JP6974180B2 - 中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の方法 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年６月１日に出願された米国仮出願第６２／１６９，３７９号および２０１５年６月１日に出願された米国仮出願第６２／１６９，４４４号に対する優先権を主張する（それぞれに対する優先権が主張され、それぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）。

１．緒言
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導される、中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロン、およびその前駆体、ならびに神経障害の細胞ベースの処置のためのそれらの使用に関する。

２．発明の背景
以前、胚性幹細胞および体性幹細胞が、神経変性疾患に対する治療薬およびモデル系として使用されていた。胚性幹細胞および体性幹細胞の誘導された分化に関する研究開発および技術開発は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、例えばハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症の分野で行われている。しかしながら、これらの研究の結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでニューロン機能を回復させる可能性をほとんど示さず、患者において望ましくない腫瘍の成長をもたらすことが多かった。

したがって、パーキンソン病などの神経変性障害を処置する際に使用されるニューロン前駆細胞を分化させるための組成物および方法に対する必要性が存在する。

３．発明の概要
本開示の主題は、少なくとも部分的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化によるヒト幹細胞から誘導される中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロン（ｍＤＡ）、およびその前駆体に関する。

本開示の主題は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化、およびウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化を伴う、ＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害（例えば、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達およびＢＭＰシグナル伝達の阻害による）であって、Ｗｎｔ活性化化合物の濃度を、細胞のＳＭＡＤ阻害剤、ＳＨＨ活性化剤、およびＷｎｔ活性化剤への最初の接触の約４日後に増加させる二重阻害によって、中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロン、およびその前駆体をヒト幹細胞から分化させることができるという発見に関する。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、例えば、未成熟前駆細胞のマーカー、例えばＰＡＸ６の発現を低下させること、および生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）後に機能的チロシンヒドロキシラーゼを発現するｍＤＡ細胞に分化する細胞を生成することによって、幹細胞をＷｎｔ活性化化合物の増加を含まない中脳ＤＡ細胞に分化させる方法に勝る利益をもたらす。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＤＡニューロン系列活性化剤および阻害剤、例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ、例えば、ＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、およびＤＡＰＴ（これは、Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル；ＬＹ−３７４９７３、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル；またはＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン ｔ−ブチルエステルとしても公知である）とさらに接触させる。

ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の中脳ＤＡ前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ヒト幹細胞の集団または複数のヒト幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させるステップを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、阻害剤と活性化剤は、同時に細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、細胞をＷｎｔ活性化剤と最初に接触させてから少なくとも約２、３、４、５または６日後に増加させる。ある特定の実施形態では、少なくとも約４、５、６、７、８、９、または１０日またはそれを超える間、細胞を、濃度を増加させたＷｎｔ活性化剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、中脳ＤＡニューロン、またはその前駆体、例えばこれらに限定されないが、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１（ＥＮ−１）、ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅホメオボックス２（ＯＴＸ２）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、およびＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）の１種または複数のマーカーの発現の検出可能なレベルを上昇させるのに有効な量で、前述の薬剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ニューロン特異的クラスＩＩＩ型ベータ−チューブリン（Ｔｕｊ１）、トレフォイルファクターファミリー３（ＴＴＦ３）、ペアード様ホメオドメイン（ｐａｉｒｅｄ−ｌｉｋｅ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）３（ＰＩＴＸ３）、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体（ＡＳＣＬ）、早期Ｂ細胞因子１（ｅａｒｌｙ Ｂ−ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ １）（ＥＢＦ−１）、早期Ｂ細胞因子３（ｅａｒｌｙ Ｂ−ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ ３）（ＥＢＦ−３）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、およびＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３および／またはＣＤ９９の１種または複数の発現の検出可能なレベルを上昇させるのに有効な量で、前述の薬剤と接触させる。

本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された、中脳ＤＡ細胞、またはその前駆体の１種または複数のマーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団も提供する。ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞の集団から誘導される。本開示の主題は、このような分化細胞集団を含む組成物を、さらに提供する。

ある特定の実施形態では、細胞は、ペアードボックスタンパク質（ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＡＸ６）および／またはＫｉ６７の発現の検出可能なレベルを低下させるのに有効な量で、前述の薬剤と共に培養される。ある特定の実施形態では、細胞は、検出可能なレベルのＰＡＸ６および／またはＫｉ６７を発現しない。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って調製された細胞を、例えばフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１４２発現、および／またはコリン作用性受容体（ＣＨＲＮＢ３）発現に基づいて選別、選択、および単離することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って調製された細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼ、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ_Ｎｍ）などの細菌のポリシアリルトランスフェラーゼとさらに接触させることができる。ある特定の実施形態では、細胞は、組換えポリシアリルトランスフェラーゼを発現する組換え細胞である。

さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。

ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、（ｂ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｄ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および（ｅ）幹細胞の、中脳ＤＡニューロン、またはその前駆体の１種または複数のマーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている方法に従って調製された幹細胞由来の前駆体を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の細胞は、成熟した分化細胞、例えば中脳ＤＡ細胞である。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化剤は、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、Ｃ２５ＩＩ、および小分子パルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）などのＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）受容体アゴニスト、それらの誘導体、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される。

ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群より選択される。ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、さらに分化した細胞、例えば、胚性遺伝子（これらに限定されないが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃＭｙｃ、およびＫＬＦ４導入遺伝子など）の体細胞への導入（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ １２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年））によって形成される分化体細胞から調製される細胞である。

ある特定の実施形態では、方法は、分化細胞の前記集団を、前記分化細胞の中脳ＤＡニューロンの集団への成熟に好ましい条件に供するステップを含む。

本開示の主題は、被験体の神経変性障害、例えばパーキンソン病を処置する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、有効量の本明細書に記載されている分化細胞集団を、神経変性障害を患っている被験体に投与するステップを含む。

本開示の主題は、神経変性障害を処置するための本明細書に記載されている分化細胞集団をさらに提供する。

本開示の主題は、神経変性障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載されている分化細胞集団の使用をさらに提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
多能性細胞を分化させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、複数の多能性細胞を、（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤、
（ｂ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤、および
（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤
と接触させるステップを含み、
前記複数の多能性細胞に接触させる、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約２日から約６日の間の後に増加させ、その結果、複数の前記細胞が分化して、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）およびＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）を発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
（項目２）
前記細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と接触させる、項目１に記載の方法。
（項目３）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、約４日間から約１０日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目４）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、最長約７日間まで、または少なくとも約７日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目５）
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、約８日間から約１５日間の間、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目６）
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を、約１２日間にわたり、最長約１２日間まで、または少なくとも約１２日間にわたり、前記複数の多能性細胞に接触させる、項目２に記載の方法。
（項目７）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤を前記複数の多能性細胞に最初に接触させてから約４日後に増加させる、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の約４００％〜１４５０％である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記複数の細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の約７００％〜１０５０％である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約３から１０μＭの間の濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約３μＭの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、約７．５μＭの濃度までの増加である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記複数の細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１（ＥＮ−１）、および核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）の１種または複数を発現する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質（ＰＡＸ６）および／またはＫｉ６７を発現しない、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、および／またはＤＡＰＴと接触させることを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記多能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の胚性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の人工多能性幹細胞、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
ＢＭＰおよびＳＭＡＤシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、パルモルファミン、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、および／またはＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、および／またはＷｎｔ１を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記多能性細胞が、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤、およびＷｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤との接触の開始後、２２〜２７日以内に、中脳ドーパミンニューロンに分化する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記複数の細胞が、検出可能なレベルのＣＤ１４２を発現し、前記方法が、ＣＤ１４２を発現する中脳ドーパミンニューロンの集団を選択するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記項目のいずれかに記載の方法に従って分化させた中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
（項目２５）
前記細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼと接触させる、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
（項目２６）
項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体を含むキット。
（項目２７）
被験体における神経変性障害を処置する方法であって、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体をそれを必要とする被験体に投与するステップを含む方法。
（項目２８）
前記神経変性障害が、パーキンソン病であり、前記中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体が、パーキンソン病の１つまたは複数の症状を減少させるのに有効な量で投与される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
検出可能なマーカーを発現する組換え細胞である、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。
（項目３０）
生体適合性スキャホールドに含まれる、項目２４に記載の中脳ドーパミンニューロン、またはその前駆体。

前述の内容は、以下に続く詳細な説明がより理解されやすいように、本出願の特徴および技術的な利点をやや大まかに概説した。本出願の特許請求の範囲の主題を形成する本出願のさらなる特徴および利点は、以下に説明される。開示されている概念および具体的な実施形態は、本出願と同じ目的を実行するために他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用できることを当業者は理解すべきである。このような均等な構築物が、添付の特許請求の範囲に示された本出願の精神および範囲を逸脱しないことも当業者は認識すべきである。本出願の特性と考えられる新規特徴は、その構成および操作方法の両方について、さらなる目的および利点と共に、以下の記載からより理解されるものである。

図１は、Ｗｎｔ ｂｕｍｐにより生成された中脳ＤＡニューロンおよび他の脳領域のニューロンを用いずに、ＫＳＲ培地（Ｎｏｎ−ＧＭＰ）中またはＥ８／ＮＢ／Ｎ２培地（ＧＭＰ Ｖ１）中で、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁に記載されている方法に従って、ｈＥＳＣを１０日間分化させたことを示す。Ｄ４〜Ｄ１０に７．５μＭ（または５〜１０μＭ）のＷｎｔ ｂｕｍｐを利用する実施例１の方法に従って、Ｅ８／ＮＢ／Ｎ２培地中でｈＥＳＣを培養することは、中脳ＤＡ細胞を生成するために特異的であった。

図２は、Ｗｎｔ ｂｕｍｐを用いずに、ＫＳＲ培地（Ｎｏｎ−ＧＭＰ）中またはＥ８／ＮＢ／Ｎ２培地（ＧＭＰ Ｖ１）中で、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁に記載されている方法に従って、２２から２７日の間分化させたｈＥＳＣにおけるＰＡＸ６、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、およびＬＭＸ１Ａの発現を示す。細胞を回収し、指定された遺伝子に対してｑＲＴ−ＰＣＲで解析した（ｎ＝条件ごとに３から１４の間）。データは、正規化したｃＴ値として表し、数値が低い程、高い遺伝子発現を示す。

図３は、Ｗｎｔ ｂｕｍｐを用いずに、ＫＳＲ培地（Ｎｏｎ−ＧＭＰ）中またはＥ８／ＮＢ／Ｎ２培地（ＧＭＰ Ｖ１）中で、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁に記載されている方法に従って、および３μＭ（ＧＭＰ Ｖ２Ａ）または７．５μＭ（ＧＭＰ Ｖ２Ｂ）のＷｎｔ ｂｕｍｐを用いて、Ｅ８／ＮＢ／Ｎ２培地中でｈＥＳＣを培養することを含む、実施例１に記載されている方法に従って、２２から２７日の間分化させたｈＥＳＣにおけるＰＡＸ６、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＥｎ−１の発現を示す。細胞を回収し、指定された遺伝子に対してｑＲＴ−ＰＣＲで解析した（ｎ＝条件ごとに３から１４の間）。データは、正規化したｃＴ値として表し、数値が低い程、高い遺伝子発現を示す。ＧＭＰ Ｖ２ＡおよびＧＭＰ Ｖ２Ｂに従って培養した細胞は、高レベルのＥｎ−１を発現した。

図４は、分化した中脳ＤＡ細胞を特定するために使用することができる中脳ＤＡマーカーを示す。 図４は、分化した中脳ＤＡ細胞を特定するために使用することができる中脳ＤＡマーカーを示す。 図４は、分化した中脳ＤＡ細胞を特定するために使用することができる中脳ＤＡマーカーを示す。 図４は、分化した中脳ＤＡ細胞を特定するために使用することができる中脳ＤＡマーカーを示す。

図５は、Ｅ８／マトリゲル条件下で維持され、次いで、０．７μＭのＷｎｔを用い、Ｗｎｔ ｂｕｍｐを用いないＮＢ／Ｎ２培地中で、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁に記載されている方法に従って、２５日間分化させたｈＥＳＣが、ｉｎ ｖｉｖｏでの増殖領域を呈することを示す。分化に続いて、細胞は、損傷していない、免疫無防備状態のマウスに移植され、４週間後に移植片を回収した。切片を、ヒトＮＣＡＭ、ＦＯＸＡ２およびＴＨに対してＩＣＣで解析した。多数のＦＯＸＡ２を発現するＴＨ＋細胞が観察された一方、移植片コア内にｈＮＣＡＭ＋細胞のクラスターも検出された。これらのパッチはＰＡＸ６も発現し、神経前駆細胞状態を示した。

図６Ａ〜Ｂは、（Ａ）Ｅ８／マトリゲル条件下で維持され、次いで、実施例１で記載されているＧＭＰ Ｖ２Ａ（０．７μＭのＷｎｔバックグラウンドの存在下で３μＭのＷｎｔ ｂｕｍｐ）およびＧＭＰ Ｖ２Ｂ （０．７μＭのＷｎｔバックグラウンドの存在下で７．５μＭのＷｎｔ ｂｕｍｐ）培養方法に従ってＮＢ／Ｎ２培地で２５日間分化させたｈＥＳＣが、高レベルのＥＮ−１およびＴＨを発現する中脳ＤＡ細胞の分化を誘導することを示す。中脳ＤＡニューロンを固定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＨおよびＥＮ−１（上のパネル）ならびにＮＵＲＲ１およびＬＭＸ１Ａ（下のパネル）に対して染色した。（Ｂ）ＧＭＰ Ｖ２Ｂプロトコルに従って分化させた中脳ＤＡ細胞を、損傷していない、免疫無防備状態のマウスの線条体に移植し、これは、移植の３週間後に、線維伸長の増大とｈＮＣＡＭおよびＴＨの発現を示した。 図６Ａ〜Ｂは、（Ａ）Ｅ８／マトリゲル条件下で維持され、次いで、実施例１で記載されているＧＭＰ Ｖ２Ａ（０．７μＭのＷｎｔバックグラウンドの存在下で３μＭのＷｎｔ ｂｕｍｐ）およびＧＭＰ Ｖ２Ｂ （０．７μＭのＷｎｔバックグラウンドの存在下で７．５μＭのＷｎｔ ｂｕｍｐ）培養方法に従ってＮＢ／Ｎ２培地で２５日間分化させたｈＥＳＣが、高レベルのＥＮ−１およびＴＨを発現する中脳ＤＡ細胞の分化を誘導することを示す。中脳ＤＡニューロンを固定し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＨおよびＥＮ−１（上のパネル）ならびにＮＵＲＲ１およびＬＭＸ１Ａ（下のパネル）に対して染色した。（Ｂ）ＧＭＰ Ｖ２Ｂプロトコルに従って分化させた中脳ＤＡ細胞を、損傷していない、免疫無防備状態のマウスの線条体に移植し、これは、移植の３週間後に、線維伸長の増大とｈＮＣＡＭおよびＴＨの発現を示した。

