[go: up one dir, main page]

MD3423105T2 - Conjugați anticorp-medicament pe bază de eribulină și metode de utilizare - Google Patents

Conjugați anticorp-medicament pe bază de eribulină și metode de utilizare Download PDF

Info

Publication number
MD3423105T2
MD3423105T2 MDE20190061T MDE20190061T MD3423105T2 MD 3423105 T2 MD3423105 T2 MD 3423105T2 MD E20190061 T MDE20190061 T MD E20190061T MD E20190061 T MDE20190061 T MD E20190061T MD 3423105 T2 MD3423105 T2 MD 3423105T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
antibody
sequence
linker
cancer
drug
Prior art date
Application number
MDE20190061T
Other languages
English (en)
Inventor
Earl F Albone
Xin Cheng
Daniel W Custar
Keiji Furuuchi
Jing Li
Utpal Majumder
Toshimitsu Uenaka
Original Assignee
Eisai R&D Man Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai R&D Man Co Ltd filed Critical Eisai R&D Man Co Ltd
Publication of MD3423105T2 publication Critical patent/MD3423105T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Sunt dezvăluite toxine de legătură şi conjugaţi anticorp-medicament care se leagă de ţinte antigenice oncologice umane, cum ar fi receptorul alfa al folatului şi/sau care oferă activitate medicamentoasă anti-tubulină. Toxinele de legătură şi conjugaţii anticorp-medicament cuprind o fracţiune medicamentoasă eribulină şi pot fi internalizate în celulele care exprimă antigenul ţintă. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la metode şi compoziţii pentru utilizare în tratamentul cancerului prin administrarea conjugaţilor anticorp-medicament prevăzuţi aici.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI
Prezenta descriere a invenţiei se referă la conjugaţi anticorp medicament (ADC-uri) care leagă ţintele antigenului oncologic uman cum ar fi receptorul alfa al folatului şi/sau asigură activitate medicamentoasă anti-tubulină. Descrierea invenţiei se referă suplimentar la metode şi compoziţii utile în tratamentul şi diagnosticarea cancerelor care exprimă receptorul alfa al folatului şi/sau sunt capabile da a fi influenţate de tratament prin perturbarea tubulinei.
STADIUL TEHNICII
Cancerul se numără printre principalele cauze de morbiditate şi mortalitate la nivel mondial, cu aproximativ 14 milioane de cazuri noi şi 8,2 milioane de decese ca-uzate de cancer în 2012. Cele mai frecvente cauze de deces de cancer sunt cancerele de: plămân (1,59 milioane de decese); ficat (745.000 de decese); stomac (723.000 de decese); colorectal (694.000 de decese); sân (521.000 de decese); şi esofag (400.000 de decese). Se preconizează că numărul de noi cazuri de cancer va creşte cu aproxi-mativ 70% în următoarele două decenii, la aproximativ 22 de milioane de cazuri noi de cancer pe an (World Cancer Report 2014).
Microtubulii sunt proteine cito-scheletice filamentoase dinamice care sunt im-plicate într-o varietate de funcţii celulare, inclusiv migraţie intracelulară şi transport, semnalizare celulară şi menţinerea formei celulare. Microtubulii joacă, de asemenea, un rol critic în diviziunea celulelor mitotice prin formarea fusului mitotic necesar pentru a separa cromozomii în două celule fiice. Funcţiile biologice ale microtubulilor în toate celulele sunt reglate în mare parte de dinamica lor de polimerizare, care are loc prin adăugarea reversibilă, non-covalentă, a dimerilor de tubulină α şi β la ambele capete ale microtubulilor. Acest comportament dinamic şi controlul rezultat asupra lungimii micro-tubulilor sunt vitale pentru funcţionarea corectă a fusului mitotic. Alterarea chiar minoră a dinamicii microtubulilor poate angaja punctul de control al fusului, poate opri progresia ciclului celular la mitoză, şi, ulterior, poate duce la moartea celulară (Mukhtar şi colab., (2014) Mol. Cancer Ther., 13: 275-84). Datorită diviziunii celulare rapide a acestora, celulele canceroase sunt în general mai sensibile la compuşii care se leagă la tubulină şi îi perturbă funcţia normală, în comparaţie cu celulele normale. Din acest motiv, inhi-bitorii tubulinei şi alţi agenţi ţintiţi de microtubuli au devenit o clasă promiţătoare de me-dicamente pentru tratamentul cancerului (Dumontet şi Jordan, (2010) Nat. Rev. Drug Discov., 9: 790 - 803).
Receptorul alfa al folatului (FRA) este o proteină de membrană legată de glico-fosfatidilinozitol (GPI) care leagă folatul. În timp ce rolul FRA în biologia ţesutului normal şi canceros nu este pe deplin înţeles, este extrem de supra-exprimat într-un procent ridicat de cancere ovariene de origine epitelială (O'Shannessy şi colab., (2013) Int. J. Gynecol. Pathol., 32 (3): 258-68), precum şi într-un procent de carcinoame pulmonare cu celule non-mici (Christoph şi colab., (2014) Clin. Lung Cancer, 15 (5): 320-30). FRA are, de asemenea, o exprimare limitată în ţesuturile normale. Aceste proprietăţi fac din FRA o ţintă atractivă pentru imunoterapia cancerului.
Diamantis şi colab., (2016) Brit. J. Cancer, 114: 362 - 367, face cunoscută o trecere in revistă a conjugaţilor anticorp-medicament, inclusiv conjugaţii antiFRA-anti-corp.
EXPUNEREA INVENŢIEI
Într-un prim aspect, prezenta invenţie furnizează un conjugat anticorp-medica-ment cu Formula (I):
Ab-(L-D)p (I)
în care (i) Ab este un anticorp anti-receptorul alfa al folatului de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 2 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 3 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 4 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 7 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 8 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 9 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 13 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 14 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 15 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 16 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 17 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 18 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; (ii) D este eribulină; (iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi (iv) p este un număr întreg de la 1 până la 8. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen poate cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24. p poate fi un număr întreg de la 3 la 4. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen poate cuprinde un domeniu constant al lanţului greu al IgG1 umane şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa al Ig umane.
Într-un al doilea aspect, prezenta invenţie furnizează o compoziţie care cuprinde mai multe copii ale conjugatului anticorp-medicament din primul aspect, în care p mediu al conjugaţilor anticorp-medicament în compoziţie este de la aproximativ 3,2 până la aproximativ 3,8 sau de la aproximativ 3,6 până la aproximativ 4,4.
Într-un al treilea aspect, prezenta invenţie asigură că primul aspect sau al doilea aspect pot fi pentru utilizare în tratamentul unui cancer care exprimă receptorul alfa al folatului. Cancerul este un cancer gastric, un cancer ovarian seros, un cancer ovarian cu celule clare, un cancer pulmonar cu celule non-mici, un cancer colorectal, un cancer mamar triplu negativ, un cancer endometrial, un cancer endometrial seros, un carcinoid pulmonar, sau un osteosarcom.
Într-un al patrulea aspect, prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmace-utică ce cuprinde conjugatul anticorp-medicament din primul aspect sau compoziţia din cel de-al doilea aspect, şi un transportor acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
Într-un al cincilea aspect, prezenta invenţie furnizează o metodă pentru produ-cerea conjugatului anticorp-medicament din primul aspect sau compoziţiei din cel de-al doilea aspect, care cuprinde punerea în reacţie a unui anticorp sau a unui fragment de legare la antigen cu un linker care poate fi scindat legat la eribulină în condiţii care permit conjugare.
Într-un al şaselea aspect, prezenta invenţie furnizează o metodă pentru a de-termina dacă un pacient va răspunde la tratamentul cu conjugatul anticorp-medicament dintre oricare dintre cele din primul aspect sau compoziţia din cel de-al doilea aspect, cuprinzând furnizarea unei probe biologice de la pacient şi punerea în contact a probei biologice cu conjugatul anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4 sau compoziţia conform revendicării 5. Proba biologică poate fi o biopsie tumorală de la un gastric cancer, un cancer ovarian seros, un cancer ovarian cu celule clare, un cancer pulmonar cu celule non-mici, un cancer colorectal, un cancer mamar triplu negativ, un cancer endometrial, un cancer endometrial seros, un carcinoid pul-monar, sau un osteosarcom.
Într-un al şaptelea aspect, prezenta invenţie furnizează o compoziţie care cu-prinde mai multe copii ale unui conjugat anticorp-medicament of Formula (I):
Ab-(L-D)p (I)
în care (i) Ab este un anticorp anti-receptorul alfa al folatului de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 2 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 3 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 4 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 7 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 8 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 9 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 13 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 14 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 15 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 16 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 17 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 18 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; (ii) D este eribulină; (iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi (iv) p este numărul mediu de porţiuni indivizibile -L-D per Ab, unde p mediu al conjugaţilor anticorp-medicament în compoziţie este de la aproximativ 3,6 până la aproximativ 4,4. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen poate cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24.
Prezenta descriere a invenţiei descrie, în parte, compuşi noi cu activitate biolo-gică împotriva celulelor tumorale. Compuşii pot inhiba creşterea tumorii la mamifere, şi pot fi utili pentru tratarea pacienţilor umani cu cancer.
Prezenta descriere a invenţiei se referă în mod mai specific la compuşi conjugaţi anticorp-medicament care sunt capabili să lege, să internalizeze, şi să omoare celulele tumorale (de exemplu, celulele tumorale care exprimă FRA). Sunt făcuţi cunoscuţi compuşi conjugaţi anticorp-medicament care cuprind un linker care ataşează o porţiune indivizibilă de medicament la o porţiune indivizibilă de anticorp. Compuşii conjugaţi anticorp-medicament (ADC) pot fi reprezentaţi prin Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care Ab este un anticorp de internalizare sau un fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală;
D este eribulină;
L este un linker care poate fi scindat care ataşează covalent Ab la D; şi
p este un număr întreg de la 1 până la 20.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este stabil în afara unei celule, astfel încât ADC rămâne intact atunci când este prezent în condiţii extracelulare, dar este capabil de a fi scindat la internalizarea într-o celulă, de exemplu, o celulă cance-roasă. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament de eribulină este scindată din porţiunea indivizibilă de anticorp atunci când ADC-ul intră într-o celulă care exprimă un antigen specific pentru porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului, iar scindarea eliberează o formă nemodificată de eribulină. Aşa cum se des-crie în acest document, linkerul cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată care este poziţionată astfel încât nicio parte a linkerului sau a porţiunii indivizibile de anticorp nu rămâne legată la porţiunea indivizibilă de medicament de eribulină la scin-dare.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă care poate fi scin-dată în linker este o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată demonstrează niveluri de agregare mai mici, raport anticorp:medicament îmbunătăţit, ucidere la ţintă a celulelor canceroase crescută, ucidere scăzută de-parte de ţintă a celulelor non-canceroase, şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului (p) în raport cu un ADC care cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată al-ternativă. Aşa cum se descrie în acest document, adăugarea unei porţiuni indivizibile care poate fi scindată creşte citotoxicitatea şi/sau potenţa în raport cu un linker non-scindabil. Aşa cum se descrie în acest document, potenţa şi/sau citotoxicitatea crescută este într-un cancer care exprimă niveluri moderate ale antigenului ţintit de porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului (de exemplu, exprimare moderată a FRA). Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată este scindabilă de o enzimă, iar linkerul este un linker care poate fi scindat de enzimă. Aşa cum se descrie în acest document, enzima este catepsina, iar linkerul este un linker care poate fi scindat de catepsină. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care poate fi scindat de enzimă (de exemplu, linkerul care poate fi scindat de catepsină) prezintă una sau mai multe dintre proprietăţile îmbunătăţite menţionate mai sus, în comparaţie cu un mecanism de scindare alternativ.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată în linker cuprinde o unitate de aminoacizi. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde valină-citrulină (Val-Cit). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde Val-Cit demonstrează stabilitate crescută, ucidere scăzută a celulelor departe de ţintă, ucidere a celulelor la ţintă crescută, niveluri de agregare mai mici, şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului în raport cu un ADC care cuprinde o unitate de aminoacizi alternativă sau o porţiune indivizibilă care poate fi scindată alternativă.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde cel puţin o unitate de distanţiere care uneşte porţiunea indivizibilă de anticorp la porţiunea indivizibilă care poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere în linker poate cuprinde cel puţin o porţiune indivizibilă de polietilen glicol (PEG). Porţiunea indivizibilă de PEG poate să cuprindă, pentru exemplificare, -(PEG)m-, în care m este un număr întreg de la 1 până la 10. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere în linker cuprinde (PEG)2. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde o unitate de distanţiere mai scurtă (de exemplu, (PEG)2) demonstrează niveluri de agregare mai mici şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului în raport cu un ADC care cuprinde o unitate de distanţiere mai lungă (de exemplu, (PEG)8) în ciuda lungimii mai mici a linkerului.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere în linker se ataşează la porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului prin intermediul unei porţiuni indivizibile de maleimidă (Mal). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker ataşat la porţiunea indivizibilă de anticorp prin intermediul unei Mal demonstrează o încărcare de medicament mai mare în raport cu un ADC care cuprinde un linker ataşat la porţiunea indivizibilă de anticorp prin intermediul unei porţiuni indivizibile alternative. Aşa cum se descrie în acest document, Mal în linker este reactivă cu un reziduu de cisteină în porţiunea indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, Mal în linker este unită la porţiunea indivizibilă de anticorp prin intermediul unui reziduu de cisteină. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)m, de exemplu, Mal-(PEG)2. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal ataşează porţiunea indivizibilă de anticorp la porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker este o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată, de exemplu, o unitate de aminoacizi. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă care poate fi scin-dată în linker este unită în mod direct la porţiunea indivizibilă de medicament de eribu-lină a ADC-ului, iar porţiunea indivizibilă care poate fi scindată este fie conectată în mod direct la porţiunea indivizibilă de anticorp, fie conectată printr-o unitate de distanţiere. Aşa cum se descrie în acest document, o unitate de distanţiere ataşează, de asemenea, porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker la porţiunea indivizibilă de medica-ment de eribulină. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere care ataşează porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker la porţiunea porţiune in-divizibilă de medicament de eribulină este auto-distrugătoare. Aşa cum se descrie în acest document, distanţierul auto-distrugător este capabil să elibereze eribulină nemo-dificată într-o celulă ţintă. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere auto-distrugătoare cuprinde un alcool p-aminobenzilic. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere auto-distrugătoare cuprinde p-aminobenziloxicarbonil (pAB). pAB-ul în linker, aşa cum se descrie în acest document, ataşează porţiunea indivizibilă care poate fi scindată la porţiunea indivizibilă de medicament de eribulină. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă care poate fi scindată este o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată, de exemplu, o unitate de amino-acizi. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Val-Cit-pAB şi o unitate de distanţiere PEG care uneşte linkerul la porţiunea indivizibilă de anticorp printr-o Mal.
Aşa cum se descrie în acest document, p este un număr întreg de la 1 până la 6, de la 2 până la 5, sau, preferabil, de la 3 la 4. Aşa cum se descrie în acest document, p este 4. Aşa cum se descrie în acest document, este furnizată o reuniune de ADC-uri, iar p mediu în reuniune este de aproximativ 4 (de exemplu, 3,5 - 4,5, cum ar fi aproxi-mativ 3,8). Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB şi p este 4. Aşa cum se descrie în acest document, este furnizată o reuniune de ADC-uri, în care fiecare ADC cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB, iar p mediu în reu-niune este de aproximativ 4 (de exemplu, 3,5 - 4,5, cum ar fi aproximativ 3,8).
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare (Ab sau porţiunea indivizibilă de Ab) a ADC-ului este un anticorp sau fragment de anticorp de internalizare anti-receptorul alfa al folatului (FRA), şi poate lega celule tumorale care exprimă FRA (adică, ADC-ul ţinteşte celule care exprimă FRA). Aşa cum se descrie în acest document, ADC-ul care cuprinde o porţiune indivizibilă de Ab anti-FRA şi o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scin-dată demonstrează niveluri de agregare mai mici, raport anticorp:medicament îmbună-tăţit, ucidere la ţintă a celulelor canceroase crescută, ucidere scăzută departe de ţintă a celulelor non-canceroase, încărcare mai mare a medicamentului (p), citotoxicitate crescută, şi/sau potenţă în raport cu un linker non-scindabil sau un mecanism de scin-dare alternativ. Aşa cum se descrie în acest document, potenţa şi/sau citotoxicitatea crescută este într-un cancer care exprimă niveluri moderate ale antigenului ţintit de porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului (de exemplu, exprimare moderată a FRA). Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată este scindabilă de o enzimă, iar linkerul este un linker care poate fi scindat de enzimă. Aşa cum se descrie în acest document, enzima este catepsina, iar linkerul este un linker care poate fi scindat de catepsină. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care poate fi scindat de enzimă (de exemplu, linkerul care poate fi scindat de catepsină) prezintă una sau mai multe dintre proprietăţile îmbunătăţite menţionate mai sus, în comparaţie cu un mecanism de scindare alternativ. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un Mal-(PEG)m-Val-Cit-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare se leagă la receptorul alfa al folatului (FRA) şi ţinteşte celule tumorale care exprimă FRA. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR-uri) ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor, în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu con-stituită din ID. SECV. NR.: 2, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 3, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 4; şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 7, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 8, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 9, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 13, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 14, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 15; şi CDR-urile lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 16, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 17, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 18, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde secvenţe de cadru umane. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 23 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare concurează pentru legare şi/sau se leagă la acelaşi epitop ca un anticorp care cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 23 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare se leagă la un epitop care cuprinde alanină-histidină-lizină-acid aspartic (AHKD) (ID. SECV. NR.: 365) (O'Shannessy şi colab., (2011) Oncotarget 2: 1227-43). Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare se leagă la un epitop care cuprinde NTSQEAHKDVSYL (ID. SECV. NR.: 366).
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare este un anticorp anti-FRA de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor, în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 2, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 3, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 4; şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor con-stituită din ID. SECV. NR.: 7, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 8, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 9, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 13, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 14, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 15; şi CDR-urile lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 16, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 17, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 18, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi p este 4. Aşa cum se descrie în acest document, este furnizată o reu-niune de astfel de ADC-uri şi p este de aproximativ 4 (de exemplu, aproximativ 3,8). Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 23 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la anti-gen de internalizare cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare concu-rează pentru legare şi/sau se leagă la acelaşi epitop ca un anticorp care cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 23 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anti-corpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare se leagă la un epitop care cuprinde ID. SECV. NR.: 365. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare se leagă la un epitop care cuprinde ID. SECV. NR.: 366.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare se leagă de receptorul factorului de creştere epidermic uman 2 (her2) şi ţinteşte celule tumorale care exprimă her2. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR-uri) ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor, în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 71, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 72, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 73; şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 74, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 75, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 76, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 191, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 192, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 193; şi CDR-urile lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 194, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 195, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 196, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen de interna-lizare cuprinde secvenţe de cadru umane. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 27 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 28. Aşa cum se descrie în acest document, anti-corpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare concurează pentru legare şi/sau se leagă la acelaşi epitop ca un anticorp care cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 27 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 28.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare este un anticorp anti-her2 de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor, în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 71, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 72, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 73; şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor con-stituită din ID. SECV. NR.: 74, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 75, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 76, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 191, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 192, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 193; şi CDR-urile lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 194, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 195, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 196, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; linkerul cu-prinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi p este 4. Aşa cum se descrie în acest document, este furnizată o reuniune de astfel de ADC-uri şi p este de aproximativ 4 (de exemplu, aproximativ 3,8). Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 27 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 28. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la anti-gen de internalizare concurează pentru legare şi/sau se leagă la acelaşi epitop ca un anticorp care cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 27 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 28.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare se leagă de mezotelină (MSLN) şi ţinteşte celule tumorale care exprimă MSLN. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii (CDR-uri) ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lan-ţului uşor, în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 65, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 66, şi CDR3 a lan-ţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 67; şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 68, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 69, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 70, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 185, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 186, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 187; şi CDR-urile lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 188, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 189, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 190, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 25 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 26. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la anti-gen de internalizare concurează pentru legare şi/sau se leagă la acelaşi epitop ca un anticorp care cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 25 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 26.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare este un anticorp anti-MSLN de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor, în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 65, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 66, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 67; şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor con-stituită din ID. SECV. NR.: 68, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 69, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 70, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau în care CDR-urile lanţului greu cuprind CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 185, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 186, şi CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 187; şi CDR-urile lanţului uşor cuprind CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 188, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 189, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 190, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; linkerul cu-prinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi p este 4. Aşa cum se descrie în acest document, este furnizată o reuniune de astfel de ADC-uri şi p este de aproximativ 4 (de exemplu, aproximativ 3,8). Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 25 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 26. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la anti-gen de internalizare concurează pentru legare şi/sau se leagă la acelaşi epitop ca un anticorp care cuprinde un domeniu variabil al lanţului greu având ID. SECV. NR.: 25 şi un domeniu variabil al lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 26.
De asemenea, în acest document sunt descrise compoziţii care cuprind mai multe copii ale oricăruia dintre ADC-urile descrise, în care încărcarea medie a medica-mentului (p medie) a ADC-urilor în compoziţie este cuprinsă între aproximativ 3 şi 4, sau aproximativ 3,5 până la aproximativ 4,5, sau aproximativ 4. Aşa cum se descrie în acest document, p medie este cuprinsă între aproximativ 3,2 şi 3,8. Aşa cum se descrie în acest document, p medie este cuprinsă între aproximativ 3,6 şi 4,4.
De asemenea, în acest document sunt descrise compoziţii care cuprind -L-D, în care D este eribulină; şi L este un linker care poate fi scindat care se ataşează covalent la D. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care poate fi scindat se ataşează covalent la amina C-35 pe eribulină. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care poate fi scindat cuprinde Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care poate fi scindat cuprinde o unitate de distanţiere de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care poate fi scindat cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB.
În acest document sunt descrise suplimentar compoziţii farmaceutice care cu-prind un ADC şi un diluant, transportor şi/sau excipient acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
Un alt aspect al prezentei descrieri a invenţiei include utilizări terapeutice şi de diagnostic pentru compuşii ADC şi compoziţiile descrise, de exemplu, în tratarea can-cerului. Un alt aspect include metode pentru tratarea unui cancer care exprimă un antigen ţintit de porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului, cum ar fi FRA. Aşa cum se descrie în acest document, sunt descrise metode pentru uciderea sau inhibarea proli-ferării celulelor tumorale sau a celulelor canceroase prin administrarea unei cantităţi eficiente din punct de vedere terapeutic şi/sau unui regim din oricare dintre ADC-urile descrise. Un alt aspect include metode pentru detectarea celulelor tumorale sau a celulelor canceroase care exprimă FRA utilizând ADC-urile făcute cunoscute, şi metode de screening pentru pacienţii cu cancer care vor răspunde la tratamentul cu ADC-urile descrise. Aşa cum se descrie în acest document, cancerul este un cancer gastric, un cancer ovarian seros, un cancer ovarian cu celule clare, un cancer pulmonar cu celule non-mici, un cancer colorectal, un cancer mamar triplu negativ, un cancer endometrial, un cancer endometrial seros, un carcinoid pulmonar, sau un osteosarcom. Sunt făcute cunoscute, de asemenea, metode pentru producerea ADC-urilor descrise.
SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR
Figura 1 arată una dintre metodologiile utilizate pentru prepararea ADC-urilor MORAb-003. În această abordare, cisteinele neîmperecheate sunt generate prin reducere parţială cu echivalenţi molari limitaţi ai agentului de reducere non-tiol TCEP. Această abordare reduce preferenţial legăturile de disulfură intercatenare care leagă lanţul uşor şi lanţul greu (o pereche per împerechere H-L) şi cele două lanţuri grele în regiunea balama (două perechi per împerechere H-H în cazul IgG1 umane), în timp ce lasă legăturile de disulfură intracatenare intacte.
Figura 2 arată o metodă de sintetizare de maleimidă-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribu-lină (mal-(PEG)2-VCP-eribulină).
Figura 3 arată o analiză SDS-PAGE a condiţiilor de reducere pentru MORAb-003. Benzile sunt indicate în dreapta figurii. Banda M corespunde standardului proteic; banda 1 corespunde MORAb-003 netratat; banda 2 corespunde cu 5,3 mg/ml redus în 70,6 µM TCEP; banda 3 corespunde MORAb-003 5,3 mg/mL redus în 141,2 µM TCEP; banda 4 corespunde MORAb-003 1,5 mg/mL redus în 20 µM TCEP; iar banda 5 corespunde MORAb-003 1,5 mg/mL redus în 40 µM TCEP. Identităţile fiecărei benzi sunt indicate pe gelul din dreapta jos. "H" indică lanţ greu. "L" indică lanţ uşor.
Figura 4 arată o analiză SDS-PAGE a condiţiilor de reducere pentru MORAb-003. Banda 1 corespunde standardului proteic; banda 2 corespunde MORAb-003 netratat; banda 3 corespunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:1; banda 4 corespunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:2; banda 5 corespunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:3; şi banda 6 corespunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:4.
Figura 5 arată o analiză SDS-PAGE non-reducătoare a ADC-urilor MORAb-003 selectate, inclusiv M-MMAE (banda 2), M-DM1 (banda 3), M-0026 (banda 4), M-0260 (banda 5), M-0267 (banda 6), M-0272 (banda 7), M-0285 (banda 8), M-0292 (banda 9), M-027-0381 (banda 10), şi M-0284 (banda 11).
Figura 6A arată rezultatele unei analize de citotoxicitate a vecinătăţilor pentru MORAb-003-maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB-eribulină (M3-VCP-eribulină, sau "MORAb-202"). Figura 6B arată rezultatele unei analize de citotoxicitate a vecinătăţilor pentru MORAb-003-maleimido-(CH2)5-Val-Cit-pAB-ER-001150828 (M3-ER-61318). Figura 6C arată rezultatele unei analize de citotoxicitate a vecinătăţilor pentru MORAb-003-PEG-pAB-duostatină 3 (M3-027-0285). Infor-maţia arătată în legendele figurii respective oferă linia celulară:agent testat (linia celulară/liniile celulare cultivate, densitatea de însămânţare a primei/celei de-a doua linii celulare).
Figurile 7A şi 7B arată distribuţia raportului medicament-anticorp (DAR) pentru ADC-urile MORAb-003-VCP-eribulină (Figura 7A) şi MORAb-003-0285 (Figura 7B) în raport cu MORAb-003 neconjugat. Numerele de deasupra fiecărui vârf indică DAR-ul speciilor individuale.
Figura 8 arată rezultatele unei analize de citotoxicitate - concurenţa MORAb-003-VCP-eribulină cu MORAb-003 neconjugat (2 µM) în celule IGROV1 sau SJSA-1.
Figura 9 arată cinetica greutăţii corporale pentru fiecare grup de şoareci CD-1 (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de vehicul (PBS), sau MORAb-202 la 10, 20, 40, sau 80 mg/kg.
Figura 10 arată cinetica greutăţii corporale pentru fiecare grup de şoareci CD-1 (media grupului şi SEM) trataţi intravenos cu PBS, sau cu eribulină la 0,4, 0,8, 1,6 sau 3,2 mg/kg, în conformitate cu un regim de dozare q4dx3 (doze administrate o dată la fiecare patru zile pentru 3 doze în total).
Figura 11 arată cinetica creşterii tumorii pentru fiecare grup de şoareci CB17-SCID implantaţi cu celule de hNSCLC NCI-H2110 (media grupului şi SEM) şi trataţi cu o singură doză intravenoasă de PBS, MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 1, 2,5, sau 5 mg/kg, sau MORAb-003-0285 la 5 mg/kg.
Figura 12 arată volumele tumorale ale şoarecilor CB17-SCID individuali implan-taţi cu celule de hNSCLC NCI-H2110, precum şi media grupului şi SEM, în ziua 17. Grupurile au fost tratate cu o singură doză intravenoasă de PBS, MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 1, 2,5, sau 5 mg/kg, sau MORAb-003-0285 la 5 mg/kg.
Figura 13 arată cinetica greutăţii corporale pentru fiecare grup de şoareci CB17-SCID implantaţi cu NCI-H2110 (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de PBS, MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 1, 2,5, sau 5 mg/kg, sau MORAb-003-0285 la 5 mg/kg.
Figura 14 arată cinetica creşterii tumorii pentru fiecare grup de şoareci CB17-SCID implantaţi cu NCI-H2110 (media grupului şi SEM) trataţi intravenos cu vehicul (PBS), sau cu eribulină la 0,5, 0,2, 0,8, sau 1,6 mg/kg, în conformitate cu un regim de dozare q4dx3.
Figura 15 arată volumele tumorale ale şoarecilor CB17-SCID implantaţi cu NCI-H2110 individuali, precum şi media grupului şi SEM, în ziua 24. Grupurile au fost tratate intravenos cu vehicul (PBS), sau cu eribulină la 0,5, 0,2, 0,8, sau 1,6 mg/kg, în conformitate cu un regim de dozare q4dx3.
Figura 16 arată cinetica schimbării greutăţii corporale pentru fiecare grup de şoareci CB17-SCID implantaţi cu NCI-H2110 (media grupului şi SEM) trataţi intravenos cu vehicul (PBS) sau cu eribulină la 0,5, 0,2, 0,8, sau 1,6 mg/kg, în conformitate cu un regim de dozare q4dx3.
Figura 17 arată arată potenţa MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) pe celule IGROV1, OVCAR3, NCI-H2110, A431-A3, şi SJSA-1, aşa cum este măsurată prin testul de citotoxicitate cu violet de genţiană.
Figura 18 arată cinetica creşterii tumorii pentru fiecare grup de şoareci CB17-SCID implantaţi cu NCI-H2110 (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de PBS, sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 1, 2,5, sau 5 mg/kg.
Figurile 19A şi 19B arată cinetica creşterii tumorii (Figura 19A) şi cinetica schim-bării greutăţii corporale (Figura 19B) pentru fiecare grup de şoareci purtători de tumori NSCLC PDx (LXFA-737) (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de vehicul (PBS), MORAb-003 la 5 mg/kg, sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg.
Figurile 20A şi 20B arată rapoartele volumului tumorii individual (Figura 20A) şi cinetica schimbării greutăţii corporale (Figura 20B) pentru fiecare grup de şoareci purtători de tumori cu cancer endometrial PDx (Endo-12961) (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de PBS, eribulină la 0,1 sau 3,2 mg/kg, sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg. Figurile 20C şi 20D arată cinetica creşterii tumorii (Figura 20C) şi cinetica schimbării greutăţii corporale (Figura 20D) pentru fiecare grup de şoareci purtători de tumori cu cancer endometrial PDx (Endo-10590) (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de PBS, eribulină la 0,1 sau 3,2 mg/kg, sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg.
Figura 21A arată colorarea imunohistochimică (IHC) a ţesutului tumoral la şoareci purtători de tumori TNBC PDx (OD-BRE-0631) cu un anticorp anti-IgG umană. Ţesuturile tumorale de la şoarecii trataţi cu o singură doză intravenoasă de ve-hicul (dreapta) sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg (stân-ga), au fost colectate şi colorate după 5 zile de la tratament. Figura 21B arată colorarea IHC a ţesutului tumoral la şoareci purtători de tumori TNBC PDx (OD-BRE-0631) cu un anticorp α-actină a muşchiului neted (SMA)-FITC. Ţesuturile tumorale de la şoarecii netrataţi au fost colectate cu 2 zile înainte de tratament (stânga), în timp ce ţesuturile tumorale de la şoarecii trataţi cu o singură doză intravenoasă de MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg au fost colectate după 5 zile de la tratament (dreapta). Figura 21C arată cineticile de creştere a tumorilor pentru fiecare grup de şoareci purtători de tumori TNBC PDx (OD-BRE-0631) (media grupului şi SEM) trataţi cu o singură doză intravenoasă de vehicul (PBS), sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg.
Figura 22 arată diferenţierea celulelor stem mezenchimale ale măduvei osoase umane (BM-MSC-uri) în cultură cu celule MKN-74 după tratamentul cu vehicul (PBS sau etanol), eribulină, MORAb-003, sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202), aşa cum este măsurată prin analiza citometriei în flux. Stro-1+/CD105+, CD34+/CD31-, şi NG2+ sunt markeri ai MSC-urilor, adipocitelor, şi pericitelor, respectiv.
Figura 23 arată analiza cursului în timp a ţesuturilor tumorale de la şoareci CB17-SCID implantaţi cu NCI-H2110 trataţi cu o singură doză intravenoasă de vehicul (PBS) sau MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) la 5 mg/kg, colorate cu un anticorp α-actină a muşchiului neted (SMA)-FITC. Ţesuturile tumorale au fost colectate şi colorate în ziua 0, şi în zilele 3, 5, 7 şi 9 post-tratament. Axa Y: % = [celule colorate numărate/celule totale numărate] ∗ 100. Axa X: ziua (celule totale numărate).
DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI
Compoziţiile şi metodele descrise pot fi înţelese cu mai multă uşurinţă prin re-ferire la următoarea descriere detaliată luată în legătură cu figurile însoţitoare, care fac parte din această descriere a invenţiei. Trebuie să se înţeleagă că compoziţiile şi me-todele descrise nu sunt limitate la compoziţiile şi metodele specifice descrise şi/sau prezentate în acest document. Domeniul de aplicare al invenţiei este definit de reven-dicări.
