JP6886191B2

JP6886191B2 - リボ核酸高収量を示す酵母

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Publication number: JP6886191B2
Application number: JP2018233950A
Authority: JP
Inventors: 拓也岸本; 聖人太田; 和也石毛
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: JP2020092671A

Description

本発明は、リボ核酸高収量を示す酵母に関するものである。

ＲＮＡ（リボ核酸）は、旨味調味料、機能性食品や医薬品の原料として使用されている。そのため、ＲＮＡを効率よく製造する技術は、産業上重要である。

ＲＮＡを製造するには、酵母を炭素源、窒素源、リン源を含む培地で培養し、酵母菌体からＲＮＡを抽出する方法が一般的に用いられている。ＲＮＡを効率よく製造する試みは以前から多く見られ、例えば、酵母菌体のＲＮＡ含量を高める方法や、得られた酵母菌体内のＲＮＡを効率よく抽出する方法などである。

前者の例としては、実用的には菌株の育種が主に行われており、ラパマイシンに耐性を有する変異株を取得する方法（特許文献１）、塩化カリウムに感受性を示す変異株を取得する方法（非特許文献１）、低温環境下で生育が著しく阻害される変異株を探索する方法（特許文献２）、チアジン・オキサジン系色素、およびアクリジン系色素に対する耐性を有する変異株を探索する方法（特許文献３）、Ｒｒｎ１０欠損株で生育のよい株に対して、Ｒｒｎ１０遺伝子を再導入する方法（特許文献４）、ＦＯＢ１遺伝子を欠損された株を得る方法（特許文献５）などが挙げられる。

後者としては、界面活性剤とともに酵母菌体を加熱する方法（特許文献６）、苛性ソーダなどのアルカリ溶液中で抽出する、もしくはアルカリで前処理して酸で中和して生成する塩の存在下で加温抽出する方法（特許文献７）などが知られているが、廉価で、高品質なＲＮＡを取得する手法として、弱酸性条件下、４０〜６０℃にて処理された菌体を中和し、塩水を加えて、９５℃加熱抽出する方法があげられ（特許文献８）、工業規模の生産では本法がよく採用されている。

特開２０１６−２１４１０４号特公昭５６−４６８２４号特公昭４８−３２３５０号特開２００９−５０２４７号特開２００７−７５０１３号特公昭４５−３３６５７号特公昭３８−８１４０号特公昭５２−１８２００号

土井等，日農化講演要旨、Ｐ３４７（１９７４）

前述した公知の菌株育種方法においては、親株と比較してＲＮＡ高収量を示す酵母の選抜効率は十分でなく、目的の株を取得するまでに多大な労力及び時間が必要だという問題点があった。
したがって、本発明の課題は、ＲＮＡ高収量を示す酵母の効率的な選抜法を確立し、することにある。

発明者らは、上記のような課題を解決すべく、酵母を用いたＲＮＡの製造方法を検討する中で、バニリン耐性を有する酵母変異株を選抜することで、ＲＮＡ高収量を示す株を効率的に取得することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の方法によれば、親株に比べてＲＮＡ高収量を示す酵母変異株を、既存の変異株取得方法と比較して極めて高い効率で取得することができる。さらに、本発明によって取得されたＲＮＡ高収量を示す株は、培養のスケールを大きくしても安定してＲＮＡ高収量を示すことから、工業的なＲＮＡ生産に好適である。

本明細書においてＲＮＡ収量とは、抽出されたＲＮＡ量を元の培養液あたりの重量濃度で示した値（ｇ／Ｌ）をいう。

酵母としては、食品や医薬品原料の製造に通常用いることが可能なキャンディダ属酵母が挙げられる。さらなる具体例としては、キャンディダ属の例としてキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）やキャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、などを挙げることができる。

本発明に用いる親株としては、供与株や一般的な野生株に加え、公知の育種法にて取得されたＲＮＡ高収量の株を用いることができる。公知の育種法としては、前述の通りラパマイシンに耐性を有する変異株を取得する方法、塩化カリウムに感受性を示す変異株を取得する方法、低温環境下で生育が著しく阻害される変異株を探索する方法、チアジン・オキサジン系色素、およびアクリジン系色素に対する耐性を有する変異株を探索する方法、Ｒｒｎ１０欠損株で生育のよい株に対してＲｒｎ１０遺伝子を再導入する方法、ＦＯＢ１遺伝子を欠損された株を得る方法、などを挙げることができるが、当然これらに限定されない。
親株は、上記の育種法のうち１つを用いて取得された株でもよいし、複数の方法を組み合わせて複数の選抜を経た株でもよい。