図７は、Ｅ８／マトリゲル条件下で維持され、次いで、実施例１で記載されているＧＭＰ Ｖ２Ｂ （０．７μＭのＷｎｔバックグラウンドの存在下で７．５μＭのＷｎｔ ｂｕｍｐ）培養方法に従ってＮＢ／Ｎ２培地で２５日間分化させたｈＥＳＣが、ＰＡＸ６発現細胞を排除する一方、ＦＯＸＡ２発現細胞を維持したことを示す。細胞を回収し、ＦＯＸＡ２およびＰＡＸ６の存在についてフローサイトメトリーで解析した。

図８は、凍結保存した中脳ＤＡニューロンが、「新鮮な」細胞と比較した場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで同様に挙動することを示す。マウスに移植した「新鮮な」細胞の３週間後の移植片と「凍結した」細胞の４週間後の移植片におけるＨｎｃａｍおよびＴＨの発現を比較した。両移植片は、右の挿入パネルで強調したように、線維伸長の早期徴候を示した。

図９Ａ〜Ｂは、（Ａ）ＭＡＣＳフローサイトメトリーを使用するＣＤ１４２を発現する中脳ＤＡ細胞の細胞選別を示す。選別前（「前」）、２４日目のフロースルー（陰性画分）および陽性画分について、ＣＤ１４２により選別されたｍＤＡニューロンを示す。フィコエリトリンをＣＤ１４２にコンジュゲートし、抗ＰＥビーズを単離のために使用して、結果を可視化した。（Ｂ）６つの実験にわたるコンシステンシーを示す。 図９Ａ〜Ｂは、（Ａ）ＭＡＣＳフローサイトメトリーを使用するＣＤ１４２を発現する中脳ＤＡ細胞の細胞選別を示す。選別前（「前」）、２４日目のフロースルー（陰性画分）および陽性画分について、ＣＤ１４２により選別されたｍＤＡニューロンを示す。フィコエリトリンをＣＤ１４２にコンジュゲートし、抗ＰＥビーズを単離のために使用して、結果を可視化した。（Ｂ）６つの実験にわたるコンシステンシーを示す。

図１０Ａ〜Ｂは、損傷していないマウスおよびパーキンソン症候群のサルにおいて、ｍＤＡニューロンが生存することを示す。（Ａ）ＣＤ１４２により選別したｍＡ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで生存する。Ｋｉｒｋｓらによって記載されている方法に従って、ＫＳＲで調製されたｍＤＡニューロンを、ＣＤ１４２についてＦＡＣＳで選別し、マウスに移植した。移植片を、移植の３０日後に回収し、ＴＨおよびｈＮＣＡＭの発現について解析した。（Ｂ）ＫＳＲプロトコルに由来する（Ｋｒｉｋｓら）ｍＤＡニューロンは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で１年生存する。２５日目のｍＤＡニューロンをパーキンソン症候群のサルに移植し、移植片を移植の１２カ月後に採取した。切片を、ヒト細胞質（ＳＣ１２１）およびＴＨを検出する抗体で染色した。上半分は、通常および反転した画像を示し、一方下半分は、より高い倍率を示す。データにより、ＭＡＣＳにより選別された細胞が、マウスに移植されたＣＤ１４２により選別されたｍＤＡ細胞に対して匹敵する生存を示したことが示された。 図１０Ａ〜Ｂは、損傷していないマウスおよびパーキンソン症候群のサルにおいて、ｍＤＡニューロンが生存することを示す。（Ａ）ＣＤ１４２により選別したｍＡ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで生存する。Ｋｉｒｋｓらによって記載されている方法に従って、ＫＳＲで調製されたｍＤＡニューロンを、ＣＤ１４２についてＦＡＣＳで選別し、マウスに移植した。移植片を、移植の３０日後に回収し、ＴＨおよびｈＮＣＡＭの発現について解析した。（Ｂ）ＫＳＲプロトコルに由来する（Ｋｒｉｋｓら）ｍＤＡニューロンは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で１年生存する。２５日目のｍＤＡニューロンをパーキンソン症候群のサルに移植し、移植片を移植の１２カ月後に採取した。切片を、ヒト細胞質（ＳＣ１２１）およびＴＨを検出する抗体で染色した。上半分は、通常および反転した画像を示し、一方下半分は、より高い倍率を示す。データにより、ＭＡＣＳにより選別された細胞が、マウスに移植されたＣＤ１４２により選別されたｍＤＡ細胞に対して匹敵する生存を示したことが示された。

図１１Ａ〜Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＤＡニューロンのポリシアリルトランスフェラーゼ処理（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ_Ｎｍ））の効果を示す。（Ａ）ポリシアリル化（ＰＳＡ）レベルに対する凍結保存の効果を示す。ｍＤＡ細胞は、ＰＳＴ_Ｎｍで処理されるか、または改変されないままである。細胞の半分を固定し、一方、他の半分は凍結保存した。凍結した細胞を１週間後に解凍し、やはり固定した。細胞を、ＰＳＡについて免疫染色し、フローサイトメトリーによって解析した。黒線は、新鮮な染色されていない細胞を示す。ＰＳＴＮｍに誘導されたＰＳＡの染色は、凍結された細胞および凍結されていない細胞において同一であった。青線は、新鮮なまま解析された未処理の細胞を表し、赤および緑の線は、新鮮なまま解析された（赤）か、または凍結保存後に解析された（緑）かのいずれかのＰＳＴＮｍで処理された細胞に由来する。（Ｂ）ＣＤ１４２細胞により選別した細胞に対するＰＳＴＮｍ処理の効果を示す。未処理（左）か、またはＰＳＴＮｍで処理された（右）かのいずれかの、ＣＤ１４２により選別された細胞を１日培養した後に染色したＴＡＵ−１の代表的な画像。（Ｃ）ＰＳＴＮｍで処理されたＣＤ１４２により選別された細胞の軸索長が増大したことを示したことを示す。細胞を１日目または４日目に解析し、画像をＮＩＨ’ｓ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。（Ｄ）ＰＳＡレベルが、ｉｎ ｖｉｖｏで持続することを示す。ＰＳＴＮｍで処理されたｍＤＡニューロンをマウスの線条体に移植し、ＰＳＡレベルを移植の２週間後に可視化した。２つの視野（ＦＯＶ １およびＦＯＶ ２）は、条件ごとに示される。右のグラフに結果をまとめる。 図１１Ａ〜Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＤＡニューロンのポリシアリルトランスフェラーゼ処理（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ_Ｎｍ））の効果を示す。（Ａ）ポリシアリル化（ＰＳＡ）レベルに対する凍結保存の効果を示す。ｍＤＡ細胞は、ＰＳＴ_Ｎｍで処理されるか、または改変されないままである。細胞の半分を固定し、一方、他の半分は凍結保存した。凍結した細胞を１週間後に解凍し、やはり固定した。細胞を、ＰＳＡについて免疫染色し、フローサイトメトリーによって解析した。黒線は、新鮮な染色されていない細胞を示す。ＰＳＴＮｍに誘導されたＰＳＡの染色は、凍結された細胞および凍結されていない細胞において同一であった。青線は、新鮮なまま解析された未処理の細胞を表し、赤および緑の線は、新鮮なまま解析された（赤）か、または凍結保存後に解析された（緑）かのいずれかのＰＳＴＮｍで処理された細胞に由来する。（Ｂ）ＣＤ１４２細胞により選別した細胞に対するＰＳＴＮｍ処理の効果を示す。未処理（左）か、またはＰＳＴＮｍで処理された（右）かのいずれかの、ＣＤ１４２により選別された細胞を１日培養した後に染色したＴＡＵ−１の代表的な画像。（Ｃ）ＰＳＴＮｍで処理されたＣＤ１４２により選別された細胞の軸索長が増大したことを示したことを示す。細胞を１日目または４日目に解析し、画像をＮＩＨ’ｓ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。（Ｄ）ＰＳＡレベルが、ｉｎ ｖｉｖｏで持続することを示す。ＰＳＴＮｍで処理されたｍＤＡニューロンをマウスの線条体に移植し、ＰＳＡレベルを移植の２週間後に可視化した。２つの視野（ＦＯＶ １およびＦＯＶ ２）は、条件ごとに示される。右のグラフに結果をまとめる。 図１１Ａ〜Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍＤＡニューロンのポリシアリルトランスフェラーゼ処理（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ_Ｎｍ））の効果を示す。（Ａ）ポリシアリル化（ＰＳＡ）レベルに対する凍結保存の効果を示す。ｍＤＡ細胞は、ＰＳＴ_Ｎｍで処理されるか、または改変されないままである。細胞の半分を固定し、一方、他の半分は凍結保存した。凍結した細胞を１週間後に解凍し、やはり固定した。細胞を、ＰＳＡについて免疫染色し、フローサイトメトリーによって解析した。黒線は、新鮮な染色されていない細胞を示す。ＰＳＴＮｍに誘導されたＰＳＡの染色は、凍結された細胞および凍結されていない細胞において同一であった。青線は、新鮮なまま解析された未処理の細胞を表し、赤および緑の線は、新鮮なまま解析された（赤）か、または凍結保存後に解析された（緑）かのいずれかのＰＳＴＮｍで処理された細胞に由来する。（Ｂ）ＣＤ１４２細胞により選別した細胞に対するＰＳＴＮｍ処理の効果を示す。未処理（左）か、またはＰＳＴＮｍで処理された（右）かのいずれかの、ＣＤ１４２により選別された細胞を１日培養した後に染色したＴＡＵ−１の代表的な画像。（Ｃ）ＰＳＴＮｍで処理されたＣＤ１４２により選別された細胞の軸索長が増大したことを示したことを示す。細胞を１日目または４日目に解析し、画像をＮＩＨ’ｓ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。（Ｄ）ＰＳＡレベルが、ｉｎ ｖｉｖｏで持続することを示す。ＰＳＴＮｍで処理されたｍＤＡニューロンをマウスの線条体に移植し、ＰＳＡレベルを移植の２週間後に可視化した。２つの視野（ＦＯＶ １およびＦＯＶ ２）は、条件ごとに示される。右のグラフに結果をまとめる。

図１２は、偽移植ラットと比較した、実施例２に記載されているように分化させ、１６日目に凍結保存したｍＤＡ前駆体で移植した損傷ラットの回転行動を示す。ラットは、移植前、ならびに移植の１、２、３、４および５カ月後に試験した。回転行動は、アンフェタミン投与により誘導した。移植片を受けた損傷ラットは、移植の４カ月後に、偽移植ラットと比較して、回転行動における統計的に有意な低下を示した。

図１３は、実施例２に記載されているように分化させ、１６日目に凍結保存したｍＤＡ前駆体で移植した損傷ラットにおけるｈＮＣＡＭ、ＴＨ、およびＧＩＲＫ２のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を示す。移植後の移植片を、移植後５カ月調査した。ＴＨ染色は、典型的なｍＤＡ形態を示した。ＴＨ陽性ニューロンは、ＧＩＲＫ２陽性でもあった。

図１４は、実施例２に従って分化させ、１６日目に凍結保存したｍＤＡ前駆体は、解凍および非ヒト霊長類への移植後６週間生存した。移植後の移植片は、移植コアから堅固な線維伸長を示し、また典型的なｍＤＡ形態も示した。

５．発明の詳細な説明
本開示の主題は、ヒト幹細胞の中脳ドーパミン（ｍＤＡ）細胞またはその前駆体の１種または複数のマーカーを発現する細胞への分化を誘導するための方法、このようなマーカーを発現する細胞の組成物、および神経変性障害を処置するための方法に関する。

限定としてではなく、開示の明確性を目的として、詳細な説明は以下の小項目に分割される：
５．１．定義；
５．２．幹細胞を分化させる方法；
５．３．神経変性障害を処置する方法；および
５．４．キット。

５．１ 定義
この明細書において使用される用語は、一般に、この発明の文脈の中で、および各用語が使用される具体的な文脈で、当技術分野における通常の意味を有する。ある特定の用語については、本発明の組成物および方法ならびに本発明の組成物の作製方法および使用方法を説明する際に、専門家にさらなるガイダンスを与えるために、以下で、または本明細書の他の場所で論じられる。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、部分的に特定の値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの限界に応じて、当業者によって決定されるその値に対する許容される誤差範囲を意味する。例えば、「約」は、当技術分野の実施によって、３または３超の標準偏差内を意味する場合がある。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、例えば１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味する場合がある。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスについて、この用語は、例えば値の５倍以内または２倍以内といった１桁内を意味する。

本明細書で使用する場合、「シグナルトランスダクションタンパク質」に関する用語「シグナル伝達」は、活性化されるかまたはそうでなければ、膜受容体タンパク質へのリガンド結合もしくはいくつかの他の刺激によって影響を受けるタンパク質を指す。シグナルトランスダクションタンパク質の例として、これらに限定されないが、ＳＭＡＤ、ベータ−カテニンを含むウィングレス（Ｗｎｔ）複合体タンパク質、ＮＯＴＣＨ、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が挙げられる。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質に関して、リガンド−受容体相互作用は、細胞の応答に直接的には結び付かない。リガンドによって活性化された受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理学的効果が生じる前に、細胞の内部で他のタンパク質とまず相互作用しうる。いくつかの相互作用する細胞タンパク質の鎖の挙動はしばしば、受容体活性化または阻害後に変更される。受容体活性化によって誘導される細胞変化一式が、シグナルトランスダクション機構またはシグナル伝達経路と称される。

本明細書で使用される場合、用語「シグナル」は、細胞構造および機能における変化を制御する内部および外部因子を指す。これらは、本質的に化学的であっても物理的であってもよい。

本明細書で使用される場合、用語「リガンド」は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば形質転換成長因子−ベータ（ＴＦＧβ）、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。