De la un capăt la altul al acestui text, descrierile se referă la compoziţii şi me-tode pentru utilizarea respectivelor compoziţii. Acolo unde descrierea descrie sau re-vendică o caracteristică sau o dezvăluire asociată cu o compoziţie, o astfel de carac-teristică sau dezvăluire este aplicabilă în mod egal metodelor pentru utilizarea respec-tivei compoziţii. La fel, acolo unde descrierea invenţiei descrie sau revendică o carac-teristică sau o dezvăluire asociată cu o metodă pentru utilizarea unei compoziţii, o astfel de caracteristică sau dezvăluire se aplică în mod egal compoziţiei.
Atunci când este exprimat un interval de valori, acesta include divulgări folosind orice valoare particulară din cadrul intervalului. Mai mult decât atât, referinţa la valorile declarate în intervale include fiecare şi toate valorile din cadrul acelui interval. Toate intervalele includ punctele lor finale şi pot fi combinate. Atunci când valorile sunt expri-mate ca aproximări, prin utilizarea antecedentului "aproximativ", se va înţelege că va-loarea particulară formează o altă dezvăluire. Referirea la o valoare numerică particu-lară include cel puţin acea valoare particulară, cu excepţia cazului în care contextul dictează în mod clar altfel. Utilizarea lui "sau" va însemna "şi/sau", cu excepţia cazului în care contextul specific al utilizării sale dictează altfel. În cazul în care o referinţă şi spe-cificaţia intră în conflict, specificaţia va avea prioritate.
Trebuie apreciat faptul că anumite caracteristici ale compoziţiilor şi metodelor făcute cunoscute, care sunt, pentru claritate, descrise în acest document în contextul dezvăluirilor separate, pot fi furnizate, de asemenea, în combinaţie într-o singură dez-văluire. Invers, diverse caracteristici ale compoziţiilor şi metodelor făcute cunoscute, care sunt descrise, pentru exprimare concisă, în contextul unei singure dezvăluiri, pot fi, de asemenea, descrise separat sau în orice subcombinaţie.
Definiţii
Diverşi termeni referitori la aspecte ale descrierii sunt folosiţi de la un capăt la celălalt al specificaţiei şi revendicărilor. Unor astfel de termeni urmează să le fie atribuită semnificaţia lor obişnuită în domeniul de specialitate, cu excepţia cazului în care se indică în alt fel. Alţi termeni definiţi în mod specific urmează să fie interpretaţi într-o manieră compatibilă cu definiţiile descrise în acest document.
Aşa cum se utilizează în acest document, formele de singular "o", "un" şi formele cu articol hotărât includ formele de plural, cu excepţia cazului în care contextul dictează în mod clar în alt fel.
Termenii "aproximativ" sau "în jur de" în contextul valorilor şi intervalelor nu-merice se referă la valori sau intervale care aproximează sau sunt apropiate de valorile sau intervalele enumerate, astfel încât descrierea invenţiei poate funcţiona aşa cum se intenţionează, cum ar fi a avea o cantitate dorită de acizi nucleici sau polipeptide într-un amestec de reacţie, aşa cum este evident pentru persoana de specialitate din expu-nerile conţinute în acest document. Acest lucru se datorează, cel puţin parţial, proprie-tăţilor care variază ale compoziţiilor de acid nucleic, vârstei, rasei, sexului, variaţiilor anatomice şi fiziologice şi inexactitudinii sistemelor biologice. Astfel, aceşti termeni cuprind valori dincolo de cele rezultate din eroarea sistematică.
Termenii "conjugat anticorp-medicament", "conjugat de anticorp", "conjugat", "imunoconjugat", şi "ADC" sunt utilizaţi în mod interschimbabil, şi se referă la un compus sau derivat al acestuia care este legat la un anticorp (de exemplu, un anticorp anti-FRA) şi este definit de formula generică: Ab-(L-D)p (Formula I), în care Ab = o porţiune indi-vizibilă de anticorp (adică, anticorp sau fragment de legare la antigen), L = o porţiune indivizibilă linker, D = o porţiune indivizibilă de medicament, şi p = numărul de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp.
Termenul "anticorp" este utilizat în sensul cel mai larg pentru a se referi la o moleculă de imunoglobulină care recunoaşte şi se leagă în mod specific la o ţintă, cum ar fi o proteină, polipeptidă, carbohidrat, polinucleotidă, lipidă, sau combinaţii ale celor de mai înainte prin cel puţin un situs de recunoaştere a antigenului în cadrul regiunii variabile a moleculei de imunoglobulină. Lanţul greu al unui anticorp este alcătuit dintr-un domeniu variabil al lanţului greu (VH) şi o regiune constantă a lanţului greu (CH). Lanţul uşor este alcătuit dintr-un domeniu variabil al lanţului uşor (VL) şi un domeniu constant al lanţului uşor (CL). În sensul acestei aplicaţii, domeniile variabile ale lanţului greu şi ale lanţului uşor mature cuprind, fiecare, trei regiuni de determinare a comple-mentarităţii (CDR1, CDR2 şi CDR3) în cadrul a patru regiuni cadru (FR1, FR2, FR3 şi FR4) dispuse de la capătul N-terminal până la capătul C-terminal: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 şi FR4. Un "anticorp" poate fi de origine naturală sau creat de om, cum ar fi anticorpii monoclonali produşi prin tehnologia convenţională a hibridomului. Termenul "anticorp" include anticorpi monoclonali de lungime completă şi anticorpi policlonali de lungime completă, precum şi fragmente de anticorpi cum ar fi Fab, Fab', F(ab')2, Fv, şi anticorpi cu lanţ unic. Un anticorp poate fi oricare dintre cele cinci clase majore de imunoglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG, şi IgM, sau subclasele acestora (de exemplu, izotipurile IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Termenul cuprinde suplimentar anticorpi umani, anticorpi chimerici, anticorpi umanizaţi şi orice moleculă de imunoglobulină mo-dificată care conţine un situs de recunoaştere a antigenului, atât timp cât demonstrează activitatea biologică dorită.
Termenul "anticorp monoclonal", aşa cum este utilizat în acest document, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie de anticorpi în mod substanţial omogeni, adică, anticorpii individuali care cuprind populaţia sunt identici, cu excepţia posibilelor mutaţii de origine naturală care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali sunt foarte specifici, fiind direcţionaţi împotriva unui singur epitop antigenic. În contrast, preparatele convenţionale de anticorp (policlonal) includ în mod obişnuit o multitudine de anticorpi direcţionaţi împotriva (sau specifici pentru) epitopi diferiţi. Modificatorul "mo-noclonal" arată caracterul anticorpului ca fiind obţinut dintr-o populaţie de anticorpi în mod substanţial omogenă, şi nu trebuie să fie interpretat ca necesitând producerea anticorpului prin orice metodă particulară. Pentru exemplificare, anticorpii monoclonali care urmează să fie utilizaţi în conformitate cu prezenta descriere a invenţiei pot fi realizaţi prin metoda hibridom care a fost descrisă mai întâi de către Kohler şi colab., (1975) Nature, 256: 495, sau pot fi realizaţi prin metode de ADN recombinant (a se ve-dea, de exemplu, brevetul de invenţie U.S. numărul 4.816.567). Anticorpii monoclonali pot fi izolaţi, de asemenea, din biblioteci de anticorpi fagi utilizând tehnicile descrise în Clackson şi colab., (1991) Nature, 352: 624-8, şi Marks şi colab., (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-97, pentru exemplificare.
Anticorpii monoclonali descrişi în acest document includ în mod specific anti-corpi "chimerici" în care o porţiune a lanţului greu şi/sau uşor este identică sau omologă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o specie particulară sau care aparţin unei clase sau subclase particulare de anticorpi, în timp ce restul lanţului (lan-ţurilor) este identic cu, sau omolog cu secvenţele corespunzătoare în anticorpii derivaţi de la o altă specie sau care aparţin unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmentele unor astfel de anticorpi, atât timp cât acestea leagă în mod specific anti-genul ţintă şi/sau prezintă activitatea biologică dorită.
Termenul "anticorp uman", aşa cum este utilizat în acest document, se referă la un anticorp produs de un om sau un anticorp având o secvenţă de aminoacizi a unui anticorp produs de un om.
Termenul "anticorp chimeric", aşa cum este utilizat în acest document, se referă la anticorpi în care secvenţa de aminoacizi a moleculei de imunoglobulină este derivată de la două sau mai multe specii. În unele cazuri, regiunile variabile atât ale lanţurilor grele cât şi uşoare corespund regiunilor variabile ale anticorpilor derivaţi de la o specie cu specificitatea, afinitatea şi activitatea dorite, în timp ce regiunile constante sunt omologe cu anticorpii derivaţi de la o altă specie (de exemplu, om) pentru a minimiza un răspuns imun în ultima specie.
Aşa cum este utilizat în acest document, termenul "anticorp umanizat" se referă la forme de anticorpi care conţin secvenţe de la anticorpi non-umani (de exemplu, mu-rini), precum şi anticorpi umani. Astfel de anticorpi sunt anticorpi chimerici care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulina non-umană. În general, anticorpul uma-nizat va cuprinde în mod substanţial toate domeniile variabile dintre cel puţin unul şi, în mod tipic, două, în care toate sau în mod substanţial toate buclele hipervariabile co-respund cu cele ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau în mod substanţial toate regiunile cadru (FR) sunt cele ale unei secvenţe de imunoglobulină umană. Anti-corpul umanizat va cuprinde, opţional, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă a imunoglobulinei (Fc), în mod tipic aceea a unei imunoglobuline umane. Anticorpul umanizat poate fi modificat în continuare prin substituţia reziduurilor, în ori-care dintre regiunea cadru Fv şi/sau în interiorul reziduurilor non-umane înlocuite pentru a rafina şi optimiza specificitatea, afinitatea şi/sau activitatea anticorpului.
Termenul "fragment de legare la antigen" sau "porţiune de legare la antigen" a unui anticorp, aşa cum este utilizat în acest document, se referă la unul sau mai multe fragmente ale unui anticorp care păstrează capacitatea de a se lega în mod specific la un antigen (de exemplu, FRA). Fragmentele de legare la antigen păstrează preferabil, de asemenea, capacitatea de a se internaliza într-o celulă care exprimă antigenul. În unele descrieri, fragmentele de legare la antigen păstrează, de asemenea, activitatea efectoare imună. A fost demonstrat faptul că fragmente ale unui anticorp de lungime completă pot îndeplini funcţia de legare la antigen a unui anticorp de lungime completă. Exemplele de fragmente de legare cuprinse în cadrul termenului "fragment de legare la antigen" sau "porţiune de legare la antigen" a unui anticorp includ (i) un fragment Fab, un fragment monovalent care este constituit din domeniile VL, VH, CL, şi CH1; (ii) un fragment F(ab')2, un fragment bivalent care cuprinde două fragmente Fab legate printr-o punte disulfură în regiunea balama; (iii) un fragment Fd care este constituit din domeniile VH şi CH1; (iv) un fragment Fv care este constituit din domeniile VL şi VH ale unui singur braţ al unui anticorp; (v) un fragment dAb, care cuprinde un singur domeniu variabil, de exemplu, un domeniu VH (a se vedea, de exemplu, Ward şi colab., (1989) Nature, 341: 544-6; şi Winter şi colab., WO 90/05144); şi (vi) o regiune de determinare a comple-mentarităţii (CDR) izolată. Mai mult decât atât, cu toate că cele două domenii ale frag-mentului Fv, VL şi VH, sunt codificate de gene separate, acestea pot fi unite, folosind metode recombinante, printr-un linker sintetic care le permite să fie realizate ca un singur lanţ proteic în care regiunile VL şi VH se împerechează pentru a forma molecule monovalente (cunoscute sub numele de Fv cu un singur lanţ (scFv)). A se vedea, de exemplu, Bird şi colab., (1988) Science, 242: 423-6; şi Huston şi colab., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83. Se intenţionează ca astfel de anticorpi cu un singur lanţ să fie cuprinşi, de asemenea, în cadrul termenului "fragment de legare la antigen" sau "porţiune de legare la antigen" a unui anticorp, şi sunt cunoscuţi în domeniu ca un tip exemplar de fragment de legare care se poate internaliza în celule la legare. A se vedea, de exemplu, Zhu şi colab., (2010) 9: 2131-41; He şi colab., (2010) J. Nucl. Med., 51: 427-32; şi Fitting şi colab., (2015) MAbs 7: 390 - 402. Aşa cum se descrie în acest document, moleculele scFv pot fi încorporate într-o proteină de fuziune. Sunt cuprinse, de asemenea, alte forme de anticorpi cu lanţ unic, cum ar fi diacorpii. Diacorpii sunt anticorpi bivalenţi, bispecifici, în care domeniile VH şi VL sunt exprimate pe un singur lanţ polipeptidic, dar folosind un linker care este prea scurt pentru a permite împerecherea între cele două domenii pe acelaşi lanţ, forţând astfel domeniile să se împerecheze cu domenii complementare ale altui lanţ şi creând două situsuri de legare la antigen (a se vedea de exemplu, Holliger şi colab., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-8; şi Poljak şi colab., (1994) Structure, 2: 1121-3). Fragmentele de legare la antigen sunt obţinute folosind tehnici convenţionale cunoscute celor care au pregătire în domeniul de specialitate, şi fragmentele de legare sunt examinate pentru utilitate (de exemplu, afi-nitate de legare, internalizare) în acelaşi mod ca şi anticorpii intacţi. Fragmentele de legare la antigen pot fi preparate prin scindarea proteinei intacte, de exemplu, prin protează sau scindare chimică.
"Internalizare", aşa cum este utilizat în acest document cu referire la un anticorp sau un fragment de legare la antigen, se referă la un anticorp sau un fragment de legare la antigen care este capabil de a fi preluat prin membrana bistratului lipidic al celulei la un compartiment intern (adică "internalizat") la legarea la celulă, preferabil într-un com-partiment de degradare în celulă. Pentru exemplificare, un anticorp anti-FRA de inter-nalizare este unul care poate fi luat în celulă după legarea la FRA pe membrana celulei.
Termenul "receptorul alfa al folatului" sau "FRA", aşa cum este utilizat în acest document, se referă la orice formă nativă de FRA uman. Termenul cuprinde FRA de lungime completă (de exemplu, secvenţa de referinţă NCBI: NP_000793; ID. SECV. NR.: 19), precum şi orice formă de FRA uman care rezultă din procesarea celulară. Termenul cuprinde, de asemenea, variante de origine naturală ale FRA, incluzând, dar fără a se limita la, variantele de îmbinare, variantele alelice, şi izoformele. FRA poate fi izolat de la un om, sau poate fi produs recombinant sau prin metode sintetice.
Termenul "anticorp anti-FRA" sau "anticorp care se leagă în mod specific la FRA" se referă la orice formă de anticorp sau fragment al acestuia care se leagă în mod specific la FRA, şi cuprinde anticorpi monoclonali (inclusiv anticorpi monoclonali de lungime completă), anticorpi policlonali, şi fragmente de anticorpi funcţionali din punct de vedere biologic atât timp cât aceştia se leagă în mod specific la FRA. Preferabil, anticorpul anti-FRA utilizat în ADC-urile făcute cunoscute în acest document este un anticorp de internalizare sau fragment de anticorp de internalizare. MORAb-003 este un anticorp anti-FRA uman de internalizare cu titlu de exemplu. Aşa cum sunt utilizaţi în acest document, termenii "specific", "se leagă în mod specific" şi "leagă în mod specific" se referă la legarea selectivă a anticorpului la epitopul antigenului ţintă. Anticorpii pot fi testaţi pentru specificitatea legării prin compararea legării la antigenul corespunzător cu legarea la antigenul irelevant sau amestecul de antigen într-un set dat de condiţii. Dacă anticorpul se leagă la antigenul corespunzător cu de cel puţin 2, 5, 7 şi preferabil 10 ori mai multă afinitate decât la antigenul irelevant sau amestecul de antigen, atunci acesta este considerat că este specific. Aşa cum se descrie în acest document, un anticorp specific este unul care leagă doar antigenul FRA, dar nu se leagă (sau prezintă o legare minimă) la alţi antigeni.
Termenul "receptorul factorului de creştere epidermică uman 2", "her2", sau "her2/neu", aşa cum este utilizat în acest document, se referă la orice formă nativă de her2 uman. Termenul cuprinde her2 de lungime completă (de exemplu, secvenţa de referinţă NCBI: NP_004439.2; ID. SECV. NR.: 21), precum şi orice formă de her2 uman care rezultă din procesarea celulară. Termenul cuprinde, de asemenea, variante de origine naturală ale her2, incluzând, dar fără a se limita la, variantele de îmbinare, va-riantele alelice, şi izoformele. Her2 poate fi izolat de la om, sau poate fi produs recom-binant sau prin metode sintetice.
Termenul "anticorp anti-her2" sau "anticorp care se leagă în mod specific la her2" se referă la orice formă de anticorp sau fragment al acestuia care se leagă în mod specific la her2, şi cuprinde anticorpi monoclonali (inclusiv anticorpi monoclonali de lungime completă), anticorpi policlonali, şi fragmente de anticorpi funcţionali din punct de vedere biologic atât timp cât aceştia se leagă în mod specific la her2. Brevetul de invenţie U.S. nr. 5.821.337 oferă secvenţe de legare la her2 cu titlu de exemplu, inclusiv secvenţe de anticorp anti-her2 cu titlu de exemplu. Preferabil, anticorpul anti-her2 utilizat în ADC-urile făcute cunoscute în acest document este un anticorp de internalizare sau fragment de anticorp de internalizare. Trastuzumab este un anticorp anti-her2 uman de internalizare cu titlu de exemplu.
Termenul "epitop" se referă la porţiunea unui antigen capabilă să fie recunos-cută şi legată în mod specific de un anticorp. Atunci când antigenul este o polipeptidă, epitopii pot fi formaţi din aminoacizi continui sau aminoacizi necontinui juxtapuşi prin plierea terţiară a polipeptidei. Epitopul legat de un anticorp poate fi identificat folosind orice tehnică de mapare a epitopului cunoscută în domeniul de specialitate, inclusiv cristalografia cu raze X pentru identificarea epitopului prin vizualizarea directă a complexului antigen-anticorp, precum şi monitorizarea legării anticorpului la fragmente ale antigenului sau variaţii care au suferit mutaţie ale antigenului, sau monitorizarea accesibilităţii la solvent a diferitelor părţi ale anticorpului şi ale antigenului. Strategii cu titlu de exemplu utilizate pentru a mapa epitopii de anticorpi includ, dar nu sunt limitate la, scanare oligo-peptidică bazată pe matrice, proteoliză limitată, mutageneză direcţionată spre situs, mapare de mutageneză cu randament ridicat, schimb hidrogen-deuteriu, şi spectrometrie de masă (a se vedea, de exemplu, Gershoni et al. şi colab., (2007) 21: 145-56; şi Hager-Braun şi Tomer, (2005) Expert Rev. Proteomics, 2: 745-56).
Legarea competitivă şi legarea epitopului (epitope binning) pot fi utilizate, de asemenea, pentru a determina anticorpii care partajează epitopi identici sau care se suprapun. Legarea competitivă poate fi evaluată utilizând o analiză de blocare încrucişată, cum ar fi analiza descrisă în "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow şi Lane (prima ediţie, 1988, ediţia a II-a, 2014). Aşa cum se descrie în acest document, legarea competitivă este identificată atunci când un anticorp de test sau o proteină de legare reduce legarea unui anticorp de referinţă sau a unei proteine de legare de referinţă la un antigen ţintă cum ar fi FRA sau her2 (de exemplu, o proteină de legare care cuprinde CDR-uri şi/sau domenii variabile selectate dintre cele identificate în Tabelele 2, 4 şi 6), cu cel puţin aproximativ 50% în analiza de blocare încrucişată (de exemplu, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5%, sau mai mult, sau orice procent între ele), şi/sau invers. Aşa cum se descrie în acest document, legarea competitivă se poate datora epitopilor partajaţi sau similari (de exemplu, care se suprapun parţial), sau se poate datora obstacolelor sterice acolo unde anticorpii sau proteinele de legare se leagă la epitopii din apropiere. A se vedea, de exemplu, Tzartos, Methods in Molecular Biology (Morris, ed. (1998) vol. 66, p. 55 - 66). Aşa cum se descrie în acest document, legarea competitivă poate fi utilizată pentru a sorta grupuri de proteine de legare care partajează epitopi similari, de exemplu, cei care concurează pentru legare pot fi "grupaţi" ("binned") ca un grup de proteine de legare care au epitopi care se suprapun sau în apropiere, în timp ce cei care nu concurează sunt plasaţi într-un grup separat de proteine de legare care nu au epitopi care se suprapun sau în apropiere.
Termenul "kon" sau "ka" se referă la constanta vitezei de asociere pentru aso-cierea unui anticorp la antigen pentru a forma complexul anticorp/antigen. Viteza poate fi determinată utilizând analize standard, cum ar fi o analiză Biacore sau ELISA.
Termenul "koff" sau "kd" se referă la constanta vitezei de disociere pentru diso-cierea unui anticorp din complexul anticorp/antigen. Viteza poate fi determinată utilizând analize standard, cum ar fi o analiză Biacore sau ELISA.
Termenul "KD" se referă la constanta de disociere la echilibru a unei interacţiuni anticorp-antigen particulare. KD este calculată prin ka/kd. Viteza poate fi determinată utilizând analize standard, cum ar fi o analiză Biacore sau ELISA.
Termenul "p" sau "raport anticorp:medicament" sau "raport medicament-anti-corp" sau "DAR" se referă la numărul de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp, adică la încărcarea medicamentului, sau la numărul de porţiuni indivizibile -L-D per anticorp sau fragment de legare la antigen (Ab) în ADC-urile cu Formula I. În compoziţiile care cuprind mai multe copii ale ADC-urilor cu Formula I, "p" se referă la numărul mediu de porţiuni indivizibile -L-D per anticorp sau fragment de legare la antigen, menţionat, de asemenea, ca încărcare medie a medicamentului.
Un "linker" sau "porţiune indivizibilă linker" este orice porţiune indivizibilă chimică ce este capabilă să unească în mod covalent un compus, de obicei o porţiune indivizi-bilă de medicament cum ar fi un agent chimioterapeutic, la o altă porţiune indivizibilă cum ar fi o porţiune indivizibilă de anticorp. Linkerii pot fi sensibili la, sau în mod sub-stanţial rezistenţi la scindarea indusă de acid, scindarea indusă de peptidază, scindarea pe bază de lumină, scindarea indusă de esterază, şi/sau scindarea legăturii disulfură, în condiţiile în care compusul sau anticorpul rămâne activ.
Termenul "agent" este utilizat în acest document pentru a se referi la un compus chimic, un amestec de compuşi chimici, o macromoleculă biologică, sau un extract realizat din materiale biologice. Termenii "agent terapeutic", "medicament" sau "porţiune indivizibilă de medicament" se referă la un agent care este capabil să moduleze un proces biologic şi/sau are activitate biologică.
Termenul "agent chimioterapeutic" sau "agent anti-cancer" este utilizat în acest document pentru a se referi la toţi compuşii chimici care sunt eficienţi în tratarea can-cerului indiferent de mecanismul de acţiune. Inhibarea metastazelor sau angiogenezei este în mod frecvent o proprietate a unui agent chimioterapeutic. Exemplele care nu sunt limitative de agenţi chimioterapeutici includ agenţi de alchilare, pentru exemplifi-care, muştaruri de azot, compuşi de etilenimină, şi sulfonaţi de alchil; antimetaboliţi, pentru exemplificare, antagonişti ai acidului folic, purinei sau pirimidinei; agenţi anti-mitotici, pentru exemplificare, agenţi anti-tubulină cum ar fi eribulina sau mesilatul de eribulină (Halaven™) sau derivaţii acestora, alcaloizi vinca, şi auristatine; antibiotice citotoxice; compuşi care deteriorează sau interferează cu exprimarea sau replicarea ADN-ului, pentru exemplificare, lianţi la nivelul cavităţii mici a ADN; şi antagonişti ai receptorului factorului de creştere. În plus, agenţii chimioterapeutici includ anticorpi, molecule biologice, şi molecule mici. Un agent chimioterapeutic poate fi un agent cito-toxic sau citostatic. Termenul "agent citostatic" se referă la un agent care inhibă sau suprimă creşterea celulară şi/sau multiplicarea celulelor.
Termenul "agent citotoxic" se referă la o substanţă care cauzează moartea ce-lulelor în primul rând prin interferenţa cu o activitate de exprimare a celulei şi/sau cu funcţionarea unei celule. Exemplele de agenţi citotoxici includ, dar nu se limitează la, agenţi anti-mitotici, cum ar fi eribulină, auristatine (de exemplu, monometil auristatină E (MMAE), monometil auristatină F (MMAF)), maitansinoide (de exemplu, maitansine), dolastatine, duostatine, criptoficine, alcaloizi vinca (de exemplu, vincristină, vinblastină), taxani, taxoli, şi colchicine; antracicline (de exemplu, daunorubicină, doxorubicină, di-hidroxiantracindionă); antibiotice citotoxice (de exemplu, mitomicine, actinomicine, duocarmicine (de exemplu, CC-1065), auromicine, duomicine, calicheamicine, endo-micine, fenomicine); agenţi de alchilare (de exemplu, cisplatină); agenţi de intercalare (de exemplu, bromură de etidiu); inhibitori de topoizomerază (de exemplu, etopozid, tenopozid); radioizotopi, cum ar fi At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 sau 213, P32, şi izotopi radioactivi ai luteţiului (de exemplu, Lu177); şi toxine de origine bacteriană, fungică, vegetală sau animală (de exemplu, ricină (de exemplu, lanţul A de ricină), toxina difterică, exotoxina Pseudomonas A (de exemplu, PE40), endotoxină, mitogelină, combrestatină, restrictocină, gelonină, alfa-sarcină, abrină (de exemplu, lanţ A de abrină), modeccină (de exemplu, lanţ A de modeccină), curicină, crotină, inhibitor de Sapaonaria officinalis, glucocorticoid).
Termenul "eribulină", aşa cum este utilizat în acest document, se referă la un analog sintetic al halicondrinei B, un compus macrociclic care a fost izolat iniţial din buretele marin Halichondria okadais. Termenul "porţiune indivizibilă de medicament de eribulină" se referă la componenta unui ADC care are structura eribulinei, şi este ataşată la linkerul ADC-ului prin intermediul aminei sale C-35. Eribulina este un inhibitor al di-namicii microtubulilor, despre care se crede că se leagă la tubulină şi induce oprirea ciclului celular în faza G2/M prin inhibarea ansamblului fusului mitotic. Termenul "mesilat de eribulină" se referă la sarea de mesilat a eribulinei, care este comercializată sub denumirea comercială Halaven™.
Termenul "omolog" se referă la o moleculă care prezintă omologie faţă de o altă moleculă, prin faptul că are, pentru exemplificare, secvenţe de reziduuri chimice care sunt aceleaşi sau similare la poziţiile corespunzătoare.
Termenul "inhibă" sau "inhibare a", aşa cum este utilizat în acest document, înseamnă reducerea cu o cantitate măsurabilă şi poate include, dar nu necesită pre-venire sau inhibare completă.
Termenul "ţintă-negativ" sau "antigen-negativ ţintă" se referă la absenţa ex-primării antigenului ţintă de către o celulă sau un ţesut. Termenul "ţintă-pozitiv" sau "antigen-pozitiv ţintă" se referă la prezenţa exprimării antigenului ţintă. Pentru exem-plificare, o celulă sau o linie de celule care nu exprimă un antigen ţintă poate fi descrisă ca ţintă-negativă, în timp ce o celulă sau o linie de celule care exprimă un antigen ţintă poate fi descrisă ca fiind ţintă-pozitivă.
Termenul "ucidere a vecinătăţilor" sau "efect asupra vecinătăţilor" se referă la uciderea celulelor ţintă-negative în prezenţa celulelor ţintă-pozitive, unde uciderea celulelor ţintă-negative nu este observată în absenţa celulelor ţintă-pozitive. Contactul celulă-la-celulă, sau cel puţin proximitatea între celulele ţintă-pozitive şi ţintă-negative, permite uciderea vecinătăţilor. Acest tip de ucidere se distinge de "ucidere departe de ţintă," care se referă la uciderea fără discriminare a celulelor ţintă-negative. "Uciderea departe de ţintă" poate fi observată în absenţa celulelor ţintă-pozitive.
Termenul "cancer" se referă la starea fiziologică la mamifere în care o populaţie de celule este caracterizată de creştere celulară nereglementată. Exemplele de cancer includ, dar nu sunt limitate la, carcinom, limfom, blastom, sarcom, şi leucemie. Exemple mai particulare de astfel de cancere includ cancerul cu celule scuamoase, cancerul pulmonar cu celule mici, cancerul pulmonar cu celule non-mici, adenocarcinomul pul-monar, carcinomul scuamos al plămânului, cancerul peritoneului, cancerul hepatoce-lular, cancerul gastro-intestinal, cancerul pancreatic, glioblastomul, cancerul de col uterin, cancerul ovarian, cancerul de ficat, cancerul de vezică urinară, hepatomul, cancerul de sân (de exemplu, cancerul de sân triplu negativ), osteosarcomul, melano-mul, cancerul de colon, cancerul colorectal, cancerul endometrial (de exemplu, seros) sau uterin, carcinomul glandei salivare, cancerul de rinichi, cancerul de ficat, cancerul de prostată, cancerul vulval, cancerul tiroidian, carcinomul hepatic, şi diferite tipuri de cancer de cap şi gât. Cancerul de sân triplu negativ se referă la cancerul de sân care este negativ pentru exprimarea genelor pentru receptorul de estrogen (ER), receptorul de progesteron (PR), sau Her2/neu.
Termenii "tumoră" şi "neoplasm" se referă la orice masă de ţesut care rezultă din creşterea sau proliferarea excesivă a celulelor, fie benignă, fie malignă, inclusiv leziuni precanceroase.
Termenii "celulă canceroasă" şi "celulă tumorală" se referă la celule individuale sau la populaţia totală de celule derivate dintr-o tumoră, incluzând atât celule non-tu-morigene, cât şi celule stem canceroase. Aşa cum este utilizat în acest document, termenul "celulă tumorală" va fi modificat prin termenul "non-tumorigen" atunci când se referă exclusiv la acele celule tumorale care sunt lipsite de capacitatea de a se reînnoi şi diferenţia pentru a distinge acele celule tumorale de celulele stem canceroase.
Termenii "subiect" şi "pacient" sunt folosiţi în mod interschimbabil în acest do-cument pentru a se referi la orice animal, cum ar fi orice mamifer, incluzând, dar fără a se limita la, oameni, primate non-umane, rozătoare, şi altele asemenea. Aşa cum se descrie în acest document, mamiferul este un şoarece. Aşa cum se descrie în acest document, mamiferul este un om.
Termenul "co-administrare" sau administrare "în combinaţie cu" unul sau mai mulţi agenţi terapeutici include administrarea concurentă şi consecutivă în orice ordine.
O "compoziţie farmaceutică" se referă la un preparat care este într-o astfel de formă încât să permită administrarea şi să furnizeze ulterior activitatea biologică inten-ţionată a ingredientului activ (ingredientelor active) şi/sau să obţină un efect terapeutic, şi care nu conţine componente suplimentare care sunt inacceptabil de toxice pentru un subiect căruia i s-ar administra formularea. Compoziţia farmaceutică poate fi sterilă.
Un "excipient farmaceutic" cuprinde un material cum ar fi un adjuvant, un transportor, agenţi de ajustare a pH-ului şi de tamponare, agenţi de ajustare a tonicităţii, agenţi de umectare, conservanţi, şi alţii asemenea.
"Acceptabil din punct de vedere farmaceutic" înseamnă aprobat sau care poate fi aprobat de o agenţie de reglementare a guvernului federal sau a unui guvern de stat, sau listat în Farmacopeia SUA sau în altă farmacopeie recunoscută în general, pentru utilizare la animale, şi mai în particular la oameni.
O "cantitate eficientă" dintr-un ADC aşa cum este făcută cunoscută în acest document este o cantitate suficientă pentru a îndeplini un scop declarat în mod specific, pentru exemplificare pentru a produce un efect terapeutic după administrare, cum ar fi o reducere a ratei de creştere a tumorii sau a volumului tumorii, o reducere a unui simp-tom al cancerului, sau câteva alte indicii ale eficacităţii tratamentului. O cantitate efici-entă poate fi determinată într-o manieră de rutină în raport cu scopul declarat. Termenul "cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic" se referă la o cantitate dintr-un ADC eficientă pentru tratarea unei boli sau tulburări la un subiect. În cazul cancerului, o cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic de ADC poate reduce numărul de celule canceroase, poate reduce dimensiunea tumorii, poate inhiba (de exemplu, în-cetineşte sau opreşte) metastaza tumorii, poate inhiba (de exemplu, încetineşte sau opreşte) creşterea tumorii, şi/sau poate ameliora unul sau mai multe simptome. O "cantitate eficientă din punct de vedere profilactic" se referă la o cantitate eficientă, la dozele şi pentru perioadele de timp necesare, pentru a obţine rezultatul profilactic dorit. De obicei, din moment ce o doză profilactică este utilizată la subiecţi înainte de boală sau într-o etapă timpurie a bolii, cantitatea eficientă din punct de vedere profilactic va fi mai mică decât cantitatea eficientă din punct de vedere terapeutic.
