (t, 3H, ³J=7.4 Hz), 1.40-1.50 (m, 2H), 1.67-1.75 (m, 2H), 2.91-2.97 (m, 2H), 3.40-3.48 (m, 2H), 4.00 (t, 2H, ³J=6.5 Hz), 4.13-4.18 (m, 2H), 4.31-4.36 (m, 2H), 7.00-7.05 (m, 2H), 7.40-7.45 (m, 2H), 8.66 (s, 1H)

5-[(3-メトキシフェニル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00343)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、3-メトキシ-ベンズアルデヒド(272mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(69mg;2.3mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(64mg;1.1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 42 mg (15.1%); ESI-MS: m/z 244.3 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 4.89分 (97.6%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.53-2.58 (m, 2H), 2.67-2.72 (m, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 6.81-6.86 (m, 1H), 6.90-6.94 (m, 2H), 7.22-7.28 (m, 1H), 7.41 (s, 1H), 11.64 (br s, 1H)

5-[(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロ-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00344)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-カルボキシアルデヒド(372mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(49mg;1.6mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(46mg;0.8mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 53 mg (22.0%); ESI-MS: m/z 294.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.94分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.53-2.59 (m, 2H), 2.7 (t, 2H, J=5.7 Hz), 3.35-3.38 (m, 2H), 3.69 (s, 2H), 7.19 (dd, 1H, ⁴J=1.3 Hz, ³J=8.3 Hz), 7.35 (d, 1H, ³J=8.3 Hz), 7.38 (d, 1H, ⁴J=1.3 Hz), 7.42 (s, 1H), 11.68 (br s, 1H)

5-[(4-ベンジルオキシフェニル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00359)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、4-ベンジルオキシ-ベンズアルデヒド(425mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(57mg;1.9mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(53mg;0.94mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 61 mg (20.2%); ESI-MS: m/z 320.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 9.37分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.53-2.57 (m, 2H), 2.69-2.72 (m, 2H), 3.6 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 6.96-7.01 (m, 2H), 7.23-7.29 (m, 2H), 7.31-7.48 (m, 6H)

5-[(3-ピロリジン-1-イルフェニル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00361)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、3-ピロリジン-1-イルベンズアルデヒド(351mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(37mg;1.2mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(35mg;0.61mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 39 mg (22.4%); ESI-MS: m/z 283.4 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.15分 (96.5%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 1.93-1.97 (m, 4H), 2.53-2.58 (m, 2H), 2.69-2.74 (m, 2H), 3.19-3.23 (m, 4H), 3.60 (s, 2H), 6.42-6.46 (m, 1H), 6.51-6.59 (m, 2H), 7.08-7.14 (m, 1H), 7.43 (s, 1H)

5-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イルメチル)-1,4,6,7-テトラヒドロ-イミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00380)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、1,4-ベンゾジオキサン-6-カルボキシアルデヒド(328mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(66mg;2.2mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(62mg;1.1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。生成物をセミ分取HPLCによって更に精製した。収率 (第二段階): 72 mg (13.1%); ESI-MS: m/z 272.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 3.74分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.88-2.95 (m, 2H), 4.11 (br s, 2H), 4.24 (br s, 2H), 4.27 (s, 4H), 6.92-6.98 (m, 2H), 7.04 (s, 1H), 8.62 (br s, 1H)

5-(p-トリルメチル)-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00420)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、p-トリルアルデヒド(240mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(34mg;1.1mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(32mg;0.6mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 10 mg (7.7%); ESI-MS: m/z 228.2 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 5.61分 (98.1%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.34 (s, 3H), 2.89-2.94 (m, 2H), 3.35-3.44 (m, 2H), 4.08-4.13 (m, 2H), 4.27-4.33 (m, 2H), 7.26-7.3 (m, 2H), 7.37-7.41 (m, 2H), 8.66 (s, 1H)

5-[(4-クロロフェニル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00421)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、4-クロロベンズアルデヒド(281mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(74mg;2.5mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(69mg;1.2mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 38 mg (12.5%); ESI-MS: m/z 248.1 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 6.28分 (94.4%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.82-2.89 (m, 2H), 3.18-3.28 (m, 2H), 3.90-3.96 (m, 2H), 4.12-4.20 (m, 2H), 7.47-7.54 (m, 4H), 8.73 (s, 1H)

