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JP6870051B2 - エリブリンをベースとする抗体−薬物コンジュゲート及び使用方法 - Google Patents

エリブリンをベースとする抗体−薬物コンジュゲート及び使用方法 Download PDF

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Description

本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年３月２日出願の米国特許仮特許出願第６２／３０２，５６２号に対する優先権の利益を主張する。
本開示は、葉酸受容体アルファなどのヒト腫瘍抗原標的に結合し、及び／または抗チューブリン薬物活性をもたらす抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。本開示はさらに、葉酸受容体アルファを発現し、及び／またはチューブリンの破壊による処置に適しているがんの処置及び診断において有用な方法及び組成物に関する。
がんは世界的に、罹患及び死亡の主な原因のうちの１つであり、２０１２年には約１４００万の新たな症例及び８２０万のがん関連死があった。がんによる死亡の最も共通する原因は、肺癌（１５９万人の死亡）；肝臓癌（７４５，０００人の死亡）；胃癌（７２３，０００人の死亡）；結腸直腸癌（６９４，０００人の死亡）；乳癌（５２１，０００人の死亡）；及び食道癌（４００，０００人の死亡）である。新たながんの症例数は、来る２０年で約７０％、１年当たり約２２００万の新たながん症例へと増加すると予測されている（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１４）。
微小管は、細胞内移行及び輸送、細胞シグナル伝達、ならびに細胞形状の維持を含む様々な細胞機能に関係する動的な線維状の細胞骨格タンパク質である。微小管はまた、染色体を２つの娘細胞に分離するために必要な有糸分裂紡錘体を形成することにより、有糸分裂細胞分裂において重要な役割を果たす。すべての細胞における微小管の生物学的機能は大部分、それらの重合ダイナミクスにより調節され、これは、微小管の両端でのα及びβチューブリン二量体の可逆的な非共有結合性の付加により生じる。この動的挙動及びその結果生じる微小管の長さにわたる制御は、紡錘体の適正な機能に非常に重要である。微小管ダイナミクスのわずかな変化でさえ、紡錘体チェックポイントに連動し、有糸分裂における細胞周期の進行を停止させ、続いて、細胞死をもたらし得る（Ｍｕｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１３：２７５−８４）。それらの急速な細胞分裂により、がん細胞は一般に、チューブリンに結合し、その正常な機能を破壊する化合物に対して、正常な細胞よりも感受性がある。この理由で、チューブリン阻害薬及び他の微小管標的薬は、がんを処置するための有望な薬物群となっている（Ｄｕｍｏｎｔｅｔ ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９：７９０−８０３）。
葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）は、葉酸に結合するグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合膜タンパク質である。正常組織及びがん性組織の生物学におけるＦＲＡの役割は、完全には理解されていないが、上皮由来の卵巣癌の高いパーセンテージで（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３２（３）：２５８−６８）、さらには、非小細胞肺癌のあるパーセンテージでは高度に過剰に発現される（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ １５（５）：３２０−３０）。ＦＲＡはまた、正常な組織では発現を制限している。これらの特性により、ＦＲＡは、がん免疫療法のための魅力的な標的となっている。
がん原遺伝子ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーに属する膜貫通チロシンキナーゼ受容体をコードする（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９７４−６）。ＨＥＲ２の過剰発現は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路などの成長因子シグナル伝達経路の構成的活性化を可能にし、それにより、侵襲性乳癌の約２０％を含む数種のがんにおいて発がんドライバー（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｄｒｉｖｅｒ）として役立つ（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７−１２； Ｇａｊｒｉａ ａｎｄ Ｃｈａｎｄａｒｌａｐａｔｙ（２０１１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１：２６３−７５）。ＨＥＲ２増幅が形質転換表現型を媒介するということから、ＨＥＲ２は、がん処置のための別の有望な標的である。
本開示は一部では、腫瘍細胞に対して生物学的活性を有する新規化合物を提供する。その化合物は、哺乳類において腫瘍増殖を阻害することができ、ヒトがん患者を処置するために有用であり得る。
本開示はより具体的には、腫瘍細胞（例えば、ＦＲＡ発現性腫瘍細胞）と結合し、それに内在化し、それを死滅させることができる抗体−薬物コンジュゲート化合物に関する。薬物部分を抗体部分に結合するリンカーを含む抗体−薬物コンジュゲート化合物を開示する。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物は、式Ｉにより表され得る：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
［式中、Ａｂは、腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片であり；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、ＡｂをＤに共有結合する切断可能なリンカーであり；
ｐは、１〜２０の整数である］。
一部の実施形態では、ＡＤＣが、細胞外条件に存在する場合にはインタクトなままであるが、細胞、例えば、がん細胞内に内在化されると切断され得るように、リンカーは、細胞外では安定的である。一部の実施形態では、エリブリン薬物部分は、ＡＤＣが、ＡＤＣの抗体部分に特異的な抗原を発現する細胞に進入すると、抗体部分から切断され、切断により、エリブリンの未修飾形態が放出される。一部の実施形態では、リンカーは、切断された際に、エリブリン薬物部分に結合したままになっているリンカーの部分または抗体部分がないように配置されている切断可能な部分を含む。
一部の実施形態では、リンカー内の切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分である。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分を含むＡＤＣは、代替の切断可能な部分を含むＡＤＣに対して、低い凝集レベル、抗体：薬物比の改善、がん細胞のオンターゲット死滅の増加、非がん細胞のオフターゲット死滅の減少、及び／または高い薬物負荷（ｐ）を実証する。一部の実施形態では、切断可能な部分の付加は、切断不可能なリンカーに対して、細胞傷害性及び／または効力を上昇させる。一部の実施形態では、効力及び／または細胞傷害性の上昇は、ＡＤＣの抗体部分により標的とされる抗原を中等度のレベルで発現するがん（例えば、中等度のＦＲＡ発現）においてである。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、酵素により切断可能であり、リンカーは、酵素切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、酵素は、カテプシンであり、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーである。特定の実施形態では、酵素切断可能なリンカー（例えば、カテプシン切断可能なリンカー）は、代替の切断機構と比較すると、上述の改善される特性の１つまたは複数を示す。
一部の実施形態では、リンカー内の切断可能なペプチド部分は、アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）を含む。一部の実施形態では、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含むＡＤＣは、代替のアミノ酸ユニットまたは代替の切断可能な部分を含むＡＤＣに対して、安定性の上昇、オフターゲットな細胞死滅の減少、標的上の細胞死滅の増加、低い凝集レベル、及び／または高い薬物負荷を実証する。
一部の実施形態では、リンカーは、抗体部分を切断可能な部分に接続する少なくとも１個のスペーサーユニットを含む。一部の実施形態では、リンカー内のスペーサーユニットは、少なくとも１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでよい。ＰＥＧ部分は、例えば、−（ＰＥＧ）ｍ−を含んでよく、ここで、ｍは、１〜１０の整数である。一部の実施形態では、リンカー内のスペーサーユニットは、（ＰＥＧ）２を含む。一部の実施形態では、より短いリンカー長さにも関わらず、長いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）８）を含むＡＤＣに対して、短いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）２）を含むＡＤＣは、低い凝集レベル及び／または高い薬物負荷を実証する。
一部の実施形態では、リンカー内のスペーサーユニットは、マレイミド部分（Ｍａｌ）を介してＡＤＣの抗体部分に結合する。一部の実施形態では、Ｍａｌを介して抗体部分に結合しているリンカーを含むＡＤＣは、代替の部分を介して抗体部分に結合しているリンカーを含むＡＤＣに対して、高い薬物負荷を実証する。一部の実施形態では、リンカー内のＭａｌは、抗体部分の上のシステイン残基と反応性である。一部の実施形態では、リンカー内のＭａｌは、システイン残基を介して抗体部分に接続されている。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）ｍ、例えば、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２を含む。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットは、抗体部分を、リンカー内の切断可能な部分に結合する。一部の実施形態では、リンカー内の切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えば、アミノ酸ユニットである。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。
一部の実施形態では、リンカー内の切断可能な部分は、ＡＤＣのエリブリン薬物部分に直接接続しており、切断可能な部分は、抗体部分に直接接続しているか、またはスペーサーユニットを介して接続している。一部の実施形態では、スペーサーユニットはまた、リンカー内の切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結合する。一部の実施形態では、リンカー内の切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結合するスペーサーユニットは、自壊性（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）である。一部の実施形態では、自壊性スペーサーは、標的細胞内で非修飾エリブリンを放出することができる。一部の実施形態では、自壊性スペーサーユニットは、ｐ−アミノベンジルアルコールを含む。一部の実施形態では、自壊性スペーサーユニットは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）を含む。リンカー内のｐＡＢは、一部の実施形態では、切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結合する。一部の実施形態では、切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えば、アミノ酸ユニットである。一部の実施形態では、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ、及びＭａｌを介してリンカーを抗体部分に接続するスペーサーユニットを含む。
一部の実施形態では、ｐは、１〜６、２〜５、または好ましくは、３〜４の整数である。一部の実施形態では、ｐは、４である。一部の実施形態では、一群のＡＤＣを提供し、その群における平均ｐは、約４（例えば、３．５〜４．５、例えば、約３．８）である。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含み、ｐは、４である。一部の実施形態では、一群のＡＤＣを提供し、ここで、各ＡＤＣはＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含み、その群における平均ｐは、約４（例えば、３．５〜４．５、例えば、約３．８）である。
一部の実施形態では、ＡＤＣの内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片（ＡｂまたはＡｂ部分）は、抗葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）抗体または内在化型抗体断片であり、ＦＲＡ発現性腫瘍細胞に結合することができる（すなわち、ＡＤＣは、ＦＲＡ発現性細胞を標的とする）。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ Ａｂ部分及び切断可能なペプチド部分を含むＡＤＣは、切断不可能なリンカーまたは代替の切断機構に対して、低い凝集レベル、抗体：薬物比の改善、がん細胞のオンターゲット死滅の増加、非がん細胞のオフターゲット死滅の減少、高い薬物負荷（ｐ）、細胞傷害性及び／または効力の上昇を実証する。一部の実施形態では、効力及び／または細胞傷害性の上昇は、ＡＤＣの抗体部分により標的とされる抗原を中等度のレベルで発現するがん（例えば、中等度のＦＲＡ発現）においてである。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、酵素により切断可能であり、リンカーは、酵素切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、酵素は、カテプシンであり、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーである。特定の実施形態では、酵素切断可能なリンカー（例えば、カテプシン切断可能なリンカー）は、代替の切断機構と比較すると、上述の改善された特性のうちの１つまたは複数を示す。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）ｍ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢである。
一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）に結合し、ＦＲＡ発現性腫瘍細胞を標的とする。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、その際、重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号２からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号７からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９からなる軽鎖ＣＤＲ３を含むか；または重鎖ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１３からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；軽鎖ＣＤＲは、配列番号１６からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号２３の重鎖可変ドメイン及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性は、配列番号２３の重鎖可変ドメイン及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープへの結合について競合し、及び／または、それに結合する。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、アラニン−ヒスタジン−リシン−アスパラギン酸（ＡＨＫＤ）を含むエピトープ（配列番号３６５）に結合する（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２：１２２７−４３）。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ＮＴＳＱＥＡＨＫＤＶＳＹＬを含むエピトープ（配列番号３６６）に結合する。
一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、内在化型抗ＦＲＡ抗体または内在化型抗原結合性断片である。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、その際、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号２からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号４からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号７からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９からなる軽鎖ＣＤＲ３を含むか；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号１３からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；軽鎖ＣＤＲは、配列番号１６からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８からなる軽鎖ＣＤＲ３を含み；リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含み；ｐは、４である。一部の実施形態では、一群のそのようなＡＤＣを提供し、ｐは、約４（例えば、約３．８）である。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号２３の重鎖可変ドメイン及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性は、配列番号２３の重鎖可変ドメイン及び配列番号２４の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープへの結合について競合し、及び／またはそれに結合する。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号３６５を含むエピトープに結合する。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号３６６を含むエピトープに結合する。
一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒト上皮成長因子受容体２（ｈｅｒ２）に結合し、ｈｅｒ２発現性腫瘍細胞を標的とする。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、その際、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号７１からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号７４からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６からなる軽鎖ＣＤＲ３を含むか；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号１９１からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９２からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９３からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；軽鎖ＣＤＲは、配列番号１９４からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９５からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９６からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク配列を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号２７の重鎖可変ドメイン及び配列番号２８の軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性は、配列番号２７の重鎖可変ドメイン及び配列番号２８の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープへの結合について競合し、及び／またはそれに結合する。
一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、内在化型抗ｈｅｒ２抗体または内在化型抗原結合性断片である。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、その際、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号７１からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号７４からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７６からなる軽鎖ＣＤＲ３を含むか；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号１９１からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９２からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９３からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；軽鎖ＣＤＲは、配列番号１９４からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９５からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９６からなる軽鎖ＣＤＲ３を含み；リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含み；ｐは、４である。一部の実施形態では、一群のそのようなＡＤＣを提供し、ｐは約４（例えば、約３．８）である。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号２７の重鎖可変ドメイン及び配列番号２８の軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性は、配列番号２７の重鎖可変ドメイン及び配列番号２８の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープへの結合について競合し、及び／またはそれに結合する。
一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、メソテリン（ＭＳＬＮ）に結合し、ＭＳＬＮ発現性腫瘍細胞を標的とする。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、その際、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号６５からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号６８からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６９からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７０からなる軽鎖ＣＤＲ３を含むか；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号１８５からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８６からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８７からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；軽鎖ＣＤＲは、配列番号１８８からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８９からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９０からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号２５の重鎖可変ドメイン及び配列番号２６の軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性は、配列番号２５の重鎖可変ドメイン及び配列番号２６の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープへの結合について競合し、及び／またはそれに結合する。
一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、内在化型抗ＭＳＬＮ抗体または内在化型抗原結合性断片である。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、その際、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号６５からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６７からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；３つの軽鎖ＣＤＲは、配列番号６８からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６９からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７０からなる軽鎖ＣＤＲ３を含むか；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、重鎖ＣＤＲは、配列番号１８５からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８６からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８７からなる重鎖ＣＤＲ３を含み；軽鎖ＣＤＲは、配列番号１８８からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８９からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９０からなる軽鎖ＣＤＲ３を含み；リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含み；ｐは、４である。一部の実施形態では、一群のそのようなＡＤＣを提供し、ｐは約４（例えば、約３．８）である。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、配列番号２５の重鎖可変ドメイン及び配列番号２６の軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態では、内在化型抗体または内在化型抗原結合性は、配列番号２５の重鎖可変ドメイン及び配列番号２６の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープへの結合について競合し、及び／またはそれに結合する。
記載のＡＤＣのいずれかの多数のコピーを含む組成物も、本明細書では提供し、その際、組成物中のＡＤＣの平均薬物負荷（平均ｐ）は、約３〜４、または約３．５〜約４．５、または約４である。一部の実施形態では、平均ｐは、約３．２〜３．８である。一部の実施形態では、平均ｐは、約３．６〜４．４である。
−Ｌ−Ｄを含み、Ｄが、エリブリンであり；Ｌが、Ｄに共有結合している切断可能なリンカーである組成物も、本明細書では提供する。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、エリブリンの上のＣ−３５アミンに共有結合している。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ＰＥＧスペーサーユニットを含む。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。
さらに、ＡＤＣと、薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／または添加剤とを含む医薬組成物を本明細書では提供する。
本開示の別の態様は、例えば、がんの処置における記載のＡＤＣ化合物及び組成物の治療上及び診断上の使用を含む。別の態様は、ＦＲＡなどの、ＡＤＣの抗体部分により標的とされる抗原を発現するがんを処置する方法を含む。さまざまな実施形態で、記載のＡＤＣのいずれか１つの治療有効量及び／またはレジメンを投与することにより、腫瘍細胞またはがん細胞を死滅させる、またはその増殖を阻害する方法を提供する。別の態様は、開示のＡＤＣを使用して、ＦＲＡを発現する腫瘍細胞またはがん細胞を検出する方法、及び記載のＡＤＣでの処置に応答するであろうがん患者をスクリーニングする方法を含む。一部の実施形態では、がんは、胃癌、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、三重陰性乳癌、子宮内膜癌、漿液性子宮内膜癌、肺類癌、または骨肉腫である。記載のＡＤＣを生成する方法も開示する。
特定の実施形態で開示されているとおりに、ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣを調製するために使用される方法の１つを示している。このアプローチでは、非対合システインを、限定モル当量の非チオール還元剤ＴＣＥＰで部分的に還元することにより生成する。このアプローチは、鎖内ジスルフィド結合をインタクトなままにしながら、軽鎖及び重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合（１つのＨ−Ｌ対合１つ当たり１対）及びヒンジ領域の２つの重鎖（ヒトＩｇＧ１の場合は１つのＨ−Ｈ対合１つ当たり２対）を優先的に還元させる。 特定の実施形態で開示されているとおりに、マレイミド−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン（ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−ＶＣＰ−エリブリン）を合成する方法を示している。 ＭＯＲＡｂ−００３での還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。レーンは、図の右側に示されている。レーンＭは、タンパク質標準に対応し；レーン１は、未処理ＭＯＲＡｂ−００３に対応し；レーン２は、７０．６μＭ ＴＣＥＰで還元させた５．３ｍｇ／ｍＬに対応し；レーン３は、１４１．２μＭ ＴＣＥＰで還元させたＭＯＲＡｂ−００３ ５．３ｍｇ／ｍＬに対応し；レーン４は、２０μＭ ＴＣＥＰで還元させたＭＯＲＡｂ−００３ １．５ｍｇ／ｍＬに対応し；レーン５は、４０μＭ ＴＣＥＰで還元させたＭＯＲＡｂ−００３ １．５ｍｇ／ｍＬに対応する。各バンドのアイデンティティは、右下のゲル上に示されている。「Ｈ」は、重鎖を示す。「Ｌ」は、軽鎖を示す。 ＭＯＲＡｂ−００３での還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。レーン１は、タンパク質標準に対応し；レーン２は、未処理ＭＯＲＡｂ−００３に対応し；レーン３は、１：１のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応し；レーン４は、１：２のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応し；レーン５は、１：３のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応し；レーン６は、１：４のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応する。 Ｍ−ＭＭＡＥ（レーン２）、Ｍ−ＤＭ１（レーン３）、Ｍ−００２６（レーン４）、Ｍ−０２６０（レーン５）、Ｍ−０２６７（レーン６）、Ｍ−０２７２（レーン７）、Ｍ−０２８５（レーン８）、Ｍ−０２９２（レーン９）、Ｍ−０２７−０３８１（レーン１０）、及びＭ−０２８４（レーン１１）を含む、選択されたＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。 図６Ａは、ＭＯＲＡｂ−００３−マレイミド−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン（Ｍ３−ＶＣＰ−エリブリン、または「ＭＯＲＡｂ−２０２」）のバイスタンダー細胞傷害性アッセイの結果を示している。図６Ｂは、ＭＯＲＡｂ−００３−マレイミド−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−ＥＲ−００１１５０８２８（Ｍ３−ＥＲ−６１３１８）のバイスタンダー細胞傷害性アッセイの結果を示している。図６Ｃは、ＭＯＲＡｂ−００３−ＰＥＧ−ｐＡＢ−デュオスタチン（ｄｕｏｓｔａｔｉｎ）３（Ｍ３−０２７−０２８５）のバイスタンダー細胞傷害性アッセイの結果を示している。それぞれの図の説明に示されている情報は、細胞系：試験した薬剤（培養した細胞系（複数可）、１ｓｔ／２ｎｄ細胞系の播種密度）を示している。 図７Ａ及び７Ｂは、特定の実施形態で開示されているとおり、非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３に対する、ＡＤＣのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（図７Ａ）及びＭＯＲＡｂ−００３−０２８５（図７Ｂ）の薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）分布を示している。各ピークの上の数値は、個々の種のＤＡＲを示している。 細胞傷害性分析の結果、すなわち、ＩＧＲＯＶ１またはＳＪＳＡ−１細胞におけるＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリンと非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３（２μＭ）との競合を示している。 ビヒクル（ＰＢＳ）、または１０、２０、４０、もしくは８０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２の単回静脈内投与で処置されたＣＤ−１マウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での体重動態を示している。 ｑ４ｄ×３投与計画（用量を４日ごとに１回、合計３用量で投与）に従って、ＰＢＳで、または０．４、０．８、１．６、もしくは３．２ｍｇ／ｋｇのエリブリンで静脈内処置されたＣＤ−１マウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での体重動態を示している。 ｈＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞（群平均及びＳＥＭ）を移植され、かつＰＢＳ、１、２．５、もしくは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−０２８５の単回静脈内投与で処置されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの各群での腫瘍増殖動態を示している。 ｈＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞を移植された個々のＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの、１７日目での腫瘍体積、さらには群平均及びＳＥＭを示している。群を、ＰＢＳ、１、２．５、もしくは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−０２８５の単回静脈内投与で処置した。 ＰＢＳ、１、２．５、もしくは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−０２８５の単回静脈内投与で処置されたＮＣＩ−Ｈ２１１０−移植されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの各群の体重動態（群平均及びＳＥＭ）を示している。 ｑ４ｄ×３投与計画に従って、ビヒクル（ＰＢＳ）、または０．５、０．２、０．８、もしくは１．６ｍｇ／ｋｇのエリブリンで静脈内処置された、ＮＣＩ−Ｈ２１１０移植されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での腫瘍増殖動態を示している。 個々のＮＣＩ−Ｈ２１１０移植されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスの、２４日目での腫瘍体積、さらには群平均及びＳＥＭを示している。群を、ｑ４ｄ×３投与計画に従ってビヒクル（ＰＢＳ）、または０．５、０．２、０．８、もしくは１．６ｍｇ／ｋｇのエリブリンで静脈内処置した。 ｑ４ｄ×３投与計画に従って、ビヒクル（ＰＢＳ）、または０．５、０．２、０．８、もしくは１．６ｍｇ／ｋｇのエリブリンで静脈内処置された、ＮＣＩ−Ｈ２１１０移植されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での体重変化動態を示している。 Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ細胞傷害性アッセイにより測定した場合の、ＩＧＲＯＶ１、ＯＶＣＡＲ３、ＮＣＩ−Ｈ２１１０、Ａ４３１−Ａ３、及びＳＪＳＡ−１細胞に対するＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の効力を示している。 ＰＢＳ、または１、２．５、もしくは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内投与で処置された、ＮＣＩ−Ｈ２１１０移植されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での腫瘍増殖動態を示している。 図１９Ａ及び１９Ｂは、ビヒクル（ＰＢＳ）、５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内投与で処置されたＮＳＣＬＣ ＰＤｘ（ＬＸＦＡ−７３７）腫瘍担持マウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での腫瘍増殖動態（図１９Ａ）及び体重変化動態（図１９Ｂ）を示している。 図２０Ａ及び２０Ｂは、ＰＢＳ、０．１もしくは３．２ｍｇ／ｋｇのエリブリン、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内投与で処置された子宮内膜癌ＰＤｘ（Ｅｎｄｏ−１２９６１）腫瘍担持マウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での個々の腫瘍体積比（図２０Ａ）及び体重変化動態（図２０Ｂ）を示している。図２０Ｃ及び２０Ｄは、ＰＢＳ、０．１もしくは３．２ｍｇ／ｋｇのエリブリン、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内投与で処置された子宮内膜癌ＰＤｘ（Ｅｎｄｏ−１０５９０）腫瘍担持マウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での腫瘍増殖動態（図２０Ｃ）及び体重変化動態（図２０Ｄ）を示している。 抗ヒトＩｇＧ抗体での、ＴＮＢＣ ＰＤｘ（ＯＤ−ＢＲＥ−０６３１）腫瘍担持マウスにおける腫瘍組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を示している。ビヒクル（右側）、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）（左側）の単回静脈内投与で処置されたマウスからの腫瘍組織を、処置から５日後に収集及び染色した。 α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−ＦＩＴＣ抗体での、ＴＮＢＣ ＰＤｘ（ＯＤ−ＢＲＥ−０６３１）腫瘍担持マウスにおける腫瘍組織のＩＨＣ染色を示している。未処置マウスからの腫瘍組織を処置の２日前に収集し（左側）、５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内投与で処置されたマウスからの腫瘍組織を処置の５日後に収集した（右側）。 ビヒクル（ＰＢＳ）、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内投与で処置されたＴＮＢＣ ＰＤｘ（ＯＤ−ＢＲＥ−０６３１）腫瘍担持マウス（群平均及びＳＥＭ）の各群での腫瘍増殖動態を示している。 フローサイトメトリー分析により測定した場合の、ビヒクル（ＰＢＳまたはエタノール）、エリブリン、ＭＯＲＡｂ−００３、またはＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）で処置した後のＭＫＮ−７４細胞を含む培養中でのヒト骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の分化を示している。Ｓｔｒｏ−１＋／ＣＤ１０５＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３１−、及びＮＧ２＋は、それぞれＭＳＣ、脂肪細胞、及び周細胞のマーカーである。 ビヒクル（ＰＢＳ）、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の単回静脈内用量で処置されたＮＣＩ−Ｈ２１１０移植されたＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスからの、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−ＦＩＴＣ抗体で染色された腫瘍組織の時間経過分析を示している。腫瘍組織を収集し、０日目、ならびに処置後の３、５、７及び９日目に染色した。Ｙ軸：％＝［カウントされた染色細胞／カウントされた総細胞］×１００。Ｘ軸：日（カウントされた総細胞）。
開示の組成物及び方法は、本開示の一部を成している添付の図面と関連して次の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本開示の組成物及び方法は、本明細書において記載する、及び／または示す特定の組成物及び方法に限定されないこと、ならびに本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を単に例示することを目的としたものであって、特許請求の範囲に記載の組成物及び方法を限定することを意図したものではないことを理解されたい。
このテキストを通じて、説明は、組成物及び前記組成物を使用する方法に関する。本開示が、組成物と関連する特徴または実施形態を記載するか、または請求する場合、そのような特徴または実施形態は、前記組成物を使用する方法にも同様に適用可能である。同様に、本開示が、組成物を使用する方法と関連する特徴または実施形態を記載するか、または請求する場合、そのような特徴または実施形態は、組成物にも同様に適用可能である。
値の範囲が示されている場合、それは、その範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲内で述べられている値に対する言及は、その範囲内のいずれもすべての値を含む。すべての範囲が、それらの終点を包括し、かつ組合せ可能である。値が、先行する「約」の使用により、近似値として示されている場合、特定の値が別の実施形態を形成していることは理解されるであろう。特定の数値に対する言及は、文脈で別段に明確に指示されていない限り、少なくともその特定の値を含む。「または」の使用は、それを使用している具体的な文脈が別段に指示していない限り、「及び／または」を意味する。本明細書において引用する参考文献はすべて、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。参考文献と本明細書とが矛盾する場合には、本明細書が優先される。
明確にするために、本明細書において別々の実施形態の文脈において記載される本開示の組成物及び方法のある種の特徴を、単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは認められるべきである。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載されている本開示の組成物及び方法の様々な特徴を、別々に、または任意の部分的組み合わせで提供することもできる。
定義
説明の態様に関連する様々な用語を、本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用する。そのような用語は、別段に示さない限り、当技術分野におけるそれらの普通の意味を与えられているものとする。他の特別に定義する用語は、本明細書において提供する定義と整合するように、解釈されるべきである。
本明細書で使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段に指示していない限り、複数形を含む。
数値及び範囲の文脈における「約」または「おおよそ」という用語は、当業者であれば本明細書に含まれる教示から分かるであろうとおり、反応混合物中で所望の量の核酸またはポリペプチドを有するなど、実施形態を意図されているとおりに行うことができるような、挙げられている値または範囲に近似している、または近い値または範囲を指す。これは、少なくとも部分的に、核酸組成、年齢、人種、性別、解剖学的及び生理学的変化ならびに生態系の不正確さの様々な特性による。したがって、これらの用語は、系統的誤差から生じる値を越える値を含む。
「抗体−薬物コンジュゲート」、「抗体コンジュゲート」、「コンジュゲート」、「イムノコンジュゲート」、及び「ＡＤＣ」という用語は、互換的に使用され、抗体（例えば、抗ＦＲＡ抗体）に連結している化合物またはその誘導体を指し、一般式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ（式Ｉ）により定義される［式中、Ａｂ＝抗体部分（すなわち、抗体または抗原結合性断片）、Ｌ＝リンカー部分、Ｄ＝薬物部分、ｐ＝抗体部分１つ当たりの薬物部分の数］。
「抗体」という用語は、最も広い意味では、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上述の組合せを認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指すために使用される。抗体の重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。本出願の目的では、成熟重鎖及び軽鎖可変ドメインはそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端へ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４と配置されている、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）内の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。「抗体」は、天然に存在してもよいし、または慣用のハイブリドーマ技術により生産されるモノクローナル抗体など、人工的であってもよい。「抗体」という用語には、全長モノクローナル抗体及び全長ポリクローナル抗体、さらには、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖抗体が含まれる。抗体は、免疫グロブリンの５つの主な群：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、またはそのサブクラス（例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のいずれか１つであってよい。この用語はさらに、所望の生物学的活性を実証する限り、抗原認識部位を含有するヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び任意の修飾された免疫グロブリン分子を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する起こり得る変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原エピトープを指向する。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は典型的には、種々のエピトープを指向する（または、それらに特異的な）多数の抗体を含む。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法により抗体を生産することが必要であると解釈されるべきではない。例えば、本開示により使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよいし、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−８、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
本明細書に記載のモノクローナル抗体には具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体群もしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一である、もしくは相同している一方で、その鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するか、または別の抗体群もしくはサブクラスに属する抗体、さらには、それらが標的抗原と特異的に結合し、及び／または所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片における対応する配列と同一であるか、もしくは相同している、「キメラ」抗体が含まれる。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトにより産生される抗体またはヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列を有する抗体を指す。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２種以上の種に由来する抗体を指す。一部の例では、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、及び活性を有する、ある種に由来する抗体の可変領域に対応する一方で、定常領域は、別の種（例えば、ヒト）に由来する抗体と相同していて、後者の種における免疫応答を最小限にしている。
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）抗体、さらにはヒト抗体からの配列を含有する抗体の形態を指す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その際、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性、及び／または活性を精密化及び最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域で、及び／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかで、残基の置換によりさらに修飾されていてもよい。
抗体の「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原（例えば、ＦＲＡ）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗原結合性断片は好ましくは、抗原発現性細胞に内在化する能力も保持している。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、免疫エフェクター活性も保持している。全長抗体の断片は、全長抗体の抗原結合機能を果たし得ることが判明している。抗体の「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」という用語の範囲内に含まれる結合性断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）１つの可変ドメイン、例えば、ＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−６；及びＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９０／０５１４４を参照されたい）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらが、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成している１本のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）として作製されることを可能にする合成リンカーにより、それらを接続することができる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照されたい。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」という用語の範囲内に含まれることが意図されており、結合すると細胞内に内在化することができる結合性断片の例示的な種類として、当技術分野では公知である。例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）９：２１３１−４１； Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５１：４２７−３２；及びＦｉｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＭＡｂｓ ７：３９０−４０２を参照されたい。特定の実施形態では、ｓｃＦｖ分子を、融合タンパク質に組み込んでもよい。ディアボディディアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も含まれる。ディアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それにより、ドメインが、別の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を作製することを強制される二価のディアボディである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８；及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−３を参照されたい）。抗原結合性断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、結合性断片は、インタクトな抗体と同じ手法で、有用性（例えば、結合親和性、内在化）についてスクリーニングされる。抗原結合性断片は、インタクトなタンパク質の切断により、例えば、プロテアーゼまたは化学的な切断により調製することもできる。
「内在化」は、抗体または抗原結合性断片と関連して本明細書で使用する場合、細胞に結合すると、細胞の脂質二層膜を通って内部コンパートメントに、好ましくは、細胞内の分解コンパートメントに取り込まれ（すなわち、「内在化」され）得る抗体または抗原結合性断片を指す。例えば、内在化型抗ＦＲＡ抗体は、細胞膜上のＦＲＡに結合した後に、細胞内に取り込まれ得るものである。
「葉酸受容体アルファ」または「ＦＲＡ」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトＦＲＡの任意の天然形態を指す。この用語は、全長ＦＲＡ（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００７９３；配列番号１９）、さらには、細胞プロセシングから生じるヒトＦＲＡの任意の形態を含む。この用語はまた、これらだけに限定されないが、スプライシング変異型、対立遺伝子変異型、及びアイソフォームを含む、ＦＲＡの天然に存在するバリアントを含む。ＦＲＡは、ヒトから単離することができるか、または組換えで、もしくは合成法により生産してもよい。
「抗ＦＲＡ抗体」または「ＦＲＡに特異的に結合する抗体」という用語は、ＦＲＡに特異的に結合する抗体またはその断片の任意の形態を指し、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、及びＦＲＡに特異的に結合する限り、生物学的に機能性の抗体断片を含む。好ましくは、本明細書において開示するＡＤＣで使用する抗ＦＲＡ抗体は、内在化型抗体または内在化型抗体断片である。ＭＯＲＡｂ−００３は、例示的な内在化型抗ヒトＦＲＡ抗体である。本明細書で使用する場合、「特異的」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」及び「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）という用語は、標的抗原エピトープへの抗体の選択的結合を指す。抗体を、所与の条件設定下で、適切な抗原への結合と、無関係抗原または抗原混合物への結合とを比較することにより、結合の特異性について試験することができる。抗体が、無関係抗原または抗原混合物よりも、少なくとも２、５、７、及び好ましくは１０倍高い親和性で、適切な抗原に結合するならば、それは、特異的であると考えられる。一実施形態では、特異的な抗体は、ＦＲＡ抗原にのみ結合し、他の抗原には結合しない（または僅かな結合のみを示す）ものである。