Aşa cum se utilizează în acest document, "a trata" sau "terapeutic" şi termenii asociaţi din punct de vedere gramatical, se referă la orice îmbunătăţire a oricărei con-secinţe a bolii, cum ar fi supravieţuirea prelungită, morbiditate mai mică, şi/sau o mic-şorare a efectelor secundare care sunt produsele secundare ale unei modalităţi tera-peutice alternative. Aşa cum este recunoscut cu uşurinţă în domeniul de specialitate, eradicarea completă a bolii este o preferinţă, chiar dacă nu este o cerinţă pentru un act de tratament. "Tratament" sau "tratare", aşa cum se utilizează în acest document, se referă la administrarea către un subiect, de exemplu, un pacient, a unui ADC descris. Tratamentul poate fi pentru a vindeca, restaura, ameliora, uşura, altera, remedia, ameliora, a fi un paliativ, a îmbunătăţi sau afecta tulburarea, simptomele tulburării sau predispoziţia către tulburare, de exemplu, un cancer.
Aşa cum se descrie în acest document, este utilizat un ADC etichetat. "Etiche-tele" adecvate includ radionuclizi, enzime, substraturi, cofactori, inhibitori, porţiuni in-divizibile fluorescente, porţiuni indivizibile chimioluminiscente, particule magnetice, şi altele asemenea.
Prin "proteină", aşa cum se utilizează în acest document, sunt înţeleşi cel puţin doi aminoacizi ataşaţi în mod covalent. Termenul cuprinde polipeptide, oligopeptide şi peptide. Aşa cum se descrie în acest document, cei doi sau mai mulţi aminoacizi ataşaţi în mod covalent sunt ataşaţi printr-o legătură peptidică. Proteina poate fi făcută din aminoacizi de origine naturală şi legături peptidice, pentru exemplificare atunci când proteina este fabricată recombinant utilizând sisteme de exprimare şi celule gazdă. Alternativ, proteina poate include aminoacizi sintetici (de exemplu, homofenilalanină, citrulină, ornitină, şi norleucină), sau structuri peptidomimetice, adică "analogi de peptide sau proteine", cum ar fi peptoizii. Peptoizii sunt o clasă de peptidomimetice cu titlu de exemplu ale căror lanţuri laterale sunt anexate la atomul de azot al structurii principale a peptidei, mai degrabă decât la atomii de carbon α (aşa cum aceştia sunt în aminoacizi), şi au legare la hidrogen diferită şi caracteristici conformaţionale diferite în comparaţie cu peptidele (a se vedea, de exemplu, Simon şi colab., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367). Ca atare, peptoizii pot fi rezistenţi la proteoliză sau alte condiţii fiziologice sau de depozitare, şi pot fi eficienţi la penetrarea membranelor celulare. Astfel de aminoacizi sintetici pot fi încorporaţi în particular atunci când anticorpul este sintetizat in vitro prin metode convenţionale bine cunoscute în domeniul de specialitate. În plus, poate fi uti-lizată orice combinaţie de reziduuri/structuri peptidomimetice, sintetice şi de origine naturală. "Aminoacid" include, de asemenea, reziduuri de aminoacizi, cum ar fi prolina şi hidroxiprolina. Aminoacidul "grupa R" sau "lanţ lateral" poate fi fie în configuraţia (L), fie în configuraţia (S). Aşa cum se descrie în acest document, aminoacizii sunt în confi-guraţia (L) sau (S).
O "proteină recombinantă" este o proteină făcută utilizând tehnici recombinante utilizând orice tehnici şi metode cunoscute în domeniul de specialitate, adică prin ex-primarea unui acid nucleic recombinant. Metodele şi tehnicile pentru producerea pro-teinelor recombinate sunt bine cunoscute în domeniul de specialitate.
O proteină "izolată" nu este acompaniată de cel puţin o parte din materialul cu care aceasta este asociată în mod normal în starea sa naturală, pentru exemplificare constituind cel puţin aproximativ 5% sau cel puţin aproximativ 50% din greutatea pro-teinei totale dintr-o probă dată. Se înţelege că proteina izolată poate constitui de la 5 până la 99,9% în greutate din conţinutul total de proteine, în funcţie de circumstanţe. Pentru exemplificare, proteina poate fi făcută la o concentraţie semnificativ mai mare prin utilizarea unui promotor inductibil sau promotor de exprimare ridicată, astfel încât proteina este făcută la niveluri de concentraţie crescute. Definiţia include producerea unui anticorp într-o mare varietate de organisme şi/sau celule gazdă care sunt cunos-cute în domeniul de specialitate.
Pentru secvenţele de aminoacizi, identitatea şi/sau similaritatea secvenţei pot fi determinate folosind tehnici standard cunoscute în domeniul de specialitate, incluzând, dar fără a se limita la, algoritmul de identitate locală a secvenţei al lui Smith şi Waterman, (1981) Adv. Appl. Math., 2: 482, algoritmul de aliniere de identitate a sec-venţei al lui Needleman şi Wunsch, (1970) J. Mol. Biol., 48: 443, metoda de căutare pentru similaritate a lui Pearson şi Lipman, (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 2444, implementările computerizate ale acestor algoritmi (GAP, BESTFIT, FASTA, şi TFASTA în pachetul software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), programul de secvenţă Best Fit descris de Devereux şi colab., (1984) Nucl. Acid Res., 12: 387-95, preferabil folosind setările implicite, sau prin in-specţie. Preferabil, identitatea procentuală este calculată prin FastDB pe baza urmă-torilor parametri: penalizare de nepotrivire de 1; penalizare de spaţiu de 1; penalizare pentru dimensiunea spaţiului de 0,33; şi penalizarea de unire de 30 ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, p. 127 - 149 (1988), Alan R. Liss, Inc).
Un exemplu de un algoritm util este PILEUP. PILEUP creează o aliniere multiplă de secvenţă dintr-un grup de secvenţe conexe utilizând alinieri progresive, în pereche. Poate, de asemenea, să reprezinte grafic un arbore care arată relaţiile de legătură de grupare utilizate pentru a crea alinierea. PILEUP foloseşte o simplificare a metodei de aliniere progresivă a lui Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol., 35: 351-60; metoda este similară cu cea descrisă de Higgins şi Sharp, (1989) CABIOS, 5: 151-3. Parametrii PILEUP utili includ o greutate implicită a spaţiului de 3,00, o greutate implicită a lungimii spaţiului de 0,10, şi spaţii finale ponderate.
Un alt exemplu de algoritm util este algoritmul BLAST, descris în: Altschul şi colab., (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-10; Altschul şi colab., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-402; şi Karin şi colab., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-87. Un program BLAST deosebit de util este programul WU-BLAST-2 care a fost obţinut din Altschul şi colab., (1996) Methods in Enzymology, 266: 460-80. WU-BLAST-2 utilizează mai mulţi parametri de căutare, dintre care cei mai mulţi sunt setaţi la valorile implicite. Parametrii reglabili sunt setaţi cu următoarele valori: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = II. Parametrii HSP S şi HSP S2 sunt valori dinamice şi sunt stabiliţi de programul însuşi, în funcţie de compoziţia secvenţei particulare şi compoziţia bazei de date particulare în raport cu care se caută secvenţa de interes; cu toate acestea, valorile pot fi ajustate pentru a creşte sensibilitatea.
Un algoritm suplimentar util este BLAST spaţiat, aşa cum este raportat de Altschul şi colab., (1993) Nucl. Acids Res., 25: 3389-402. BLAST spaţiat foloseşte sco-ruri de substituţie BLOSUM-62; parametrul T de prag setat la 9; metoda cu două lovituri pentru a declanşa extensii fără spaţii, încarcă lungimi de spaţiu de k cu un cost de 10+k; Xu setat la 16, şi Xg setat la 40 pentru etapa de căutare în baza de date şi la 67 pentru etapa de ieşire a algoritmilor. Alinierile spaţiate sunt declanşate de un scor care cores-punde la aproximativ 22 de biţi.
În general, omologia, similaritatea, sau identitatea aminoacizilor între proteinele făcute cunoscute în acest document şi variantele acestora, inclusiv variante ale FRA, variante ale her2, variante ale secvenţelor de tubulină, şi variante ale domeniilor vari-abile de anticorpi (inclusiv CDR-uri variante individuale), sunt de cel puţin 80% cu sec-venţele descrise în acest document, şi mai de obicei cu omologii sau identităţi de preferinţă crescătoare de cel puţin 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, şi aproape 100% sau 100%.
Într-un mod similar, "procent (%) de identitate de secvenţă de acid nucleic" în raport cu secvenţa de acid nucleic a anticorpilor şi a altor proteine identificate în acest document este definit ca procentul de reziduuri de nucleotide dintr-o secvenţă candidat care sunt identice cu reziduurile de nucleotide din secvenţa de codificare a proteinei de legare la antigen. O metodă specifică utilizează modulul BLASTN al WU-BLAST-2 setat la parametrii impliciţi, cu overlap span şi overlap fraction setaţi la 1 şi 0,125, respectiv.
În timp ce situsul sau regiunea pentru introducerea unei variaţii a secvenţei de aminoacizi este predeterminat, mutaţia în sine nu trebuie să fie predeterminată. Pentru exemplificare, pentru a optimiza performanţa unei mutaţii la un situs dat, poate fi efec-tuată mutageneza aleatorie la codonul sau regiunea ţintă şi variantele CDR ale proteinei de legare la antigen exprimate sunt evaluate pentru combinaţia optimă a activităţii do-rite. Tehnicile pentru realizarea mutaţiilor de substituţie la situsurile predeterminate din ADN având o secvenţă cunoscută sunt bine cunoscute, pentru exemplificare, mutage-neza cu primer MI3 şi mutageneza PCR.
Conjugaţi anticorp-medicament
Compuşii din prezenta descriere a invenţiei îi includ pe cei cu activitate anti-cancer. În particular, compuşii include o porţiune indivizibilă de anticorp (incluzând un fragment de legare la antigen al acestuia) conjugată (adică, ataşată covalent de către un linker) la o porţiune indivizibilă de medicament, unde porţiunea indivizibilă de medica-ment, atunci când nu este conjugată la o porţiune indivizibilă de anticorp, are un efect citotoxic sau citostatic. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament prezintă citotoxicitate redusă sau nicio citotoxicitate atunci când este legată într-un conjugat, dar revine la citotoxicitate după scindarea de linker şi porţiunea indi-vizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament prezintă o ucidere redusă sau nicio ucidere a vecinătăţilor atunci când este legată într-un conjugat (de exemplu, utilizând un linker non-scindabil), dar prezintă o ucidere a vecinătăţilor crescută după scindarea dintr-un conjugat (de exemplu, un conjugat având o porţiune indivizibilă scindabilă Val-Cit care poate fi scindată).
Dezvoltarea şi producţia unui ADC pentru utilizare ca un agent terapeutic uman, de exemplu, ca un agent oncologic, poate necesita mai mult decât identificarea unui anticorp capabil să se lege la o ţintă dorită sau la ţinte dorite şi să se ataşeze la un medicament utilizat de unul singur la tratarea cancerului. Legarea anticorpului la medi-cament poate avea efecte semnificative şi imprevizibile asupra activităţii unuia dintre, sau atât a anticorpului cât şi medicamentului, efecte care vor varia în funcţie de tipul linkerului şi/sau medicamentului ales. Aşa cum se descrie în acest document, prin ur-mare, componentele ADC-ului (i) a păstra una sau mai multe proprietăţi terapeutice prezentate de anticorp şi porţiunile indivizibile de medicament în izolare, (ii) a menţine proprietăţile de legare specifice ale porţiunii indivizibile de anticorp; (iii) a optimiza în-cărcarea medicamentului şi rapoartele medicament-anticorp; (iv) a permite livrarea, de exemplu, livrarea intracelulară a porţiunii indivizibile de medicament prin intermediul ataşării stabile la porţiunea indivizibilă de anticorp; (v) a păstra stabilitatea ADC ca un conjugat intact până la transportul sau livrarea la un situs ţintă; (vi) a minimiza agre-garea ADC-ului înainte de, sau după administrare; (vii) a permite efectul terapeutic, de exemplu, efectul citotoxic, al porţiunii indivizibile de medicament după scindarea în mediul celular; (viii) a prezenta Eficacitate a tratamentului anti-cancer in vivo compa-rabilă cu, sau superioară celei a anticorpului şi porţiunilor indivizibile de medicament în izolare; (ix) a minimiza uciderea departe de ţintă de către porţiunea indivizibilă de me-dicament; şi/sau (x) a prezenta proprietăţi farmacocinetice şi farmacodinamice, formu-labilitate, şi profiluri toxicologice/imunologice dorite. Este posibil să fie necesară examinarea fiecăreia dintre aceste proprietăţi pentru a identifica un ADC îmbunătăţit pentru uz terapeutic (Ab şi colab., (2015) Mol. Cancer Ther., 14: 1605-13).
Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute în acest document prezintă proprietăţi neaşteptat de favorabile în unele sau fiecare dintre cate-goriile enumerate mai sus. De exemplu, aşa cum se descrie în acest document, con-structele ADC cuprinzând o ataşare Mal la un anticorp, o unitate de distanţiere PEG (preferabil o unitate de distanţiere PEG scurtă), şi/sau un linker scindabil peptidic (de exemplu, un linker Val-Cit) prezintă o încărcare a medicamentului, agregare şi/sau profiluri de stabilitate surprinzător de favorabile, şi/sau păstrează funcţia de legare la anticorp, activitatea medicamentului, şi/sau uciderea îmbunătăţită a vecinătăţilor, în timp ce reduce uciderea departe de ţintă, în comparaţie cu ADC-urile care utilizează alte structuri linker care pot fi scindate sau care nu pot fi scindate.
Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la un anticorp (de exemplu, un anticorp anti-FRA cum ar fi MORAb-003) prezintă proprietăţi deosebit de favorabile în categoriile enumerate, în comparaţie cu alţi linkeri care pot fi scindaţi sau care nu pot fi scindaţi care unesc eribulina la o porţiune indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribu-lina la un anticorp (de exemplu, un anticorp anti-FRA cum ar fi MORAb-003) prezintă proprietăţi de ucidere a vecinătăţilor deosebit de favorabile în comparaţie cu un ADC care nu poate fi scindat. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la un anticorp (de exemplu, un anticorp anti-FRA cum ar fi MORAb-003) prezintă proprietăţi de ucidere a vecinătăţilor deosebit de favorabile în comparaţie cu un ADC care utilizează structuri linker care pot fi scindate alternative.
Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la MORAb-003 prezintă un raport medica-ment:anticorp mai mare şi mai de dorit (adică un raport de aproximativ 3 - 4) în raport cu un ADC, de exemplu, care cuprinde un linker ataşat la anticorp prin intermediul unei porţiuni indivizibile alternative (de exemplu, o porţiune indivizibilă succinimidă). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la MORAb-003 prezintă un raport medicament:anticorp mai mare şi mai de dorit şi/sau niveluri de agregare mai mici, în raport cu un ADC, de exemplu, care cuprinde o unitate de distanţiere mai lungă (de exemplu, (PEG)8). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la MORAb-003 demonstrează un raport medicament:anticorp mai mare şi mai de dorit, niveluri de agregare mai mici, ucidere la ţintă crescută, şi/sau ucidere departe de ţintă scăzută în raport cu un ADC, de exemplu, care cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată alternativă (adică o porţiune indivizibilă care poate fi scindată non-peptidică, cum ar fi o disulfură sau sulfonamidă care poate fi scindată). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la MORAb-003 demonstrează stabilitate crescută, ucidere la ţintă crescută, ucidere departe de ţintă scăzută, niveluri de agregare mai mici, şi/sau un raport medicament:anticorp mai mare şi mai de dorit în raport cu un ADC, de exemplu, care cuprinde o unitate de aminoacizi alternativă (de exemplu, Ala-Ala-Asn) sau o porţiune indivizibilă care poate fi scindată alternativă (de exemplu, o disulfură sau sulfonamidă care poate fi scindată).
Aşa cum se descrie în acest document, unele dintre caracteristicile dorite sau toate caracteristicile dorite descrise mai sus pentru ADC-uri care cuprind un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina cu MORAb-003 pot fi observate cu ADC-uri care cuprind linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină-toxină conjugată la un anticorp anti-her2 cum ar fi trastuzumab, sau un anticorp anti-mezotelină.
Compuşii ADC din prezenta descriere a invenţiei pot livra selectiv o doză efici-entă dintr-un agent citotoxic sau citostatic către celulele canceroase sau către ţesutul tumoral. S-a descoperit că ADC-urile făcute cunoscute au activitate citotoxică şi/sau citostatică puternică împotriva celulelor care exprimă antigenul ţintă respectiv (de exemplu, FRA sau her2). Aşa cum se descrie în acest document, activitatea citotoxică şi/sau citostatică a ADC-ului este dependentă de nivelul de exprimare al antigenului ţintă într-o celulă. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute sunt deosebit de eficiente în uciderea celulelor canceroase care exprimă un nivel ridicat de antigen ţintă, în comparaţie cu celulele canceroase care exprimă acelaşi antigen la un nivel scăzut. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute sunt deosebit de eficiente în uciderea celulelor canceroase care exprimă antigenul ţintă la un nivel moderat, în comparaţie cu celulele canceroase care exprimă acelaşi antigen la un nivel scăzut. Cancerele care exprimă FRA ridicat cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, cancer ovarian (de exemplu, cancer ovarian seros, cancer ovarian cu celule clare), carcinoid pulmonar, cancer mamar triplu negativ, cancer endometrial, şi cancer pulmonar cu celule mici (de exemplu, adenocarcinom). Cancerele care exprimă FRA moderat cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, cancer gastric şi cancer colorectal. Cancerele care exprimă FRA scăzut cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, melanom şi limfom. Cancerele care exprimă her2 ridicat cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, cancer mamar, cancer gastric, cancer esofagian, cancer ovarian, şi cancer endometrial. Cancerele care exprimă her2 moderat cu titlu de exem-plu includ, dar nu sunt limitate la, cancer pulmonar şi cancer de vezică urinară.
Aşa cum se descrie în acest document, scindarea unui ADC eliberează eribulină din porţiunea indivizibilă de anticorp şi linker. Aşa cum se descrie în acest document, scindarea şi eliberarea eribulinei îmbunătăţesc citotoxicitatea ADC-ului. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker care poate fi scindat este deosebit de eficient în uciderea celulelor canceroase, inclusiv uciderea vecinătăţilor, în comparaţie cu tratamentul comparabil cu un ADC care cuprinde un linker care nu poate fi scindat. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker care poate fi scindat (de exemplu, un linker Val-Cit) demonstrează ucidere a celulelor la ţintă crescută şi/sau ucidere scăzută a celulelor departe de ţintă în raport cu un ADC care cuprinde un linker care nu poate fi scindat (de exemplu, un linker care nu poate fi scindat (PEG)2 sau (PEG)4), în particular unde celulele şi/sau cancerul tratat cu ADC-ul nu exprimă niveluri ridicate ale antigenului ţintă.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute demon-strează, de asemenea, activitate de ucidere a vecinătăţilor, dar citotoxicitate scăzută de-parte de ţintă. Fără a fi legat de teorie, activitatea de ucidere a vecinătăţilor a unui ADC poate fi deosebit de benefică în cazul în care penetrarea sa într-o tumoră solidă este limitată şi/sau exprimarea antigenului ţintă între celulele tumorale este heterogenă. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker care poate fi scindat este deosebit de eficient în uciderea vecinătăţilor şi/sau demonstrează o activitate de ucidere a vecinătăţilor îmbunătăţită, în comparaţie cu tratamentul comparabil cu un ADC care cuprinde un linker care nu poate fi scindat.
În acest document sunt furnizaţi compuşi ADC care cuprind un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia (Ab) care ţinteşte o celulă tumorală, o porţiune indivizibilă de medicament (D), şi o porţiune indivizibilă linker (L) care ataşează covalent Ab la D. În anumite aspecte, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen este capabil să se lege la un antigen asociat tumorii (de exemplu, FRA sau her2) cu specificitate ridicată şi afinitate ridicată. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul sau fragmentul de legare la antigen este internalizat într-o celulă ţintă la legare, de exemplu, într-un compartiment de degradare din celulă. ADC-urile preferate sunt, prin urmare, cele care se internalizează după legarea la o celulă ţintă, suferă degradare, şi elibe-rează porţiunea indivizibilă de medicament pentru a ucide celulele canceroase. Por-ţiunea indivizibilă de medicament poate fi eliberată din anticorp şi/sau porţiunea indi-vizibilă linker a ADC-ului prin acţiune enzimatică, hidroliză, oxidare, sau orice alt me-canism.
Un ADC cu titlu de exemplu are Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care Ab = porţiune indivizibilă de anticorp (adică anticorp sau fragment de legare la antigen), L = porţiune indivizibilă linker, D = porţiune indivizibilă de medicament, şi p = numărul de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp.
Anticorpi
Porţiunea indivizibilă de anticorp (Ab) cu Formula I include în sfera sa orice anticorp sau fragment de legare la antigen care se leagă în mod specific la un antigen ţintă pe o celulă canceroasă. Anticorpul sau fragmentul de legare la antigen se poate lega la un antigen ţintă cu o constantă de disociere (KD) de ≤1 mM, ≤ 100 nM sau ≤ 10 nM, sau orice cantitate între ele, măsurată prin, de exemplu, analiza BIAcore®. Aşa cum se descrie în acest document, KD este de 1 pM până la 500 pM. Aşa cum se descrie în acest document, KD este cuprinsă între 500 pM până la 1 µM, 1 µM până la 100 nM, sau 100 mM până la 10 nM.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp este un anticorp cu patru lanţuri (menţionat, de asemenea, ca o imunoglobulină), care cuprinde două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare. Aşa cum se descrie în acest document, por-ţiunea indivizibilă de anticorp este un semicorp cu două lanţuri (un lanţ uşor şi un lanţ greu), sau un fragment de legare la antigen al unei imunoglobuline.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp is an anticorp de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare se leagă la un anti-gen ţintă de cancer exprimat pe suprafaţa unei celule şi intră în celulă la legare. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament a ADC-ului este eliberată din porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului după ce ADC intră şi este prezent într-o celulă care exprimă antigenul ţintă de cancer (adică după ce ADC a fost internalizat).
Secvenţele de aminoacizi şi de acid nucleic ale unor anticorpi cu titlu de exemplu din prezenta descriere a invenţiei sunt stabilite în Tabelele 1-9.
Tabelul 1. Anticorpi
mAb Clasă/izotip Ţintă MORAb-003 umanizat receptorul alfa al folatului uman MORAb-009 chimeric şoarece-uman mezotelină umană trastuzumab umanizat her2/neu uman 33011-xi chimeric iepure-uman mezotelină umană 33011-zu umanizat mezotelină umană 111B10-xi chimeric iepure-uman mezotelină umană 111B10-zu umanizat mezotelină umană 201C15-xi chimeric iepure-uman mezotelină umană 201C15-zu umanizat mezotelină umană 346C6-xi chimeric iepure-uman mezotelină umană 346C6-zu umanizat mezotelină umană Abrevieri: xi - chimeric; zu - umanizat.
