JP6172814B2 - 高いリボ核酸収量を示す酵母の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、高いリボ核酸収量を示す酵母の製造方法に関するものである。

ＲＮＡ（リボ核酸）は、旨味調味料、機能性食品や医薬品の原料として使用され、ＲＮＡを効率よく製造する技術は、産業上重要である。

ＲＮＡを製造するには、酵母を炭素源、窒素源、リン源を含む培地で培養し、酵母菌体からＲＮＡを抽出する方法が一般的に用いられている。ＲＮＡを効率よく製造する試みは以前から多く見られ、例えば、酵母菌体のＲＮＡ含量を高める方法や、得られた酵母菌体内のＲＮＡを効率よく抽出する方法などである。

前者の例としては、実用的には菌株の育種が主に行われており、塩化カリウムに感受性を示す変異株を取得する方法（非特許文献１）、低温環境下で生育が著しく阻害される変異株を探索する方法（特許文献１）、チアジン・オキサジン系色素、およびアクリジン系色素に対する耐性を有する変異株を探索する方法（特許文献２）、Ｒｒｎ１０欠損株で生育のよい株に対して、Ｒｒｎ１０遺伝子を再導入する方法（特許文献３）、ＦＯＢ１遺伝子を欠損された株を得る方法（特許文献４）などが挙げられる。

後者としては、界面活性剤とともに酵母菌体を加熱する方法（特許文献５）、苛性ソーダなどのアルカリ溶液中で抽出する、もしくはアルカリで前処理して酸で中和して生成する塩の存在下で加温抽出する方法（特許文献６）などが知られているが、廉価で、高品質なＲＮＡを取得する手法として、弱酸性条件下、４０〜６０℃にて処理された菌体を中和し、塩水を加えて、９５℃加熱抽出する方法があげられ（特許文献７）、工業規模の生産では本法がよく採用されている。
ただし、酵母菌体からのＲＮＡの抽出は、使用する菌株の種類や培地成分、酵母菌体の状態によって抽出収量が大きく異なるという難点があった。

一方、ＲＮＡを得るための工業的酵母培養法としては、回分培養や流加培養、連続培養などの手法が用いられるが、コスト面や設備の規模の面から、連続培養を選択する場合が多い。したがって、連続培養を行う上で、安定的に高い収量でＲＮＡを取得できる酵母株を取得することは、ＲＮＡの安定的な工業生産を行う上で重要と考えられるが、そのような酵母株の取得方法については知られていなかった。

特公昭５６−４６８２４号 特公昭４８−３２３５０号 特開２００９−５０２４７号 特開２００７−７５０１３号 特公昭４５−３３６５７号 特公昭３８−８１４０号 特公昭５２−１８２００号

土井等， 日農化講演要旨、Ｐ３４７（１９７４）

したがって本発明の課題は、高ＲＮＡ収量を有する酵母、中でも工業的ＲＮＡ生産に適した酵母菌株の取得法を確立することにある。

発明者らは、上記のような課題を解決すべく、酵母を用いたＲＮＡの製造方法を検討する中で、マクロライド系抗生物質耐性を有する酵母変異株を選抜することで、高いＲＮＡ収量を示す株を効率的に取得することができ、しかも当該取得した変異株は、連続培養においてとくに高いＲＮＡ収量となることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の方法によれば、親株に比べて高いＲＮＡ収量を示す酵母変異株を効率的に取得することができる。とくに、本発明の方法によって取得された高ＲＮＡ収量を示す株は、連続培養に用いたときにきわめて高いＲＮＡ収量を示すため、工業的なＲＮＡ生産にきわめて適した株となる。

本明細書において、ＲＮＡ収量とは、抽出されたＲＮＡ量を、元の培養液あたりの重量濃度で示した値（ｇ／Ｌ）をいう。

本発明の酵母変異株は、親株に比べて１．０５〜３倍のＲＮＡ収量を示し、とくに連続培養に用いたときには親株の１．２〜３倍のＲＮＡ収量を示す。このため、工業的ＲＮＡ生産にきわめて適した変異株である。

酵母としては、食品や医薬品原料の製造に通常用いることが可能な任意のものを用いることができ、たとえばキャンディダ属、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属などに属する酵母が挙げられる。さらなる具体例としては、キャンディダ属の例としてキャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）やキャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、サッカロマイセス属の例としてサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア属の例としてピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロマイセス属の例としてシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｐｏｍｂｅ）などを挙げることができる。中でも、ＲＮＡの製造に用いられることの多いキャンディダ属に属する酵母が好ましい。