本発明は（１）酵母に変異原処理を行う工程、（２）バニリン耐性を有する酵母変異株を選抜する工程、（３）選抜された株の中から、親株よりもＲＮＡ収量の高い株を取得する工程、を含む、高いＲＮＡ収量を示す酵母変異株の取得方法によって取得されるキャンディダ属酵母変異株に関するものである。
なお、高いＲＮＡ収量を示す酵母変異株とは、親株と比較したときにＲＮＡ収量が１．１０倍以上である変異株のことをいう。

（１）の変異原処理の方法は、特に限定されないが、紫外線や電離放射線などによる物理的な方法や、亜硝酸、ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸メチルを用いた化学的な方法など、公知の方法を用いればよい。

（２）のバニリンに対する耐性を有する変異株を選抜する方法としては、バニリンを含む寒天培地上に酵母を播種し、生存する株を選抜すればよい。このバニリンの濃度としては、５００ｐｐｍ以上２０００ｐｐｍ以下であればよく、７５０ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下が好ましく、１０００ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下がさらに好ましい。

工程（１）と（２）は、（１）（２）の順に実施することもでき、または同時に行うこともできる。（１）（２）を同時に行う際には、バニリンを含有する寒天培地に酵母の親株を播種し、寒天培地上の当該親株に対して紫外線照射を行うなどして変異原処理を行えばよい。その後、培地上にコロニーを形成する株を選抜することで、バニリン耐性を有する変異株を選抜することができる。

（３）のＲＮＡ収量の高い株を取得する方法としては、特に限定されないが、たとえばバニリン耐性変異株をフラスコ内で小スケール培養し、酵母菌体から所定の方法でＲＮＡ抽出を行い、ＨＰＬＣ等の手法によりＲＮＡを定量するなどして、親株よりＲＮＡ収量の高い株を選抜することができる。

ＲＮＡの抽出方法については、公知の方法に従えばよい。たとえば、培養液を遠心分離して菌体を濃縮した後、塩酸等による酸性条件下で加熱処理する。その後、上清を除き、沈殿物に水を加えて濃縮スラリーを調製し、アルカリで中和させた後、塩化ナトリウム等の塩を加えて加熱処理する。得られた加熱処理物を遠心分離に供し、上清を回収することによりＲＮＡ抽出液を得ることができる。

取得したＲＮＡ抽出液におけるＲＮＡ量は、ＨＰＬＣ等の公知の方法により、定量することができる。
ＲＮＡ量を定量し、元の培養液あたりの重量濃度で表すことで、ＲＮＡ収量を算出することができる。

この方法によれば、単に酵母に変異原処理を行い、ＲＮＡ高収量を示す株を選抜するだけの方法や、公知のＲＮＡ高含量を示す株の取得方法（たとえば、ラパマイシン耐性株を取得する方法（特許文献１））に比べて、極めて効率よくＲＮＡ高収量を示す株を取得することができる。

本発明では、さらに取得した酵母変異株を好気培養し、培養した酵母よりＲＮＡを抽出することによるＲＮＡの製造法が提供される。ＲＮＡ製造においては、前述の方法で得られたバニリン耐性変異株を炭素源、窒素源および無機塩等を含む培地で好気的に培養すればよい。

菌株を培養する培地組成としては、炭素源として通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選抜される、１種または２種以上が用いられ、窒素源としては硝酸およびその塩、尿素、アンモニア、およびその塩、およびコーンスティープリカー、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる１あるいは２種以上が使用される。さらに、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしてはリン酸一アンモニウム、リン酸、過リン酸石灰、水酸化カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等の工業用原料でよい。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機イオンを添加してもよい。さらに、ビタミン、核酸関連物質等を添加してもよい。

培養形式としては、特に限定されず、回分培養、流加培養あるいは連続培養のいずれであってもよい。
培養装置としては、公知のものを制限なく用いることができるが、工業的にＲＮＡ生産を行う際には、そのスケールや利便性から、ファーメンターを用いて培養を行うことが好ましい。

培養温度は一般的な酵母の培養条件に従えばよく、たとえば２０〜４０℃、望ましくは２５〜３５℃がよく、ｐＨについては２．５〜８．０、望ましくは２．８〜６．０がよい。

以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。なお、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