5-[(3,4-ジクロロフェニル)メチル]-1,4,6,7-テトラヒドロイミダゾ[4,5-c]ピリジン(MWT-S-00423)
ヒスタミン(222mg;2mmol;1当量)、3,4-ジクロロ-ベンズアルデヒド(350mg;2mmol;1当量)、NaBH₄(114mg;3mmol;1.5当量)から出発し、第二段階では、パラホルムアルデヒド(58mg;1.9mmol;2当量)、及び水酸化カリウム(54mg;1mmol;1当量)から出発して、化合物を上に記載する通りの方法D及びFによって合成した。収率 (第二段階): 50 mg (18.3%); ESI-MS: m/z 282.0 [M+H]⁺; HPLC (勾配2): 7.47分 (100%); ¹H-NMR, 400 MHz, DMSO d₆: δ 2.78-2.84 (m, 2H), 3.08-3.15 (m, 2H), 3.83-3.87 (m, 2H), 4.03-4.1 (m, 2H), 7.44 (dd, 1H, ³J=8.3 Hz, ⁴J=2.0 Hz), 7.67-7.74 (m, 2H), 8.79 (s, 1H)

分析法
HPLC:分析用HPLCシステムは、LUNA RP 18(5μm)、分析用カラム(長さ:125mm、直径:4mm)、及び報告する波長としてλ=214nmを有するダイオードアレイ検出器(DAD)を利用するMerck-Hitachi社のデバイス(LaChromモデル)から構成した。化合物は、以下による勾配を1mL/分の流量で使用して分析した;溶出液(A)はアセトニトリル、溶出液(B)は水であり、両方とも0.04%(v/v)トリフルオロ酢酸を含有しており、次の勾配の1つを適用した:
勾配1: 0分～5分→5%(A)、5分～17分→5～15%(A)、17分～27分 15～95%(A) 27分～30分 95%(A)
勾配2: 0分～5分→5%(A)、5分～15分→5～60%(A)、15分～20分 60～95%(A) 20分～30分 95%(A)

報告する全ての化合物の純度は、214nmでのピーク面積の百分率によって決定した。

質量分析法:ESI及びAPCI質量スペクトルは、SCIEX API 1200分光計(Perkin Elmer社)又はexpression CMS(Advion社)を用いて得た。

NMR分光法:1H NMRスペクトルをAgilent社DD2 400-MHz分光計で記録した。化学シフトは、テトラメチルシランから低磁場側の百万分率(ppm)として表す。分裂パターンは次のように示した:s(一重線)、d(二重線)、dd(二重線の二重線)、t(三重線)、m(多重線)、及びbr(ブロードシグナル)。

(実施例11)
PgQC、TfQC、及びPiQCを発現する細菌の標的化
PgQC、TfQC、及びPiQCを発現する細菌、すなわち、P.ジンジバリス(ATCC 33277)、P.ジンジバリス(M5-1-2)、T.フォーサイシア(ATCC 42077)、及びP.インターメディア(ATCC 25611)を、2倍希釈系列の化合物、MWT-S-00275、MWT-S-00431、MWT-S-00441、及びドキシサイクリンの存在下で培養した。以下のTable 6(表6)において、MICは、目に見える増殖(混濁度)がない最低の化合物濃度を示し、MBCは、継代培養の増殖がないか又は少なくとも99.9%(対数目盛で3)の低減が観察される化合物濃度を示す。

Table 6(表6)の結果から、化合物MWT-S-00275、MWT-S-00431、MWT-S-00441は、歯周炎の標準的な抗生物質補助療法に現在使用されている広域抗生物質ドキシサイクリンと比較して有意に低い濃度で、PgQC、TfQC、及びPiQCを既に発現している細菌の増殖を阻害する又はそれらを死滅させる能力があることが示される。

結論:本発明による化合物は、非特異的な広域抗生物質より遥かに低い濃度で、歯周疾患を誘導する病原体を標的化する能力がある。

本発明による細菌グルタミニルシクラーゼ(bacQC)は、歯周炎を誘導する病原体を選択的に標的化する能力のある阻害剤を特定するために特異的且つ実質的に使用することができる治療標的タンパク質を表す。よって、それらは、特定の疾患、例えば歯周炎の治療に関連しており、したがって産業上の利用可能性があり得る。

本発明による抗体は、bacQC酵素を認識する。bacQCを発現する細菌の存在は歯周炎の発生に関係する。これに対して、bacQCの阻害を歯周炎の治療に使用することができる。したがって、本発明による抗体は、特定の疾患の治療及び/又は診断に使用することができ、したがって産業上の利用可能性があり得る。

本明細書に明示した、歯周炎の発生に対するbacQC酵素の医薬的関連性、及び歯周病原体の増殖に対するbacQC酵素の不可欠性を鑑みると、本発明によるbacQCの阻害剤を特定する方法には産業上の利用可能性がある。