Tabelul 2. Secvenţele de aminoacizi ale regiunilor variabile ale mAb
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 Lanţ greu 23 2 MORAb-003 Lanţ uşor 24 3 MORAb-009 Lanţ greu 25 4 MORAb-009 Lanţ uşor 26 5 trastuzumab Lanţ greu 27 6 trastuzumab Lanţ uşor 28 7 33011-xi Lanţ greu 29 8 33011-xi Lanţ uşor 30 9 33011-zu Lanţ greu 31 10 33011-zu Lanţ uşor 32 11 111B10-xi Lanţ greu 33 12 111B10-xi Lanţ uşor 34 13 111B10-zu Lanţ greu 35 14 111B10-zu Lanţ uşor 36 15 201C15-xi Lanţ greu 37 16 201C15-xi Lanţ uşor 38 17 201C15-zu Lanţ greu 39 18 201C15-zu Lanţ uşor 40 19 346C6-xi Lanţ greu 41 20 346C6-xi Lanţ uşor 42 21 346C6-zu Lanţ greu 43 22 346C6-zu Lanţ uşor 44
Tabelul 3. Secvenţe de acid nucleic care codifică regiuni variabile ale mAb
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 Lanţ greu 45 2 MORAb-003 Lanţ uşor 46 3 MORAb-009 Lanţ greu 47 4 MORAb-009 Lanţ uşor 48 5 33011-xi Lanţ greu 49 6 33011-xi Lanţ uşor 50 7 33011-zu Lanţ greu 51 8 33011-zu Lanţ uşor 52 9 111B10-xi Lanţ greu 53 10 111B10-xi Lanţ uşor 54 11 111B10-zu Lanţ greu 55 12 111B10-zu Lanţ uşor 56 13 201C15-xi Lanţ greu 57 14 201C15-xi Lanţ uşor 58 15 201C15-zu Lanţ greu 59 16 201C15-zu Lanţ uşor 60 17 346C6-xi Lanţ greu 61 18 346C6-xi Lanţ uşor 62 19 346C6-zu Lanţ greu 63 20 346C6-zu Lanţ uşor 64
Tabelul 4. Secvenţele de aminoacizi ale CDR-urilor Kabat ale mAb
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 CDR1 HC 2 GYGLS 2 MORAb-003 CDR2 HC 3 MISSGGSYTYYADSVKG 3 MORAb-003 CDR3 HC 4 HGDDPAWFAY 4 MORAb-003 CDR1 LC 7 SVSSSISSNNLH 5 MORAb-003 CDR2 LC 8 GTSNLAS 6 MORAb-003 CDR3 LC 9 QQWSSYPYMYT 7 MORAb-009 CDR1 HC 65 GYTMN 8 MORAb-009 CDR2 HC 66 LITPYNGASSYNQKFRG 9 MORAb-009 CDR3 HC 67 GGYDGRGFDY 10 MORAb-009 CDR1 LC 68 SASSSVSYMH 11 MORAb-009 CDR2 LC 69 DTSKLAS 12 MORAb-009 CDR3 LC 70 QQWSKHPLT 13 trastuzumab CDR1 HC 71 DTYIH 14 trastuzumab CDR2 HC 72 RIYPTNGYTRYADSVKG 15 trastuzumab CDR3 HC 73 WGGDGFYAMDY 16 trastuzumab CDR1 LC 74 RASQDVNTAVA 17 trastuzumab CDR2 LC 75 SASFLYS 18 trastuzumab CDR3 LC 76 QQHYTTPPT 19 33011-xi CDR1 HC 77 SDAIS 20 33011-xi CDR2 HC 78 IINGGGNTYYASWAKG 21 33011-xi CDR3 HC 79 GIQHGGGNSDYYYYGMDL 22 33011-xi CDR1 LC 80 QASQSISSVLS 23 33011-xi CDR2 LC 81 LASTLAS 24 33011-xi CDR3 LC 82 QTNYGTSSSNYGFA 25 33011-zu CDR1 HC 83 SDAIS 26 33011-zu CDR2 HC 84 IINGGGNTYYASWAKG 27 33011-zu CDR3 HC 85 GIQHGGGNSDYYYYGMDL 28 33011-zu CDR1 LC 86 QASQSISSVLS 29 33011-zu CDR2 LC 87 LASTLAS 30 33011-zu CDR3 LC 88 QTNYGTSSSNYGFA 31 111B10-xi CDR1 HC 89 NYAMS 32 111B10-xi CDR2 HC 90 SISTGGLAFYANWAKG 33 111B10-xi CDR3 HC 91 NGGGSYIFYYFDL 34 111B10-xi CDR1 LC 92 QASQSISSYLS 35 111B10-xi CDR2 LC 93 SASTLAS 36 111B10-xi CDR3 LC 94 QSYYDIGTST 37 111B10-zu CDR1 HC 95 NYAMS 38 111B10-zu CDR2 HC 96 SISTGGLAFYANWAKG 39 111B10-zu CDR3 HC 97 NGGGSYIFYYFDL 40 111B10-zu CDR1 LC 98 QASQSISSYLS 41 111B10-zu CDR2 LC 99 SASTLAS 42 111B10-zu CDR3 LC 100 QSYYDIGTST 43 201C15-xi CDR1 HC 101 SYAMG 44 201C15-xi CDR2 HC 102 TINIGGRVYYASWAKG 45 201C15-xi CDR3 HC 103 YYNGGSYDI 46 201C15-xi CDR1 LC 104 QASESIYRVLA 47 201C15-xi CDR2 LC 105 DTSTLAS 48 201C15-xi CDR3 LC 106 QGGYYADSYGIA 49 201C15-zu CDR1 HC 107 SYAMG 50 201C15-zu CDR2 HC 108 TINIGGRVYYASWAKG 51 201C15-zu CDR3 HC 109 YYNGGSYDI 52 201C15-zu CDR1 LC 110 QASESIYRVLA 53 201C15-zu CDR2 LC 111 DTSTLAS 54 201C15-zu CDR3 LC 112 QGGYYADSYGIA 55 346C6-xi CDR1 HC 113 SYAMI 56 346C6-xi CDR2 HC 114 TISTGGITYYASWAKG 57 346C6-xi CDR3 HC 115 GGYAASSAYYLPYYFDL 58 346C6-xi CDR1 LC 116 QSSQSVYNNNNLA 59 346C6-xi CDR2 LC 117 LASTLAS 60 346C6-xi CDR3 LC 118 LGGCDDDADTFA 61 346C6-zu CDR1 HC 119 SYAMI 62 346C6-zu CDR2 HC 120 TISTGGITYYASWAKG 63 346C6-zu CDR3 HC 121 GGYAASSAYYLPYYFDL 64 346C6-zu CDR1 LC 122 QSSQSVYNNNNLA 65 346C6-zu CDR2 LC 123 LASTLAS 66 346C6-zu CDR3 LC 124 LGGCDDDADTFA
Tabelul 5. Secvenţele de aminoacizi care codifică CDR-urile Kabat ale mAb
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 CDR1 HC 125 GGCTATGGGTTGTCT 2 MORAb-003 CDR2 HC 126 3 MORAb-003 CDR3 HC 127 CATGGGGACGATCCCGCCTGGTTCGCTTAT 4 MORAb-003 CDR1 LC 128 5 MORAb-003 CDR2 LC 129 GGCACATCCAACCTGGCTTCT 6 MORAb-003 CDR3 LC 130 CAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACATGTACACG 7 MORAb-009 CDR1 HC 131 GGCTACACCATGAAC 8 MORAb-009 CDR2 HC 132 9 MORAb-009 CDR3 HC 133 GGGGGTTACGACGGGAGGGGTTTTGACTAC 10 MORAb-009 CDR1 LC 134 AGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCAC 11 MORAb-009 CDR2 LC 135 GACACATCCAAACTGGCTTCT 12 MORAb-009 CDR3 LC 136 CAGCAGTGGAGTAAGCACCCTCTCACG 13 33011-xi CDR1 HC 137 AGCGATGCAATAAGC 14 33011-xi CDR2 HC 138 15 33011-xi CDR3 HC 139 16 33011-xi CDR1 LC 140 CAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTGTCTTGTCC 17 33011-xi CDR2 LC 141 CTGGCATCCACTCTGGCATCT 18 33011-xi CDR3 LC 142 19 33011-zu CDR1 HC 143 TCCGACGCGATTAGC 20 33011-zu CDR2 HC 144 21 33011-zu CDR3 HC 145 22 33011-zu CDR1 LC 146 CAGGCGTCCCAGTCAATTAGCAGCGTGCTCTCC 23 33011-zu CDR2 LC 147 TTGGCCTCCACTCTGGCCTCG 24 33011-zu CDR3 LC 148 25 111B10-xi CDR1 HC 149 AACTAT GCAAT GAGC 26 111B10-xi CDR2 HC 150 27 111B10-xi CDR3 HC 151 28 111B10-xi CDR1 LC 152 CAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTTACTTATCC 29 111B10-xi CDR2 LC 153 TCTGCATCCACTCTGGCATCT 30 111B10-xi CDR3 LC 154 CAAAGCTATTATGATATTGGTACTAGTACT 31 111B10-zu CDR1 HC 155 AACTACGCCATGTCC 32 111B10-zu CDR2 HC 156 33 111B10-zu CDR3 HC 157 34 111B10-zu CDR1 LC 158 CAGGCCTCCCAGTCCATCTCCTCCTACCTGTCC 35 111B10-zu CDR2 LC 159 TCTGCCTCCACACTGGCCTCC 36 111B10-zu CDR3 LC 160 CAGTCCTACTACGACATCGGCACCTCCACC 37 201C15-xi CDR1 HC 161 AGCTATGCAATGGGC 38 201C15-xi CDR2 HC 162 39 201C15-xi CDR3 HC 163 TATTATAATGGTGGTAGTTATGACATC 40 201C15-xi CDR1 LC 164 CAGGCCAGTGAGAGCATTTATCGCGTATTGGCC 41 201C15-xi CDR2 LC 165 GATACATCCACTCTGGCATCT 42 201C15-xi CDR3 LC 166 43 201C15-zu CDR1 HC 167 TCCTACGCTATGGGC 44 201C15-zu CDR2 HC 168 45 201C15-zu CDR3 HC 169 TACTACAACGGCGGCTCCTACGATATC 46 201C15-zu CDR1 LC 170 CAGGCCTCCGAGTCCATCTACCGGGTGCTGGCC 47 201C15-zu CDR2 LC 171 GACACCAGCACACTGGCCTCC 48 201C15-zu CDR3 LC 172 49 346C6-xi CDR1 HC 173 50 346C6-xi CDR2 HC 174 51 346C6-xi CDR3 HC 175 52 346C6-xi CDR1 LC 176 53 346C6-xi CDR2 LC 177 CTGGCATCCACTCTGGCATCT 54 346C6-xi CDR3 LC 178 55 346C6-zu CDR1 HC 179 TCCTACGCTATGATC 56 346C6-zu CDR2 HC 180 57 346C6-zu CDR3 HC 181 58 346C6-zu CDR1 LC 182 59 346C6-zu CDR2 LC 183 CTGGCCTCCACACTGGCCTCT 60 346C6-zu CDR3 LC 184
Tabelul 6. Secvenţele de aminoacizi ale CDR-urilor IMGT ale mAb
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 CDR1 HC 13 GFTFSGYG 2 MORAb-003 CDR2 HC 14 ISSGGSYT 3 MORAb-003 CDR3 HC 15 ARHGDDPAWFAY 4 MORAb-003 CDR1 LC 16 SSISSNN 5 MORAb-003 CDR2 LC 17 GTS 6 MORAb-003 CDR3 LC 18 QQWSSYPYMYT 7 MORAb-009 CDR1 HC 185 GYSFTGYT 8 MORAb-009 CDR2 HC 186 ITPYNGAS 9 MORAb-009 CDR3 HC 187 ARGGYDGRGFDY 10 MORAb-009 CDR1 LC 188 SSVSY 11 MORAb-009 CDR2 LC 189 DTS 12 MORAb-009 CDR3 LC 190 QQWSKHPLT 13 trastuzumab CDR1 HC 191 GFNIKDTY 14 trastuzumab CDR2 HC 192 IYPTNGYT 15 trastuzumab CDR3 HC 193 SRWGGDGFYAMDY 16 trastuzumab CDR1 LC 194 QDVNTA 17 trastuzumab CDR2 LC 195 SAS 18 trastuzumab CDR3 LC 196 QQHYTTPPT 19 33011-xi CDR1 HC 197 GISLSSDA 20 33011-xi CDR2 HC 198 INGGGNT 21 33011-xi CDR3 HC 199 ARGIQHGGGNSDYYYYGMDL 22 33011-xi CDR1 LC 200 QSISSV 23 33011-xi CDR2 LC 201 LAS 24 33011-xi CDR3 LC 202 QTNYGTSSSNYGFA 25 33011-zu CDR1 HC 203 GISLSSDA 26 33011-zu CDR2 HC 204 INGGGNT 27 33011-zu CDR3 HC 205 ARGIQHGGGNSDYYYYGMDL 28 33011-zu CDR1 LC 206 QSISSV 29 33011-zu CDR2 LC 207 LAS 30 33011-zu CDR3 LC 208 QTNYGTSSSNYGFA 31 111B10-xi CDR1 HC 209 GFSLNNYA 32 111B10-xi CDR2 HC 210 ISTGGLA 33 111B10-xi CDR3 HC 211 GRNGGGSYIFYYFDL 34 111B10-xi CDR1 LC 212 QSISSY 35 111B10-xi CDR2 LC 213 SAS 36 111B10-xi CDR3 LC 214 QSYYDIGTST 37 111B10-zu CDR1 HC 215 GFSLNNYA 38 111B10-zu CDR2 HC 216 ISTGGLA 39 111B10-zu CDR3 HC 217 ARNGGGSYIFYYFDL 40 111B10-zu CDR1 LC 218 QSISSY 41 111B10-zu CDR2 LC 219 SAS 42 111B10-zu CDR3 LC 220 QSYYDIGTST 43 201C15-xi CDR1 HC 221 GIDLSSYA 44 201C15-xi CDR2 HC 222 INIGGRV 45 201C15-xi CDR3 HC 223 ARYYNGGSYDI 46 201C15-xi CDR1 LC 224 ESIYRV 47 201C15-xi CDR2 LC 225 DTS 48 201C15-xi CDR3 LC 226 QGGYYADSYGIA 49 201C15-zu CDR1 HC 227 GIDLSSYA 50 201C15-zu CDR2 HC 228 INIGGRV 51 201C15-zu CDR3 HC 229 ARYYNGGSYDI 52 201C15-zu CDR1 LC 230 ESIYRV 53 201C15-zu CDR2 LC 231 DTS 54 201C15-zu CDR3 LC 232 QGGYYADSYGIA 55 346C6-xi CDR1 HC 233 GFSLSSYA 56 346C6-xi CDR2 HC 234 ISTGGIT 57 346C6-xi CDR3 HC 235 ARGGYAASSAYYLPYYFDL 58 346C6-xi CDR1 LC 236 QSVYNNNN 59 346C6-xi CDR2 LC 237 LAS 60 346C6-xi CDR3 LC 238 LGGCDDDADTFA 61 346C6-zu CDR1 HC 239 GFSLSSYA 62 346C6-zu CDR2 HC 240 ISTGGIT 63 346C6-zu CDR3 HC 241 ARGGYAASSAYYLPYYFDL 64 346C6-zu CDR1 LC 242 QSVYNNNN 65 346C6-zu CDR2 LC 243 LAS 66 346C6-zu CDR3 LC 244 LGGCDDDADTFA
Tabelul 7. Secvenţele de aminoacizi care codifică CDR-urile IMGT ale mAb
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 CDR1 HC 245 GGCTTCACCTTCAGCGGCTATGGG 2 MORAb-003 CDR2 HC 246 ATTAGTAGTGGTGGTAGTTATACC 3 MORAb-003 CDR3 HC 247 4 MORAb-003 CDR1 LC 248 TCAAGTATAAGTTCCAACAAC 5 MORAb-003 CDR2 LC 249 GGCACATCC 6 MORAb-003 CDR3 LC 250 CAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACATGTACACG 7 MORAb-009 CDR1 HC 251 GGTTACTCATTCACTGGCTACACC 8 MORAb-009 CDR2 HC 252 ATTACTCCTTACAATGGTGCTTCT 9 MORAb-009 CDR3 HC 253 10 MORAb-009 CDR1 LC 254 TCAAGTGTAAGTTAC 11 MORAb-009 CDR2 LC 255 GACACATCC 12 MORAb-009 CDR3 LC 256 CAGCAGTGGAGTAAGCACCCTCTCACG 13 33011-xi CDR1 HC 257 GGAATCTCCCTCAGTAGCGATGCA 14 33011-xi CDR2 HC 258 ATTAATGGTGGTGGTAACACA 15 33011-xi CDR3 HC 259 16 33011-xi CDR1 LC 260 CAGAGCATTAGTAGTGTC 17 33011-xi CDR2 LC 261 CTGGCATCT 18 33011-xi CDR3 LC 262 19 33011-zu CDR1 HC 263 GGAATTTCCCTCTCCTCCGACGCG 20 33011-zu CDR2 HC 264 ATCAACGGCGGCGGAAACACC 21 33011-zu CDR3 HC 265 22 33011-zu CDR1 LC 266 CAGTCAATTAGCAGCGTG 23 33011-zu CDR2 LC 267 TTGGCCTCC 24 33011-zu CDR3 LC 268 25 111B10-xi CDR1 HC 269 GGATTCTCCCTCAATAACTATGCA 26 111B10-xi CDR2 HC 270 ATTAGTACTGGTGGTCTCGCA 27 111B10-xi CDR3 HC 271 28 111B10-xi CDR1 LC 272 CAGAGCATTAGTAGTTAC 29 111B10-xi CDR2 LC 273 TCTGCATCC 30 111B10-xi CDR3 LC 274 CAAAGCTATTATGATATTGGTACTAGTACT 31 111B10-zu CDR1 HC 275 GGCTTCTCCCTGAACAACTACGCC 32 111B10-zu CDR2 HC 276 ATCAGCACAGGCGGCCTGGCC 33 111B10-zu CDR3 HC 277 34 111B10-zu CDR1 LC 278 CAGTCCATCTCCTCCTAC 35 111B10-zu CDR2 LC 279 TCTGCCTCC 36 111B10-zu CDR3 LC 300 CAGTCCTACTACGACATCGGCACCTCCACC 37 201C15-xi CDR1 HC 301 GGAATCGACCTCAGTAGCTATGCA 38 201C15-xi CDR2 HC 302 ATTAATATTGGTGGTCGCGTA 39 201C15-xi CDR3 HC 303 GCCAGATATTATAATGGTGGTAGTTATGACATC 40 201C15-xi CDR1 LC 304 GAGAGCATTTATCGCGTA 41 201C15-xi CDR2 LC 305 GATACATCC 42 201C15-xi CDR3 LC 306 43 201C15-zu CDR1 HC 307 GGAATCGACCTGTCCTCCTACGCT 44 201C15-zu CDR2 HC 308 ATCAACATCGGCGGCAGAGTG 45 201C15-zu CDR3 HC 309 GCCCGGTACTACAACGGCGGCTCCTACGATATC 46 201C15-zu CDR1 LC 310 GAGTCCATCTACCGGGTG 47 201C15-zu CDR2 LC 311 GACACCAGC 48 201C15-zu CDR3 LC 312 49 346C6-xi CDR1 HC 313 GGATTCTCCCTCAGTAGTTATGCA 50 346C6-xi CDR2 HC 314 ATTAGTACTGGTGGTATCACA 51 346C6-xi CDR3 HC 315 52 346C6-xi CDR1 LC 316 CAGAGTGTTTATAATAATAACAAC 53 346C6-xi CDR2 LC 317 CTGGCATCC 54 346C6-xi CDR3 LC 318 55 346C6-zu CDR1 HC 319 GGCTTCTCCCTGTCCTCCTACGCT 56 346C6-zu CDR2 HC 320 ATCTCTACCGGCGGAATTACC 57 346C6-zu CDR3 HC 321 58 346C6-zu CDR1 LC 322 CAGTCCGTGTATAACAACAACAAC 59 346C6-zu CDR2 LC 323 CTGGCCTCC 60 346C6-zu CDR3 LC 324
Tabelul 8. Secvenţele de aminoacizi ale lanţurilor Ig mAb de lungime completă
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de aminoacizi 1 MORAb-003 Lanţ greu 1 2 MORAb-003 Lanţ uşor 6 3 MORAb-009 Lanţ greu 325 4 MORAb-009 Lanţ uşor 326 5 trastuzumab Lanţ greu 327 6 trastuzumab Lanţ uşor 328 7 33011-xi Lanţ greu 329 8 33011-xi Lanţ uşor 330 9 33011-zu Lanţ greu 331 10 33011-zu Lanţ uşor 332 11 111B10-xi Lanţ greu 333 12 111B10-xi Lanţ uşor 334 13 111B10-zu Lanţ greu 335 14 111B10-zu Lanţ uşor 336 15 201C15-xi Lanţ greu 337 16 201C15-xi Lanţ uşor 338 17 201C15-zu Lanţ greu 339 18 201C15-zu Lanţ uşor 340 19 346C6-xi Lanţ greu 341 20 346C6-xi Lanţ uşor 342 21 346C6-zu Lanţ greu 343 22 346C6-zu Lanţ uşor 344
Tabelul 9. Secvenţele de acid nucleic care codifică lanţuri Ig mAb de lungime completă+
mAb Lanţ IgG ID. SECV. NR. Secvenţa de acid nucleic 1 MORAb-003 Lanţ greu 345 2 MORAb-003 Lanţ uşor 346 3 MORAb-009 Lanţ greu 347 4 MORAb-009 Lanţ uşor 348 5 33011-xi Lanţ greu 349 6 33011-xi Lanţ uşor 350 7 33011-zu Lanţ greu 351 8 33011-zu Lanţ uşor 352 9 111B10-xi Lanţ greu 353 10 111B10-xi Lanţ uşor 354 11 111B10-zu Lanţ greu 355 12 111B10-zu Lanţ uşor 356 13 201C15-xi Lanţ greu 357 14 201C15-xi Lanţ uşor 358 15 201C15-zu Lanţ greu 359 16 201C15-zu Lanţ uşor 360 17 346C6-xi Lanţ greu 361 18 346C6-xi Lanţ uşor 362 19 346C6-zu Lanţ greu 363 20 346C6-zu Lanţ uşor 364 + Secvenţele de acid nucleic enumerate nu includ secvenţe lider.
Aşa cum se descrie în acest document, un ADC făcut cunoscut în acest docu-ment poate cuprinde orice set de domenii variabile ale lanţului greu şi uşor enumerate în tabelele de mai sus (de exemplu, domenii variabile ale lanţului greu şi uşor ale MORAb-003, sau domenii variabile ale lanţului greu şi uşor ale trastuzumab), sau setul din şase secvenţe CDR din setul de lanţ greu şi uşor. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-ul cuprinde în continuare domenii constante ale lanţului greu şi uşor uman sau fragmente ale acestora. De exemplu, ADC-ul poate cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG uman (cum ar fi o IgG1) şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa sau lambda uman. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-urilor descrise cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de imunoglobulină G subtipul 1 (IgG1) uman cu un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig umană.
Aşa cum se descrie în acest document, antigenul de cancer ţintă pentru un ADC este receptorul alfa al folatului ("FRA").
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor după cum urmează: CDR1 a lanţului greu (HCDR1) constituită din ID. SECV. NR.: 2, CDR2 a lanţului greu (HCDR2) constituită din ID. SECV. NR.: 3, CDR3 a lanţului greu (HCDR3) constituită din ID. SECV. NR.: 4; CDR1 a lanţului uşor (LCDR1) constituită din ID. SECV. NR.: 7, CDR2 a lanţului uşor (LCDR2) constituită din ID. SECV. NR.: 8, şi CDR3 a lanţului uşor (LCDR3) constituită din ID. SECV. NR.: 9, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 şi 1991))).
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor după cum urmează: CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 13, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 14, CDR3 a lanţului greu con-stituită din ID. SECV. NR.: 15; CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 16, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 17, şi CDR3 a lanţului uşor consti-tuită din ID. SECV. NR.: 18, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT (International ImMunoGeneTics Information System (IMGT®)).
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde secvenţa de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu având ID. SECV. NR.: 23 şi secvenţa de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 24, sau secvenţe care sunt cel puţin 95% identic cu secvenţele menţionate mai sus. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu, care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 23 şi o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 24.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA cuprinde un dome-niu constant al lanţului greu de IgG1 umană cu un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig umană.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului greu având ID. SECV. NR.: 1 sau o secvenţă care este cel puţin 95% identică cu ID. SECV. NR.: 1, şi secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 6 sau o secvenţă care este cel puţin 95% identică cu ID. SECV. NR.: 6. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului greu având ID. SECV. NR.: 1 şi secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 6, sau secvenţe care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele menţionate mai sus. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA are o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 1 şi/sau o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 6. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA cuprinde un lanţ greu codificat de secvenţa de nucleotide având ID. SECV. NR.: 11 (cu nucleotidele care codifică secvenţa lider), sau ID. SECV. NR.: 345 (fără nucleotidele care codifică secvenţa lider); şi un lanţ uşor codificat de secvenţa de nucleotide având ID. SECV. NR.: 12 (cu nucleotidele care codifică secvenţa lider), sau ID. SECV. NR.: 346 (fără nucleotidele care codifică secvenţa lider). Aşa cum se descrie în acest document, sec-venţei de aminoacizi a lanţului greu îi lipseşte lizina C-terminală. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA are secvenţa de aminoacizi a anticorpului produs de o linie celulară depozitată în condiţii în conformitate cu Tratatul de la Budapesta cu American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110 - 2209) în 24 aprilie 2006, sub numărul de acces PTA-7552, sau astfel de secvenţe lipsite de lizina C-terminală a lanţului greu. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA este MORAb-003 (nume USAN: farletuzumab) (Ebel şi colab., (2007) Cancer Immunity 7: 6), sau un fragment de legare la antigen al acestuia.
Aşa cum se descrie în acest document, antigenul de cancer ţintă pentru un ADC este receptorul factorului de creştere epidermică uman 2 ("her2").
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor după cum urmează: CDR1 a lanţului greu (HCDR1) constituită din ID. SECV. NR.: 71, CDR2 a lanţului greu (HCDR2) constituită din ID. SECV. NR.: 72, CDR3 a lanţului greu (HCDR3) constituită din ID. SECV. NR.: 73; CDR1 a lanţului uşor (LCDR1) constituită din ID. SECV. NR.: 74, CDR2 a lanţului uşor (LCDR2) constituită din ID. SECV. NR.: 75, şi CDR3 a lanţului uşor (LCDR3) constituită din ID. SECV. NR.: 76, aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde trei CDR-uri ale lanţului greu şi trei CDR-uri ale lanţului uşor după cum urmează: CDR1 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 191, CDR2 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 192, CDR3 a lanţului greu constituită din ID. SECV. NR.: 193; CDR1 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 194, CDR2 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 195, şi CDR3 a lanţului uşor constituită din ID. SECV. NR.: 196, aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 27, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 28. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde secvenţa de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu având ID. SECV. NR.: 27 şi secvenţa de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 28, sau secvenţe care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele menţionate mai sus. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia are o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 27 şi/sau o secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 28.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 cuprinde un dome-niu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig umană.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului greu având ID. SECV. NR.: 327 sau o secvenţă care este cel puţin 95% identică cu ID. SECV. NR.: 327, şi secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 328 sau o secvenţă care este cel puţin 95% identică cu ID. SECV. NR.: 328. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul cuprinde secvenţa de aminoacizi a lanţului greu având ID. SECV. NR.: 327 şi secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor având ID. SECV. NR.: 328, sau secvenţe care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele menţionate mai sus. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 are o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu, care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 327 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor care este cel puţin 96%, cel puţin 97%, cel puţin 98%, sau cel puţin 99% identică cu ID. SECV. NR.: 328. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 este trastuzumab, sau un fragment de legare la antigen al acestuia.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-FRA sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde cele trei CDR-uri ale lanţului greu şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor ale MORAb-003 sau în care CDR-urile includ nu mai mult de una, două, trei, patru, cinci, sau şase adiţii, deleţii sau substituţii de aminoacizi ale HCDR1 (ID. SECV. NR.: 2 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 13 în conformitate cu IMGT), HCDR2 (ID. SECV. NR.: 3 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 14 în conformitate cu IMGT), HCDR3 (ID. SECV. NR.: 4 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 15 în conformitate cu IMGT); LCDR1 (ID. SECV. NR.: 7 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 16 în conformitate cu IMGT), LCDR2 (ID. SECV. NR.: 8 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 17 în conformitate cu IMGT), şi LCDR3 (ID. SECV. NR.: 9 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 18 în conformitate cu IMGT).
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul anti-her2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia cuprinde cele trei CDR-uri ale lanţului greu şi cele trei CDR-uri ale lanţului uşor ale trastuzumab sau în care CDR-urile includ nu mai mult de una, două, trei, patru, cinci, sau şase adiţii, deleţii sau substituţii de aminoacizi ale HCDR1 (ID. SECV. NR.: 71 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 191 în conformitate cu IMGT), HCDR2 (ID. SECV. NR.: 72 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 192 în conformitate cu IMGT), HCDR3 (ID. SECV. NR.: 73 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 193 în conformitate cu IMGT); LCDR1 (ID. SECV. NR.: 74 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 194 în conformitate cu IMGT), LCDR2 (ID. SECV. NR.: 75 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 195 în conformitate cu IMGT), şi LCDR3 (ID. SECV. NR.: 76 în conformitate cu Kabat, sau ID. SECV. NR.: 196 în conformitate cu IMGT).
Aşa cum se descrie în acest document, substituţiile de aminoacizi sunt de re-ziduuri unice. Inserţiile vor fi, de obicei, de ordinul de la aproximativ 1 până la aproxi-mativ 20 de reziduuri de aminoacizi, cu toate că pot fi tolerate inserţii considerabil mai mari atât timp cât funcţia biologică este păstrată (de exemplu, legarea la FRA sau her2). Deleţiile variază de obicei de la aproximativ 1 până la aproximativ 20 de reziduuri de aminoacizi, cu toate că în unele cazuri deleţiile pot fi mult mai mari. Substituţiile, dele-ţiile, inserţiile, sau orice combinaţie a acestora, pot fi utilizate pentru a ajunge la un derivat final sau o variantă finală. În general, aceste modificări sunt făcute pe câţiva aminoacizi pentru a minimiza modificarea moleculei, în particular imunogenicitatea şi specificitatea proteinei de legare la antigen. Cu toate acestea, schimbări mai mari pot fi tolerate în anumite circumstanţe. Înlocuirile conservative sunt făcute în general în conformitate cu următoarea diagramă descrisă ca Tabelul 10.
Tabelul 10
Reziduu original Substituţii cu titlu de exemplu Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn, Gln Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe Met, Leu, Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe Val Ile, Leu
Prin selectarea substituţiilor care sunt mai puţin conservative decât cele arătate în Tabelul 10 sunt făcute modificări substanţiale ale funcţiei sau identităţii imunologice. Pentru exemplificare, pot fi făcute substituţii care afectează mai semnificativ: structura structurii principale polipeptidice în zona alterării, pentru exemplificare structura alfa-elicoidală sau de foaie beta; încărcătura sau hidrofobicitatea moleculei la situsul ţintă; sau volumul lanţului lateral. Substituţiile care sunt aşteptate, în general, să producă cele mai mari modificări ale proprietăţilor polipeptidei sunt cele în care (a) un reziduu hidrofil, de exemplu, seril sau treonil, este substituit cu (sau de) un reziduu hidrofob, de exem-plu, leucil, izoleucil, fenilalanil, valil sau alanil; (b) o cisteină sau prolină este substituită cu (sau de) orice alt reziduu; (c) un reziduu având un lanţ lateral electropozitiv, de exemplu, lizil, arginil, sau histidil, este substituit cu (sau de) un reziduu electronegativ, de exemplu, glutamil sau aspartil; sau (d) un reziduu având un lanţ lateral voluminos, de exemplu, fenilalanină, este substituit cu (sau de) unul care nu are un lanţ lateral, de exemplu, glicină.
Aşa cum se descrie în acest document, când într-un ADC sunt utilizate secvenţe variante de anticorpi, variantele prezintă în mod tipic aceeaşi activitate biologică cali-tativă şi vor provoca acelaşi răspuns imun, deşi pot fi selectate, de asemenea, variante pentru a modifica după cum este necesar caracteristicile proteinelor de legare la anti-gen. Alternativ, varianta poate fi proiectată astfel încât activitatea biologică a proteinei de legare la antigen este alterată. Pentru exemplificare, situsurile de glicozilare pot fi alterate sau eliminate, aşa cum a fost discutat în acest document.
Diverşi anticorpi pot fi utilizaţi cu ADC-urile care se utilizează în acest document pentru a ţinti celulele canceroase. Aşa cum se arată mai jos, toxinele linker în ADC-urile făcute cunoscute în acest document sunt surprinzător de eficiente cu diferiţi anticorpi care ţintesc antigenul tumoral. Antigenii adecvaţi exprimaţi pe celule tumorale, dar nu pe celule sănătoase, sau exprimaţi pe celule tumorale la un nivel mai înalt decât pe celule sănătoase, sunt cunoscuţi în domeniul de specialitate, la fel ca şi anticorpii direcţionaţi împotriva lor. Aceşti anticorpi pot fi utilizaţi cu linkerii şi toxinele (de exemplu, eribulină) care sun făcute cunoscute în acest document. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp ţinteşte FRA. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp care ţinteşte FRA este MORAb-003. Aşa cum se des-crie în acest document, în timp ce linkerii făcuţi cunoscuţi şi toxina (eribulina) sunt sur-prinzător de eficienţi cu mai mulţi anticorpi diferiţi care ţintesc tumorile, porţiunile indi-vizibile de anticorp care ţintesc FRA, cum ar fi MORAb-003, au furnizat raport medi-cament:anticorp, ţintirea tumorii, uciderea vecinătăţilor, eficacitatea tratamentului, şi ucidere departe de ţintă redusă, deosebit de îmbunătăţite. Eficacitatea îmbunătăţită a tratamentului poate fi măsurată in vitro sau in vivo, şi poate include o rată redusă de creştere a tumorii şi/sau un volum tumoral redus.
Aşa cum se descrie în acest document, sunt utilizaţi anticorpi faţă de alte ţinte antigene şi oferă cel puţin unele dintre proprietăţile funcţionale favorabile ale unui ADC cuprinzând o porţiune indivizibilă de anticorp care ţinteşte FRA, cum ar fi MORAb-003 (de exemplu, raport medicament:anticorp îmbunătăţit, eficacitate a tratamentului îmbu-nătăţită, ucidere departe de ţintă redusă, etc.). Aşa cum se descrie în acest document, unele dintre, sau toate aceste proprietăţi funcţionale favorabile sunt observate atunci când linkerii făcuţi cunoscuţi şi toxina (eribulina) se conjugă cu o porţiune indivizibilă de anticorp care ţinteşte her2, cum ar fi trastuzumab. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, porţiunea indivizibilă de anticorp ţinteşte her2. Aşa cum se descrie în acest do-cument, porţiunea indivizibilă de anticorp care ţinteşte her2 este trastuzumab. Aşa cum se descrie în acest document, unele dintre, sau toate aceste proprietăţi funcţionale favorabile sunt observate atunci când linkerii făcuţi cunoscuţi şi toxina (eribulina) se conjugă cu o porţiune indivizibilă de anticorp care ţinteşte MSLN, cum ar fi MORAb-009. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp ţinteşte MSLN. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp care ţinteşte MSLN este MORAb-009.
Linkeri
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul într-un ADC este stabil în mod extracelular într-o manieră suficientă pentru a fi eficient din punct de vedere terapeutic. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este stabil în afara unei celule, astfel încât ADC rămâne intact atunci când este prezent în condiţii extracelulare (de exemplu, înainte de transport sau livrare într-o celulă). Termenul "intact", utilizat în contextul unui ADC, înseamnă că porţiunea indivizibilă de anticorp rămâne ataşată la porţiunea indi-vizibilă de medicament. Aşa cum se utilizează în acest document, "stabil", în contextul unui linker sau ADC care cuprinde un linker, înseamnă că nu mai mult de 20%, nu mai mult de aproximativ 15%, nu mai mult de aproximativ 10%, nu mai mult de aproximativ 5%, nu mai mult de aproximativ 3%, sau nu mai mult de aproximativ 1% din linkeri (sau orice procent între acestea) într-o probă de ADC este scindat (sau, în cazul unui ADC global, nu sunt intacte altfel) atunci când ADC-ul este prezent în condiţii extracelulare.
Dacă un linker este stabil în mod extracelular poate fi determinat, pentru exem-plificare, prin includerea unui ADC în plasmă pentru o perioadă de timp predeterminată (de exemplu, 2, 4, 6, 8, 16, sau 24 de ore) şi apoi cuantificarea cantităţii de porţiune indivizibilă de medicament liberă prezentă în plasmă. Stabilitatea poate lăsa ADC-ului timp să localizeze să ţintească celulele tumorale şi să prevină eliberarea prematură a medicamentului, ceea ce ar putea scădea indicele terapeutic al ADC-ului prin deterio-rarea fără discriminare atât a ţesuturilor normale cât şi tumorale. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este stabil în afara unei celule ţintă şi eliberează porţiunea indivizibilă de medicament din ADC odată ce e în interiorul celulei, astfel încât porţiunea indivizibilă de medicament se poate lega de ţinta sa (de exemplu, la microtubuli). Astfel, un linker eficient: (i) va menţine proprietăţile specifice de legare ale porţiunii indivizibile de anticorp; (ii) va permite livrarea, de exemplu, livrarea intracelulară, a porţiunii indivi-zibile de medicament prin intermediul ataşării stabile la porţiunea indivizibilă de anticorp; (iii) va rămâne stabil şi intact până când ADC a fost transportat sau livrat la locul său ţintă; şi (iv) va permite efectul terapeutic, de exemplu, efectul citotoxic, al porţiunii indi-vizibile de medicament după scindare.
Linkerii pot avea impact asupra proprietăţilor fizico-chimice ale unui ADC. Pentru că mulţi agenţi citotoxici sunt de natură hidrofobă, legarea lor la anticorp cu o porţiune indivizibilă hidrofobă suplimentară poate duce la agregare. Agregatele ADC sunt inso-lubile şi adesea limitează încărcarea realizabilă a medicamentului pe anticorp, ceea ce poate afecta în mod negativ potenţa ADC-ului. Agregatele proteice ale produselor bio-logice au fost, în general, de asemenea, legate de imunogenicitatea crescută. Aşa cum se arată mai jos, linkerii făcuţi cunoscuţi în acest document au ca rezultat ADC-uri cu niveluri de agregare scăzute şi niveluri dorite de încărcare a medicamentului.