「ヒト上皮成長因子受容体２」、「ｈｅｒ２」、または「ｈｅｒ２／ｎｅｕ」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトｈｅｒ２の任意の天然形態を指す。この用語は、全長ｈｅｒ２（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００４４３９．２；配列番号２１）、さらには、細胞プロセシングから生じるヒトｈｅｒ２の任意の形態を含む。この用語はまた、これらだけに限定されないが、スプライシング変異型、対立遺伝子変異型、及びアイソフォームを含むｈｅｒ２の天然に存在するバリアントを含む。Ｈｅｒ２は、ヒトから単離することができるか、または組換えで、もしくは合成法により生産してもよい。
「抗ｈｅｒ２抗体」または「ｈｅｒ２に特異的に結合する抗体」という用語は、ｈｅｒ２に特異的に結合する抗体またはその断片の任意の形態を指し、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、及びｈｅｒ２に特異的に結合する限り、生物学的に機能性の抗体断片を含む。米国特許第５，８２１，３３７号（参照により本明細書に組み込まれる）は、例示的な抗ｈｅｒ２抗体配列を含む、例示的なｈｅｒ２結合性配列を提供している。好ましくは、本明細書において開示するＡＤＣにおいて使用する抗ｈｅｒ２抗体は、内在化型抗体または内在化型抗体断片である。トラスツズマブは、例示的な内在化型抗ヒトｈｅｒ２抗体である。
「エピトープ」という用語は、抗体が認識し、かつ特異的に結合し得る抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続アミノ酸から、またはポリペプチドの三次フォールディングにより並列する非連続アミノ酸から形成され得る。抗原−抗体複合体の直接的な可視化によるエピトープ同定のためのＸ線結晶学、さらには、抗原の断片または変異異型への抗体の結合をモニターすること、または抗体及び抗原の種々の部分の溶媒露出度をモニターすることを含む、当技術分野で公知の任意のエピトープマッピング技術を使用して、抗体が結合するエピトープを同定することができる。抗体エピトープをマッピングするために使用される例示的なストラテジーには、これらだけに限定されないが、アレイベースのオリゴ−ペプチドスキャニング、限定タンパク質分解、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピング、水素−ジュウテリウム交換、及び質量分析法が含まれる（例えば、Ｇｅｒｓｈｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）２１：１４５−５６；及びＨａｇｅｒ−Ｂｒａｕｎ及びＴｏｍｅｒ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２：７４５−５６を参照されたい）。
競合結合及びエピトープビニングも、同一または重複エピトープを共有する抗体を決定するために使用することができる。クロスブロッキングアッセイ、例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ １９８８、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１４）に記載のアッセイなどを使用して、競合結合を評価することができる。一部の実施形態では、試験抗体または結合性タンパク質が、標的抗原、例えば、ＦＲＡまたはｈｅｒ２への参照抗体または結合性タンパク質（例えば、表２、４、及び６において同定されているものから選択されるＣＤＲ及び／または可変ドメインを含む結合性タンパク質）の結合を、クロスブロッキングアッセイにおいて少なくとも約５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、もしくはそれ以上、またはその間の任意のパーセンテージ）減少させる、及び／またはその逆である場合に、競合結合は同定される。一部の実施形態では、競合結合は、共用または同様の（例えば、部分的に重複する）エピトープによるか、または抗体もしくは結合性タンパク質が近接するエピトープで結合する場合の立体障害により得る。例えば、Ｔｚａｒｔｏｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｄ．（１９９８）ｖｏｌ．６６，ｐｐ．５５−６６）を参照されたい。一部の実施形態では、競合結合は、類似のエピトープを共用する結合性タンパク質の群を分類するために使用することができ、例えば、結合について競合するものを、重複または近接エピトープを有する結合性タンパク質の群として「ビニング」することができ、競合しないものは、重複または近接エピトープを有さない結合性タンパク質の別の群に入れる。
「ｋｏｎ」または「ｋａ」という用語は、抗体と抗原とが会合して抗体／抗原複合体を形成することについての速度定数を指す。この速度は、標準的なアッセイ、例えば、ＢｉａｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定され得る。
「ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についてのオフ速度定数（ｏｆｆ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を指す。この速度は、標準的なアッセイ、例えば、ＢｉａｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定され得る。
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。ＫＤは、ｋａ／ｋｄにより計算される。この速度は、標準的なアッセイ、例えば、ＢｉａｃｏｒｅまたはＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定され得る。
「ｐ」または「抗体：薬物比」または「薬物−対−抗体比」または「ＤＡＲ」という用語は、抗体部分１つ当たりの薬物部分の数、すなわち、薬物負荷、または式ＩのＡＤＣでは、抗体または抗原結合性断片（Ａｂ）１つ当たりの−Ｌ−Ｄ部分の数を指す。式ＩのＡＤＣの多数のコピーを含む組成物では、「ｐ」は、抗体または抗原結合性断片１つ当たりの−Ｌ−Ｄ部分の平均数を指し、また、平均薬物負荷と称される。
「リンカー」または「リンカー部分」は、化合物、通常は化学療法薬などの薬物部分を、抗体部分などの別の部分に共有結合で接続することができる任意の化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性なままである条件で、酸誘発性切断、ぺプチダーゼ誘発性切断、光ベースの切断、エステラーゼ誘発性切断、及び／またはジスルフィド結合切断に対して感受性があるか、または実質的に抵抗性であってよい。
「薬剤」という用語は本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生物高分子、または生物物質から作製された抽出物を指すために使用される。「治療薬」、「薬物」、または「薬物部分」という用語は、生物学的プロセスをモジュレートすることができる、及び／または生物学的活性を有する薬剤を指す。
「化学療法薬」または「抗がん薬」という用語は本明細書では、作用機序に関わらず、がんを処置する際に有効であるすべての化学化合物を指すために使用される。転移または血管新生の阻害が多くの場合に、化学療法薬の特性である。化学療法薬の非限定的例には、アルキル化薬、例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、及びアルキルスルホナート；代謝拮抗薬、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト；抗有糸分裂薬、例えば、エリブリンまたはエリブリンメシラート（Ｈａｌａｖｅｎ（商標））またはその誘導体などの抗チューブリン薬、ビンカアルカロイド、及びオーリスタチン；細胞傷害性抗生物質；ＤＮＡ発現または複製に損傷を与える、またはそれに干渉する化合物、例えば、ＤＮＡ小溝結合薬；及び成長因子受容体アンタゴニストが含まれる。加えて、化学療法薬には、抗体、生物学的分子、及び小分子が含まれる。化学療法薬は、細胞傷害薬または細胞増殖抑制薬であってよい。「細胞増殖抑制薬」という用語は、細胞成長及び／または細胞の増殖を阻害または抑制する薬剤を指す。
「細胞傷害性薬物」という用語は、主に、細胞の発現活性及び／または機能化に干渉することにより、細胞死をもたらす物質を指す。細胞傷害性薬物の例には、これらだけに限定されないが、抗有糸分裂薬、例えば、エリブリン、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））、マイタンシノイド（例えば、メイタンシン）、ドラスタチン、デュオスタチン、クリプトフィシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキサン、タキソール、及びコルヒチン；アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ジヒドロキシアンスラシンジオン）；細胞傷害性抗生物質（例えば、マイトマイシン、アクチノマイシン、デュオカルマイシン（例えば、ＣＣ−１０６５）、オーロマイシン、デュオマイシン（ｄｕｏｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン、エンドマイシン（ｅｎｄｏｍｙｃｉｎ）、フェノマイシン）；アルキル化薬（例えば、シスプラチン）；挿入薬（例えば、臭化エチジウム）；トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ））；放射性同位体、例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２、及びルテチウムの放射性同位体（例えば、Ｌｕ１７７）；ならびに細菌、真菌、植物または動物由来の毒素（例えば、リシン（例えば、リシンＡ−鎖）、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ（例えば、ＰＥ４０）、内毒素、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、コンブレスタチン、レストリクトシン、ゲロニン、アルファ−サルシン、アブリン（例えば、アブリンＡ−鎖）、モデシン（例えば、モデシンＡ−鎖）、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害薬、グルココルチコイド）が含まれる。
「エリブリン」という用語は、本明細書で使用する場合、ハリコンドリンＢという、海綿Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉａ ｏｋａｄａｉｓから元々は単離された大環状化合物の合成類似体を指す。「エリブリン薬物部分」という用語は、エリブリンの構造を有し、そのＣ−３５アミンを介してＡＤＣのリンカーに結合しているＡＤＣの構成成分を指す。エリブリンは、微小管ダイナミクス阻害薬であり、これは、チューブリンに結合し、有糸分裂紡錘体の構築を阻害することによりＧ２／Ｍ期での細胞周期の停止を誘導すると考えられる。「エリブリンメシル酸塩」という用語は、エリブリンのメシル酸塩を指し、これは、商品名Ｈａｌａｖｅｎ（商標）で販売されている。
「相同体」という用語は、例えば、対応する位置で同じか、または相似している化学的残基の配列を有することにより、別の分子に対して相同性を示す分子を指す。
「〜を阻害する」または「〜の阻害」という用語は、本明細書で使用する場合、測定可能な量で減少させることを意味し、完全な防止または阻害を含み得るが、それを必要としない。
「標的陰性」または「標的抗原陰性」という用語は、細胞または組織による標的抗原の発現が存在しないことを指す。「標的陽性」または「標的抗原陽性」という用語は、標的抗原の発現が存在することを指す。例えば、標的抗原を発現しない細胞または細胞系は、標的陰性と記載され得る一方で、標的抗原を発現する細胞または細胞系は、標的陽性と記載され得る。
「バイスタンダー死滅」または「バイスタンダー効果」という用語は、標的陽性細胞の存在下での標的陰性細胞の死滅を指し、標的陰性細胞の死滅は、標的陽性細胞の非存在下では観察されない。細胞−対−細胞接触、または少なくとも標的陽性と標的陰性細胞との間の近接が、バイスタンダー死滅を可能にする。この種の死滅は、標的陰性細胞の無差別の死滅を指す「オフターゲット死滅」とは識別される。「オフターゲット死滅」は、標的陽性細胞の非存在下でも観察され得る。
「がん」という用語は、細胞集団が未制御の細胞成長により特徴づけられる、哺乳類における生理学的状態を指す。がんの例には、これらだけに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。そのようながんのより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌（例えば、三重陰性乳癌）、骨肉腫、黒色腫、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜（例えば、漿液性）または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。三重陰性乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、またはＨｅｒ２／ｎｅｕのための遺伝子の発現について陰性である乳癌を指す。
「腫瘍」及び「新生物」という用語は、前がん性病変を含む、良性または悪性のいずれかの過剰な細胞成長または増殖から生じる組織の任意の塊を指す。
「がん細胞」及び「腫瘍細胞」という用語は、非腫瘍発生性細胞及びがん幹細胞の両方を含めて、腫瘍に由来する個々の細胞または細胞の全集団を指す。本明細書で使用する場合、「腫瘍細胞」という用語は、がん幹細胞からそれらの腫瘍細胞を識別するために、再生及び分化する能力を欠いた腫瘍細胞のみを指す場合には、「非腫瘍発生性」という用語により修飾される。
「対象」及び「患者」という用語は、これらだけに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含む任意の哺乳類などの任意の動物を指すために、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態では、哺乳類は、マウスである。一部の実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
１種または複数の治療薬との「同時投与」またはそれ「と組み合わせた」投与という用語は、同時及び任意の順序での連続投与を含む。
「医薬組成物」は、投与を可能にし、続いて、活性成分（複数可）の意図された生物学的活性をもたらす、及び／または治療効果を達成するような形態であり、製剤を投与されるであろう対象に対して、許容できないほど毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。医薬組成物は、無菌であり得る。
「医薬品添加剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調節及び緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤、防腐剤などの物質を含む。
「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局により承認されているか、もしくは承認され得ること、または動物、より詳細にはヒトにおける使用について、米国薬局方または他の一般に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。
本明細書に開示のとおりのＡＤＣの「有効量」は、具体的に述べられる目的を果たすために、例えば、腫瘍増殖速度または腫瘍体積の減少、がんの症候の減少、または処置有効性の多少の他の徴候など、投与後に治療効果を生じさせるために十分な量である。有効量は、述べられている目的に関連して日常的な手法で決定することができる。「治療有効量」という用語は、対象において疾患または障害を処置するために有効なＡＤＣの量を指す。がんの場合、ＡＤＣの治療有効量は、がん細胞の数を減少させる、腫瘍サイズを減少させる、腫瘍転位を阻害する（例えば、減速させる、または停止させる）、腫瘍増殖を阻害する（例えば、減速させる、または停止させる）、及び／または１つもしくは複数の症状を軽減することができる。「予防有効量」は、必要な投薬量で、必要な期間にわたって、所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。典型的には、予防用量を対象において疾患前に、または疾患の早期段階で使用するので、予防有効量は、治療有効量未満となる。
本明細書で使用する場合、「処置するために」または「治療上の」及び文法的に関連する用語は、生存の持続、より低い罹患率、及び／または代替の治療モダリティの副産物である副作用の緩和など、疾患の何らかの予後の何らかの改善を指す。当技術分野では容易に分かるとおり、疾患の完全な根絶が好ましいが、処置作用の要件ではない。「処置」または「処置する」は、本明細書で使用する場合、対象、例えば、患者への記載のＡＤＣの投与を指す。処置は、障害、障害の症状または障害、例えば、がんに対する素因を治療する、治癒させる、和らげる、軽減する、変更する、矯正する、向上する、緩和する、改善する、またはそれに影響を及ぼすためであってよい。
一部の実施形態では、標識ＡＤＣを使用する。適切な「標識」には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害薬、蛍光部分、化学発光部分、磁気粒子などが含まれる。
「タンパク質」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味する。この用語は、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む。一部の実施形態では、２個またはそれ以上の共有結合したアミノ酸は、ペプチド結合により結合している。例えば、タンパク質が発現系及び宿主細胞を使用して組換えで作製されている場合、タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合から構成されてもよい。別法では、タンパク質には、合成アミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、及びノルロイシン）、またはペプチド模倣構造、すなわち、「ペプチドまたはタンパク質類似体」、例えば、ペプトイドが含まれ得る。ペプトイドは、その側鎖が、（アミノ酸においてのとおり）α−炭素ではなく、ペプチド主鎖の窒素原子に付いていて、かつペプチドと比較して異なる水素結合及び配座異性特徴を有する、ペプチド模倣物質の例示的な群である（例えば、Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７を参照されたい）。したがって、ペプトイドは、タンパク質分解または他の生理学的または貯蔵条件に対して抵抗性であり得、かつ細胞膜を透過するという点では有効であり得る。特に、抗体が当技術分野で周知の慣用の方法により、インビトロで合成される場合に、そのような合成アミノ酸を組み込むことができる。加えて、ペプチド模倣物質、合成及び天然に存在する残基／構造のいずれの組合せも使用することができる。「アミノ酸」には、イミノ酸残基、例えば、プロリン及びヒドロキシプロリンも含まれる。アミノ酸「Ｒ基」または「側鎖」は、（Ｌ）−または（Ｓ）−配置のいずれであってもよい。具体的な一実施形態では、アミノ酸は、（Ｌ）−または（Ｓ）−配置である。
「組換えタンパク質」は、当技術分野で公知の任意の技術及び方法を使用する組換え技術を使用して、すなわち、組換え核酸の発現により作製されたタンパク質である。組換えタンパク質を生成するための方法及び技術は、当技術分野で周知である。
「単離された」タンパク質は、例えば、所与のサンプル中の全タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成する、その天然状態で通常は付随する物質の少なくとも一部を随伴しない。単離されたタンパク質が、状況に応じて、全タンパク質含分の５〜９９．９重量％を構成することがあることは理解される。例えば、タンパク質は、タンパク質が高い濃度レベルで作製されるように、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用により、かなり高い濃度で作製され得る。この定義は、当技術分野で公知である広範囲の様々な生体及び／または宿主細胞における抗体の生産を含む。
アミノ酸配列では、配列同一性及び／または類似性は、これらだけに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−９５により記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを含む、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して、好ましくは、デフォルト設定を使用するか、または検査により、決定することができる。好ましくは、同一性パーセントを、ＦａｓｔＤＢにより次のパラメーターに基づき計算する：１のミスマッチペナルティ；１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；及び３０の接続ペナルティ（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ）。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメント（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を使用して、関連する配列の群から複数の配列アラインメントを作製する。これは、アラインメントを作製するために使用されるクラスタリング関係を示す系統樹もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−６０のプログレッシブアラインメント法の単純化を使用し；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−３により記載された方法と類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトギャップ重量、０．１０のデフォルトギャップ長重量、及び重量末端ギャップを含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２；及びＫａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−８７に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメーターを使用し、その多くはデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメーターは、次の値で設定される：オーバーラップスパン＝ｌ、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、目的の配列が検索されている特定の配列の組成及び特定データベースの組成にそれ自身が依存するプログラムにより確立されるが；しかしながら、その値を、感度を増加させるために調節してもよい。
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２により報告されているとおりのギャップＢＬＡＳＴである。ギャップＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメーター；ギャップなしの伸長を開始させるための２ヒット法、ギャップ長ｋにコスト１０＋ｋを負荷；１６に設定されたＸｕ、ならびにアルゴリズムのデータベース検索段階で４０に、及び出力段階で６７に設定されたＸｇを使用する。ギャップアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアにより開始される。
一般に、ＦＲＡのバリアント、ｈｅｒ２のバリアント、チューブリン配列のバリアント、及び抗体可変ドメインのバリアント（個々のバリアントＣＤＲを含む）を含む本明細書において開示するタンパク質及びそのバリアント間のアミノ酸相同性、類似性、または同一性は、本明細書に示す配列に対して少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及びほぼ１００％または１００％と、相同性または同一性が上昇することが好ましい。
同様に、本明細書で特定される抗体及び他のタンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、抗原結合性タンパク質中のコード配列のヌクレオチド残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。特定の方法は、それぞれ１及び０．１２５に設定されたオーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションで、デフォルトパラメーターに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
アミノ酸配列変化を導入するための部位または領域が予め決定されていても、変異自体は、予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を最適化するために、標的コドンまたは領域でランダム変異誘発を行って、発現された抗原結合性タンパク質ＣＤＲバリアントを所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングしてもよい。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換変異を作製するための技術、例えば、ＭＩ３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発が周知である。
抗体−薬物コンジュゲート
本開示の化合物には、抗がん活性を有するものが含まれる。特に、化合物は、薬物部分にコンジュゲートしている（すなわち、リンカーにより共有結合している）抗体部分（その抗原結合性断片を含む）を含み、その際、薬物部分は、抗体部分にコンジュゲートしていない場合、細胞傷害または細胞増殖抑制効果を有する。様々な実施形態で、薬物部分は、コンジュゲート内で結合している場合には、細胞傷害性の低下を示すか、または細胞傷害性を示さないが、リンカー及び抗体部分から切断された後に、細胞傷害性を回復する。様々な実施形態で、薬物部分は、（例えば、切断不可能なリンカーを使用して）コンジュゲート内で結合している場合には、バイスタンダー死滅の低下を示すか、またはバイスタンダー死滅を示さないが、コンジュゲートから切断された後に、バイスタンダー死滅の増加を示す（例えば、切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔ切断可能な部分を有するコンジュゲート）。
ヒト治療薬として、例えば、腫瘍薬（ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔ）として使用するためのＡＤＣの開発及び生産は、所望の１つまたは複数の標的に結合し、がんを処置するために単独で使用される薬物に結合することができる抗体を同定する以上のことを必要とすることがある。薬物への抗体の結合は、抗体及び薬物の一方または両方の活性に対して有意で、予測不可能な効果、選択されたリンカー及び／または薬物の種類に応じて変動する効果を有し得る。したがって、一部の実施形態では、ＡＤＣの構成成分は、（ｉ）単独での抗体及び薬物部分により示される１つまたは複数の治療特性を保持する、（ｉｉ）抗体部分の特異的な結合特性を維持する；（ｉｉｉ）薬物負荷及び薬物−対−抗体比を最適化する；（ｉｖ）抗体部分への安定した結合による薬物部分の送達、例えば、細胞内送達を可能にする；（ｖ）標的部位への輸送または送達まで、インタクトなコンジュゲートとしてＡＤＣ安定性を保持する；（ｖｉ）投与前またはその後のＡＤＣの凝集を最小化する；（ｖｉｉ）細胞環境内での切断後の薬物部分の治療効果、例えば、細胞傷害性効果を可能にする；（ｖｉｉｉ）単独での抗体及び薬物部分のインビボ抗がん処置有効性に匹敵するか、またはそれよりも優れたインビボ抗がん処置有効性を示す；（ｉｘ）薬物部分によるオフターゲット死滅を最小限にする；及び／または（ｘ）望ましい薬物動態及び薬力学特性、製剤化適性（ｆｏｒｍｕｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）、及び毒物学的／免疫学的プロファイルを示すように選択される。これらの特性のそれぞれのスクリーニングが、治療的使用のために改善されたＡＤＣを同定するために、必要とされることがある（Ａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１４：１６０５−１３）。
様々な実施形態で、本明細書において開示するＡＤＣは、上記で列挙したカテゴリーの一部またはそれぞれで、予想外に好ましい特性を示す。例えば、一部の実施形態では、抗体へのＭａｌ結合、ＰＥＧスペーサーユニット（好ましくは、短いＰＥＧスペーサーユニット）、及び／またはペプチド切断可能なリンカー（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー）を含むＡＤＣコンストラクトは、他の切断可能なまたは切断不可能なリンカー構造を使用するＡＤＣと比較すると、オフターゲット死滅を減少させながら、驚くべき好ましい薬物負荷、凝集、及び／または安定性プロファイルを示し、及び／または抗体結合機能、薬物活性、及び／またはバイスタンダー死滅の改善を維持する。
一部の実施形態では、エリブリンを抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３などの抗ＦＲＡ抗体）に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、エリブリンを抗体部分に接続する他の切断可能な、または切断不可能なリンカーと比較すると、列挙したカテゴリーに全体にわたって特に好ましい特性を示す。一部の実施形態では、エリブリンを抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３などの抗ＦＲＡ抗体）に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、切断不可能なＡＤＣと比較すると、特に好ましいバイスタンダー死滅特性を示す。一部の実施形態では、エリブリンを抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３などの抗ＦＲＡ抗体）に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、代替の切断可能なリンカー構造を使用するＡＤＣと比較すると、特に好ましいバイスタンダー死滅特性を示す。
一部の実施形態では、エリブリンをＭＯＲＡｂ−００３に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、例えば、代替の部分（例えば、スクシンイミド部分）により抗体に結合しているリンカーを含むＡＤＣに対して、高く、かつ望ましい薬物：抗体比（すなわち、約３〜４）の比を示す。一部の実施形態では、エリブリンをＭＯＲＡｂ−００３に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、例えば、より長いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）８）を含むＡＤＣに対して、高く、かつ望ましい薬物：抗体比、及び／または低い凝集レベルを示す。一部の実施形態では、エリブリンをＭＯＲＡｂ−００３に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、例えば、代替の切断可能な部分（すなわち、非ペプチド切断可能な部分、例えば、切断可能なジスルフィドまたはスルホンアミド）を含むＡＤＣに対して、高く、かつ望ましい薬物：抗体比、より低い凝集レベル、オンターゲット死滅の増加、及び／またはオフターゲット死滅の減少を実証する。一部の実施形態では、エリブリンをＭＯＲＡｂ−００３に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣは、例えば、代替のアミノ酸ユニット（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ）または代替の切断可能な部分（例えば、切断可能なジスルフィドまたはスルホンアミド）を含むＡＤＣに対して、安定性の上昇、オンターゲット死滅の増加、オフターゲット死滅の減少、低い凝集レベル、及び／または高く、かつ望ましい薬物：抗体比を実証する。
一部の実施形態では、エリブリンをＭＯＲＡｂ−００３に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーを含むＡＤＣについての上記の望ましい特徴の一部または全部が、トラスツズマブ、または抗メソテリン抗体などの抗ｈｅｒ２抗体にコンジュゲートしているＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンリンカー−毒素を含むＡＤＣで観察され得る。
本開示のＡＤＣ化合物は、細胞傷害性または細胞増殖抑制薬剤の有効な用量をがん細胞または腫瘍組織に選択的に送達することができる。本開示のＡＤＣがそれぞれの標的抗原（例えば、ＦＲＡまたはｈｅｒ２）を発現する細胞に対して強力な細胞傷害性及び／または細胞増殖抑制活性を有することが発見されている。一部の実施形態では、ＡＤＣの細胞傷害性及び／または細胞増殖抑制活性は、細胞における標的抗原発現レベルに依存する。一部の実施形態では、本開示のＡＤＣは、同じ抗原を低レベルで発現するがん細胞と比較すると、高レベルの標的抗原を発現するがん細胞を死滅させるのに特に有効である。一部の実施形態では、本開示のＡＤＣは、同じ抗原を低レベルで発現するがん細胞と比較すると、標的抗原を中等度のレベルで発現するがん細胞を死滅させるのに特に有効である。例示的な高ＦＲＡ発現性がんには、これらだけに限定されないが、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌）、肺類癌、三重陰性乳癌、子宮内膜がん、及び非小細胞肺癌（例えば、腺癌）が含まれる。例示的な中等度ＦＲＡ発現性がんには、これらだけに限定されないが、胃癌及び結腸直腸癌が含まれる。例示的な低ＦＲＡ発現性がんには、これらだけに限定されないが、黒色腫及びリンパ腫が含まれる。例示的な高ｈｅｒ２発現性がんには、これらだけに限定されないが、乳癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、及び子宮内膜癌が含まれる。例示的な中等度ｈｅｒ２発現性がんには、これらだけに限定されないが、肺癌及び膀胱癌が含まれる。
一部の実施形態では、ＡＤＣの切断により、エリブリンが抗体部分及びリンカーから放出される。一部の実施形態では、切断及びエリブリンの放出により、ＡＤＣの細胞傷害性が改善される。一部の実施形態では、切断可能なリンカーを含むＡＤＣは、切断不可能なリンカーを含むＡＤＣでの比較可能な処置と比較すると、バイスタンダー死滅を含めて、がん細胞を死滅させるのに特に有効である。一部の実施形態では、特に、ＡＤＣで処置される細胞及び／またはがんが、高レベルの標的抗原を発現しない場合には、切断可能なリンカー（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー）を含むＡＤＣは、切断不可能なリンカー（例えば、切断不可能な（ＰＥＧ）２または（ＰＥＧ）４リンカー）を含むＡＤＣに対して、オンターゲット細胞死滅の増加及び／またはオフターゲット細胞死滅の低下を実証する。
一部の実施形態では、本開示のＡＤＣはまた、バイスタンダー死滅活性を、ただし、低いオフターゲット細胞傷害性を実証する。理論に束縛されることはないが、充実性腫瘍へのその透過が限定され、及び／または腫瘍細胞内での標的抗原の発現が不均一である場合に、ＡＤＣのバイスタンダー死滅活性は、特に有利であり得る。一部の実施形態では、切断可能なリンカーを含むＡＤＣは、切断不可能なリンカーを含むＡＤＣでの比較可能な処置と比較すると、バイスタンダー死滅に特に有効であり、及び／またはバイスタンダー死滅活性の改善を実証する。
腫瘍細胞を標的とする抗体またはその抗原結合性断片（Ａｂ）と、薬物部分（Ｄ）と、ＡｂをＤに共有結合するリンカー部分（Ｌ）とを含むＡＤＣ化合物を本明細書では提供する。ある種の態様では、抗体または抗原結合性断片は、高い特異性及び高い親和性で、腫瘍関連抗原（例えば、ＦＲＡまたはｈｅｒ２）に結合することができる。特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、結合すると、標的細胞に、例えば、細胞内の分解コンパートメントに内在化する。したがって、好ましいＡＤＣは、標的細胞に結合すると内在化し、分解を受け、かつがん細胞を死滅させる薬物部分を放出するものである。薬物部分は、酵素作用、加水分解、酸化、またはいずれかの他の機構により、ＡＤＣの抗体及び／またはリンカー部分から放出され得る。
例示的なＡＤＣは、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ（Ｉ）
を有する［式中、Ａｂ＝抗体部分（すなわち、抗体または抗原結合性断片）、Ｌ＝リンカー部分、Ｄ＝薬物部分、及びｐ＝抗体部分１つ当たりの薬物部分の数］。
抗体
式Ｉの抗体部分（Ａｂ）は、その範囲内に、がん細胞上の標的抗原に特異的に結合する任意の抗体または抗原結合性断片を含む。抗体または抗原結合性断片は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析により測定すると、≦１ｍＭ、≦１００ｎＭまたは≦１０ｎＭの解離定数（ＫＤ）で、またはその間の任意の量で、標的抗原に結合し得る。特定の実施形態では、ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭである。一部の実施形態では、ＫＤは、５００ｐＭ〜１μＭ、１μＭ〜１００ｎＭ、または１００ｍＭ〜１０ｎＭである。
一部の実施形態では、抗体部分は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む４本鎖抗体（免疫グロブリンとも称される）である。一部の実施形態では、抗体部分は、免疫グロブリンの２本鎖ハーフボディ（ｈａｌｆ ｂｏｄｙ）（１本の軽鎖及び１本の重鎖）、または抗原結合性断片である。
一部の実施形態では、抗体部分は、内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片である。一部の実施形態では、内在化型抗体は、細胞の表面上に発現される標的がん抗原に結合し、結合すると、細胞に進入する。一部の実施形態では、ＡＤＣの薬物部分は、ＡＤＣが標的がん抗原を発現する細胞に進入し、その中に存在した後に（すなわち、ＡＤＣが内在化された後に）、ＡＤＣの抗体部分から放出される。
本開示の例示的な抗体のアミノ酸及び核酸配列を表１〜９に明記する。
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様々な実施形態で、本明細書において開示するＡＤＣは、上の表に列挙した重鎖及び軽鎖可変ドメインの任意のセット（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３重鎖及び軽鎖可変ドメイン、またはトラスツズマブ重鎖及び軽鎖可変ドメイン）、または重鎖及び軽鎖セットからの６つのＣＤＲ配列のセットを含んでよい。一部の実施形態では、ＡＤＣはさらに、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインまたはその断片を含む。例えば、ＡＤＣは、ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメイン（ＩｇＧ１など）及びヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常ドメインを含んでよい。様々な実施形態で、記載のＡＤＣの抗体部分は、ヒト免疫グロブリンＧサブタイプ１（ＩｇＧ１）重鎖定常ドメインをヒトＩｇカッパ軽鎖定常ドメインと共に含む。
様々な実施形態で、ＡＤＣのための標的がん抗原は、葉酸受容体アルファ（「ＦＲＡ」）である。
様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体またはその抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７及び１９９１）））により定義すると、次のとおりの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む：配列番号２からなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３からなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、配列番号４からなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；配列番号７からなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号８からなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号９からなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）。
一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体またはその抗原結合性断片は、ＩＭＧＴナンバリングシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ（登録商標）））により定義すると、次のとおりの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む：配列番号１３からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５からなる重鎖ＣＤＲ３；配列番号１６からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８からなる軽鎖ＣＤＲ３。
様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２３の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号２４の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または上述の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２３に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号２４に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインをヒトＩｇカッパ軽鎖定常ドメインと共に含む。
様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列または配列番号１に対して少なくとも９５％同一である配列、及び配列番号６の軽鎖アミノ酸配列または配列番号６に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列及び配列番号６の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体は、配列番号１に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である重鎖アミノ酸配列及び／または配列番号６に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体は、配列番号１１（リーダー配列をコードするヌクレオチドを含む）、または配列番号３４５（リーダー配列をコードするヌクレオチドを含まない）のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖；及び配列番号１２（リーダー配列をコードするヌクレオチドを含む）、または配列番号３４６（リーダー配列をコードするヌクレオチドを含まない）のヌクレオチドによりコードされる軽鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖アミノ酸配列は、Ｃ末端リシンを欠失している。様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体は、ブダペスト条約に従った条項下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９）に２００６年４月２４日に受託番号ＰＴＡ−７５５２で寄託された細胞系により産生される抗体のアミノ酸配列、または重鎖Ｃ末端リシンを欠失したそのような配列を有する。様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体は、ＭＯＲＡｂ−００３（ＵＳＡＮ名：ファルレツズマブ）（Ｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：６）、またはその抗原結合性断片である。
様々な他の実施形態では、ＡＤＣのための標的がん抗原は、ヒト上皮成長因子受容体２（「ｈｅｒ２」）である。
様々な実施形態で、抗ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、次のとおりの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む：配列番号７１からなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号７２からなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、配列番号７３からなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；配列番号７４からなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号７５からなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７６からなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）。
一部の実施形態では、抗ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合性断片は、ＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、次のとおりの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む：配列番号１９１からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９２からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９３からなる重鎖ＣＤＲ３；配列番号１９４からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９５からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９６からなる軽鎖ＣＤＲ３。
様々な実施形態で、抗ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２７の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号２８の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または上述の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２７に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である重鎖可変領域アミノ酸配列及び／または配列番号２８に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する。
様々な実施形態で、抗ｈｅｒ２抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。
様々な実施形態で、抗ｈｅｒ２抗体は、配列番号３２７の重鎖アミノ酸配列または配列番号３２７に対して少なくとも９５％同一である配列、及び配列番号３２８の軽鎖アミノ酸配列または配列番号３２８に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３２７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号３２８の軽鎖アミノ酸配列、または上述の配列に対して少なくとも９５％同一である配列を含む。一部の実施形態では、抗ｈｅｒ２抗体は、配列番号３２７に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である重鎖アミノ酸配列、及び配列番号３２８に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である軽鎖アミノ酸配列を有する。様々な実施形態で、抗ｈｅｒ２抗体は、トラスツズマブ、またはその抗原結合性断片である。
様々な実施形態で、抗ＦＲＡ抗体またはその抗原結合性断片は、ＭＯＲＡｂ−００３の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含むか、またはそれらのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる配列番号２、またはＩＭＧＴによる配列番号１３）、ＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる配列番号３、またはＩＭＧＴによる配列番号１４）、ＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる配列番号４、またはＩＭＧＴによる配列番号１５）；ＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる配列番号７、またはＩＭＧＴによる配列番号１６）、ＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる配列番号８、またはＩＭＧＴによる配列番号１７）、及びＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる配列番号９、またはＩＭＧＴによる配列番号１８）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以下のアミノ酸付加、欠失または置換を含む。
様々な他の実施形態では、抗ｈｅｒ２抗体またはその抗原結合性断片は、トラスツズマブの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含むか、またはそれらのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる配列番号７１、またはＩＭＧＴによる配列番号１９１）、ＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる配列番号７２、またはＩＭＧＴによる配列番号１９２）、ＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる配列番号７３、またはＩＭＧＴによる配列番号１９３）；ＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる配列番号７４、またはＩＭＧＴによる配列番号１９４）、ＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる配列番号７５、またはＩＭＧＴによる配列番号１９５）、及びＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる配列番号７６、またはＩＭＧＴによる配列番号１９６）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以下のアミノ酸付加、欠失または置換を含む。
様々な実施形態で、アミノ酸置換は、単一の残基の置換である。挿入は通常、約１〜約２０アミノ酸残基ほどであるが、生物学的機能（例えば、ＦＲＡまたはｈｅｒ２への結合）が維持される限り、かなりより大きな挿入も許容され得る。欠失は通常、約１〜約２０アミノ酸残基の範囲であるが、場合によっては、欠失は、もっと大きくてもよい。置換、欠失、挿入、またはその任意の組合せを、最終誘導体またはバリアントに到達するために使用してもよい。一般に、これらの変化は、分子、特に、免疫原性及び抗原結合性タンパク質の特異性の改変を最小化するために、僅かなアミノ酸で行われる。しかしながら、より大きな変化が、ある種の状況では許容され得る。保存的置換は一般に、表１０のとおりに示される次のチャートに従って成される。
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表１０に示されているものよりも保存性が低い置換を選択することにより、機能または免疫同一性を実質的に変化させる。例えば、変化領域でのポリペプチド主鎖の構造、例えば、アルファ−へリックスまたはベータ−シート構造；標的部位での分子の電荷もしくは疎水性；または側鎖の嵩に、より著しい影響を及ぼす置換を行ってよい。一般に、ポリペプチドの特性に最大の変化をもたらすと予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルで（またはそれにより）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基で（またはそれにより）置換される；（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルが、電気陰性の残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルで（またはそれにより）置換される；または（ｄ）嵩高な側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンで（またはそれにより）置換される置換である。
様々な実施形態で、バリアント抗体配列がＡＤＣで使用されている場合、そのバリアントは典型的には、同じ定性生物学的活性を示し、同じ免疫応答を誘導するが、必要な場合には、抗原結合性タンパク質の特徴を変更するように、バリアントを選択することもできる。別法では、抗原結合性タンパク質の生物学的活性を変更するように、バリアントを設計してもよい。例えば、グリコシル化部位を、本明細書において検討したとおり、変更または除去してもよい。
がん細胞を標的とするために、本明細書において使用されるＡＤＣで、様々な抗体を使用してよい。下記に示すとおり、本明細書において開示するＡＤＣ中のリンカー−毒素は、種々の腫瘍抗原標的化抗体で、意外にも有効である。抗体が指向し、健康な細胞上ではなく、腫瘍細胞上に発現されるか、または健康な細胞上においてよりも高いレベルで腫瘍細胞上に発現される適切な抗原は、当技術分野で公知である。これらの抗体を、本明細書において開示するリンカー及び毒素（例えば、エリブリン）と共に使用することができる。一部の実施形態では、抗体部分は、ＦＲＡを標的とする。一部の実施形態では、ＦＲＡ標的化抗体部分は、ＭＯＲＡｂ−００３である。一部の実施形態では、本開示のリンカー及び毒素（エリブリン）は、複数の異なる腫瘍標的化抗体で意外にも有効であり、ＭＯＲＡｂ−００３などのＦＲＡ標的化抗体部分は、薬物：抗体比、腫瘍標的化、バイスタンダー死滅、処置有効性の具体的な改善、及びオフターゲット死滅の減少をもたらした。処置有効性の改善は、インビトロまたはインビボで測定することができ、腫瘍増殖速度の減少及び／または腫瘍体積の減少を含み得る。
特定の実施形態では、他の抗原標的に対する抗体を使用し、それは、ＭＯＲＡｂ−００３などのＦＲＡ標的化抗体部分を含むＡＤＣの好ましい機能特性の少なくとも一部（例えば、薬物：抗体比の改善、処置有効性の改善、オフターゲット死滅の減少など）を提供する。一部の実施形態では、本開示のリンカー及び毒素（エリブリン）をトラスツズマブなどのｈｅｒ２標的化抗体部分にコンジュゲートした場合に、これらの好ましい機能特性の一部または全部が観察される。一部の実施形態では、抗体部分は、ｈｅｒ２を標的とする。一部の実施形態では、ｈｅｒ２標的化抗体部分は、トラスツズマブである。一部の実施形態では、本開示のリンカー及び毒素（エリブリン）をＭＯＲＡｂ−００９などのＭＳＬＮ標的化抗体部分にコンジュゲートした場合に、これらの好ましい機能特性の一部または全部が観察される。一部の実施形態では、抗体部分は、ＭＳＬＮを標的とする。一部の実施形態では、ＭＳＬＮ標的化抗体部分は、ＭＯＲＡｂ−００９である。
リンカー
様々な実施形態で、ＡＤＣ中のリンカーは、充分に治療上有効であるように、細胞外で安定している。一部の実施形態では、リンカーは、細胞外で安定しているので、ＡＤＣは、細胞外条件で存在する場合（例えば、細胞への輸送または送達前）にはインタクトなままである。ＡＤＣの文脈で使用される「インタクト」という用語は、抗体部分が薬物部分に結合したままであることを意味する。本明細書で使用する場合、リンカーまたはリンカーを含むＡＤＣの文脈での「安定な」は、ＡＤＣが細胞外条件下に存在する場合に、ＡＤＣのサンプル中の２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下のリンカー（またはその間の任意のパーセンテージ）が切断されていること（または、全ＡＤＣが別段にインタクトではないケース）を意味する。
リンカーが細胞外で安定であるかどうかは、例えば、ＡＤＣを血漿中に所定の期間（例えば、２、４、６、８、１６、または２４時間）にわたって入れ、次いで、血漿中に存在する遊離の薬物部分の量を定量化することにより決定することができる。安定性は、ＡＤＣ期間が標的腫瘍細胞に局在化することを可能にし、正常及び腫瘍組織の両方に無差別に損傷を与えることによりＡＤＣの治療指数を低下させるであろう薬物の早期放出を防ぐことができる。一部の実施形態では、リンカーは、標的細胞の外側では安定しているが、細胞の内側では、ＡＤＣから薬物部分を放出するので、薬物部分は、その標的に（例えば、微小管に）に結合することができる。したがって、有効なリンカーは：（ｉ）抗体部分の特異的結合特性を維持する；（ｉｉ）抗体部分への安定な結合を介して薬物部分の送達、例えば、細胞内送達を可能にする；（ｉｉｉ）ＡＤＣがその標的部位に輸送または送達されるまで、安定していて、かつインタクトなままである；及び（ｉｖ）切断後の薬物部分の治療効果、例えば、細胞傷害効果を可能にする。
リンカーは、ＡＤＣの物理化学的特性に影響を及ぼし得る。多くの細胞傷害性薬物が本来は疎水性であるので、それらを、追加の疎水性部分を有する抗体と結合することは、凝集をもたらし得る。ＡＤＣ凝集物は不溶性であり、多くの場合に、抗体上で達成可能な薬物負荷を制限し、このことは、ＡＤＣの効力にマイナスの影響を及ぼし得る。生物製剤のタンパク質凝集は一般に、免疫原性の上昇にもつながっている。下に示すとおり、本明細書において開示するリンカーは、低い凝集レベル及び望ましいレベルの薬物負荷を有するＡＤＣをもたらす。
リンカーは、「切断可能」または「切断不可能」であってよい（Ｄｕｃｒｙ ａｎｄ Ｓｔｕｍｐ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２０１０）２１：５−１３）。切断可能なリンカーは、特定の環境因子に曝露されると、例えば、標的細胞内に内在化されると、薬物を放出するように設計され、切断不可能なリンカーは一般に、抗体部分自体の分解に依存する。