本発明は（１）酵母に変異原処理を行う工程、（２）マクロライド系抗生物質耐性を有する酵母変異株を選抜する工程、（３）選抜された株の中から、親株よりもＲＮＡ収量の高い株を取得する工程を含む、高ＲＮＡ収量を有する酵母変異株の取得方法に関するものである。

（１）の変異原処理の方法はとくに限定されないが、紫外線や電離放射線などによる物理的な方法や、亜硝酸、ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸メチルを用いた化学的な方法など、公知の方法を用いればよい。

（２）のマクロライド系抗生物質に対する耐性を有する変異株を選抜する方法としては、たとえば、０．０２ｐｐｍ以上のマクロライド系抗生物質を含む寒天培地上に酵母を播種し、生存する株を選抜すればよい。マクロライド系抗生物質とは大環状ラクトンを有する抗生物質であり、例としてラパマイシン、レイナマイシン、ランカシディンＣ、タクロリムス（ＦＫ５０６）などを挙げることができる。

なお工程（１）と（２）は、（１）（２）の順に実施することもでき、または同時に行うこともできる。（１）（２）を同時に行う際には、マクロライド系抗生物質を含有する寒天培地に酵母の親株を播種し、寒天培地上の当該親株に対して紫外線照射を行うなどして変異原処理を行えばよい。その後、培地上にコロニーを形成する株を選抜することで、マクロライド系抗生物質耐性を有する変異株を選抜することができる。

（３）のＲＮＡ抽出収量の高い株を取得する方法としては、たとえば複数の耐性変異株をフラスコ内で小スケール培養し、酵母菌体から所定の方法でＲＮＡ抽出を行い、ＨＰＬＣ等の手法によりＲＮＡを定量して、親株より収量の高い株を選抜すればよい。

本発明の方法によれば、単に酵母に変異原処理を行い、高ＲＮＡ収量を示す株を選抜するだけの方法や、公知の高ＲＮＡ含量を示す株の取得方法（たとえば、塩化カリウム感受性株を取得する方法（非特許文献１））に比べて、きわめて効率よく高ＲＮＡ収量を示す株を取得することができる。また、本発明の方法によって取得された変異株は、単にＲＮＡ収量が高いだけでなく、連続培養に用いたときに、さらに高いＲＮＡ収量を示す。

本発明では、さらに取得した酵母変異株を好気培養し、培養した酵母よりＲＮＡを抽出することによるＲＮＡの製造法が提供される。ＲＮＡ製造においては、前述の方法で得られたマクロライド系抗生物質耐性変異株を炭素源、窒素源および無機塩等を含む培地で好気的に培養すればよい。

菌株を培養する培地組成としては、炭素源として通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選抜される、１種または２種以上が用いられ、窒素源としては硝酸およびその塩、尿素、アンモニア、およびその塩、およびコーンスティープリカー、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる１あるいは２種以上が使用される。さらに、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしてはリン酸一アンモニウム、リン酸、過リン酸石灰、水酸化カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等の工業用原料でよい。その他、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機イオンを添加してもよい。さらに、ビタミン、核酸関連物質等を添加してもよい。

培養形式としては、回分培養、流加培養あるいは連続培養のいずれでもよい。中でも連続培養であれば、本発明の酵母の特性によって、より効率よくＲＮＡを取得することが可能となり、好ましい。

培養温度は一般的な酵母の培養条件に従えばよく、たとえば２０℃〜４０℃、望ましくは２５℃〜３５℃がよく、ｐＨについては２．５〜８．０、望ましくは２．８〜６．０がよい。

ＲＮＡの抽出方法についても、公知の方法に従えばよい。たとえば、培養液を遠心分離して菌体を濃縮した後、塩酸等による酸性条件下で加熱処理する。その後、上清を除き、沈殿物に水を加えて濃縮スラリーを調製し、アルカリで中和させた後、塩化ナトリウム等の塩を加えて加熱処理する。得られた加熱処理物を遠心分離に供し、上清を回収することによりＲＮＡ抽出液を得ることができる。

以下、本発明を実施例を挙げて説明する。本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

（実施例１）変異株の取得
親株として、製品評価技術基盤機構に寄託されているキャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８株およびヤマサ醤油保有菌株であるＭ２５−１５０株を用いた。当該親株を、ＹＭ培地（０．６％酵母エキス、０．６％麦芽エキス、１％バクトトリプトン、２％グルコース、２％寒天）を含む試験管にて１昼夜培養した。培養した菌体を回収し、２ｐｐｍのラパマイシンを含む、グルコースを唯一の炭素源とした寒天培地に播種し、紫外線照射（ＵＶランプ：Ｐａｎａｓｏｎｉｃ ＧＬ−１５、波長２５３．７ｎｍ）により、致死率７０−８０％となるような条件で変異処理を行った。変異処理した寒天培地を３昼夜３０℃で培養し、耐性株のコロニー形成を確認した。