「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げる（例えば、低減させる、減少させる、抑制する、排除する、または遮断する）化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。阻害剤は、一例として、ＳＭＡＤシグナル伝達に直接接触すること、ＳＭＡＤｍＲＮＡに接触すること、ＳＭＡＤのコンフォメーションを変化させること、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、またはＳＭＡＤのシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されているものを含む）との相互作用を妨げること、およびＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されているもの）の発現に影響を及ぼすことによって、特定のタンパク質（シグナル伝達分子、特定のシグナル伝達分子に関与する任意の分子、特定の関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、これらに限定されないが、本明細書に記載されているシグナル伝達分子を含む）の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子でありうる。阻害剤は、シグナル伝達分子を上流で妨害することによって、生物活性、例えばＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子も含む（例えば、細胞外ドメイン内でのシグナル伝達分子と効果の例として以下が挙げられる：骨形成タンパク質を捕捉するノギンは、ＡＬＫ受容体１、２、３、および６の活性化を阻害し、したがって下流でＳＭＡＤ活性化を防止する。さらに、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎは、同様に、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化剤を捕捉する。Ｂａｍｂｉ、膜貫通タンパク質も、細胞外ＴＧＦｂシグナル伝達分子を捕捉する偽受容体として作用する）。上流または下流でタンパク質を遮断する抗体は、タンパク質のシグナル伝達の細胞外活性化剤などを中和するために使用することが企図される。阻害剤は、特定のシグナル伝達分子の上流で分子に結合して影響を及ぼし、順次、特定の分子の阻害を引き起こすことによって誘導される阻害に加えて、競合阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除するかまたは低減させるように活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（タンパク質のコンフォメーションを変化させるようにタンパク質に結合して、そのタンパク質の活性部位への化合物の結合を妨げる）に関して記載されている。阻害剤は、シグナル伝達の標的と実際に接触することによって、シグナル伝達の標的またはシグナル伝達の標的経路を阻害する「直接阻害剤」でありうる。

「活性化剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能、例えばＷｎｔシグナル伝達、ＳＨＨシグナル伝達などの活性化を増大させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、または増強する化合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「誘導体」は、類似するコア構造を有する化学化合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」または「細胞集団」は、少なくとも２個の細胞の群を指す。非限定例では、細胞集団は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００個の細胞を含むことができる。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団、例えば中脳ＤＡ前駆体の集団、または未分化幹細胞の集団であってもよい。あるいは、集団は、２種以上の細胞型を含んでもよい（例えば、混合細胞集団）。

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、培養下で無期限に分裂して、特化した細胞を生じる能力を有する細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」および「ＥＳＣ」は、培養下で長期間分化せずに分裂することができる移植前の段階の胚から誘導され、３つの一次胚葉の細胞および組織に発生することが知られている原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトの胚に由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」は、培養下で長期間分化せずに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発生することが知られている、初期段階のヒト胚から胚盤胞期までおよび胚盤胞期を含む胚から誘導される１種の多能性幹細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞株」は、数日、数カ月から数年までの間、分化せずに増殖可能であるｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。

本明細書で使用される場合、用語「全能性」は、体の全ての細胞型、および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じる能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「多分化能」は、体の２種以上の細胞型に発生する能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「多能性」は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む生物の発生における３つの胚葉に発生する能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、ある特定の胚性遺伝子（例えば、これらに限定されないが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年）を参照のこと）を体細胞に導入することによって形成された１種の多能性幹細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「体細胞」は、配偶子（卵子または精子）以外の体内の任意の細胞を指し、「成体」細胞と称されることもある。

本明細書で使用される場合、用語「体性（成体）幹細胞」は、自己再生（実験室における）と分化の両方に対する能力が制限された多くの器官および分化した組織において見られる比較的稀な未分化細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ニューロン」は神経系の主な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体とその突起、すなわち軸索と１つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって、情報を他のニューロンまたは細胞に伝達する。

本明細書で使用される場合、用語「増殖」は、細胞数の増加を指す。

本明細書で使用される場合、用語「未分化」は、特化した細胞型に未だ発生していない細胞を指す。

本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特化していない胚性細胞が、ニューロン、心臓、肝臓、または筋肉細胞などの特化した細胞の特徴を獲得する工程を指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれたタンパク質に関与するシグナル伝達経路を通って、細胞の遺伝子と細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御されている。

本明細書で使用される場合、用語「誘導された分化」は、神経、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉の前駆体などの特定の（例えば、所望の）細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。

本明細書で使用される場合、幹細胞に関する用語「誘導された分化」は、多能性状態からより成熟したまたは特化した細胞運命への幹細胞の遷移を促進する小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。

本明細書で使用される場合、細胞に関する用語「分化を誘導する」は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって、「幹細胞における分化を誘導すること」は、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子解析によって決定される遺伝子発現における変化）および／または表現型（例えば、中脳ＤＡ細胞、またはその前駆体、例えばＥＮ−１、ＯＴＸ２、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、およびＬＬＭＸ１Ａのタンパク質マーカーの発現における変化）を有する子孫細胞へ分裂するように幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を誘導することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「細胞培養」は、研究または医学的処置のための人工培地におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。

本明細書で使用される場合、用語「培養培地」は、培養容器、例えばペトリ皿、マルチウェルプレートなどにおいて細胞を覆い、細胞を養い、支持する栄養物を含有する液体を指す。培養培地は、細胞において所望の変化をもたらすために添加される成長因子も含む。

本明細書で使用される場合、用語、細胞（複数可）を化合物（例えば、１種または複数の阻害剤、活性化剤、および／または誘導剤）と「接触させること」は、細胞（複数可）を化合物にアクセス可能にする位置に化合物を提供することを指す。接触させることは、任意の適切な方法を使用して達成される。例えば、接触させることは、濃縮形態の化合物を、細胞培養の状況下で、所望の濃度を達成するために、細胞または細胞の集団に添加することによって達成されうる。接触させることは、化合物を配合培養培地の構成成分として含むことによっても達成される。

本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。例示されるｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、これらに限定されないが、試験管および細胞培養である。

本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で起こるプロセスまたは反応、例えば胚発生、細胞分化、神経管形成などを指す。

本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する用語「発現すること」は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察することができるｍＲＮＡまたはタンパク質を作製することを指す。

本明細書で使用される場合、用語「マーカー」または「細胞マーカー」は、特定の細胞または細胞型を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞に対するマーカーは、１種のマーカーに限定されず、マーカーは、指定されたマーカー群が、別の細胞または細胞型からある細胞または細胞型を特定することができるようなマーカーの「パターン」を指す場合がある。

本明細書で使用される場合、本明細書で開示されている任意の細胞に言及した場合の用語「から誘導される」または「から確立される」または「から分化させる」は、任意の操作、例えば、限定せずに、単細胞単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルス感染、ＤＮＡ配列を用いる、例えばモルフォゲンなどを用いるトランスフェクション、培養された親細胞に含有される任意の細胞の選択（例えば、連続培養による）を使用する処置および／または変異誘発を使用して、細胞株、組織（例えば、解離させた胚）、または体液における最終的な親細胞から得られた（例えば、単離された、精製されたなど）細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子に対する応答、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などにより、混合集団から選択されうる。

本明細書における「個体」または「被験体」は、脊椎動物、例えばヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物として、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、競技動物、げっ歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定例として、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、細胞、組織、または器官の通常の機能に損傷を与えるかまたはそれらを妨げる任意の状態または障害を指す。

本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」は、処置される個体または細胞の疾患経過を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防としてかまたは臨床病理の経過中にのいずれかで実施されうる。処置の治療効果として、限定されず、疾患の発生または再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的なまたは間接的な病理学的帰結の減弱、転移を予防すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）または軽減、および寛解または改善された予後が挙げられる。疾患または障害の進行を予防することによって、処置によって、罹患したもしくは診断された被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害に起因する悪化が予防されうるが、処置によって、障害のリスクを有する被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害または障害の症状の発症も予防することができる。

５．２ 幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、少なくとも一部は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化、およびウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化を伴う、ＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害（例えば、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達およびＢＭＰシグナル伝達の阻害による）であって、Ｗｎｔ活性化化合物の濃度を、細胞のＳＭＡＤ阻害剤、ＳＨＨ活性化剤、およびＷｎｔ活性化剤への最初の接触の約４日後に増加させる二重阻害によって、中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロン、およびその前駆体をヒト幹細胞から分化させることができるという発見に基づく。ある特定の非限定的実施形態では、Ｗｎｔ活性化化合物の濃度における前記増加は、前記増加の前のＷｎｔ活性化化合物の濃度の約４００％〜１０００％であってよい。ある特定の非限定的実施形態では、Ｗｎｔ活性化剤の前記より高い濃度は、少なくとも約７または８日間維持されうる。ある特定の非限定的実施形態では、Ｗｎｔ活性化における増加は、第２のまたはそれを超えるＷｎｔ活性化剤を添加することによって達成される。細胞は、中脳ＤＡ系列特異的活性化剤および阻害剤、例えばＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、ＴＧＦβ、ＡＡ、およびＤＡＰＴとさらに接触させることができる。ある特定の非限定的実施形態では、増加したＷｎｔ活性化剤の濃度の有効量は、Ｗｎｔ活性化剤と接触させた細胞の集団におけるＰＡＸ６発現の検出可能なレベルを低減させる濃度である。ある特定の非限定的実施形態では、ＰＡＸ６発現は、細胞の集団において検出不可能である。

本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定例として、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化の可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。

本出願によって記載されている方法に従って使用することができる幹細胞の非限定例として、ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類の非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性多能性細胞および操作された多能性細胞も挙げられる。

ある特定の非限定的実施形態では、幹細胞またはその子孫細胞は、導入された異種核酸を含有し、前記核酸は、所望の核酸またはタンパク質産物をコードしてもよく、情報としての価値を有してもよい（例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第６，３１２，９１１号を参照のこと）。所望のタンパク質産物の非限定例として、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化研究により検出可能なマーカー、例えばこれらに限定されないが、受容体またはヒトのナトリウムヨウ素共輸送体などの他の細胞膜タンパク質が挙げられる。

マーカーの非限定例として、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ））、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、酵素（例えば、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼ）、ならびに抗原分子がさらに挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」は、着色したタンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質またはベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素などの容易に検出可能なまたは容易にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸を含む遺伝子構築物を指す。ある特定の実施形態では、レポーターは、ｍＤＡマーカー遺伝子の組換えプロモーター、例えばＴＨおよび／またはＥｎ−１によって駆動されうる。

ある特定の非限定的実施形態では、幹細胞、またはその前駆細胞は、細胞の代謝プロセス、例えば、グルコース代謝および／またはコリン代謝を上昇または低下させる導入された異種核酸を含有し、ここで、細胞は、変更された代謝活性により、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで画像化されうる。

ある特定の実施形態では、本開示の分化方法は、ヒト幹細胞の集団を、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害をもたらす形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｎｏｄａｌ、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、またはそれらのシグナル経路を受容体および下流のエフェクターを遮断することによって遮断する。ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤の非限定例は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１０／０９６４９６、ＷＯ／２０１１／１４９７６２、ＷＯ／２０１３／０６７３６２、ＷＯ／２０１４／１７６６０６、ＷＯ／２０１５／０７７６４８、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年３月；２７巻（３号）：２７５〜８０頁、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁、およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年７月１日；３０巻（７号）：７１５〜２０頁（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＳＢ４３１５４２」は、番号がＣＡＳ３０１８３６−４１−９、分子式がＣ_２２Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_３、名称が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドである分子を指す。例えば、以下の構造を参照のこと：

本開示の分化方法は、ヒト幹細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害をもたらすＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させることをさらに含む。ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤の非限定例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年３月；２７巻（３号）：２７５〜８０頁、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁、およびＣｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年７月１日；３０巻（７号）：７１５〜２０頁に開示されている。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＬＤＮ１９３１８９」は、小分子ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン、を指し、化学式Ｃ_２５Ｈ_２２Ｎ_６を有し、以下の式を有する。

ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９は、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤でもあり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナル、ならびにそれに続くＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化を含む複数の生物シグナルの伝達の阻害をもたらす（参照により本明細書に組み込まれるＹｕら、（２００８年）Ｎａｔ Ｍｅｄ １４巻：１３６３〜１３６９頁；Ｃｕｎｙら（２００８年）Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １８巻：４３８８〜４３９２頁）。

本開示の分化方法は、ヒト幹細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させることをさらに含む。本明細書で使用される場合、リガンドに関する用語「ＷＮＴ」または「ウィングレス」はＷＮＴ受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーにおける受容体など、ＷＮＴ受容体と相互作用することができる分泌タンパク質（すなわち、ヒトにおけるＩｎｔｌ（インテグレーション１））の群を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関する用語「ＷＮＴ」または「ウィングレス」は、β−カテニンで媒介されるかまたはβ−カテニンを有さないＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体など、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体から構成されるシグナル経路を指す。本明細書に記載されている目的として、好ましいＷＮＴシグナル伝達経路は、β−カテニン、例えばＷＮＴ／−カテニンによる媒介を含む。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化に対するＧＳＫ３βを低下させる。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤であってよい。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣａｄｉｇａｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００６年；１１９巻：３９５〜４０２頁；Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． ２００７年；１９巻：６５９〜６７１頁を参照されたい。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｂｌｅら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００３年；１１６巻：１１７５〜１１８６頁を参照されたい。

Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定例は、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１１／１４９７６２、ＷＯ１３／０６７３６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２年７月１日；３０巻（７号）：７１５〜２０頁、Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁、およびＣａｌｄｅｒら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」としても公知）は、ＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指し、以下の式を有する。

ＣＨＩＲ９９０２１は、選択性が高く、関連するおよび関連しないキナーゼのパネルに対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭおよびげっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値を有する。

ある特定の非限定的実施形態では、本明細書に記載されている細胞の集団を、約０．００１から２μＭの間、または約０．０１から１．５μＭの間、または約０．１から１μＭの間、または約０．５から０．８μＭの間、または約０．７μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１の初期濃度で接触させ、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、本明細書に記載されているように、例えば、細胞のＣＨＩＲ９９０２１への最初の接触の約４日後に、約２から１５μＭの間、または約３から１４μＭの間、または約４から１３μＭの間、または約５から１２μＭの間、または約６から１１μＭの間、または約７から１０μＭの間、または約８から９μＭの間、または約３から１０μＭの間、または約５から１０μＭの間、または約３μＭ、または約７．５μＭまで増加させる。

本開示の分化方法は、ヒト幹細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させることをさらに含む。本明細書で使用する場合、用語「ソニックヘッジホッグ」、「ＳＨＨ」、または「Ｓｈｈ」は、ヘッジホッグと称され、別のものはデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ）であり、一方、３つ目はインディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ）である、哺乳動物のシグナル伝達経路ファミリーにおける少なくとも３つのタンパク質のうちの１つであるタンパク質を指す。Ｓｈｈは、膜貫通分子であるＰａｔｃｈｅｄ（ＰＴＣ）およびＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）と相互作用することによって少なくとも２種の膜貫通タンパク質と相互作用する。Ｓｈｈは、典型的には、ＰＴＣに結合し、次いで、シグナルトランスデューサーとしてＳＭＯの活性化を可能にする。ＳＨＨの非存在下では、ＰＴＣは典型的にはＳＭＯを阻害し、順次、ある特定の遺伝子の転写が起こらないように転写抑制因子を活性化する。Ｓｈｈが存在し、ＰＴＣに結合する場合、ＰＴＣは、ＳＭＯの機能を妨げることはできない。ＳＭＯが阻害されないと、ある特定のタンパク質が核に侵入し、ある特定の遺伝子の活性化を可能にする転写因子として作用することができる（Ｇｉｌｂｅｒｔ、２０００年 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと）。ある特定の実施形態では、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化剤は、ＰＴＣまたはＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストなどに結合する分子または化合物を含む、ＳＨＨシグナル伝達経路を活性化する任意の分子または化合物を指す。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定例は、ＷＯ１０／０９６４９６、ＷＯ１３／０６７３６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年３月；２７巻（３号）：２７５〜８０頁、およびＫｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁に開示されている。このような化合物の例は、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、タンパク質ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ（すなわち、ＳＨＨを活性化するためにＳＨＨ受容体に結合することができる全長マウスソニックヘッジホッグタンパク質の組換えＮ−Ｔ末端断片、例えばＲ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓのカタログ番号：４６４−５Ｈ−０２５／ＣＦ）および小分子Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト、例えばパルモルファミンなどである。