一部の実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。一部の実施形態では、ＡＤＣの薬物部分は、抗体部分の分解により放出される。切断不可能なリンカーは、標的細胞による内在化及びその内部での分解で、抗体の少なくとも１個のアミノ酸及び薬物と共有結合で会合したままになる傾向がある。切断不可能なリンカーは一般に、それぞれ、薬物または抗体上のチオール基と、抗体または薬物上のマレイミドまたはハロアセトアミド基とのコンジュゲーションにより調製されるチオエーテル結合を含む（Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ（Ｇ．Ｌ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３））。例示的な切断不可能なリンカーは、チオエーテル、シクロヘキシル、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、または１種もしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、例えば、１、２、３、４、５、または６つのＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、切断不可能なリンカーは、（ＰＥＧ）２を含む。他の実施形態では、切断不可能なリンカーは、（ＰＥＧ）４を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーは、切断可能な部分を含む任意のリンカーを指す。本明細書で使用する場合、「切断可能な部分」という用語は、切断され得る任意の化学結合を指す。適切な切断可能な化学結合は、当技術分野で周知であり、それらには、これらだけに限定されないが、酸不安定結合、プロテアーゼ／ぺプチダーゼ不安定結合、光不安定結合、ジスルフィド結合、及びエステラーゼ不安定結合が含まれる。切断可能な部分を含むリンカーは、リンカー内の特定部分での切断により、ＡＤＣからの薬物部分の放出を可能にし得る。様々な実施形態で、結合した毒素からの抗体の切断が、毒素の活性を活性化または増加させる。一部の実施形態では、切断可能なリンカー（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー）を含むＡＤＣは、切断不可能なリンカー（例えば、切断不可能な（ＰＥＧ）２または（ＰＥＧ）４リンカー）を含むＡＤＣと比較すると、オンターゲット細胞死滅の増加及び／またはオフターゲット細胞死滅の減少を実証する。一部の実施形態では、ＡＤＣで処置される細胞及び／またはがんが高レベルの標的抗原（例えば、ＦＲＡまたはｈｅｒ２）を発現しない場合に、切断可能なリンカーを含むＡＤＣは、切断不可能なリンカーを含むＡＤＣに対して、処置有効性の改善を示す。一部の実施形態では、結合した毒素からの抗体の切断は、インビトロ及び／またはインビボで測定すると、ＡＤＣの処置有効性の改善を達成するために必要である。
一部の実施形態では、リンカーの切断が、細胞内環境で抗体部分から薬物部分を十分に放出して、薬物を活性化し、かつ／または薬物を治療上有効にするように、リンカーは、細胞内条件下で切断可能である。一部の実施形態では、薬物部分は、ＡＤＣがＡＤＣの抗体部分に特異的な抗原を発現する細胞に進入するまで、抗体部分から切断されず、薬物部分は、細胞に進入すると、抗体部分から切断される。一部の実施形態では、リンカーは、切断されると、薬物部分に結合したままになっているリンカーの一部または抗体部分がないように配置されている切断可能な部分を含む。例示的な切断可能なリンカーには、酸不安定リンカー、プロテアーゼ／ぺプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチル−、ジスルフィド−、またはスルホンアミド含有リンカーが含まれる。
一部の実施形態では、リンカーは、ｐＨ感受性リンカーであり、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性がある。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で切断可能である。この切断戦略は一般に、リンカー内の酸不安定基、例えば、ヒドラゾンの加水分解を開始させるために、サイトゾル（ｐＨ約７．４）と比較すると、エンドソーム（ｐＨ約５〜６）及びリソソーム（ｐＨ約４．８）細胞内コンパートメントでの低いｐＨを利用する（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３２：３５２６−４０）。一部の実施形態では、リンカーは、酸不安定及び／または加水分解不安定リンカーである。例えば、リソソームで加水分解可能であり、酸不安定基（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を含有する酸不安定リンカーを使用することができる。例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号；同第５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−６１を参照されたい。そのようなリンカーは、血液中の条件などの中性ｐＨ条件下では、比較的安定しているが、リソソームのおおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療薬に結合しているチオエーテルなど）である。例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照されたい。
一部の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である。一部の実施形態では、リンカーは、グルタチオンまたはジチオスレイトールなどの還元剤の存在下で、切断可能である。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なジスルフィドリンカーまたは切断可能なスルホンアミドリンカーである。
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なジスルフィドリンカーである。様々なジスルフィドリンカーは、当技術分野で公知であり、それには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオアセタート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチラート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成され得るものが含まれる。例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４−３１； Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７）を参照されたい。米国特許第４，８８０，９３５号も参照されたい。ジスルフィドリンカーを典型的には使用して、それらのジスルフィド結合の切断を促進し得る豊富な細胞内チオールを利用する。最も豊富な細胞内チオール、還元型グルタチオンの細胞内濃度は一般に、１〜１０ｎＭの範囲であり、これは、約５μＭである血液中で最も豊富な低分子チオール（すなわち、システイン）の濃度よりも約１，０００倍高い（Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ（Ｇ．Ｌ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３））。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの細胞内酵素も、ジスルフィドリンカーの細胞内切断に寄与し得る。本明細書で使用する場合、切断可能なジスルフィドリンカーは、切断可能なジスルフィド部分を含む任意のリンカーを指す。「切断可能なジスルフィド部分」という用語は、例えば、チオールまたは酵素により切断及び/または還元することができるジスルフィド結合を指す。一部の実施形態では、切断可能なジスルフィド部分は、ジスルフィジル−ジメチルである。
一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なスルホンアミドリンカーである。本明細書で使用する場合、切断可能なスルホンアミドリンカーは、切断可能なスルホンアミド部分を含む任意のリンカーを指す。「切断可能なスルホンアミド部分」という用語は、スルホンアミド基、すなわち、アミン基に結合しているスルホニル基を指し、この場合、硫黄−窒素結合が切断され得る。
一部の実施形態では、リンカーは、分枝多官能性リンカー部分を介して、１つよりも多い薬物部分を抗体部分に共有結合するための樹状型のリンカーであってもよい。例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２：２２１３−５；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１：１７６１−８を参照されたい。樹状リンカーは、ＡＤＣの効力に関連する、抗体に対する薬物のモル比、すなわち、薬物負荷を増加させ得る。したがって、抗体部分が反応性システインチオール基を１個しか持たない場合に、例えば、多数の薬物部分を、樹状リンカーを介して結合することができる。一部の実施形態では、リンカー部分またはリンカー−薬物部分は、還元型ジスルフィド架橋ケミストリーまたは限定的リシン利用技術により、抗体に結合することができる。例えば、国際公開番号ＷＯ２０１３１７３３９１及びＷＯ２０１３１７３３９３を参照されたい。
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断作用物質、例えば、酵素により切断可能である。リンカーは、例えば、これらだけに限定されないが、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼを含む、細胞内ぺプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチドリンカーであってよい。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なペプチドリンカーである。本明細書で使用する場合、切断可能なペプチドリンカーは、切断可能なペプチド部分を含む任意のリンカーを指す。「切断可能なペプチド部分」という用語は、細胞内環境に存在する作用物質により切断され得る任意の化学結合架橋性アミノ酸（天然または合成アミノ酸誘導体）を指す。例えば、リンカーは、カテプシン、例えば、カテプシンＢなどのぺプチダーゼにより切断可能であるアラニン−アラニン−アスパラギン（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ）配列またはバリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）配列を含み得る。
一部の実施形態では、リンカーは、酵素切断可能なリンカーであり、リンカー内の切断可能なペプチド部分は、酵素により切断可能である。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、リソソームの酵素、例えば、カテプシンにより切断可能である。一部の実施形態では、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、リンカー内の切断可能なペプチド部分は、リソソームのシステインカテプシン、例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｓ、Ｖ、Ｘ、またはＷにより切断可能である。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、カテプシンＢにより切断可能である。カテプシンＢにより切断され得る例示的なジペプチドは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：８５５−６９）である。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分を含むＡＤＣは、代替の切断可能な部分（例えば、切断可能なジスルフィド部分または切断可能なスルホンアミド部分）を含むＡＤＣに対して、低い凝集レベル及び／または高い薬物負荷（ｐ）を実証する。
一部の実施形態では、リンカーまたはリンカー内の切断可能なペプチド部分は、アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、１種または複数の細胞内プロテアーゼ、例えば、１種または複数のリソソームの酵素に曝露されると、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それにより、ＡＤＣからの薬物部分の放出を促進する（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−８４；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３）。例示的なアミノ酸ユニットには、これらだけに限定されないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドには、これらだけに限定されないが、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）、アラニン−アスパラギン（Ａｌａ−Ａｓｎ）、アラニン−フェニルアラニン（Ａｌａ−Ｐｈｅ）、フェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）、アラニン−リシン（Ａｌａ−Ｌｙｓ）、アラニン−バリン（Ａｌａ−Ｖａｌ）、バリン−アラニン（Ｖａｌ−Ａｌａ）、バリン−リシン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）、リシン−リシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）、フェニルアラニン−シトルリン（Ｐｈｅ−Ｃｉｔ）、ロイシン−シトルリン（Ｌｅｕ−Ｃｉｔ）、イソロイシン−シトルリン（Ｉｌｅ−Ｃｉｔ）、トリプトファン−シトルリン（Ｔｒｐ−Ｃｉｔ）、及びフェニルアラニン−アラニン（Ｐｈｅ−Ａｌａ）が含まれる。例示的なトリペプチドには、これらだけに限定されないが、アラニン−アラニン−アスパラギン（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ）、グリシン−バリン−シトルリン（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ）、グリシン−グリシン−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、フェニルアラニン−フェニルアラニン−リシン（Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）、及びグリシン−フェニルアラニン−リシン（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）が含まれる。他の例示的なアミノ酸ユニットには、これらだけに限定されないが、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号に記載されているとおりのＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ｔｏｓｙｌ−Ａｒｇ、及びＰｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが含まれる。一部の実施形態では、リンカー内のアミノ酸ユニットは、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカー内のアミノ酸ユニットは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含むＡＤＣは、代替のアミノ酸ユニットまたは代替の切断可能な部分を含むＡＤＣに対して、オフターゲット細胞死滅の減少、オンターゲット細胞死滅の増加、低い凝集レベル、及び／または高い薬物負荷（ｐ）を実証する。アミノ酸ユニットは、天然に存在するアミノ酸残基及び／または微量アミノ酸及び／または天然に存在しないアミノ酸類似体、例えば、シトルリンを含んでよい。アミノ酸ユニットは、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、リソソームのプロテアーゼ、例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、またはＳ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的開裂のために設計及び最適化され得る。
一部の実施形態では、本明細書において開示するＡＤＣのいずれかにおけるリンカーは、抗体部分を薬物部分に接続する少なくとも１個のスペーサーユニットを含んでよい。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、リンカー内の切断部位（例えば、切断可能なペプチド部分）を抗体部分に接続する。一部の実施形態では、リンカー、及び／またはリンカー内のスペーサーユニットは、実質的に親水性である。親水性リンカーを使用すると、薬物が多剤耐性（ＭＤＲ）または機能的に同様の輸送体により抵抗性がん細胞から排出される程度を低下させることができる。一部の態様では、リンカーは、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、例えば、１、２、３、４、５、または６つのＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、短いＰＥＧリンカーであり、長いＰＥＧリンカーよりも、安定性の改善及び凝集の減少をもたらす。
一部の実施形態では、リンカー内のスペーサーユニットは、１つまたは複数のＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、−（ＰＥＧ）ｍ−を含み、ｍは、１〜１０の整数である。一部の実施形態では、ｍは、１〜１０；２〜８；２〜６；２〜５；２〜４；または２〜３の範囲である。一部の実施形態では、ｍは、８である。一部の実施形態では、ｍは、４である。一部の実施形態では、ｍは、３である。一部の実施形態では、ｍは、２である。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、（ＰＥＧ）２、（ＰＥＧ）４、（ＰＥＧ）８、（ＰＥＧ）９、（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３、（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３、またはジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３を含む。一部の好ましい実施形態では、スペーサーユニットは、（ＰＥＧ）２を含む。一部の実施形態では、短いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）２）を含むＡＤＣは、長いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）８）を含むＡＤＣに対して、低い凝集レベル及び／または高い薬物負荷（ｐ）を実証する。
一部の実施形態では、リンカー内のスペーサーユニットは、アルキル部分を含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、−（ＣＨ２）ｎ−を含み、ｎは、１〜１０の整数である（すなわち、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であってよい）。一部の実施形態では、ｎは、５である。一部の実施形態では、短いスペーサーユニット（例えば、（ＣＨ２）５）を含むＡＤＣは、長いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）８）を含むＡＤＣに対して、低い凝集レベル及び／または高い薬物負荷（ｐ）を実証する。
スペーサーユニットは、例えば、抗体部分を薬物部分に、直接的または間接的に結合するために使用することができる。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、抗体部分を薬物部分に直接的に結合する。一部の実施形態では、抗体部分及び薬物部分は、１つまたは複数のＰＥＧ部分（例えば、（ＰＥＧ）２または（ＰＥＧ）４）を含むスペーサーユニットを介して結合する。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、抗体部分を薬物部分に間接的に結合する。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、抗体部分を、切断可能な部分（例えば、切断可能なペプチド、切断可能なジスルフィド、または切断可能なスルホンアミド）及び／またはスペーサーユニットを抗体部分に接続する結合部分、例えば、マレイミド部分を介して、薬物部分に間接的に結合する。
スペーサーユニットは、様々な実施形態で、マレイミド部分（Ｍａｌ）を介して抗体部分（すなわち、抗体または抗原結合性断片）に結合する。一部の実施形態では、マレイミド部分を介して抗体部分に結合しているリンカーを含むＡＤＣは、スクシンイミド部分などの代替の結合部分を介して、抗体部分に結合しているリンカーを含むＡＤＣに対して、高い薬物負荷（ｐ）を実証する。
Ｍａｌを介して抗体または抗原結合性断片に結合しているスペーサーユニットは、本明細書では、「Ｍａｌ−スペーサーユニット」と称される。「マレイミド部分」という用語は、本明細書で使用する場合、マレイミド基を含有し、かつスルフヒドリル基、例えば、抗体部分の上のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応性である化合物を意味する。スルフヒドリル基（チオール）と反応性である他の官能基には、これらだけに限定されないが、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアナート、及びイソチオシアナートが含まれる。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットは、抗体または抗原結合性断片の上のシステイン残基と反応性である。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットは、システイン残基を介して抗体または抗原結合性断片に接続する。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットは、アルキル部分を含む。
特定の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット及び切断可能なペプチド部分を含む。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）ｍ及びＶａｌ−Ｃｉｔを含み、ｍは、２〜８または２〜５、または２、３、４、または５である。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）８及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。特定の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＣＨ２）５及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット及びＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２及びＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット及び切断可能なジスルフィド部分を含む。一部の実施形態では、切断可能なジスルフィド部分は、ジスルフィジル−ジメチルである。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット及びジスルフィジル−ジメチルを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びジスルフィジル−ジメチルを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット及び切断可能なスルホンアミド部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びスルホンアミドを含む。
様々な実施形態で、スペーサーユニットは、スクシンイミド部分（ＯＳｕ）を介して、抗体または抗原結合性断片に結合する。ＯＳｕを介して抗体または抗原結合性断片に結合するスペーサーユニットは、本明細書では、「ＯＳｕ−スペーサーユニット」と称される。「スクシンイミド部分」という用語は、本明細書で使用する場合、アミン基、例えば、抗体部分の上のリシン残基のアミン基と反応性であるスクシンイミド化合物を含有する化合物を意味する。例示的なスクシンイミド部分は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）である。一部の実施形態では、ＯＳｕ−スペーサーユニットは、抗体または抗原結合性断片の上のリシン残基と反応性である。一部の実施形態では、ＯＳｕ−スペーサーユニットは、リシン残基を介して抗体または抗原結合性断片に接続する。一部の実施形態では、ＯＳｕ−スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、ＯＳｕ−スペーサーユニットは、アルキル部分を含む。
特定の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット及び切断可能なペプチド部分を含む。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）９及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＣＨ２）５及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。特定の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びＶａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット及びＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２及びＡｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット及び切断可能なジスルフィド部分を含む。一部の実施形態では、切断可能なジスルフィド部分は、ジスルフィジル−ジメチルである。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット及びジスルフィジル−ジメチルを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びジスルフィジル−ジメチルを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びジスルフィジル−ジメチルを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット及び切断可能なスルホンアミド部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びスルホンアミドを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３及びスルホンアミドを含む。
一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニットは、抗体部分（すなわち、抗体または抗原結合性断片）をリンカー内の切断可能な部分に結合する。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニットは、抗体または抗原結合性断片を切断可能なペプチド部分に結合する。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−アミノ酸ユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニット−アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニットは、アルキル部分を含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。他の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、構造：Ｍａｌ−スペーサーユニット−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、構造：Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、構造：Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）８−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。特定の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）９−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−Ｖａｌ−Ｃｉｔを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含む。
様々な実施形態で、Ｍａｌ−スペーサーユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニットは、抗体または抗原結合性断片を、切断可能なジスルフィド部分に結合する。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−ジスルフィドまたはＯＳｕ−スペーサーユニット−ジスルフィドを含む。一部の実施形態では、ジスルフィドは、ジスルフィジル−ジメチルである。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−ジスルフィジル−ジメチルを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィジル−ジメチルを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット−ジスルフィジル−ジメチルを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィジル−ジメチルを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィジル−ジメチルを含む。
特定の実施形態では、Ｍａｌ−スペーサーユニットまたはＯＳｕ−スペーサーユニットは、抗体または抗原結合性断片を切断可能なスルホンアミド部分に結合する。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−スルホンアミドまたはＯＳｕ−スペーサーユニット−スルホンアミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−スルホンアミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−スルホンアミドを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−スルホンアミドを含む。
様々な実施形態で、リンカー内の切断可能な部分は、薬物部分に直接的に接続する。他の実施形態では、別のスペーサーユニットを使用して、リンカー内の切断可能な部分を薬物部分に結合する。様々な実施形態で、薬物部分は、エリブリンである。様々な実施形態で、エリブリンは、スペーサーユニットにより、リンカー内の切断可能な部分に結合する。一部の実施形態では、エリブリンは、自壊性スペーサーユニットにより、リンカー内の切断可能な部分に結合する。特定の実施形態では、エリブリンは、自壊性スペーサーユニットにより、リンカー内の切断可能な部分に結合し、切断可能な部分は、Ｖａｌ−Ｃｉｔを含み、ＰＥＧを含むさらなるスペーサーユニットは、切断可能な部分を抗体部分に接続する。特定の実施形態では、エリブリンは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ切断可能な部分及びｐＡＢ自壊性スペーサーユニットに接続しているリンカー内のＭａｌ−スペーサーユニットを介して、抗ＦＲＡ抗体に接続する。特定の他の実施形態では、エリブリンは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ切断可能な部分及びｐＡＢ自壊性スペーサーユニットに接続するリンカー内のＭａｌ−スペーサーユニットを介して、抗ｈｅｒ２抗体に接続する。
スペーサーユニットは、「自壊性」または「非自壊性」であってよい。「非自壊性」スペーサーユニットは、リンカーが切断された際に、スペーサーユニットの一部または全部が、薬物部分に結合したままであるものである。非自壊性スペーサーユニットの例には、これらだけに限定されないが、グリシンスペーサーユニット及びグリシン−グリシンスペーサーユニットが含まれる。非自壊性スペーサーユニットは最終的には経時的に分解し得るが、細胞条件下では、結合した本来の薬物を完全には容易に放出しない。「自壊性」スペーサーユニットは、細胞内条件下で、本来の薬物部分の放出を可能にする。「本来の薬物」は、スペーサーユニットまたは他の化学的修飾部分の一部が、スペーサーユニットの切断／分解後に残らないものである。
自壊ケミストリーは、当技術分野で公知であり、本開示のＡＤＣのために容易に選択され得る。様々な実施形態で、リンカー内の切断可能な部分を薬物部分（例えば、エリブリン）に結合するスペーサーユニットは、自壊性であり、細胞内条件下での切断可能な部分の切断と同時に、またはその直前／直後に自壊する。
特定の実施形態では、リンカー内の自壊性スペーサーユニットは、ｐ−アミノベンジルユニットを含む。一部の実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコール（ｐＡＢＯＨ）は、アミド結合を介して、リンカー内のアミノ酸ユニットまたは他の切断可能な部分に結合し、カルバマート、メチルカルバマート、またはカルボナートが、ｐＡＢＯＨと薬物部分との間に作製される（Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ １５：１０８７−１０３）。一部の実施形態では、自壊性スペーサーユニットは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）であるか、またはそれを含む。理論に束縛されることはないが、ｐＡＢの自壊は、自発的な１，６−除去反応に関係すると考えられる（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３２：３５２６−４０）。
様々な実施形態で、本開示のＡＤＣで使用されるｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）の構造は、下式で示される：
Figure 0006870051
様々な実施形態で、自壊性スペーサーユニットは、リンカー内の切断可能な部分をエリブリンの上のＣ−３５アミンに結合する。一部の実施形態では、自壊性スペーサーユニットは、ｐＡＢである。一部の実施形態では、ｐＡＢは、リンカー内の切断可能な部分を、エリブリンの上のＣ−３５アミンに結合する。一部の実施形態では、ｐＡＢは、切断可能な部分が切断されると自壊して、エリブリンが、ＡＤＣから、その本来の活性形態で放出される。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３）は、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含むリンカーにより、エリブリンのＣ−３５アミンに接続される。他の実施形態では、抗ｈｅｒ２抗体（例えば、トラスツズマブ）は、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含むリンカーにより、エリブリンのＣ−３５アミンに接続される。
一部の実施形態では、ｐＡＢは、リンカー内の切断可能なペプチド部分が切断されると、自壊する。一部の実施形態では、切断可能なペプチド部分は、アミノ酸ユニットを含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ｖａｌ−Ｃｉｔである。一部の実施形態では、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ（ＶＣＰ）を含む。特定の実施形態では、アミノ酸ユニットは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎである。一部の実施形態では、リンカーは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ｐＡＢを含む。
一部の実施形態では、ｐＡＢは、リンカー内の切断可能なジスルフィド部分が切断されると、自壊する。一部の実施形態では、リンカーは、ジスルフィド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ジスルフィジル−ジメチル−ｐＡＢを含む。
一部の実施形態では、ｐＡＢは、リンカー内の切断可能なスルホンアミド部分が切断されると、自壊する。一部の実施形態では、リンカーは、スルホンアミド−ｐＡＢを含む。
様々な態様で、ＡＤＣの抗体部分は、リンカーを介して、薬物部分にコンジュゲートし、その際、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット、切断可能なアミノ酸ユニット、及びｐＡＢを含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、アルキル部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。他の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）８−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＣＨ２）５−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。
様々な実施形態で、ＡＤＣの抗体部分は、リンカーを介して薬物部分にコンジュゲートしており、その際、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−ジスルフィド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィジル−ジメチル−ｐＡＢを含む。
一部の実施形態では、ＡＤＣの抗体部分は、リンカーを介して薬物部分にコンジュゲートしており、その際、リンカーは、Ｍａｌ−スペーサーユニット−スルホンアミド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）４−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−スルホンアミド−ｐＡＢを含む。
一部の態様では、ＡＤＣの抗体部分は、リンカーを介して薬物部分にコンジュゲートしており、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、アルキル部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。他の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）９−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）９−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＣＨ２）５−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−アミノ酸ユニット−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む。
一部の実施形態では、ＡＤＣの抗体部分は、リンカーを介して薬物部分にコンジュゲートしており、その際、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット−ジスルフィド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィジル−ジメチル−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−ジスルフィジル−ジメチル−ｐＡＢを含む。
一部の実施形態では、ＡＤＣの抗体部分は、リンカーを介して薬物部分にコンジュゲートしており、その際、リンカーは、ＯＳｕ−スペーサーユニット−スルホンアミド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、スペーサーユニットは、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−（ＰＥＧ）３−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−スルホンアミド−ｐＡＢを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＯＳｕ−ジベンジルシクロオクテン−トリアゾール−（ＰＥＧ）３−スルホンアミド−ｐＡＢを含む。
様々な実施形態で、リンカーは、細胞内在化の後の切断及びリンカー−薬物部分及び／または薬物部分のみの隣接細胞への拡散による、バイスタンダー死滅（隣接細胞の死滅）を促進するように設計される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内在化を促進する。一部の実施形態では、リンカーは、標的組織へのＡＤＣ結合、及びＡＤＣの抗体部分により標的とされる抗原を発現しないが、抗原を発現する標的がん組織を囲んでいるがん性組織のバイスタンダー死滅を維持しつつ、細胞外環境での切断を最小化し、それにより、オフターゲット組織（例えば、非がん性組織）への毒性を低下させるように設計されている。一部の実施形態では、マレイミド部分（Ｍａｌ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔまたは「ｖｃ」）、及びｐＡＢを含むリンカーは、これらの機能的特徴を提供する。一部の実施形態では、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含むリンカーは、これらの機能的特徴を得る際に、例えば、ＭＯＲＡｂ−００３などの抗ＦＲＡ抗体部分及びエリブリンなどの薬物部分を接続する場合に、特に有効である。一部の実施形態では、これらの機能的特徴のうちの少なくとも一部はまた、抗ＦＲＡ抗体部分を伴わずに、及び／またはＭＯＲＡｂ−００３を伴わずに観察され得る。例えば、一部の実施形態では、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含むリンカーは、これらの機能的特徴の一部または全部を得る際に、例えば、トラスツズマブなどの抗ｈｅｒ２抗体部分及びエリブリンなどの薬物部分を接続する場合に、有効である。
一部の実施形態では、抗体部分は、マレイミド部分（Ｍａｌ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、バリンシトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔまたは「ｖｃ」）、及びｐＡＢを含むリンカーを介して、薬物部分にコンジュゲートしている。これらの実施形態では、マレイミド部分は、リンカー−薬物部分を抗体部分に共有結合しており、ｐＡＢは、自壊性スペーサーユニットとして作用する。そのようなリンカーは、「ｍ−ｖｃ−ｐＡＢ」リンカー、「Ｍａｌ−ＶＣＰ」リンカー、「Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−ＶＣＰ」リンカー、または「Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ」リンカーと称され得る。一部の実施形態では、薬物部分は、エリブリンである。Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンの構造は、表４６に示されている。Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーのｐＡＢは、エリブリンの上のＣ−３５アミンに結合している。
Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンを含むＡＤＣは、特に、ＭＯＲＡｂ−００３またはその抗原結合性断片などの抗ＦＲＡ抗体と対合した場合に、望ましい特性の特定の組合せを実証することが発見された。これらの特性には、これらだけに限定されないが、他のリンカー−毒素及び／または抗体部分を使用するＡＤＣとすべて比較すると、薬物負荷の有効なレベル（ｐ約４）、低い凝集レベル、貯蔵条件下または身体循環中の場合の安定性（例えば、血清安定性）、非コンジュゲート抗体と比較可能な標的発現性細胞への親和性の維持、標的発現性細胞に対する強力な細胞傷害性、低レベルのオフターゲット細胞死滅、高レベルのバイスタンダー死滅、及び／または有効なインビボ抗がん活性が含まれる。多数のリンカー選択肢ならびにスペーサー及び切断部位の組合せが当技術分野で公知であり、これらの機能性カテゴリーの１つまたは複数において特定の利益を提供し得るが、エリブリンを抗ＦＲＡ抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３）などの抗体部分に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーの特定の組合せは、治療用ＡＤＣに望ましい幅広い機能特性にわたって、良好か、または優れた特性を提供し得る。一部の実施形態では、エリブリンを抗体部分に接続するＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢリンカーの特定の組合せにより提供される良好または優れた機能特性は、例えば、トラスツズマブなどの抗ｈｅｒ２抗体にコンジュゲートしている、このリンカー−毒素で観察され得る。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン及び内在化型抗体、または腫瘍細胞を標的とし、それに内在化する能力を維持しているその抗原結合性断片を含む抗体部分を含む。一部の実施形態では、ＡＤＣは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン及びＦＲＡ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、ＦＲＡ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号２（ＨＣＤＲ１）、配列番号３（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号４（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号７（ＬＣＤＲ１）、配列番号８（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号９（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１３（ＨＣＤＲ１）、配列番号１４（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１６（ＬＣＤＲ１）、配列番号１７（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、ＦＲＡ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ＦＲＡ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、式Ｉを有する：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ（Ｉ）
［式中、
（ｉ）Ａｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号２（ＨＣＤＲ１）、配列番号３（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号４（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号７（ＬＣＤＲ１）、配列番号８（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号９（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１３（ＨＣＤＲ１）、配列番号１４（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１６（ＬＣＤＲ１）、配列番号１７（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む内在化型抗葉酸受容体アルファ（ＦＲＡ）抗体またはその内在化型抗原結合性断片であり；
（ｉｉ）Ｄは、エリブリンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；
（ｉｖ）ｐは、１〜２０の整数である］。
一部の実施形態では、内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体は、ＭＯＲＡｂ−００３である。一部の実施形態では、ｐは、１〜８、または１〜６である。一部の実施形態では、ｐは、２〜８、または２〜５である。一部の実施形態では、ｐは、３〜４である。一部の実施形態では、ｐは、４である。
他の実施形態では、ＡＤＣは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン及びｈｅｒ２発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、ｈｅｒ２発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号７１（ＨＣＤＲ１）、配列番号７２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号７３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号７４（ＬＣＤＲ１）、配列番号７５（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１９１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１９２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１９３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１９４（ＬＣＤＲ１）、配列番号１９５（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、ｈｅｒ２発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ｈｅｒ２発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、式Ｉを有する：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
［式中、
（ｉ）Ａｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号７１（ＨＣＤＲ１）、配列番号７２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号７３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号７４（ＬＣＤＲ１）、配列番号７５（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１９１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１９２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１９３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１９４（ＬＣＤＲ１）、配列番号１９５（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む内在化型抗ヒト上皮成長因子受容体２（ｈｅｒ２）抗体またはその内在化型抗原結合性断片であり；
（ｉｉ）Ｄは、エリブリンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；
（ｉｖ）ｐは、１〜２０の整数である］。
一部の実施形態では、内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体は、トラスツズマブである。一部の実施形態では、ｐは、１〜８、または１〜６である。一部の実施形態では、ｐは、２〜８、または２〜５である。一部の実施形態では、ｐは、３〜４である。一部の実施形態では、ｐは、４である。
他の実施形態では、ＡＤＣは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン、及びメソテリン（ＭＳＬＮ）発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、ＭＳＬＮ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号６５（ＨＣＤＲ１）、配列番号６６（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号６７（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号６８（ＬＣＤＲ１）、配列番号６９（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１８５（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８６（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１８７（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１８８（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、ＭＳＬＮ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ＭＳＬＮ発現性腫瘍細胞を標的とする内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、式Ｉを有する：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
［式中、
（ｉ）Ａｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号６５（ＨＣＤＲ１）、配列番号６６（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号６７（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号６８（ＬＣＤＲ１）、配列番号６９（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１８５（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８６（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１８７（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１８８（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む内在化型抗メソテリン抗体またはその内在化型抗原結合性断片であり；
（ｉｉ）Ｄは、エリブリンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；
（ｉｖ）ｐは、１〜２０の整数である］。
一部の実施形態では、内在化型抗体またはその内在化型抗原結合性断片は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、内在化型抗体は、ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、またはトラスツズマブである。一部の実施形態では、ｐは、１〜８、または１〜６である。一部の実施形態では、ｐは、２〜８、または２〜５である。一部の実施形態では、ｐは、３〜４である。一部の実施形態では、ｐは、４である。
薬物部分
本明細書に記載のＡＤＣの薬物部分（Ｄ）は、任意の化学療法薬であってよい。化学療法薬の有用な群には、例えば、抗チューブリン薬が含まれる。特定の実施形態では、薬物部分は、抗チューブリン薬である。抗チューブリン薬の例には、クリプトフィシン及びエリブリンが含まれる。記載のＡＤＣで使用するための好ましい薬物部分は、エリブリンである。
様々な実施形態で、薬物部分は、エリブリンである。これらの実施形態では、ＡＤＣのリンカーは、エリブリンの上のＣ−３５アミンにより結合している。
様々な実施形態で、リンカー及び抗体部分に接続するために使用されるエリブリンの本来の形態は、以下に示される：
Figure 0006870051
特定の実施形態では、リンカーの前駆体である中間体を、適切な条件下で薬物部分と反応させる。特定の実施形態では、反応性基を、薬物及び／または中間体またはリンカーで使用する。薬物と中間体との間の反応の生成物、誘導体化薬物を続いて、適切な条件下で抗体または抗原結合性断片と反応させる。別法では、リンカーまたは中間体を初めに、抗体または誘導体化抗体と反応させ、次いで、薬物または誘導体化薬物と反応させてもよい。
いくつかの異なる反応を、薬物及び／またはリンカーを抗体部分に共有結合するために利用することができる。これは多くの場合に、リシンのアミン基、グルタミン酸及びアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、及び芳香族アミノ酸の様々な部分を含む、抗体分子の１個または複数のアミノ酸残基の反応により達成される。例えば、非特異的共有結合を、化合物の上のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体部分の上のアミノ（またはカルボキシ）基に結合するカルボジイミド反応を使用して行ってもよい。加えて、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性作用物質を、化合物の上のアミノ基を抗体部分の上のアミノ基に結合するために使用してもよい。薬物を結合剤に結合するために、シッフ塩基反応も利用可能である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物を過ヨウ素酸酸化させて、アルデヒドを形成し、次いで、これを、結合剤と反応させることを含む。結合は、結合剤のアミノ基とのシッフ塩基の形成により起こる。イソチオシアナートも、薬物を結合剤に共有結合するためのカップリング剤として使用することができる。他の技術は、当業者に公知であり、本開示の範囲内である。