本発明によるbacQCの阻害剤を特定する方法によって特定された阻害剤を含めた本発明によるbacQC阻害剤、及び本発明による医薬組成物にも産業上の利用可能性があり得る。何故なら、これらは、ヒト又は動物の体を治療する方法、特に、細菌感染症、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテーラ・インターメディア、及びタネレラ・フォーサイシアからなる群から選択される細菌によって引き起こされる細菌感染症の治療法若しくは予防法、及び/又は急性、慢性、若しくは再発性歯周疾患、例えば、歯周炎の治療法若しくは予防法に使用できるからである。

Claims (11)

1. 以下の式Iによる化合物、
   

   

   ［式中、Arは、置換されている又は置換されていないフェニルであり;
   Lは、単結合、-CH₂-、-CH₂CH₂-、及び-CH=CH-からなる群から選択され;
   R¹及びR²の各々が、Hであり、又は一緒に=Oを表し;
   R³及びR⁴は、H及びメチルからなる群から選択され、又は、R³/R⁴基の対において、2つの基は、一緒に結合してオキセタン環を形成し;
   (i)R¹及びR²の各々が、Hである場合は、R³及びR⁴の各々は、Hであり、又は、R³及びR⁴は、メチルであり、又は、R³/R⁴基の対において、2つの基は、一緒に結合してオキセタン環を形成し、
   (a)Lが、-CH₂-、-CH₂CH₂-、及び-CH=CH-からなる群から選択されている場合、Arは、置換されている又は置換されていないフェニルであり、
   (b)Lが単結合である場合、置換されている又は置換されていないフェニルであるArは、フェニル、3-メトキシフェニル、3,4,5-トリフルオロフェニル、4-(ベンジルオキシ)フェニル、4-ブトキシフェニル、及び4-クロロフェニル、並びに以下の構造Ar-IからAr-XII
   

   

   (式中、
   R¹²は独立に、H、F、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され;
   R¹³は独立に、H、Cl、Br、I、OH、CNからなる群から、又は、アルキル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、n-ペントキシ、ヘキソキシ、ヘプトキシ、オクトキシ、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択され、前記基の各々は、置換されていない、或いは、C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、C_1～5ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、及びヒドロキシル基から独立に選択される1個又は数個の基によって置換され、前記C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、及びC_1～5ヘテロアリール基は、置換されていない、又は、1個若しくは数個のハロゲン原子、及び/若しくはヒドロキシル基によって置換され、
   R¹⁴は独立に、H、F、Cl、Br、I、OH、及びCNからなる群から、又は、アルキル、アルコキシ、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択され、前記基の各々は、置換されていない、或いは、C_1～6アルキル、C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、C_1～5ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、及びヒドロキシル基から独立に選択される1個又は数個の基によって置換され、前記C_1～6アルキル、C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、及びC_1～5ヘテロアリール基は、置換されていない、又は、1個若しくは数個のハロゲン原子、及び/若しくはヒドロキシル基によって置換され
   R¹⁵は独立に、H、Cl、Br、I、OH、及びCNからなる群から選択され、又は、アルキル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、n-ペントキシ、ヘキソキシ、ヘプトキシ、オクトキシ、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択され、前記基の各々は、置換されていない、或いは、C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、C_1～5ヘテロアリール基、ハロゲン原子、シアノ基、及びヒドロキシル基から独立に選択される1個又は数個の基によって置換され、前記C_1～6ヘテロアルキル、C_1～6カルボシクリル、C_1～5ヘテロシクリル、及びC_1～5ヘテロアリール基は、置換されていない、又は、1個若しくは数個のハロゲン原子、及び/若しくはヒドロキシル基によって置換され、
   R¹⁶は独立に、H、F、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され、
   R¹⁷は独立に、F、Cl、Br、I、OH、CN、場合により置換されているアルキル、場合により置換されているアルコキシ、場合により置換されているアリール、場合により置換されているヘテロアルキル、及び場合により置換されているヘテロアリールからなる群から選択され、
   R¹²～R¹⁶の少なくとも1つはHではなく、
   R¹²～R¹⁷の任意の2つの基は、場合により一緒に結合して炭素環式又は複素環式環を形成することができる）
   からなる群から選択され;且つ
   (ii)R¹及びR²が、一緒に=Oを表す場合は、R³及びR⁴は、同じであるか、若しくは互いに異なっており、独立して、H及びメチルからなる群から選択され、又は、R³/R⁴基の対において、2つの基は、一緒に結合してオキセタン環を形成し、
   (a)Lが、-CH=CH-である場合、Arは、置換されている又は置換されていないフェニルであり、
   (b)Lが単結合、-CH₂-、又は-CH₂CH₂-である場合、Arは、場合により置換されているカルボキシフェニル、場合により置換されているヒドロキシフェニルからなる群から選択される、置換されているフェニルであり、又は、2,3-ジクロロフェニル、3-クロロ-5-メトキシフェニル、3,4,5-トリフルオロフェニル、3,5-ジクロロフェニル、4-(ベンジルオキシ)フェニル、4-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェニル、4-ブトキシフェニル、4-フルオロ-3-メトキシフェニル、及びビフェニル-3-イルである］
   その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩。
2. R³及びR⁴の各々がメチルである、請求項1に記載の化合物。
3. R³及びR⁴の各々がHである、請求項1に記載の化合物。
4. R³及びR⁴が、一緒に結合して、以下の式IIによって表される複素環基を形成する、
   