ある特定の実施形態では、上述の阻害剤および活性化剤は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地として、これらに限定されないが、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」）培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地（ＮＢ）、Ｎ２培地、Ｂ−２７培地、およびＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ＫＳＲ培地、ＮＢ培地、Ｎ２培地、Ｂ−２７培地、およびＥ８／Ｅ６培地は市販されている。ＫＳＲ培地は、培養下で未分化ｈＥＳＣ細胞を成長させ維持するために最適化された規定の血清不含配合物である。

ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。ＫＳＲ培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ、および１３−メルカプトエタノールを含む。ある特定の実施形態では、１リットルのＫＳＲ培地は、８２０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、１５０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１０ｍＬの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ、および５５μＭの１３−メルカプトエタノールを含む。

ある特定の実施形態では、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、およびＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、およびＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。

ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および増殖を支持するフィーダーフリーおよび異種成分不含（ｘｅｎｏ ｆｒｅｅ）培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞再プログラミングを支持することが判明した。さらにＥ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣの培養に対するカスタム培地の配合物のベースとして使用することができる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれるＣｈｅｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１年５月；８巻（５号）：４２４〜９頁に記載されている。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ１５／０７７６４８に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン（ｓｅｌｅｎｕｍ）、インスリン、ＮａＨＣＯ_３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が、活性ＢＭＰまたはＷｎｔ成分を含まない点でＫＳＲ培地と異なる。したがって、ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６培地が、本開示の幹細胞の集団を培養して固有受容器の集団に分化させるために使用される場合、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（例えば、ＢＭＰを阻害するもの）は、Ｅ８／Ｅ６培地に添加される必要がない。ある特定の実施形態では、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、およびＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、およびＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰが、培地にさらに添加される場合がある。

ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ヒト幹細胞の中脳ＤＡニューロン、またはその前駆体への分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、およびＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と、例えば、これらの阻害剤を、同日に、幹細胞を含む細胞培養培地に添加することによって、同時に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤の濃度は、細胞をＷｎｔ活性化剤と最初に接触させてから少なくとも約２、３、４、５または６日後に増加させる。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、少なくとも約４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数の間、例えば約４から１０日の間、または約５から９日の間、または約６から８日の間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数までの間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約７日間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、０日目〜１０日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に、毎日または隔日で添加される（例えば、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、および１０日目に添加される）。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、０、１、３、４、および６日目に添加される。

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約１から２０μＭの間、または約２から１９μＭの間、または約３から１８μＭの間、または約４から１７μＭの間、または約５から１６μＭの間、または約６から１５μＭの間、または約７から１４μＭの間、または約８から１３μＭの間、または約９から１２μＭの間、または約１０から１１μＭの間、およびその間の値の濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約７、８、９、１０、１１、１２、または１３μＭの濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約１０．８μＭの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、少なくとも約４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数の間、例えば約４から１０日の間、または約５から９日の間、または約６から８日の間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数までの間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約７日間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、０日目〜１０日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に、毎日または隔日で添加される（例えば、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、および１０日目に添加される）。ある特定の実施形態では、１種または複数の阻害剤は、０、１、３、４、および６日目に添加される。

ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約５０から５００ｎＭの間、または約７５から４７５ｎＭの間、または約１００から４５０ｎＭの間、または約１２５から４２５ｎＭの間、または約１５０から４００ｎＭの間、または約１７５から３７５ｎＭの間、または約２００から３５０ｎＭの間、または約２２５から３２５ｎＭの間、または約２５０から３００ｎＭの間、およびその間の値の濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約１５０、２００、２５０、３００、または３５０ｎＭの濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、約２５０ｎＭの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、少なくとも約４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数の間、例えば約４から１０日の間、または約５から９日の間、または約６から８日の間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数までの間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約７日間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、０日目〜１０日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に、毎日または隔日で添加される（例えば、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、および１０日目に添加される）。ある特定の実施形態では、１種または複数の阻害剤は、０、１、３、４、および６日目に添加される。

ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約５０から１０００ｎｇ／ｍＬの間、または約１００から９５０ｎｇ／ｍＬの間、または約１５０から９００ｎｇ／ｍＬの間、または約２００から８５０ｎｇ／ｍＬの間、または約２５０から８００ｎｇ／ｍＬの間、または約３００から７５０ｎｇ／ｍＬの間、または約３５０から７００ｎｇ／ｍＬの間、または約４００から６５０ｎｇ／ｍＬの間、または約４５０から６００ｎｇ／ｍＬの間、または約５００から５５０ｎｇ／ｍＬの間、およびその間の値の濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約４００、４５０、５００、５５０、または６００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態ではＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約５００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０またはそれを超える日数の間、例えば約４から２０日の間、または約４から１９日の間、または約４から１８日の間、または約４から１７日の間、または約４から１６日の間、または約４から１５日の間、または約４から１４日の間、または約４から１３日の間、または約４から１２日の間、または約４から１１日の間、または約４から１０日の間、または約４から９日の間、または約４から８日の間、または約４から７日の間、または約４から６日の間、または約５から１９日の間、または約６から１７日の間、または約７から１６日の間、または約８から１５日の間、または約９から１４日の間、または約１０から１３日の間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０またはそれを超える日数までの間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約１２日間、細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤は、０日目〜１２日目まで、幹細胞を含む細胞培養培地に、毎日または隔日で添加される（例えば、０日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、および１２日目に添加される）。ある特定の実施形態では、１種または複数の阻害剤は、０、１、３、４、６、７、９、１０、および１１日目に添加される。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約０．０５から１５μＭの間、または約０．１から１４μＭの間、または約０．５から１３μＭの間、または約１から１２μＭの間、または約１．５から１１μＭの間、または約２から１０μＭの間、または約２．５から９．５μＭの間、または約３から９μＭの間、または約３．５から８．５μＭの間、または約４から８μＭの間、または約４．５から７．５μＭの間、または約５から７μＭの間、または約５．５から６．５μＭの間、およびその間の値の濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１μＭの濃度で細胞に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤を、約０．７μＭの濃度で細胞に接触させる。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、細胞をＷｎｔ活性化剤と最初に接触させてから少なくとも約２、３、４、５または６日後、例えば約２から１０日の間、または約３から９日の間、または約４から８日の間、または約５から７日の間に増加させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、細胞をＷｎｔ活性化剤と最初に接触させてから約２、３、４、５または６日後までに増加させる。ある特定の実施形態では、細胞を、増加した濃度のＷｎｔ活性化剤と、少なくとも約４、５、６、７、８、９、もしくは１０日またはそれを超える間、例えば、約４から２０日の間、または約５から１９日の間、または約６から１８日の間、または約７から１７日の間、または約８から１６日の間、または約９から１５日の間、または約８から１４日の間、または約９から１３日の間、または約１０から１２日の間、接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、増加した濃度のＷｎｔ活性化剤と、約４、５、６、７、８、９、もしくは１０日またはそれを超えるまでの間、接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、増加した濃度のＷｎｔ活性化剤と、約５、６、７、８、９、１０、または１１日の間、接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、増加した濃度のＷｎｔ活性化剤と、約８日間接触させる。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、約２から１５μＭの間、または約３から１４μＭの間、または約４から１３μＭの間、または約５から１２μＭの間、または約６から１１μＭの間、または約７から１０μＭの間、または約８から９μＭの間の濃度まで増加される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、約３から１０μＭの間、または約５から１０μＭの間の濃度まで増加される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、約３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０μＭの濃度まで増加される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、約３μＭの濃度まで増加される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、約７．５μＭの濃度まで増加される。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、細胞に接触させた初期濃度から、約５０から２０００％の間、または約１００から１９５０％の間、または約１５０から１９００％の間、または約２００から１８５０％の間、または約２５０から１８００％の間、または約３００から１７５０％の間、または約３５０から１７００％の間、または約４００から１６５０％の間、または約４５０から１６００％の間、または約５００から１５５０％の間、または約５５０から１５００％の間、または約６００から１４５０％の間、または約６５０から１４００％の間、または約７００から１３５０％の間、または約７５０から１３００％の間、または約８００から１２５０％の間、または約８５０から１２００％の間、または約９００から１１５０％の間、または約９５０から１１００％の間、または約１０００から１０５０％、およびその間の値、増加させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、細胞に接触させた初期濃度から、約４００から１４５０％の間、または約７００から１０５０％の間、およびその間の値、増加される。

ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤の濃度は、細胞に接触させた初期濃度から、約４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％、１０５０％、もしくは１１００％またはそれを超えて増加される。

特定の非限定的実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（すなわち、第１のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば約１０．８μＭの濃度のＳＢ４３１５４２、ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（すなわち、第２のＳＭＡＤ阻害剤）、例えば約２５０ｎＭの濃度のＬＤＮ１９３１８９、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、例えば０．７μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１、および約５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と接触させ、ここで、細胞は、約７日間（すなわち、培養の０日目から６日目まで）阻害剤と接触させ、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、細胞培養の４日目に、３μＭまたは７．５μＭまで増加させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤と約１１日間（すなわち、培養の０日目〜１１日目）接触させ、細胞を、細胞培養の４日目から１１日目に７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させるか、または細胞を、培養の４日目から９日目に７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させ、次いで細胞培養の１０日目から１１日目に３μＭのＣＨＩＲ９９０２１と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１（ＥＮ−１）、ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅホメオボックス２（ＯＴＸ２）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、およびＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）の１種または複数の発現の検出可能なレベルを上昇させるのに有効な濃度および時間で、本明細書に記載されている活性化剤および阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ニューロン特異的クラスＩＩＩ型ベータ−チューブリン（Ｔｕｊ１）、トレフォイルファクターファミリー３（ＴＴＦ３）、ペアード様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ 複合体（ＡＳＣＬ）、早期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ−１）、早期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ−３）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、シナプシン、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、およびＧタンパク質共役内向き整流性カリウムチャネル（Ｋｉｒ３．２／ＧＩＲＫ２）、ＣＤ１４２、ＤＣＳＭ１、ＣＤ６３および／またはＣＤ９９の１種または複数の発現の検出可能なレベルを上昇させるのに有効な濃度および時間で、本明細書に記載されている活性化剤および阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＤＡニューロンのマーカーの１種または複数、例えばＣＤ１４２の発現の検出可能なレベルを上昇させるのに有効な濃度および時間で、本明細書に記載されている活性化剤および阻害剤と接触させ、ここで、細胞はＡ９型ニューロン細胞である。

ある特定の実施形態では、細胞を、ペアードボックスタンパク質（ＰＡＸ６）およびＫｉ６７の発現を低下させるのに有効な濃度および時間で、本明細書に記載されている活性化剤および阻害剤と接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＤＡニューロン系列特異的活性化剤および阻害剤、例えば、Ｌ−グルタミン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ、例えばＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、およびＤＡＰＴ（Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル）グリシン−１，１−ジメチレニルエステル；ＬＹ−３７４９７３、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；またはＮ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルとしても公知である）とさらに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、上述のＤＡニューロン系列特異的活性化剤および阻害剤と、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数の間、例えば約２から２０日の間、約３から１９日の間、約４から１８日の間、約５から１７日の間、約６から１６日の間、約７から１５日の間、約８から１５日の間、約９から１４日の間、または約１０から１３日の間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、上述のＤＡニューロン系列特異的活性化剤および阻害剤と、約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれを超える日数までの間接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、上述のＤＡニューロン系列特異的活性化剤および阻害剤と、約４、５、６、７、または８日間接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、Ｌ−グルタミンと、約０．５から５ｍＭの間、または約１から４ｍＭの間、または約１．５から３ｍＭの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、Ｌ−グルタミンと、約２ｍＭの濃度で接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＢＤＮＦと、約５から５０ｎｇ／ｍＬの間、または約１０から４０ｎｇ／ｍＬの間、または約１５から３０ｎｇ／ｍＬの間、または約１８から２５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＢＤＮＦと、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＡＡと、約５０から５００ｎＭの間、または約１００から４００ｎＭの間、または約１５０から３００ｎＭの間、または約１８０から２５０ｎＭの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＡＡと、約２００ｎＭの濃度で接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＧＤＮＦと、約５から５０ｎｇ／ｍＬの間、または約１０から４０ｎｇ／ｍＬの間、または約１５から３０ｎｇ／ｍＬの間、または約１８から２５ｎｇ／ｍＬの間の濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＧＤＮＦと約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ｃＡＭＰと、約２００から８００ｎＭの間、または約２５０から７５０ｎＭの間、または約３００から７００ｎＭの間、または約３５０から６５０ｎＭの間、または約４００から６００ｎＭの間、または約４５０から５５０ｎＭの濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ｃＡＭＰと、約５００ｎＭの濃度で接触させる。

ある特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ３と、約０．０１から５ｎｇ／ｍＬの間、または約０．０５から４ｎｇ／ｍＬの間、または約０．１から３ｎｇ／ｍＬの間、または約０．５から２ｎｇ／ｍＬ濃度で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ３と、約１ｎｇ／ｍＬの濃度で接触させる。

ある特定の実施形態では、分化した中脳ＤＡ前駆体は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／００１０５１４号に記載されているようにさらに培養される。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って調製された細胞を、例えばフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ１４２発現、またはコリン作用性受容体（ＣＨＲＮＢ３）発現に基づいて選別、選択および単離することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法に従って調製された細胞を、ポリシアリルトランスフェラーゼ、例えば細菌のポリシアリルトランスフェラーゼ、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ_Ｎｍ）とさらに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、組換えポリシアリルトランスフェラーゼを発現する組換え細胞である。

５．３ 神経変性障害を処置する方法
中脳ＤＡニューロン、またはその前駆体（「幹細胞由来中脳ＤＡ前駆体」または「ｍＤＡ」前駆体とも称される）の１種または複数のマーカーを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を、神経変性障害を処置するために使用することができる。本開示の主題は、神経変性障害を処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来前駆体を、神経変性障害を患っている被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

神経変性障害の非限定例として、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、および多発性硬化症が挙げられる。