薬物負荷
薬物負荷は、ｐにより表され、本明細書では、薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）とも称される。薬物負荷は、抗体部分１つ当たり１〜２０の薬物部分の範囲内であり得る。一部の実施形態では、ｐは、１〜２０の整数である。一部の実施形態では、ｐは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の整数である。一部の実施形態では、ｐは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３の整数である。一部の実施形態では、ｐは、３〜４の整数である。他の実施形態では、ｐは、１、２、３、４、５、または６、好ましくは３または４である。
薬物負荷は、抗体部分の上の結合部位の数により限定され得る。一部の実施形態では、ＡＤＣのリンカー部分（Ｌ）は、抗体部分の上の１個または複数個のアミノ酸残基の上の化学的に活性な基により、抗体部分に結合している。例えば、リンカーを、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオール、またはカルボキシル基を介して、抗体部分に（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端に、１個もしくは複数のリシン残基のイプシロンアミノ基に、１個もしくは複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基に、または１個もしくは複数のシステイン残基のスルフヒドリル基に）結合してよい。リンカーが結合する部位は、抗体部分のアミノ酸配列中の天然残基であってもよいし、または例えば、ＤＮＡ組換え技術により（例えば、アミノ酸配列にシステイン残基を導入することにより）、またはタンパク質生化学により（例えば、還元、ｐＨ調節、もしくは加水分解により）、抗体部分に導入されていてもよい。
一部の実施形態では、抗体部分にコンジュゲートし得る薬物部分の数は、遊離システイン残基の数により限定される。例えば、結合がシステインチオール基である場合、抗体は、１個のみ、または数個のシステインチオール基を有し得るか、またはリンカーがそれを介して結合することができる、１個のみ、または数個の十分に反応性のチオール基を有し得る。一般に、抗体は、薬物部分に結合し得る多くの遊離で反応性のシステインチオール基を含有しない。実際に、抗体中の多くのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。抗体へのリンカー−毒素の過剰結合は、ジスルフィド架橋を形成するために利用可能なシステイン残基を減少させることにより、抗体を不安定化し得る。したがって、最適な薬物：抗体比は、抗体部分を不安定化させることなく、（抗体１つ当たりの結合薬物部分の数を増加させることにより）ＡＤＣの効力を上昇させるべきである。一部の実施形態では、最適な比は、約３〜４であり得る。
一部の実施形態では、Ｍａｌ部分を介して抗体部分に結合しているリンカーは、約３〜４の比を示す。一部の実施形態では、代替の部分（例えば、ＯＳｕ部分）を介して抗体部分に結合しているリンカーは、より低い最適比（例えば、約０〜３などの、より低い比）を示し得る。一部の実施形態では、短いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）２もしくは（ＰＥＧ）４などの短いＰＥＧスペーサーユニット、または（ＣＨ２）５などの短いアルキルスペーサーユニット）を含むリンカーは、約３〜４の比を示す。一部の実施形態では、長いスペーサーユニット（例えば、（ＰＥＧ）８）を含むリンカーは、より低い最適比（例えば、約０〜３などの、より低い比）を示し得る。一部の実施形態では、ペプチド切断可能な部分を含むリンカーは、約３〜４の比を示す。一部の実施形態では、代替の切断可能な部分（例えば、切断可能なジスルフィドまたは切断可能なスルホンアミド）を含むリンカーは、より低い最適比（例えば、約０〜３などの、より低い比）を示し得る。一部の実施形態では、抗ＦＲＡ抗体（例えば、ＭＯＲＡｂ−００３）などの抗体に接続しているＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンを含むＡＤＣは、約３〜４の比を有する。一部の実施形態では、約３〜４の比が、抗ｈｅｒ２抗体（例えば、トラスツズマブ）などの異なる抗体に接続しているＭａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンを含むＡＤＣで観察される。一部の実施形態では、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンリンカー−毒素を含むＡＤＣで観察される最適な比は、抗体に依存していない。
一部の実施形態では、１個または複数の遊離システイン残基を生成するために、抗体部分を、コンジュゲーションの前に還元条件に曝露する。一部の実施形態では、抗体を、部分的または全体還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で還元させて、反応性システインチオール基を生成することができる。非対合システインは、鎖内ジスルフィド結合をインタクトなままにしながら軽鎖及び重鎖（Ｈ−Ｌ対合１つ当たり１対）ならびにヒンジ領域の２つの重鎖（ヒトＩｇＧ１の場合にはＨ−Ｈ対合１つ当たり２対）を結合する鎖間ジスルフィド結合を優先的に還元する、限定モル当量のＴＣＥＰでの部分的還元により生成することができる（Ｓｔｅｆａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０４５：１４５−７１）。実施形態では、抗体内のジスルフィド結合を、電気化学的に、例えば、交互の還元及び酸化電圧を印加する作用電極を使用することにより還元させる。このアプローチは、ジスルフィド結合の還元を、分析用デバイス（例えば、電気化学的検出デバイス、ＮＭＲ分光計、または質量分析計）または化学的分離デバイス（例えば、液体クロマトグラフ（例えば、ＨＰＬＣ）または電気泳動デバイス（例えば、米国特許出願公開第２０１４００６９８２２号を参照されたい））へとオンラインで連結することを可能にする。特定の実施形態では、抗体を変性条件に掛けて、アミノ酸残基の上の反応性求核基、例えば、リシンまたはシステインを露出させる。
ＡＤＣの薬物負荷を、種々の方法で、例えば、（ｉ）抗体に対して、モル過剰の薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬を限定すること；（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間もしくは温度を限定すること；（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための還元条件を部分的に、もしくは限定すること；及び／または（ｉｖ）システイン残基の数及び位置がリンカー−薬物結合の数及び／または位置の制御のために修飾されるように、組換え技術により、抗体のアミノ酸配列を操作することにより制御することができる。
一部の実施形態では、遊離システイン残基を、抗体部分のアミノ酸配列に導入する。例えば、親抗体の１個または複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置き換えられているシステイン操作された抗体を調製することができる。抗体の任意の形態を、そのように操作する、すなわち、変異させることができる。例えば、親Ｆａｂ抗体断片を操作して、「ＴｈｉｏＦａｂ」と称される、システイン操作されたＦａｂを形成することができる。同様に、親モノクローナル抗体を操作して、「ＴｈｉｏＭａｂ」を形成することができる。単一部位変異は、ＴｈｉｏＦａｂでは単一の操作システイン残基をもたらし、単一の部位変異は、ＩｇＧ抗体の二量体の性質により、ＴｈｉｏＭａｂでは２個の操作システイン残基をもたらす。親ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントをコードするＤＮＡは、当技術分野で公知の様々な方法により調製することができる（例えば、ＷＯ２００６／０３４４８８に記載の方法を参照されたい）。これらの方法には、これらだけに限定されないが、ポリペプチドをコードする当初に調製されたＤＮＡの部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介性）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が含まれる。組換え抗体のバリアントはまた、制限断片操作によっても、または合成オリゴヌクレオチドとのオーバーラップ伸長ＰＣＲによってもコンストラクトすることができる。式ＩのＡＤＣは、これらだけに限定されないが、１、２、３、または４個の操作システインアミノ酸を有する抗体を含む（Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０２：１２３−３８）。一部の実施形態では、操作を使用しなくても、１個または複数の遊離システイン残基が抗体部分にすでに存在し、その場合、既存の遊離システイン残基を使用して、抗体部分を薬物部分にコンジュゲートすることができる。
一部の実施形態では、高い薬物負荷（例えば、ｐ＞５）は、特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の喪失をもたらし得る。高い薬物負荷はまた、特定のＡＤＣの薬物動態（例えば、クリアランス）にマイナスの影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、低い薬物負荷（例えば、ｐ＜３）は、標的発現性細胞及び／またはバイスタンダー細胞に対する特定のＡＤＣの効力を低下させ得る。一部の実施形態では、本開示のＡＤＣでの薬物負荷は、１〜約８；約２〜約６；約２〜約５；約３〜約５；または約３〜約４の範囲である。
抗体部分及びリンカー部分の多数のコピーを含む反応混合物中で、１個を上回る求核基が薬物−リンカー中間体またはリンカー部分試薬、続いて薬物部分試薬と反応する場合、得られる生成物は、ＡＤＣ化合物の混合物であり得、その混合物では、抗体部分の各コピーに結合している１つまたは複数の薬物部分の分布がある。一部の実施形態では、コンジュゲーション反応から生じるＡＤＣの混合物における薬物負荷は、抗体部分１つ当たり１〜２０の結合した薬物部分の範囲である。抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数（すなわち、平均薬物負荷、または平均ｐ）は、当技術分野で公知の任意の従来の方法により、例えば、質量分析法（例えば、逆相ＬＣ−ＭＳ）、及び／または高速液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）により計算することができる。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、疎水性相互作用クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）により決定される。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、逆相液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）により決定される。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、約３〜約４；約３．１〜約３．９；約３．２〜約３．８；約３．２〜約３．７；約３．２〜約３．６；約３．３〜約３．８；または約３．３〜約３．７である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、約３．２〜約３．８である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、約３．８である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、３〜４；３．１〜３．９；３．２〜３．８；３．２〜３．７；３．２〜３．６；３．３〜３．８；または３．３〜３．７である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、３．２〜３．８である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、３．８である。
一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、約３．５〜約４．５；約３．６〜約４．４；約３．７〜約４．３；約３．７〜約４．２；または約３．８〜約４．２である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、約３．６〜約４．４である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、約４．０である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、３．５〜４．５；３．６〜４．４；３．７〜４．３；３．７〜４．２；または３．８〜４．２である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、３．６〜４．４である。一部の実施形態では、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数は、４．０である。
様々な実施形態で、抗体部分１つ当たりの薬物部分の平均数に関して使用される場合の「約」という用語は、＋／−１０％を意味する。
個々のＡＤＣ化合物、または「種」を、質量分析により混合物において同定し、ＵＰＬＣまたはＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）により分離することができる。特定の実施形態では、単一の負荷値を有する均一か、またはほぼ均一なＡＤＣを、コンジュゲーション混合物から、例えば、電気泳動またはクロマトグラフィーにより単離することができる。
一部の実施形態では、約４の薬物負荷及び／または平均薬物負は、有利な特性をもたらす。一部の実施形態では、約４未満の薬物負荷及び／または平均薬物負荷は、許容できないほど高レベルの非コンジュゲート抗体種をもたらし得、それらは、標的抗原への結合についてＡＤＣと競合し得る、及び／または処置有効性の減少をもたらし得る。一部の実施形態では、約４を上回る薬物負荷及び／または平均薬物負荷は、許容できないほど高レベルの生成物異質性及び／またはＡＤＣ凝集をもたらし得る。約４を上回る薬物負荷及び／または平均薬物負荷はまた、抗体部分の安定化に必要な１つまたは複数の化学結合の喪失により、ＡＤＣの安定性に影響を及ぼし得る。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、式Ｉを有する：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
［式中、
（ｉ）Ａｂは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む内在化型抗葉酸受容体アルファ抗体またはその抗原結合性断片であり；
（ｉｉ）Ｄは、エリブリンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；
（ｉｖ）ｐは、３〜４の整数である］。
他の実施形態では、ＡＤＣは、式Ｉを有する：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
［式中、
（ｉ）Ａｂは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む内在化型抗ヒト上皮成長因子受容体２抗体またはその抗原結合性断片であり；
（ｉｉ）Ｄは、エリブリンであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；
（ｉｖ）ｐは、３〜４の整数である］。
一部の実施形態では、ｐは、４である。
本開示は、記載のＡＤＣを生産する方法を含む。簡単に述べると、ＡＤＣは、抗体部分としての抗体または抗原結合性断片、薬物部分、ならびに薬物部分及び抗体部分を接続するリンカーを含む。一部の実施形態では、ＡＤＣを、薬物部分及び抗体部分に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して調製することができる。例えば、一部の実施形態では、抗体部分のシステインチオールは、リンカーまたは薬物−リンカー中間体の反応性官能基（例えば、マレイミド部分）と結合を形成して、ＡＤＣを作製することができる。ＡＤＣの生成を、当業者に公知の任意の技術により達成することができる。
一部の実施形態では、ＡＤＣを、抗体部分をリンカー及び薬物部分と逐次的に接触させて、抗体部分が最初にリンカーと共有結合し、次いで、予め形成した抗体−リンカー中間体が薬物部分と反応するようにすることにより生産する。抗体−リンカー中間体を、薬物部分を接触させる前に、精製ステップに掛けても、または掛けなくてもよい。他の実施形態では、ＡＤＣを、抗体部分を、リンカーを薬物部分と反応させることにより予め形成したリンカー薬物化合物と接触させることにより生産する。予め形成したリンカー−薬物化合物を、抗体部分を接触させる前に、精製ステップに掛けても、または掛けなくてもよい。他の実施形態では、抗体部分を、１つの反応混合物においてリンカー及び薬物部分と接触させて、抗体部分とリンカーとの間、及びリンカーと薬物部分との間の共有結合の同時形成を可能にする。ＡＤＣを生産するこの方法は、リンカーを反応混合物に添加する前に、抗体部分を、抗体部分と接触させる反応を含んでもよく、逆も同様である。特定の実施形態では、抗体部分を、コンジュゲーションを可能にする条件下で、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンなどの薬物部分に接続したリンカーと反応させることにより、ＡＤＣを生産する。
上記の方法に従って調製したＡＤＣを精製ステップに掛けてもよい。精製ステップは、タンパク質を精製するために当技術分野で公知の任意の生化学的方法、またはそれらの方法の任意の組合せを含んでよい。これらには、これらだけに限定されないが、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、任意の電荷または等電点をベースとするクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、例えば、ＣＨＴ（セラミックハイドロキシアパタイト）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、濾過、選択的沈殿、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
治療的使用及び組成物
障害、例えば、腫瘍障害について対象を処置する際に、本開示のＡＤＣを使用する方法を、本明細書において開示する。ＡＤＣを、単独で、または第２の治療薬と組み合わせて投与してもよく、任意の薬学的に許容される製剤、投薬量、及び投与計画で投与してもよい。ＡＤＣ処置有効性を、毒性について、さらには、有効性の指標について評価し、それに応じて調節してもよい。有効性の尺度には、これらだけに限定されないが、インビトロまたはインビボで観察される細胞増殖抑制及び／または細胞傷害効果、腫瘍体積の減少、腫瘍増殖の阻害、及び／または生存の持続が含まれる。
ＡＤＣが細胞に対して細胞増殖抑制及び／または細胞傷害効果を発揮するかどうかを決定する方法は、公知である。例えば、ＡＤＣの細胞傷害性または細胞増殖抑制活性は、ＡＤＣの標的タンパク質を発現する哺乳類細胞に、細胞培養培地中で曝露すること；約６時間から約５日間にわたって細胞を培養すること；及び細胞生存率を測定することにより測定することができる。細胞ベースのインビトロアッセイを使用して、生存率（増殖）、細胞傷害性、及びＡＤＣのアポトーシス（カスパーゼ活性化）の誘導を測定してもよい。
抗体−薬物コンジュゲートが細胞増殖抑制効果を発揮するかどうかを決定するために、チミジン組込みアッセイを使用してもよい。例えば、標的抗原を発現するがん細胞を、９６ウェルプレートで５，０００細胞／ウェルの密度で、７２時間にわたって培養し、その７２時間のうちの最後の８時間の間、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに曝露することができる。培養細胞への３Ｈ−チミジンの組込みを、ＡＤＣの存在下、及び非存在下で測定する。
細胞傷害性を決定するために、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を測定してもよい。壊死は典型的には、形質膜の透過性の上昇；細胞の腫脹、及び形質膜の破壊により達成される。アポトーシスは典型的には、細胞膜の小疱形成、細胞質の凝縮、及び内在性エンドヌクレアーゼの活性化により特徴づけられる。がん細胞に対するこれらの作用のいずれかの決定は、ＡＤＣががんの処置において有用であることを示す。
細胞生存率を、例えば、細胞において、ニュートラルレッド、トリパンブルー、クリスタルバイオレット、またはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの色素の取込みを決定することにより測定してもよい（例えば、Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３：４７３−６を参照されたい）。そのようなアッセイでは、細胞を、色素を含有する培地中でインキュベートし、細胞を洗浄し、色素の細胞取り込みを反映する残りの色素を分光測光法で測定する。特定の実施形態では、調製したＡＤＣのインビトロ効力を、クリスタルバイオレットアッセイを使用して評価する。クリスタルバイオレットは、生細胞の核に蓄積するトリアリールメタン色素である。このアッセイでは、細胞を、ＡＤＣまたは対照薬剤に規定の期間にわたって曝露し、その後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、水で充分に洗浄し、次いで、１％ＳＤＳで可溶化し、分光測光法で読み取る。タンパク質結合性色素スルホロダミンＢ（ＳＲＢ）も、細胞傷害性を測定するために使用することができる（Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１２）。
アポトーシスは、例えば、ＤＮＡ断片化を測定することにより、定量化することができる。ＤＮＡ断片化を定量的にインビトロで決定するための市販の測光法が利用可能である。ＴＵＮＥＬ（断片化ＤＮＡ中の標識ヌクレオチドの組込みを検出する）及びＥＬＩＳＡベースのアッセイを含む、そのようなアッセイの例は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ（１９９９）Ｎｏ．２，ｐｐ．３４−３７（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。
アポトーシスは、細胞の形態学的変化を測定することにより決定することもできる。例えば、壊死と同様に、形質膜完全性の喪失を、ある種の色素（例えば、蛍光色素、例えば、アクリジンオレンジまたは臭化エチジウムなど）の取込みを測定することにより決定することができる。アポトーシス細胞数を測定するための方法は、Ｄｕｋｅ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９２）ｐｐ．３．１７．１−３．１７．１６）に記載されている。細胞をまた、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、またはヨウ化プロピジウム）で標識し、細胞を、クロマチン凝縮及び核内膜に沿った辺縁趨向について観察することができる。アポトーシスを決定するために測定することができる他の形態学的変化には、例えば、細胞質凝縮、細胞膜小疱形成の増加、及び細胞収縮が含まれる。
本開示のＡＤＣをまた、バイスタンダー死滅活性について評価してもよい。バイスタンダー死滅活性は、例えば、標的抗原について１陽性である細胞系及び標的抗原について１陰性である細胞系の２つの細胞系を使用するアッセイにより決定することができる。細胞系を好ましくは、それらを識別するように標識する。例えば、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ（商標）Ｇｒｅｅｎ（ＮＬＧ）で標識されたＩＧＲＯＶ１細胞（ＦＲＡ＋）及びＮｕｃｌｉｇｈｔ（商標）Ｒｅｄ（ＮＬＲ）で標識されたＨＬ−６０（ＦＲＡ−）を同時培養し、抗ＦＲＡ ＡＤＣで処理し、続いて、細胞傷害性を監視することができる。標的抗原陽性細胞と混合した場合の標的抗原陰性細胞の死滅は、バイスタンダー死滅を示す一方で、標的抗原陽性細胞の非存在下での標的抗原陰性細胞の死滅は、オフターゲット死滅を示す。
一部の態様では、本開示は、チューブリンを破壊することにより、がん細胞または組織を死滅させる、その成長を阻害もしくは調節する、またはその代謝を妨害する方法を特色とする。この方法は、任意の対象で、チューブリンの破壊が治療効果をもたらす場合に使用することができる。チューブリンの破壊から利益を受けることができる対象には、これらだけに限定されないが、胃癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、乳癌（例えば、三重陰性乳癌）、子宮内膜癌（例えば、漿液性子宮内膜癌）、骨肉腫、カポジ肉腫、精巣生殖細胞癌、白血病、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌（例えば、神経膠芽細胞腫）、甲状腺癌、結腸直腸癌、及び／または皮膚癌（例えば、黒色腫）、またはその任意の転移を有するか、またはそれらを有するリスクのある対象が含まれる（Ｄｕｍｏｎｔｅｔ ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９：７９０−８０３）。様々な実施形態で、本開示のＡＤＣを、ＦＲＡを発現する任意の細胞または組織、例えば、ＦＲＡ発現性がん細胞または組織に投与することができる。例示的な実施形態は、ＦＲＡ媒介性細胞シグナル伝達を阻害する方法または細胞を死滅させる方法を含む。この方法を、ＦＲＡを発現する任意の細胞または組織、例えば、がん性細胞または転移病変で使用することができる。ＦＲＡ発現性がんの非限定的例には、胃癌、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、三重陰性乳癌、子宮内膜癌、漿液性子宮内膜癌、肺類癌、及び骨肉腫が含まれる。ＦＲＡ発現性細胞の非限定的例には、ＩＧＲＯＶ１及びＯＶＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞、ＮＣＩ−Ｈ２１１０ヒト非小細胞肺癌細胞、及びＦＲＡをコードする組換え核酸またはその一部を含む細胞が含まれる。
様々な他の実施形態では、本開示のＡＤＣを、ｈｅｒ２を発現する任意の細胞または組織、例えば、ｈｅｒ２発現性がん細胞または組織で投与することができる。例示的な実施形態は、ｈｅｒ２媒介性細胞シグナル伝達を阻害する方法または細胞を死滅させる方法を含む。この方法は、ｈｅｒ２を発現する任意の細胞または組織、例えば、がん性細胞または転移病変で使用することができる。ｈｅｒ２発現性がんの非限定的例には、乳癌、胃癌、膀胱癌、尿路上皮細胞癌、食道癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び卵巣癌が含まれる（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１７：８５−９９）。ｈｅｒ２発現性細胞の非限定的例には、ＮＣＩ−Ｎ８７−ｌｕｃヒト胃癌細胞、ＺＲ７５及びＢＴ−４７４ヒト乳房腺管癌細胞、ならびにｈｅｒ２をコードする組換え核酸またはその一部を含む細胞が含まれる。
様々な他の実施形態では、本開示のＡＤＣは、メソテリン（ＭＳＬＮ）を発現する任意の細胞または組織、例えば、ＭＳＬＮ発現性がん細胞または組織で投与することができる。例示的な実施形態は、ＭＳＬＮ媒介性細胞シグナル伝達を阻害する方法または細胞を死滅させる方法を含む。この方法は、ＭＳＬＮを発現する任意の細胞または組織、例えば、がん性細胞または転移病変で使用することができる。ＭＳＬＮ発現性がんの非限定的例には、中皮腫、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、卵巣癌、及び肺癌（例えば、肺腺癌）が含まれる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３３２１４）。ＭＳＬＮ発現性細胞の非限定的例には、ＯＶＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞、ＨＥＣ−２５１ヒト類内膜細胞、Ｈ２２６ヒト肺扁平上皮細胞中皮腫細胞、及びＭＳＬＮをコードする組換え核酸またはその一部を含む細胞が含まれる。
例示的な方法は、細胞を、有効量、すなわち、細胞を死滅させるために十分な量の、本明細書に記載のとおりのＡＤＣと接触させるステップを含む。この方法は、培養中の細胞で、例えば、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはインサイチュで使用することができる。例えば、ＦＲＡ、ｈｅｒ２、及び／またはＭＳＬＮを発現する細胞（例えば、腫瘍または転移病変の生検から収集された細胞；樹立されたがん細胞系からの細胞；または組換え細胞）をインビトロで、培養培地中で培養することができ、接触ステップを、ＡＤＣを培養培地に添加することにより行うことができる。この方法は、特に、ＦＲＡ、ｈｅｒ２、及び／またはＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞を含む、ＦＲＡ、ｈｅｒ２、及び／またはＭＳＬＮを発現する細胞の死滅をもたらす。別法では、ＡＤＣを、インビボで効果を有するように、任意の適切な投与経路（例えば、静脈内、皮下、または腫瘍組織との直接的な接触）により、対象に投与することができる。
開示のＡＤＣ治療用組成物のインビボ効果は、適切な動物モデルで評価することができる。例えば、異種がんモデルを使用することができ、その際、がん移植片または継代異種移植片組織を、免疫低下動物、例えば、ヌードまたはＳＣＩＤマウスに導入する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２−８）。腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮または転移などを測定するアッセイを使用して、有効性を予測することができる。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイも使用することができる。一実施形態では、治療用組成物で処置された腫瘍担持マウスからの異種移植片を、アポトーシス病巣の有無について検査し、未処置の対象異種移植片担持マウスと比較することができる。処置マウスの腫瘍でアポトーシス病巣が見い出される程度は、組成物の治療効力の示度を与える。
さらに、がんを処置する方法を本明細書において提供する。本明細書において開示するＡＤＣは、治療目的で、非ヒト哺乳類またはヒト対象に投与することができる。治療方法は、腫瘍を有する哺乳類に、結合に利用することができる、またはがん細胞表面に局在している、発現される抗原に結合する標的化抗体に結合している選択された化学療法薬（例えば、エリブリン）を含むＡＤＣの生物学的有効量を投与することを必要とする。例示的な実施形態は、化学療法薬を、ＦＲＡを発現する細胞に送達する方法であって、化学療法薬を、ＦＲＡエピトープに免疫特異的に結合する抗体にコンジュゲートすること、及び細胞をＡＤＣに曝露することを含む方法である。本開示のＡＤＣが適応とされる、ＦＲＡを発現する例示的な腫瘍細胞には、胃癌、漿液性卵巣癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌（例えば、三重陰性乳癌）、肺類癌腫、骨肉腫、子宮内膜癌、及び漿液性組織を含む子宮内膜癌からの細胞が含まれる。
別の例示的な実施形態は、化学療法薬を、ｈｅｒ２を発現する細胞に送達する方法であって、化学療法薬を、ｈｅｒ２エピトープに免疫特異的に結合する抗体にコンジュゲートすること、及び細胞をＡＤＣに曝露することを含む方法である。本開示のＡＤＣが適応とされる、ｈｅｒ２を発現する例示的な腫瘍細胞には、乳癌、胃癌、膀胱癌、尿路上皮細胞癌、食道癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び卵巣癌からの細胞が含まれる。
別の例示的な実施形態は、化学療法薬を、ＭＳＬＮを発現する細胞に送達する方法であって、化学療法薬を、ＭＳＬＮエピトープに免疫特異的に結合する抗体にコンジュゲートすること、及び細胞をＡＤＣに曝露することを含む方法である。本開示のＡＤＣが適応とされる、ＭＳＬＮを発現する例示的な腫瘍細胞には、中皮腫、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、卵巣癌、及び肺癌（例えば、肺腺癌）からの細胞が含まれる。
別の例示的な実施形態は、ＡＤＣの抗体部分のための標的抗原、例えば、ＦＲＡ、ｈｅｒ２、またはＭＳＬＮを発現するがんを有するか、または有するリスクのある患者を処置する方法であって、患者に、本開示のＡＤＣの治療有効量を投与することを含む方法である。一部の実施形態では、患者は、単独で投与される場合の抗ＦＲＡ抗体での処置に対して、及び／または単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して、非応答性または不十分に応答性である。他の実施形態では、患者は、単独で投与される場合の抗ｈｅｒ２抗体での処置に対して、及び／または単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して、非応答性または不十分に応答性である。他の実施形態では、患者は、単独で投与される場合の抗ＭＳＬＮ抗体での処置に対して、及び／または単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して、非応答性または不十分に応答性である。他の実施形態では、患者は、単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して非忍容性である。例えば、患者は、がんを処置するために、全身毒性をもたらす用量のエリブリンを必要とすることがあるが、これは、ＡＤＣの抗体部分のための標的抗原、例えば、ＦＲＡ、ｈｅｒ２、またはＭＳＬＮを発現するがんに標的化送達し、それにより、オフターゲット死滅を減少させることにより、克服される。
別の例示的な実施形態は、標的抗原発現性腫瘍（例えば、ＦＲＡ発現性腫瘍、ｈｅｒ２発現性腫瘍、またはＭＳＬＮ発現性腫瘍）の成長を減少または阻害する方法であって、治療有効量のＡＤＣを投与することを含む方法である。一部の実施形態では、処置は、患者の腫瘍の成長を減少させる、もしくは阻害する、転移病変の数もしくはサイズを減少させる、腫瘍負荷を減少させる、原発性腫瘍負荷を減少させる、侵襲性を減少させる、生存期間を延長させる、及び／または生活の質を維持する、もしくは改善することに十分である。一部の実施形態では、腫瘍は、単独で投与される場合の抗ＦＲＡ抗体での処置に対して、及び／または単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して、抵抗性または難治性である。他の実施形態では、腫瘍は、単独で投与される場合の抗ｈｅｒ２抗体での処置に対して、及び／または単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して、抵抗性または難治性である。一部の実施形態では、腫瘍は、単独で投与される場合の抗ＭＳＬＮ抗体での処置に対して、及び／または単独で投与される場合の薬物部分（例えば、エリブリン）での処置に対して、抵抗性または難治性である。
さらに、本開示の抗体を、獣医学目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、ＡＤＣが結合することができる抗原を発現する非ヒト哺乳類に投与することができる。後者については、そのような動物モデルは、本開示のＡＤＣの治療効力を評価するために（例えば、投薬量及び投与の時間経過を試験するために）有用であり得る。
さらに、本開示のＡＤＣの治療的使用を本明細書において提供する。例示的な実施形態は、標的抗原発現性がん（例えば、ＦＲＡ発現性がん、ｈｅｒ２発現性がん、またはＭＳＬＮ発現性がん）の処置におけるＡＤＣの使用である。標的抗原発現性がん（例えば、ＦＲＡ発現性がん、ｈｅｒ２発現性がん、またはＭＳＬＮ発現性がん）の処置において使用するためのＡＤＣも開示している。ＦＲＡ、ｈｅｒ２、及び／またはＭＳＬＮを発現するがんを有する対象を同定するための方法は、当技術分野で公知であり、開示のＡＤＣで処置するために適した患者を同定するために使用することができる。
別の例示的な実施形態は、標的抗原発現性がん（例えば、ＦＲＡ発現性がん、ｈｅｒ２発現性がん、またはＭＳＬＮ発現性がん）を処置するための医薬品を製造する方法における、ＡＤＣの使用である。
上述の方法の実施において使用される治療用組成物を、所望の送達方法に適した薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に製剤化することができる。例示的な実施形態は、本開示のＡＤＣ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。適切な担体には、治療用組成物と合わせた場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を維持し、かつ一般に、患者の免疫系と非反応性である任意の物質が含まれる。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合性であるあらゆるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、メシル酸塩の１種または複数など、さらには、それらの組合せが含まれる。多くの場合に、組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容される担体はさらに、ＡＤＣの貯蔵寿命または有効性を増強する、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤を含んでもよい。
治療用製剤を可溶化し、腫瘍部位に治療用組成物を送達することができる任意の経路を介して投与することができる。潜在的に有効な投与経路には、これらだけに限定されないが、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、内臓内、同所などが含まれる。治療用タンパク質製剤を凍結乾燥させ、無菌粉末として、好ましくは真空下で貯蔵し、次いで、注射の前に静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含有）または滅菌水中で再構成することができる。治療用製剤は、ＡＤＣまたは薬学的に許容されるその塩、例えば、メシル酸塩を含んでもよい。
本明細書において開示するＡＤＣを、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量で、それを必要とする患者に投与することができる。一部の実施形態では、ＡＤＣを、患者に、毎日、隔月で、またはその間の任意の期間で投与する。上述の方法を使用してがんを処置するための投薬量及び投与プロトコルは、方法及び標的がんで様々であり、一般に、当技術分野で認められているいくつかの他の因子に依存している。
さまざまな送達系が公知であり、本開示の１つまたは複数のＡＤＣを投与するために使用することができる。ＡＤＣを投与する方法には、これらだけに限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、及び粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口経路）が含まれる。加えて、例えば、吸入器または噴霧器、及びエアロゾル剤を含む製剤を使用することにより、肺投与を使用することができる。例えば、米国特許出願第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、及び同第４，８８０，０７８号；ならびにＣＴ公開番号ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６、及びＷＯ９９／６６９０３に記載の肺投与のための組成物及び方法を参照されたい。ＡＤＣを、任意の慣用の経路により、例えば、注入もしくは大量注射により、または上皮性もしくは粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を介しての吸収により投与することができる。投与は、全身でも局所でもよい。
本明細書において開示する治療用組成物は、製造及び貯蔵の条件下で無菌で、安定している。一部の実施形態では、ＡＤＣの１つもしくは複数、または医薬組成物を、無水滅菌凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として気密密閉容器内で供給し、（例えば、水または生理食塩水で）対象に投与するために適切な濃度に再構成することができる。好ましくは、予防薬もしくは治療薬または医薬組成物の１種または複数を、無水滅菌凍結乾燥粉末として気密密閉容器内で、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、または少なくとも１００ｍｇ、またはその間の任意の量の単位投薬量で供給する。一部の実施形態では、凍結乾燥ＡＤＣまたは医薬組成物を、２℃〜８℃でオリジナルの容器内で貯蔵する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣまたは医薬組成物の１種または複数を、液体形態で、気密密閉容器内で、例えば、薬剤の量及び濃度を示している容器内で供給する。一部の実施形態では、投与組成物の液体形態を、気密密閉容器内で、ＡＤＣを少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１００ｍｇ／ｍＬで供給する。液体形態を、２℃〜８℃で、オリジナルの容器内で貯蔵してよい。
一部の実施形態では、本開示のＡＤＣを、非経口投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。注射用液剤は、フリントもしくは褐色バイアル、アンプル、またはプレフィルドシリンジ、または他の既知の送達もしくは貯蔵デバイス内の液体か、または凍結乾燥させた剤形のいずれかから構成されてよい。
本明細書に記載の組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体、半固体、及び固体剤形、例えば、液体液剤（例えば、注射可能及び不融性液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤、及び坐剤が含まれる。好ましい形態は、意図されている投与様式及び治療適用に依存する。
様々な実施形態で、処置は、許容される投与経路を介してのＡＤＣ製剤の単回ボーラスまたは反復投与を含む。
最も有効な投与計画の決定を援助することなどために、患者を、所与のサンプルにおける標的抗原のレベル（例えば、標的抗原発現性細胞のレベル）について評価することができる。例示的な実施形態は、患者が本開示のＡＤＣでの処置に応答するかどうかを決定する方法であって、患者から生体試料を得ること、及びその生体試料をＡＤＣと接触させることを含む方法である。例示的な生体試料には、組織または体液、例えば、炎症性浸出液、血液、血清、腸液、糞便サンプル、または腫瘍生検（例えば、標的抗原発現性がん、例えば、ＦＲＡ発現性がん、ｈｅｒ２発現性がん、またはＭＳＬＮ発現性がんを有するか、そのリスクのある患者に由来する腫瘍生検）が含まれる。一部の実施形態では、サンプル（例えば、組織及び／または体液）を対象から得ることができ、適切な免疫学的方法を使用して、標的抗原（例えば、ＦＲＡ、ｈｅｒ２、またはＭＳＬＮ）のタンパク質発現を検出及び／または測定することができる。そのような評価は、治療を通じて目的を監視するためにも使用され、他のパラメーターの評価と組み合わせて、治療の成功を正確に測定するために有用である。
一部の実施形態では、ＡＤＣの有効性を、対象からの腫瘍サンプルをＡＤＣと接触させること、及び腫瘍増殖速度または体積を評価することにより評価することができる。一部の実施形態では、ＡＤＣが有効であると決定された場合に、それを、対象に投与することができる。
上記の治療上のアプローチを、広範囲の様々な追加の外科手術、化学療法、または放射線療法レジメンのいずれか１つと組み合わせることができる。
例えば、上記の方法に従ってがんを処置するための医薬品の製造における本開示のＡＤＣの１つまたは複数の使用も本明細書において開示する。一部の実施形態では、本明細書において開示するＡＤＣを、例えば、上記の方法に従ってがんを処置するたに使用する。
様々な実施形態で、本明細書に記載の実験室及び治療適用において使用するためのキットは、本開示の範囲内である。そのようなキットは、１つまたは複数の容器、例えば、バイアル、管などを収容するように区画化されている担体、パッケージ、または容器を含んでもよく、その際、容器（複数可）のそれぞれは、本明細書に記載の使用などの取扱説明を含むラベルまたは挿入物と共に、本明細書において開示する方法で使用される別々の要素の１つを含む。キットは、薬物部分を含む容器を含み得る。本開示はまた、薬剤の量を示す、アンプルまたはサシェなどの気密密閉された容器中にパッケージングされたＡＤＣの１つもしくは複数、またはその医薬組成物を提供する。
キットは、上記の容器及び、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含めて、商業的及び使用者の観点から望ましい材料を含む、それと関連する１個または複数の他の容器；内容物及び／または取扱説明を列挙する担体、パッケージ、容器、バイアル及び／または管用ラベル、ならびに取扱説明書を含む添付文書を含んでもよい。
ラベルは、組成物が特定の治療または非治療適用、例えば、予後判定、予防、診断、または実験室適用などのために使用されることを示すために、容器上に存在していてもよいし、または容器に付随してもよい。ラベルはまた、本明細書に記載のものなど、インビボまたはインビトロで使用するための指示を示していてもよい。指示及びまたは他の情報も、添付文書（複数可）またはラベル（複数可）の上に含まれていてよく、それらは、キットに付随するか、またはその上に含まれる。ラベルは、容器の上に、またはそれに随伴していてよい。ラベルを形成する文字、数字、または他の記号が容器自体に成形またはエッチングされている場合には、ラベルは、容器の上にあってよい。容器も収容する入れ物または担体内に存在する場合には、ラベルは、例えば、添付文書として容器に随伴してよい。ラベルは、組成物が本明細書に記載のがんなどの状態を診断または処置するために使用されることを示し得る。
当業者には、本明細書に記載の本発明の方法の他の適切な変更及び適応が明らかであること、及びそれらが、本発明の範囲または本明細書において開示する実施形態から逸脱することなく、適切な同等物を使用して成され得ることは、容易に分かるであろう。ここまで、本発明を詳細に記載してきたが、同じことが、次の実施例を参照することにより、より明確に理解されるであろうが、その実施例は、単に説明を目的として含まれるものであって、限定的であることを意図したものではない。
実施例１
１．物質及び方法
ＡＤＣを調製するために使用したＭＯＲＡｂ−００３は、Ｌｏｔ＃ＡＡ０３１２に由来した。
１．１ 細胞毒素
コンジュゲート可能な細胞毒素の構造を表１１に示す。
Figure 0006870051
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１．２ 抗体−薬物コンジュゲーション
１．２．１ ＴＣＥＰを使用しての部分的還元
ＭＯＲＡｂ−００３のための部分的還元条件を、非チオール還元剤トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の濃度、抗体濃度、及び還元時間を変動させることにより確立した。ＭＯＲＡｂ−００３を１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に緩衝液交換し、次いで、１０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心濾過器フィルターを備えた遠心濃縮を使用して、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。抗体を適切な濃度に希釈し、ＴＣＥＰを指示最終濃度で添加し、１時間にわたって室温で穏やかに混合した。製造者プロトコルに従って緩衝液としてＤＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、４０ｋＤ ＭＷＣＯ）を用いる５または１０ｍＬ Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラムを使用して脱塩することにより、ＴＣＥＰを除去した。製造者プロトコルに従ってチオール蛍光定量化キット（Ａｂｃａｍ）を使用して、サンプルを遊離チオール含分について分析した。セクション１．３．３において記載するとおり、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行って、ジスルフィド結合切断の規模及び位置を決定した。場合によっては、ＤＰＢＳ中で希釈することにより、脱塩ＭＡｂを１〜２ｍｇ／ｍＬにし、ビオチン化に掛けて、コンジュゲート可能性及び薬物−対−抗体（ＤＡＲ）比を決定した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍＭマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を抗体（ｍＡｂ）に、１０：１のモル比で添加し、穏やかに撹拌しながら室温で４時間にわたってインキュベートした。コンジュゲーションの後に、未反応の化合物を、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して脱塩することにより除去した。次いで、セクション１．３．４に詳述するとおり、サンプルをＬＣ−ＭＳにより分析して、ＤＡＲを決定した。
１．２．２ 細胞毒素コンジュゲーション
部分的に還元された抗体を、０．５×ＤＰＢＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中で２．５ｍｇ／ｍＬにし、十分に混合した。次いで、使用する場合には、有機補助溶媒を添加し、十分に混合した。検査した補助溶媒は、プロピレングリコール（最終濃度２０％及び５０％）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０％）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０％）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（２０％）、及びＮ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド（２０％）であった。マレイミド修飾された細胞毒素（ＤＭＳＯ中６ｍＭ保存溶液）を抗体に、１：６（ｍＡｂ：化合物）のモル比で添加し、十分に混合した。コンジュゲーションを、穏やかに混合させながら室温で３．５時間にわたって進行させた。５０％プロピレングリコールを５０％で、最終有機調整剤として選択し、その後のすべてのコンジュゲーション反応において使用した。
１．２．３ 精製
未反応のマレイミド−細胞毒素及びプロピレングリコールを除去するために、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われるクロマトグラフィーで２６／１０ ＨｉＴｒａｐ（登録商標）脱塩カラム（複数可）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、コンジュゲートした抗体を精製した。ＭＯＲＡｂ−００３−ｍａｌ−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）を含むＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣをＤＰＢＳ中で製剤化した（製剤緩衝液を、ＦＰＬＣクロマトグラフィー中に泳動緩衝液として使用した）。
１．３ 生物物理学的特徴づけ
１．３．１ ＢＣＡアッセイ
調製したビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（２００μＬ）を、２５μＬの連続希釈したＡＤＣまたはウシガンマグロブリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）２ｍｇ／ｍＬ標準に添加し、サンプルを十分に混合した。サンプルを３７℃で２０分間にわたってインキュベートした。プレートを５９５ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。データを、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ（ｖｅｒ３．２）を４−パラメーターフィッティングモデルで使用して解析した。
１．３．２ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
抗体凝集を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００を使用するサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。ｍＡｂを、ＤＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。抗体（２０μＬ）をＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷガードカラム（４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、４μｍ空孔サイズ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、続いて、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍ、４μｍ空孔サイズ）上に注入し、カラムから、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５％ＮａＮ３を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で、０．３ｍＬ／分の流速で２０分間にわたって溶離した。すべてのデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して解析した。凝集パーセントを［ＰＡ凝集／ＰＡ合計］×１００として計算した［式中、ＰＡ＝積算ピーク面積］。
１．３．３ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
タンパク質サンプル（０．１〜１０μｇ）を、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）サンプル緩衝液で１倍にした。非還元サンプルでは、インキュベーションを電気泳動の前に、室温で１０分間にわたって行った。還元サンプルでは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２０ｍＭの最終濃度まで添加し、サンプルを１０分間にわたって９５℃に加熱し、電気泳動の前に、氷上に置いた。サンプルを、１０−、１２−、または１５−ウェルのビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に、泳動緩衝液としての１倍ＭＯＰＳまたは１倍ＭＥＳと共に装填した。電気泳動を、１８５Ｖ（定電圧）で１時間にわたって行った。ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色液（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、水中で脱染した。ドキュメンテーションを、６００ｎｍオレンジ色フィルターを使用してＵｌｔｒａＬｕｍゲルドキュメンテーションシステムで行った。
１．３．４ 薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）のＵＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ分析
ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して、ＡＤＣを脱グリコシル化した。Ｇ７緩衝液（１０μＬ）及びＰＮＧａｓｅ Ｆ（２μＬ）をｍＡｂ（９０μＬ、ＤＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）に添加した。反応物をＤｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波（ＣＥＭ）中で２サイクルにわたってインキュベートした：（１）マイクロ波出力１０Ｗ、３７℃、１０分、続いて、５分休止；（２）マイクロ波出力２Ｗ、３７℃、１０分。ＤＴＴを２０ｍＭの最終濃度まで添加し、続いて、６０℃で３分間にわたってインキュベートすることにより、サンプルの一部を還元した。次いで、サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）及び四重極飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ）Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計を使用して分析した。サンプル（それぞれ０．５〜２μｇ）をＭａｓｓＰｒｅｐ（商標）マイクロ脱塩カラム上に６５℃で注入し、カラムから、移動相Ａ９５％中での５分の平衡、１０分の勾配（Ｂ５〜９０％）、及び移動相Ａ９５％中での１０分の再平衡化で、０．０５ｍＬ／分で溶離した。移動相Ａは、水中０．１％ギ酸であった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸であった。Ｑ−Ｔｏｆ質量分析計を陽イオン、Ｖモードで、５００〜４０００ｍ／ｚの範囲での検出で操作した。ソースパラメーターは、次のとおりであった：キャピラリー電圧、２．２５ｋＶ（インタクトな抗体）〜２．５０ｋＶ（還元抗体）；サンプリングコーン電圧、６５．０Ｖ（インタクトな抗体）または５０．０Ｖ（還元抗体）；ソース温度、１００℃；脱溶媒温度、２５０℃；脱溶媒ガスフロー、５５０Ｌ／時。タンパク質ピークを、ＭａｓｓＬｙｎｘ（登録商標）ＭａｘＥｎｔ１関数を使用してデコンボリュートした。コンジュゲートしなかった、単一コンジュゲートした、及び多重コンジュゲートした重鎖及び軽鎖質量それぞれの相対強度を合計して、下式を使用して全体ＤＡＲを計算した：
２［［ＩＬＣ＋１＋２（ＩＬＣ＋２）＋３（ＩＬＣ＋３）＋…ｎ（ＩＬＣ＋ｎ）］／ΣＩＬＣｔｏｔ］＋２［［ＩＨＣ＋１＋２（ＩＨＣ＋２）＋３（ＩＨＣ＋３）＋…ｎ（ＩＨＣ＋ｎ）］／ΣＩＨＣｔｏｔ］
［式中、ＩＬＣ＋１は、１つの細胞毒素とコンジュゲートした軽鎖の質量強度であり、ＩＬＣ＋２は、２つの細胞毒素とコンジュゲートした軽鎖の質量強度である、など。ＩＨＣは、対応するコンジュゲートした重鎖からの強度であり、ΣＩＬＣｔｏｔ及びΣＩＨＣｔｏｔは、それぞれ、すべてのコンジュゲートしなかった、及びコンジュゲートした軽鎖及び重鎖の合計強度である。
１．３．５ ＨＩＣ−ＨＰＬＣ ＤＡＲ分析