Un linker poate fi "scindabil" sau "non-scindabil" (Ducry şi Stump, Bioconjugate Chem. (2010) 21: 5 - 13). Linkerii scindabili sunt concepuţi să elibereze medicamentul atunci când sunt supuşi anumitor factori de mediu, de exemplu, atunci când sunt inter-nalizaţi în celula ţintă, în timp ce linkerii non-scindabili se bazează, în general, pe de-gradarea porţiunii indivizibile de anticorp în sine.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker care nu poate fi scindat. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament a ADC-ului este eliberată prin degradarea porţiunii indivizibile de anticorp. Linkerii care nu pot fi scindaţi tind să rămână asociaţi covalent cu cel puţin un aminoacid al anticorpului şi medicamentului la internalizarea de celula ţintă, şi degradarea în interiorul celulei ţintă. Linkerii care nu pot fi scindaţi includ în mod obişnuit o legătură tioeter, care este preparată prin conjugarea unei grupări tiol pe medicament sau anticorp cu o grupare maleimidă sau haloacetamidă pe anticorp sau medicament, respectiv (Goldmacher şi colab., In Cancer Drug Discovery and Development: Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins (G. L. Phillips ed., Springer, 2013)). Un linker care nu poate fi scindat cu titlu de exemplu cuprinde tioeter, ciclohexil, 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilat de N-succinimidil (SMCC), N-hidroxisuccinimidă (NHS), sau una sau mai multe porţiuni indivizibile de polietilen glicol (PEG), de exemplu, 1, 2, 3, 4, 5, sau 6 porţiuni indivizibile PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care nu poate fi scindat cuprinde (PEG)2. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul care nu poate fi scindat cu-prinde (PEG)4.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker care poate fi scindat. Un linker care poate fi scindat se referă la orice linker care cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată. Aşa cum este utilizat în acest document, termenul "porţiune indivizibilă care poate fi scindată" se referă la orice legătură chimică ce poate fi scindată. Legăturile chimice ce pot fi scindate adecvate sunt bine cunoscute în domeniul de specialitate şi includ, dar nu sunt limitate la, legături labile la acid, legături labile la protează/peptidază, legături fotolabile, legături de disulfură, şi legături labile la esterază. Linkerii care cuprind o porţiune indivizibilă care poate fi scindată pot permite eliberarea porţiunii indivizibile de medicament din ADC prin intermediul scindării la un anumit situs în linker. Aşa cum se descrie în acest document, scindarea anticorpului de toxina legată activează sau creşte activitatea toxinei. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker care poate fi scindat (de exemplu, un linker Val-Cit) demon-strează ucidere a celulelor la ţintă crescută şi/sau ucidere scăzută a celulelor departe de ţintă, în comparaţie cu un ADC care cuprinde un linker care nu poate fi scindat (de exemplu, un linker (PEG)2 sau (PEG)4 care nu poate fi scindat). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker care poate fi scindat prezintă eficaci-tate îmbunătăţită a tratamentului în raport cu un ADC care cuprinde un linker care nu poate fi scindat atunci când celulele şi/sau cancerul tratat cu ADC-ul nu exprimă niveluri ridicate ale antigenului ţintă (de exemplu, FRA sau her2). Aşa cum se descrie în acest document, scindarea anticorpului de toxina legată este necesară pentru a obţine o eficacitate îmbunătăţită a tratamentului a unui ADC, aşa cum este măsurat in vitro şi/sau in vivo.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este scindabil în condiţii intra-celulare, astfel încât scindarea linkerului eliberează suficient porţiunea indivizibilă de medicament de porţiunea indivizibilă de anticorp în mediul intracelular pentru a activa medicamentul şi/sau a face medicamentul eficient din punct de vedere terapeutic. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament nu este scin-dată de porţiunea indivizibilă de anticorp până când ADC-ul nu intră într-o celulă care exprimă un antigen specific pentru porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului, şi por-ţiunea indivizibilă de medicament este scindată de porţiunea indivizibilă de anticorp la intrarea în celulă. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată care este poziţionată astfel încât nicio parte a linkerului sau a porţiunii indivizibile de anticorp nu rămâne legată la porţiunea indivizibilă de me-dicament la scindare. Linkeri scindabili cu titlu de exemplu includ linkeri labili la acid, linkeri sensibili la protează/peptidază, linkeri fotolabili, linkeri care conţin dimetil, disul-fură, sau sulfonamidă.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker sensibil la pH, şi este sensibil la hidroliză la anumite valori ale pH-ului. De obicei, linkerul sensibil la pH este scindabil în condiţii acide. Această strategie de scindare profită în general de pH-ul mai scăzut în compartimentele intracelulare endozomale (pH ~ 5 - 6) şi lizozomale (pH ~ 4,8), în comparaţie cu citosolul (pH ~ 7,4), pentru a declanşa hidroliza unei grupări labile la acid în linker, cum ar fi o hidrazonă (Jain şi colab., (2015) Pharm Res, 32: 3526-40). Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker labil la acid şi/sau hidro-lizabil. Pentru exemplificare, poate fi folosit un linker labil la acid care este hidrolizabil în lizozom, şi conţine o grupare labilă la acid (de exemplu, o hidrazonă, o semicarbazonă, o tiosemicarbazonă, o amidă cis-aconitică, un ortoester, un acetal, un ketal, sau altele asemenea). A se vedea, de exemplu, brevetele de invenţie U.S. nr. 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik şi Walker, (1999) Pharm. Therapeutics, 83: 67 - 123; Neville şi colab., (1989) Biol. Chem., 264: 14653-61. Astfel de linkeri sunt relativ stabili în condiţii de pH neutru, cum ar fi cei din sânge, dar sunt instabili la pH sub 5,5 sau 5,0, pH-ul aproximativ al lizozomului. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul hi-drolizabil este un linker tioeter (cum ar fi, de exemplu, un tioeter ataşat la agentul tera-peutic prin intermediul unei legături acilhidrazonă). A se vedea, de exemplu, brevetul de invenţie U.S. nr. 5.622.929.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este scindabil în condiţii redu-cătoare. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este scindabil în prezenţa unui agent reducător, cum ar fi glutationă sau ditiotreitol. Aşa cum se descrie în acest do-cument, linkerul este un linker disulfură scindabil sau un linker sulfonamidă scindabil.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker disulfură scindabil. În domeniul de specialitate este cunoscută o varietate de linkeri disulfură, incluzându-i, pentru exemplificare, pe cei care pot fi formaţi folosind SATA (N-succinimidil-5-acetil-tioacetat), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionat), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) şi SMPT (N-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolu-en), SPDB şi SMPT. A se vedea, de exemplu, Thorpe şi colab., (1987) Cancer Res., 47: 5924-31; Wawrzynczak şi colab., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987). A se vedea, de asemenea, brevetul de invenţie U.S. nr. 4.880.935. Linkerii disulfură sunt utilizaţi în mod obişnuit pentru a exploata abundenţa tiolilor intracelulari, care pot facilita scindarea legăturilor lor disulfură. Concentraţiile intracelulare ale tiolului intracelular cel mai abundent, glutationul redus, sunt în general în intervalul 1-10 nM, care este de a-proximativ 1.000 de ori mai mare decât acela al tiolului molecular scăzut cel mai abun-dent în sânge (adică, cisteină) la aproximativ 5 µM (Goldmacher şi colab., In Cancer Drug Discovery and Development: Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins (G. L. Phillips ed., Springer, 2013)). Enzimele intracelulare ale familiei de izomerază de di-sulfură a proteinei pot contribui, de asemenea, la scindarea intracelulară a unui linker disulfură. Aşa cum este utilizat în acest document, un linker disulfură care poate fi scindat se referă la orice linker care cuprinde o porţiune indivizibilă de disulfură care poate fi scindată. Termenul "porţiune indivizibilă de disulfură care poate fi scindată" se referă la o legătură disulfură care poate fi scindată şi/sau redusă, de exemplu, de un tiol sau enzimă. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de disulfură care poate fi scindată este disulfidil-dimetil.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker sulfonamidă care poate fi scindat. Aşa cum este utilizat în acest document, un linker sulfonamidă care poate fi scindat se referă la orice linker care cuprinde o porţiune indivizibilă sulfonamidă care poate fi scindată. Termenul "porţiune indivizibilă sulfonamidă care poate fi scindată" se referă la o grupare sulfonamidă, adică o grupare sulfonil conectată la o grupare amină, în care legătura sulf-azot poate fi scindată.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul poate fi un linker de tip dendritic pentru ataşarea covalentă a mai mult de o porţiune indivizibilă de medicament la o porţiune indivizibilă de anticorp printr-o porţiune indivizibilă linker multifuncţională, de ramificare. A se vedea, de exemplu, Sun şi colab., (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett., 12: 2213-5; Sun şi colab., (2003) Bioorg. Med. Chem., 11: 1761-8. Linkerii dendritici pot creşte raportul molar dintre medicament şi anticorp, adică încărcarea medicamentului, care este legată de potenţa ADC-ului. Prin urmare, în cazul în care o porţiune indivizibilă de anticorp poartă doar o singură grupare cisteină tiol reactivă, pentru exemplificare, o multitudine de porţiuni indivizibile pot fi ataşate printr-un linker dendritic. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă linker sau porţiunea indivizibilă de medicament-linker poate fi ataşată la anticorp prin intermediul chimiei de punte de di-sulfură redusă sau tehnologiei limitate de utilizare a lizinei. A se vedea, de exemplu, Publ. Int. nr. WO2013173391 şi WO2013173393.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este scindabil de un agent de scindare, de exemplu, o enzimă, care este prezent în mediul intracelular (de exemplu, în interiorul unui lizozom sau endozom sau caveolae). Linkerul poate fi, de exemplu, un linker peptidic care este scindat de o peptidază intracelulară sau de o enzimă protează, incluzând, dar fără a se limita la, o protează lizozomală sau endozomală. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker peptidic care poate fi scindat. Aşa cum este utilizat în acest document, un linker peptidic care poate fi scindat se referă la orice linker care cuprinde o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată. Termenul "porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată" se referă la orice legătură chimică care leagă aminoacizii (derivaţi de aminoacizi naturali sau sintetici) care pot fi scindaţi de un agent care este prezent în mediul intracelular. De exemplu, un linker poate cuprinde o secvenţă alanină-alanină-asparagină (Ala-Ala-Asn) sau o secvenţă valină-citrulină (Val-Cit) care este scindabilă de o peptidază cum ar fi catepsina, de exemplu, catepsina B.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker care poate fi scindat de enzimă şi o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată în linker este scindabilă de către enzimă. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată este scindabilă de o enzimă lizozomală, de exemplu, catepsină. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker care poate fi scindat de catepsină. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată în linker este scindabilă de o cisteină catepsină lizozo-mală, cum ar fi catepsina B, C, F, H, K, L, O, S, V, X, sau W. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată este scindabilă de catepsina B. O dipeptidă cu titlu de exemplu care poate fi scindată de catepsina B este valină-citrulină (Val-Cit) (Dubowchik şi colab., (2002) Bioconjugate Chem., 13: 855-69). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată demonstrează niveluri de agregare mai mici şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului (p) în raport cu un ADC care cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată alternativă (de exemplu, o porţiune indivizibilă de disulfură ce poate fi scindată sau o porţiune indivizibilă de sulfonamidă ce poate fi scindată).
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul sau porţiunea indivizibilă pep-tidică ce poate fi scindată în linker cuprinde o unitate de aminoacizi. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi permite scindarea linkerului de către o pro-tează, facilitând astfel eliberarea porţiunii indivizibile de medicament din ADC la expu-nerea la una sau mai multe proteaze intracelulare, cum ar fi una sau mai multe enzime lizozomale (Doronina şi colab., (2003) Nat. Biotechnol., 21: 778-84; Dubowchik şi Walker, (1999) Pharm. Therapeutics, 83: 67-123). Unităţile de aminoacizi cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide, şi pentapep-tide. Dipeptidele cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, valină-citrulină (Val-Cit), alanină-asparagină (Ala-Asn), alanină-fenilalanină (Ala-Phe), fenilalanină-lizină (Phe-Lys), alanină-lizină (Ala-Lys), alanină-valină (Ala-Val), valină-alanină (Val-Ala), valină-lizină (Val-Lys), lizină-lizină (Lys-Lys), fenilalanină-citrulină (Phe-Cit), leucine-citrulină (Leu-Cit), izoleucină-citrulină (Ile-Cit), triptofan-citrulină (Trp-Cit), şi fenilalanină-alanină (Phe-Ala). Tripeptidele cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, ala-nină-alanină-asparagină (Ala-Ala-Asn), glicină-valină-citrulină (Gly-Val-Cit), glicină-glicină-glicină (Gly-Gly-Gly), fenilalanină-fenilalanină-lizină (Phe-Phe-Lys), şi glicină-fenilalanină-lizină (Gly-Phe-Lys). Alte unităţi de aminoacizi cu titlu de exemplu includ, dar nu sunt limitate la, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe-N9-tosil-Arg, şi Phe-N9-Nitro-Arg, aşa cum este descris în, de exemplu, brevetul de invenţie U.S. nr. 6.214.345. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi în linker cuprinde Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi în linker cuprinde Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde Val-Cit de-monstrează ucidere scăzută a celulelor departe de ţintă, ucidere a celulelor la ţintă crescută, niveluri de agregare mai mici, şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului (p) în raport cu un ADC care cuprinde o unitate de aminoacizi alternativă sau o porţiune indivizibilă care poate fi scindată alternativă. O unitate de aminoacizi poate cuprinde reziduuri de aminoacizi care apar în mod natural şi/sau aminoacizi minori şi/sau analogi de aminoacizi care nu apar în mod natural, cum ar fi citrulina. Unităţile de aminoacizi pot fi proiectate şi optimizate pentru scindarea enzimatică de către o anumită enzimă, pentru exemplificare, o protează asociată tumorii, o protează lizozomală cum ar fi catepsina B, C, D sau S, sau o protează plasminică.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul în oricare dintre ADC-urile fă-cute cunoscute în acest document poate cuprinde cel puţin o unitate de distanţiere care uneşte porţiunea indivizibilă de anticorp cu porţiunea indivizibilă de medicament. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere uneşte un situs de scindare (de exemplu, o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată) în linker la porţiunea indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul şi/sau unitatea de distanţiere în linker sunt în mod substanţial hidrofile. Se poate utiliza un linker hidrofil pentru a reduce măsura în care medicamentul poate fi pompat afară din celulele can-ceroase rezistente prin rezistenţa multiplă la medicamente (MDR) sau transportori similari din punct de vedere funcţional. În unele aspecte, linkerul include una sau mai multe porţiuni indivizibile de polietilen glicol (PEG), de exemplu, 1, 2, 3, 4, 5, sau 6 porţiuni indivizibile de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este un linker PEG mai scurt, şi oferă stabilitate îmbunătăţită şi agregare redusă faţă de linkeri PEG mai lungi.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere în linker cuprinde una sau mai multe porţiuni indivizibile de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde -(PEG)m-, şi m este un număr întreg de la 1 până la 10. Aşa cum se descrie în acest document, m variază de la 1 până la 10; de la 2 până la 8; de la 2 până la 6; de la 2 până la 5; de la 2 până la 4; sau de la 2 până la 3. Aşa cum se descrie în acest document, m este 8. Aşa cum se descrie în acest document, m este 4. Aşa cum se descrie în acest document, m este 3. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, m este 2. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde (PEG)2, (PEG)4, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)3-triazol-(PEG)3, (PEG)4-triazol-(PEG)3, sau dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde (PEG)2. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde o unitate de distanţiere mai scurtă (de exemplu, (PEG)2) demonstrează niveluri de agregare mai mici şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului (p) în raport cu un ADC care cuprinde o unitate de distanţiere mai lungă (de exemplu, (PEG)8).
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere în linker cuprinde o porţiune indivizibilă alchil. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde -(CH2)n-, şi n este un număr întreg de la 1 până la 10 (adică, n poate fi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, sau 10). Aşa cum se descrie în acest document, n este 5. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde o unitate de distanţiere mai scurtă (de exemplu, (CH2)5) demonstrează niveluri de agregare mai mici şi/sau o încărcare mai mare a medicamentului (p) în raport cu un ADC care cuprinde o unitate de distanţiere mai lungă (de exemplu, (PEG)8).
O unitate de distanţiere poate fi utilizată, pentru exemplificare, pentru a lega porţiunea indivizibilă de anticorp la porţiunea indivizibilă de medicament, fie în mod direct, fie în mod indirect. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere leagă porţiunea indivizibilă de anticorp la porţiunea indivizibilă de medicament în mod direct. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp şi porţiunea indivizibilă de medicament sunt ataşate prin intermediul unei unităţi distanţier care cuprinde una sau mai multe porţiuni indivizibile de PEG (de exemplu, (PEG)2 sau (PEG)4). Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere leagă porţiunea indivizibilă de anticorp la porţiunea indivizibilă de medicament în mod indirect. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere leagă porţiunea indivizibilă de anticorp la porţiunea indivizibilă de medicament în mod indirect printr-o porţiune indivizibilă care poate fi scindată (de exemplu, o peptidă care poate fi scindată, o disulfură care poate fi scindată, sau o sulfonamidă care poate fi scindată) şi/sau o porţiune indivizibilă de ataşare pentru a uni unitatea de distanţiere la porţiunea indivizibilă de anticorp, de exemplu, o porţiune indivizibilă de maleimidă.
Unitatea de distanţiere, aşa cum se descrie în acest document, se ataşează la porţiunea indivizibilă de anticorp (adică anticorpul sau fragmentul de legare la antigen) prin intermediul unei porţiuni indivizibile de maleimidă (Mal). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde un linker ataşat la porţiunea indivizibilă de anticorp prin intermediul unei porţiuni indivizibile de maleimidă demonstrează o încărcare de medicament mai mare (p) în raport cu un ADC care cuprinde un linker ataşat la porţiunea indivizibilă de anticorp prin intermediul unei porţiuni indivizibile de ataşare alternative, cum ar fi o porţiune indivizibilă de succinimidă.
O unitate de distanţiere care se ataşează la anticorpul sau fragmentul de legare la antigen prin intermediul unei Mal este menţionată în acest document ca o "unitate de distanţiere Mal". Termenul "porţiune indivizibilă de maleimidă", aşa cum este utilizat în acest document, înseamnă un compus care conţine o grupare maleimidă şi care este reactiv cu o grupare sulfhidril, de exemplu, o grupare sulfhidril a unui reziduu de cisteină în porţiunea indivizibilă de anticorp. Alte grupări funcţionale care sunt reactive cu grupările sulfhidril (tioli) includ, dar nu sunt limitate la, iodacetamidă, bromacetamidă, vinil piridină, disulfură, piridil disulfură, izocianat, şi izotiocianat. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal este reactivă cu un reziduu de cisteină în anticorpul sau fragmentul de legare la antigen. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal este unită la anticorpul sau fragmentul de legare la antigen prin intermediul reziduului de cisteină. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal cuprinde o porţiune indivizibilă alchil.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere Mal şi o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată cuprinde o unitate de aminoacizi. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere Mal şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)m şi Val-Cit, unde m este 2 până la 8 sau 2 până la 5, sau 2, 3, 4 sau 5. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)8 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, linkerul cuprinde Mal-(CH2)5 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere Mal şi Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2 şi Ala-Ala-Asn.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere Mal şi o porţiune indivizibilă de disulfură ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de disulfură ce poate fi scindată este disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere Mal şi disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3 şi disulfidil-dimetil.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere Mal şi o porţiune indivizibilă de sulfonamidă ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3 şi sulfonamidă.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere se ataşează la anticorpul sau fragmentul de legare la antigen prin intermediul unei porţiuni indivizibile de succinimidă (OSu). O unitate de distanţiere care se ataşează la anticorpul sau frag-mentul de legare la antigen prin intermediul unei OSu este menţionată în acest docu-ment ca o "unitate de distanţiere OSu". Termenul "porţiune indivizibilă de succinimidă", aşa cum este utilizat în acest document, înseamnă un compus care conţine un compus de succinimidă care este reactiv cu o grupare amină, de exemplu, o grupare amină a unui reziduu de lizină în porţiunea indivizibilă de anticorp. O porţiune indivizibilă de succinimidă cu titlu de exemplu este N-hidroxisuccinimida (NHS). Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere OSu este reactivă cu un reziduu de lizină în anticorpul sau fragmentul de legare la antigen. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere OSu este unită la anticorpul sau fragmentul de legare la antigen prin intermediul reziduului de lizină. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere OSu cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere OSu cuprinde o porţiune indivizibilă alchil.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere OSu şi o porţiune indivizibilă peptidică ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată cuprinde o unitate de ami-noacizi. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere OSu şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)9 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(CH2)5 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3 şi Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere OSu şi Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2 şi Ala-Ala-Asn.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere OSu şi o porţiune indivizibilă de disulfură ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de disulfură ce poate fi scindată este disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere OSu şi disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3 şi disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cu-prinde OSu-dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3 şi disulfidil-dimetil.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de distanţiere OSu şi o porţiune indivizibilă de sulfonamidă ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3 şi sulfonamidă. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3 şi sulfonamidă.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal sau unitatea de distanţiere OSu ataşează porţiunea indivizibilă de anticorp (adică anticorpul sau frag-mentul de legare la antigen) la porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal sau unitatea de distan-ţiere OSu ataşează anticorpul sau fragmentul de legare la antigen la o porţiune indivi-zibilă peptidică ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată cuprinde o unitate de aminoacizi. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitatea de aminoacid a unităţii de distan-ţiere Mal sau unitatea de aminoacid a unităţii de distanţiere OSu. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal sau unitatea de distanţiere OSu cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de dis-tanţiere Mal sau unitatea de distanţiere OSu cuprinde o porţiune indivizibilă alchil. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi cuprinde Ala-Ala-Asn.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde structura: unitate de distanţiere Mal-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde struc-tura: Mal-(PEG)2-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde structura: Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)8-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(CH2)5-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere Mal-Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Ala-Ala-Asn.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere OSu-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)9-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(CH2)5-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere OSu-Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2-Ala-Ala-Asn.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal sau unitatea de distanţiere OSu ataşează anticorpul sau fragmentul de legare la antigen la o porţiune indivizibilă de disulfură ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere Mal-disulfură sau unitate de distanţiere OSu-disulfură. Aşa cum se descrie în acest document, disulfura este disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere Mal-disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere OSu-disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere Mal sau unitatea de distanţiere OSu ataşează anticorpul sau fragmentul de legare la antigen la o porţiune indivizibilă de sulfonamidă ce poate fi scindată. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de distanţiere Mal-sulfonamidă sau unitate de distanţiere OSu-sulfonamidă. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-sulfonamidă. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-sulfonamidă. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3-sulfonamidă.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă care poate fi scin-dată în linker este unită în mod direct la porţiunea indivizibilă de medicament. Aşa cum se descrie în acest document, o altă unitate de distanţiere este utilizată pentru a ataşa porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker la porţiunea indivizibilă de medi-cament. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament este eribulină. Aşa cum se descrie în acest document, eribulina este ataşată la porţiu-nea indivizibilă care poate fi scindată în linker printr-o unitate de distanţiere. Aşa cum se descrie în acest document, eribulina este ataşată la porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker printr-o unitate de distanţiere auto-distrugătoare. Aşa cum se descrie în acest document, eribulina este ataşată la porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker printr-o unitate de distanţiere auto-distrugătoare, porţiunea indivizibilă care poate fi scindată cuprinde Val-Cit, şi o unitate de distanţiere suplimentară care cuprinde PEG uneşte porţiunea indivizibilă care poate fi scindată la porţiunea indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, eribulina este unită la un anticorp anti-FRA prin intermediul unei unităţi de distanţiere Mal în linker unită la o porţiune indivi-zibilă care poate fi scindată Val-Cit şi o unitate de distanţiere auto-distrugătoare pAB. Aşa cum se descrie în acest document, eribulina este unită la un anticorp anti-her2 prin intermediul unei unităţi de distanţiere Mal în linker unită la o porţiune indivizibilă care poate fi scindată Val-Cit şi o unitate de distanţiere auto-distrugătoare pAB.
O unitate de distanţiere poate fi "auto-distrugătoare" sau "non-auto-distrugă-toare". O unitate de distanţiere "non-auto-distrugătoare" este una în care o parte din, sau toată unitatea de distanţiere rămâne legată la porţiunea indivizibilă de medicament la scindarea linkerului. Exemplele de unităţi distanţier non-auto-distrugătoare includ, dar nu sunt limitate la, o unitate de distanţiere glicină şi o unitate de distanţiere glicină-glicină. Unităţile de distanţiere non-auto-distrugătoare se pot degrada în cele din urmă în timp, dar nu eliberează cu uşurinţă un medicament legat nativ în întregime în condiţii celulare. O unitate de distanţiere "auto-distrugătoare" permite eliberarea porţiunii indi-vizibilă de medicament native în condiţii intracelulare. Un "medicament nativ" este unul în care nicio parte a unităţii de distanţiere sau altă modificare chimică nu rămâne după scindarea/degradarea unităţii de distanţiere.
Chimia de auto-distrugere este cunoscută în domeniul de specialitate şi ar putea fi selectată cu uşurinţă pentru ADC-urile făcute cunoscute. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere care ataşează porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker la porţiunea indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) este auto-distrugătoare, şi suferă auto-distrugere concomitent cu, sau puţin înainte/după scindarea porţiunii indivizibile care poate fi scindată în condiţii intracelulare.
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere auto-distrugă-toare în linker cuprinde o unitate p-aminobenzil. Aşa cum se descrie în acest document, un alcool p-aminobenzilic (pABOH) este ataşat la o unitate de aminoacizi sau la altă porţiune indivizibilă care poate fi scindată în linker prin intermediul unei legături amidă, şi un carbamat, metilcarbamat, sau carbonat este făcut între pABOH şi porţiunea indivi-zibilă de medicament (Hamann şi colab., (2005) Expert Opin. Ther. Patents, 15: 1087-103). Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere auto-distrugătoare este sau cuprinde p-aminobenziloxicarbonil (pAB). Fără a fi legat de teorie, se crede că auto-distrugerea pAB implică o reacţie spontană de 1,6-eliminare (Jain şi colab., (2015) Pharm Res, 32: 3526-40).
Aşa cum se descrie în acest document, structura p-aminobenziloxicarbonilului (pAB) utilizat în ADC-urile făcute cunoscute este prezentată mai jos:
Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere auto-distrugă-toare ataşează porţiunea indivizibilă care poate fi scindată în linker la amina C-35 pe eribulină. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere auto-distru-gătoare este pAB. Aşa cum se descrie în acest document, pAB ataşează porţiunea in-divizibilă care poate fi scindată în linker la amina C-35 pe eribulină. Aşa cum se descrie în acest document, pAB suferă auto-distrugere la scindarea porţiunii indivizibilă care poate fi scindată, iar eribulina este eliberată din ADC în forma sa nativă, activă. Aşa cum se descrie în acest document, un anticorp anti-FRA (de exemplu, MORAb-003) este unit la amina C-35 a eribulinei printr-un linker care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, un anticorp anti-her2 (de exemplu, trastuzumab) este unit la amina C-35 a eribulinei printr-un linker care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, pAB suferă auto-distrugere la scindarea unei porţiuni indivizibile peptidice care poate fi scindată în linker. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă peptidică ce poate fi scindată cuprinde o unitate de aminoacizi. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde unitate de aminoacizi-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi este Val-Cit. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Val-Cit-pAB (VCP). Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de aminoacizi este Ala-Ala-Asn. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Ala-Ala-Asn-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, pAB suferă auto-distrugere la scindarea unei porţiuni indivizibile de disulfură ce poate fi scindată în linker. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde disulfură-pAB. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, linkerul cuprinde disulfidil-dimetil-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, pAB suferă auto-distrugere la scindarea unei porţiuni indivizibile de sulfonamidă ce poate fi scindată în linker. Aşa cum se des-crie în acest document, linkerul cuprinde sulfonamidă-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker, unde linkerul cuprinde a unitate de distanţiere Mal, o unitate de aminoacizi care poate fi scindată, şi un pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă alchil. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-unitate de aminoacizi-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)2-Ala-Ala-Asn-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)8-unitate de aminoacizi-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)8-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(CH2)5-unitate de aminoacizi-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(CH2)5-Val-Cit-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker, unde linkerul cuprinde unitate de distanţiere Mal-disulfură-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-disul-fură-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker, unde linkerul cuprinde unitate de distanţiere Mal-sulfonamidă-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde Mal-(PEG)4-triazol-(PEG)3-sul-fonamidă-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker, unde linkerul cuprinde unitate de distanţiere OSu-unitate de aminoacid-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă alchil. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2-unitate de aminoacid-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)2-Ala-Ala-Asn-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)9-unitate de aminoacid-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)9-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cu-prinde OSu-(CH2)5-unitate de aminoacid-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(CH2)5-Val-Cit-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-unitate de aminoacid-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-Val-Cit-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker, unde linkerul cuprinde unitate de distanţiere OSu-disulfură-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-disul-fură-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3-disulfură-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-dibenzilciclooctenă-triazol-(PEG)3-disulfidil-dimetil-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker, unde linkerul cuprinde unitate de distanţiere OSu-sulfonamidă-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, unitatea de distanţiere cuprinde o porţiune indivizibilă de PEG. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-(PEG)3-triazol-(PEG)3-sul-fonamidă-pAB. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul cuprinde OSu-diben-zilciclooctenă-triazol-(PEG)3-sulfonamidă-pAB.
Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este proiectat pentru a facilita uciderea vecinătăţilor (uciderea celulelor învecinate) prin scindare după internalizarea celulară şi difuzia porţiunii indivizibile de medicament-linker şi/sau a porţiunii indivizibile de medicament singură la celulele învecinate. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul promovează internalizarea celulară. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul este proiectat pentru a minimiza scindarea în mediul extracelular şi, prin urmare, pentru a reduce toxicitatea în ţesut departe de ţintă (de exemplu, ţesutul non-canceros), în acelaşi timp păstrând legarea ADC de ţesutul ţintă şi uciderea vecinătăţilor a ţesutului canceros care nu exprimă un antigen ţintit de porţiunea indivizibilă de anticorp a unui ADC, dar înconjoară ţesutul de cancer ţintă care exprimă acel antigen. Aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde o porţiune indivizibilă de maleimidă (Mal), o porţiune indivizibilă de polietilen glicol (PEG), valină-citrulină (Val-Cit sau "vc"), şi un pAB oferă aceste caracteristici funcţionale. Aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB este deosebit de eficient în furnizarea acestor caracteristici funcţionale, de exemplu, atunci când se uneşte o porţiune indivizibilă de anticorp anti-FRA cum ar fi MORAb-003 şi o porţiune indivizibilă de medicament cum ar fi eribulina. Aşa cum se descrie în acest document, cel puţin unele dintre aceste caracteristici funcţionale pot fi observate, de asemenea, fără o porţiune indivizibilă de anticorp anti-FRA, şi/sau fără MORAb-003. De exemplu, aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB este eficient în furnizarea unora dintre acestor caracteristici funcţionale sau a tuturor caracteristicilor funcţionale, de exemplu, atunci când se uneşte o porţiune indivizibilă de anticorp anti-her2 cum ar fi trastuzumab şi o porţiune indivizibilă de medicament cum ar fi eribulina.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp este conjugată la porţiunea indivizibilă de medicament prin intermediul unui linker care cuprinde o porţiune indivizibilă de maleimidă (Mal), o porţiune indivizibilă de polietilen glicol (PEG), valină citrulină (Val-Cit sau "vc"), şi un pAB. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de maleimidă ataşează covalent porţiunea indivizibilă de medicament-linker la porţiunea indivizibilă de anticorp, şi pAB acţionează ca o unitate de distanţiere auto-distrugătoare. Un astfel de linker poate fi menţionat ca linkerul "m-vc-pAB", linkerul "Mal-VCP", linkerul "Mal-(PEG)2-VCP", sau linkerul "Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB". Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament este eribulina. Structura Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulinei este furnizată în Tabelul 46. pAB al linkerului Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB este ataşat la amina C-35 pe eribulină.
S-a descoperit că ADC-urile care cuprind Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină demonstrează o combinaţie particulară de proprietăţi dorite, în particular atunci când se împerechează cu un anticorp anti-FRA cum ar fi MORAb-003 sau un fragment de legare la antigen al acestuia. Aceste proprietăţi includ, dar nu sunt limitate la, niveluri eficiente de încărcare a medicamentului (p ~ 4), niveluri de agregare scăzute, stabilitate în condiţii de depozitare sau atunci când sunt în circulaţie în corp (de exemplu, stabilitate serică), afinitate păstrată pentru celulele care exprimă ţinta comparabil cu anticorpul neconjugat, citotoxicitate puternică împotriva celulelor care exprimă ţinta, niveluri scă-zute de ucidere a celulelor departe de ţintă, niveluri ridicate de ucidere a vecinătăţilor, şi/sau activitate anticancer in vivo eficientă, toate în comparaţie cu ADC-urile care utilizează alte porţiuni indivizibile de linker-toxină şi/sau anticorp. În timp ce în domeniul de specialitate sunt cunoscute numeroase opţiuni de linker şi combinaţii de distanţiere şi situsuri de scindare, şi pot oferi anumite beneficii în una sau mai multe dintre aceste categorii funcţionale, combinaţia particulară dintre un linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la o porţiune indivizibilă de anticorp cum ar fi un anticorp anti-FRA (de exemplu, MORAb-003) poate oferi proprietăţi bune sau superioare în spectrul proprietăţilor funcţionale dorite pentru un ADC terapeutic. Aşa cum se descrie în acest document, proprietăţile funcţionale bune sau superioare oferite de combinaţia particulară a unui linker Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB care uneşte eribulina la o porţiune indivizibilă de anticorp pot fi observate cu acest linker-toxină conjugat la, de exemplu, un anticorp anti-her 2, cum ar fi trastuzumab.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină şi o porţiune indivizibilă de anticorp care cuprinde un anticorp de internalizare sau un fragment de legare la antigen al acestuia care păstrează capacitatea de a ţinti şi internaliza într-o celulă tumorală. Aşa cum se descrie în acest document, ADC cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină şi un anticorp de internalizare sau un fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care expri-mă FRA. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă FRA cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 2 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 3 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 4 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 7 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 8 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 9 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 13 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 14 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 15 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 16 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 17 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 18 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT. Aşa cum se descrie în acest document, anti-corpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă FRA cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care expri-mă FRA cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC are Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care:
(i) Ab este un anticorp anti-receptorul alfa al folatului (FRA) de internalizare sau un fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprin-zând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 2 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 3 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 4 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a com-plementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 7 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 8 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 9 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cu-prinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 13 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 14 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 15 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de amino-acizi având ID. SECV. NR.: 16 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 17 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 18 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT;
(ii) D este eribulină;
(iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi
(iv) p este un număr întreg de la 1 până la 20.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare este MORAb-003. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 1 până la 8, sau de la 1 până la 6. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 2 până la 8, sau 2 până la 5. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 3 la 4. Aşa cum se descrie în acest document, p este 4.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină şi un anticorp de internalizare sau fragment de legare la antigen de internali-zare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă her2. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă her2 cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 71 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 72 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 73 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complemen-tarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 74 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 75 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 76 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 191 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 192 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 193 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 194 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 195 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 196 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţin-teşte o celulă tumorală care exprimă her2 cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 27, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 28. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă her2 cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC are Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care:
(i) Ab este un anticorp anti-receptorul factorului de creştere epidermic uman 2 (her2) de internalizare sau un fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lan-ţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 71 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 72 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 73 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprin-zând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 74 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 75 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 76 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lan-ţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 191 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 192 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 193 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cu-prinzând secvenţe de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 194 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 195 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 196 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT;
(ii) D este eribulină;
(iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi
(iv) p este un număr întreg de la 1 până la 20.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 27, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 28. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare este trastuzumab. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 1 până la 8, sau de la 1 până la 6. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 2 până la 8, sau 2 până la 5. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 3 la 4. Aşa cum se descrie în acest document, p este 4.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină şi un anticorp de internalizare sau fragment de legare la antigen de internali-zare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă mezotelina (MSLN). Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă MSLN cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 65 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 66 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 67 (HCDR3); şi trei regiuni de deter-minare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 68 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 69 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 70 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 185 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 186 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 187 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a comple-mentarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 188 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 189 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 190 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţinteşte o celulă tumorală care exprimă MSLN cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 25, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de ami-noacizi având ID. SECV. NR.:26. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau fragmentul de legare la antigen de internalizare al acestuia care ţin-teşte o celulă tumorală care exprimă MSLN cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC are Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care:
(i) Ab este un anticorp anti-mezotelină de internalizare sau un fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de ami-noacizi având ID. SECV. NR.: 65 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 66 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 67 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 68 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 69 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 70 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei regiuni de de-terminare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secven-ţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 185 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 186 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 187 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a com-plementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 188 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 189 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 190 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT;
(ii) D este eribulină;
(iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi
(iv) p este un număr întreg de la 1 până la 20.
Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen de internalizare al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 25, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 26. Aşa cum se descrie în acest document, anticorpul de internalizare este MORAb-003, MORAb-009, sau trastuzumab. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 1 până la 8, sau de la 1 până la 6. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 2 până la 8, sau 2 până la 5. Aşa cum se descrie în acest document, p este de la 3 la 4. Aşa cum se descrie în acest document, p este 4.
Porţiuni indivizibile de medicament
Porţiunea indivizibilă de medicament (D) a ADC-urilor descrişi în acest docu-ment poate fi orice agent chimioterapeutic. Clasele utile de agenţi chimioterapeutici includ, pentru exemplificare, agenţi anti-tubulină. Aşa cum se descrie în acest docu-ment, porţiunea indivizibilă de medicament este un agent anti-tubulină. Exemplele de agenţi anti-tubulină includ criptoficina şi eribulina. Porţiunea indivizibilă de medicament preferată pentru utilizare în ADC-urile descrise este eribulina.
Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de medicament este eribulina. Aşa cum se descrie în acest document, linkerul ADC-ului este ataşat prin intermediul aminei C-35 pe eribulină.
Aşa cum se descrie în acest document, forma naturală a eribulinei utilizată pentru unirea la linker şi porţiunea indivizibilă de anticorp este arătată mai jos:
Aşa cum se descrie în acest document, un intermediar, care este precursorul linkerului, este pus în reacţie cu porţiunea indivizibilă de medicament în condiţii cores-punzătoare. Aşa cum se descrie în acest document, grupările reactive sunt utilizate pe medicament şi/sau intermediar sau linker. Produsul reacţiei dintre medicament şi inter-mediar, sau medicamentul derivatizat, este pus în reacţie ulterior cu anticorpul sau fragmentul de legare la antigen în condiţii corespunzătoare. Alternativ, linkerul sau intermediarul poate fi pus în reacţie mai întâi cu anticorpul sau un anticorp derivatizat, şi apoi pus în reacţie cu medicamentul sau medicamentul derivatizat.
Pentru ataşarea covalentă a medicamentelor şi/sau a linkerilor la porţiunea in-divizibilă de anticorp este disponibilă o serie de reacţii diferite. Acest lucru este adesea obţinut prin reacţia unuia sau mai multor reziduuri de aminoacizi ale moleculei de anti-corpi, incluzând grupările de amină ale lizinei, grupările de acid carboxilic libere ale acidului glutamic şi acidului aspartic, grupările sulfhidril ale cisteinei, şi diferitele porţiuni indivizibile ale aminoacizilor aromatici. De exemplu, ataşarea covalentă non-specifică poate fi întreprinsă folosind o reacţie de carbodiimidă pentru a lega o grupare carboxi (sau amino) pe un compus la o grupare amino (sau carboxi) pe o porţiune indivizibilă de anticorp. În plus, pentru a lega gruparea amino pe un compus la o grupare amino pe o porţiune indivizibilă de anticorp pot fi utilizaţi, de asemenea, agenţi bifuncţionali, cum ar fi dialdehidele sau imidoesterii. De asemenea, pentru ataşarea medicamentelor la agenţi de legare este disponibilă reacţia de bază Schiff. Această metodă implică periodat oxi-darea unui medicament care conţine grupări glicol sau hidroxi, formând astfel o aldehidă care este apoi pusă în reacţie cu agentul de legare. Ataşarea are loc prin formarea unei baze Schiff cu grupări amino ale agentului de legare. Izotiocianaţii pot fi folosiţi, de asemenea, ca agenţi de cuplare pentru ataşarea covalentă a medicamentelor la agenţi de legare. Alte tehnici sunt cunoscute specialiştilor în domeniu şi în cadrul domeniului de aplicare al prezentei descrieri a invenţiei.
Încărcarea medicamentului
Încărcarea medicamentului este reprezentată prin p, şi este menţionată, de asemenea, în acest document, ca raportul medicament-anticorp (DAR). Încărcarea medicamentului poate varia de la 1 până la 20 de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, p este un nu-măr întreg de la 1 până la 20. Aşa cum se descrie în acest document, p este un număr întreg de la 1 până la 10, 1 până la 9, 1 până la 8, 1 până la 7, 1 până la 6, 1 până la 5, 1 până la 4, 1 până la 3, sau 1 până la 2. Aşa cum se descrie în acest document, p este un număr întreg de la 2 până la 10, 2 până la 9, 2 până la 8, 2 până la 7, 2 până la 6, 2 până la 5, 2 până la 4, sau 2 până la 3. Aşa cum se descrie în acest document, p este un număr întreg de la 3 la 4. Aşa cum se descrie în acest document, p este 1, 2, 3, 4, 5, sau 6, preferabil 3 sau 4.
Încărcarea medicamentului poate fi limitată de numărul de situsuri de ataşare în porţiunea indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă linker (L) a ADC-ului se ataşează la porţiunea indivizibilă de anticorp printr-o grupare activă din punct de vedere chimic pe unul sau mai multe reziduuri de aminoacizi în porţiunea indivizibilă de anticorp. Pentru exemplificare, linkerul poate fi ataşat la porţiunea indivizibilă de anticorp prin intermediul unei grupări amino, imino, hidroxil, tiol sau carboxil libere (de exemplu, la capătul N- sau C-terminal, la gruparea amino epsilon a unuia sau mai multor reziduuri de lizină, la gruparea de acid carboxilic liberă a unuia sau mai multor reziduuri de acid glutamic sau acid aspartic, sau la gruparea sulfhidril a unuia sau mai multor reziduuri de cisteină). Situsul la care este ataşat linkerul poate fi un reziduu natural în secvenţa de aminoacizi a porţiunii indivizibile de anticorp, sau acesta poate fi introdus în porţiunea indivizibilă de anticorp, de exemplu, prin tehnologia ADN recombinant (de exemplu, prin introducerea unui reziduu de cisteină în secvenţa de aminoacid) sau prin biochimie proteică (de exemplu, prin reducere, ajustarea pH-ului sau hidroliză).
Aşa cum se descrie în acest document, numărul porţiunilor indivizibile de me-dicament care pot fi conjugate la o porţiune indivizibilă de anticorp este limitat de nu-mărul reziduurilor de cisteină libere. Pentru exemplificare, în cazul în care ataşamentul este o grupare cisteină tiol, un anticorp poate avea doar una sau câteva grupări cisteină tiol, sau poate avea doar una sau câteva grupări tiol suficient de reactive prin care poate fi ataşat un linker. În general, anticorpii nu conţin multe grupări cisteină tiol libere şi re-active care pot fi legate la o porţiune indivizibilă de medicament. Într-adevăr, majoritatea reziduurilor cisteină tiol din anticorpi există ca punţi disulfură. Ataşarea excesivă de linker-toxină la un anticorp poate destabiliza anticorpul prin reducerea reziduurilor de cisteină disponibile pentru a forma punţi disulfură. Prin urmare, un raport optim medi-cament:anticorp ar trebui să crească potenţa ADC-ului (prin creşterea numărului de porţiuni indivizibile de medicament ataşate per anticorp) fără a destabiliza porţiunea indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, un raport optim poate fi de aproximativ 3 - 4.
Aşa cum se descrie în acest document, un linker ataşat la o porţiune indivizibilă de anticorp printr-o porţiune indivizibilă Mal asigură un raport de aproximativ 3 - 4. Aşa cum se descrie în acest document, un linker ataşat la o porţiune indivizibilă de anticorp printr-o porţiune indivizibilă alternativă (de exemplu, o porţiune indivizibilă OSu) poate furniza un raport mai puţin optim (de exemplu, un raport mai mic, cum ar fi aproximativ 0 - 3). Aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde o unitate de dis-tanţiere scurtă (de exemplu, o unitate de distanţiere PEG scurtă cum ar fi (PEG)2 sau (PEG)4, sau o unitate de distanţiere alchil scurtă cum ar fi (CH2)5) asigură un raport de aproximativ 3 - 4. Aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde o unitate de distanţiere mai lungă (de exemplu, (PEG)8) poate furniza un raport mai puţin optim (de exemplu, un raport mai mic, cum ar fi aproximativ 0 - 3). Aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată peptidică asigură un raport de aproximativ 3 - 4. Aşa cum se descrie în acest document, un linker care cuprinde o porţiune indivizibilă care poate fi scindată alternativă (de exemplu, o disulfură care poate fi scindată sau o sulfonamidă care poate fi scindată) poate furniza un raport mai puţin optim (de exemplu, un raport mai mic, cum ar fi aproximativ 0 - 3). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină unită la un anticorp cum ar fi un anticorp anti-FRA (de exemplu, MORAb-003) are un raport de aproximativ 3 - 4. Aşa cum se descrie în acest document, un raport de aproximativ 3 - 4 este observat cu un ADC care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină unită la un anticorp diferit, cum ar fi un anticorp anti-her2 (de exemplu, trastuzumab). Aşa cum se descrie în acest document, raportul optim observat cu ADC-uri care cuprind linker-toxină Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulină este independent de anticorp.
Aşa cum se descrie în acest document, o porţiune indivizibilă de anticorp este expusă condiţiilor de reducere înainte de conjugare pentru a genera unul sau mai multe reziduuri de cisteină libere. Un anticorp, aşa cum se descrie în acest document, poate fi redus cu un agent reducător, cum ar fi ditiotreitol (DTT) sau tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP), în condiţii de reducere parţială sau totală, pentru a genera grupări cisteină tiol reactive. Cisteinele neîmperecheate pot fi generate prin reducere parţială cu echivalenţi molari de TCEP limitaţi, ceea ce reduce preferenţial legăturile disulfură intercatenare care leagă lanţul uşor şi lanţul greu (o pereche per împerechere HL) şi cele două lanţuri grele în regiunea balama (două perechi per împerechere H-H în cazul IgG1 umane) în timp ce lasă intacte legăturile disulfură intracatenare (Stefano şi colab., (2013) Methods Mol. Biol., 1045: 145-71). Aşa cum se descrie în acest document, legăturile disulfură în interiorul anticorpilor sunt reduse electrochimic, de exemplu, prin întrebuinţarea unui electrod de lucru care aplică o tensiune alternativă de reducere şi oxidare. Această abordare poate permite cuplarea în-linie a reducerii legăturii disulfură la un dispozitiv analitic (de exemplu, un dispozitiv de detectare electrochimică, un spectrometru RMN, sau un spectrometru de masă) sau un dispozitiv de separare chimică (de exemplu, un cromatograf lichid (de exemplu, un HPLC) sau un dispozitiv de electroforeză (a se ve-dea, de exemplu, Publ. U.S. nr. 20140069822)). Aşa cum se descrie în acest document, un anticorp este supus condiţiilor de denaturare pentru a dezvălui grupări nucleofile reactive pe reziduuri de aminoacizi, cum ar fi lizina sau cisteina.
Încărcarea medicamentului a unui ADC poate fi controlată în moduri diferite, de exemplu, prin: (i) limitarea excesului molar al intermediarului medicament-linker sau al reactivului linker în raport cu anticorpul; (ii) limitarea timpului sau temperaturii reacţiei de conjugare; (iii) condiţii reductive parţiale sau limitative pentru modificarea cisteină tiolului; şi/sau (iv) proiectarea prin inginerie prin tehnici recombinante a secvenţei de aminoacizi a anticorpului astfel încât numărul şi poziţia reziduurilor de cisteină să fie modificate pentru controlul numărului şi/sau poziţiei ataşamentelor medicament-linker.
Aşa cum se descrie în acest document, reziduurile de cisteină libere sunt in-troduse în secvenţa de aminoacizi a porţiunii indivizibile de anticorp. Pentru exemplifi-care, pot fi preparaţi anticorpi proiectaţi prin inginerie cu cisteină, în care unul sau mai mulţi aminoacizi ai unui anticorp părinte sunt înlocuiţi cu un aminoacid cisteină. Orice formă de anticorp poate fi astfel proiectată prin inginerie, adică mutată. Pentru exem-plificare, un fragment de anticorp Fab părinte poate fi proiectat prin inginerie pentru a forma un Fab proiectat prin inginerie cu cisteină, menţionat ca "ThioFab". În mod similar, un anticorp monoclonal părinte poate fi proiectat prin inginerie pentru a forma un "ThioMab". O mutaţie la un singur situs produce un singur reziduu de cisteină proiectat prin inginerie într-un ThioFab, în timp ce o mutaţie la un singur situs produce două reziduuri de cisteină proiectate prin inginerie într-un ThioMab, datorită naturii dimerice a anticorpului IgG. ADN-ul care codifică o variantă a secvenţei de aminoacizi a polipep-tidei părinte poate fi preparat printr-o varietate de metode cunoscute în domeniul de specialitate (a se vedea, de exemplu, metodele descrise în WO2006/034488). Aceste metode includ, dar nu sunt limitate la, prepararea prin mutageneză dirijată în situs (sau mediată de oligonucleotide), mutageneză PCR, şi mutageneză de casetă a unui ADN preparat anterior care codifică polipeptida. Variante de anticorpi recombinanţi pot fi construite, de asemenea, prin manipularea fragmentului de restricţie sau prin suprapu-nerea extensiei PCR cu oligonucleotide sintetice. ADC-urile cu Formula I includ, dar nu sunt limitate la, anticorpi care au 1, 2, 3, sau 4 aminoacizi de cisteină proiectaţi prin in-ginerie (Lyon şi colab., (2012) Methods Enzymol., 502: 123-38). Aşa cum se descrie în acest document, unul sau mai multe reziduuri de cisteină libere sunt deja prezente într-o porţiune indivizibilă de anticorp, fără utilizarea proiectării prin inginerie caz în care re-ziduurile de cisteină libere existente pot fi utilizate pentru a conjuga porţiunea indivizibilă de anticorp la o porţiune indivizibilă de medicament.
Aşa cum se descrie în acest document, o încărcare de medicament mai mare (de exemplu, p > 5) poate provoca agregarea, insolubilitatea, toxicitatea, sau pierderea permeabilităţii celulare a anumitor conjugaţi anticorp-medicament. O încărcare mai mare a medicamentului poate afecta negativ farmacocinetica (de exemplu, clearance-ul) anumitor ADC-uri. Aşa cum se descrie în acest document, o încărcare mai mică a me-dicamentului (de exemplu, p < 3) poate reduce potenţa anumitor ADC-uri împotriva celulelor care exprimă ţinta şi/sau a celulelor vecine. Aşa cum se descrie în acest document, încărcarea medicamentului pentru un ADC din prezenta descriere a invenţiei variază de la 1 până la aproximativ 8; de la aproximativ 2 până la aproximativ 6; de la aproximativ 2 până la aproximativ 5; de la aproximativ 3 până la aproximativ 5; sau de la aproximativ 3 până la aproximativ 4.
În cazul în care mai mult de o grupare nucleofilă reacţionează cu un intermediar medicament-linker sau un reactiv cu porţiune indivizibilă linker urmat de reactiv cu por-ţiune indivizibilă de medicament, într-un amestec de reacţie care cuprinde mai multe copii ale porţiunii indivizibile de anticorp şi porţiunii indivizibile linker, atunci produsul rezultat poate fi un amestec de compuşi ADC cu o distribuţie de una sau mai multe porţiuni indivizibile de medicament ataşate la fiecare copie a porţiunii indivizibile de anticorp în amestec. Aşa cum se descrie în acest document, încărcarea medicamentului într-un amestec de ADC-uri care rezultă dintr-o reacţie de conjugare variază de la 1 până la 20 de porţiuni indivizibile de medicament ataşate per porţiune indivizibilă de anticorp. Numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp (adică, încărcarea medie a medicamentului, sau p mediu) poate fi calculat prin orice metodă convenţională cunoscută în domeniul de specialitate, de exemplu, prin spectrometrie de masă (de exemplu, LC-MS în fază inversă), şi/sau cromatografie li-chidă de înaltă performanţă (de exemplu, HIC-HPLC). Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este determinat prin cromatografie cu interacţiune hidrofobă-cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HIC-HPLC). Aşa cum se descrie în acest document, nu-mărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este determinat prin cromatografie lichidă în fază inversă-spectrometrie de masă (LC-MS). Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la aproximativ 3 la aproximativ 4; de la aproximativ 3,1 până la aproximativ 3,9; de la aproximativ 3,2 to aproximativ 3,8; de la aproximativ 3,2 până la aproximativ 3,7; de la aproximativ 3,2 până la apro-ximativ 3,6; de la aproximativ 3,3 până la aproximativ 3,8; sau de la aproximativ 3,3 până la aproximativ 3,7. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la apro-ximativ 3,2 până la aproximativ 3,8. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de aproximativ 3,8. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la 3 la 4; de la 3,1 până la 3,9; de la 3,2 până la 3,8; de la 3,2 până la 3,7; de la 3,2 până la 3,6; de la 3,3 până la 3,8; sau de la 3,3 până la 3,7. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la 3,2 până la 3,8. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de 3,8.
Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la aproximativ 3,5 până la aproximativ 4,5; de la aproximativ 3,6 până la aproximativ 4,4; de la aproximativ 3,7 până la aproximativ 4,3; de la aproximativ 3,7 până la aproximativ 4,2; sau de la apro-ximativ 3,8 până la aproximativ 4,2. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la aproximativ 3,6 până la aproximativ 4,4. Aşa cum se descrie în acest document, nu-mărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de aproximativ 4,0. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la 3,5 până la 4,5; de la 3,6 până la 4,4; de la 3,7 până la 4,3; de la 3,7 până la 4,2; sau de la 3,8 până la 4,2. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de la 3,6 până la 4,4. Aşa cum se descrie în acest document, numărul mediu de porţiuni indivizibile de me-dicament per porţiune indivizibilă de anticorp este de 4,0.
Aşa cum se descrie în acest document, termenul "aproximativ" aşa cum este utilizat în ceea ce priveşte numărul mediu de porţiuni indivizibile de medicament per porţiune indivizibilă de anticorp înseamnă +/- 10%.
Compuşii ADC individuali, sau "specii", pot fi identificaţi în amestec prin spec-troscopie de masă şi separaţi prin UPLC sau HPLC, de exemplu cromatografie cu interacţiune hidrofobă (HIC-HPLC). Aşa cum se descrie în acest document, un ADC omogen sau aproape omogen cu o singură valoare de încărcare poate fi izolat din amestecul de conjugare, de exemplu, prin electroforeză sau cromatografie.
Aşa cum se descrie în acest document, o încărcare a medicamentului şi/sau o încărcare medie a medicamentului de aproximativ 4 asigură proprietăţi benefice. Aşa cum se descrie în acest document, o încărcare a medicamentului şi/sau o încărcare medie a medicamentului mai mică de aproximativ 4 poate avea ca rezultat un nivel inacceptabil de ridicat al speciilor de anticorp neconjugat, care pot concura cu ADC pentru legarea la un antigen ţintă şi/sau poate asigura eficacitate redusă a tratamentului. Aşa cum se descrie în acest document, o încărcare a medicamentului şi/sau o încărcare medie a medicamentului mai mare de aproximativ 4 poate avea ca rezultat un nivel inacceptabil de ridicat al eterogenităţii produsului şi/sau agregării ADC. O încărcare a medicamentului şi/sau o încărcare medie a medicamentului mai mare de aproximativ 4 poate afecta, de asemenea, stabilitatea ADC-ului, din cauza pierderii uneia sau mai multor legături chimice necesare pentru a stabiliza porţiunea indivizibilă de anticorp.
Aşa cum se descrie în acest document, un ADC are Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care:
(i) Ab este un anticorp anti-receptorul alfa al folatului de internalizare sau frag-mentul de legare la antigen al acestuia care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24;
(ii) D este eribulină;
(iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi
(iv) p este un număr întreg de la 3 la 4.
Aşa cum se descrie în acest document, un ADC are Formula I:
Ab-(L-D)p (I)
în care:
(i) Ab este un anticorp anti-receptorul factorului de creştere epidermic uman 2 de internalizare sau fragmentul de legare la antigen al acestuia care cuprinde o re-giune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 27, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 28;
(ii) D este eribulină;
(iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi
(iv) p este un număr întreg de la 3 la 4.
Aşa cum se descrie în acest document, p este 4.
Prezenta descriere a invenţiei include metode pentru producerea ADC-urilor descrise. Pe scurt, ADC-urile cuprind un anticorp sau un fragment de legare la antigen ca porţiunea indivizibilă de anticorp, o porţiune indivizibilă de medicament, şi un linker care uneşte porţiunea indivizibilă de medicament şi porţiunea indivizibilă de anticorp. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile pot fi preparate folosind un linker care are funcţionalităţi reactive pentru ataşarea covalentă la porţiunea indivizibilă de medi-cament şi la porţiunea indivizibilă de anticorp. Pentru exemplificare, aşa cum se descrie în acest document, o cisteină tiol a unei porţiuni indivizibile de anticorp poate forma o legătură cu o grupare funcţională reactivă a unui linker sau a unui intermediar medica-ment-linker (de exemplu, o porţiune indivizibilă maleimidă) pentru a produce un ADC. Generarea ADC-urilor poate fi realizată prin orice tehnică cunoscută specialiştilor calificaţi.
Aşa cum se descrie în acest document, un ADC este produs prin punerea în contact a unei porţiuni indivizibile de anticorp cu un linker şi o porţiune indivizibilă de medicament într-o manieră secvenţială, astfel încât porţiunea indivizibilă de anticorp este legată covalent mai întâi la linker, şi apoi intermediarul anticorp-linker pre-format reacţionează cu porţiunea indivizibilă de medicament. Intermediarul anticorp-linker poate fi supus sau nu unei etape de purificare înainte de punerea în contact a porţiunii indivizibile de medicament. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC este produs prin punerea în contact a unei porţiuni indivizibile de anticorp cu un compus linker me-dicament pre-format prin punerea în reacţie a unui linker cu o porţiune indivizibilă de medicament. Compusul linker-medicament pre-format poate fi supus sau nu unei etape de purificare înainte de punerea în contact a porţiunii indivizibile de medicament. Aşa cum se descrie în acest document, porţiunea indivizibilă de anticorp contactează linkerul şi porţiunea indivizibilă de medicament într-un amestec de reacţie, permiţând formarea simultană a legăturilor covalente între porţiunea indivizibilă de anticorp şi linker, şi între linker şi porţiunea indivizibilă de medicament. Această metodă de producere a ADC-urilor poate include o reacţie, în care porţiunea indivizibilă de anticorp contactează porţiunea indivizibilă de anticorp înainte de adăugarea linkerului la amestecul de reacţie, şi vice versa. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC este produs prin punerea în reacţie a unei porţiuni indivizibile de anticorp cu un linker ataşat la o porţiune indivi-zibilă de medicament, cum ar fi Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB-eribulin, în condiţii care permit conjugarea.
ADC-urile preparate în conformitate cu metodele descrise mai sus pot fi supuse unei etape de purificare. Etapa de purificare poate implica orice metode biochimice cunoscute în domeniul de specialitate pentru purificarea proteinelor, sau orice combi-naţie a metodelor acestora. Acestea includ, dar nu sunt limitate la, filtrare cu flux tangenţial (TFF), cromatografie de afinitate, cromatografie cu schimb de ioni, orice cromatografie bazată pe sarcină sau puncte izoelectrice, cromatografie în mod mixt, de exemplu, CHT (hidroxiapatită ceramică), cromatografie cu interacţiune hidrofobă, cromatografie de excludere a dimensiunii, dializă, filtrare, precipitare selectivă, sau orice combinaţie a acestora.
Utilizări terapeutice şi compoziţii
În acest document sunt făcute cunoscute metode pentru utilizarea ADC-urilor făcute cunoscute în tratarea unui subiect pentru o tulburare, de exemplu, o tulburare oncologică. ADC-urile pot fi administrate singure sau în combinaţie cu un al doilea agent terapeutic şi pot fi administrate în orice formulare acceptabilă din punct de vedere far-maceutic, dozare, şi regim de dozare. Eficacitatea tratamentului cu ADC poate fi eva-luată pentru toxicitate, precum şi indicatori de eficacitate şi ajustată în consecinţă. Mă-surile de eficacitate includ, dar nu sunt limitate la, un efect citostatic şi/sau citotoxic observat in vitro sau in vivo, volum al tumorii redus, inhibare a creşterii tumorii, şi/sau supravieţuire prelungită.
Sunt cunoscute metode pentru a determina dacă un ADC exercită un efect citostatic şi/sau citotoxic asupra unei celule. Pentru exemplificare, activitatea citotoxică sau citostatică a unui ADC poate fi măsurată prin: expunerea celulelor de mamifere care exprimă o proteină ţintă a ADC-ului într-un mediu de cultură de celule; cultivarea celu-lelor pentru o perioadă de la aproximativ 6 ore până la aproximativ 5 zile; şi măsurarea viabilităţii celulei. Analizele in vitro bazate pe celule pot fi utilizate, de asemenea, pentru a măsura viabilitatea (proliferarea), citotoxicitatea, şi inducerea apoptozei (activarea caspazei) ale ADC-ului.
Pentru a determina dacă un conjugat anticorp-medicament exercită un efect citostatic, poate fi utilizată o analiză de încorporare a timidinei. Pentru exemplificare, celulele canceroase care exprimă un antigen ţintă la o densitate de 5.000 de celule/godeu dintr-o placă cu 96 de godeuri pot fi cultivate pentru o perioadă de 72 de ore şi expuse la 0,5 µCi de 3H-timidină pe parcursul ultimelor 8 ore din perioada de 72 de ore. Încorporarea de 3H-timidina în celulele culturii este măsurată în prezenţa şi absenţa ADC-ului.
Pentru determinarea citotoxicităţii se poate măsura necroza sau apoptoza (moartea celulară programată). Necroza este însoţită de obicei de o permeabilitate crescută a membranei plasmatice; umflarea celulei, şi ruperea membranei plasmatice. Apoptoza este caracterizată de obicei prin sângerarea membranei, condensarea cito-plasmei, şi activarea endonucleazelor endogene. Determinarea oricăruia dintre aceste efecte asupra celulelor canceroase indică faptul că un ADC este util în tratamentul cancerelor.
Viabilitatea celulei poate fi măsurată, de exemplu, determinând într-o celulă absorbţia unui colorant, cum ar fi roşu neutru, albastru tripan, violet de genţiană, sau albastru ALAMAR™ (a se vedea, de exemplu, Page şi colab., (1993) Intl. J. Oncology, 3: 473-6). Într-o astfel de analiză, celulele sunt incubate în medii care conţin colorantul, celulele sunt spălate, iar colorantul rămas, care reflectă absorbţia celulară a colorantului, este măsurat spectrofotometric. Aşa cum se descrie în acest document, potenţa in vitro a ADC-urilor preparate este evaluată folosind o analiză cu violet de genţiană. Violetul de genţiană este un colorant triarilmetan care se acumulează în nucleul celulelor viabile. În această analiză, celulele sunt expuse ADC-urilor sau agenţilor de control pentru o pe-rioadă de timp definită, după care celulele sunt colorate cu violet de genţiană, spălate abundent cu apă, apoi solubilizate cu SDS 1% şi citite spectrofotometric. Pentru a mă-sura citoxicitatea poate fi utilizat, de asemenea, colorantul de legare la proteină sulfo-rodamină B (SRB) (Skehan şi colab., (1990) J. Natl. Cancer Inst., 82: 1107-12).
Apoptoza poate fi cuantificată, pentru exemplificare, prin măsurarea fragmentării ADN-ului. Sunt disponibile metode fotometrice comerciale pentru determinarea canti-tativă in vitro a fragmentării ADN-ului. Exemple de astfel de analize, inclusiv TUNEL (care detectează încorporarea nucleotidelor marcate în ADN fragmentat) şi analize bazate pe ELISA, sunt descrise în Biochemica (1999), nr. 2, p. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
Apoptoza poate fi determinată, de asemenea, prin măsurarea modificărilor morfologice într-o celulă. Pentru exemplificare, ca şi în cazul necrozei, pierderea inte-grităţii membranei plasmatice poate fi determinată prin măsurarea absorbţiei anumitor coloranţi (de exemplu, un colorant fluorescent, cum ar fi, pentru exemplificare, porto-caliul de acridină sau bromura de etidiu). O metodă pentru măsurarea numărului de celule apoptotice a fost descrisă de Duke şi Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan şi colab., ed. (1992) p. 3.17.1-3.17.16). Celulele pot fi marcate, de asemenea, cu un colorant ADN (de exemplu, portocaliu de acridină, bromură de etidiu sau iodură de propidiu) şi celulele observate pentru condensarea cromatinei şi marginaţie de-a lungul membranei nucleare interioare. Alte modificări morfologice care pot fi măsurate pentru a determina apoptoza includ, de exemplu, condensarea citoplasmatică, sân-gerare a membranei crescute, şi contracţia celulară.
ADC-urile făcute cunoscute pot fi evaluate, de asemenea, pentru activitatea de ucidere a vecinătăţilor. Activitatea de ucidere a vecinătăţilor poate fi determinată, de exemplu, printr-o analiză care foloseşte două linii celulare, una pozitivă pentru antigenul ţintă şi una negativă pentru antigenul ţintă. Liniile celulare sunt, preferabil, marcate, pentru a le diferenţia. Pentru exemplificare, celulele IGROV1 (FRA+) marcate cu Nuclight™ Green (NLG) şi HL-60 (FRA-) marcate cu Nuclight™ Red (NLR) pot fi co-cultivate, tratate cu un ADC anti-FRA, după care urmează monitorizarea citotoxicităţii. Uciderea celulelor ţintă negative la antigen atunci când sunt amestecate cu celule ţintă pozitive la antigen este un indicativ pentru uciderea vecinătăţilor, în timp ce uciderea celulelor ţintă negative la antigen în absenţa celulelor ţintă pozitive la antigen este un indicativ pentru ucidere departe de ţintă.
În unele aspecte, prezenta descriere a invenţiei furnizează o metodă de ucidere, inhibare sau modulare a creşterii, sau interferare cu metabolismul unei celule cance-roase sau unui ţesut canceros prin perturbarea tubulinei. Metoda poate fi utilizată cu orice subiect în care perturbarea tubulinei oferă un beneficiu terapeutic. Subiecţii care pot beneficia de perturbarea tubulinei includ, dar nu sunt limitaţi la, cei care au sau prezintă riscul de a avea un cancer gastric, cancer ovarian (de exemplu, cancer ovarian seros), cancer pulmonar (de exemplu, cancer pulmonar cu celule non-mici), cancer mamar (de exemplu, cancer mamar triplu negativ), cancer endometrial (de exemplu, carcinom endometrial seros), osteosarcom, sarcom Kaposi, cancer cu celule germinale testiculare, leucemie, limfom (de exemplu, boala Hodgkin, limfom non-Hodgkin), mielom, cancer de cap şi gât, cancer esofagian, cancer pancreatic, cancer de prostată, cancer cerebral (de exemplu, glioblastom), cancer tiroidian, cancer colorectal, şi/sau cancer de piele (de exemplu, melanom), sau orice metastaze ale acestora (Dumontet şi Jordan, (2010) Nat. Rev. Drug Discov., 9: 790 - 803). Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute pot fi administrate în orice celulă sau ţesut care exprimă FRA, cum ar fi o celulă canceroasă sau un ţesut canceros care exprimă FRA. O des-criere a invenţiei cu titlu de exemplu include o metodă de inhibare a semnalizării ce-lulare mediată de FRA sau o metodă de ucidere a unei celule. Metoda poate fi utilizată cu orice celulă sau ţesut care exprimă FRA, cum ar fi o celulă canceroasă sau o leziune metastatică. Exemplele nelimitative de cancere care exprimă FRA includ cancerul gastric, cancerul ovarian seros, cancerul ovarian cu celule clare, cancerul pulmonar cu celule non-mici, cancerul colorectal, cancerul de sân triplu negativ, cancerul endome-trial, carcinomul endometrial seros, carcinoidul pulmonar şi osteosarcomul. Exemplele nelimitative de celule care exprimă FRA includ celulele de carcinom ovarian uman IGROV1 şi OVCAR3, celulele de carcinom pulmonar cu celule non-mici uman NCI-H2110, şi celulele care conţin un acid nucleic recombinant care codifică FRA sau o porţiune a acestuia.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute pot fi ad-ministrate în orice celulă sau ţesut care exprimă her2, cum ar fi o celulă canceroasă sau un ţesut canceros care exprimă her2. O descriere a invenţiei cu titlu de exemplu include o metodă de inhibare a semnalizării celulare mediată de her2 sau o metodă de ucidere a unei celule. Metoda poate fi utilizată cu orice celulă sau ţesut care exprimă her2, cum ar fi o celulă canceroasă sau o leziune metastatică. Exemplele nelimitative de cancere care exprimă her2 includ cancerul de sân, cancerul gastric, cancerul de vezică urinară, carcinomul de celule uroteliale, cancerul esofagian, cancerul pulmonar, cancerul de col uterin, cancerul endometrial şi cancerul ovarian (English şi colab., (2013) Mol. Diagn. Ther., 17: 85 - 99). Exemplele nelimitative de celule care exprimă her2 includ celulele de carcinom gastric uman NCI-N87-luc, celulele de carcinom ductal de sân uman ZR75 şi BT-474, şi celulele care cuprind un acid nucleic recombinant care codifică her2 sau o porţiune a acestuia.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute pot fi ad-ministrate în orice celulă sau ţesut care exprimă mezotelina (MSLN), cum ar fi o celulă canceroasă sau un ţesut canceros care exprimă MSLN. O descriere a invenţiei cu titlu de exemplu include o metodă de inhibare a semnalizării celulare mediată de MSLN sau o metodă de ucidere a unei celule. Metoda poate fi utilizată cu orice celulă sau ţesut care exprimă MSLN, cum ar fi o celulă canceroasă sau o leziune metastatică. Exem-plele nelimitative de cancere care exprimă MSLN includ mezoteliomul, cancerul pan-creatic (de exemplu, adenocarcinomul pancreatic), cancerul ovarian, şi cancerul pul-monar (de exemplu, adenocarcinomul pulmonar) (Wang şi colab., (2012) PLoS ONE, 7: e33214). Exemplele nelimitative de celule care exprimă MSLN includ celulele de car-cinom ovarian uman OVCAR3, celulele endometroide umane HEC-251, celulele de mezoteliom cu celule scuamoase pulmonare umane H226, şi celulele care conţin un acid nucleic recombinant care codifică MSLN sau o porţiune a acestuia.