ＮＢＲＣ０９８８株系統より得られた４８０株の耐性株およびＭ２５−１５０株系統より得られた１０４０株の耐性株を小規模で培養し、得られた菌体をＨＣｌ存在下ｐＨ２〜３．５にて６０℃にて１０分前処理したのち、９５℃で４時間加熱して得られた抽出液中のＲＮＡ含量が親株に比べて高い株を選抜することによって、ＮＢＲＣ０９８８株系統よりＮＲ−７、ＮＲ−２１、ＮＲ−２２の３株、Ｍ２５−１５０株からＯＲ−３９、ＯＲ−４０の３株をそれぞれ取得した。

（実施例２）回分培養におけるＲＮＡ製造および収量の比較
親株であるＮＢＲＣ０９８８株、Ｍ２５−１５０株および実施例１で取得した変異株６株を、あらかじめフラスコ内で種培養しておき、３Ｌファーメンターへ植菌して回分培養を行った。
培地組成は４．２％グルコース、０．２％塩化カリウム、６００ｐｐｍ 硫酸マグネシウム・７水和物、８ｐｐｍ 塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物、６ｐｐｍ 塩化マンガン４水和物、０．５ｐｐｍ 硫酸銅・５水和物、１０ｐｐｍ硫酸亜鉛・７水和物、２．２ｇ／Ｌ リン酸一アンモニウム、 ５ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム、０．０２５％ Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９とした。培養条件は、培地液量１．５Ｌ、液温３０℃、攪拌回転速度１０００ｒｐｍ、通気１．３ｖｖｍとし、溶存酸素量が０．２ｍｇ／Ｌを下回らないように、状況に応じて酸素ガスを通気した。また、ｐＨ３．２以上を維持するように１４％のアンモニア水を滴下し、ｐＨを維持した。

得られた培養液を、乾燥菌体重量が１０〜１５％となるように遠心分離で菌体を濃縮した後、６０℃に加温し、ｐＨ２．０〜３．５となるよう塩酸を添加して１０分間加熱処理を行った。その後、遠心分離上清を除き、沈殿物に対して水を加えて、もとの培養液の１５％量にけん濁液を調製した。けん濁液を塩化ナトリウム水溶液で中和した後、食塩を４％となるよう添加し、９５℃にて４時間加熱処理した。得られた加熱処理物を遠心分離に供し、上清を回収した。沈殿物に対して、加熱処理液と等量の水を加えて再けん濁させ、再度遠心分離に供して上清を回収した。回収した上清をあわせ、これをＲＮＡ抽出液とした。

得られたＲＮＡ抽出液を適当に希釈し、ゲル浸潤高圧液体クロマトグラフィー（以下ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣカラムはＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ_ＸＬを用い、移動層として７Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液を使用し、高分子領域における２６０ ｎｍ紫外光吸収物質を検出した。あらかじめシュミット・タンホイザー・シュナイダーの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６、１６４、７４７］（以下ＳＴＳ法）により定量しておいたＲＮＡ溶液を同様の分析に供し、その紫外吸収ピーク面積から、抽出液中のＲＮＡ収量を定量した。

それぞれの菌株培養液より得られた抽出液中のＲＮＡ収量は表１および２のとおりであった。本発明によりＮＢＲＣ０９８８株から得られた３株は、安定して高いＲＮＡ収量を示した。Ｍ２５−１５０株については、ＮＢＲＣ０９８８株よりも比較的安定して高いＲＮＡ収量が得られる株であるが、本発明によりＭ２５−１５０株から得られた２株はそれにも増して高収量でＲＮＡを抽出可能であった。

（実施例３）公知のスクリーニング方法との比較
本発明の方法と、ＲＮＡ含量の高い株を取得する方法として公知である塩化カリウム（ＫＣｌ）感受性株を取得する方法（以下「ＫＣｌ法」と表記する場合がある）のそれぞれについて比較した。
ＫＣｌ感受性株を取得する方法を行う際には、親株としてキャンディダ・ユティリスＮＢＲＣ０９８８株を用いた。当該親株を、ＹＭ培地（０．６％酵母エキス、０．６％麦芽エキス、１％バクトトリプトン、２％グルコース、２％寒天）を含む試験管にて１昼夜培養した。培養した菌体を回収し、グルコースを唯一の炭素源とした寒天培地に播種した上で、紫外線照射（ＵＶランプ：Ｐａｎａｓｏｎｉｃ ＧＬ−１５、波長２５３．７ｎｍ）により、致死率７０−８０％となるような条件で変異処理を行った。