ＵＰＬＣ／エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＭＳ分析によるＤＡＲ分析に加えて、ＭＯＲＡｂ−００３−ｖｃｐ−エリブリンＤＡＲ及びＭＯＲＡｂ−００３−０２８５ＤＡＲも、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して分析した。サンプルをＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ、内径７．５ｍｍ×７．５ｃｍ、空孔サイズ１０μＭ上に注入し、カラムから、移動相Ａ１００％中での３分間の平衡化、１５分の勾配（０〜１００％Ｂ）、１００％Ｂ中での５分の保持、１００％Ａへの１分での変化、及び移動相Ａ１００％中での５分の再平衡化で、０．７ｍＬ／分で溶離した。移動相Ａは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０であった。移動相Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノール、ｐＨ７．０であった。検出を２８０ｎｍで行った（基準３２０ｎｍ）。ＤＡＲを下式により決定した：
［ＡＵＣ＋１＋２（ＡＵＣ＋２）＋３（ＡＵＣ＋３）＋…ｎ（ＡＵＣ＋ｎ）］／ΣＡＵＣｔｏｔ］
［式中、ＡＵＣ＋１は、１つの細胞毒素とコンジュゲートしたＡＤＣに対応するｍＡｂピークでの曲線下面積であり、ＡＵＣ＋２は、２つの細胞毒素とコンジュゲートしたＡＤＣに対応するｍＡｂピークでの曲線下面積である、など。ΣＡＵＣｔｏｔは、すべてのピークでの合計曲線下面積である］。
１．４ 細胞傷害性分析
１．４．１ クリスタルバイオレットアッセイ
ＩＧＲＯＶ１（ＦＲｈｉ）及びＳＪＳＡ−１（ＦＲｎｅｇ）細胞を継代培養し、１０，０００細胞／ウェルで、完全成長培地中で９６ウェル組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、終夜（１６時間）インキュベートした。典型的には、試験試薬を１：４で、２ｍＬディープウェル希釈プレート内で、１μＭから開始して連続希釈した（合計で１０の希釈）。希釈サンプル１００μＬを細胞プレートに添加した（５００ｎＭの試験試料濃度から開始）。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに４８時間にわたってインキュベートした。培地を廃棄し、プレートをＤＰＢＳ２００μＬで１回洗浄し、０．２％クリスタルバイオレット溶液５０μＬで、室温で１５分間にわたって染色し、次いで、水道水で充分に洗浄した。プレートを風乾させ、クリスタルバイオレットを１％ＳＤＳ溶液２００μＬで溶解させた。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を使用して解析した。アッセイを、１ウェル当たり１，０００細胞の播種密度を使用して行い、化合物曝露は、合計５日間にわたった。短期間曝露が望ましい場合には、細胞傷害性薬物を含有する培地を４時間後に除去し、５日間のインキュベーションの前に新たな増殖培地に置き換えた。ＯＶＣＡＲ３、ＣａＯＶ３、及びＮＣＩ−Ｈ２１１０では、細胞を３，０００細胞／ウェルで播種し、ＡＤＣと共に５日間にわたってインキュベートした。競合実験のために、細胞と共にインキュベートする前に、用量設定したＡＤＣを、２μＭ（最終）の非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３と共に予めインキュベートした。
１．４．２ バイスタンダー死滅アッセイ
試験開始の前日に、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ（商標）Ｇｒｅｅｎ（ＮＬＧ）ＩＧＲＯＶ１細胞を５，０００細胞／ウェルで、９６ウェル丸底プレートに播種し、続いて、１，０００ｒｐｍで３分間にわたって室温で遠心して、細胞ペレットの形成を確実にした。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（登録商標）（ＥｓｓｅｎＢｉｏ ｓｃｉｅｎｃｅ）の容器内に入れ、３７℃／５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。プログラムを、細胞増殖の画像を収集し、かつ核が緑色に染色された細胞及び核が赤色に染色された細胞の合計数、さらには２時間ごとの細胞のフェーズ集密度を決定するように設定した。実験当日に、ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣまたは遊離薬物を完全ＲＰＭＩ培地中で希釈し、連続希釈し、４００ｎＭで開始した。細胞毒素溶液５０μＬを、ＮＬＧ−ＩＧＲＯＶ１細胞に添加し、３０分間にわたってインキュベートした。インキュベーション期間中に、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ（商標）Ｒｅｄ（ＮＬＲ）ＨＬ−６０（ＦＲｎｅｇ）細胞を新鮮な培地で、２×１０５、１×１０５または５×１０４細胞／ｍＬに希釈した。ＮＬＲ−ＨＬ６０細胞懸濁液または培地のみ５０μＬをＮＬＧ−ＩＧＲＯＶ１ウェルに添加し、続いて、１，０００ｒｐｍで３分間にわたって室温で遠心して、細胞ペレットの再形成を確実にした。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ ｓｃｉｅｎｃｅ）の容器に戻し入れ、３７℃／５％ＣＯ２で最高５日間にわたってインキュベートした。ＮＬＧ−ＩＧＲＯＶ１の相対細胞増殖を、緑色の細胞数を使用して、ＡＤＣがサンプルに添加されなかった、または遊離薬物のみが添加された場合と比較することにより決定した。赤色の細胞数を決定したことを除いて、ＨＬ６０の相対細胞増殖は同様に行われた。ＮＬＧ−ＩＧＲＯＶ１及びＮＬＲ−ＨＬ−６０の両方でのＩＣ５０値の決定を、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して決定した。
１．４．３ 血清安定性アッセイ
ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣ２０μＬを、ＤＰＢＳ、正常にプールされたヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｌｏｔ ＢＲＨ５５２９１１）、または正常にプールされたマウス血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｌｏｔ ＭＳＥ１５２５９１）８０μＬと十分に混合し、３７℃で０、４、２４、及び４８時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後に、サンプルを凍結させ、細胞傷害性及び結合アッセイでの評価まで、−２０℃で貯蔵した。細胞傷害性分析のために、セクション１．４．１で詳述するとおり、サンプルをＩＧＲＯＶ１及びＳＪＳＡ−１細胞で評価した。結合評価のために、サンプルを、溶液ベースのＭＳＤ ＥＣＬアッセイを使用して評価した。サンプルをビオチン化葉酸受容体アルファ及びスルホタグ抗ＭＯＲＡｂ−００３と共にインキュベートし、その後、ストレプトアビジンプレート上で捕捉し、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００で電気化学ルミネセンスを使用して検出した。
２． 結果
２．１ ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣの調製
ＭＯＲＡｂ−００３とコンジュゲートさせるためにリンカー及び細胞毒素の最良の組合せを選択するために、３つの方法を使用してＡＤＣを調製した。図１に示されているコンジュゲーション戦略に従って、非対合システインを、限定モル当量の非チオール還元剤ＴＣＥＰでの部分的な還元により生成する。この戦略は、軽鎖及び重鎖（Ｈ−Ｌ対合１つ当たり１対）ならびにヒンジ領域の２つの重鎖（ヒトＩｇＧ１の場合には、Ｈ−Ｈ対合１つ当たり２対）を結合する鎖間ジスルフィド結合を優先的に還元させる一方で、鎖内ジスルフィド結合はインタクトなままにする。
ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣを調製するための第二のコンジュゲーション戦略は、還元ジスルフィド架橋ケミストリーを利用した。還元ジスルフィド架橋ケミストリーは、部分的還元プロセス中に放出されたシステイン残基の遊離チオールを再架橋し、これは、ジスルフィド結合の役割を模倣し、したがって、ＡＤＣの安定性及び機能を維持する。
ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣを調製するための第三のコンジュゲーション戦略は、限定的リシン利用を用いた。限定的リシン利用は、典型的なヒトＩｇＧ分子上で利用可能な推定７０＋の溶媒曝露リシンのうちの非常に限定的な数のコンジュゲーションをもたらし、システイン修飾を伴う戦略に対して低い均一性を有するＡＤＣ生成物の混合物を潜在的にもたらし得る。
２．１．１ ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣのためのＶＣＰ−エリブリンの調製
エリブリン（１）（１０ｍｇ、１４μｍｏｌ）（図２）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍＬ）に溶解させ、十分に混合した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ塩基またはｉＰｒ２ＮＥｔ）（３．６μＬ、２１μｍｏｌ）及びＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−パラ−アミノベンジル−パラ−ニトロフェノール（Ｆｍｏｃ−ＶＣＰ−ＰＮＰ）（２）（１６ｍｇ、２１μｍｏｌ、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＶＣ１００３）を添加した。反応混合物を室温で４〜１６時間にわたって撹拌し、反応が完了するまで、ニンヒドリン試験キット（Ａｎａｓｐｅｃ、ｃａｔ＃２５２４１）を使用して監視した。次いで、ジエチルアミン（Ｅｔ２ＮＨ）（０．０１４ｍＬ、０．１４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、２時間にわたって１８〜２５℃で撹拌して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。反応を、ニンヒドリン試験キットを使用して監視した。完了したら、溶媒を真空下で蒸発させて、粗製のＶＣＰ−エリブリン（３）（１６ｍｇ）を得、ＺＯＢＡＸ ＳＢ−Ｃ１８カラム（空孔サイズ５μｍ、９．４×１５０ｍｍ）をＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５ ＨＰＬＣシステム上で、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮの移動相で、１５〜７０％Ｂの勾配により使用して精製した。ＶＣＰ−エリブリン（３）（１６ｍｇ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。ヒューニッヒ塩基（７．２μＬ、４１μｍｏｌ）及びマレイミド−ＰＥＧ２−ＮＨＳ（４）（９．７ｍｇ、２７μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８〜２５℃で３時間にわたって撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ）により、１５〜７０％Ｂの勾配により精製した。溶媒を凍結乾燥により除去して、ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）−エリブリン（ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−ＶＣＰ−エリブリン）（５）を得た。
２．１．２ 還元条件の最適化
限定モル当量の非チオール還元剤トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いる部分的還元により非対合システインを生成することにより、ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣを調製した。当初の調査をＭＯＲＡｂ−００３で行い、それにより、抗体分子１個当たり平均で４つのコンジュゲーション可能部位を生成することを目的として、抗体濃度、ＴＣＥＰ濃度、及びインキュベーション時間を変動させた。遊離チオール部位の数は、蛍光測定チオール定量化アッセイを使用して決定した。この分析の結果は表１２に示す。１０分、３０分、６０分、または１２０分のインキュベーション後のＨ−Ｈ及びＨ−Ｌ結合の切断の規模も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）により分析した。この分析のために、非還元及び還元サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填し、電気泳動を１８５Ｖで１時間にわたって行った。図３では、レーンＭは、タンパク質標準に対応する。レーン１は、未処理の非還元ＭＯＲＡｂ−００３に対応する。レーン２は、７０．６μＭ ＴＣＥＰ中で還元させたＭＯＲＡｂ−００３（５．３ｍｇ／ｍＬ）に対応する。レーン３は、１４１．２μＭ ＴＣＥＰでのＭＯＲＡｂ−００３（５．３ｍｇ／ｍＬ還元）に対応する。レーン４は、２０μＭ ＴＣＥＰ中で還元させたＭＯＲＡｂ−００３（１．５ｍｇ／ｍＬ）に対応する。レーン５は、４０μＭ ＴＣＥＰ中で還元させたＭＯＲＡｂ−００３（１．５ｍｇ／ｍＬ）に対応する。各バンドのアイデンティティが右下のゲルに示されている。「Ｈ」は重鎖を示し、「Ｌ」は軽鎖を示す。
Figure 0006870051
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析及びチオール含分は、分子内ジスルフィドの限定的な還元が存在するようであり（遊離チオール含分により決定されるとおり）、かつ非常に僅かな非還元ｍＡｂが残留しているので（非還元ｍＡｂは、調製したＡＤＣを使用するインビトロ及びインビボ試験において競合阻害薬として作用するであろう）、ｍＡｂに対してＴＣＥＰの４倍モル比での、ｍＡｂ５．３ｍｇ／ｍＬの６０分のインキュベーションが合理的な出発点を示すことを示唆した。さらなる試験をＭＯＲＡｂ−００３で、５．０ｍｇ／ｍＬの濃度から出発して行って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して、ｍＡｂに対するＴＣＥＰのこの最適化モル比を確認した（図４）。図４では、レーン１は、タンパク質標準に対応する。レーン２は、未処理の非還元ＭＯＲＡｂ−００３に対応する。レーン３は、１：１のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応する。レーン４は、１：２のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応する。レーン５は、１：３のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応する。レーン６は、１：４のＭＯＲＡｂ−００３：ＴＣＥＰの比で処理されたＭＯＲＡｂ−００３に対応する。ＡＤＣ調製のための細胞毒素のコンジュゲーションをシミュレートするために、還元及びＴＣＥＰ除去の後に、マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを使用するコンジュゲーションも行った。ＤＡＲ分析を、ＬＣ−ＭＳを使用して行った。これらの試験の結果を表１３に示す。
Figure 0006870051
ビオチンコンジュゲーションの後に、遊離チオール分析は、遊離チオールが、ＭＯＲＡｂ−００３−ビオチン中に存在しないことを示した。これは、ジスルフィド結合の還元後に、コンジュゲーションが典型的には、生成した両方のチオールで起こること、及びいずれの非コンジュゲート還元ジスルフィドも、再酸化されてジスルフィド結合を再形成することを示した。ＡＤＣ生成のための還元で選択された最終条件は、５．０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度、１１０μＭのＴＣＥＰ濃度、及び６０分のインキュベーション時間であった。これは、コンジュゲーション後に４のＤＡＲを有するｍＡｂをもたらす。
２．１．３ ＡＤＣコンジュゲーションの最適化
ＡＤＣ調製のために使用される第１の細胞毒素が、疎水性化合物であるクリプトフィシンであったので、当初のコンジュゲーション最適化実験を、特異的な位置にコンジュゲーションのために利用可能な２つの非対合システイン（軽鎖当たり１つ）を有する「代理」抗ヒトメソテリン抗体で行った。このことは、軽鎖のみを分析すればよいので、質量分析法によるコンジュゲーション効率の分析を大いに促進する。マレイミド−ＬＬ３−クリプトフィシンを代理抗体へとコンジュゲーションする間のプロピレングリコールの用量設定を行い、続いて、ＬＣ−ＭＳにより、軽鎖のコンジュゲーション効率を分析した（表１４）。
Figure 0006870051
５０％プロピレングリコールは、利用可能な部位の完全な占拠をもたらし、使用する最終濃度として選択された。コンジュゲーション後に、ｍＡｂの結合の損失は観察されず（データ図示せず）、これは、プロピレングリコールが、抗体に対して有害作用を有さないことを示した。したがって、選択された最終コンジュゲーション反応条件は、最終的に２．５ｍｇ／ｍＬ ｍＡｂ、０．５倍ＤＰＢＳ中でマレイミド−リンカー−細胞毒素：ｍＡｂの６：１モル比（プロピレングリコール添加後の最終濃度）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％プロピレングリコール、ｐＨ７．２、室温で３．５〜４時間であった。これらの反応で、プロピレングリコールを、マレイミド−リンカー−細胞毒素の添加前に添加する。
２．１．４ ＡＤＣの調製及び生物物理学的特徴づけ
セクション２．１．２に記載した確立された還元及びコンジュゲーション条件を使用して、表１５に列挙されている最初の１０のＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣを調製した。Ｍ−ＭＭＡＥ及びＭ−ＤＭ１を除いて、残りのＡＤＣを、還元ジスルフィド架橋または限定的リシン利用のいずれかにより調製した。Ｍ−ＭＭＡＥ及びＭ−ＤＭ１は、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により調製され、コンジュゲートした形態で投与された。
還元ジスルフィド架橋ケミストリーは、部分的還元プロセス中に生成された遊離チオールを架橋させて、還元されたジスルフィド１つ当たり１つの細胞毒素をもたらす。理論的には、ＤＡＲ＝４の抗体は、Ｈ−Ｌ及びヒンジジスルフィドの両方を再架橋させて、従来のコンジュゲーションアプローチを上回る上昇した安定性及び均一性を有するＡＤＣをもたらすであろう。限定的なリシン利用は、典型的なヒトＩｇＧ分子上で利用可能な推定７０＋溶媒曝露リシンのうちの非常に限定された数のコンジュゲーションをもたらす。この方法を使用して調製したＭＯＲＡｂ−００３コンジュゲートは２．０のＤＡＲをもたらし、これは、Ｈ−Ｌ対当たり１つのみのリシンが利用されたことを示唆している。
すべてのＡＤＣを、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩クロマトグラフィーにより精製して、ＤＰＢＳ中で製剤化した。ＤＡＲ分析をすべての調製したＡＤＣで、ＬＣ−ＭＳにより行い、凝集レベルをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定した。これらのＤＡＲ及び凝集分析の結果を、個々のＡＤＣに次いで表１５に列挙する。
Figure 0006870051
すべてのＡＤＣでのＤＡＲ値は、予め決定された範囲内であった（３から４の間のＤＡＲ）。クリプトフィシンをベースとするＡＤＣでの凝集レベルは、所望よりもかなり高かったが（＞１０％）、エリブリンをベースとする（ＶＣＰ−エリブリン）及びメイタンシンをベースとするマレイミド−リンカー−細胞毒素（ＥＲ−００１１６１３１８、ＥＲ−００１１６１３１９、及びＭ−ＭＭＡＥ）はすべて、許容される凝集レベルを実証した。他の有機補助溶媒の調査を、ＶＣＰ−クリプトフィシンを使用して、ＭＯＲＡｂ−００３に対するコンジュゲーション反応で行った。試験した補助溶媒は、ＤＭＳＯ（１０％）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０％）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（２０％）、及びＮ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド（２０％）であった。これらの補助溶媒を使用してのコンジュゲーション後の凝集レベルはすべて、５０％プロピレングリコールと同等であるか、またはそれよりも高かった。
非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をＡＤＣのサブセットで行った（図５）。これらすべてのＡＤＣでのＤＡＲが４であると決定されたため、これらのＡＤＣは、両方のＨ−Ｌ及び両方のヒンジジスルフィドが再架橋しているはずなので、約１６０ｋＤのインタクトなＩｇＧとして移動するはずであると考えられた。ＡＤＣのこのサブセットは、Ｍ−ＭＭＡＥ（レーン２）、Ｍ−ＤＭ１（レーン３）、Ｍ−００２６（レーン４）、Ｍ−０２６０（レーン５）、Ｍ−０２６７（レーン６）、Ｍ−０２７２（レーン７）、Ｍ−０２８５（レーン８）、Ｍ−２９２（レーン９）、Ｍ−０２７−０３８１（レーン１０）、及びＭ−０３８４（レーン１１）を含んだ（図５）。図５では、レーン１は、タンパク質標準に対応する。
この分析から、還元ジスルフィド架橋ケミストリーＡＤＣ（レーン４〜９、１１）では、インタクトなＡＤＣに加えて、かなりのＨ−Ｌ一価種（８０ｋＤ）が存在することが明らかである。このことは、鎖間ヒンジ架橋に加えて、かなりの鎖内ヒンジジスルフィド架橋が存在することを示している。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、ＡＤＣが単一のインタクトなＩｇＧとして移動することを示しており、鎖内Ｈ−Ｈ架橋を有するＡＤＣでは、重鎖は、最終ＡＤＣにおいて共有結合していないことを示している。
２．２ ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣのインビトロ効力の分析
２．２．１ ＩＧＲＯＶ１及びＳＪＳＡ−１細胞での細胞傷害性
セクション１．４．１に詳述したとおりにクリスタルバイオレットアッセイを使用して、調製したＡＤＣのインビトロ効力を評価した。
すべてのＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣの当初スクリーニングを、ＩＧＲＯＶ１（ＦＲｈｉ（＋＋＋））及びＳＪＳＡ−１（ＦＲｎｅｇ（−））細胞で行った。ＩＧＲＯＶ１細胞は、ヒト卵巣上皮癌由来のものであり、高レベルの葉酸受容体アルファ（ＦＲ）、すなわち、ＭＯＲＡｂ−００３の標的抗原を発現する。ＳＪＳＡ−１細胞は、葉酸受容体アルファについて陰性であるヒト骨肉腫腫瘍細胞系である。選択されたＡＤＣのスクリーニングも、ＣａＯＶ３（ヒト卵巣癌、ＦＲｍｅｄ（＋＋））、ＮＣＩ−Ｈ２１１０（ヒト非小細胞肺癌、ＦＲｍｅｄ（＋＋））、及び／またはＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣癌、ＦＲｍｅｄ（＋＋））細胞で行った。このスクリーニングの結果を表１６に示す。
Figure 0006870051
ＶＣＰ−エリブリンＡＤＣは、ＩＧＲＯＶ１細胞に対して効力があり（５４ｐＭ）、ＳＪＳＡ−１細胞ではほとんど死滅を示さなかった。これらの細胞系では、ＶＣＰ−エリブリンＡＤＣは、同等のＤＡＲ値を有するＡＤＣ、例えば、Ｍ−ＭＭＡＥ及びＭ−ＤＭ１に対して、高い効力及び特異性を実証した。ＶＣＰ−エリブリンＡＤＣはまた、卵巣（ＣａＯＶ３及びＯＶＣＡＲ３）及び非小細胞肺癌（ＮＣ−Ｈ２１１０）由来の追加のＦＲ発現性腫瘍細胞系に対して強力な細胞傷害性を実証した。
ＡＤＣ ＶＣＰ−エリブリン、ＬＬ２−クリプトフィシン、ＬＬ３−クリプトフィシン、ＶＣＰ−クリプトフィシン、ＥＲ−００１１６１３１８、ＥＲ−００１１６１３１９、及びＥＲ−００１１５９２００は、ＣａＯＶ３（ＦＲｍｅｄ（＋＋））細胞において特異的な細胞傷害性（＞２−ｌｏｇの特異性）を示した。これらのＡＤＣの多くが、サブナノモルの効力を示した。クリプトフィシンコンジュゲートはまた、ＩＧＲＯＶ１細胞において高レベルの効力（２３ｐＭ〜８６ｐＭ）を実証し（ただし、ＶＣＰ−クリプトフィシンを除く）、同じく、ＳＪＳＡ−１細胞で測定可能な細胞傷害性を実証した。切断可能なメイタンシンコンジュゲートＥＲ−００１１６１３１８及びＥＲ−００１１６１３１９は、ＩＧＲＯＶ１（０．２６ｎＭ及び０．４９ｎＭ）で、中間の効力を有し、ＳＪＳＡ−１細胞のオフターゲット死滅をほとんど有さなかった。
すべての限定的リシン利用コンジュゲートは、特異性を実証せず、それらをさらに評価することはなかった。デュオスタチン−３（Ｍ−０２８５）、デュオスタチン−５（Ｍ−０１１５）、及びデュオスタチン−１４（Ｍ−２９２及びＭ−００２６）の、還元ジスルフィド架橋技術を使用する切断可能なコンジュゲートはすべて、ＩＧＲＯＶ１細胞系で特異的な細胞傷害性を実証し、ＳＪＳＡ−１細胞系には細胞傷害性をほとんど有さなかった。オーリスタチンの誘導体であるデュオスタチン−３及びデュオスタチン−５コンジュゲートは、メイタンシン誘導体であるデュオスタチン−１４コンジュゲートよりも、効力がわずかに高かった。効力及び特異性は、モノメチルＥに結合しているＶａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ（ＶＣＰ）リンカーを使用する対照Ｍ−ＭＭＡＥコンジュゲートに匹敵した。切断不可能な還元ジスルフィドケミストリーコンジュゲートはすべて、充分な効力または特異性が不足しており、さらに分析されることはなかった。
２．２．２ ヒト葉酸受容体発現性卵巣癌細胞系ＣａＯＶ３での細胞傷害性
選択されたＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣの効力も、ヒト卵巣腫瘍細胞系ＯＶＣＡＲ３及びＣａＯＶ３、さらにはヒトＮＳＣＬＣ細胞系ＮＣＩ−Ｈ２１１０で実証した（表１６）。ＩＧＲＯＶ１細胞で観察された効力とは異なり、ヒト卵巣細胞系ＣａＯＶ３では、クリプトフィシンコンジュゲートは、ＶＣＰ−エリブリンコンジュゲートよりも、測定可能なほど高い効力を実証した。これは、ＩＧＲＯＶ１と比較して、ＣａＯＶ３細胞での葉酸受容体アルファの低い発現レベル、またはエリブリンと比較して、これらの細胞に対するクリプトフィシンの高い効力により得る。メイタンシンをベースとするコンジュゲートＥＲ−００１１６１３１８、ＥＲ−００１１６１３１９、及びＥＲ−００１１５９２００はすべて、ＶＣＰ−エリブリンと同様か、またはそれよりも低い効力を有した。
２．３ ＶＣＰ−エリブリン、ＥＲ−００１１６１３１８、及びＭ−０２８５のバイスタンダー死滅
バイスタンダー死滅活性を評価するために、アッセイを、２つの標識細胞系を使用して構成した。このアッセイでは、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ（商標）Ｇｒｅｅｎで標識されたＩＧＲＯＶ１細胞（ＦＲｈｉ）及びＮｕｃｌｉｇｈｔ（商標）Ｒｅｄで標識されたＨＬ−６０（ＦＲｎｅｇ）を種々の細胞数比で同時培養し、ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣのＶＣＰ−エリブリン、ＥＲ−００１１６１３１８、またはＭ−０２８５の用量設定で処理した。ＶＣＰ−エリブリンは、マレイミド−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ切断可能なリンカーを含む、エリブリンをベースとするＡＤＣであり、ＥＲ−００１１６１３１８は、マレイミド−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ切断可能なリンカーを含む、メイタンシンをベースとするＡＤＣであり、Ｍ−０２８５は、ＰＥＧ−ｐＡＢ切断可能なリンカーを含むデュオスタチンをベースとするＡＤＣである。細胞傷害性を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ（登録商標）セルイメージャーにより監視した。このバイスタンダー細胞傷害性アッセイの結果を、表１７及び図６Ａ〜Ｃにおいて示す。
Figure 0006870051
ＨＬ−６０（ＦＲｎｅｇ）細胞をＩＧＲＯＶ１（ＦＲｈｉ）細胞に対して２：１比で培養した場合、ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリンでの処理は、ＨＬ−６０細胞のみと比較して、ＨＬ−６０細胞の死滅の２−ｌｏｇ増加をもたらした（表１７及び図６Ａ）。これらのデータは、葉酸受容体アルファ（ＦＲ）標的陰性細胞が、ＦＲ標的陽性細胞と同時培養した場合に、ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリンにより、より効果的に死滅されることを示唆しており、これは、本明細書でバイスタンダー死滅と称される。バイスタンダー死滅は、それら単独での、標的陽性細胞の非存在下での、かつそれらとの同時培養とは無関係な標的陰性細胞の死滅と定義されるオフターゲット死滅とは識別される。観察されたバイスタンダー死滅の増加はまた、遊離エリブリンでＨＬ−６０細胞を処理した後に観察される増加とほぼ同一であったが、これは、バイスタンダー作用のための潜在的な機構を示している。何らかの理論に束縛されることは望まないが、ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリンは、ＦＲ陽性ＩＧＲＯＶ１細胞において、またはその付近で切断され得て、それらがまた、アポトーシスを受けて、培養中に遊離エリブリンを放出する。放出された細胞毒素が、ＦＲ陰性ＨＬ−６０細胞を死滅させ得る。
対照的に、ＭＯＲＡｂ００３−ＥＲ−００１１６１３１８では、僅かなシフトのみが観察され（図６Ｂ）、ＭＯＲＡｂ００３−０２８５では、シフトは観察されなかった（図６Ｃ）。ＨＬ−６０：ＩＧＲＯＶ１比を２：１から１：２へと低下させた場合、ＭＯＲＡｂ００３−ＥＲ−００１１６１３１８では、ＨＬ−６０細胞のみに対して、ＨＬ−６０細胞の測定可能な死滅が観察されたが、ＭＯＲＡｂ００３−０２８５では、検出可能ではあるが、バイスタンダー作用はなお低いままであった。これらのデータは、バイスタンダー死滅の点において、評価したＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣは、ＶＣＰ−エリブリン＞ＥＲ−００１１６１３１８＞Ｍ−０２８５と格付けすることができることを示唆する。
２．４ 血清安定性分析
ＡＤＣのインビボでの長い循環半減期、及び細胞毒素が循環中に放出された場合の毒性の可能性を想定すると、ＡＤＣは、血清中での安定性を実証すべきである。ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣのＶＣＰ−エリブリン、ＥＲ−００１１６１３１９、及びＭ−０２８５を、ヒトまたはマウス血清中で、３７℃で、最高４８時間にわたってプレインキュベートし、次いで、ＩＧＲＯＶ１及びＳＪＳＡ−１細胞を用いる細胞傷害性アッセイで評価した。ＥＲ−００１１６１３１９は、ＶＣＰ−エリブリンと同じ切断可能なリンカー、マレイミド−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢを含む、メイタンシンをベースとするＡＤＣである。アッセイ性能に対する何らかの血清作用を修正するために、ＰＢＳ及び血清対照が含まれた。この試験の結果を表１８に示す。
Figure 0006870051
ＶＣＰ−エリブリン及びＭ−０２８５は、いずれの血清中でも少なくとも４８時間にわたって安定していたが、ＥＲ−００１１６１３１９は、４８時間後に、効力のかなりの低下を実証した。これは、メイタンシンへのアジリジノ−カルバマート連結により得るが、これは、以前に文献に記載されたことはない。細胞傷害性の上昇がＳＪＳＡ−１細胞で観察されることはなかったので、放出された化合物の形態が、高度に強力であることはないであろう。
２．５ ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリンでのインビトロ試験
２．５．１ ＤＡＲのＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析及び生成物の異質性
代替方法によりＤＡＲを評価し、生成物の異質性及び非コンジュゲート抗体（競合物質）の含分を検査するために、ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリン及びＭＯＲＡｂ００３−０２８５をＨＩＣ−ＨＰＬＣにより分析した。ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリンは、０、２、４、及び６のＤＡＲ種を有することが示されたが、これは、還元及びコンジュゲーションのために使用された方法と一致する（図７Ａ）。非常に少量のＤＡＲ＝０種が観察された。ＡＵＣ計算に基づく全ＤＡＲは、３．８０であり、これは、ＬＣ−ＭＳにより決定された値と一致した。ＭＯＲＡｂ００３−０２８５は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによると単一ピークとして移動し、これは、単一のＤＡＲ種を示した（図７Ｂ）。これを、ＤＡＲ４．０と指定した。
２．５．２ 競合アッセイによる特異性
競合アッセイ形式を使用して、ＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン細胞傷害性の抗原特異性をＶＣＰ−エリブリンコンジュゲートについて実証した（図８）。この実験では、ＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリンの用量設定（出発濃度１００ｎＭ）を、２μＭ非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３と同時インキュベートした。ＫＢ細胞に対して、ＩＭＧＮ８５３、現在第ＩＩ相治験中のＩｍｍｕｎｏｇｅｎ製の抗ヒト葉酸受容体アルファ−メイタンシンＡＤＣで得られる結果と同様に、非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３は、ＩＧＲＯＶ１細胞での効力において２−ｌｏｇシフトを示した（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ＡＳＣＯ）Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ５５１８）。
２．５．３ ＮＣＩ−Ｈ２１１０ ＮＳＣＬＣ細胞での細胞傷害性
ヒトＮＳＣＬＣ細胞系ＮＣＩ−Ｈ２１１０に対するＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリン及びＭＯＲＡｂ００３−０２８５の両方での細胞傷害性を、クリスタルバイオレットアッセイを使用して行った。このアッセイの結果を表１６に示す。ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリンは、０．７３ｎＭのＩＣ５０を有し、ＭＯＲＡｂ００３−０２８５は、１４ｎＭのＩＣ５０を有した。
２．６ インビボ試験
２．６．１ ＣＤ−１マウス株におけるＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の最大耐量（ＭＴＤ）
ナイーブＣＤ−１マウスに、表１９のスケジュールに従って、２００μＬのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。体重を、投与日の投与前に、投与から２４時間後に、及びその後は週に３回測定した。動物を、試験期間を通じて臨床的健康について観察した。投与から２週間後に、最終体重を測定し、記録した。試験の終了時に安楽死させたマウス（及びもしあるならば、試験中に安楽死させたか、または死亡が発見されたマウス）を、検死のために処理した。臓器を、組織損傷の徴候について検査した。
Figure 0006870051
ＰＢＳ処置対象群と比較して、処置群のいずれでも、有意な体重減少、または処置中の毒性を示す任意の臨床的所見は観察されなかった。個々のマウスの体重を表２０に示し、群平均及びＳＥＭを表２１に示す。各群での体重変化動態（群平均及びＳＥＭ）を図９に示す。ボーラス静脈内投与による最高８０ｍｇ／ｋｇの用量でのＭＯＲＡｂ−２０２は、毒性をもたらさなかった。したがって、ＭＴＤは、８０ｍｇ／ｋｇ超である。
Figure 0006870051
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２．６．２ ＣＤ−１マウスでのエリブリンの最大耐量
ナイーブＣＤ−１マウスに、表２２のスケジュールに従って、エリブリン２００μＬを静脈内注射した。体重を、各投与日での投与前、各投与から２４時間後を含めて、週に３回測定した。動物を、試験期間を通じて（最後の投与後２週間）臨床的健康について観察した。最終体重を測定し、記録した。試験の終了時に安楽死させたマウス（及びもしあるならば、試験中に安楽死させたか、または死亡が発見されたマウス）を、検死のために処理した。臓器を、組織損傷の徴候について検査した。
Figure 0006870051
ｑ４ｄ×３投与計画（４日毎に１回で合計３回の投与）を使用して最高１．６ｍｇ／ｋｇの用量でエリブリンを投与された動物では、毒性を示す有意な体重減少または臨床的所見は観察されなかった。同じスケジュールでの３．２ｍｇ／ｋｇの投与は、２回目の投与後に３匹のマウスすべてで、起毛を誘発した。ＰＢＳ処置対象と比較して、重度の体重減少（２回目の投与後に１匹のマウス＃５５２で２３％の減少；３回目の投与後に残りの＃５５１及び＃５５２で１７％及び８％）を観察した。検死中に、マウスの臓器において、肉眼的な変化は観察されなかった。個々のマウスの体重を表２３に示し、群平均及びＳＥＭを表２４に示す。各群での体重変化動態（群平均及びＳＥＭ）を図１０に示す。
ｑ４ｄ×３投与計画を使用する最高１．６ｍｇ／ｋｇの用量のエリブリンは、毒性をもたらさず、３．２ｍｇ／ｋｇは、重篤な体重減少を誘発した。したがって、エリブリンのＭＴＤは、この試験では、１．６ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄ×３である。
Figure 0006870051
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２．６．３ ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおけるｈＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ２１１０モデルでのＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）の最小有効用量の評価
ヒトＮＳＣＬＣ、ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞、継代４７を、３０匹のＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（雌、５〜６週齢、体重２０グラム）に皮下移植した。移植から１４日後に、マウスを５つの群に無作為化した。処置日（０日）での各群の平均腫瘍体積は、１５４〜１７５ｍｍ３（表２７）の範囲であった。試験設計（表２５）に従って、登録されたマウスを、１、２．５、もしくは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）（Ｌｏｔ＃ＮＢ２９００−８７Ｅ １０／０７／１５）で、対照として５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３−０２８５（Ｌｏｔ＃０４２−１５０−００２）で、またはＰＢＳで処置した。群内のいずれかの動物の腫瘍体積が＞２０００ｍｍ３になったときに、各群を試験から排除した。最後の群を６１日目に終了させた。
Figure 0006870051
個々のマウスの腫瘍体積を表２６に示し、群平均及びＳＥＭを表２７に示す。各群での腫瘍増殖動態（群平均及び平均の標準誤差、ＳＥＭ）を図１１に示し、個々のマウスにおける腫瘍体積、さらには群平均及びＳＥＭを図１２に示す。１７日目（初めて、＞２０００ｍｍ３の腫瘍体積が観察されたとき）の腫瘍体積に基づき、ＭＯＲＡｂ−２０２は、１ｍｇ／ｋｇで４７％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）（生理食塩水に対してｐ＝０．００２）、２．５ｍｇ／ｋｇで９６％のＴＧＩ（生理食塩水に対してｐ＜０．０００１）をもたらした。しかしながら、退縮した腫瘍が、処置の終了から１〜２週後に再増殖した。５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２で処置されたマウスでは、腫瘍は検出されなかった。これらのマウスは、単回投与処置後に６０日超にわたって腫瘍を含有しないままであった。ＭＯＲＡｂ−００３−０２８５は、５ｍｇ／ｋｇで８９．７％のＴＧＩをもたらした（生理食塩水に対してｐ＜０．０００１）。
個々のマウスの体重を表２８に示し、群平均及びＳＥＭを表２９に示す。各群での体重変化動態（群平均及びＳＥＭ）を図１３に示す。
処置群のいずれにおいても、対照と比較して、有意な体重減少は観察されなかった。
ＭＯＲＡｂ−２０２は、ＮＣＩ−Ｈ２１１０腫瘍増殖に対して有意な効果を示した。腫瘍退縮が２．５ｍｇ／ｋｇでのボーラス処置により、９４％のＴＧＩ（ＰＢＳに対して）で達成された。したがって、ＭＯＲＡｂ−２０２の最小有効用量は、このモデルで試験された２．５ｍｇ／ｋｇである。完全腫瘍根絶が５ｍｇ／ｋｇの単回投与により達成された。６０日超にわたって、腫瘍増殖は観察されなかった。
Figure 0006870051
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Figure 0006870051
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２．６．４ ＣＢ１７−ＳＣＩＤマウスにおけるｈＮＳＣＬＣ ＮＣＩ−Ｈ２１１０モデルでのエリブリンの最小有効用量の評価
ヒトＮＳＣＬＣ、Ｈ２１１０細胞、継代４６を、３０匹のＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（雌、５〜６週齢、体重２０グラム）に皮下移植した。移植から１１日後に、マウスを５つの群に無作為化した。腫瘍体積が平均から最も偏差している５匹の動物を排除した。処置日（０日）での各群での平均腫瘍体積は、８７．６〜８９．４ｍｍ３の範囲であった（表３２）。試験設計（表３０）に従って、登録されたマウスを、０．０５、０．２、０．８、または１．６ｍｇ／ｋｇのエリブリン（Ｌｏｔ＃Ｎ１２０１１９３）で、またはＰＢＳで処置した。群内で＞２０００ｍｍ３の腫瘍体積が初めて観察されたときに、それぞれ、各群を終了させた。試験を３８日目に終了させた（最後の投与後３０日間）。
Figure 0006870051
個々のマウスの腫瘍体積を表３１に示し、群平均及びＳＥＭを表３２に示す。各群での腫瘍増殖動態（群平均及びＳＥＭ）を図１４に示し、個々のマウスにおける腫瘍体積、さらには２４日目（ＰＢＳ処置マウスで＞２０００ｍｍ３の腫瘍体積が観察されたとき）での群平均及びＳＥＭを図１５に示す。エリブリンは、０．０５ｍｇ／ｋｇで５０．５％のＴＧＩ（腫瘍退縮は観察されなかった）（生理食塩水に対してｐ＝０．００２６）；０．２、０．８、または１．６ｍｇ／ｋｇで約９９％のＴＧＩ（ｐ値は、生理食塩水と比較した場合に、３つの群すべてで＜０．０００１であった）をもたらした。腫瘍退縮を誘発する最小有効用量は、０．２ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、これらのマウスにおける退縮腫瘍の大部分（０．２ｍｇ／ｋｇ群で３／５、０．８ｍｇ／ｋｇ群で４／５、及び１．６ｍｇ／ｋｇ群で２／５）は再増殖し、試験期間（最後の投与後３０日間）を通じて測定可能なままであった。
個々のマウスの体重を表３３に示し、群平均及びＳＥＭを表３４に示す。各群での体重変化動態（群平均及びＳＥＭ）を図１６に示す。
生理食塩水処置対照群と比較して、処置群のいずれにおいても、有意な体重減少は観察されなかった。処置中の毒性を示す臨床所見は観察されなかった。
ｑ４ｄ×３で静脈内投与された０．２ｍｇ／ｋｇ以上のエリブリンは、Ｈ２１１０腫瘍増殖に対して有意な効果を示した。腫瘍退縮が達成された。より低い用量を投与した場合には（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、腫瘍退縮は達成されなかった。したがって、この試験で試験された最小有効用量は、０．２ｍｇ／ｋｇである。
Figure 0006870051
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実施例２
１．物質及び方法
ＭＯＲＡｂ００３−ＶＣＰ−エリブリン（ＭＯＲＡｂ−２０２）を、ＭＯＲＡｂ−００３（ヒト化抗ヒト葉酸受容体アルファ）を実施例３のセクション１．１に記載のＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１５９５６９）化合物にコンジュゲートすることにより合成した。コンジュゲーション方法は、実施例４のセクション１．４．１に記載する。
１．１ 腫瘍モデル
ＭＯＲＡｂ−２０２の追加のインビトロ評価で使用するヒト腫瘍細胞系には、ＩＧＲＯＶ１（ヒト卵巣癌、ＦＲｈｉ（＋＋＋））、ＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣癌、ＦＲｍｅｄ（＋＋））、ＮＣＩ−Ｈ２１１０（ヒト非小細胞肺癌、ＦＲｍｅｄ（＋＋））、Ａ４３１−Ａ３（ヒトメソテリンを安定的に遺伝子導入されたＡ４３１親細胞系、ＦＲｌｏ（＋／−））、ＳＪＳＡ−１（ヒト骨肉腫、ＦＲｎｅｇ（−））、及びＨＬ−６０（ヒト白血病、ＦＲｎｅｇ（−））が含まれる。これらの細胞系のすべてを、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から直接得た。インビトロ試験のために、非小細胞肺癌、三重陰性乳癌、及び子宮内膜癌患者に由来する異種移植片マウスモデルを樹立し、それぞれＯｎｃｏｔｅｓｔ ＧｍｂＨ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ（Ｄｉｊｏｎ、フランス）、及びＥＰＯ Ｂｅｒｌｉｎ−Ｂｕｃｈ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）で維持した。
１．２ インビトロ細胞傷害性分析
１．２．１ クリスタルバイオレットアッセイ
ＩＧＲＯＶ１（ＦＲｈｉ（＋＋＋））、Ａ４３１−Ａ３（ＦＲｌｏ（＋／−））、及びＳＪＳＡ−１（ＦＲｎｅｇ（−））細胞を継代培養し、１０，０００細胞／ウェルで、完全増殖培地中で、９６ウェル組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、終夜（１６時間）インキュベートした。典型的には、試験試薬を１：４で、２ｍＬディープウェル希釈プレート内で、１μＭから開始して連続希釈した（合計で１０の希釈）。希釈サンプル１００μＬを細胞プレートに添加した（１００ｎＭの試験試料濃度から開始）。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに４８時間にわたってインキュベートした。培地を廃棄し、プレートをＤＰＢＳ２００μＬで１回洗浄し、０．２％クリスタルバイオレット溶液５０μＬで、室温で１５分間にわたって染色し、次いで、水道水で充分に洗浄した。プレートを風乾させ、クリスタルバイオレットを１％ＳＤＳ溶液２００μＬで溶解させた。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を使用して解析した。ＯＶＣＡＲ３（ＦＲｍｅｄ（＋＋））及びＮＣＩ−Ｈ２１１０（ＦＲｍｅｄ（＋＋））では、細胞を３，０００細胞／ウェルで播種し、ＭＯＲＡｂ−２０２と共に５日間にわたってインキュベートした。
１．３ インビボ試験
１．３．１ ＮＣＩ−Ｈ２１１０異種移植片モデル
動物の準備：ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（雌、６週齢）を、換気ケージ１つ当たりマウス５匹で飼育した。滅菌フードペレット及び水用ボトルを、動物は任意に利用可能であった。動物を、腫瘍移植の前に５〜７日間にわたって順応させた。
細胞培養：ヒトＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞を凍結保存品（ＮＢ２８１３−６５）から解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％ＣＯ２中で、３７℃で培養した。２継代の後に、約７０％の集密度に達したら、細胞を、細胞分離液を使用することにより採取し、血清非含有培地で２回洗浄し、カウントした。
腫瘍移植：血清非含有培地中の細胞懸濁液を氷冷マトリゲルと１：１（ｖ：ｖ）で、１．０×１０８細胞／ｍＬの最終濃度まで混合した。各マウスに、１．０×１０７細胞／マウスで混合物１００μＬを皮下注射した。２７Ｇ針を、すべての注射で使用した。マウスを臨床的健康について監視し、腫瘍を、デジタルキャリパーにより、移植後３日目に開始して週に３回測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、式：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６を使用して計算した。腫瘍が約１００ｍｍ３（＞７０〜約１３０ｍｍ３の平均）に達したときに、動物を１群当たり４〜５匹に無作為化した。腫瘍体積が平均から最も偏差している５匹の動物を排除した。
試験設計：登録された実験マウスに、無作為化の日に、試験設計（表３５）に従って、２００μＬのビヒクルまたは１．０、２．５、及び５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。体重を投与の前及び試験中に週に２回測定した。試験の終了時に、最終体重を測定し、記録した。個々の腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたときに、動物を安楽死させた。最大許容腫瘍体積に達する前の早期終了基準には、（１）腫瘍の５０％（ｖ：ｖ）を越える腫瘍潰瘍；（２）麻痺；（３）＞２０％の体重減少；及び（４）群内の動物の５０％が終了に該当が含まれた。安楽死させたまたは、試験中に死亡が発見されたいずれのマウスも、上記の終了手順に従って処理した。
Figure 0006870051
１．３．２ 患者由来異種移植片（ＰＤｘ）モデル
１．３．２．１ 非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＰＤｘモデル：ＬＸＦＡ−７３７（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ）
腫瘍移植：ＮＳＣＬＣ腫瘍断片を、ヌードマウスにおいて連続継代したＬＸＦＡ−７３７腫瘍異種移植片から得た。ドナーマウスから除去した後に、腫瘍を断片（３〜４ｍｍ辺長）に切断し、１０％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に入れた。レシピエント動物に、イソフルランの吸入により麻酔を掛け、側腹部で皮下に、片側性または両側性で腫瘍移植片を与えた。腫瘍異種移植片を、＜６５％の生着率で、マウス１匹当たり１または２つの腫瘍で移植した。両側で生着した場合には、これらの腫瘍の一方を、無作為化の前に外植した。固体腫瘍増殖が動物の十分な匹数で検出可能になるまで、動物及び腫瘍移植片を毎日監視した。無作為化で、増殖腫瘍の体積を決定した。約１００〜１２０ｍｍ３の比較可能な中央及び平均群腫瘍体積を目的として、無作為化基準を満たす動物（すなわち、５０〜２５０ｍｍ３、好ましくは８０〜２００ｍｍ３の腫瘍を担持する）を、１群当たり５〜６匹の動物からなる実験群に分散させた。実験に使用しない動物は安楽死させた。無作為化の日を実験の０日目と呼んだ。
試験設計：無作為化の日に、試験設計（表３６）に従って、登録実験マウスに、ビヒクル、５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。体重を、各投与日の投与前、及び試験中に週に２回測定した。試験の終了時に、終了体重を測定し、記録した。個々の腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えたときに、動物を安楽死させた。
Figure 0006870051
１．３．２．２ 三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤｘモデル：ＯＤ−ＢＲＥ−０６３１（Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ）
腫瘍移植：９匹の雌のＳＷＩＳＳヌードマウスに、患者由来ＴＮＢＣ腫瘍断片を右側腹部で皮下注射した。腫瘍体積が５００〜１０００ｍｍ３に達したときに、腫瘍担持マウスを安楽死させ、腫瘍を外科的に切除した。ガンマ線源（２Ｇｙ、６０Ｃｏ、ＢｉｏＭＥＰ、フランス）を全身照射してから２４〜７２時間後に、腫瘍断片（３０〜５０ｍｇ）を３４匹の雌のＳＷＩＳＳヌードマウスの乳房脂肪体領域に同所移植した。腫瘍が２００〜３００ｍｍ３の平均体積に達したときに、それらの個々の腫瘍体積により、Ｖｉｖｏ Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ、フランス）を使用して、合計３４匹の動物のうちの２４匹を、２つの群（ｎ＝１２動物）に無作為化した。統計試験（分散分析）を、群間の均一性を評価するために行った。無作為化の日を実験の０日目と呼んだ。
試験設計：１日目（無作為化の１日後及び処置の２日前）に、２つの未処置群のそれぞれから３匹のマウスを終了させた。３日目に、試験設計（表３７）に従って、残りの実験マウスに、ビヒクルまたは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。８日目（処置から５日後）に、２つの処置群のそれぞれから３匹のマウスを終了させた。終了直後に、腫瘍組織を収集し、４％中性緩衝ホルマリン中で２４〜４８時間にわたって固定し、次いで、パラフィン（Ｈｉｓｔｏｓｅｃ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に包埋した。パラフィン包埋サンプルをその後の免疫組織化学分析のために、室温で貯蔵した。
Figure 0006870051
免疫組織化学（ＩＨＣ）分析：ＭＯＲＡｂ−２０２占拠及びがん関連線維芽細胞発現の両方を評価するために、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された腫瘍組織のＩＨＣ染色を行った。染色の前に、スライドを脱ろうし、抗原をＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ（商標）ＰＴ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で、８５℃に予め加温されたクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で、次のプログラムを使用して回収した：９７℃に加温する；９７℃で３０分間にわたってインキュベートする；６０℃に冷却する。次いで、スライドを二回蒸留水に、室温で５分間にわたって移した。染色を、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ（商標）Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ３６０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。簡単に述べると、スライドを１倍トリス緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）中で、洗浄１回当たり６分間にわたって２回洗浄した。次いで、組織切片をブロッキング緩衝液（３００μＬ）（１０％ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ Ｎｏ．００５−０００−１２１）、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈）中で１時間にわたってインキュベートし、コンジュゲート抗体（２００μＬ）（表３８）中で１時間にわたってインキュベートし、１倍ＴＢＳＴ中で５回、洗浄１回当たり６分間にわたって洗浄した。スライドを、ＤＡＰＩを用いて、封入剤中で対比染色し、カバーガラスを備えたスライドを３０分間にわたって硬化させた。スライドをＰａｎｏｒａｍｉｃ ＭＩＤＩスキャナ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ）で処理し、ＩＨＣイメージを、Ｈａｌｏソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して解析した。この分析で使用された抗体は、がん関連線維芽細胞の特異的マーカーであるα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、及びＭＯＲＡｂ−２０２の存在を検出することができるヒトＩｇＧを標的とした。
Figure 0006870051
１．３．２．３ 子宮内膜癌ＰＤｘモデル：Ｅｎｄｏ−１２９６１及びＥｎｄｏ−１０５９０（ＥＰＯ Ｂｅｒｌｉｎ）
腫瘍移植：子宮内膜癌腫瘍断片を、連続継代したＥｎｄｏ−１２９６１及びＥｎｄｏ−１０５９０腫瘍異種移植片から得、液体窒素中で保存物として保存した。腫瘍断片を雌の４０匹のＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウスの左側腹部に皮下移植し、腫瘍体積を監視した。１００〜１６０ｍｍ３の腫瘍体積を有するマウスを４つの群（群Ａ〜Ｄ、表３９）の１つに無作為化した。無作為化のためのサテライトマウスが第５の群に含まれた（群Ｅ、表３９）。各群は、８匹の動物からなった。無作為化の日を実験の０日目と呼んだ。
試験設計：無作為化の日に、試験設計（表３９）に従って、登録された実験マウスに、ＰＢＳ、３．２ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇのエリブリン、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。腫瘍増殖を、２つの垂直直径を週に２回測定することにより評価し、腫瘍体積（ＴＶ）、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）及び処置／対照（Ｔ／Ｃ）値を計算した。体重も、毒性についてのパラメーターとして週に２回、群当たりの体重変化の計算及び処置の開始時に対する体重変化（ＢＷＣ）と共に評価した。個々の腫瘍体積が１ｃｍ３を超えたとき、または試験の終了時に、動物を屠殺した。
Figure 0006870051
１．４ 作用機序
１．４．１ ｚＰｒｅｄｉｃｔａにおける三次元（３Ｄ）同時培養系
すべての間葉系幹細胞（ＭＳＣ）含有３Ｄ同時培養実験をｚＰｒｅｄｉｃｔａにおいて、臓器特異的３Ｄ細胞外マトリックス系、例えば、ｒＳｔｏｍａｃｈ（商標）を使用して行った。ｒＳｔｏｍａｃｈ（商標）内の骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を、Ｎｕｃ Ｒｅｄ Ｌｉｇｈｔ ＭＫＮ−７４胃癌細胞系と共に、４連で、４８ウェルフォーマットで１２日間にわたって同時培養した。ＭＫＮ−７４細胞は、細胞アポトーシスを誘発するＭＯＲＡｂ−２０２処置のために十分な葉酸受容体アルファ（ＦＲ）を発現することが、以前に示されていた。培養の前に、ＢＭ−ＭＳＣを、標的抗原発現について、及びＭＳＣ分化のマーカーについて（表４０）フローサイトメトリーにより評価した。
Figure 0006870051
表４１に記載されているとおり、ｒＳｔｏｍａｃｈ（商標）培養物をＭＯＲＡｂ−２０２、非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３抗体、エリブリン、または対照のいずれかで処理した。対照には、未処理及びビヒクル処理（ＰＢＳ及びＤＭＳＯ）培養物が含まれた。ＭＳＣ分化を光学顕微鏡法により監視した。可視の分化が観察されたら、サンプルを染色及びフローサイトメトリー分析のために採取した。