ある特定の実施形態では、神経変性障害はパーキンソン病である。パーキンソン病の主要な運動徴候として、例えばこれらに限定されないが、手、腕、足、顎および顔の震え、運動緩徐もしくは動きの緩慢さ、四肢体幹の硬直もしくはこわばり、および不安定な姿勢（ｐｏｓｔｕｒａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）または平衡および共調が損なわれることが挙げられる。

ある特定の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン症候群疾患（ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｄｉｓｅａｓｅ）であり、これは、運動を制御する脳の部分である基底核におけるドーパミンの不足に関連する疾患を指す。症状として、震え、運動緩徐（動きの極端な緩慢さ）、屈曲姿勢、不安定な姿勢、および硬直が挙げられる。パーキンソン症候群疾患の非限定例として、皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、および進行性核上性麻痺が挙げられる。

本開示の幹細胞由来前駆体は、神経変性障害を処置または予防するために、被験体に、全身的または直接的に投与または提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、目的の器官（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ））に直接注射される。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、線条体に直接注射される。

本開示の幹細胞由来前駆体は、任意の生理学的に許容されるビヒクルにおいて投与することができる。本開示の幹細胞由来前駆体および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来前駆体および前記細胞を含む医薬組成物は、局注、同所（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与によって投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体は、神経変性障害を患っている患者に、同所（ＯＴ）注射により投与することができる。

本開示の幹細胞由来前駆体および前記細胞を含む医薬組成物は、選択されたｐＨに緩衝されうる滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁物、エマルション、分散物、または粘性組成物として、都合よく提供することができる。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物より調製しやすい。さらに、液体組成物は、特に注射によって、投与するのに多少都合がよい。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間をもたらすのに適当な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でありうる担体を含むことができる。滅菌注射溶液は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来前駆体を含む組成物を、所望の様々な量の他の成分を含む必要量の適当な溶媒に組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤との混合物において存在してもよい。組成物は、凍結乾燥されてもよい。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化もしくは粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１７版、１９８５年などの標準教科書が、過度な実験を行うことなく適切な調製物を調製するために参考にされうる。

抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌状態を増強する種々の添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保される。注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本開示の幹細胞由来前駆体と適合性であるべきである。

必要であれば、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持することができる。容易かつ経済的に入手可能であり、容易に作用するため、メチルセルロースを使用することができる。他の適切な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて変わりうる。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適切な担体および他の添加剤の選択は、投与の正確な経路および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物が、液体、懸濁物、ゲルまたは別の液体形態、例えば時限放出形態（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍ）または液体充填形態に製剤化されることになるか否か）に依存して変わる。

当業者は、組成物の構成成分は、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来前駆体の生存度または有効性に影響を与えないことを認識している。このことは、化学および製薬分野の当業者（ｔｈｏｓｅ ｓｋｉｌｌｅｄ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）にとって課題を提示せず、すなわち、この開示および本明細書で引用された文書から、標準教科書を参照することにより、または簡単な実験（過度の実験を含まない）により、課題を容易に回避することができる。

ある特定の非限定的実施形態では、本明細書に記載されている細胞および前駆体は、生体適合性スキャホールドまたはマトリクス、例えば、細胞を被験体に植込むかまたは移植する際に、組織再生を促進する生体適合性三次元スキャホールドをさらに含む組成物中に含まれる。ある特定の非限定的実施形態では、生体適合性スキャホールドは、細胞外マトリクス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドまたはタンパク質、多糖類（フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースまたはゼラチン、および／またはヒドロゲルを含む）を含む。（例えば、そのそれぞれの内容が、全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照のこと。）ある特定の実施形態では、組成物は、中脳ＤＡ細胞に植込まれた／移植した細胞の成熟を促進するための成長因子をさらに含む。

本開示の幹細胞由来前駆体の治療用途に関する１つの検討事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適の効果として、これらに限定されないが、神経変性障害を患っている被験体のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳ領域の再増殖、ならびに／または被験体のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳの機能の改良が挙げられる。

「有効量」（または「治療有効量」）は、処置の際に有益な結果または所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１または複数の用量で被験体に投与することができる。処置について、有効量は、神経変性障害または下垂体障害の進行を和らげる、好転させる、安定化させる、反転させるもしくは遅延させる、または代わりに神経変性障害の病理学的帰結を低減するのに十分な量である。有効量は、一般的に、ケースバイケースを基本に医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。いくつかの因子が、典型的には、有効量を達成するために適当な投薬量を決定する際に考慮に入れられる。これらの因子として、被験体の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が挙げられる。

ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体の有効量は、神経変性障害を患っている被験体のＣＮＳおよび／またはＰＮＳ領域の再増殖に十分な量である。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来前駆体の有効量は、神経変性障害を患っている被験体のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能を改良するのに十分な量であり、例えば改良された機能は、通常のヒトのＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％でありうる。

投与される細胞の量は、処置される被験体に対して変化する。ある特定の実施形態では、約１×１０^４〜約１×１０^１０、約１×１０^４〜約１×１０^５、約１×１０^５〜約１×１０^９、約１×１０^５〜約１×１０^６、約１×１０^５〜約１×１０^７、約１×１０^６〜約１×１０^７、約１×１０^６〜約１×１０^８、約１×１０^７〜約１×１０^８、約１×１０^８〜約１×１０^９、約１×１０^８〜約１×１０^１０、または約１×１０^９〜約１×１０^１０の本開示の幹細胞由来前駆体が、被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０^５〜約１×１０^７の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０^６〜約１×１０^７の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害を患っている被験体に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０^６〜約４×１０^６の本開示の幹細胞由来前駆体が、神経変性障害を患っている被験体に投与される。検討される有効用量の正確な決定は、特定の被験体のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む各被験体に対する個々の因子に基づいてよい。投薬量は、この開示および当技術分野の知識から、当業者によって容易に確認されうる。

ある特定の実施形態では、神経変性障害を処置するために、神経変性障害を患っている被験体に投与される細胞は、本開示の幹細胞由来中脳ＤＡ前駆体から分化／成熟されたニューロンの集団である。

５．４ キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１種または複数の活性化剤、および（ｅ）幹細胞の、中脳ＤＡニューロン、またはその前駆体の１種または複数のマーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。

ある特定の実施形態では、キットは、ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を含まない。

ある特定の実施形態では、キットは、ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤をさらに含む。

ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、特異的な順序で、阻害剤、活性化剤および分子と接触させることを含む。阻害剤、活性化剤および分子を接触させる順序は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定することができる。

ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、本開示の方法によって記載されているように、阻害剤、活性化剤および分子と接触させることを含む（上掲の項目５．２を参照のこと）。

ある特定の実施形態では、本開示は、有効量の本開示の幹細胞由来前駆体の集団または前記前駆体を単位剤形で含む組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来の細胞は、成熟分化細胞、例えば中脳ＤＡニューロンである。ある特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、積層した紙、金属箔、または医薬を保持するために適切な他の材料から作製されうる。

ある特定の実施形態では、キットは、本開示の幹細胞由来前駆体またはそれを含む組成物の集団を、神経変性障害を患っている被験体に投与するための指示を含む。指示は、神経変性障害を処置または予防するための細胞または組成物の使用についての情報を含むことができる。ある特定の実施形態では、指示は、以下のもののうちの少なくとも１つを含む：治療剤についての記載、投薬スケジュールおよび神経変性障害もしくはその症状を処置もしくは予防するための投与、注意事項、警告、適応症、禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、過量投薬情報、有害反応、動物薬理学、臨床試験、および／または参照文献。指示は、容器（存在する場合）に直接、または容器に貼られたラベルとして、または容器の中もしくは容器と一緒に供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとして印刷されうる。

６．実施例
本開示の主題は、限定としてではなく、本開示の主題の例として提供される以下の実施例を参照してより理解される。

６．１ 実施例１：幹細胞由来中脳ドーパミン（ＤＡ）前駆細胞を調製する方法

概要
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、潜在的に、身体の任意の細胞型を生じることができる。長期的な目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全なヒトの系統樹を再現するためのストラテジーの開発である。本実施例は、ｈＥＳＣを中脳ドーパミンニューロン前駆体細胞に分化させるストラテジーについて記載し、ここで細胞は、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達阻害剤）、ＬＤＮ１９３１８９（ＢＭＰ／ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達を増大させるＧＳＫ３β阻害剤）を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）／Ｎ２培地（任意選択でＥ６培地を含むことができる）中で分化され、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、細胞を、成長因子と一緒に４または５日間最初に培養した後に増加させる（「ｂｕｍｐ」）。細胞を、濃度を増加させたＣＨＩＲ９９０２１と一緒に、７または８日間培養した。次いで、細胞を、ＤＡニューロン成長因子である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、およびＤＡＰＴと一緒に培養して、中脳ＤＡ前駆体を生成した。

方法
ｈＥＳＣを、分化の前に、Ｅ８／マトリゲル培地中で維持した。細胞を、以下の培養ストラテジーに従って、成長因子を補充したＮＢ／Ｎ２培地中で分化させた（細胞は、４日目の３μＭのｂｕｍｐかまたは５日目の７．５μＭのｂｕｍｐのいずれかを用いて培養した）。

３μＭｂｕｍｐのプロトコル（ＧＭＰ Ｖ２Ａ）
− ０日目（Ｄ０）：ｈＥＳＣを、Ｅ８／マトリゲル培地から以下の分化因子を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）／Ｎ２培地を含む分化培地に移した（Ｄ０培地は、細胞の生存を増強するために、１０μＭのＹ−２７６３２ ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）阻害剤も含んでいた）。細胞は、１ｍＬ当たり約２百万個の細胞の濃度であった：
・ ２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９
・ １０μＭのＳＢ４３１５４２
・ ５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ
・ ０．７μＭのＣＨＩＲ９９０２１

− Ｄ１：分化培地を、Ｙ−２７６３２を含まない新鮮な分化培地と交換した。

− Ｄ２：培地の交換なし。

− Ｄ３：Ｄ１に記載されたように交換した培地。

− Ｄ４：分化培地を、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む（Ｙ−２７６３２を含まない）新鮮な分化培地と交換した。

− Ｄ５：培地の交換なし。

− Ｄ６：Ｄ４に記載されたように交換した培地。

− Ｄ７：分化培地を、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を補充したＮＢ／Ｎ２を含む（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨまたはＹ−２７６３２は含まない）新鮮な培地と交換した。

− Ｄ８：培地の交換なし。

− Ｄ９：Ｄ７に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１０：培地を、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、ＴＧＦβ３、およびＡＡを含む新鮮なＮＢ／Ｂ２７培地と交換した。

− Ｄ１１：Ｄ１０に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１２：培地が、ＤＡＰＴをさらに含み、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないことを除いて、Ｄ１０に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１３〜Ｄ１９：Ｄ１２に記載されたように交換した培地。（培養期間は、Ｄ２７またはそれを超えるまでであり、Ｄ１７またはＤ１８に少なくとも１回の継代を含みうる。）

− Ｄ２０：細胞から培地を吸引し、細胞を洗浄してＮＢ培地に懸濁させ、次いで平板培養した。

− 次いで、細胞を、早期中脳ＤＡマーカーの組合せ：１）ＯＴＸ２／ＥＮ／ＬＭＸ１Ａならびに２）ＰＡＸ６／ＦＯＸＡ２／ＥＮ／およびＮＫＸ２．２もしくはＮＫＸ６．１、または後期中脳ＤＡマーカーの組合せ：１）ＴＨ／ＥＮ／ＦＯＸＡ２および２）ＬＭＸ１Ａ／ＯＴＸ２／ＮＵＲＲ１の発現について試験した。

− 細胞を、凍結保存またはマウスへの移植に供した。

− マウスへの移植のために、細胞を１５０，０００個／マイクロリットルの濃度でＨＢＳＳ＋ＨＥＰＰＥＳに懸濁させ、ここで、５〜６百万個の細胞を免疫不全マウスに移植した。

７．５μＭｂｕｍｐのプロトコル（ＧＭＰ Ｖ２Ｂ）
− ０日目（Ｄ０）：ｈＥＳＣを、Ｅ８／マトリゲル培地から以下の分化因子を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）／Ｎ２培地を含む分化培地に移した（Ｄ０培地は、細胞の生存を増強するために、１０μＭのＹ−２７６３２ ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）阻害剤も含んでいた）。細胞は、１ｍＬ当たり約２百万個の細胞の濃度であった：
・ ２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９
・ １０μＭのＳＢ４３１５４２
・ ５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ
・ ０．７μＭのＣＨＩＲ９９０２１

− Ｄ１：分化培地を、Ｙ−２７６３２を含まない新鮮な分化培地と交換した。

− Ｄ２：培地の交換なし。

− Ｄ３：Ｄ１に記載されたように交換した培地。

− Ｄ４：培地の交換なし。

− Ｄ５：分化培地を、７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む（Ｙ−２７６３２を含まない）新鮮な分化培地と交換した。

− Ｄ６：培地の交換なし。

− Ｄ７：分化培地を、７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を補充したＮＢ／Ｎ２を含む（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨまたはＹ−２７６３２は含まない）新鮮な培地と交換した。

− Ｄ８：培地の交換なし。

− Ｄ９：Ｄ７に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１０：培地を、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、ＴＧＦβ３、およびＡＡを含む新鮮なＮＢ／Ｂ２７培地と交換した。

− Ｄ１１：Ｄ１０に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１２：培地が、ＤＡＰＴをさらに含み、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないことを除いて、Ｄ１０に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１３〜Ｄ１９：Ｄ１２に記載されたように交換した培地。（培養期間は、Ｄ２７またはそれを超えるまでであり、Ｄ１７またはＤ１８に少なくとも１回の継代を含みうる。）

− Ｄ２０：細胞から培地を吸引し、細胞を洗浄してＮＢ培地に懸濁させ、次いで平板培養した。

− 細胞を、早期中脳ＤＡマーカーの組合せ：１）ＯＴＸ２／ＥＮ／ＬＭＸ１Ａならびに２）ＰＡＸ６／ＦＯＸＡ２／ＥＮ／およびＮＫＸ２．２もしくはＮＫＸ６．１、または後期中脳ＤＡマーカーの組合せ：１）ＴＨ／ＥＮ／ＦＯＸＡ２および２）ＬＭＸ１Ａ／ＯＴＸ２／ＮＵＲＲ１の発現について試験した。

− 細胞を、凍結保存またはマウスへの移植に供した。

− マウスへの移植のために、細胞を１５０，０００個／マイクロリットルの濃度でＨＢＳＳ＋ＨＥＰＰＥＳに懸濁させ、ここで、５〜６百万個の細胞を免疫不全マウスに移植した。