（実施例１）バニリン耐性を指標とした変異株の取得
キャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８株を親株に用いて、以下の方法により、変異株の取得を行った。
当該親株を、ＹＭ培地（０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．５％カゼインペプトン、１％グルコース、２％寒天）を含むフラスコにて１昼夜培養した。培養した菌体を回収し、１０００ｐｐｍまたは１５００ｐｐｍのバニリンを含む、グルコースを唯一の炭素源とした寒天培地に播種し、紫外線照射（ＵＶランプ：ＰａｎａｓｏｎｉｃＧＬ−１５、波長２５３．７ｎｍ）により、致死率７０−８０％となるような条件で変異処理を行った。変異処理した寒天培地を１５００ｐｐｍのバニリン含有培地で３〜７昼夜３０℃で培養し、耐性株のコロニー形成を確認した。

ＮＢＲＣ０９８８株より得られた１００株の耐性株を、４０ｍＬのＹＭ培地を含む５００ｍＬフラスコで培養し、得られた菌体培養液酵母を培養して得られた培養液から、乾燥菌体重量が１０〜１５％となるように遠心分離で菌体を濃縮した後、５０±１０℃に加温し、ｐＨ２．０〜３．５となるよう塩酸を添加して加熱処理を行った。遠心分離上清を除き、沈殿物に対して水を加えて、もとの培養液の１５％量にけん濁液を調製した。けん濁液に３０％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ６．５〜７．０に中和した後、食塩を４％となるよう添加し、９０±５℃にて加熱処理した。得られた加熱処理物を遠心分離に供し、上清を回収した。沈殿物に対して、加熱処理液と等量の水を加えて再けん濁させ、再度遠心分離に供して上清を回収した。回収した上清をあわせることで、ＲＮＡ抽出液を取得した。

得られたＲＮＡ抽出液を適当に希釈し、ゲル浸潤高圧液体クロマトグラフィー（以下ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣカラムにはＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷ_ＸＬを、移動層として７Ｍ尿素・５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を用いた。高分子領域における２６０ｎｍ紫外光吸収物質を検出する。あらかじめシュミット・タンホイザー・シュナイダーの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６、１６４、７４７］（以下ＳＴＳ法）により定量しておいたＲＮＡ溶液を同様の分析に供することで、その紫外吸収ピーク面積から、抽出液中のＲＮＡ量を定量した。
上記方法によって、取得された変異株のＲＮＡ収量を算出し、ＲＮＡ収量が親株に比べて高い株を選抜した。

本実施例１の結果、親株であるＮＢＲＣ０９８８株から、収量が１．１０倍以上に向上した株を１４株取得した。

（実施例２）公知のスクリーニング方法との比較
本発明の方法と、公知のＲＮＡ高収量を示す変異株取得方法とを比較した。比較対象として、ＫＣｌ法、ラパマイシン法を選択した。
ＫＣｌ法及びラパマイシン法については、それぞれ非特許文献１又は特許文献１に記載の方法に従って変異株取得を行った。ＫＣｌ法では６８０株のＫＣｌ耐性変異株を、ラパマイシン法では５６０株のラパマイシン耐性変異株を取得した。

ＮＢＲＣ０９８８株より得られた各耐性変異株を、４０ｍＬのＹＭ培地を含む５００ｍＬフラスコで培養し、得られた菌体培養液酵母を培養して得られた培養液から、乾燥菌体重量が１０〜１５％となるように遠心分離で菌体を濃縮した後、５０±１０℃に加温し、ｐＨ２．０〜３．５となるよう塩酸を添加して加熱処理を行った。遠心分離上清を除き、沈殿物に対して水を加えて、もとの培養液の１５％量にけん濁液を調製した。けん濁液に３０％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ６．５〜７．０に中和した後、食塩を４％となるよう添加し、９０±５℃にて加熱処理した。得られた加熱処理物を遠心分離に供し、上清を回収した。沈殿物に対して、加熱処理液と等量の水を加えて再けん濁させ、再度遠心分離に供して上清を回収した。回収した上清をあわせることで、ＲＮＡ抽出液を取得した。

得られたＲＮＡ抽出液を適当に希釈し、ゲル浸潤高圧液体クロマトグラフィー（以下ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣカラムにはＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＰＷ_ＸＬを、移動層として７Ｍ尿素・５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を用いた。高分子領域における２６０ｎｍ紫外光吸収物質を検出する。あらかじめシュミット・タンホイザー・シュナイダーの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６、１６４、７４７］（以下ＳＴＳ法）により定量しておいたＲＮＡ溶液を同様の分析に供することで、その紫外吸収ピーク面積から、抽出液中のＲＮＡ量を定量した。
上記方法によって、実施例１と同様それぞれ取得された変異株のＲＮＡ収量を算出し、ＲＮＡ収量が親株に比べて高い株を選抜した。