Metodele cu titlu de exemplu includ etapele de punere în contact a celulei cu un ADC, aşa cum se descrie în acest document, într-o cantitate eficientă, adică o cantitate suficientă pentru a ucide celula. Metoda poate fi utilizată pe celule în cultură, de exem-plu in vitro, in vivo, ex vivo, sau in situ. Pentru exemplificare, celulele care exprimă FRA, her2, şi/sau MSLN (de exemplu, celulele colectate prin biopsia unei leziuni tumorale sau metastatice; celulele dintr-o linie celulară de cancer stabilită; sau celulele recombinate), pot fi cultivate in vitro în mediu de cultură şi etapa de punere în contact poate fi efec-tuată prin adăugarea ADC-ului la mediul de cultură. Metoda va avea ca rezultat uciderea celulelor care exprimă FRA, her2, şi/sau MSLN, inclusiv în special a celulelor tumorale care exprimă FRA, her2, şi/sau MSLN. Alternativ, ADC-ul poate fi administrat unui su-biect pe orice rută de administrare adecvată (de exemplu, intravenos, subcutanat, sau contact direct cu un ţesut tumoral) pentru a avea un efect in vivo.
Efectul in vivo al unei compoziţii terapeutice de ADC făcute cunoscută poate fi evaluat într-un model animal adecvat. Pentru exemplificare, pot fi folosite modele de cancer xenogenice, în care explanţii de cancer sau ţesuturile de xenogrefă care au suferit pasaj sunt introduse în animale compromise imun, cum ar fi şoarecii nud sau SCID (Klein şi colab., (1997) Nature Med., 3: 402-8). Eficacitatea poate fi prezisă fo-losind analize care măsoară inhibarea formării tumorii, regresia tumorii sau metastaza, şi altele asemenea.
Pot fi utilizate, de asemenea, analize in vivo care evaluează stimularea apop-tozei. Aşa cum se descrie în acest document, xenogrefele de la şoareci purtători de tumoră trataţi cu compoziţia terapeutică pot fi examinate pentru prezenţa focarelor apoptotice şi comparate cu şoareci purtători de xenogrefă de control netrataţi. Măsura în care focarele apoptotice se găsesc în tumorile şoarecilor trataţi oferă o indicaţie a eficacităţii terapeutice a compoziţiei.
În acest document sunt descrise suplimentar metode pentru tratarea cancerului. ADC-urile făcute cunoscute în acest document pot fi administrate unui mamifer non-uman sau unui subiect uman în scopuri terapeutice. Metodele terapeutice presupun administrarea către un mamifer care are o tumoră a unei cantităţi eficiente din punct de vedere biologic dintr-un ADC care cuprinde un agent chimioterapeutic selectat (de exemplu, eribulină) legat de un anticorp de ţintire care se leagă la un antigen exprimat, care este accesibil legării, sau este localizat pe o suprafaţă a celulei canceroase. O descriere cu titlu de exemplu este o metodă de livrare a unui agent chimioterapeutic la o celulă care exprimă FRA, care cuprinde conjugarea agentului chimioterapeutic la un anticorp care se leagă imunospecific la un epitop FRA şi expune celula la ADC. Celulele tumorale cu titlu de exemplu care exprimă FRA pentru care sunt indicate ADC-urile din prezenta descriere a invenţiei includ celule dintr-un cancer gastric, un cancer ovarian seros, un cancer pulmonar cu celule non-mici, un cancer colorectal, un cancer mamar (de exemplu, un cancer mamar triplu negativ), un carcinoid pulmonar, un osteosarcom, un cancer endometrial, şi un carcinom endometrial cu histologie seroasă.
O altă descriere cu titlu de exemplu este o metodă de livrare a unui agent chi-mioterapeutic la o celulă care exprimă her2, care cuprinde conjugarea agentului chi-mioterapeutic la un anticorp care se leagă imunospecific la un epitop her2 şi expune celula la ADC. Celulele tumorale cu titlu de exemplu care exprimă her2 pentru care sunt indicate ADC-urile din prezenta descriere a invenţiei includ celule dintr-un cancer ma-mar, un cancer gastric, un cancer de vezică urinară, un carcinom de celule uroteliale, un cancer esofagian, un cancer pulmonar, un cancer de col uterin, un cancer endometrial, şi un cancer ovarian.
O altă descriere cu titlu de exemplu este o metodă de livrare a unui agent chi-mioterapeutic la o celulă care exprimă MSLN, care cuprinde conjugarea agentului chi-mioterapeutic la un anticorp care se leagă imunospecific la un epitop MSLN şi expune celula la ADC. Celulele tumorale cu titlu de exemplu care exprimă MSLN pentru care sunt indicate ADC-urile din prezenta descriere a invenţiei includ celule dintr-un mezo-teliom, un cancer pancreatic (de exemplu, un adenocarcinom pancreatic), un cancer ovarian, şi un cancer pulmonar (de exemplu, adenocarcinom pulmonar).
O altă descriere cu titlu de exemplu este o metodă pentru tratarea unui pacient care are sau prezintă riscul de a avea un cancer care exprimă un antigen ţintă pentru porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului, cum ar fi FRA, her2 sau MSLN, care cu-prinde administrarea către pacient a unei cantităţi eficiente din punct de vedere tera-peutic dintr-un ADC din prezenta descriere a invenţiei. Aşa cum se descrie în acest document, pacientul nu răspunde sau răspunde slab la tratamentul cu un anticorp anti-FRA atunci când este administrat singur, şi/sau la tratamentul cu o porţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur. Aşa cum se descrie în acest document, pacientul nu răspunde sau răspunde slab la tratamentul cu un anticorp anti-her2 atunci când este administrat singur, şi/sau tratamentul cu o por-ţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur. Aşa cum se descrie în acest document, pacientul nu răspunde sau răspunde slab la tratamentul cu un anticorp anti-MSLN atunci când este administrat singur, şi/sau tratamentul cu o porţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur. Aşa cum se descrie în acest document, pacientul este intolerant la tratamentul cu o porţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur. De exemplu, un pacient poate necesita doze de eribulină pentru a trata un cancer care duc la toxicitate sistemică, care sunt depăşite prin livrarea ţintită către un cancer care exprimă un antigen ţintă pentru porţiunea indivizibilă de anticorp a ADC-ului cum ar fi FRA, her2 sau MSLN, prin urmare reducând uciderea departe de ţintă.
O altă descriere cu titlu de exemplu este o metodă pentru reducerea sau inhi-barea creşterii unei tumori care exprimă antigen ţintă (de exemplu, o tumoră care ex-primă FRA, o tumoră care exprimă her2, sau o tumoră care exprimă MSLN), cuprinzând administrarea unei cantităţi eficiente din punct de vedere terapeutic dintr-un ADC. Aşa cum se descrie în acest document, tratamentul este suficient pentru a reduce sau inhiba creşterea tumorii pacientului, pentru a reduce numărul sau dimensiunea leziunilor me-tastatice, pentru a reduce sarcina tumorală, pentru a reduce sarcina tumorală primară, pentru a reduce invazivitatea, pentru a prelungi timpul de supravieţuire, şi/sau pentru a menţine sau îmbunătăţi calitatea vieţii. Aşa cum se descrie în acest document, tumora este rezistentă sau refractară la tratamentul cu un anticorp anti-FRA atunci când este administrat singur, şi/sau tratamentul cu o porţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur. Aşa cum se descrie în acest document, tumora este rezistentă sau refractară la tratamentul cu un anticorp anti-her2 atunci când este administrat singur, şi/sau tratamentul cu o porţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur. Aşa cum se descrie în acest document, tumora este rezistentă sau refractară la tratamentul cu un anticorp anti-MSLN atunci când este administrat singur, şi/sau tratamentul cu o porţiune indivizibilă de medicament (de exemplu, eribulină) atunci când este administrat singur.
Mai mult, anticorpii din prezenta descriere a invenţiei pot fi administraţi unui mamifer non-uman care exprimă un antigen cu care ADC-ul este capabil să se lege în scopuri veterinare sau ca un model animal al bolii umane. În legătură cu acesta din urmă, astfel de modele animale pot fi utile pentru evaluarea eficacităţii terapeutice a ADC-urilor făcute cunoscute (de exemplu, testarea dozelor şi a duratelor de timp de administrare).
În acest document sunt descrise suplimentar utilizări terapeutice ale ADC-urilor făcute cunoscute. O descriere cu titlu de exemplu este utilizarea unui ADC în trata-mentul unui cancer care exprimă antigen ţintă (de exemplu, un cancer care exprimă FRA, un cancer care exprimă her2, sau un cancer care exprimă MSLN). Sunt făcute cunoscute, de asemenea, ADC-uri pentru utilizare în tratamentul unui cancer care ex-primă antigen ţintă (de exemplu, un cancer care exprimă FRA, un cancer care exprimă her2, sau un cancer care exprimă MSLN). Metodele pentru identificarea subiecţilor care au cancer care exprimă FRA, her2, şi/sau MSLN sunt cunoscute în domeniul de spe-cialitate şi pot fi utilizate pentru a identifica pacienţii adecvaţi pentru tratament cu un ADC făcut cunoscut.
O altă descriere cu titlu de exemplu este utilizarea unui ADC într-o metodă de fabricare a unui medicament pentru tratamentul unui cancer care exprimă antigen ţintă (de exemplu, un cancer care exprimă FRA, un cancer care exprimă her2, sau un cancer care exprimă MSLN).
Compoziţiile terapeutice utilizate în practica metodelor de mai sus pot fi formu-late în compoziţii farmaceutice ce cuprind un transportor acceptabil din punct de vedere farmaceutic adecvat pentru metoda de livrare dorită. O descriere cu titlu de exemplu este o compoziţie farmaceutică ce cuprinde un ADC din prezenta descriere a invenţiei şi un transportor acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Transportorii adecvaţi includ orice material care, atunci când este combinat cu compoziţia terapeutică, păstrează funcţia anti-tumorală a compoziţiei terapeutice şi este, în general, non-reactiv cu sis-temul imunitar al pacientului. Transportorii acceptabili din punct de vedere farmaceutic includ oricare şi toţi solvenţii, oricare şi toate mediile de dispersie, acoperirile, oricare şi toţi agenţii antibacterieni şi antifungici, agenţii izotonici şi de întârziere a absorbţiei, şi alţii similari care sunt compatibili din punct de vedere fiziologic. Exemplele de transpor-tori acceptabili din punct de vedere farmaceutic includ unul sau mai mulţi dintre apă, soluţie salină, soluţie salină tamponată cu fosfat, dextroză, glicerol, etanol, sare mesilat, şi alţii asemenea, precum şi combinaţii ale acestora. În multe cazuri, va fi de preferat să se includă în compoziţie agenţi izotonici, pentru exemplificare, zaharuri, polialcooli precum manitol, sorbitol, sau clorură de sodiu. Transportorii acceptabili din punct de vedere farmaceutic pot cuprinde suplimentar cantităţi minore de substanţe auxiliare, cum ar fi agenţii de umectare sau de emulsionare, conservanţii sau tampoanele, care sporesc durata de valabilitate sau eficacitatea ADC-ului.
Formulările terapeutice pot fi solubilizate şi administrate prin intermediul oricărei rute capabile să livreze compoziţia terapeutică la locul tumorii. Rutele de administrare potenţial eficiente includ, dar nu sunt limitate la, ruta intravenoasă, parenterală, intra-peritoneală, intramusculară, intratumorală, intradermică, intraorganică, ortotopică, şi altele asemenea. Preparatele proteice terapeutice pot fi liofilizate şi depozitate sub formă de pulberi sterile, preferabil sub vid, şi apoi reconstituite în apă bacteriostatică (care conţine, pentru exemplificare, conservant de alcool benzilic) sau în apă sterilă înainte de injecţie. Formulările terapeutice pot cuprinde un ADC sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic a acestuia, de exemplu, o sare mesilat.
ADC-urile făcute cunoscute în acest document pot fi administrate unui pacient care are nevoie de acestea la o doză care variază de la aproximativ 0,2 mg/kg până la aproximativ 10 mg/kg. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-ul este administrat pacientului zilnic, bilunar, sau orice perioadă de timp între acestea. Dozele şi proto-coalele de administrare pentru tratamentul cancerelor care utilizează metodele de mai sus vor varia în funcţie de metodă şi de cancerul ţintă, şi vor depinde în general de o serie de alţi factori recunoscuţi în domeniul de specialitate.
Pentru a administra unul sau mai multe ADC-uri din prezenta descriere a in-venţiei sunt cunoscute şi pot fi utilizate diverse sisteme de livrare. Metodele de admi-nistrare a ADC-urilor includ, dar nu sunt limitate la, administrarea parenterală (de exemplu, intradermică, intramusculară, intraperitoneală, intravenoasă şi subcutanată), administrarea epidurală, administrarea intratumorală, şi administrarea mucozală (de exemplu, căile intranazale şi orale). În plus, poate fi utilizată administrarea pulmonară, de exemplu, prin utilizarea unui inhalator sau nebulizator, şi formulare cu un agent de aerosolizare. A se vedea, de exemplu, compoziţiile şi metodele pentru administrare pulmonară descrise în brevetele de invenţie U.S. nr. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, şi 4.880.078; şi Publ. PCT nr. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, şi WO 99/66903. ADC-urile pot fi administrate prin orice rută convenabilă, pentru exemplificare, prin perfuzie sau injecţie în bolus, sau prin absorbţie prin căptuşeli epiteliale sau mucocutanate (de exemplu, mucoasă orală, mucoasă rectală şi intestinală etc.). Administrarea poate fi fie sistemică, fie locală.
Compoziţiile terapeutice făcute cunoscute în acest document pot fi sterile şi stabile în condiţiile de fabricaţie şi depozitare. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC sau mai mulţi dintre ADC, sau o compoziţie farmaceutică sau mai multe dintre compoziţiile farmaceutice, se furnizează sub formă de pulbere liofilizată sterilizată uscată sau concentrat fără apă într-un recipient închis ermetic şi pot fi reconstituite (de exemplu, cu apă sau soluţie salină) la concentraţia corespunzătoare pentru administrare unui subiect. Preferabil, unul sau mai mulţi agenţi profilactici sau terapeutici sau una sau mai multe compoziţii farmaceutice sunt furnizate sub formă de pulbere liofilizată sterilă uscată într-un recipient închis ermetic la o doză unitară de cel puţin 5 mg, cel puţin 10 mg, cel puţin 15 mg, cel puţin 25 mg, cel puţin 35 mg, cel puţin 45 mg, cel puţin 50 mg, cel puţin 75 mg, sau cel puţin 100 mg, sau orice cantitate între acestea. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile liofilizate sau compoziţiile farmaceutice sunt depozitate la temperaturi între 2°C şi 8°C în recipientul original. Aşa cum se descrie în acest document, un ADC sau mai mulţi dintre ADC, sau o compoziţie farmaceutică sau mai multe dintre compoziţiile farmaceutice, descrise în acest document se furnizează sub formă lichidă într-un recipient închis ermetic, de exemplu, un recipient care arată cantitatea şi concentraţia agentului. Aşa cum se descrie în acest document, forma lichidă a compoziţiei administrate este furnizată într-un recipient închis ermetic de cel puţin 0,25 mg/mL, cel puţin 0,5 mg/mL, cel puţin 1 mg/mL, cel puţin 2,5 mg/mL, cel puţin 5 mg/mL, cel puţin 8 mg/mL, cel puţin 10 mg/mL, cel puţin 15 mg/mL, cel puţin 25 mg/mL, cel puţin 50 mg/mL, cel puţin 75 mg/mL, sau cel puţin 100 mg/mL de ADC. Forma lichidă poate fi depozitată la temperaturi între 2°C şi 8°C în recipientul original.
Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute pot fi în-corporate într-o compoziţie farmaceutică adecvată pentru administrare parenterală. Soluţia injectabilă poate fi compusă fie dintr-o formă de dozare lichidă, fie liofilizată într-un flacon din sticlă flint sau flacon din sticlă brună, ampulă, sau seringă preumplută, sau alt dispozitiv de livrare sau depozitare cunoscut.
Compoziţiile descrise în acest document pot fi într-o varietate de forme. Acestea includ, pentru exemplificare, formele de dozare lichide, semi-solide, şi solide, cum ar fi soluţiile lichide (de exemplu, soluţiile injectabile şi perfuzabile), dispersiile sau suspen-siile, tabletele, pastilele, pulberile, lipozomii, şi supozitoarele. Forma preferată depinde de modul de administrare intenţionat şi de aplicaţia terapeutică.
Aşa cum se descrie în acest document, tratamentul implică administrarea într-un singur bolus sau administrarea repetată a preparatului ADC prin intermediul unei rute de administrare acceptabile.
Pacienţii pot fi evaluaţi pentru nivelurile de antigen ţintă într-o probă dată (de exemplu, nivelurile de celule care exprimă antigenul ţintă) pentru a ajuta la determinarea celui mai eficient regim de dozare, etc. O descriere cu titlu de exemplu este o metodă pentru a determina dacă un pacient va răspunde la tratamentul cu un ADC din prezenta descriere a invenţiei, cuprinzând furnizarea unei probe biologice de la pacient şi pune-rea în contact a probei biologice cu ADC-ul. Probele biologice cu titlu de exemplu includ fluidul tisular sau corporal, cum ar fi un exsudat inflamator, sângele, serul, lichidul in-testinal, proba de scaun, sau biopsia tumorală (de exemplu, o biopsie tumorală derivată de la un pacient care are sau prezintă riscul unui cancer care exprimă antigen ţintă, de exemplu, un cancer care exprimă FRA, un cancer care exprimă her2, sau un cancer care exprimă MSLN). Aşa cum se descrie în acest document, o probă (de exemplu, un fluid tisular şi/sau corporal) poate fi obţinută de la un subiect, şi se poate utiliza o me-todă imunologică adecvată pentru a detecta şi/sau măsura exprimarea proteinei a antigenului ţintă (de exemplu, FRA, her2, sau MSLN). Astfel de evaluări sunt utilizate, de asemenea, în scopuri de monitorizare pe tot parcursul terapiei, şi sunt utile pentru a aprecia succesul terapeutic în combinaţie cu evaluarea altor parametri.
Aşa cum se descrie în acest document, eficacitatea unui ADC poate fi evaluată prin punerea în contact a unei probe tumorale de la un subiect cu ADC şi evaluarea ratei de creştere a tumorii sau evaluarea volumului tumorii. Aşa cum se descrie în acest do-cument, atunci când s-a determinat că un ADC este eficient, acesta poate fi administrat subiectului.
Abordările terapeutice de mai sus pot fi combinate cu oricare dintre o mare varietate de regimuri suplimentare chirurgicale, chimioterapice, sau radioterapice.
De asemenea, în acest document sunt făcute cunoscute utilizări ale unui ADC sau mai multora dintre ADC-urile făcute cunoscute la fabricarea unui medicament pentru tratarea cancerului, de exemplu, în conformitate cu metodele descrise mai sus. Aşa cum se descrie în acest document, ADC-urile făcute cunoscute în acest document se utili-zează pentru tratarea cancerului, de exemplu, în conformitate cu metodele descrise mai sus.
Aşa cum se descrie în acest document, kiturile pentru utilizare în aplicaţiile de laborator şi terapeutice descrise în acest document sunt în sfera prezentei descrieri a invenţiei. Astfel de kituri pot cuprinde un transportor, un pachet, sau un container care este compartimentat pentru a primi unul sau mai multe recipiente, cum ar fi flacoane, tuburi, şi altele asemenea, fiecare recipient (fiecare dintre recipiente) cuprinzând unul dintre elementele separate care urmează să fie utilizate într-o metodă făcută cunoscută în acest document, împreună cu o etichetă sau un insert care conţine instrucţiuni de utilizare, cum ar fi o utilizare descrisă în acest document. Kiturile pot cuprinde un reci-pient care cuprinde o porţiune indivizibilă de medicament. Prezenta descriere a invenţiei descrie, de asemenea, un ADC sau mai mulţi dintre ADC, sau compoziţiile farmaceutice ale acestora, care sunt ambalate într-un recipient sigilat ermetic, cum ar fi o ampulă sau un pliculeţ, indicând cantitatea de agent.
Kiturile pot cuprinde recipientul descris mai sus şi unul sau mai multe alte re-cipiente asociate acestuia, care cuprind materiale dorite din punct de vedere comercial şi din punctul de vedere al utilizatorului, inclusiv tampoane, diluanţi, filtre, ace, seringi; etichete de transport, ambalaj, recipient, flacon şi/sau tub care menţionează conţinutul şi/sau instrucţiunile de utilizare, şi inserturi de ambalaj cu instrucţiunile de utilizare.
O etichetă poate fi prezentă pe sau împreună cu recipientul pentru a indica faptul că compoziţia este utilizată pentru o terapie specifică sau o aplicaţie non-tera-peutică, cum ar fi o aplicaţie de prognostic, profilactică, de diagnostic, sau de laborator. O etichetă poate indica, de asemenea, direcţii fie pentru utilizare in vivo, fie pentru utilizare in vitro, cum ar fi cele descrise în acest document. Direcţiile şi alte informaţii pot fi incluse, de asemenea, pe un insert (inserturi) sau o etichetă (etichete), care este inclusă (sunt incluse) cu sau pe kit. Eticheta poate fi pe, sau asociată cu recipientul. O etichetă poate fi pe un recipient atunci când literele, numerele sau alte caractere care formează eticheta sunt turnate sau gravate în recipientul însuşi. O etichetă poate fi asociată cu un recipient atunci când este prezentă în interiorul unui recipient sau suport care ţine, de asemenea, recipientul, de exemplu, ca un insert de ambalaj. Eticheta poate indica faptul că compoziţia este utilizată pentru diagnosticarea sau tratarea unei afec-ţiuni, cum ar fi un cancer descris în acest document.
EXEMPLUL 1
1. Materiale şi metode
MORAb-003 utilizat pentru prepararea ADC-urilor a fost din lotul #AA0312.
1.1 Citotoxine
Structurile citotoxinelor care pot fi conjugate sunt prezentate în Tabelul 11.
Tabelul 11. Citotoxine conjugabile
Numele compusului Linker Citotoxină Scindabilitate Structură PEG3-Bz-disulfidil-dimetil-criptoficină maleimido-PEG3-Benzil-disulfidil-dimetil criptoficină da LL2-criptoficină LL2 criptoficină da LL3-criptoficină LL3 criptoficină da VCP-criptoficină maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB criptoficină da VCP-eribulină (ER-001159569) maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB eribulină da ER-001161318 maleimido-(CH2)5-Val-Cit-pAB ER-001150828 (aziridino-maitanzină- P3) da ER-001161319 maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB ER-001150828 (aziridino-maitanzină- P3) da ER-001159200 maleimido-(CH2)5 maitanzină DM1 nu M-MMAE maleimido-(CH2)5-Val-Cit-pAB monometil auristatină E da NHS-PEG2-AuF NHS-PEG2 auristatină F nu M-DM1 SMCC maitanzină DM1 nu M-0285 PEG-pAB duostatină 3 da Chimie de punere în punte a disulfurii reduse M-0115 Asn-Ala duostatină-5 da M-172 ciclohexil duostatină 3 nu Chimie de legare de disulfură redusă M-174 ciclohexil duostatină 3 nu Chimie de legare de disulfură redusă M-158 PEG-pAB duostatină 10 da Chimie de legare de disulfură redusă M-0384 PEG-tioeter duostatină 14 nu Chimie de legare de disulfură redusă M-0302 PEG-Asn duostatină 14 nu Chimie de legare de disulfură redusă M-292 PEG-Asn duostatină 14 da Chimie de legare de disulfură redusă M-0026 PEG duostatină 14 da Chimie de legare de disulfură redusă M-0267 PEG-tioeter duomicină 7 nu Chimie de legare de disulfură redusă M-0272 Asn-Ala duomicină 7 da Chimie de legare de disulfură redusă M-0260 PEG-pAB duomicină 7 da Chimie de legare de disulfură redusă M-0276 Asn-Ala duomicină 7 da Chimie de legare de disulfură redusă M-015-0913 ciclohexil duostatină 3 nu Utilizare limitată a lizinei M-030-0132 PEG-pAB duostatină 6 da Utilizare limitată a lizinei M-0161 ciclohexil duostatină 10 nu Utilizare limitată a lizinei M-0157 PEG-pAB duostatină 10 da Utilizare limitată a lizinei M-027-0381 tioeter duostatină 14 nu Utilizare limitată a lizinei M-0025 PEG duostatină 14 nu Utilizare limitată a lizinei M-0301 PEG-Asn duostatină 14 nu Utilizare limitată a lizinei M-030-0011 PEG-pAB duostatină 14 da Utilizare limitată a lizinei M-030-0291 PEG-Asn duostatină 14 da Utilizare limitată a lizinei M-0114 PEG-pAB duostatină-5 da Chimie de punere în punte a disulfurii reduse Abrevieri: Ala, alanină; Asn, asparagină; Cit, citrulină; NHS, N-hidroxisuccinimidă; pAB, p-aminobenziloxicarbonil; PEG, polietilen glicol; SMCC, succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilat; Val, valină; VCP, Val-Cit-pAB.
1.2 Conjugarea anticorp-medicament
1.2.1 Reducere parţială folosind TCEP
Condiţiile de reducere parţială pentru MORAb-003 au fost stabilite prin varierea concentraţiei agentului reducător non-tiol tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP), a concen-traţiei de anticorp, şi a timpului de reducere. MORAb-003 a fost schimbat în tampon în soluţie salină tamponată cu fosfat Dulbecco (DPBS) conţinând 1 mM acid etilendiami-nătetraacetic (EDTA), apoi concentrat la 10 mg/mL folosind concentrarea centrifugă cu filtre de centrifugare cu prag de greutate moleculară (MWCO) de 10 kD. Anticorpii au fost diluaţi la concentraţia corespunzătoare şi s-a adăugat TCEP la concentraţia finală indicată, şi s-a amestecat uşor timp de 1 oră la temperatura camerei. TCEP a fost în-depărtat prin desalinizare utilizând coloane de desalinizare cu rotire Zeba™ de 5 sau 10 mL cu DPBS/1mM EDTA ca tampon (Thermo Fisher, MWCO de 40 kD), în conformitate cu protocolul producătorului. Probele au fost analizate pentru conţinut de tiol liber fo-losind kitul de cuantificare fluorometrică a tiolului (Abeam), în conformitate cu protocolul producătorului. Pentru a determina amploarea şi localizarea ruperii legăturii disulfură a fost efectuată analiza SDS-PAGE în condiţii nereducătoare, aşa cum este descris în secţiunea 1.3.3. În unele cazuri, MAb-urile desalinizate au fost aduse la 1-2 mg/mL prin diluare în DPBS şi supuse biotinilării pentru a determina conjugabilitatea şi raportul medicament-anticorp (DAR). La anticorp (mAb) se adaugă 10 mM maleimido-PEG2-biotină (Thermo Fisher) în dimetilsulfoxid (DMSO) la un raport molar de 10:1 şi se in-cubează la temperatura camerei timp de 4 ore cu agitare uşoară. După conjugare, compusul care nu a reacţionat a fost îndepărtat prin desalinizare utilizând coloane de desalinizare cu rotire Zeba™ (Thermo Fisher). Probele au fost apoi analizate prin LC-MS pentru determinarea DAR, aşa cum este detaliat în secţiunea 1.3.4.
1.2.2 Conjugarea citotoxinei
Anticorpul redus parţial a fost adus la 2,5 mg/mL în DPBS 0,5x, EDTA 0,5 mM, şi amestecat bine. Co-solvenţii organici, dacă sunt folosiţi, au fost adăugaţi după aceea şi amestecaţi bine. Co-solvenţii examinaţi au fost propilen glicol (concentraţie finală 20% şi 50%), dimetilsulfoxid (DMSO) (10%), N,N-dimetilformamidă (20%), N,N-dimetilacet-amidă (20%) şi N,N-dimetilpropionamida (20%). Citotoxina modificată cu maleimido (stoc 6 mM în DMSO) a fost adăugată la anticorpi la un raport molar de 1:6 (mAb:com-pus) şi amestecată bine. Conjugarea a continuat la temperatura camerei timp de 3,5 ore, cu amestecare uşoară. Propilen glicol 50% la 50% a fost ales ca modificatorul organic final şi a fost utilizat în toate reacţiile de conjugare ulterioare.
1.2.3 Purificare
Anticorpul conjugat a fost purificat folosind coloană (coloane) de desalinizare HiTrap® 26/10 (GE Healthcare) cu cromatografie efectuată cu o cromatografie lichidă cu proteină rapidă (FPLC) (GE Healthcare), pentru a îndepărta maleimido-citotoxina şi propilen glicolul care nu au reacţionat. ADC-urile MORAb-003, inclusiv MORAb-003-mal-VCP-eribulină (MORAb-202), au fost formulate în DPBS (tamponul de formulare a fost utilizat ca tampon de rulare în timpul cromatografiei FPLC).
1.3 Caracterizarea biofizică
1.3.1 Analiza BCA
Reactiv acid bicinconinic (BCA) preparat (200 µL) a fost adăugat la 25 µL de ADC-uri diluate în serie sau gamma globină bovină (Thermo Fisher) 2 mg/mL standard, şi probele au fost amestecate bine. Probele au fost incubate la 37°C timp de 20 min. Plăcile au fost citite la 595 nm pe un cititor de plăci SpectraMax® M5 (Molecular Devices). Datele au fost analizate folosind SoftMax® Pro (versiunea 3.2) cu un model de montare cu 4 parametri.
1.3.2 Analiza SEC-HPLC
Agregarea anticorpului a fost analizată prin cromatografie lichidă de înaltă per-formanţă cu excluderea dimensiunii (SEC-HPLC), folosind un Agilent 1100. mAb a fost diluat la 1 mg/mL în DPBS. Anticorpul (20 µL) a fost injectat pe o coloană de siguranţă TSKgel® SuperSW (4,6 mm x 3,5 cm, dimensiunea porilor de 4 µm, Tosoh Bioscience), urmată de o coloană TSKgel® SuperSW3000 (4,6 mm x 30 cm, dimensiunea porilor de 4 µm), eluat din coloană cu fosfat de sodiu 0,1 M conţinând NaCI 0,15 M şi NaN3 0,05%, la pH 7,4, la un debit de 0,3 mL/min timp de 20 min. Toate datele au fost analizate utilizând software Agilent ChemStation. Procentul de agregare a fost calculat ca [PAagregat/PAtotal]∗100, unde PA = zona de vârf integrată.
1.3.3 Analiza SDS-PAGE
Probe de proteine (0,1-10 µg) au fost aduse la IX cu tampon de probă de do-decilsulfat de litiu (LDS). Pentru probele nereduse, incubaţia a fost efectuată la tem-peratura camerei timp de 10 minute înainte de electroforeză. Pentru probele reduse, s-a adăugat ditiotreitol (DTT) la o concentraţie finală de 20 mM şi probele au fost încălzite la 95°C timp de 10 min. şi plasate pe gheaţă înainte de electroforeză. Probele au fost încărcate pe geluri SDS-PAGE Bis-Tris cu 10, 12 sau 15 godeuri (Thermo Fisher) cu IX MOPS sau IX MES ca tampon de rulare. Electroforeza a fost efectuată la 185 V (tensiune constantă) timp de 1 oră. Gelurile au fost colorate cu soluţie de colorare InstantBlue (Expedeon) şi decolorate în apă. Documentarea a fost efectuată pe un sistem de documentare cu gel UltraLum folosind filtre portocalii de 600 nm.