結果
Ｋｒｉｋｓら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１１年１１月６日；４８０巻（７３７８号）：５４７〜５１頁には、ＳＭＡＤ二重阻害、ＳＨＨ活性化、およびＷｎｔ活性化を含むＫＳＲ培地において細胞を培養することによって、中脳ＤＡ細胞へのｈＥＳＣの分化についてのプロトコルが記載されている（以下に記載されているように「ｂｕｍｐ」を含まない）。しかしながら、ＫＳＲ培地は規定されておらず、この分化プロトコルを使用して生成された細胞は、移植後にｉｎ ｖｉｖｏで不十分な役割しか果たさない。本実施例に従って分化させた細胞は、ＮＢ／Ｎ２培地においてＳＭＡＤ二重阻害（ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ１９３１８９による）、ＳＨＨ活性化およびＷｎｔ活性化を含む培養プロトコルを利用し、この培養プロトコルでは、Ｗｎｔの濃度は、培養のＤ４またはＤ５において、０．７μＭのベースライン濃度から５〜１０μＭの間まで増加させる（すなわち、Ｗｎｔ「ｂｕｍｐ」）。

図１に示すように、ＫＳＲ培地（Ｎｏｎ−ＧＭＰ）において、またはＥ８／ＮＢ／Ｎ２培地（ＧＭＰ Ｖ１）において、Ｋｒｉｋｓらに記載されている方法に従ってｈＥＳＣを分化させることにより、中脳ＤＡニューロンが生成されたが、他の脳領域のニューロンも生成された。Ｄ４〜Ｄ１０において７．５μＭ（または５〜１０μＭ）のＷｎｔ ｂｕｍｐを利用する本実施例の方法によるＥ８／ＮＢ／Ｎ２培地で細胞を培養した場合、中脳ＤＡ細胞が特異的に生成された。

図２に示すように、ＫＳＲ培地（Ｎｏｎ−ＧＭＰ）において、またはＥ８／ＮＢ／Ｎ２培地（ＧＭＰ Ｖ１）において、Ｋｒｉｋｓらに記載されている方法に従ってｈＥＳＣを分化させることにより、同様のレベルのＰＡＸ６、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、およびＬＭＸ１Ａを発現する細胞が、両者共に生成された。しかしながら、いずれかの培地を使用して生成された細胞は、げっ歯類に移植された場合に、不十分な生存しか示さなかった。

Ｅ８／ＮＢ／Ｎ２培地および３μＭ（ＧＭＰ Ｖ２Ａ）または７．５μＭ（ＧＭＰ Ｖ２Ｂ）のＷｎｔ ｂｕｍｐを使用して、ｈＥＳＣを分化させた場合、細胞はまた、ＫＳＲ（Ｎｏｎ−ＧＭＰ）またはＥ８／ＮＢ／Ｎ２（ＧＭＰ Ｖ１）を使用するＫｒｉｋｓらのプロトコルと同様のレベルのＰＡＸ６、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２、およびＬＭＸ１Ａを発現した。しかしながら、ＧＭＰ Ｖ２ＡまたはＧＭＰ Ｖ２Ｂプロトコルに従って分化させた細胞は、より高レベルの中脳ＤＡマーカーＥＮ−１を発現した（図３）。図４は、分化細胞を特定するために使用することができる他の中脳ＤＡマーカーについて記載する。

Ｅ８／ＮＢ／Ｎ２培地におけるＫｒｉｋｓらのプロトコルを使用して分化させたｈＥＳＣは、２５日間の分化および損傷していない、免疫無防備状態のマウスへの移植後に、ｉｎ ｖｉｖｏでＨｎｃａｍ、ＦＯＸＡ２、およびＴＨを発現するＤＡ細胞について良好な生存をもたらすことがあった。移植の４週間後に移植片を調査した。しかしながら、細胞は、ＰＡＸ６についても陽性であり、神経前駆状態を示す、Ｈｎｃａｍ発現の密なパッチを示した（図５）。ＧＭＰ Ｖ２Ａ（３μＭのｂｕｍｐ）またはＧＭＰ Ｖ２Ｂ（７．５μＭのｂｕｍｐ）に従って培養したｈＥＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、レベルが増加したＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａ、ＥＮ−１、およびＴＨを発現するＤＡ細胞を生成し（図６Ａ）、ＰＡＸ６を発現しなかった（図７）。さらに、損傷していない、免疫無防備状態のマウスの線条体に移植された、ＧＭＰ Ｖ２Ｂ（７．５μＭのｂｕｍｐ）プロトコルを使用して分化させた中脳ＤＡ細胞は、移植の３週間後に、線維伸長の増大とｈＮＣＡＭおよびＴＨの発現を示し、Ｈｎｃａｍパッチを有さなかった（図６Ｂ）。さらに、移植前に、細胞を凍結保存した場合、細胞は、前もって凍結保存しなかったマウスに移植した細胞の線維伸長と同様の線維伸長を示した（図８）。

図９Ａ〜Ｂに示すように、ＧＭＰ Ｖ２ＡまたはＧＭＰ Ｖ２Ｂプロトコルに従って調製した細胞は、ＣＤ１４２発現に基づいて成功裏に選別することができる。さらに、ＫＳＲ培地においてＫｒｉｋｓらに記載されている方法に従って培養し、ＣＤ１４２発現に基づいて選別された中脳ＤＡ細胞を、マウスおよび非ヒト霊長類に移植した。図１０Ａ〜Ｂに示すように、これらの細胞は、マウス（移植後３０日）および非ヒト霊長類（移植後１年）に移植した場合、短い期間生存し、多くのＴＨ発現ニューロンを含有する。

さらに、分化中脳ＤＡ細胞をポリシアリルトランスフェラーゼ処理（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ_Ｎｍ））することによりレベルの上昇したポリシアリル化は、凍結解凍サイクルの後、およびｉｎ ｖｉｖｏでのマウスへの移植後に安定であった。さらに、ＣＤ１４２細胞の選別は、ポリシアリルトランスフェラーゼ処理によって影響を受けなかった（図１１Ａ、ＢおよびＤ）。さらに、未処理の細胞は、マウスへの移植後に、ｉｎ ｖｉｖｏで注目すべき伸長を有さない約１０％のニューロンを有するが、ポリシアリルトランスフェラーゼ処理した細胞はいずれも、マウスの線条体におけるｍＤＡ細胞の移植の２週間後に１００μｍ未満の長さの軸索を有していなかった（図１１Ｃ）。

６．２ 実施例２：幹細胞由来中脳ドーパミン（ＤＡ）前駆細胞の調製方法

概要
本実施例は、実施例１に記載されているＧＭＰ Ｖ２Ａ分化プロトコルの改変バージョンを提供する。

ｈＥＳＣを、分化前に、Ｅ８／マトリゲル培地で維持した。以下の培養ストラテジーによる成長因子を補充したＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地において、細胞を分化させ、ここで細胞は、４日目に７．５μＭのｂｕｍｐを用いて培養した。

７．５μＭｂｕｍｐのプロトコル（ＧＭＰ Ｖ２Ｂの改変）
− ０日目（Ｄ０）：ｈＥＳＣを、Ｅ８／マトリゲル培地から以下の分化因子を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）／Ｎ２／Ｂ２７培地を含む分化培地に移した（Ｄ０培地は、細胞の生存を増強するために、１０μＭのＹ−２７６３２ ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）阻害剤も含んでいた）。細胞は、１Ｌ当たり約７億５千万個の細胞の濃度であった：
・ ２ｍＭのＬ−グルタミン
・ ２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９
・ １０．８μＭのＳＢ４３１５４２
・ ５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨ
・ ０．７μＭのＣＨＩＲ９９０２１

− Ｄ１：分化培地を、Ｙ−２７６３２を含まない新鮮な分化培地と交換した。

− Ｄ２：培地の交換なし。

− Ｄ３：Ｄ１に記載されたように交換した培地。

− Ｄ４：分化培地を、７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含む（Ｙ−２７６３２を含まない）新鮮な分化培地と交換した。

− Ｄ５：培地の交換なし。

− Ｄ６：Ｄ４に記載されたように交換した培地。

− Ｄ７：分化培地を、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を補充したＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７を含む（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨまたはＹ−２７６３２は含まない）新鮮な培地と交換した。

− Ｄ８：培地の交換なし。

− Ｄ９：Ｄ７に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１０：培地を、２ｍＭのＬ−グルタミン、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３、および２００ｎＭのＡＡを含む新鮮なＮＢ／Ｂ２７培地と交換した。

− Ｄ１１：細胞の継代および１Ｌ当たり１５億個の細胞の濃度を達成するために、Ｄ１０に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１２：培地が、１０μＭのＤＡＰＴをさらに含み、ＣＨＩＲ９９０２１を含まないことを除いて、Ｄ１０に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１３〜Ｄ１５：成熟培地。Ｄ１２に記載されたように交換した培地。

− Ｄ１６：細胞を回収し、ＮＢ中で凍結保存した。

方法
５．０ 試薬および材料
５．１ Ｔｅｘｗｉｐｅ Ｓｔｅｒｉｌｅ ＴｅｃｈｎｉＳａｔ Ｐｒｅｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｗｉｐｅｒｓ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１９−００３−２３９）または等価物
５．２ 遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号０５−５３８−５１ １５ｍＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号０５− ５３８−４９ ５０ｍＬ用）または等価物
５．３ 組織培養プレート（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号０８−７７２−２４ １５ｃｍ）または等価物
５．４ 組織培養フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６８０−６５ ７５ｃｍ^２；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１２−５６５−２２１ ２２５ｃｍ^２）または等価物
５．５ 滅菌ポリスチレン血清学ピペット（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７５−４７ ２ｍＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７８−１１Ｄ ５ｍＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７８−１１Ｅ １０ｍＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７８−１１ ２５ｍＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７８−１１Ｆ；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７５−７３ １００ｍＬ用）または等価物
５．６ 滅菌吸引ピペット（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１３−６７８−２０Ｄ）または等価物
５．７ ｚＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ計数スライド（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、Ｃａｔ番号ＣＨＴ４−ＰＤ−１００−００３）または等価物
５．８ 滅菌ピペットチップ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号２１−４０３−００ ２０μＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号２１−４０３− ０１ ２００μＬ用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号２１−４０３−０２ １０００μＬ用）または等価物
５．９ 凍結保存バイアル（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１２−５６５−１６４Ｎ）または等価物
５．１０ ＣｒｙｏＣｏｌｏｒ Ｃｏｄｅ Ｃａｐ Ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１２−５６５−２４２ 白色用；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１２−５６５−１８０ 種々の色用）または等価物
５．１１ セルストレーナー（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号０８−７７１−１ ４０μＭ用）または等価物
５．１２ ＡＯＰＩ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、Ｃａｔ番号ＣＳ２−０１０６−５ ｍＬ）
５．１３ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号１１３２０）
５．１４ Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ番号ＡＴ１０４）
５．１５ Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標） ＬＤＥＶ−ｆｒｅｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号Ａ１４１３２−０１）
５．１６ ＣＴＳ（商標）（Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）塩化カルシウムを含まず、塩化マグネシウムを含まないＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号Ａ１２８５６０１）
５．１７ Ｂ２７（ビタミンＡを含まない）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号１２５８７−０１０）
５．１８ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号０７１５６）
５．１９ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号２１１０３０４９）
５．２０ ５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン［任意選択］（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ番号１５７５００７８） ５．２１ ５００μＭのＬＤＮ １９３１８９（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１１）
５．２２ １０．８ｍＭのＳＢ４３１５４２（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１３）
５．２３ １００μｇ／ｍＬのＳｈｈ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１４）
５．２４ １５ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００４）
５．２５ １０μｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００３）
５．２６ １０ｍＭのＹ−２７６３２（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１６）
５．２７ １００ｍＭのアスコルビン酸（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００２）
５．２８ １０μｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００７）
５．２９ １００ｍＭのｄｂｃＡＭＰ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００６）
５．３０ ２μｇ／ｍＬのＴＧＦ−ベータ３（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１５）
５．３１ １０ｍＭのＤＡＰＴ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００５）
５．３２ ４ｍＭのＨＣｌ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００８）
５．３３ １５ｍｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−オルニチン（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１２）
５．３４ １ｍｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００１）
５．３５ １ｍｇ／ｍｌのＣｕｌｔｒｅｘマウスラミニンＩ（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−０１０）
５．３６ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地（ＳＳＣＲＦ−ＦＲ−００２）
５．３７ ２００ｍＭのＬ−グルタミン（ＳＳＣＲＦ−ＲＰ−００９）

６．０ 機器

６．１ Ｇｉｌｓｏｎの調整可能ピペッター（Ｐｉｐｅｔｍａｎ−ｐ１０００、ｐ２００、ｐ２０、ｐ１０、ｐ２）または等価物
６．２ Ｉｎｔｅｇｒａ Ｐｉｐｅｔｔｅｂｏｙ Ｐｒｏ Ｐｉｐｅｔａｉｄ Ｄｅｖｉｃｅまたは等価物
６．３ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標） Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
６．４ ＣＯ_２インキュベーター（Ｎｕａｉｒｅ ＩＲ Ａｕｔｏｆｌｏｗ ＣＯ_２ ｗａｔｅｒ−ｊａｃｋｅｄ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）または等価物
６．５ Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＸＴＲ遠心分離器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ番号７５００４５２０）または等価物
６．６ ＣｒｙｏＭｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒａｔｅ Ｆｒｅｅｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ番号７４５０）または等価物
６．７ 倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＫ２）または等価物
６．８ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ｃａｂｉｎｅｔ（Ｂａｋｅｒ ＳｔｅｒｉｌｅＧＡＲＤ Ｃｌａｓｓ ＩＩ）または等価物

７．０ 手順

７．１ 分化開始前の日：Ｇｅｌｔｒｅｘ解凍
７．１．１ ６×５ ｍＬの凍結Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）バイアルを、４℃で終夜または氷晶がなくなるまで解凍する。

７．２ ０日目：ｈＥＳＣの供給およびＧｅｌｔｒｅｘコーティング
７．２．１ すべてのＷＡ０９ ｈＥＳＣ培養物に新鮮なＥ８培地を補給する。
７．２．２ ４８×Ｔ７５フラスコに、バッチ記録番号を番号を増番させて標識した。各タスクを後で順次実施する。
７．２．３ Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２の１：３０の混合物を作製する。
７．２．３．１ ８７０ｍＬの冷却ＤＭＥＭ／Ｆ１２を１Ｌの瓶に添加する。
７．２．３．２ ３０ｍＬのＧｅｌｔｒｅｘ（商標）を注意深く添加する。各Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）バイアルを、瓶からのＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄し、生成物のほとんどを回収する。
７．２．３．３ キャップをきつく締め、Ｇｅｌｔｒｅｘと培地を逆さまにして混合することを一度行う。沈降を防止するために、使用の間に時折注意深く回転させる。
７．２．４ Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）コーティングをスタートした時間を記録する。
７．２．５ 各Ｔ７５容器を１５ｍＬのＧｅｌｔｒｅｘ（商標）で順次コーティングする。
７．２．６ Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）インキュベーションが始まった時間を記録する。
７．２．７ フード中、室温で、２〜３時間インキュベートする。
７．２．８ 吸引をスタートする時間を記録する。
７．２．９ インキュベーションに続き、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）を吸引し、１５ｍＬのプレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌを添加する。細胞を平板培養する準備ができるまで、容器を室温に置く。
７．２．１０ Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）を容器から除去した時間を記録する。