Figure 0006870051
１．４．２ がん関連線維芽細胞に対するＭＯＲＡｂ−２０２の効果の時間経過分析
皮下Ｈ２１１０異種移植片腫瘍担持マウスをセクション１．３．１に記載されているとおりに調製した。腫瘍サンプルを、ビヒクル、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２の投与後に０、３、５、７、及び９日目に採取した。収集した腫瘍サンプルをスライド上で処理し、セクション１．３．２．２に記載されているとおりに、がん関連線維芽細胞の発現をＩＨＣにより分析した。
２． 結果
２．１ インビトロ細胞傷害性分析
２．１．１ ＭＯＲＡｂ−２０２の細胞傷害性
セクション１．２．１に詳述したとおり、クリスタルバイオレットアッセイを使用して、ＭＯＲＡｂ−２０２のインビトロ効力を評価した。スクリーニングを、ＩＧＲＯＶ１（ＦＲｈｉ（＋＋＋））、ＯＶＣＡＲ３（ＦＲｍｅｄ（＋＋））、ＮＣＩ−Ｈ２１１０（ＦＲｍｅｄ（＋＋））、Ａ４３１−Ａ３（ＦＲｌｏ（＋／−））、及びＳＪＳＡ−１（ＦＲｎｅｇ（−））細胞で行った。このスクリーニングの結果を図１７及び表４２に示す。
Figure 0006870051
ＭＯＲＡｂ−２０２は、腫瘍細胞系に対する葉酸受容体アルファ発現依存性細胞傷害性及び低レベルのオフターゲット死滅を示した。ＭＯＲＡｂ−２０２は、ＩＧＲＯＶ１細胞では最高レベルの効力（０．０１ｎＭ）を実証したが、葉酸受容体アルファ陰性ＳＪＳＡ−１細胞では細胞傷害性（＞１００ｎＭ）ほとんど実証しなかった。中間の効力が、ＯＶＣＡＲ３及びＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞（０．１６ｎＭ及び０．７４ｎＭ）で観察された。
２．２ インビボ試験
２．２．１ ＮＣ１−Ｈ２１１０異種移植片モデルにおけるＭＯＲＡｂ−２０２の有効性
皮下Ｈ２１１０腫瘍担持マウスに、ビヒクルまたは１、２．５、及び５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２の単回投与後に、顕著な腫瘍退縮が観察された（図１８及び表４３）。高い葉酸受容体アルファ発現を伴うこの異種移植片モデル及び単回用量投与を使用すると、ＭＯＲＡｂ−２０２での治療ウィンドウは、腫瘍増殖の遅延（疾患の安定）では１ｍｇ／ｋｇであり、及び腫瘍退縮では≧２．５ｍｇ／ｋｇであることが示された。この試験では、２．５ｍｇ／ｋｇの用量でのＭＯＲＡｂ−２０２は、部分応答をもたらし、５ｍｇ／ｋｇの用量でのＭＯＲＡｂ−２０２は、完全応答をもたらした。
Figure 0006870051
２．２．２ ＮＳＣＬＣ ＰＤｘモデル：ＬＸＦＡ−７３７におけるＭＯＲＡｂ−２０２の有効性
皮下ＮＳＣＬＣ ＰＤｘ腫瘍担持マウスに、ビヒクル、５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−００３、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。このモデルにおいて、有意な抗腫瘍活性を実証しなかった非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３抗体（５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与とは対照的に、ＭＯＲＡｂ−２０２（５ｍｇ／ｋｇ）の単回投与は、顕著な腫瘍退縮をもたらした（図１９Ａ）。ＭＯＲＡｂ−２０２で処置された合計６匹のマウスのうちの５匹は、試験の３２日目に腫瘍非含有であると判断され（表４４）、４匹は、７４日（試験の終了）を通じて腫瘍非含有のままであった。加えて、ビヒクル処置対照群と比較すると、処置群では、有意な体重減少は観察されなかったが、これは、処置中に毒性がないことを示していた（図１９Ｂ）。
Figure 0006870051
２．２．３ 子宮内膜癌ＰＤｘモデル：Ｅｎｄｏ−１２９６１及びＥｎｄｏ−１０５９０におけるＭＯＲＡｂ−２０２及びエリブリンの相対有効性
Ｅｎｄｏ−１２９６１及びＥｎｄｏ−１０５９０異種移植片は、高レベルの葉酸受容体アルファを発現する。皮下子宮内膜癌ＰＤｘ腫瘍担持マウスに、ＰＢＳ、３．２ｍｇ／ｋｇもしくは０．１ｍｇ／ｋｇのエリブリン、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。このモデルでのエリブリンの最大耐量（ＭＴＤ）は、３．２ｍｇ／ｋｇであるのに対して、０．１ｍｇ／ｋｇが、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＭＯＲＡｂ−２０２により得られるエリブリンの投薬量と同等である。試験の開始を通じて、ＭＯＲＡｂ−２０２（５ｍｇ／ｋｇ）及びエリブリンのＭＴＤ用量（３．２ｍｇ／ｋｇ）で処置した後に、両方の動物モデルで、有意な抗腫瘍活性が観察された一方で、０．１ｍｇ／ｋｇのエリブリンで処置した後には、有意な抗腫瘍活性は観察されなかった（図２０Ａ及び２０Ｃ）。しかしながら、３．２ｍｇ／ｋｇのエリブリンで処置されたマウスの退縮腫瘍は、試験期間中に再成長し始めた一方で、ＭＯＲＡｂ−２０２で処置されたマウスでは、有意な腫瘍再成長は特記されなかった。この試験で、ＭＯＲＡｂ−２０２は、エリブリンよりもかなりより有効であることが判明した。エリブリン処置はまた、処置後の第１週に、体重に一時的に影響を及ぼした（図２０Ｂ及び２０Ｄ）。対照的に、ＭＯＲＡｂ−２０２で処理された動物では、体重減少は観察されなかった。
２．３ ＭＯＲＡｂ−２０２の作用機序
２．３．１ ＴＮＢＣ ＰＤｘモデル：ＯＤ−ＢＲＥ−０６３１におけるＭＯＲＡｂ−２０２のＩＨＣ及び有効性
皮下ＴＮＢＣ ＰＤｘ腫瘍担持マウスに、ビヒクルまたは５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２を静脈内注射した。腫瘍組織を処置前（１日目）及び処置後（８日目）に各群のマウスから収集した。収集した腫瘍組織のＩＨＣ分析は、ＭＯＲＡｂ−２０２が、単回投与（５ｍｇ／ｋｇ）として３日目に投与した後、処置から５日後（８日目）に、葉酸受容体アルファ発現性腫瘍細胞を占拠することを明らかにした。抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、細胞占拠を評価した（図２１Ａ）。抗α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−ＦＩＴＣ抗体でのＩＨＣ染色により示されるとおり、ＭＯＲＡｂ−２０２処置は、がん関連線維芽細胞の構造を縮小させることも示された（図２１Ｂ）。有効性の点において、ＭＯＲＡｂ−２０２処置は、処置後１１日目に、０．６２の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）により測定される最大腫瘍退縮をもたらした（図２１Ｃ）。
２．３．２ ３Ｄ同時培養系でのＭＯＲＡｂ−２０２、ＭＯＲＡｂ−００３、及びエリブリンの効果
ｒＳｔｏｍａｃｈ（商標）内の骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）を、ＭＫＮ−７４胃癌細胞系と共に１２日間にわたって同時培養した。培養の前に、ＢＭ−ＭＳＣを、葉酸受容体アルファ発現について、及びＭＳＣ分化のマーカーについてフローサイトメトリーにより評価した。次いで、ｒＳｔｏｍａｃｈ（商標）培養物をＭＯＲＡｂ−２０２、非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３抗体、エリブリン、または対照のいずれかで処理した。可視のＭＳＣ分化が光学顕微鏡法により観察されたら、サンプルを染色及びフローサイトメトリー分析のために採取した。これらの分析の結果を図２２に示す。
ＭＫＮ−７４細胞を含む培養物中でヒトＢＭ−ＭＳＣの分化について測定可能な効果を生じさせるために、７日間の合計処置期間で充分であった（期間中に処置の補充がある）。ビヒクル対照に対して、ＭＯＲＡｂ−２０２（１０ｎＭ）での処置は、ＭＳＣ及び脂肪細胞集団の増加、ならびに周細胞集団の減少をもたらした（表４５）。これらのデータは、ＭＯＲＡｂ−２０２が、腫瘍微細環境に顕著な効果を有し得ることを示している。
Figure 0006870051
２．３．３ がん関連線維芽細胞に対するＭＯＲＡｂ−２０２の効果の時間経過分析
ビヒクル、または５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２の投与後０、３、５、７、及び９日目に、腫瘍サンプルを皮下Ｈ２１１０異種移植片腫瘍担持マウスから採取した。収集された腫瘍サンプルをスライド上で処理し、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）発現をＩＨＣにより分析した。抗α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）−ＦＩＴＣ抗体での染色により評価及び定量化されたＣＡＦネットワーク構造は、５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ−２０２の単回用量の投与後、３日目及び５日目に顕著であった（図２３）。しかしながら、７日目までに、この構造の大部分がかなり減少した。
実施例３
１． 物質及び方法
表４６に示す構造を有するコンジュゲート可能なエリブリン化合物を、次の手順に従って合成し、ＡＤＣの調製（実施例４）において使用した。
合成反応で使用される溶媒はすべて、無水グレードであった（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。後処理または精製のために使用された溶媒はすべて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）グレード（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。別段に示さない限り、薬品はすべて、市販されていた。カラムクロマトグラフィーを、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）ＳＰ４を使用して行った。溶媒除去を、回転蒸発器（Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒａｔｅｃｈｉｋ ＡＧ）、または遠心蒸発器（Ｇｅｎｅｖａｃ、ＳＰ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して行った。分取液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を、酸性移動相条件下でＷａｔｅｒｓ ＡｕｔｏＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ及びＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（５μｍ、１９ｍｍ×１００ｍｍ）を使用して行った。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを、別段に述べない限り、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を使用して取得し、Ｖａｒｉａｎ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して４００または５００ＭＨｚで記録した。質量スペクトルを、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ／ＭＳを使用して取得した。本明細書で使用する場合、「不活性化」という用語は、反応器（例えば、反応容器、フラスコ、ガラス製反応器）内の空気を、本質的に水分非含有の不活性ガス、例えば、窒素またはアルゴンに置き換えることを指す。多重性は、次の略語を使用して示される：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｑｕｉｎｔ＝五重線、ｓｘｔ＝六重線、ｍ＝多重線、ｄｄ＝二重二重線、ｄｄｄ＝二重線の二重二重線、ｄｔ＝三重線の二重線、ｂｒ ｓ＝幅広一重線。
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１．１ ＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１５９５６９）の調製
Figure 0006870051
エリブリン（ＥＲ−００００８６５２６）（６１．５ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（６．０ｍＬ）に溶解させ、次いで、ヒューニッヒ塩基（０．０２７ｍＬ、０．１５６ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（８６ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）と混合した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により決定してカップリングが完了するまで、反応物を室温で１８時間にわたって撹拌した。ジエチルアミン（０．０７８ｍＬ、０．７４５ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、反応が完了するまで、混合物をさらに２時間にわたって撹拌した。溶媒を蒸発により除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）を白色の固体として得た（６０ｍｇ、収率７１％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１４ （ｓ， １Ｈ）， ５．０６ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８３ （ｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３２−４．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１３−４．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８−３．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６−３．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２６−３．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， １１．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９１−２．８４ （ｍ， １Ｈ）， ２．７５−２．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４４−２．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２１−１．９７ （ｍ， ８Ｈ）， １．９３−１．８３ （ｍ， ３Ｈ）， １．７９−１．７２ （ｍ， ５Ｈ）， １．６８−１．２９ （ｍ， ８Ｈ）， １．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０７−１．０１ （ｍ， １Ｈ）， １．０６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１１３５．７。
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）（１６ｍｇ、１４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．２μＬ、４１μｍｏｌ）及びＭａｌ−ＰＥＧ２−ＮＨＳ（９．７ｍｇ、２７μｍｏｌ）をこの溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で１時間にわたって撹拌した。反応が完了したら、粗製の混合物を、０．１％ギ酸を含有するアセトニトリル−水移動相を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製した。収集した画分を真空下で、室温で、非加熱水浴内で濃縮して、Ｍａｌ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１５９５６９）（７．１ｍｇ、５．２μｍｏｌ、収率３８％）を得た。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０６ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０２ （ｓ， １Ｈ）， ５．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８２ （ｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ５．２， ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３２−４．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．８， １１．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１３−４．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８−３．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６−３．６４ （ｍ， ６Ｈ）， ３．６２−３．５１ （ｍ， ６Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２２−３．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．４， ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９２−２．８４ （ｍ， １Ｈ）， ２．７６−２．６３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４−２．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２１−１．９７ （ｍ， ８Ｈ）， １．９３−１．８３ （ｍ， ３Ｈ）， １．８０−１．６６ （ｍ， ５Ｈ）， １．６６−１．２８ （ｍ， １０Ｈ）， １．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０７−１．０１ （ｍ， １Ｈ）， ０．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１３７４．９。
１．２ ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４０）の調製
Figure 0006870051
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）（４５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及びビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）３，３’−（エタン−１，２−ジイルビス（オキシ））ジプロパノアート（７９ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）中で混合し、次いで、Ｅｔ３Ｎ（４４．２μｌ、０．３１７ｍｍｏｌ）を添加した。ＨＰＬＣ分析により決定して反応が完了するまで、混合物を１８時間にわたって撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４０）を白色の固体として得た（３８ｍｇ、収率６８％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１４ （ｓ， １Ｈ）， ５．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８３ （ｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０−４．４７ （ｍ， １Ｈ）， ４．３２−４．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１４−４．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８−３．８２ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７８−３．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．６２−３．５８ （ｍ， １Ｈ）， ３．５０−３．４６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３９ （ｓ， ４Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２２−３．０８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， １１．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９１−２．８７ （ｍ， １Ｈ）， ２．８４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．８０ （ｓ， ２Ｈ）， ２．７５−２．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５９−２．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４４−２．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２１−１．９７ （ｍ， １０Ｈ）， １．９３−１．８３ （ｍ， ３Ｈ）， １．７９−１．７２ （ｍ， ５Ｈ）， １．６８−１．２９ （ｍ， ８Ｈ）， １．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０８−０．９８ （ｍ， １Ｈ）， １．００ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１４２１．０。
１．３ ＮＨＳ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４１）の調製
Figure 0006870051
ヘプタン二酸（１．６ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１００ｍＬ）に溶解させ、次いで、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（２．２９９ｇ、１９．９８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ＤＣＣ（４．１２ｇ、１９．９８ｍｍｏｌ）を添加した。ＨＰＬＣ分析が反応の完了を示すまで、混合物を室温で１８時間にわたって撹拌した。固体を、セライトパッドに通す濾過により除去し、ＴＨＦ（３×２ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ヘプタンジオアート（ＥＲ−００１２３６１４０）を白色の固体として得た（２．５ｇ、収率７１％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ２．８３ （ｓ， ８Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．８０ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．５９−１．５１ （ｍ， ２Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝３５５．２。
ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４０）の調製のために上記した手順と同じ手順を使用して、ＶＣＰ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）及びビス（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ヘプタンジオアート（ＥＲ−００１２３６１４０）から、ＮＨＳ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４１）を調製した（８．５ｍｇ、収率４７％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０４ （ｄ， Ｊ ＝ １２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０１ （ｓ， １Ｈ）， ５．００ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８６ （ｓ， １Ｈ）， ４．８２ （ｓ， １Ｈ）， ４．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６−４．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１３−４．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９７ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７−３．８０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７４−３．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２０−３．０６ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， １１．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９０−２．８２ （ｍ， １Ｈ）， ２．８２ （ｓ， ４Ｈ）， ２．７４−２．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４６−２．２６ （ｍ， ７Ｈ）， ２．２４−１．８１ （ｍ， １３Ｈ）， １．７８−１．２８ （ｍ， １９Ｈ）， １．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０６−０．９６ （ｍ， １Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１３７５．１。
１．４ Ｍａｌ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３５６３８）の調製
Figure 0006870051
エリブリン（ＥＲ−００００８６５２６）（１０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（９．０２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びヒューニッヒ塩基（４．４４μＬ、０．０２５ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、ＨＰＬＣ分析が反応の完了を示すまで、混合物を室温で１２時間にわたって撹拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｍａｌ−（ＣＨ２）５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３５６３８）を白色の固体として得た（１１．３ｍｇ、収率６３％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０５ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０２ （ｓ， １Ｈ）， ５．００ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８３ （ｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５６−４．４６ （ｍ， ３Ｈ）， ４．３５−４．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２０−４．０７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８７−３．８３ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７３−３．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２０−３．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １．６， ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．８９−２．８５ （ｍ， １Ｈ）， ２．６９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．２， １６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４４−２．３３ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２７−１．８３ （ｍ， １３Ｈ）， １．７８−１．６８ （ｍ， ５Ｈ）， １．６６−１．２７ （ｍ， １４Ｈ）， １．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０７−０．９８ （ｍ， １Ｈ）， ０．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１３２８．９。
１．５ Ｍａｌ−ＰＥＧ８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４２２８７）の調製
Figure 0006870051
ＶＣＰ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）（１０ｍｇ、８．８０８μｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３−オキソ−７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８−オクタオキサ−４−アザヘントリアコンタン−３１−オアート（６．０７ｍｇ、８．８０８μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中で混合し、続いて、Ｅｔ３Ｎ（９．８２μｌ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。ＨＰＬＣ分析が反応の完了を示すまで、反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌した。溶媒を蒸発により除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｍａｌ−ＰＥＧ８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４２２８７）を白色の固体として得た（３．０ｍｇ、収率２０％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ）δ ｐｐｍ ７．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８０ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１２ （ｓ， １Ｈ）， ５．０４ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０１ （ｓ， １Ｈ）， ４．９９ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８５ （ｓ， １Ｈ）， ４．８０ （ｓ， １Ｈ）， ４．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０−４．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３２−４．２４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２０−４．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１２−４．０４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．９６ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８６−３．８０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６−３．５７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２０−３．０８ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， １１．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９０−２．８２ （ｍ， １Ｈ）， ２．７４−２．６０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４４−２．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２１−１．９７ （ｍ， １０Ｈ）， １．９３−１．８３ （ｍ， ３Ｈ）， １．７９−１．２０ （ｍ， １９Ｈ）， １．０９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０４−０．９８ （ｍ， １Ｈ）， ０．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１７１１．６。
１．６ ＮＨＳ−ＰＥＧ９−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４２２８８）の調製
Figure 0006870051
ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４０）の調製のために上記した手順と同じ手順を使用して、ＶＣＰ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）及びビスＮＨＳ−ＰＥＧ９から、ＮＨＳ−ＰＥＧ９−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４２２８８）を調製した（１３ｍｇ、収率８５％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１６ （ｓ， １Ｈ）， ５．０６ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０１ （ｓ， １Ｈ）， ５．００ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８２ （ｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５２−４．４５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３４−４．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２０−４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１４−４．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８−３．８０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６−３．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６６−３．５８ （ｍ， ３７Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２４−３．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２．０， １１．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．９１−２．８４ （ｍ， １Ｈ）， ２．８４ （ｓ， ４Ｈ）， ２．７６−２．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５８−２．５０ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４６−２．２８ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２２−１．９６ （ｍ， ８Ｈ）， １．９１−１．８２ （ｍ， ３Ｈ）， １．７９−１．６８ （ｍ， ５Ｈ）， １．６４−１．２４ （ｍ， ８Ｈ）， １．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０８−０．９６ （ｍ， １Ｈ）， ０．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１７２９．７。
１．７ ＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４３７００）の調製
Figure 0006870051
ＶＣＰ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）（２５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解させ、次いで、Ｅｔ３Ｎ（２４．５５μｌ、０．１７６ｍｍｏｌ）及びアジド−ＰＥＧ３−ＮＨＳ（８．３４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）と混合した。ＨＰＬＣ分析が反応の完了を示すまで、混合物を室温で１８時間にわたって撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、残渣を、分取ＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ及び水）により精製した。アジド−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリンを含有する画分をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）（３×２０ｍＬ）で抽出し、ＣＨ２Ｃｌ２を蒸発させて、アジド−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４３１１６）を白色の固体として得た（１８．９ｍｇ、収率６３％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．５８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１４ （ｓ， １Ｈ）， ５．０４ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８５ （ｓ， １Ｈ）， ４．８１ （ｓ， １Ｈ）， ４．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５２−４．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３１−４．２５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２０−４．１５ （ｍ， １Ｈ）， ４．１３−４．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９９ （ｔ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８４−３．７９ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７７−３．６５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６４−３．５６ （ｍ， １３Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２０−３．０５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．９５−２．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７５−２．６０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５５−２．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４３−２．２５ （ｍ， ５Ｈ）， ２．２１−１．９７ （ｍ， ８Ｈ）， １．９３−１．８３ （ｍ， ３Ｈ）， １．７９−１．７２ （ｍ， ５Ｈ）， １．６８−１．２９ （ｍ， １０Ｈ）， １．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０５−０．９５ （ｍ， １Ｈ）， ０．９８ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１３６５．１。
アジド−ＰＥＧ３−ＶＣＰ−エリブリン（ＥＲ−００１２４３１１６）（９．６ｍｇ、７．０３５μｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）エトキシ）プロパノアート（６．６１ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を水（０．６ｍＬ）及びｔ−ブタノール（１．８ｍＬ）中で混合した。混合物に、Ｎ２を４５分間にわたって吹き込んだ。ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−２１上のヨウ化銅（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１０ｍｇ）を混合物に添加し、Ｎ２を、混合物にさらに３０分間にわたって吹き込んだ。次いで、出発物質の完全消費まで、反応混合物を室温で７２時間にわたって撹拌した。ＬＣＭＳ分析によると、所望のＮＨＳエステル生成物は観察されず、加水分解カルボン酸のみが観察された。混合物を、短いセライトパッドを通して濾過して、ＣｕＩ樹脂を除去した。濾液を真空中で濃縮し、得られた残渣を、分取薄層クロマトグラフィー（分取−ＴＬＣ）（２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、酸−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４３７０１）を白色の固体として得た（３．７ｍｇ、収率３３％）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）（Ｍ＋Ｈ）＝１５８１．２。
酸−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４３７０１）（３．０ｍｇ、１．８９８μｍｏｌ）をＤＭＦ（２００μＬ）に溶解させ、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（０．４３７ｍｇ、３．７９６μｍｏｌ）を添加し、続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（０．７２８ｍｇ、３．７９６μｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間にわたって撹拌した後に、反応は約５０％完了した。ＥＤＣ（１．４６ｍｇ、７．８μｍｏｌ）を添加し、ＨＰＬＣ分析がＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリンへの＞９５％変換率を示すまで、混合物をさらに１８時間にわたって撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、残渣を分取−ＴＬＣ（１５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、ＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４３７００）を白色の固体として得た（２．２ｍｇ、収率６９％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ８．００ （ｓ， １Ｈ）， ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．１３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０４ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．０２ （ｓ， １Ｈ）， ５．００ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８３ （ｓ， １Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５７−４．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．５１−４．４５ （ｍ， １Ｈ）， ４．３２−４．２８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２１−４．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１３−４．１０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９８ （ｔ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８８−３．８０ （ｍ， ５Ｈ）， ３．７５−３．７０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６８−３．５５ （ｍ， １８Ｈ）， ３．４５−３．４０ （ｍ， ２Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２０−３．０８ （ｍ， ４Ｈ）， ２．９３−２．８０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７５−２．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．６８ （ｓ， ４Ｈ）， ２．４８−２．３０ （ｍ， ７Ｈ）， ２．２８−１．９２ （ｍ， １０Ｈ）， １．９０−１．６８ （ｍ， ８Ｈ）， １．６５−１．２７ （ｍ， ８Ｈ）， １．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０５−０．９５ （ｍ， １Ｈ）， ０．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１６７８．３。
１．８ Ｍａｌ−ＰＥＧ２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６７９）及びＭａｌ−ＰＥＧ２−（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ）２−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６９０）の調製
Figure 0006870051
エリブリン（ＥＲ−００００８６５２６）（１０ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させ、ヒューニッヒ塩基（３．５９μＬ、０．０２１ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−アミノ−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１，４−ジオキソブタン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）カルバマート（１５．７６ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を添加し、ＨＰＬＣ分析が出発物質の完全な消費を示すまで、得られた黄色の溶液を室温で３日間にわたって撹拌した。ジエチルアミン（１４．２３μＬ、０．１３７ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、次いで、これを、Ｆｍｏｃ保護の１００％切断が存在するまで、室温でさらに２時間にわたって撹拌した。反応混合物を濃縮して、ジエチルアミンを除去し、残渣をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に再溶解させた。Ｅｔ３Ｎ（０．０１５ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ）を室温で添加し、続いて、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）プロパノアート（９．７１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を添加した。ＬＣＭＳ分析により決定して反応が完了するまで、反応混合物を室温で１６時間にわたって撹拌した。混合物を高真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｍａｌ−ＰＥＧ２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６７９）（９．２ｍｇ、収率４９％）及びＭａｌ−ＰＥＧ２−（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ）２−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６９０）（６．０ｍｇ、収率１８％）を無色の油状物として得た。
Ｍａｌ−ＰＥＧ２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６７９）：１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ９．２３ （ｓ， １Ｈ）， ８．００ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．３０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．０４−６．００ （ｍ， １Ｈ）， ５．７７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．４２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．０７ （ｓ， １Ｈ）， ５．０６−４．９８ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９３ （ｓ， １Ｈ）， ４．８８ （ｓ， １Ｈ）， ４．９０−４．８２ （ｍ， １Ｈ）， ４．８０ （ｓ， １Ｈ）， ４．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４９−４．４２ （ｍ， １Ｈ）， ４．３８−４．２５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．１９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１５−４．０８ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９７−３．８５ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８３−３．５０ （ｍ， １２Ｈ）， ３．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５０−３．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０２−２．６４ （ｍ， ６Ｈ）， ２．５２−２．３０ （ｍ， ７Ｈ）， ２．３０−１．６５ （ｍ， １４Ｈ）， １．６５−１．２０ （ｍ， １２Ｈ）， １．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１３−１．０５ （ｍ， １Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＝１３９６．６。
Ｍａｌ−ＰＥＧ２−（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ）２−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６９０）：１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ３ＯＤ） δ ｐｐｍ ７．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．７９ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１３ （ｓ， １Ｈ）， ５．０２ （ｓ， １Ｈ）， ５．０６−４．９８ （ｍ， ４Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １Ｈ）， ４．８２ （ｓ， １Ｈ）， ４．８５−４．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．７１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３０−４．０６ （ｍ， ９Ｈ）， ３．９７ （ｔ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８９−３．８０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７５−３．４８ （ｍ， １２Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．１７ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．９４−２．６２ （ｍ， ８Ｈ）， ２．５０−２．２８ （ｍ， ７Ｈ）， ２．２２−１．６５ （ｍ， １４Ｈ）， １．５８−１．３０ （ｍ， １８Ｈ）， １．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．０６−０．９７ （ｍ， １Ｈ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｎａ）＝１８０２．８。
１．９ ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６９１）の調製
Figure 0006870051
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２２８９５０）の調製のために上記した手順と同じ手順を使用して、エリブリン（ＥＲ−００００８６５２６）及びＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＰＮＰから、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６７８）を調製した（１５ｍｇ、定量収率）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１１３５．５。
ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３６９４０）の調製のために上記した手順と同じ手順を使用して、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６７８）及びビスＮＨＳ−ＰＥＧ２から、ＮＨＳ−ＰＥＧ２−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３１６９１）を調製した（１２．４ｍｇ、収率６４％）。１ＨＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ９．２１ （ｓ， １Ｈ）， ７．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５８−７．５２ （ｍ， １Ｈ）， ７．２８ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ６．２９ （ｄ， Ｊ ＝ １２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．３８ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ５．０７ （ｓ， １Ｈ）， ５．０５−４．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９３ （ｓ， １Ｈ）， ４．８８ （ｓ， １Ｈ）， ４．９０−４．８３ （ｍ， １Ｈ）， ４．８１ （ｓ， １Ｈ）， ４．６９ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６−４．４１ （ｍ， １Ｈ）， ４．３６−４．２５ （ｍ， ４Ｈ）， ４．１９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１５−４．０９ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ４．８， ６．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９−３．８９ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８５−３．５０ （ｍ， １０Ｈ）， ３．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４０−３．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０１−２．６０ （ｍ， １０Ｈ）， ２．６０−２．３５ （ｍ， ７Ｈ）， ２．３５−１．６５ （ｍ， １４Ｈ）， １．６５−１．２０ （ｍ， １４Ｈ）， １．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１５−１．０３ （ｍ， １Ｈ）。ＬＣＭＳ（ＥＳ）（Ｍ＋Ｈ）＝１４４２．７。
１．１０ アジド−ＰＥＧ３−ジスルフィド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３７５０８）の調製
Figure 0006870051