ＵＶ照射処理によって得られた変異株コロニーを採取し、先述の寒天培地ならびにそれに８％ ＫＣｌを添加した寒天培地上にて菌を生育させ、ＫＣｌを含まない培地でのみ良好な生育を示す株を選ぶという手法により、６８０株のＫＣｌ感受性株を得た。その中から、親株であるＮＢＲＣ０９８８株より１割以上ＲＮＡ収量が向上している変異株を探索したところ、最もＲＮＡ収量の高かった株でもＲＮＡ収量は親株の１．０８倍であり、１割以上ＲＮＡ収量の向上した変異株を発見することはできなかった。

一方、本発明の方法では、実施例１および２に記載したように、ＮＢＲＣ０９８８株を親株として得た４８０株のラパマイシン耐性株のうち、親株よりも１割以上ＲＮＡ収量が向上している株が３株得られた（実施例２および表１を参照）。

以上の結果から、本発明の方法は、公知の高ＲＮＡ含有株の取得方法であるＫＣｌ法と比較して、ＲＮＡ収量の大きく向上した株を効率的に取得できる方法であることが明らかになった。

（実施例４）連続培養におけるＲＮＡ製造および収量の比較
本発明の方法で得られた酵母変異株およびその親株について、連続培養に用いたときのＲＮＡ収量を検討した。
実施例１で取得した変異株およびその親株として、ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＲ−７、ＮＲ−２２、Ｍ２５−１５０、ＯＲ−３９およびＯＲ−４０を、あらかじめフラスコ内で種培養しておき、３Ｌファーメンターへ植菌して連続培養を行った。培地組成は、５．２５％ グルコース、０．２％塩化カリウム、６００ｐｐｍ 硫酸マグネシウム・７水和物、８ｐｐｍ 塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物、６ｐｐｍ 塩化マンガン４水和物、０．５ｐｐｍ 硫酸銅・５水和物、１０ｐｐｍ硫酸亜鉛・７水和物、２．２ｇ／Ｌ リン酸一アンモニウムとした。培養条件は、培地液量１．５Ｌ、液温３０℃、攪拌回転速度１０００ｒｐｍ、通気１．３ｖｖｍとし、溶存酸素量が０．２ｍｇ／Ｌを下回らないように、状況に応じて酸素ガスを通気した。培養中はｐＨ３．２以上を維持するように１４％のアンモニア水を滴下し、ｐＨを維持した。連続培養の通液速度は、ＮＢＲＣ０９８８株およびその変異株であるＮＲ−７、ＮＲ−２２では希釈率Ｄ＝０．３６ ｈ^−１、Ｍ２５−１５０株およびその変異株であるＯＲ−３９、ＯＲ−４０ではＤ＝０．２８ ｈ^−１にて行った。

液出口より培養液を回収し、実施例２の方法に従い、培養液当たりのＲＮＡ収量を求めた結果、表３および４のとおりであった。結果、親株であるＮＢＲＣ０９８８およびＭ２５−１５０では、回分培養と連続培養においてＲＮＡ収量に大きな違いはなかったのに対し、変異株では連続培養においてとくにＲＮＡ収量がよく増加していた。

一方、ＫＣｌ法において取得された中で、最もＲＮＡ収量の高かった変異株（回分培養においてＲＮＡ収量が親株の１．０８倍）についても同様に、連続培養したときのＲＮＡ収量を検討した。その結果、連続培養時における当該変異株のＲＮＡ収量は、親株であるＮＢＲＣ０９８８株のＲＮＡ収量とほぼ同等（約１．０倍）であった。
したがってＫＣｌ法において取得された変異株では、連続培養に用いたとき、とくにＲＮＡ収量は増加していなかった。

以上の結果から、ＮＢＲＣ０９８８およびＭ２５−１５０のいずれを親株に用いた場合であっても、本発明の方法によって取得されたすべての変異株は、単に親株に比べてＲＮＡ収量が高いだけでなく、とくに連続培養時においてきわめて高いＲＮＡ収量を示すという、ＲＮＡの実用生産にきわめて適した性質をもつ菌株であることが明らかになった。

Claims (3)

1. 下記（１）〜（３）の工程を含む取得方法によって、連続培養に用いたとき、親株に比べて１．２倍〜３．０倍のＲＮＡ収量を示す酵母変異株を取得する方法。
   （１）酵母に変異原処理を行う工程、
   （２）変異原処理した酵母菌株の中から、ラパマイシン耐性を有する変異株を選抜する工程、
   （３）選抜された株の中から、親株よりもＲＮＡ収量の高い株を取得する工程。
2. 酵母がキャンディダ属に属するものである、請求項１に記載の取得方法。
3. 請求項１または２に記載の方法で得られた酵母変異株を好気的に連続培養し、培養した酵母よりＲＮＡを抽出することによる、ＲＮＡの製造方法。