７．３ ０日目：細胞の準備および誘導

注記：７．３は、生成の組ごとに２人の独立したオペレーターにより同時に実施することができる。２つの組は、同時に処理し、処理時間を低減させることができる。生成物は、均質性を確保するために播種前にプールされなければならない。

注記：収量が必要量より多い場合、４８個のフラスコのみを播種することができる。収量が４８個未満のフラスコである場合、試行は中止される。

７．３．１ 開始前の、ＯＣＴ４＋ＱＣ（ＳＳＣＲＦ−ＳＯＰ−１０７）およびｃＤＮＡ生成（ＳＳＣＲＦ−ＳＯＰ−１０９）のために使用するための、かつ収量を評価するためのＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の単一の容器。
７．３．１．１ 密度、コロニーのサイズおよび表面を覆うコロニーの分布に基づき、代表的なプレートを見つける。
７．３．１．２ 細胞から培地を吸引し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を添加する。
７．３．１．２．１ Ｔ２２５フラスコ当たり１５ｍＬ
７．３．１．２．２ １５ｃｍの皿当たり１０ｍＬ
７．３．１．３ 細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートする。
７．３．１．４ １０ｍＬのピペットを使用して、細胞を移動させて粉砕し、均質な懸濁物にする。
７．３．１．５ ５０ｍＬのコニカルにピペットで移し、１０ｍＬのＥ８培地を添加する（合計２０ｍＬ）。
７．３．１．６ ２００×ｇで５分間室温で遠心分離する。
７．３．１．７ 培地を吸引し、５ｍＬのＥ８培地を添加する。
７．３．１．８ 細胞の計数を実施する（７．３．２０を参照のこと）
７．３．１．９ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＳＳＣＲＦ−ＳＯＰ−１０９と標識した凍結保存チューブに入れる（ＱＣのためのｃＤＮＡ生成）。
７．３．１．１０ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＳＳＣＲＦ−ＳＯＰ−１０７と標識した凍結保存チューブに入れる（ＯＣＴ４測定）。
７．３．１．１１ ＱＣチューブを別のオペレーターに提出し、ＱＣ実験室に持ち込む。

７．３．２ ２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳｈｈ、０．７μＭのＣＨＩＲおよび１０μＭのＹ−２７６３２を含有する２．５ＬのＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７を調製する。

７．３．３ インプットＷＡ０９番号（バッチ番号）および関連するデータをバッチ記録に記録する。

７．３．４ １２個の容器のバッチにおいて、順次、一つずつ作業する。
注記：これは、オペレーターごとに行う。

７．３．５ 吸引を開始する時間を記録する。

７．３．６ ＷＡ０９ ｈＥＳＣの１２個の容器をインキュベーターから取り除き、細胞から培地を吸引し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を添加する。
７．３．６．１ Ｔ２２５フラスコ当たり１５ｍＬ
７．３．６．２ １５ｃｍの皿当たり１０ｍＬ

７．３．７ 細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートする。

７．３．８ バッチ記録に関して、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）インキュベーションのスタート時間を記録する。

７．３．９ １２［Ｔ２２５］または６［１５ｃｍ］×５０ｍＬのコニカルチューブの組み立てを開始する。

７．３．１０ バッチ記録に関して、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）インキュベーション終了時間を記録する。

７．３．１１ １０ｍＬのピペットを使用して、各容器の表面をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で約５〜１０回洗浄して、細胞を移して、塊が見えなくなるまで粉砕する。

７．３．１２ Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）中に解離した細胞を５０ｍＬのコニカルに移す。

７．３．１３ 乾燥した容器の表面を新鮮なＥ８培地で洗浄し（Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）と等しい体積を使用する）、残っている細胞を回収し、細胞−Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を有するコニカルに添加する。
注記：例えば、１５ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を有していたＴ２２５フラスコをコニカルに移す。次いで乾燥したフラスコを１５ｍＬのＥ８培地で洗浄し、回収した細胞−Ｅ８を、１５ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）−細胞を含有するコニカルに添加する（合計３０ｍＬ）。１０ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を含有する１５ｃｍの皿をコニカルに移し、次いで、１０ｍＬの新鮮なＥ８で洗浄する（合計２０ｍＬ）。２つの１５ｃｍの皿を１つのコニカルにプールすることができる（合計４０ｍＬ）。
注記：可能であれば、生きた試料を、記録保管の目的で凍結保存すべきでもある。生きた試料は、ＦｒｅＳＲ−ＳおよびＱＣ実験室における凍結保存プロトコル「ＵＳＥＲ１」を使用して、単一の細胞として凍結することができる。

７．３．１４ 細胞を、５分間２００×ｇで室温で遠心分離する。

７．３．１５ 培地を吸引し、各ペレットを、新鮮なプレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌを含む１０ｍＬに穏やかに再懸濁させる。

７．３．１６ ３つのチューブを新鮮な５０ｍＬのコニカルにプールする（バッチごとに合計２×５０ｍＬのコニカルを与える）。

７．３．１７ 細胞を、５分間２００×ｇで室温で遠心分離する。

７．３．１８ 培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳｈｈ、０．７μＭのＣＨＩＲおよび１０μＭのＹ−２７６３２を含有する合計５ｍｌのＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７を使用して、穏やかに再懸濁させる。すべての容器が処理されるまで４℃に置く。

７．３．１９ すべての容器を処理したら、すべての細胞をプールし、２００ｍＬに合わせる。

７．３．２０ プールした細胞を計数する：
７．３．２０．１ プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌにおける細胞の既知の希釈液を作製する（成長因子を含まない）。
７．３．２０．２ ２０ｕＬの希釈細胞を２０ｕＬのＡＯＰＩと混合する。
７．３．２０．３ ２０ｕＬの細胞／ＡＯＰＩ混合物をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）スライドにロードする。
７．３．２０．４ スライドをスロットに挿入する。
７．３．２０．５ プログラムファイル「ｈＥＳ Ｃｅｌｌｓ ＡＯＰＩ」を選択する。
７．３．２０．６ 以下のフォーマット「ＤＡ０１ Ｌｏｔ＃ＭＭＤＤＹＹ ｄ０」を使用してファイル名を与える。
７．３．２０．７ 希釈値を入力する。
７．３．２０．８ Ｆ１チャネルを使用して、機械の右側のつまみを使用して細胞に焦点を当てる。
７．３．２０．９ 焦点があったら、「Ｃｏｕｎｔ」を押す。

７．３．２１ １ｍＬ当たりの、目に見えるおよび目に見えない細胞の総数、細胞の総数、および生存率％を記録する。

７．３．２２ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＭＩＣＲ−ＣＵＬＴ−ＳＯＰ−１６３４と標識した凍結保存チューブに入れる（無菌）。３×１０^６個の細胞のアリコートをＰＴ−ＯＰ−７０２０と標識した凍結保存チューブに入れる（マイコプラズマ）。提出前にそれぞれを１ｍＬに合わせ、処理のために別のオペレーターに送る。

７．３．２３ 細胞濃度を１Ｌ当たり７億５千万個の細胞に調整する（合計２Ｌ必要）。
７．３．２３．１ ７億５千万個の細胞を達成するために必要な体積を計算する。
７．３．２３．２ 計算した体積を２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳｈｈ、０．７μＭのＣＨＩＲおよび１０μＭのＹ−２７６３２を含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７の各１Ｌ瓶から取り除く。
７．３．２３．３ ７億５千万個の細胞を含有する計算した体積を各１Ｌ瓶に添加する。

７．３．２４ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。

７．３．２５ プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）でコーティングされたフラスコから吸引する。

７．３．２６ ４０ｍＬの細胞懸濁物を各Ｔ７５に注意深く添加する。
注記：ピペッティングの前に細胞を注意深く懸濁させることを確認する。

７．３．２７ フラスコを穏やかに揺すり、表面を細胞で均一にコーティングする。
注記：細胞分布は顕微鏡で検証することができる。

７．３．２８ フード中で撹乱することなく１０〜１５分間静置する。

７．３．２９ フラスコを注意深くインキュベーターに移動させる。

７．３．３０ ３７℃で５％のＣＯ_２と一緒に終夜インキュベートする。

７．４ １日目：供給（０．７μＭのＣＨＩＲ）
７．４．１ 制御点：ＢＲで示されたフラスコの集密度をチェックする。培養は１００％コンフルエントであるべきである。指定されたフラスコのコンフルエンスに留意すること。
７．４．２ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．４．３ 既存の培地を吸引し、Ｔ７５ごとに、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９および１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨおよび０．７μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。

７．５ ２日目：培地交換なし

７．６ ３日目：供給（０．７μＭのＣＨＩＲ）
７．６．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．６．２ 既存の培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９および１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨおよび０．７μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。

７．７ ４日目：供給（７．５μＭのＣＨＩＲ ＢＵＭＰ）
７．７．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．７．２ 既存の培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９および１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨおよび７．５μＭのＣＨＩＲを含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。

７．８ ５日目：培地交換なし

７．９ ６日目：供給（７．５μＭのＣＨＩＲ）
７．９．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．９．２ 既存の培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９および１０．８μＭのＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨおよび７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。

７．１０ ７日目：ＬＤＮ、ＳＢおよびＳＨＨの除去
７．１０．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１０．２ 既存の培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔおよび７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。

７．１１ ８日目：培地交換なし

７．１２ ９日目：供給（７．５μＭのＣＨＩＲ）およびＰＯコーティング
７．１２．１ ７．５μＭのＣＨＩＲを供給する：
７．１２．１．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１２．１．２ 既存の培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔおよび７．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｎ２／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。
７．１２．２ ＰＯコーティング
７．１２．２．１ 各Ｔ７５フラスコに、バッチ記録番号を番号を増番させて標識した。各タスクを順次実施する。
７．１２．２．２ ４８×Ｔ７５を、フラスコごとに、ＤＰＢＳ中の１５μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−オルニチン１５ｍＬでコーティングする。
注記：必要量は７２０ｍＬであるが、過剰に８００ｍＬを作製する。
７．１２．２．３ ３７℃で５％のＣＯ_２と一緒に終夜インキュベートする。

７．１３ １０日目：供給（３μＭのＣＨＩＲ、ＤＡＰＴなし）およびＦ／Ｌコーティング
７．１３．１ ３μＭのＣＨＩＲをプレートに供給する。
７．１３．１．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１３．１．２ 既存の培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｂ２７培地４０ｍＬを穏やかに添加する。
７．１３．２ Ｆ／Ｌコーティング
７．１３．２．１ フラスコを４つのバッチで処理することができる。
７．１３．２．２ 吸引し、次いで、１５ｍＬのＤＰＢＳを添加する。
７．１３．２．３ 穏やかに揺すって洗浄し、次いで、合計で３×ＤＰＢＳ洗浄のために、もう２回繰り返す。
７．１３．２．４ 吸引し、次いで、ＤＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのフィブロネクチン／ラミニン１５ｍＬを添加する。
注記：必要量は７２０ｍＬであるが、過剰に８００ｍＬを作製する。
７．１３．２．５ ３７℃で５％のＣＯ_２と一緒に終夜インキュベートする。

７．１４ １１日目：継代
注記：７．１４は、生成の組ごとに２人の独立したオペレーターにより同時に実施することができる。２つの組は、同時にフラスコを処理し、処理時間を低減させることができる。生成物は、均質性を確保するために播種前にプールされなければならない。
注記：収量が必要量より多い場合、４８個のフラスコのみを継代することができる。収量が合計１×１０^９個の細胞未満である場合、バッチは中止される場合がある。

７．１４．１ ２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｂ２７培地２．５Ｌを調製する。

７．１４．２ １２個の容器のバッチにおいて、順次、一つずつ作業する。

７．１４．３ フードからフラスコを注意深く取り除き、順次配列させ、吸引が開始する時を記録する。

７．１４．４ 既存の培地を吸引し、Ｔ７５ごとに、５ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を添加する。

７．１４．５ 最後のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の添加後に、インキュベーションのスタート時間を記録する。

７．１４．６ ３７℃で３０〜４０分間インキュベートする。

７．１４．７ 可能な限り十分に乾燥させるため、フィブロネクチン／ラミニンコーティングを吸引し、乾燥するまでフード下でフラスコを開けたままにする。

７．１４．８ 順次、５０ｍＬのコニカルを標識し、継代されているＴ７５フラスコに一致させる。

７．１４．９ フード内で、滅菌技術を注意深く使用して、フラスコごとに、標識した５０ｍＬのコニカルのうちの１つに４０μｍのブルーセルストレーナーを据え付ける。

７．１４．１０ インキュベーション時間が経過したら、インキュベーション停止時間を記録する。

７．１４．１１ プレートをインキュベーターから取り除く。

７．１４．１２ １０ｍＬのピペットを使用して、細胞を勢いよく約５〜１０回ピペッティングして、クラスターを破壊する。

７．１４．１３ 粉砕した細胞を、４０μＭフィルターを通して注意深くピペットで取る。

７．１４．１４ １５ｍＬのプレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を乾燥したフラスコに添加し、静置された細胞を回収する。

７．１４．１５ 回収した細胞を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌを４０μＭフィルターに添加する。
注記：このステップでは２つの容器を処理して、同じチューブ内に含めることができる。

７．１４．１６ フィルターを注意深く取り除き、処分する。チューブに蓋をする。

７．１４．１７ 各Ｔ７５フラスコについて処理を繰り返す。

７．１４．１８ 細胞を、５分間２００×ｇで室温で遠心分離する。

７．１４．１９ 培地を吸引し、各ペレットを１０ｍＬのプレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌに再懸濁させる。

７．１４．２０ ４つ以下のチューブからのペレットを合わせて、５０ｍＬのコニカルチューブに入れる。

７．１４．２１ 細胞を、５分間２００×ｇで室温で遠心分離する。

７．１４．２２ 培地を吸引し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｂ２７培地１０ｍＬに、各ペレットを再懸濁させる。
注記：さらに容器を処理する必要がある場合は、細胞を４℃で保存することができる。