上記の各変異株取得方法を用いてＲＮＡ高収量を示す変異株を選抜した結果を、表１に示す。

ＫＣｌ法では、取得した６８０株の中に、ＲＮＡ収量が親株の１．１０倍以上に向上した株は存在しなかった。
ラパマイシン法では、取得した５６０株の中に、ＲＮＡ収量が親株の１．１０倍以上に向上した株が３株存在した。

以上の結果から、本発明の方法は、ＲＮＡ高収量を示す酵母変異株を、公知のＲＮＡ高含量を示す株の取得方法であるＫＣｌ法及びラパマイシン法の１０倍以上の効率で取得できることが明らかになった。

（実施例３）本願発明により取得された変異株を用いた工業的ＲＮＡ生産検討
工業的ＲＮＡ生産を行う際には、小スケールにおいてはＲＮＡ高収量を示すが、スケールアップを行った際にはＲＮＡ収量が低下する株が見出され、しばしば問題となる。
そこで、本実施例３においては、実施例１で取得した変異株を用いた工業的なＲＮＡ生産の実現可能性を検討するために、培養をスケールアップし、ファーメンターを用いて回分培養を行った。

検討には、実施例１にて取得したＲＮＡ高収量変異株であるＮＶ−９（実施例１におけるＲＮＡ収量：親株比１．１１倍）と、ＮＶ−４２（実施例１におけるＲＮＡ収量：親株比１．１６倍）と、ＮＶ−４６（実施例１におけるＲＮＡ収量：親株比１．１２倍）の３株を用いた。上記３株をあらかじめフラスコ内で種培養しておき、３Ｌファーメンターへ植菌して回分培養を行った。
培地組成は４．２％グルコース、０．２％塩化カリウム、６００ｐｐｍ硫酸マグネシウム・７水和物、８．３ｐｐｍ塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物、６．３ｐｐｍ塩化マンガン４水和物、０．５ｐｐｍ硫酸銅・５水和物、１０ｐｐｍ硫酸亜鉛・７水和物、２．２ｇ／Ｌリン酸一アンモニウム、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．０２５％ＡｄｅｋａｎｏｌＬＧ−１０９とした。培養条件は、培地液量１．５Ｌ、液温３０℃、攪拌回転速度１０００ｒｐｍ、通気１．３ｖｖｍとし、溶存酸素量が０．２ｍｇ／Ｌを下回らないように、状況に応じて酸素ガスを通気した。また、ｐＨ３．２以上を維持するように１４％のアンモニア水を滴下し、ｐＨを維持した。
得られた培養液から、前述の方法によってＲＮＡ抽出液を得て、ＲＮＡ収量を算出した。

本実施例の結果、それぞれの菌株培養液より得られた抽出液中の、親株ＲＮＡ収量に対する変異株ＲＮＡ収量比は、表２のとおりであった。

本発明によりＮＢＲＣ０９８８株から得られた３株は、いずれも安定して、小スケールと同等の親株比１．１０倍以上のＲＮＡ高収量を示した。
本実施例の結果から、本発明によって選抜された変異株は、ファーメンター培養においても、安定してＲＮＡ高収量を示すことが明らかとなった。

以上より、本発明によって、親株に比べてＲＮＡ高収量を示す酵母変異株を、既存の変異株取得方法と比較して極めて高い効率で取得することができることが明らかとなった。
加えて、本発明によって取得されたＲＮＡ高収量を示す株は、培養のスケールを大きくしても安定してＲＮＡ高収量を示すことから、工業的なＲＮＡ生産に好適であることが明らかとなった。

Claims

下記（１）〜（３）の工程を含む、親株に比べてＲＮＡ収量が向上したキャンディダ属酵母変異株の取得方法。
（１）酵母に変異原処理を行う工程、
（２）変異原処理した酵母菌株の中から、バニリン耐性を有する変異株を選抜する工程、
（３）選抜された株の中から、親株よりもＲＮＡ収量の高い株を取得する工程。
請求項１に記載の方法で酵母変異株を取得する工程、
取得した酵母変異株を好気的に培養する工程、
培養した酵母よりＲＮＡを抽出する工程、
を含むことを特徴とする、ＲＮＡの製造方法。