４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）安息香酸（１．０ｇ、３．７５４ｍｍｏｌ）を、０℃に冷却したジクロロメタン（ＤＣＭ）（２５ｍＬ）に溶解させた。次いで、トリエチルアミン（０．５４９ｍＬ、３．９４１ｍｍｏｌ）を、続いて、ジフェニルホスホラジダート（１．０８５ｍｇ、３．９４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にゆっくり加温し、１４時間にわたって撹拌した。粗製の混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）／Ｈｅｐ（１：１、１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ（５０％）で溶離して短いシリカプラグに通した。溶媒を真空下で除去して、４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ベンゾイルアジド（ＥＲ−００１１３１９７０）１．１０ｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ７．９８ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．４０ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ４．７９ （ｓ， ２ Ｈ）， ０．９４ （ｓ， ９ Ｈ）， ０．１０ （ｓ， ６ Ｈ）。
トルエン（２０ｍＬ）に溶解させた４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）ベンゾイルアジド（ＥＲ−００１１３１９７０）（１．１ｇ、３．７７５ｍｍｏｌ）を１１０℃で３時間にわたって加熱した。生成物は単一のスポットを示さなかったが、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、出発物質が消費されたことを示した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、窒素下で密閉されたバイアルに移し、トルエン中の溶液（１ｍＬ＝３２．６ｍｇ）として−２０℃で貯蔵した。
トリエチルアミン（０．０９９ｍＬ、０．７０９ｍｍｏｌ）をトルエン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（（４−イソシアナトベンジル）オキシ）ジメチルシラン（１６５ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続いて、アルコール（９０．０ｍｇ、０．５９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６時間にわたって３６℃で撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。次いで、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）の飽和溶液（１０ｍＬ）を添加し、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ（１：１、６０ｍＬ）で抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。粗製の物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ１０％〜４０％）により精製して、２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１３１９７３）２１５ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ７．３４ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ６．６３ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ４．６９ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．１７ （ｓ， ２ Ｈ）， ２．４２ （ｓ， ３ Ｈ）， １．３５ （ｓ， ６ Ｈ）， ０．９３ （ｓ， ９ Ｈ）， ０．０８ （ｓ， ６ Ｈ）。
２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１３１９７３）（１９８ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）及び２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホナート（３２５ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．６ｍＬ）に溶解させた。次いで、炭酸セシウム（６２１ｍｇ、１．９０５ｍｍｏｌ）を、続いて、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（４５ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１５時間にわたって３６℃で撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。次いで、ＮＨ４Ｃｌ（３０ｍＬ）の飽和溶液を添加し、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ（２：１、１５０ｍＬ）で抽出し、ブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。粗製の物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ２０％〜５０％）により精製して、２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１４０１４１）２４８ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ７．２８ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ７．２０ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ４．７３ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．０６ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ）， ３．８３ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４， ５．６ Ｈｚ）， ３．６８− ３．５６ （ｍ， １２ Ｈ）， ３．３７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．６， ５．２ Ｈｚ）， ２．３３ （ｓ， ３ Ｈ）， １．１４ （ｂｒ ｓ， ６ Ｈ）， ０．９３ （ｓ， ９ Ｈ）， ０．０９ （ｓ， ６ Ｈ）。
２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１４０１４１）（８１ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）の混合物に溶解させた。次いで、酢酸（０．５ｍＬ、８．７３４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、１４時間にわたって３８℃で撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、水（２×５ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３、及びブライン（３ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。粗製の物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ３０％〜９０％）により精製して、２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１４０５４９）６１．０ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ７．３４ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ４．６９ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ）， ４．０６ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ）， ３．８４ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．２， ６．２ Ｈｚ）， ３．６６−３．５６ （ｍ， １２ Ｈ）， ３．３７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ２．３３ （ｓ， ３ Ｈ）， １．７４ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， １．１４ （ｂｒ ｓ， ６ Ｈ）。
２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１４０５４９）（６０ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）を、０℃に冷却したＤＣＭ（２ｍＬ）及びＰｙ（０．０１９ｍＬ、０．２３９ｍｍｏｌ）に溶解させた。次いで、ＤＣＭ（２ｍＬ）中の４−ニトロフェニルカルボノクロリダート（３８．５ｍｇ、０．１９１ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２．９ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３０分間にわたって０℃で撹拌した。反応混合物を室温にゆっくり加温し、出発物質が消費されるまで（約２．５時間）、撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ１０％〜３５％）により精製して、２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１４０５５０）７８ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ８．２７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， ２．４ Ｈｚ）， ７．４１ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．３７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ７．２， ２．４ Ｈｚ）， ７．３３（ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ５．２７ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．０８ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ）， ３．８５ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．８， ５．８ Ｈｚ）， ３．６６− ３．５７ （ｍ， １２ Ｈ）， ３．３６ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ２．３３ （ｂｒ ｓ， ３ Ｈ）， １．１９ （ｂｒ ｓ， ６ Ｈ）。
ＤＣＭ（３ｍＬ、４６．６２５ｍｍｏｌ）中の２−メチル−２−（メチルジスルファニル）プロピル（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）カルバマート（ＥＲ−００１１４０５５０）（３０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を２５ｍｌフラスコ内に窒素下で入れ、０℃に冷却した。ＤＣＭ（２ｍＬ）及びヒューニッヒ塩基（０．０２４ｍＬ、０．１３５ｍｍｏｌ）中のアミン（４０．８ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を、続いて、ＤＭＡＰ（１．４ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、反応混合物を室温にゆっくり加温し、３時間にわたって撹拌し、真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ５０％〜１００％、続いて、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ３％〜８％）により精製して、純粋なアジド−ＰＥＧ３−ジスルフィド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３７５０８）４５．０ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ７．３２ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．２５ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ５．２８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ５．６， ５．６ Ｈｚ）， ５．１１−５．０４ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．９３ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８８ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８１ （ｓ， １ Ｈ）， ４．６９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．６０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．２， ４．２ Ｈｚ）， ４．３６ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ４．３３（ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．０， ２．０）， ４．２９ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ９．６， ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．１８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．１４−４．０４ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．０３ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４， ４．４ Ｈｚ）， ３．９７−３．８９ （ｍ， ３ Ｈ）， ３．８４−３．７８ （ｍ， ３ Ｈ）， ３．６７−３．５６ （ｍ， １４ Ｈ）， ３．４２ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４０−３．３５ （ｍ， １ Ｈ）， ３．３７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ３．２７ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ）， ３．２０ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １２．８， ６．０， ６．０ Ｈｚ）， ２．９１−２．８３ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．７０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １６．０， １０．０ Ｈｚ）， ２．５２−２．４０ （ｍ， ３ Ｈ）， ２．３５−２．１３ （ｍ， ９ Ｈ）， ２．１０−２．０６ （ｍ， １ Ｈ）， ２．０１−１．８９ （ｍ， ４ Ｈ）， １．７８−１．６４ （ｍ， ４ Ｈ）， １．６０−１．５２ （ｍ， ４ Ｈ）， １．４９−１．２８ （ｍ， ５ Ｈ）， １．２２−１．０７ （ｍ， ６ Ｈ）， １．０９ （ｄ， ３ Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）。
１．１１ Ｍａｌ−ＰＥＧ４−トリアゾール−ＰＥＧ３−ジスルフィド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３７５０４）の調製
Figure 0006870051
ｔｅｒｔ−ブタノール（１．５ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）中のアジド（９．０ｍｇ、７．１５１μｍｏｌ）及び３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカ−１４−イン−１−イル）プロパンアミド（６．８ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）の混合物を４５分間にわたって脱気した。次いで、ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−２１上のヨウ化銅（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１０ｍｇ）を添加し、さらに３０分間にわたって脱気した。反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌し、ＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。出発物質の大部分が消費され、所望の生成物が主なピークとして示された。次いで、混合物を樹脂から分離し、ＨＰＬＣ（０．０５％ギ酸を含むアセトニトリル／水）で精製して、Ｍａｌ−ＰＥＧ４−トリアゾール−ＰＥＧ３−ジスルフィド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３７５０４）１．５ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ７．７４ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３２ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ７．２７−７．２５ （ｍ， ２ Ｈ）， ６．６９ （ｂｒ ｓ， ２ Ｈ）， ５．４３ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ５．６， ５．６ Ｈｚ）， ５．１４−５．０６ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．９５ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８９ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８２ （ｓ， １ Ｈ）， ４．７０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．６６ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．６２ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．５２（ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ４．３８−４．３１ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．３０ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １０．４， ４．０， ４．０ Ｈｚ）， ４．２０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．１６−４．０５ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．０４ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４， ４．４ Ｈｚ）， ３．９９−３．９１ （ｍ， ３ Ｈ）， ３．８７−３．８０ （ｍ， ６ Ｈ）， ３．７０−３．５９ （ｍ， ２２ Ｈ）， ３．５３ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ３．４４ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４３−３．３６ （ｍ， ３ Ｈ）， ３．２９ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ）， ３．１８ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １２．９， ６．２， ６．２ Ｈｚ）， ２．９２−２．８４ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．７２ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １６．０， １０．０ Ｈｚ）， ２．５４−２．４２ （ｍ， ５ Ｈ）， ２．３７−１．９０ （ｍ， １９ Ｈ）， １７８−１．５２ （ｍ， ３ Ｈ）， １．５０−１．１４ （ｍ， １６ Ｈ）， １．１０ （ｄ， ３ Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１６４２．１。
１．１２ ＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−ジスルフィド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４４１２９）の調製
Figure 0006870051
ｔｅｒｔ−ブタノール（１ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）中のアジド（９ｍｇ、７．１５１μｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２−（２−（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）エトキシ）プロパノアート（４．５ｍｇ、１４．３０μｍｏｌ）の混合物を４５分間にわたって脱気した。次いで、ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−２１上のヨウ化銅（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１０ｍｇ、７．１５１μｍｏｌ）を添加し、さらに３０分間にわたって脱気した。反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌し、ＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。出発物質の大部分が消費され、所望の生成物が主なピークとして示された。次いで、混合物を濾過により樹脂から分離し、ＤＣＭ（１５ｍＬ）で抽出し、ブライン（３×３ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣（５ｍｇ、３．３９μｍｏｌ）をトルエンと共に共沸し、ＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＤＣＣ（４．２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、続いて、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（２．２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌した。出発物質の大部分が消費され、所望の生成物が、ＵＰＬＣ／ＭＳにより決定して主なピークとして示された。次いで、反応混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ｉ−プロパノール、８％）で精製して、ＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−ジスルフィド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４４１２９）２．５ｍｇを無色の油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ２Ｃｌ２） δ ｐｐｍ ７．７２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．３２ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．２５ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ５．０８−５．０４ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．９３ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８５ （ｓ， １ Ｈ）， ４．７８ （ｓ， １ Ｈ）， ４．６４ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．５８ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．５５ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．４８ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．０， ５．０ Ｈｚ）， ４．３２ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ４．２７−４．２２ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．１４ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．６， ４．８ Ｈｚ）， ４．１０−４．０１ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．００ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， ４．４ Ｈｚ）， ３．９２−３．７８ （ｍ， ９ Ｈ）， ３．６５−３．５３ （ｍ， １９ Ｈ）， ３．４４−３．３９ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．３７ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．２６ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ）， ３．１３ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １２．４， ６．０， ６．０ Ｈｚ）， ２．９１−２．７３ （ｍ， １１ Ｈ）， ２．７０−２．６４ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．５４−２．４１ （ｍ， ３ Ｈ）， ２．３８−１．８０ （ｍ， １６ Ｈ）， １．７４−１．５２ （ｍ， ３ Ｈ）， １．４１−１．１３ （ｍ， １０ Ｈ）， １．０７ （ｄ， ３ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１５７２．３。
１．１３ アジド−ＰＥＧ３−スルホンアミド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１３８８５６）の調製
Figure 0006870051
４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）アニリン（３１５ｍｇ、１．３２７ｍｍｏｌ）を０℃に冷却したＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解させた。次いで、ピリジン（０．２６８ｍＬ、３．３１７ｍｍｏｌ）を、続いて、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の５−シアノピリジン−２−スルホニルクロリド（３６５ｍｇ、１．８０１ｍｍｏｌ）を１５分かけて添加した。反応混合物を室温に１時間かけてゆっくり加温し、２時間にわたって撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して、Ｎ−（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）−５−シアノピリジン−２−スルホンアミド（ＥＲ−００１１３７６７０）６１０ｍｇ（１０３％）を得た。粗生成物は適度に純粋であったが、着色していた。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ８．９４ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １．８， ０．６ Ｈｚ）， ８．１０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４， ２．０ Ｈｚ）， ７．９９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０， ０．８ Ｈｚ）， ７．１８ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ）， ７．１５ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ７．１１ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．８， ０．８ Ｈｚ）， ４．６４ （ｓ， ２ Ｈ）， ０．９０ （ｓ， ９ Ｈ）， ０．０５ （ｓ， ６ Ｈ）。
Ｎ−（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）−５−シアノピリジン−２−スルホンアミド（ＥＲ−００１１３７６７０）（１０５．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及び２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホナート（１４３ｍｇ、０．３８３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。次いで、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）（１４４ｍｇ、１．０４１ｍｍｏｌ）を、続いて、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（１９．２ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３６時間にわたって５０℃で撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）の飽和溶液を添加し、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ（２：１、３０ｍＬ）で抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。粗製の物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ２５％〜８０％）により精製して、Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−Ｎ−（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）−５−シアノピリジン−２−スルホンアミド（ＥＲ−００１１３８４５２）（７５％）１１８．０ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ８．９９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １．８， ０．６ Ｈｚ）， ８．０８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．２， ２．２ Ｈｚ）， ７．８６ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０， ０．８ Ｈｚ）， ７．２４ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ １０ Ｈｚ）， ７．０９ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ４．６９ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．０６ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．０， ６．０ Ｈｚ）， ３．６７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ３．６５ − ３．６２ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．５８ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．２， ６．２ Ｈｚ）， ３．５６ − ３．５３ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．３８ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ）， ０．９３ （ｓ， ９ Ｈ）， ０．０８ （ｓ， ６ Ｈ）。
Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−Ｎ−（４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）フェニル）−５−シアノピリジン−２−スルホンアミド（ＥＲ−００１１３８４５２）（１５０ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）をメタノール（６ｍＬ）に溶解させた。次いで、水（０．６０ｍＬ）を、続いて、酢酸（ＡｃＯＨ）（０．６０ｍＬ、１０．４８１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３８℃にゆっくり加温し、１４時間にわたって撹拌した。溶媒の大部分を真空下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、水（２×５ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３、及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。粗製の物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ３５％〜９０％）により精製して、Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノ−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）ピリジン−２−スルホンアミド（ＥＲ−００１１３８４５５）１０５．０ｍｇ（８４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ８．９９ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ）， ８．０９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４， ２．０ Ｈｚ）， ７．８８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４， ０．８ Ｈｚ）， ７．３０ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．１５ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ４．６７ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．０６ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．２， ６．２ Ｈｚ）， ３．６６ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．０， ５．０ Ｈｚ）， ３．６５ − ３．５８ （ｍ， ６ Ｈ）， ３．５５ − ３．５１ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．３８ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２ Ｈｚ。
Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノ−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）ピリジン−２−スルホンアミド（ＥＲ−００１１３８４５５）（４５ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（０．０１５ｍＬ、０．１８３ｍｍｏｌ）を添加した後に０℃に冷却した。次いで、ＤＣＭ（２ｍＬ）中の４−ニトロフェニルカルボノクロリダート（２０．３ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２．３ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温にゆっくり加温し、２時間にわたって撹拌した。ＵＰＬＣ／ＭＳは、多少の出発物質が残っていることを示した。次いで、反応混合物を真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ１２％〜４０％）により精製して、４−（（Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノピリジン）−２−スルホンアミド）ベンジル（４−ニトロフェニル）カルボナート（ＥＲ−００１２３５２８６）３５ｍｇ（５８％）、及び出発物質２０ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ８．９９ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ０．８ Ｈｚ）， ８．２７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ９．２， ２．０ Ｈｚ）， ８．１２ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ７．６， ２．０ Ｈｚ）， ７．９２ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ７．３８ （ｄ， ４ Ｈ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ５．４５ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．０６ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．８， ５．８ Ｈｚ）， ３．６７ − ３．５８ （ｍ， ８ Ｈ）， ３．５８ − ３．５０ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．３８ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．１， ６．１ Ｈｚ）。
４−（Ｎ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノピリジン−２−スルホンアミド）ベンジル（４−ニトロフェニル）カルボナート（ＥＲ−００１２３５２８６）（３５．０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を２５ｍＬフラスコ内に窒素下で入れ、０℃に冷却した。次いで、ＤＣＭ（３ｍＬ、４６．６２５ｍｍｏｌ）及びヒューニッヒ塩基（０．０３７ｍＬ、０．２１４ｍｍｏｌ）中のアミン（４８．５ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を、続いて、ＤＭＡＰ（２．６１ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０分間にわたって０℃で撹拌し、次いで、さらに６時間にわたって室温で撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ５０％〜１００％、続いて、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ３％〜８％）により精製して、純粋なアジド−ＰＥＧ３−スルホンアミド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１３８８５６）６１．０ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ） δ ｐｐｍ ８．９８ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １．２ Ｈｚ）， ８．１０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．２， １．８ Ｈｚ）， ７．８７ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．２６ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ７．１３ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ５．２９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ５．６， ５．６ Ｈｚ）， ５．０８−５．００ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．９２ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８７ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８０ （ｓ， １ Ｈ）， ４．６８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．６， ４．６ Ｈｚ）， ４．５９ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．６， ４．６ Ｈｚ）， ４．３８−４．３０ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．２８ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １０．４， ４．０， ４．０， Ｈｚ）， ４．１７ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ６．２， ４．６ Ｈｚ）， ４．１３−４．０１ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．９７−３．８８ （ｍ， ３ Ｈ）， ３．８２−３．７８ （ｍ， １ Ｈ）， ３．６７−３．５０ （ｍ， １５ Ｈ）， ３．４１ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．４０−３．３３ （ｍ， １ Ｈ）， ３．３７ （ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ４．８， ４．８ Ｈｚ）， ３．２７ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ）， ３．１５ （ｄｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １２．８， ６．４， ６．４ Ｈｚ）， ２．９０−２．８２ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．７０ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １６．０， １０．０ Ｈｚ）， ２．５１−２．４０ （ｍ， ３ Ｈ）， ２．３４−２．１３ （ｍ， ７ Ｈ）， ２．１０−２．０５ （ｍ， １ Ｈ）， １．９９−１．８８ （ｍ， ４ Ｈ）， １．７８−１．６４ （ｍ， ５ Ｈ）， １．６２−１．５２ （ｍ， ２ Ｈ）， １．５０−１．２９ （ｍ， ４ Ｈ）， １．０８ （ｄ， ３ Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）。
１．１４ Ｍａｌ−ＰＥＧ４−トリアゾール−ＰＥＧ３−スルホンアミド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３７５０５）の調製
Figure 0006870051
ｔｅｒｔ−ブタノール（２．１ｍＬ）及び水（０．７ｍＬ）中のアジド（１０ｍｇ、８．０２３μｍｏｌ）及び３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカ−１４−イン−１−イル）プロパンアミド（９．２０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の混合物を４５分間にわたって脱気した。次いで、ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−２１上のヨウ化銅（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１５ｍｇ）を添加し、さらに３０分間にわたって脱気した。反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌し、ＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。出発物質の大部分が消費され、所望の生成物が主なピークとして示された。次いで、反応混合物を樹脂から分離し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／メタノール、７％）で精製して、Ｍａｌ−ＰＥＧ４−トリアゾール−ＰＥＧ３−スルホンアミド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２３７５０５）５．５ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ２Ｃｌ２） δ ｐｐｍ ９．０１ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１５ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０， １．８ Ｈｚ）， ７．８７ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．７５ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２８ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．１４ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ６．６８ （ｓ， ２ Ｈ）， ６．４７ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ５．４４ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ５．１０−５．０２ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．９４ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８６ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８０ （ｓ， １ Ｈ）， ４．６８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．５９ （ｓ， ２ Ｈ）， ４．５６ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．４， ４．４ Ｈｚ）， ４．５１（ｄｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ５．２， ５．２， Ｈｚ）， ４．３４（ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ７．６， Ｈｚ）， ４．３０−４．２３ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．１９ − ４．１４ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．０８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ４．０， ４．０ Ｈｚ）， ４．０３ − ３．９８ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．９４ − ３．７２ （ｍ， ８ Ｈ）， ３．６８ − ３．４６ （ｍ， ２８ Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．３８ − ３．３３ （ｍ， ３ Ｈ）， ３．２７ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ）， ３．１６ − ３．０２ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．９０ − ２．８１ （ｍ， ２ Ｈ）， ２．６８ （ｄｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １６．２， ９．８ Ｈｚ）， ２．５４−２．４０ （ｍ， ７Ｈ）， ２．４０−１．８ （ｍ， １１ Ｈ）， １．８０−１．５０ （ｍ， ３ Ｈ）， １．４８−１．２５ （ｍ， ３ Ｈ）， １．０９ （ｄ， ３ Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１６３０．０。
１．１５ ＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−スルホンアミド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４４６２３）の調製
Figure 0006870051
ｔｅｒｔ−ブタノール（２ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中のアジド（１４ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（２−（２−（プロパ−２−ｙｎ−１−イルオキシ）エトキシ）エトキシ）プロパノアート（８．８０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）の混合物を４５分間にわたって脱気した。次いで、ａｍｂｅｒｌｙｓｔ−２１上のヨウ化銅（１．２３ｍｍｏｌ／ｇ、２０ｍｇ）を添加し、さらに３０分間にわたって脱気した。反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌し、ＵＰＬＣ／ＭＳにより監視した。出発物質の大部分が消費され、所望の生成物が主要なピークとして示された。次いで、反応混合物を、ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）での抽出により樹脂から分離した。ＤＣＭ層をブライン（４×５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、所望の生成物に濃縮した（これを、なんらさらに精製せずに次のステップで使用した）。
粗製の酸（１５．０ｍｇ、１０．２５５μｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、ＤＣＣ（１５．２ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を、続いて、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオン（８．３ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１８時間にわたって撹拌した。ＵＰＬＣ／ＭＳは、出発物質の大部分が消費されたことを示し、所望の生成物が主要なピークとして示された。反応混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ｉ−プロパノール、８％）で精製して、ＮＨＳ−ＰＥＧ３−トリアゾール−ＰＥＧ３−スルホンアミド−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１２４４６２３）２．５ｍｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤ２Ｃｌ２） δ ｐｐｍ ９．００ （ｓ， １ Ｈ）， ８．１２ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ８．００ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．７２ （ｓ， １ Ｈ）， ７．２６ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ７．１２ （ｄ， ２ Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ５．３７ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ５．０８−５．０２ （ｍ， ３ Ｈ）， ４．９３ （ｓ， １ Ｈ）， ４．８５ （ｓ， １ Ｈ）， ４．７８ （ｓ， １ Ｈ）， ４．６６−４．６２ （ｍ， １ Ｈ）， ４．５８−４．５６ （ｍ， ４ Ｈ）， ４．３３ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ）， ４．２９−４．２１ （ｍ， ２ Ｈ）， ４．１０−３．９６ （ｍ， ４ Ｈ）， ３．９３−３．７６ （ｍ， ６ Ｈ）， ３．７４−３．４４ （ｍ， ２７ Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３ Ｈ）， ３．３４−３．２４ （ｍ， ２ Ｈ）， ３．１５−３．０６ （ｍ， １ Ｈ）， ２．９７ （ｂｒ ｓ， １ Ｈ）， ２．９０−２．７８ （ｍ， ８ Ｈ）， ２．７４−２．０８ （ｍ， １３ Ｈ）， ２．０５ −１．７８ （ｍ， ５ Ｈ）， １．７３−１．５０ （ｍ， ２ Ｈ）， １．４１−１．２５ （ｍ， ４ Ｈ）， １．０７ （ｄ， ３ Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）。ＬＣＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝１５６０．０。
１．１６ Ｍａｌ−ＰＥＧ２−エリブリンの調製
エリブリン（５ｍｇ、７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させ、マレイミド−ＰＥＧ２−ＮＨＳ（５ｍｇ、１４μｍｏｌ；Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＢＰ−２１６８０）及びヒューニッヒ塩基（２．４μＬ、１４μｍｏｌ）と混合した。反応混合物を室温で２時間にわたって撹拌した。次いで、反応混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含有する水−アセトニトリル勾配３０〜７０％）により精製した。溶離液を質量により収集し、乾燥するまで凍結乾燥させた。最終収量は３．７ｍｇ（３．８μｍｏｌ、５４％）であった。予測された正確な質量は９６８．５Ｄａであった。測定された質量は９６９．６Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］であった。
１．１７ Ｍａｌ−ＰＥＧ４−エリブリンの調製
エリブリン（５ｍｇ、７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させ、マレイミド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（６．２ｍｇ、１４μｍｏｌ；Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＢＰ−２０５５４）及びヒューニッヒ塩基（２．４μＬ、１４μｍｏｌ）と混合した。反応混合物を室温で２時間にわたって撹拌した。次いで、反応混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含有する水−アセトニトリル勾配３０〜７０％）により精製した。溶離液を質量により収集し、乾燥するまで凍結乾燥させた。最終収量は３．７ｍｇ（３．５μｍｏｌ、５０％）であった。予測された正確な質量は１０５６．５Ｄａであった。測定された質量は１０５７．７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］であった。
１．１８ アジド−ＰＥＧ２−エリブリンの調製
エリブリン（５ｍｇ、７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させ、アジド−ＰＥＧ２−ＮＨＳ（４．２ｍｇ、１４μｍｏｌ；Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＢＰ−２０５２４）及びヒューニッヒ塩基（２．４μＬ、１４μｍｏｌ）と混合した。反応混合物を室温で２時間にわたって撹拌した。次いで、反応混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含有する水−アセトニトリル勾配３０〜７０％）により精製した。溶離液を質量により収集し、乾燥するまで凍結乾燥させた。最終収量は２．２ｍｇ（２．４μｍｏｌ、３４％）であった。予測された正確な質量は９１４．５Ｄａであった。測定された質量は９１５．７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］であった。
１．１９ アジド−ＰＥＧ４−エリブリンの調製
エリブリン（５ｍｇ、７μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解させ、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（５．５ｍｇ、１４μｍｏｌ；Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＢＰ−２０５１８）及びヒューニッヒ塩基（２．４μＬ、１４μｍｏｌ）と混合した。反応混合物を室温で２時間にわたって撹拌した。次いで、反応混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含有する水−アセトニトリル勾配３０〜７０％）により精製した。溶離液を質量で収集し、乾燥するまで凍結乾燥させた。最終収量は３．０ｍｇ（３．０μｍｏｌ、４３％）であった。予測された正確な質量は１００２．５Ｄａであった。測定された質量は１００３．７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］であった。