７．１４．２３ すべての容器を処理したら、すべての細胞をプールし、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｂ２７培地を使用して、２００ｍＬの最終体積に合わせる。
７．１４．２３．１ プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地における細胞の既知の希釈液を作製する。
７．１４．２３．２ ２０ｕＬの希釈細胞を２０ｕＬのＡＯＰＩと混合する。
７．１４．２３．３ ２０ｕＬの細胞／ＡＯＰＩ混合物をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）スライドにロードする。
７．１４．２３．４ スライドをＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）に挿入する。
７．１４．２３．５ プログラムファイル「ｍＤＡ Ｎｅｕｒｏｎｓ ＡＯＰＩ」を選択する。
７．１４．２３．６ 以下のフォーマット「ＤＡ０１ Ｌｏｔ＃ＭＭＤＤＹＹ ｄ１１」を使用してファイル名を与える。
７．１４．２３．７ 希釈値を入力する。
７．１４．２３．８ Ｆ１チャネルを使用して、機械の右側のつまみを使用して細胞に焦点を当てる。
７．１４．２３．９ 焦点があったら、「Ｃｏｕｎｔ」を押す。

７．１４．２４ １ｍＬ当たりの、目に見えるおよび目に見えない細胞の総数、細胞の総数、および生存率％を記録する。

７．１４．２５ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＳＳＣＲＦ−ＳＯＰ−１０９と標識した凍結保存チューブに入れる（ＱＣのためのｃＤＮＡ生成）。

７．１４．２６ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＰＴ−ＯＰ−７０２０と標識した凍結保存チューブに入れる（マイコプラズマ）。提出前に１ｍＬに合わせる。

７．１４．２７ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＭＩＣＲ−ＣＵＬＴ−ＳＯＰ−１６３４と標識した凍結保存チューブに入れる（無菌）。提出前に１ｍＬに合わせる。
注記：可能であれば、試料を、記録保管のために生きた試料を凍結保存するために提出すべきでもある。生きた試料は、Ｓｔｅｍ−Ｃｅｌｌｂａｎｋｅｒ（登録商標）およびＱＣ実験室における凍結保存プロトコル「ＵＳＥＲ１」を使用して、単一の細胞として凍結することができる。

７．１４．２８ 別のオペレーターに、すべてのＱＣチューブを、関連するＳＯＰに従って処理するために送る。

７．１４．２９ 細胞濃度を１Ｌ当たり１５億個の細胞に調整する（合計２Ｌ必要）。
７．１４．２９．１ １５億個の細胞を達成するために必要な体積を計算する。
７．１４．２９．２ 計算した体積を２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有するＮＢ／Ｂ２７培地の各１Ｌ瓶から取り除く。
７．１４．２９．３ １５億個の細胞を含有する計算した体積を各１Ｌ瓶に添加する。
注記：細胞収量が３×１０^９個未満であるが１×１０^９個超である場合、細胞を１ｍＬ当たり１．５×１０^６個の細胞の最終濃度にするために必要なｍＬ数を計算し、可能な限り多くのフラスコに播種する。

７．１４．３０ ４０ｍＬの細胞懸濁物を各Ｔ７５に添加する（合計６０×１０^６個の細胞）。
注記：ピペッティングの前に細胞を注意深く懸濁させることを確認する。

７．１４．３１ プレートを注意深く揺すり、均一な細胞懸濁物を確保する。

７．１４．３２ プレートを室温で１０分間インキュベートさせる。

７．１４．３３ フラスコを注意深くインキュベーターに移動させる。
注記：均一なコーティングを確保するために、顕微鏡でフラスコを抜き打ち検査すること。

７．１４．３４ プレートを、３７℃で５％のＣＯ_２で終夜インキュベートする。

７．１５ 供給１２日目（ＣＨＩＲ除去、ＤＡＰＴ添加［成熟培地］）
７．１５．１ 制御点：フラスコのコンフルエンスを抜き打ち検査し、ＢＲに記録する。培養物は１００％コンフルエントであるべきである。指定されたフラスコのコンフルエンスに留意すること。
注記：継代の間に最大数のフラスコが達成されない場合には、成熟培地を次の日に使用してもよい。
７．１５．２ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１５．３ 既存の培地を吸引し、各Ｔ７５フラスコに対し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および１０μＭのＤＡＰＴを含有するＮＢ／Ｂ２７培地を穏やかに添加する。

７．１６ １３日目（成熟培地）
７．１６．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１６．２ 既存の培地を吸引し、各Ｔ７５フラスコに対し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および１０μＭのＤＡＰＴを含有するＮＢ／Ｂ２７培地を穏やかに添加する。

７．１７ １４日目（成熟培地）
７．１７．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１７．２ 既存の培地を吸引し、各Ｔ７５フラスコに対し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および１０μＭのＤＡＰＴを含有するＮＢ／Ｂ２７培地を穏やかに添加する。

７．１８ １５日目（成熟培地）
７．１８．１ 順次、各Ｔ７５フラスコを一度に一つずつ操作する。
７．１８．２ 既存の培地を吸引し、各Ｔ７５フラスコに対し、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭのＡＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５００ｎＭのｃＡＭＰ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３および１０μＭのＤＡＰＴを含有するＮＢ／Ｂ２７培地を穏やかに添加する。

７．１９ １６日目：細胞回収および凍結保存
注記：７．１４は、生成の組ごとに２人の独立したオペレーターにより同時に実施することができる。２つの組は、同時にフラスコを処理し、処理時間を低減させることができる。生成物は、均質性を確保するために播種前にプールされなければならない。

７．１９．１ 順次、すべての凍結保存チューブを標識し４℃で冷やす。

７．１９．２ 順次、ロット番号とチューブの範囲で箱を標識する。

７．１９．３ 吸引を開始する前の時間に留意すること。

７．１９．４ １２のバッチにおいて順次作業し、既存の培地をフラスコから吸引し、Ｔ７５ごとに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）５ｍＬを添加する。

７．１９．５ インキュベーションのスタート時間を記録する。

７．１９．６ ３７℃で３０〜４０分間インキュベートする。

７．１９．７ フード内で、５０ｍＬのコニカルに４０μｍのブルーセルストレーナーを据え付ける（２つのＴ７５フラスコごとに１つのコニカル）。

７．１９．８ インキュベーション後に、フラスコをインキュベーターから取り除き、バッチ記録に時間を記録する。

７．１９．９ １０ｍＬのピペットを使用して、クラスターがもはや見えなくなるまで約５〜１０回ピペッティングする。

７．１９．１０ 細胞懸濁物を４０μＭフィルターを通して注意深く移す。

７．１９．１１ １５ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を乾燥したフラスコに添加し、細胞を回収する。

７．１９．１２ 回収した細胞を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌを同じ４０μＭフィルターを通して移す。

７．１９．１３ 各フラスコについて順次繰り返す。

７．１９．１４ 細胞を、５分間２００×ｇで室温で遠心分離する。

７．１９．１５ 培地を吸引し、各ペレットを５ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に再懸濁させる。
注記：すべての容器が処理されるまで、コニカルを４℃で保存する。

７．１９．１６ すべての容器が処理されたら、全ての細胞をプールし、合計２００ｍＬの体積に合わせる。

７．１９．１７ 細胞の計数を実施する：
７．１９．１７．１ プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌにおける細胞の既知の希釈液を作製する。
７．１９．１７．２ ２０ｕＬの希釈細胞を２０ｕＬのＡＯＰＩと混合する。
７．１９．１７．３ ２０ｕＬの細胞／ＡＯＰＩ混合物をＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）スライドにロードする。
７．１９．１７．４ スライドをＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）に挿入する。
７．１９．１７．５ プログラムファイル「ｍＤＡ Ｎｅｕｒｏｎｓ ＡＯＰＩ」を選択する。
７．１９．１７．６ 以下のフォーマット「ＤＡ０１ Ｌｏｔ＃ＭＭＤＤＹＹ ｄ１６ ｃｒｙｏ」を使用してファイル名を与える。
７．１９．１７．７ 希釈値を入力する。
７．１９．１７．８ Ｆ１チャネルを使用して、機械の右側のつまみを使用して細胞に焦点を当てる。
７．１９．１７．９ 焦点があったら、「Ｃｏｕｎｔ」を押す。

７．１９．１８ １ｍＬ当たりの、目に見えるおよび目に見えない細胞の総数、細胞の総数、および生存率％を記録する。

７．１９．１９ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＳＳＣＲＦ−ＳＯＰ−１０９と標識した凍結保存チューブに入れる（ＱＣのためのｃＤＮＡ生成）。

７．１９．２０ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＰＴ−ＯＰ−７０２０と標識した凍結保存チューブに入れる（マイコプラズマ）。プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌを用いて１ｍＬに体積を合わせる。

７．１９．２１ ３×１０^６個の細胞のアリコートをＭＩＣＲ−ＣＵＬＴ−ＳＯＰ−１６３４と標識した凍結保存チューブに入れる（無菌）。プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌを用いて１ｍＬに体積を合わせる。

７．１９．２２ 別のオペレーターに、チューブを、関連するＳＯＰに従って処理するために送る。

７．１９．２３ 残っている細胞をＳＯＰ−ＳＳＣＲＦ−１０５に従って凍結保存する（１６日目の最終生成物の凍結保存）。

７．１９．２４ 終了したら、冷凍庫から細胞を速やかに取り出し、予め標識した箱に入れ、輸送業者に荷積みする。

７．１９．２５ 箱を液体窒素に移す。

７．１９．２６ バッチ記録に情報を記録する。

１６日目に凍結保存した細胞を解凍し、損傷ラットに移植した（ＮＩＨヌード、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）（すなわち、パーキンソン症候群ラットモデル）。移植前、ならびに移植の１、２、３、４および５カ月後に、移植ラットと偽移植ラットにおけるアンフェタミン誘導回転行動について調査した。ｈＮＣＡＭ、およびｍＤＡマーカーＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）およびＧＩＲＫ２（Ｇタンパク質活性化内向き整流性カリウムチャネル２）のｉｎ ｖｉｖｏでの発現を、移植の５カ月後に調査した。

１６日目に凍結保存した細胞を解凍し、非ヒト霊長類に移植した。移植した移植片からの線維伸長と細胞形態を移植の６週間後に調査した。

結果
図１２に示すように、ｍＤＡ前駆体の損傷ラットへの移植の４カ月後に、移植片を受けたラットは、偽処置ラットと比較して少ない、１分当たりの回転数を示した。移植の５カ月後には、移植した移植片の免疫細胞化学により、移植片が、ｍＤＡ形態の典型的なＴＨ染色を示し、ＴＨ陽性ニューロンは、ＧＩＲＫ２発現についても陽性であることが示された（図１３）。

非ヒト霊長類に移植されたｍＤＡ前駆体移植片の形態を、移植の６週間後に調査した。移植片は、移植片コアからの堅固な線維伸長を示し、典型的なｍＤＡ形態も示した（図１４）。

本開示の主題およびその利点について詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲によって定義された発明の精神および範囲を逸脱せずに、種々の変化、置換および変更を本明細書において行うことができることを理解されたい。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されている過程、機械、製造物、組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者が本開示の主題の開示から容易に理解するように、本明細書に記載されている対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施し、または実質的に同じ結果を達成する既存のまたは後に開発される過程、機械、製造物、組成物、手段、方法またはステップを、本開示の主題に従って利用できる。したがって、添付の特許請求の範囲は、このような過程、機械、製造物、組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むことを意図する。

その開示が、参照によりすべての目的のために全体として本明細書に組み込まれる特許、特許出願、刊行物、製品の記載およびプロトコルがこの出願を通して引用されている。

Claims (29)

1. 多能性幹細胞を分化させるためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記方法は、
   （ａ）複数の多能性幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の少なくとも１種の阻害剤と接触させるステップと、
   （ｂ）前記細胞を、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤、およびウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の少なくとも１種の活性化剤と接触させるステップを含み、
   前記細胞に接触させる、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤との前記細胞の最初の接触から２日から６日の間に、かつ（ｂ）前記細胞に接触させたＷｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度から２５０％〜１８００％で増加させ、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）およびＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）を発現する分化細胞の集団を得る、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
2. 前記細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の少なくとも１種の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰの前記少なくとも１種の阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、４日間から１０日間の間接触させる、請求項２に記載の方法。
4. 前記細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤、ＢＭＰの前記少なくとも１種の阻害剤、およびソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、最長７日間まで、または少なくとも７日間にわたり接触させる、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記細胞を、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、８日間から１５日間の間接触させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記細胞を、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤と、最長１２日間まで、または少なくとも１２日間にわたり接触させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤との前記細胞の最初の接触から４日後に増加させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の４００％〜１４５０％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、前記細胞に接触させた、Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の最初の濃度の７００％〜１０５０％である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、３μＭから１０μＭの間の濃度までの増加である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、３μＭの濃度までの増加である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. Ｗｎｔシグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤の濃度における増加が、７．５μＭの濃度までの増加である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記分化細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１（ＥＮ−１）、および核受容体関連１タンパク質（ＮＵＲＲ１）の１種または複数を発現する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記分化細胞が、検出可能なレベルのペアードボックスタンパク質（ＰＡＸ６）および／またはＫｉ６７を発現しない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 分化細胞の集団を、前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい条件に供するステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記細胞のドーパミンニューロンへの成熟に好ましい前記条件が、前記細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、形質転換成長因子ベータ３（ＴＧＦβ３）、アスコルビン酸（ＡＡ）、および／またはＤＡＰＴと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記多能性細胞が、ヒトの非胚性幹細胞、非ヒト霊長類の非胚性幹細胞、げっ歯類の非胚性幹細胞、ヒトの胚性幹細胞、非ヒト霊長類の胚性幹細胞、げっ歯類の胚性幹細胞、ヒトの人工多能性幹細胞、非ヒト霊長類の人工多能性幹細胞、げっ歯類の人工多能性幹細胞、ヒトの組換え多能性細胞、非ヒト霊長類の組換え多能性細胞、及びげっ歯類の組換え多能性細胞からなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤が、ＴＧＦβ受容体の阻害剤を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ＴＧＦβ受容体の阻害剤が、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）を含む、請求項１８に記載の方法。
20. ＢＭＰの前記少なくとも１種の阻害剤が、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン（ＬＤＮ１９３１８９）、ノギン、または上記の組合せを含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、ＳＨＨタンパク質、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニスト、または上記の組合せを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記ＳＨＨタンパク質が、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、または上記の組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記組換えＳＨＨが、ＳＨＨ Ｃ２５ＩＩを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストが、パルモルファミンを含む、請求項２１に記載の方法。
25. ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の前記少なくとも１種の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、または上記の組合せを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する分化細胞が、中脳ドーパミンニューロンである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記多能性幹細胞が、ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記少なくとも１種の阻害剤との前記多能性幹細胞の最初の接触から２２日〜２７日以内に、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する分化細胞に分化する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記分化細胞が、検出可能なレベルのＣＤ１４２を発現する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. ＣＤ１４２を発現する細胞を選択するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。

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