   

   請求項1に記載の化合物。
5. Arが、2,3-ジクロロフェニル、3-クロロ-5-メトキシフェニル、3,4,5-トリフルオロフェニル、3,5-ジクロロフェニル、4-(ベンジルオキシ)フェニル、4-[2-(モルホリン-4-イル)エトキシ]フェニル、4-ブトキシフェニル、及び4-フルオロ-3-メトキシフェニルからなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
6. 請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物と医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
7. 請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物又は請求項6に記載の医薬組成物を含む、ヒト又は動物の体を治療する方法に使用するための医薬剤。
8. (i)(a)細菌グルタミニルシクラーゼ(bacQC)を発現する細菌であって、bacQCが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、並びに配列番号1、配列番号2、及び配列番号3のいずれか1つと80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、細菌;若しくは
   (b)ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテーラ・インターメディア、及びタネレラ・フォーサイシアからなる群から選択される細菌;若しくは
   (c)ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテーラ・インターメディア、及びタネレラ・フォーサイシアからなる群から選択される細菌であって、バイオフィルム中の前記細菌の増殖を選択的に阻害される、細菌
   によって引き起こされる細菌感染症;又は
   (ii)急性、慢性、若しくは再発性歯周疾患
   用の医薬又は医薬組成物であって、
   前記医薬が、以下の式Iによる化合物、
   

   

   (式中、Arは、置換されている又は置換されていないフェニル、ナフタレン、1,3-ベンゾジオキソール-5-イル、及び2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イルからなる群から選択され;
   Lは、単結合、-CH₂-、-CH₂CH₂-、及び-CH=CH-からなる群から選択され;
   R¹及びR²の各々が、Hであり、又は一緒に=Oを表し;
   R³及びR⁴は、同一であるか若しくは互いに異なっており、独立に、H、メチル、及びフェニルからなる群から選択され、又は、R³/R⁴基の対において、2つの基は、一緒に結合してオキセタン環を形成する) その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩
   を含み、
   前記医薬組成物が、前記式Iによる化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、
   医薬又は医薬組成物。
9. 急性、慢性、若しくは再発性歯周疾患が、デンタルプラーク起因性歯肉疾患、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身疾患の徴候としての歯周炎、壊死性歯周疾患、歯周組織の膿瘍、歯内病変関連歯周炎、インプラント周囲粘膜炎、インプラント周囲炎、及び歯内感染症からなる群から選択される、請求項8に記載の医薬又は医薬組成物。
10. 細菌感染症用の医薬又は医薬組成物であって、
    前記医薬が、以下の式Iによる化合物、
    

    

    (式中、Arは、置換されている又は置換されていないフェニル、ナフタレン、1,3-ベンゾジオキソール-5-イル、及び2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イルからなる群から選択され;
    Lは、単結合、-CH₂-、-CH₂CH₂-、及び-CH=CH-からなる群から選択され;
    R¹及びR²の各々が、Hであり、又は一緒に=Oを表し;
    R³及びR⁴は、同一であるか若しくは互いに異なっており、独立に、H及びメチルからなる群から選択され、又は、R³/R⁴基の対において、2つの基は、一緒に結合してオキセタン環を形成する) その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩
    を含み、
    前記医薬組成物が、前記式Iによる化合物、その個々の鏡像異性体、その個々のジアステレオ異性体、その水和物、その溶媒和物、その結晶形、その個々の互変異性体、又は医薬的に許容されるそれらの塩、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、
    医薬又は医薬組成物。
11. 投与経路が局所若しくは全身投与である;及び/又は、方法が非外科的方法である、請求項8から10のいずれか一項に記載の医薬又は医薬組成物。

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