１．２０ アジド−ＰＥＧ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリンの調製
エリブリン（１５ｍｇ、２１μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解させ、十分に混合した。次いで、ヒューニッヒ塩基（５．５μＬ、３２μｍｏｌ）及びＦｍｏｃ−ＶＣＰ−ＰＮＰ（２４ｍｇ、２２μｍｏｌ；Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＶＣ１００３）を添加した。反応混合物を室温で終夜（１６時間）撹拌した。反応が完了したら、ジエチルアミン（２０μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、２時間にわたって室温で撹拌して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。脱保護反応を、Ｗａｔｅｒｓ ＳＱＤ質量分析計を使用して監視した。反応が完了したら、反応混合物を、予め秤量した１．５ｍＬ微量遠心チューブに移した。溶媒を、温度を３０℃に設定した冷凍Ｃｅｎｔｒｉｖａｐ濃縮機を使用して真空下で蒸発させた。収量は、粗製のＮＨ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン１６ｍｇ（１４μｍｏｌ）（正確な質量１１３４．６Ｄａ、収率６７％）であった。
ＮＨ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン（１６ｍｇ、１４．１μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解させた。次いで、ヒューニッヒ塩基（７．２μＬ、４１μｍｏｌ）及びアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ（１１ｍｇ、２８．２μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３時間にわたって撹拌した。次いで、反応混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸を含有する水−アセトニトリル勾配４８〜７２％）により精製した。溶離液をｍ／ｚ１４０９で収集し、凍結乾燥させて、アジド−ＰＥＧ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（正確な質量１４０７．７Ｄａ）を得た。アジド−ＰＥＧ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン１３ｍｇ（９．２μｍｏｌ）が得られた（ステップ収率６５％、全体４４％）。
実施例４
１． 物質及び方法
使用した試薬はすべて、別段に示さない限り研究グレード以上で、市場供給業者から得た。
１．１ 抗体
次の試験で使用したＭＯＲＡｂ−００３（ヒト化抗ヒト葉酸受容体アルファ、２５ｍｇ／ｍＬ）及びＭＯＲＡｂ−００９（マウス−ヒトキメラ抗ヒトメソテリン、２５ｍｇ／ｍＬ）は、それぞれＬｏｔ＃ＮＢ０２９６２−１９及びＬｏｔ＃０３０Ａ１４からのものであった。トラスツズマブは商業的に入手し（Ｃｌｉｎｇｅｎ）、Ｌｏｔ＃５０３３４５からのものであった。
ＬＣｃｙｓ８０に非対合システインを有するウサギ−ヒトキメラ及びヒト化抗ヒトメソテリン抗体（表１）を、２９３Ｆ細胞で一過性に、または安定性選択されたプールとして発現させた。馴化培地を精製し、セクション１．４．１．２．１に記載したとおりに脱システイニル化した。
１．２ 細胞毒素
コンジュゲート可能なエリブリン化合物を、実施例３に記載したとおりに合成した（表４６）。保存物（１０ｍＭ）をＤＭＳＯ中で調製し、使用まで−２０℃で保存した。
１．３ 腫瘍細胞系
マレイミド／スクシンイミド（ＯＳｕ）／アジド−リンカー−エリブリン化合物で調製したＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣの分析で使用したヒト腫瘍細胞系（表４６）には、ＩＧＲＯＶ１（ヒト卵巣癌、ＦＲｈｉ、ＭＳＬＮｎｅｇ）、ＮＣＩ−Ｈ２１１０（ヒト非小細胞肺癌、ＦＲｍｅｄ、ＭＳＬＮｍｅｄ）、Ａ４３１（ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ）、ＮＣＩ−Ｎ８７−ｌｕｃ（ヒト胃癌、ＦＲｌｏ、ＭＳＬＮｍｅｄ、ｈｅｒ２ｈｉ）、ＮＵＧＣ３（ヒト胃腺癌、ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ、ｈｅｒ２ｎｅｇ）、ＺＲ７５（ヒト乳房腺管癌、ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ、ｈｅｒ２ｍｅｄ）、及びＢＴ−４７４（ヒト乳房腺管癌、ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ、ｈｅｒ２ｈｉ）が含まれた。ＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１５９５６９）とコンジュゲートしたウサギ−ヒトキメラ及びヒト化抗ヒトメソテリンＬＣｃｙｓ８０抗体の分析で使用したヒト腫瘍細胞系は、Ａ３（ヒトメソテリンを安定的に遺伝子導入されたＡ４３１、ＭＳＬＮｈｉ）、ＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣癌、ＭＳＬＮｈｉ）、ＨＥＣ−２５１（ヒト子宮内膜、ＭＳＬＮｍｅｄ）、Ｈ２２６（ヒト肺扁平上皮細胞中皮腫、ＭＳＬＮｌｏ）、及びＡ４３１親（ＭＳＬＮｎｅｇ）であった。ＩＧＲＯＶ１（許可を得て米国国立がん研究所から得た）及びＡ３（親Ａ４３１からＭｏｒｐｈｏｔｅｋで生成）を除いて、使用した細胞系はすべて、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から直接得た。
１．４ 抗体−薬物コンジュゲーション
１．４．１ マレイミドを使用しての、システインをベースとするコンジュゲーション
１．４．１．１ 鎖間ジスルフィドへのコンジュゲーション
１．４．１．１．１ 部分的還元
ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に緩衝液交換し、次いで、遠心濃縮を使用して２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。等体積の１倍ＤＰＢＳ中の２７０μＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を２ｍＭ ＥＤＴＡと共に添加し、８０分間にわたって室温で穏やかに混合することにより、還元を実施した。還元を４０分間にわたって室温で穏やかに混合することにより実施したことを除いて、同様の手法で、トラスツズマブを部分的に還元した。
１．４．１．１．２ コンジュゲーション
マレイミド−リンカー−エリブリン化合物（ＤＭＳＯ中）を、部分的に還元した抗体に１：６（ｍＡｂ：化合物）のモル比でコンジュゲートした。化合物をＤＰＢＳ中５０％プロピレングリコールに添加し、十分に混合した。次いで、等体積の部分的に還元した抗体を添加し、穏やかに混合した（２５％の最終プロピレングリコール濃度）。コンジュゲーションを３．５〜４時間にわたって室温で進行させた。
１．４．１．２ ＬＣｃｙｓ８０へのコンジュゲーション
１．４．１．２．１ 脱システイニル化
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム体積（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２（平衡化緩衝液）で平衡化させた。次いで、馴化培地を負荷し、続いて、１０ＣＶの平衡化緩衝液で未結合の物質を洗浄した。カラムを１６ＣＶの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭシステイン、ｐＨ７．２で、０．５ｍＬ／分で、１６時間にわたって洗浄して、キャッピング基を除去した。次いで、カラムを６０ＣＶの２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５で、０．５ｍＬ／分で６０時間にわたって洗浄した。脱システイニル化した抗体を、５ＣＶの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．９を使用して溶離し、直ちに５体積％の２Ｍトリス、ｐＨ９．０を使用して中和した。抗体を含有する画分をプールし、ＭＷＣＯ ２０Ｋ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＤＰＢＳ中で透析した。
１．４．１．２．２ コンジュゲーション
脱システイニル化抗体をＤＰＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５．０ｍｇ／ｍＬにし、５０％プロピレングリコールをＤＰＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で調製した。ＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１５９５６９）（ＤＭＳＯ中１２ｍＭ）を５０％プロピレングリコールに添加し、十分に混合した。次いで、等体積の脱システイニル化抗体を１：４（ｍＡｂ：化合物）のモル比で添加し、穏やかに混合した。コンジュゲーションを３．５〜４時間にわたって室温で進行させた。
１．４．２ スクシンイミドを使用しての、アミンをベースとするコンジュゲーション
１．４．２．１ コンジュゲーション
抗体（ＭＯＲＡｂ−００３またはＭＯＲＡｂ−００９、非還元）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３中で１０．０ｍｇ／ｍＬにした。５０％プロピレングリコールを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３中で調製した。スクシンイミド（ＯＳｕ）−リンカー−エリブリン（ＤＭＳＯ中）を５０％プロピレングリコールに添加し、十分に混合した。次いで、等体積の抗体を１：４（ｍＡｂ：化合物）のモル比で添加し、十分に混合した。コンジュゲーションを１時間にわたって室温で進行させた。コンジュゲーション反応を１：２０体積の１Ｍトリス、ｐＨ８．０を添加することでクエンチし、ＡＤＣをセクション１．４．４に記載のとおりに精製した。
１．４．３ 歪促進アルキン−アジドケミストリー（ＳＰＡＡＣ）を使用しての、２ステップのアミンをベースとするコンジュゲーション
１．４．３．１ ジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）誘導体化
抗体（ＭＯＲＡｂ−００３またはＭＯＲＡｂ−００９、非還元）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３中で１０．０ｍｇ／ｍＬにした。５０％プロピレングリコールを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．３中で調製した。ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）を５０％プロピレングリコールに添加し、十分に混合した。次いで、等体積の抗体を１：４（ｍＡｂ：化合物）のモル比で添加し、十分に混合した。コンジュゲーションを１時間にわたって室温で進行させた。セクション１．４．４に記載のとおりに、未反応のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯを除去した。
１．４．３．２ コンジュゲーション
５０％プロピレングリコールをＤＰＢＳ中で調製した。アジド−リンカー−エリブリン化合物を、５０％プロピレングリコールに添加し、十分に混合した。次いで、等体積のＤＢＣＯ修飾ＭＯＲＡｂ−００３またはＭＯＲＡｂ−００９を混合物に１：４（ｍＡｂ：化合物）のモル比で添加し、十分に混合した。ＳＰＡＡＣコンジュゲーションを終夜、室温で進行させた。セクション１．４．４に記載のとおりに、未反応のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯを除去した。
１．４．４ 精製
ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（複数可）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、コンジュゲート抗体を精製した。マレイミド／ＯＳｕ／アジド−リンカー−エリブリン及びプロピレングリコールを除去するために、クロマトグラフィーを、泳動緩衝液として１倍ＤＰＢＳを使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。実施例１のセクション１．３．１に記載のとおり、最終タンパク質含有率をＢＣＡアッセイにより決定した。
１．５ 生物物理学的特徴づけ
１．５．１ ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
ＡＤＣの凝集を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを使用するサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。ＡＤＣをＤＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。次いで、ＡＤＣ（１０μＬ）をＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＥＣ ３００Ａガードカラム（４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、空孔サイズ２．７μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に、続いて、ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏ ３００Ａカラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍ、空孔サイズ２．７μｍ）に注入した。ＡＤＣをカラムから、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び５％ＩＰＡを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で、０．２５ｍＬ／分の流速で、２８分間にわたって溶離した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、すべてのデータを解析した。凝集パーセントを［ＰＡ凝集物／ＰＡ合計］×１００として計算した［式中、ＰＡ＝積算ピーク面積］。
１．５．２ 薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）のＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析
疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）を使用して、ＤＡＲを分析した。サンプルをＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ−ＮＰ５、内径４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、２．５μＭ非多孔性サイズカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に注入し、移動相Ａ１００％中での３分の平衡化、１５分の勾配（０〜１００％Ｂ）、１００％Ｂ中での５分の保持、１００％Ａへの１分での変化、及び移動相Ａ１００％中での５分の再平衡化で、０．７ｍＬ／分で溶離した。移動相Ａは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０であった。移動相Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノール、ｐＨ７．０であった。検出を２８０ｎｍで行った（基準３２０ｎｍ）。ＤＡＲを式：
［ＡＵＣ＋１＋２（ＡＵＣ＋２）＋３（ＡＵＣ＋３）＋…ｎ（ＡＵＣ＋ｎ）］／ΣＡＵＣｔｏｔ］
により決定した［式中、ＡＵＣ＋１は、１つの細胞毒素とコンジュゲートしたＡＤＣに対応する抗体ピークでの曲線下面積であり、ＡＵＣ＋２は、２つの細胞毒素とコンジュゲートしたＡＤＣに対応する抗体ピークでの曲線下面積である、など。ΣＡＵＣｔｏｔは、すべてのピークでの合計曲線下面積である］。
１．５．３ ＬＣ−ＭＳ ＤＡＲ分析
ＳＱＤ／ＰＤＡ検出を伴うＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣでのＬＣ−ＭＳ法を使用して、ＤＡＲも分析した。サンプルをＰｒｏｔｅｏｍｉｘ ＲＰ−１０００カラム（５μＭ、１０００Ａ、４．６ｍｍ×１５ｃｍ、Ｓｅｐａｘ）上に６５℃で注入し、２５％Ｂ中での３分の平衡化、２５％から５５％Ｂへの２７分での直線勾配、５５％Ｂでの５分の保持、９０％Ｂへの１分での変化、９０％Ｂでの５分の保持、２５％Ｂへ戻す１分での変化、及び２５％Ｂでの５分の再平衡化で溶離した。移動相Ａは、水中０．１％ＴＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。次いで、溶離液をＰＤＡ及びＳＱＤ検出器に分割した（１０：１）。ＳＱＤ検出器を、ＥＳポジティブ、３．２ｋＶのキャピラリー電圧、４０Ｖのコーン電圧、３Ｖの抽出機、及び０．２ＶのＲＦレンズ、１５０℃のソース温度、及び２５０℃の脱溶媒温度に設定した。質量データを２００〜２０００ｍ／ｚで４０分間にわたって、連続モード、走査時間１秒で取得した。データを解析し、ＭａｓｓＬｙｎｘ及びＭａｘＥｎｔ１を使用してオフラインでデコンボリュートした。ＤＡＲを、下式を使用して計算した：
２［［ＡＵＣＬＣ＋１＋２（ＡＵＣＬＣ＋２）＋３（ＡＵＣＬＣ＋３）＋…ｎ（ＡＵＣＬＣ＋ｎ）］／ΣＩＬＣｔｏｔ］＋
２［［ＡＵＣＨＣ＋１＋２（ＡＵＣＨＣ＋２）＋３（ＡＵＣＨＣ＋３）＋…ｎ（ＡＵＣＨＣ＋ｎ）］／ΣＡＵＣＨＣｔｏｔ］
［式中、ＡＵＣＬＣ＋１は、１つの細胞毒素とコンジュゲートした軽鎖ピークの曲線下面積であり、ＡＵＣＬＣ＋２は、２つの細胞毒素とコンジュゲートした軽鎖ピークの曲線下面積である、など。ＡＵＣＨＣは、対応する重鎖の曲線下面積であり、ΣＡＵＣＬＣｔｏｔ及びΣＡＵＣＨＣｔｏｔは、それぞれ、すべての非コンジュゲート及びコンジュゲート軽鎖及び重鎖の合計曲線下面積である］。
１．５．４ ＬＣｃｙｓ８０ＡＤＣのＵＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ ＤＡＲ分析
ＡＤＣ（１ｍｇ／ｍＬ）を、２０ｍＭの最終濃度までＤＴＴを添加することにより還元させ、続いて、６０℃で３分間にわたってインキュベートした。次いで、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ及びＱ−Ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計を使用して、サンプルを分析した。サンプル（それぞれ０．５〜２μｇ）を、６５℃のＭａｓｓＰｒｅｐマイクロ脱塩カラム上に注入し、移動相Ａ９５％中での５分間の平衡化、１０分での勾配（５〜９０％Ｂ）、及び移動相Ａ９５％中での１０分での再平衡化、０．０５ｍＬ／分でカラムから溶離した。移動相Ａは、水中０．１％ギ酸であった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸であった。Ｑ−Ｔｏｆ質量分析計を陽イオン、Ｖモードで、５００〜４０００ｍ／ｚの範囲の検出で実行した。ソースパラメーターは、次のとおりであった：キャピラリー電圧、２．２５ｋＶ（インタクトな抗体）〜２．５０ｋＶ（還元抗体）；サンプリングコーン電圧、６５．０Ｖ（インタクトな抗体）または５０．０Ｖ（還元抗体）；ソース温度、１０５℃；脱溶媒温度、２５０℃；脱溶媒ガスフロー、５５０Ｌ／時。軽鎖タンパク質ピークを、ＭａｓｓＬｙｎｘ ＭａｘＥｎｔ １関数を使用してデコンボリュートした。非コンジュゲート及び単一コンジュゲート軽鎖質量の相対強度を、下式を使用して全体ＤＡＲを計算するために使用した：
２［ＬＣ＋１／ΣＬＣｔｏｔ］
［式中、ＬＣ＋１は、１つの細胞毒素とコンジュゲートした軽鎖の質量強度であり、ΣＬＣｔｏｔは、非コンジュゲート及びコンジュゲート軽鎖の合計強度である］。
１．６ 結合の特徴づけ
１．６．１ ＢＩＡｃｏｒｅ
抗体濃度を、ＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で２μｇ／ｍＬに調節した。非修飾抗体、またはＡＤＣを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の抗ヒトＩｇＧセンサーに、１分間にわたって１０μＬ／分の流速で注入した。捕捉抗体への抗原会合を記録するために、一連の漸増濃度の抗原を３００秒間にわたって３０μＬ／分の流速で注入した。抗メソテリン抗体では、濃度の範囲は１０ｎＭ〜０．０４１ｎＭであった。ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣでは、濃度の範囲は、１００ｎＭ〜０．４１ｎＭであった。抗原の解離を３０分間にわたって同じ流速で監視した。センサー表面を、３Ｍ ＭｇＣｌ２を２×３０秒間にわたって３０μＬ／分の流速で注入することにより再生した。センサグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅで、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して解析した。
１．６．２ ＥＬＩＳＡ−葉酸受容体アルファ
組換えヒト葉酸受容体アルファをコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．６）中で１１５ｎｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ黒色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．４３７１１、１００μＬ／ウェル）上に４℃で終夜コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）緩衝液を含む１倍ＰＢＳを使用して３回洗浄した。プレートを、ブロッキング緩衝液３００μＬ（ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ）中で、室温で、２時間にわたってオービタルシェーカー上で遮断した。ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣをブロッキング緩衝液中で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈し、次いで、２倍で連続希釈して、１０００ｎｇ／ｍＬ〜０．９８ｎｇ／ｍＬの範囲を得た。ブロッキング緩衝液を廃棄し、希釈抗体１００μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを室温で、２時間にわたって、オービタルシェーカー上でインキュベートした。抗体溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴを使用して３回洗浄した。ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００希釈）溶液１００μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを、室温で１時間にわたってオービタルシェーカー上でインキュベートした。二次抗体溶液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した。ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光原ペルオキシダーゼ基質の希釈標準溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．１５１６９）１００μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で３０分間にわたってインキュベートした。蛍光を励起３２５ｎｍ／発光４２０ｎｍで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。データを、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ５．４．２ソフトウェアを使用して４−パラメーターフィッティングで解析した。
１．６．３ ＥＬＩＳＡ−メソテリン
組換えヒトメソテリンをコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸−炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．６）中で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ黒色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．４３７１１、１００μＬ／ウェル）上に４℃で終夜コーティングした。コーティング溶液を廃棄し、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）緩衝液を含む１倍ＰＢＳを使用して３回洗浄した。プレートをブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ）３００μＬ中で、室温で、２時間にわたってオービタルシェーカー上で遮断した。ＭＯＲＡｂ００９及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣをブロッキング緩衝液中で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈し、次いで、２．５倍で連続希釈して、１０００ｎｇ／ｍＬ〜０．１０５ｎｇ／ｍＬの範囲を得た。ブロッキング緩衝液を廃棄し、希釈抗体１００μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを室温で２時間にわたってオービタルシェーカー上でインキュベートした。抗体溶液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した。ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００希釈）溶液１００μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で１時間にわたってオービタルシェーカー上でインキュベートした。二次抗体溶液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄した。ＱｕａｎｔａＢｌｕ蛍光原ペルオキシダーゼ基質の希釈標準溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ Ｎｏ．１５１６９）１００μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを室温で３０分間にわたってインキュベートした。蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して励起３２５ｎｍ／発光４２０ｎｍで読み取った。データを、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ５．４．２ソフトウェアを使用して４−パラメーターフィッティングで解析した。
１．７ 細胞傷害性分析
１．７．１ クリスタルバイオレットアッセイ
ＩＧＲＯＶ１（ＦＲｈｉ、ＭＳＬＮｎｅｇ）、ＮＣＩ−Ｈ２１１０（ＦＲｍｅｄ、ＭＳＬＮｍｅｄ）、及びＡ４３１（ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ）細胞を継代培養し、５，０００細胞／ウェルで、完全成長培地中で、９６ウェル組織培養プレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で終夜（１６時間）インキュベートした。試験試薬を１：３で、２ｍＬディープウェル希釈プレート内で、２００ｎＭから開始して連続希釈した（合計１０希釈）。希釈サンプル（１００μＬ）を細胞プレートに添加した（１００ｎＭの試験試料濃度から開始）。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに５日間にわたってインキュベートした。次いで、培地を廃棄した。プレートをＤＰＢＳ２００μＬで１回洗浄し、０．２％クリスタルバイオレット溶液５０μＬで室温で１５分間にわたって染色し、次いで、水道水で充分に洗浄した。プレートを風乾させ、クリスタルバイオレットを１％ＳＤＳ溶液２００μＬで溶解させた。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を使用して解析した。
２． 結果
２．１ ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣの生物物理学的特徴づけ
（１）非チオール還元剤ＴＣＥＰを使用しての、抗体鎖間ジスルフィドの部分的還元、続く、チオール−反応性マレイミド−スペーサー−リンカー−エリブリンコンストラクトを使用してのコンジュゲーション；（２）スクシンイミド（ＯＳｕ）−スペーサー−リンカー−エリブリンコンストラクトを使用しての、抗体リシン残基への直接的なコンジュゲーション；及び（３）ＯＳｕ−ＰＥＧ４−ジベンジルシクロオクチンを初めにリシン残基にコンジュゲートし、次いで、アジド−スペーサー−リンカー−エリブリンコンストラクトの直交コンジュゲーションを、ＳＰＡＡＣを使用して行う、２ステップアプローチを使用しての抗体リシン残基へのコンジュゲーションを含む、３つのコンジュゲーション法のうちの１つに従って、ＭＯＲＡｂ−００３（ヒト化抗ヒト葉酸受容体アルファ）、ＭＯＲＡｂ−００９（マウス−ヒトキメラ抗ヒトメソテリン）、及びトラスツズマブ（ヒト化抗ヒトｈｅｒ２）ＡＤＣを、表４６に列挙したコンジュゲート可能なエリブリン化合物を使用して調製した。
精製後に、ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣのすべてでの凝集レベルをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定し、薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）を、逆相ＬＣ−ＭＳ及び／またはＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用して分析した。マレイミドをベースとするＡＤＣのすべてでのＤＡＲを、逆相ＬＣ−ＭＳ及びＨＩＣ−ＨＰＬＣの両方を使用して分析した。０．３未満のＤＡＲ値の差異が典型的には、２つの方法の間で観察された。対照的に、リシン残基を介してのコンジュゲーションにより調製したＡＤＣのすべてでのＤＡＲは、ＬＣ−ＭＳのみにより分析したが、それというのも、これらのＡＤＣの高い程度の異質性により、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる個々のＤＡＲ種の分解が妨げられるためである。ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣでは、標的抗原への結合も、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。ＤＡＲ及び凝集分析の結果を、表４７に、個々のＡＤＣの次に示す。
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051
２．１．１ ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣ
コンジュゲーション効率及び生物物理学的パラメーターの両方の点において、ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブの間で、有意な差は観察されなかった。すべてのＡＤＣが、同様のＤＡＲ値及び凝集物形成レベルを実証した。
２．１．２ マレイミドをベースとするＡＤＣ
マレイミドをベースとするＡＤＣでは、ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ切断部位と対合したペンチル及びＰＥＧ２スペーサー、及びａｌａ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐＡＢ切断部位と対合したＰＥＧ２スペーサーの両方が、低い（＜５％）凝集物レベルに加えて、逆相ＬＣ−ＭＳ及びＨＩＣ−ＨＰＬＣによると３．５〜４．０のＤＡＲ値をもたらした。しかしながら、スペーサーをＰＥＧ８（ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ切断部位と対合）まで伸長させた場合、凝集物レベルは上昇し（１１〜１８％）、コンジュゲーション効率は低下して、１．１〜２．３のＤＡＲ値をもたらした。例えば、表４７におけるＭＯＲＡｂ００３／ＭＯＲＡｂ００９−ＥＲ−００１１５９５６９（短いＰＥＧリンカー）及びＭＯＲＡｂ００３／ＭＯＲＡｂ００９−１２４２２８７（長いＰＥＧリンカー）の凝集パーセント及びＤＡＲ値を参照されたい。
ジスルフィジル−ｐＡＢ切断部位を用いて調製したＡＤＣでは、相対的に高い凝集物レベル（１０〜１４％）と共に、低いＤＡＲ値が観察された（１．０〜１．６）。これらのＡＤＣを、ＬＣ−ＭＳにより分析した場合、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによるよりも顕著に低いＤＡＲ値が観察された（例えば、表４７中のＭＯＲＡｂ００３／ＭＯＲＡｂ００９−ＥＲ１２３７５０４及びＭＯＲＡｂ００３／ＭＯＲＡｂ００９−ＥＲ１２３７５０５でのＬＣ−ＭＳ／ＨＩＣ−ＨＰＬＣ ＤＡＲ値を参照されたい）。この結果は、ＬＣ−ＭＳ分析の移動相が約３．０であるのに対して、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析の移動相が中性であるので、リンカー切断部位がｐＨ不安定性を示すことを示唆している。
スルホンアミド切断部位を用いて調製したＡＤＣでは、低い（＜５％）凝集物レベルが観察された。ジスルフィジル−ｐＡＢ ＡＤＣと同様に、ＬＣ−ＭＳ（１．８−２．３）により分析した場合、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ（３．９）によるよりも低いＤＡＲ値が観察され、これは再び、リンカー切断部位がｐＨ不安定性を示すことを示している。
ＰＥＧ２及びＰＥＧ４切断不可能なリンカーでは、効率的なコンジュゲーションが観察され、４．０〜４．７のＤＡＲ値が生じた。これらの切断不可能なリンカーを有するＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣも、低い凝集レベル（＜２％）を実証したが、対応するＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣでは、やや高い凝集レベルが観察された（ＰＥＧ２及びＰＥＧ４でそれぞれ、４％及び１０％）。
２．１．３ スクシンイミドをベースとするＡＤＣ
スペーサー−リンカー−エリブリンと対合したスクシンイミドを使用して調製したＡＤＣはすべて、ＤＡＲ値＜１．０をもたらした。この低いコンジュゲーション効率（マレイミドに対して）がコンジュゲーション手順自体の結果ではないことを確認するために、これらのＡＤＣを、より高い化合物：抗体比を使用して再び作製し、同じＤＡＲ分析法を使用して再分析した。同様の結果が得られたが、これは、理論に拘束されることはないが、低いＤＡＲ値がスクシンイミド及びエリブリンの組合せの固有の特性であること、及びマレイミドがより効率的にコンジュゲートし得ることを示唆している。スクシンイミドコンジュゲーションの効率は、ＤＢＣＯを初めに、ＮＨＳ−ＤＢＣＯを使用して抗体に付加し、続いて、アジド化合物を付加する２ステップ法の使用により上昇した。このアプローチは、直接的な抗体リシン残基へのコンジュゲーションと比較して、逆相ＨＰＬＣ分析により測定すると、高いＤＡＲ値をもたらす。スルホンアミド（切断可能）、ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ（切断可能）、またはＰＥＧ２／ＰＥＧ４（切断不可能）リンカーを有するスクシンイミドをベースとするＡＤＣでは、２ステップコンジュゲーションから生じるＤＡＲ値は、スルホンアミド切断部位を有するマレイミドをベースとするＡＤＣで決定されたＤＡＲ値と同様であった。理論に拘束されることはないが、この結果は再び、スクシンイミド−スペーサー−リンカー−エリブリンコンジュゲーション反応でのより低いＤＡＲ値が、スクシンイミド及びエリブリンの組合せの固有の特性であることを示唆している。
２．２ ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣの結合の特徴づけ
ＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣでは、標的抗原結合の点において、切断不可能なマレイミドをベースとするリンカー−エリブリンＡＤＣと親ＭＯＲＡｂ−００３との間で、顕著な差は観察されなかった。ＥＬＩＳＡ分析によると、他のマレイミドをベースとするリンカー−エリブリンＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣでは、親ＭＯＲＡｂ−００３に対して標的抗原結合の２〜３倍の低下が典型的には観察された。しかしながら、リンカー長さまたはリンカー組成のいずれかと低いＥＣ５０値との間に明らかな相関はなかった。同様に、スクシンイミドをベースとするリンカー−エリブリンＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣでは、非コンジュゲートＭＯＲＡｂ−００３に対して標的抗原結合の０〜３倍の低下が一般に観察された。再び、リンカー長さまたはリンカー組成のいずれかと低いＥＣ５０値との間の相関は明らかではなかった。ＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣでは、すべてのＡＤＣが、親ＭＯＲＡｂ−００９に対して、ＥＣ５０値の２倍未満の低下を示した。
２．３ ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣのインビトロ細胞傷害性分析
調製したＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣのインビトロ効力を、クリスタルバイオレット細胞ベース細胞傷害性アッセイを使用して評価した。ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣをスクリーニングするために選択された細胞系は、ＩＧＲＯＶ１、ＮＣＩ−Ｈ２１１０、及びＡ４３１であった。ＩＧＲＯＶ１細胞は、ヒト卵巣上皮癌由来の細胞であり、高レベルの葉酸受容体アルファを発現するが、メソテリンは発現しない（すなわち、ＭＯＲＡｂ−００３反応性）。ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞は、ヒト非小細胞肺癌由来の細胞であり、中等度のレベルの葉酸受容体アルファ及びメソテリンの両方を発現する（すなわち、ＭＯＲＡｂ−００３−及びＭＯＲＡｂ−００９反応性）。Ａ４３１対照細胞は、ヒト表皮癌由来の細胞であり、いずれの標的抗原も発現しない。このスクリーニングの結果を表４８に示す。リンカー−毒素マレイミド−ＰＥＧ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン（ＶＣＰ−エリブリン）を含むＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＡＤＣは、ＮＣＩ−Ｎ８７（ＦＲｌｏ、ＭＳＬＮｍｅｄ、ｈｅｒ２ｈｉ）、ＢＴ−４７４（ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ、ｈｅｒ２ｈｉ）、ＺＲ−７５（ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ、ｈｅｒ２ｍｅｄ）、及びＮＵＧＣ３（ＦＲｎｅｇ、ＭＳＬＮｎｅｇ、ｈｅｒ２ｎｅｇ）を含む、追加の胃及び乳癌細胞系でも評価した。このスクリーニングの結果を表４９に示す。
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051
２．３．１ マレイミドをベースとするＡＤＣの細胞傷害性
マレイミドをベースとするＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣはすべて、ＩＧＲＯＶ１細胞で特異的な細胞傷害性を示し、抗体間で観察された効力には、２〜３桁の規模の差があった。ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣは、ＩＧＲＯＶ１細胞系で、ＰＥＧ２またはＰＥＧ４切断不可能なＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣのいずれよりも高い効力を実証したが、特異性の倍数（ｆｏｌｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は変化しなかった。同様の傾向が、ＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣで観察され、切断不可能なＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣは、ＩＧＲＯＶ１細胞で、ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリンＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣよりも低い細胞傷害性を実証した。
ジスルフィジル−及びスルホンアミドをベースとするリンカーを有するマレイミドをベースとするＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣは、ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞系で、ＩＧＲＯＶ１細胞系よりも高い効力を実証した。これは、下記のとおり、培養中のリンカーの潜在的な不安定性により得る。強力な細胞傷害性が、対応するＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣでも観察された。対照的に、切断不可能なリンカーを有するマレイミドをベースとするＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣは、ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞で相対的に低い効力を実証した。理論により束縛されることはないが、この結果は、より低い標的発現で、ペイロードの効率的な切断及び放出が細胞傷害性を改善し得ることを示唆している。
ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ酵素切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを有するＡＤＣは、Ａ４３１対照細胞（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）で低レベルのオフターゲット死滅を実証したのに対して、ａｌａ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐＡＢ酵素切断可能なリンカーを有するＡＤＣは、これらの対照細胞の弱いが、検出可能な死滅を実証した。これは、ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ酵素切断可能なリンカーがａｌａ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐＡＢ酵素切断可能なリンカーよりも、培養物中で安定的であり得ることを示している。加えて、短いＰＥＧ２スペーサーを有するＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣは、ＩＧＲＯＶ１細胞において、長いＰＥＧ８スペーサーを有する対応するＡＤＣよりも高い細胞傷害性を実証した。これと同じ傾向が、短いスペーサー長さを有し、高い細胞傷害性をもたらしたＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９ＡＤＣの両方で、ＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞において観察された。
スルホンアミドをベースとするリンカーを有するＡＤＣは一般に、ジスルフィジルをベースとするリンカーを有する対応するＡＤＣよりも高いＤＡＲ値及び低い凝集レベルを実証した。しかしながら、Ａ４３１対照細胞のｎＭレベルの死滅が、これらのカテゴリーのＡＤＣの両方で観察され、ジスルフィジル−及びスルホンアミドをベースとするリンカーが、培養物中で、調査しているアッセイ条件下で酵素切断可能なリンカーよりも安定性が低いことを示唆した。
具体的なリンカー−毒素マレイミド−ＰＥＧ２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ｐＡＢ−エリブリン（ＶＣＰ−エリブリン）を種々の胃及び乳癌細胞系での特異性及び効力についてさらに検査する。ＶＣＰ−エリブリンを、抗ヒトｈｅｒ２抗体トラスツズマブに加えて、ＭＯＲＡｂ−００３及びＭＯＲＡｂ−００９にコンジュゲートした。ＭＯＲＡｂ−００３−ＶＣＰ−エリブリンは、低レベルの葉酸受容体アルファ（ＦＲ）を発現するＮＣＩ−Ｎ８７細胞で、弱いが、特異的な死滅を実証し、残りの３つのＦＲ陰性細胞系では、ほとんど死滅を実証しなかった。ＭＯＲＡｂ−００９−ＶＣＰ−エリブリンはまた、中等度のレベルのメソテリンを発現するＮＣＩ−Ｎ８７細胞で強力な細胞傷害性を実証した。トラスツズマブ−ＶＣＰ−エリブリンは、高レベルのｈｅｒ２を発現する２つの細胞系、ＮＣＩ−Ｎ８７及びＢＴ−４７４細胞で非常に強力であり（３〜６ｐＭ、ＩＣ５０）、ｈｅｒ２を中等度にのみ発現するＺＲ−７５乳癌細胞でも強力であった。ＭＯＲＡｂ−００３、ＭＯＲＡｂ−００９、及びトラスツズマブＶＣＰ−エリブリンＡＤＣはすべて、それぞれの標的抗原であるＦＲ、メソテリン、またはｈｅｒ２を発現しないＮＵＧＣ３細胞では、低い細胞傷害性を実証した。
２．３．２ スクシンイミドをベースとするＡＤＣの細胞傷害性
スクシンイミドをベースとするＡＤＣの細胞傷害性の傾向は、ＩＧＲＯＶ１細胞について、マレイミドをベースとするＡＤＣと同様であり、ＰＥＧ８スペーサーＡＤＣは、低いＤＡＲ値に加えて、低い細胞傷害性を実証した。対応するマレイミドをベースとするＡＤＣと比較して、酵素切断可能なリンカーを有するスクシンイミドをベースとするＡＤＣでは、ＩＧＲＯＶ１及びＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞の両方で低い細胞傷害性が一般に観察されたが、これは、それらの低いＤＡＲ値による可能性が最も高い。対応するマレイミドをベースとするＡＤＣと同様に、ジスルフィジル−及びスルホンアミドをベースとするリンカーでは、Ａ４３１細胞のオフターゲット死滅も観察された。これは、コンジュゲーションケミストリーではなく、切断部位から生じている可能性がある不安定性の上昇を指し示している。
直接的なスクシンイミドコンジュゲーションアプローチで得られたＤＡＲ値に対して、２ステップコンジュゲーションを行った場合、高いＤＡＲ値が観察された。これらの高いＤＡＲ値は、高い効力と相関した。ＶＣＰ−エリブリンＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣでは、ＩＧＲＯＶ１及びＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞の両方で強力な細胞傷害性が観察された。切断不可能なＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣは、ＩＧＲＯＶ１細胞で効力を実証したが（１〜４ｎＭ）、これらは、ＤＡＲ値が比較可能であっても、この方法で調製したＶＣＰ−エリブリンＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣ（３８ｐＭ）よりも、まだ効力が低かった。加えて、２ステップ法を使用して調製した切断不可能なＭＯＲＡｂ−００３ＡＤＣは、ＩＧＲＯＶ１細胞系で、対応するマレイミドをベースとするＡＤＣよりも効力がやや低かったが、これは、それらの低いＤＡＲ値により得る。それらのマレイミドをベースとするカウンターパートと同様に、２ステップ法を使用して調製した切断不可能なＡＤＣも、ＮＣＩ−２１１０細胞での細胞傷害性をほぼすべて失った。
２．４ 抗ヒトメソテリン（ＬＣｃｙｓ８０）ＡＤＣの生物物理学的特徴づけ
ＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−エリブリン（ＥＲ−００１１５９５６９）を、８種の異なる抗ヒトメソテリン抗体（表１）にコンジュゲートした。セクション１．６．１に上記したとおり、親抗体の結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定した。すべての抗ヒトメソテリンＡＤＣの凝集レベルをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより決定し、ＤＡＲを、ＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用して分析した。クリスタルバイオレット細胞ベース細胞傷害性アッセイを使用して、Ａ３（ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）を安定的に遺伝子導入されたＡ４３１、ＭＳＬＮｈｉ）、ＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣、ＭＳＬＮｈｉ）、ＨＥＣ−２５１（ヒト子宮内膜、ＭＳＬＮｍｅｄ）、Ｈ２２６（ヒト肺扁平上皮細胞中皮腫、ＭＳＬＮｌｏ）、及びＡ４３１親（ＭＳＬＮｎｅｇ）細胞において、インビトロ効力を評価した。ＤＡＲ、凝集、及び細胞傷害性分析の結果を表５０に示す。
Figure 0006870051
すべての抗ヒトメソテリンＡＤＣが低い凝集レベル（凝集物＜１０％）を維持し、標的細胞系での高い効力を実証した。高い効力がＡ３及びＯＶＣＡＲ３で観察されたのに対して、ＨＥＣ−２５１及びＨ２２６細胞は、ＡＤＣ細胞傷害性に対して比較的抵抗性であった。
選択された配列：
配列番号１（ＭＯＲＡｂ−００３重鎖（ＨＣ））
Figure 0006870051
 配列番号２（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ）：ＧＹＧＬＳ
配列番号３（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ）：ＭＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号４（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ）：ＨＧＤＤＰＡＷＦＡＹ
配列番号５（ＭＯＲＡｂ−００３重鎖全長プレタンパク質アミノ酸配列；リーダー配列に下線）
Figure 0006870051
 配列番号６（ＭＯＲＡｂ−００３軽鎖（ＬＣ））
Figure 0006870051
 配列番号７（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ）：ＳＶＳＳＳＩＳＳＮＮＬＨ
配列番号８（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ＣＤＲ２：Ｋａｂａｔ）：ＧＴＳＮＬＡＳ
配列番号９（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ＣＤＲ３；Ｋａｂａｔ）：ＱＱＷＳＳＹＰＹＭＹＴ
配列番号１０ ＭＯＲＡｂ−００３軽鎖全長プレタンパク質アミノ酸配列（リーダー配列に下線）
Figure 0006870051
 配列番号１１（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ｎｔ）
Figure 0006870051
 配列番号１２（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ｎｔ）
Figure 0006870051
 配列番号１３（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ＣＤＲ１；ＩＭＧＴ）：ＧＦＴＦＳＧＹＧ
配列番号１４（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ＣＤＲ２；ＩＭＧＴ）：ＩＳＳＧＧＳＹＴ
配列番号１５（ＭＯＲＡｂ−００３ ＨＣ ＣＤＲ３；ＩＭＧＴ）：ＡＲＨＧＤＤＰＡＷＦＡＹ
配列番号１６（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ＣＤＲ１；ＩＭＧＴ）：ＳＳＩＳＳＮＮ
配列番号１７（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ＣＤＲ２；ＩＭＧＴ）：ＧＴＳ
配列番号１８（ＭＯＲＡｂ−００３ ＬＣ ＣＤＲ３；ＩＭＧＴ）：ＱＱＷＳＳＹＰＹＭＹＴ
配列番号１９（ヒトＦＲＡ）
Figure 0006870051
 配列番号２０（ヒトＦＲＡヌクレオチド）
Figure 0006870051
 配列番号２１（ヒトｈｅｒ２）
Figure 0006870051
Figure 0006870051
配列番号２２（ヒトｈｅｒ２ヌクレオチド）
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051
Figure 0006870051

Claims (14)

  1. 式（Ｉ）の抗体−薬物コンジュゲート：
    Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ （Ｉ）
    ［式中、
    （ｉ）Ａｂは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより定義すると、配列番号７１（ＨＣＤＲ１）、配列番号７２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号７３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号７４（ＬＣＤＲ１）、配列番号７５（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号７６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；またはＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義すると、配列番号１９１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１９２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１９３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１９４（ＬＣＤＲ１）、配列番号１９５（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む内在化型抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体またはその内在化型抗原結合性断片であり；
    （ｉｉ）Ｄは、エリブリンであり；
    （ｉｉｉ）Ｌは、Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐＡＢ
    （式中、Ｍａｌはマレイミドであり、Ｍａｌ中の窒素原子がＰＥＧに結合している；
    ｐＡＢはｐ−アミノベンジルオキシカルボニルであり、ｐＡＢ中のアミノ基がＣｉｔに結合している）
    を含む切断可能なリンカーであり；
    （ｉｖ）ｐは、１〜８の整数である］。
  2. 前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  3. 前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  4. 前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＩｇカッパ軽鎖定常ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  5. ｐが１〜４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの多数のコピーを含む組成物であって、前記組成物中の前記抗体−薬物コンジュゲートの平均ｐが約３．２〜約４．４である、前記組成物。
  7. 患者におけるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を発現するがんを治療するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物または請求項６に記載の組成物。
  8. 前記がんが、乳癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、肺類癌、骨肉腫、膀胱癌、または尿路上皮細胞癌である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記がんが、三重陰性乳癌、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌、非小細胞肺癌、または漿液性子宮内膜癌である、請求項７または請求項８に記載の組成物。
  10. 患者におけるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）発現性腫瘍の増殖を減少させる、または阻害するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物または請求項６に記載の組成物。
  11. 前記腫瘍が、乳癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、肺類癌、骨肉腫、膀胱癌、または尿路上皮細胞癌である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記腫瘍が、三重陰性乳癌、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌、非小細胞肺癌、または漿液性子宮内膜癌である、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
  13. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートまたは請求項６に記載の組成物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  14. コンジュゲーションを可能にする条件下で、抗体または抗原結合性断片を、エリブリンに接続している切断可能なリンカーと反応させることを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートまたは請求項６に記載の組成物を生産する方法。
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