1.3.4 Analiza UPLC/ESI-MS a raportului medicament-anticorp (DAR)
ADC-urile au fost deglicozilate folosind PNGaza F (New England BioLabs). La mAb (90 µL, 1 mg/mL în DPBS) s-au adăugat tampon G7 (10 µL) şi PNGaza F (2 µL). Reacţia a fost incubată într-un cuptor cu microunde Discover (CEM) timp de 2 cicluri: (1) puterea cuptorului cu microunde 10 W, 37°C, 10 min., urmată de o pauză de 5 min.; (2) putere cuptorului cu microunde 2 W, 37°C, 10 min. O porţie din probă a fost redusă prin adăugare de DTT la o concentraţie finală de 20 mM, urmată de incubare la 60°C timp de 3 min. Probele au fost apoi analizate folosind o cromatografie lichidă de ultra perfor-manţă (UPLC) Waters Acquity şi spectrometru de masă Premier cu timp de zbor cva-drupol (Q-Tof). Probele (0,5 - 2 µg fiecare) au fost injectate pe o coloană de micro desalinizare MassPrep™ la 65°C, eluate din coloană cu o echilibrare de 5 min. în 95% din faza mobilă A, un gradient de 10 min. (5 - 90% B), şi o re-echilibrare de 10 min. în 95% din faza mobilă A, la 0,05 mL/min. Faza mobilă A a fost acid formic 0,1% în apă. Faza mobilă B a fost acid formic 0,1% în acetonitril. Spectrometrul de masă Q-Tof a fost rulat în modul V, cu ion pozitiv, cu detectare în intervalul 500 - 4000 m/z. Parametrii sursei au fost după cum urmează: tensiunea capilară, 2,25 kV (anticorp intact) - 2,50 kV (anticorp redus); tensiunea conului de eşantionare, 65,0 V (anticorp intact) sau 50,0 V (anticorp redus); temperatura sursei, 100°C; temperatura de desolvatare, 250°C; debitul gazului de desolvatare, 550 L/oră. Vârful proteinei a fost supus deconvoluţiei utilizând funcţia MassLynx® MaxEnt 1. Intensităţile relative ale maselor fiecărui lanţ greu şi uşor neconjugat, conjugate individual, şi conjugat multiplu au fost combinate pentru a calcula DAR-ul general folosind formula:
în care ILC+1 este intensitatea masei lanţului uşor conjugat cu o citotoxină, ILC + 2 este intensitatea masei lanţului uşor conjugat cu două citotoxine, etc. IHC sunt intensităţile de la lanţurile grele conjugate corespunzătoare şi ∑ILCtot şi ∑IHCtot sunt intensităţile combinate ale tuturor lanţurilor uşoare şi lanţurilor grele neconjugate şi conjugate, respectiv.
1.3.5 Analiza HIC-HPLC a DAR
În plus faţă de analiza DAR prin UPLC/analiza cu ionizare cu electropulverizare (ESI)-MS, DAR al MORAb-003-vcp-eribulină şi DAR al MORAb-003-0285 au fost, de asemenea, analizate utilizând HPLC cu interacţiune hidrofobă (HIC-HPLC). Probele au fost injectate pe o TSKgel® Ether-5 PW, 7,5 mm ID x 7,5 cm, dimensiunea porilor de 10 µM, şi eluate din coloană cu o echilibrare de 3 min. în 100% din faza mobilă A, un gradient de 15 min. (0-100 % B), o menţinere de 5 min. în 100% B, o schimbare de 1 min. la 100% A şi o re-echilibrare de 5 min. în 100% din faza mobilă A, la 0,7 mL/min. Faza mobilă A a fost fosfat de sodiu 25 mM, sulfat de amoniu 1,5 M, pH 7,0. Faza mobilă B a fost fosfat de sodiu 25 mM, izopropanol 25%, pH 7,0. Detectarea s-a făcut la 280 nm (referinţă 320 nm). DAR a fost determinat prin formula:
în care AUC+1 este aria de sub curbă pentru vârful mAb corespunzător ADC conjugat cu o citotoxină, AUC+2 este aria de sub curbă pentru vârful mAb corespunzător ADC con-jugat cu două citotoxine, etc. ∑AUCtot este aria de sub curbă combinată pentru toate vârfurile.
1.4 Analize de citotoxicitate
1.4.1 Analiza cu violet de genţiană
Celule IGROV1 (FRhi) şi SJSA-1 (FRneg) au fost sub-cultivate şi însămânţate la 10.000 de celule/godeu în mediu de creştere complet în plăci de cultură de ţesut cu 96 de godeuri, incubate la 37°C, CO2 5% pe parcursul nopţii (16 ore). De obicei, reactivii de test au fost diluaţi în serie 1:4 în plăci de diluare cu godeuri adânci de 2 mL, începând de la 1 µM (10 diluţii în total). 100 µL din probele diluate s-au adăugat la plăcile de celule (concentraţia iniţială a probelor de test la 500 nM). Plăcile au fost incubate la 37°C, CO2 5% o perioadă suplimentară de 48 de ore. Mediul a fost aruncat, plăcile au fost spălate o dată cu 200 µL de DPBS, colorate cu 50 µL de soluţie de violet de gen-ţiană 0,2% la temperatura camerei timp de 15 min, şi apoi spălate intens cu apă de la robinet. Plăcile au fost uscate la aer, şi violet de genţiană a fost dizolvat cu 200 µL de soluţie SDS 1%. Plăcile au fost citite la 570 nm. Datele au fost analizate folosind GraphPad Prism 6. Analizele au fost efectuate utilizând o densitate de însămânţare de 1.000 de celule per godeu şi expunerea la compus a fost pentru un total de 5 zile. Atunci când s-a dorit o expunere pe termen mai scurt, mediul conţinând agenţi citotoxici a fost îndepărtat după 4 ore şi înlocuit cu mediu de creştere proaspăt înainte de incubarea de 5 zile. Pentru OVCAR3, CaOV3, şi NCI-H2110, celulele au fost însămânţate la 3.000 de celule/godeu şi incubate timp de 5 zile cu ADC. Pentru experimentele de concurenţă, ADC-urile titrate au fost pre-incubate cu 2 µM (final) MORAb-003 neconjugat înainte de incubarea cu celule.
1.4.2 Analiza de ucidere a vecinătăţilor
Cu o zi înainte de începerea studiului, celule IGROV1 Nuclight™ Green (NLG) au fost însămânţate la 5.000 de celule/godeu în plăci cu 96 de godeuri cu fund rotund, după care a urmat centrifugare la 1.000 rpm timp de 3 min la temperatura camerei pentru a asigura formarea unui pelet de celule. Placa a fost plasată în vasul unui Incucyte Zoom® (EssenBioscience) şi incubată la 37°C/CO2 5% pe parcursul nopţii. Programul a fost configurat pentru a colecta imagini ale creşterii celulelor, şi pentru a determina numărul total de celule colorate cu verde nuclear şi celule colorate cu roşu nuclear, precum şi confluenţa de fază a celulelor la fiecare două ore. În ziua experi-mentului, ADC MORAb-003 sau medicamentul liber a fost diluat în mediu RPMI complet şi diluat în serie, începând de la 400 nM. 50 µL de soluţie de citotoxină s-au adăugat la celulele NLG-IGROV1 şi incubat timp de 30 de min. În timpul perioadei de incubaţie, celulele HL-60 (FRneg) Nuclight™ Red (NLR) au fost diluate la 2 x 105, 1 x 105 sau 5 x 104 celule/mL cu medii proaspete. 50 µL de suspensie celulară NLR-HL60 sau mediu singur s-au adăugat la godeurile NLG-IGROV1, după care a urmat centrifugare la 1.000 rpm timp de 3 min. la temperatura camerei pentru a asigura re-formarea peletului ce-lular. Placa a fost plasată înapoi în vasul Incucyte Zoom (EssenBioscience) şi incubată la 37°C/CO2 5% timp de până la 5 zile. Creşterea celulară relativă a NLG-IGROV1 a fost determinată prin comparaţie cu probele adăugate singure fără ADC sau libere de me-dicament folosind numărătoarea celulelor verzi. Creşterea celulară relativă a HL60 a fost făcută în mod similar, cu excepţia faptului că s-a determinat numărul de celule roşii. Determinarea valorilor IC50 atât pentru NLG-IGROV1, cât şi pentru NLR-HL-60 a fost determinată folosind Prism (GraphPad).
1.4.3 Analiza stabilităţii în ser
20 µL de ADC-uri MORAb-003 s-au amestecat bine cu 80 µL de DPBS, ser uman reunit normal (Bioreclamation, Lot BRH552911), sau ser de şoarece reunit normal (Bioreclamation, Lot MSE152591), şi incubat la 37°C timp de 0, 4, 24, şi 48 de ore. După incubare, probele au fost îngheţate şi depozitate la -20°C până la evaluare în analize de citotoxicitate şi legare. Pentru analizele de citotoxicitate, probele au fost evaluate pe celule IGROV1 şi SJSA-1, aşa cum este detaliat în secţiunea 1.4.1. Pentru evaluarea legării, probele au fost evaluate utilizând o analiză MSD ECL pe bază de soluţie. Probele au fost incubate cu receptorul alfa al folatului biotinilat şi sulfo-eticheta anti-MORAb-003 înainte de captare pe o placă de streptavidină şi detectate folosind electrochimioluminiscenţă cu un MSD Sector Imager 2400.
2. Rezultate
2.1 Prepararea ADC-urilor MORAb-003
Pentru a selecta cea mai bună combinaţie de linker şi citotoxină pentru conju-gare cu MORAb-003, ADC-urile au fost preparate folosind trei metodologii. În confor-mitate cu strategia de conjugare arătată în Figura 1, cisteinele neîmperecheate sunt generate prin reducere parţială cu echivalenţi molari limitaţi ai agentului reducător non-tiol TCEP. Această strategie reduce preferenţial legăturile de disulfură inter-catenare care leagă lanţul uşor şi lanţul greu (o pereche per împerechere H-L) şi cele două lanţuri grele în regiunea balama (două perechi per împerechere H-H în cazul IgG1 umane), în timp ce lasă legăturile de disulfură intra-catenare intacte.
Cea de-a doua strategie de conjugare pentru prepararea ADC-urilor MORAb-003 a utilizat chimia de punere în punte a disulfurii reduse. Chimia de punere în punte a disulfurii reduse re-pune în punte tiolii liberi ai reziduurilor de cisteină eliberaţi în timpul procesului de reducere parţială, imitând rolul legăturii de disulfură şi păstrând în acest fel stabilitatea şi funcţia ADC-ului.
A treia strategie de conjugare pentru prepararea ADC-urilor MORAb-003 a folosit utilizarea limitată a lizinei. Utilizarea limitată a lizinei are ca rezultat conjugarea unui număr foarte limitat al celor peste 70 de lizine expuse la solvent disponibile pe o moleculă IgG umană tipică, şi poate permite potenţial obţinerea de amestecuri de produse ADC cu omogenitate mai mică în raport cu strategiile care implică modificarea cisteinei.
2.1.1 Prepararea VCP-eribulinei pentru ADC-uri MORAb-003
Eribulină (1) (10 mg, 14 µmol) (Figura 2) a fost dizolvată în N,N-dimetilforma-midă (DMF) (1mL), şi a fost amestecată bine. S-au adăugat N,N-diizopropiletilamină (bază Hunig sau iPr2NEt) (3,6 µL, 21 µmol) şi Fmoc-Val-Cit-para-aminobenzil-para-nitrofenol (Fmoc-VCP-PNP) (2) (16 mg, 21 µmol, Concortis Biosystems, cat. # VC1003). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 4 - 16 ore, monitorizat folosind un kit de testare a ninhidrinei (Anaspec, cat. # 25241) până când reacţia a fost finalizată. La amestecul de reacţie a fost apoi adăugată dietilamină (Et2NH) (0,014 ml, 0,14 mmol), s-a agitat timp de 2 ore la 18 - 25°C pentru a îndepărta gruparea de pro-tecţie Fmoc. Reacţia a fost monitorizată utilizând un kit de testare a ninhidrinei. La finalizare, solventul a fost evaporat sub vid pentru a permite obţinerea VCP-eribulinei brute (3) (16 mg), purificat utilizând o coloană ZOBAX SB-C18 (dimensiunea porilor de 5 µm, 9,4 x 150 mm) pe un sistem HPLC Waters Alliance e2695 în faza mobilă a H2O-CH3CN conţinând acid formic 0,1%, printr-un gradient de 15 - 70% B. VCP-eribulina (3) (16 mg) a fost dizolvată în DMF (1 mL). S-au adăugat bază Hunig (7,2 µL, 41 µmol) şi maleimido-PEG2-NHS (4) (9,7 mg, 27 µmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la 18 - 25°C timp de 3 ore. Amestecul de reacţie a fost purificat prin HPLC (H2O-CH3CN) conţinând acid formic 0,1%) printr-un gradient de 15 - 70% B. Solventul a fost îndepărtat prin liofilizare pentru a produce mal-(PEG)2-Val-Cit-p-aminobenziloxicarbonil (pAB)-eribulină (mal-(PEG)2-VCP-eribulină) (5).
2.1.2 Optimizarea condiţiilor de reducere
ADC-urile MORAb-003 au fost preparate prin generarea de cisteine neîmpe-recheate prin reducere parţială cu echivalenţi molari limitaţi ai agentului de reducere non-tiol tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP). A fost efectuată o cercetare iniţială pe MORAb-003, prin care concentraţia anticorpului, concentraţia TCEP şi timpul de incubare au fost variate, cu scopul de a genera o medie de 4 situsuri conjugabile per moleculă de anti-corp. Numărul de situsuri de tiol liber a fost determinat utilizând o analiză de cuantificare a tiolului fluorometrică. Rezultatele acestei analize sunt arătate în Tabelul 12. Gradul de rupere a legăturilor H-H şi H-L după o incubare de 10 min., 30 de min., 60 de min. sau 120 de min. a fost analizat, de asemenea, prin SDS-PAGE (Figura 3). Pentru această analiză, probe nereduse şi reduse au fost încărcate pe un gel SDS-PAGE şi electro-foreza a fost efectuată la 185 V timp de 1 oră. În Figura 3, banda M corespunde stan-dardului proteic. Banda 1 corespunde MORAb-003 netratat, neredus. Banda 2 cores-punde MORAb-003 (5,3 mg/mL) redus în 70,6 µM TCEP. Banda 3 corespunde MORAb-003 (5,3 mg/mL redus) în 141,2 µM TCEP. Banda 4 corespunde MORAb-003 (1,5 mg/mL) redus în 20 µM TCEP. Banda 5 corespunde MORAb-003 (1,5 mg/mL) redus în 40 µM TCEP. Identităţile fiecărei benzi sunt indicate pe gelul din dreapta jos. "H" indică lanţ greu, în timp ce "L" indică lanţ uşor.
Tabelul 12. Optimizarea condiţiilor de reducere pentru MORAb-003
10 min 30 min 60 min 120 min Concentraţia MORAb-003 µM (mg/ml) Concentraţia TCEP µM Tiol liber µM Legături de disulfură reduse per MAb Tiol liber µM Legături de disulfură reduse per MAb Tiol liber µM Legături de disulfură reduse per MAb Tiol liber µM Legături de disulfură reduse per MAb 35,3 (5,3) 70,6 215 3,0 247,5 3,5 297,6 4,2 266,8 3,8 35,3 (5,3) 141,2 339 4,8 372,8 5,3 384,2 5,4 479,8 6,8 10 (1,5) 20 13,3 0,7 14,7 0,7 15,2 0,8 14,6 0,7 10 (1,5) 40 21,8 1,1 25,6 1,3 26,9 1,3 27,4 1,4
Analiza SDS-PAGE şi a conţinutului de tiol a sugerat că incubarea de 60 min a mAb de 5,3 mg/ml la raport molar de 4 ori între TCEP şi mAb a oferit un punct de ple-care rezonabil, deoarece reducerea limitată a disulfurilor intramoleculare părea să fie prezentă (aşa cum a fost determinat prin conţinutul de tiol liber), şi a rămas foarte puţin mAb neredus (mAb neredus ar acţiona ca un inhibitor competitiv în studiile in vitro şi in vivo folosind ADC-uri preparate). Au fost efectuate studii suplimentare cu MORAb-003 la concentraţii de pornire de 5,0 mg/mL pentru a confirma acest raport molar optimizat între TCEP şi mAb utilizând analiza SDS-PAGE (Figura 4). În Figura 4, banda 1 co-respunde standardului proteic. Banda 2 corespunde MORAb-003 netratat, neredus. Banda 3 corespunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:1. Banda 4 corespunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:2. Banda 5 co-respunde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:3. Banda 6 cores-punde MORAb-003 tratat la un raport MORAb-003:TCEP de 1:4. Conjugarea folosind maleimido-PEG2-biotină a fost efectuată, de asemenea, ulterior reducerii şi îndepărtării TCEP, pentru a simula conjugarea citotoxinei pentru prepararea ADC. Analiza DAR a fost efectuată utilizând LC-MS. Rezultatele acestor studii sunt prezentate în Tabelul 13.
Tabelul 13. Optimizarea condiţiilor de reducere pentru MORAb-003 - niveluri de conjugare cu maleimido-PEG2-biotină
TCEP MORAb-003 TCEP:mAb TCEP (µM) LC HC DAR 1 33,3 0,29 0,34 1,26 2 66,7 0,48 0,83 2,62 3 100 0,63 1,21 3,68 4 133,2 0,73 1,70 4,86 LC, nivelul lanţului uşor de biotină; HC, nivelul lanţului greu de biotină; DAR, biotină per mAb [DAR = 2(LC) + 2(HC)].
După conjugarea biotinei, analiza tiolului liber a indicat faptul că în MORAb-003-biotină nu a fost prezent tiol liber. Acest lucru a indicat faptul că, după reducerea legă-turilor de disulfură, conjugarea a avut loc, în mod obişnuit, la ambii tioli generaţi, şi că orice disulfuri reduse, neconjugate, au suferit o re-oxidare pentru a reforma legăturile de disulfură. Condiţiile finale alese pentru reducere pentru generarea ADC au fost con-centraţie de anticorpi de 5,0 mg/mL, concentraţie TCEP de 110 µM, şi timp de incubare de 60 min. Acest lucru duce la un mAb cu un DAR de 4 după conjugare.
2.1.3 Optimizarea conjugării ADC
Deoarece prima citotoxină utilizată pentru prepararea ADC a fost criptoficina, care este un compus hidrofob, au fost efectuate experimente iniţiale de optimizare a conjugării cu un anticorp anti-mezotelină umană "surogat" având două cisteine neîm-perecheate disponibile pentru conjugare (una per lanţ uşor) în locaţii specifice. Acest lucru facilitează foarte mult analiza eficienţei de conjugare prin spectrometrie de masă, deoarece doar lanţul uşor trebuie să fie analizat. A fost efectuată titrarea propilen glicolului în timpul conjugării maleimido-LL3-criptoficinei cu anticorpul surogat, urmată de analiza eficienţei de conjugare a lanţului uşor prin LC-MS (Tabelul 14).
Tabelul 14. Optimizarea concentraţiei de propilen glicol în reacţia de conjugare
Propilen glicol (%) LC Ab conjugat (%) 0 8% 20 48% 50 100% Mase LC: neconjugat, 23536 Da; conjugat, 24367 Da.
50% propilen glicol a avut ca rezultat ocuparea deplină a situsurilor disponibile, şi a fost aleasă drept concentraţia finală care urmează să fie utilizată. După conjugare nu s-a observat nicio pierdere în legarea mAb (datele nu sunt reprezentate), indicând faptul că propilen glicolul nu a avut efecte dăunătoare asupra anticorpului. Prin urmare, condiţiile de reacţie de conjugare finale alese au fost 2,5 mg/mL mAb final, raport molar 6:1 pentru maleimido-linker-citotoxină:mAb în 0,5X DPBS (concentraţie finală după adăugarea de propilen glicol), 0,5 mM EDTA, 50% propilen glicol, pH 7,2 timp de 3,5 - 4 ore la temperatura camerei. În aceste reacţii, propilen glicolul este adăugat înainte de adăugarea maleimido-linker-citotoxinei.
2.1.4 Prepararea ADC-urilor şi caracterizarea biofizică
Condiţiile de reducere şi conjugare stabilite, descrise în secţiunea 2.1.2, au fost folosite pentru a prepara primele 10 ADC-uri MORAb-003 enumerate în Tabelul 15. ADC-urile rămase au fost preparate fie prin punte de disulfură redusă, fie prin utilizarea limitată a lizinei, cu excepţia M-MMAE şi M-DM1. M-MMAE şi M-DM1 au fost preparate de Concortis Biosystems, Inc., şi au fost primite în forma conjugată.
Chimia de punere în punte a disulfurii reduse face punte peste tioli liberi produşi în timpul procesului de reducere parţială, dând o citotoxină per disulfură redusă. În teorie, un anticorp având DAR = 4 ar avea disulfuri atât H-L cât şi de balama repuse în punte, oferind un ADC cu stabilitate şi omogenitate crescute faţă de abordările de conjugare tradiţionale. Utilizarea limitată a lizinei are ca rezultat conjugarea unui număr foarte limitat al celor peste 70 de lizine expuse la solvent disponibile pe o moleculă IgG umană tipică. Conjugaţii MORAb-003 preparaţi utilizând această metodă au avut ca rezultat un DAR de 2,0, sugerând că a fost utilizată o singură lizină per pereche H-L.
Toate ADC-urile au fost purificate prin cromatografie de desalinizare HiPrep 26/10 şi formulate în DPBS. Analiza DAR a fost efectuată pe toate ADC-urile preparate prin LC-MS şi nivelurile de agregare au fost determinate prin SEC-HPLC. Rezultatele acestor analize DAR şi de agregare sunt enumerate în Tabelul 15 lângă ADC-ul res-pectiv.
Tabelul 15. Analize biofizice ale ADC-urilor MORAb-003
Numele compusului DAR Agregare (%) 1 PEG3-Bz-disulfidil-dimetil-criptoficină 3,7 - 3,9 29 2 LL2-criptoficină 3,2 18 - 36 3 LL3-criptoficină 3,2 - 3,7 22 - 36 4 VCP-criptoficină 3,4 50 5 VCP-eribulină 3,6 0 - 2,6 6 ER-001161318 3,5 3,2 7 ER-001161319 3,5 3,1 8 ER-001159200 2,8 9 M-MMAE 4,0 2 10 NHS-PEG2-AuF 5,0 11 M-DM1 3,6 1,8 12 M-0285 4,0 1,2 13 M-0115 4,0 0,4 14 M-172 3,1 3,6 15 M-174 2,8 4,4 16 M-158 4,5 3,8 17 M-0384 4,2 4,2 18 M-0302 4,3 3,3 19 M-292 4,0 4,5 20 M-0026 4,2 3,3 21 M-0267 4,0 2,9 22 M-0272 3,3 1,5 23 M-0260 3,2 1 24 M-0276 4,6 6,2 25 M-015-0913 2,0 < 1 26 M-030-0132 2,0 < 1 27 M-0161 2,1 2,4 28 M-0157 2,0 < 1 29 M-027-0381 2,0 < 1 30 M-0025 2,0 1,7 31 M-0301 2,0 1,4 32 M-030-0011 2,0 < 1 33 M-030-0291 2,0 <1 34 M-0255 3,6 5,9 35 M-0114 4,0 3,9
Valorile DAR pentru toate ADC-urile au fost în intervalul predeterminat (DAR între 3 şi 4). Nivelurile agregate pentru ADC-urile pe bază de criptoficină au fost sem-nificativ mai mari decât cele dorite (> 10%), în timp ce maleimido-linker-citotoxinele pe bază de eribulină (VCP-eribulină) şi pe bază de maitansină (ER-001161318, ER-001161319, şi M-MMAE) au demonstrat, toate, niveluri agregate acceptabile. O cer-cetare asupra altor co-solvenţi organici a fost efectuată pe reacţii de conjugare la MORAb-003 folosind VCP-criptoficină. Co-solvenţii testaţi au fost DMSO (10%), N,N-dimetilformamidă (20%), N,N-dimetilacetamidă (20%), şi N,N-dimetilpropionamidă (20%). Nivelurile agregate după conjugare folosind aceşti co-solvenţi au fost, toate, egale cu, sau mai mari de, 50% propilen glicol.
O analiză SDS-PAGE non-reducătoare a fost efectuată pe un subset de ADC-uri (Figura 5). Deoarece DAR pentru toate aceste ADC-uri a fost determinat a fi 4, s-a crezut că aceste ADC-uri ar trebui să migreze ca IgG intactă de ~ 160 kD, deoarece ambele disulfuri H-L, şi ambele disulfuri balama ar trebui să fie repuse în punte. Acest subset de ADC-uri a inclus M-MMAE (banda 2), M-DM1 (banda 3), M-0026 (banda 4), M-0260 (banda 5), M-0267 (banda 6), M-0272 (banda 7), M-0285 (banda 8), M-292 (banda 9), M-027-0381 (banda 10), şi M-0384 (banda 11) (Figura 5). În Figura 5, banda 1 corespunde standardului proteic.
Din această analiză reiese clar că, pentru ADC-urile cu chimie de punere în punte a disulfurii reduse (benzile 4 - 9, 11), există specii monovalente H-L semnificative (80 kD), în plus faţă de ADC intact. Acest lucru indică faptul că există o punere în punte a disulfurii balama intra-catenare semnificativă, în plus faţă de punerea în punte balama inter-catenară. Analiza SEC-HPLC indică faptul că ADC-urile migrează ca o singură IgG intactă, indicând faptul că pentru acele ADC-uri cu punere în punte H-H intra-catenare, lanţurile grele sunt asociate non-covalent în ADC-ul final.
2.2 Analize de potenţă in vitro ale ADC-urilor MORAb-003
2.2.1 Citotoxicitatea pe celulele IGROV1 şi SJSA-1
Potenţa in vitro a ADC-urilor preparate a fost evaluată folosind o analiză cu violet de genţiană, aşa cum este detaliat în secţiunea 1.4.1.
Screening-ul iniţial al tuturor ADC-urilor MORAb-003 a fost efectuat pe celule IGROV1 (FRhi(+++)) şi SJSA-1 (FRneg(-)).Celulele IGROV1 au ca origine carcinomul epi-telial ovarian uman şi exprimă niveluri ridicate ale receptorului alfa al folatului (FR), antigenul ţintă al MORAb-003. Celulele SJSA-1 sunt o linie de celule tumorale de os-teosarcom uman care sunt negative pentru receptorul alfa al folatului. Screening-ul ADC-urilor selectate a fost efectuat, de asemenea, în celule CaOV3 (carcinom ovarian uman, FRmed(++)), NCI-H2110 (carcinom pulmonar cu celule non-mici uman, FRmed(++)), şi/sau OVCAR3 (carcinom ovarian uman, FRmed(++)).Rezultatele acestui screening sunt furnizate în Tabelul 16.
Tabelul 16. Screening-ul de citotoxicitate (IC50) al ADC-urilor MORAb-003 pe diferite linii de celule tumorale
Numele compusului IGROV1 SJSA-1 CaOV3 NCI-H2110 OVCAR3 PEG3-Bz-disulfidyl-dimetil-criptoficină 0,067 0,41 LL2-criptoficină 0,023 4,7 0,33 LL3-criptoficină 0,086 12,7 0,19 0,094 VCP-criptoficină 0,03 ∼100 0,02 VCP-eribulină 0,054 > 100 3,7 0,73 0,16 ER-001161318 0,26 > 100 3,1 ER-001161319 0,49 > 100 11,3 ER-001159200 6,5 > 100 9,2 M-MMAE 0,2 253 NHS-PEG2-AuF 0,2 > 500 M-DM1 55 132 M-0285 0,3 > 100 14 8,8 M-0115 0,54 > 100 M-172 > 500 > 500 M-174 > 500 > 500 M-158 > 500 > 500 M-0384 2,25 2,45 M-0302 330 > 500 M-292 1,7 > 500 M-0026 1,38 540 M-0267 0,029 0,028 M-0272 0,252 1,02 M-0260 0,383 0,036 M-0276 0,43 30 M-015-0913 > 500 > 500 M-030-0132 > 500 17,3 M-0161 > 500 > 500 M-0157 > 500 > 500 M-027-0381 14,5 28 M-0025 > 500 > 500 M-0301 > 500 > 500 M-030-0011 61,6 > 500 M-030-0291 > 500 105 M-0255 0,12 0,46 M-0114 144 > 100 Toate valorile sunt IC50 în nM, şi sunt valori medii ale experimentelor replicate, atunci când au fost efectuate.
ADC VCP-eribulină a fost potent (54 pM) pe celulele IGROV1 şi a avut ucidere puţină asupra celulelor SJSA-1. Pentru aceste linii de celule, ADC-ul VCP-eribulină a demonstrat potenţă şi specificitate mai mare în raport cu ADC-urile cu valori DAR echivalente, cum ar fi M-MMAE şi M-DM1. ADC VCP-eribulină a demonstrat, de ase-menea, citotoxicitate puternică pe liniile de celule tumorale care exprimă FR suplimen-tare de origine ovariană (CaOV3 şi OVCAR3) şi care au ca origine carcinomul pulmonar cu celule non-mici (NC-H2110).
ADC-urile VCP-eribulin, LL2-criptoficină, LL3-criptoficină, VCP-criptoficină, ER-001161318, ER-001161319, şi ER-001159200 au afişat citotoxicitate specifică (> 2-log de specificitate) în celulele CaOV3 (FRmed(++)).Un număr din aceste ADC-uri a prezentat o potenţă sub-nanomolară. Conjugaţii de criptoficină au demonstrat, de asemenea, niveluri ridicate de potenţă (23 pM - 86 pM) în celulele IGROV1, dar, cu excepţia VCP-criptoficinei, au demonstrat, de asemenea, citotoxicitate măsurabilă pe celulele SJSA-1. Conjugaţii de maitansină care pot fi scindaţi ER-001161318 şi ER-001161319 au avut o potenţă intermediară pe IGROV1 (0,26 nM şi 0,49 nM), şi ucidere puţină departe de ţintă a celulelor SJSA-1.
Toţi conjugaţii de utilizare limitată a lizinei nu au demonstrat nicio specificitate şi nu au fost evaluaţi în continuare. Conjugaţii care pot fi scindaţi care utilizează tehnologia de punere în punte a disulfurii reduse a duostatinei-3 (M-0285), duostatinei-5 (M-0115) şi duostatinei-14 (M-292 şi M-0026) au demonstrat, toţi, citotoxicitate specifică pe linia de celule IGROV1, cu citotoxicitate mică pe linia de celule SJSA-1. Conjugaţii de duo-statină-3 şi duostatină-5, derivaţi de auristatină, au fost uşor mai mari în potenţă decât conjugaţii de duostatină-14, care este un derivat al maitansinei. Potenţele şi specifici-tăţile au fost comparabile cu conjugatul M-MMAE de control, care foloseşte un linker Val-Cit-pAB (VCP) ataşat la monometil E. Conjugaţii cu chimie de disulfură redusă care nu pot fi scindaţi, au fost, toţi, lipsiţi fie de potenţă, fie de specificitate suficientă, şi nu au fost analizaţi în continuare.
2.2.2 Citotoxicitatea pe linia de celule de cancer ovarian CaOV3 care exprimă receptorul folatului uman
Potenţa ADC-urilor MORAb-003 selectate a fost determinată, de asemenea, pe liniile de celule de tumoră ovariană umană OVCAR3 şi CaOV3, precum şi pe linia de celule de NSCLC uman NCI-H2110 (Tabelul 16). Pe linia celulară ovariană umană CaOV3, conjugaţii de criptoficină au demonstrat potenţă mai mare măsurabilă decât conjugatul VCP-eribulină, spre deosebire de cea observată în celulele IGROV1. Acest lucru se poate datora nivelului de exprimare mai mic al receptorului alfa al folatului pe celulele CaOV3 în comparaţie cu IGROV1, sau potenţei mai mari a criptoficinei pe aceste celule, în comparaţie cu eribulina. Conjugaţii pe bază de maitansină ER-001161318, ER-001161319 şi ER-001159200 au avut, toţi, potenţe similare cu, sau mai mici decât VCP-eribulină.
2.3 Uciderea vecinătăţilor a VCP-eribulină, ER-001161318 şi M-0285
Pentru a evalua activitatea de ucidere a vecinătăţilor a fost stabilită o analiză, folosind două linii de celule marcate. În această analiză, celule IGROV1 (FRhi) marcate cu Nuclight™ Green şi HL-60 (FRneg) marcate cu Nuclight™ Red au fost co-cultivate în diferite rapoarte ale numărului de celule, şi au fost tratate cu titrări ale ADC-urilor MORAb-003 VCP-eribulină, ER-001161318 sau M-0285. VCP-eribulina este un ADC pe bază de eribulină care cuprinde un linker care poate fi scindat maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB, în timp ce ER-001161318 este ADC pe bază de maitansină care cuprinde un linker care poate fi scindat maleimido-(CH2)5-Val-Cit-pAB şi M-0285 este un ADC pe bază de duostatină care cuprinde un linker care poate fi scindat PEG-pAB. Citotoxicitatea a fost monitorizată cu un sistem de imagistică de celule Incucyte Zoom®. Rezultatele acestei analize de citotoxicitate a vecinătăţilor sunt arătate în Tabelul 17 şi în Figurile 6A-C.
Tabelul 17. Activitatea de ucidere a vecinătăţilor a VCP-eribulină pe
co-cultura de linii de celule FR-pozitive şi FR-negative
EC50 (nM) IGROV-1 HL-60 HL-60 (co-cultură cu IGROV-1) HL-60 (eribulină) 0,0005972 39,74 0,2399 0,1702
Atunci când celulele HL-60 (FRneg) au fost cultivate la un raport de 2:1 faţă de celulele IGROV1 (FRhi), tratamentul cu MORAb003-VCP-eribulină a avut ca rezultat o creştere de 2-log a uciderii celulelor HL-60, în comparaţie cu celulele HL-60 singure (Tabelul 17 şi Figura 6A). Aceste date sugerează că celulele ţintă-negative ale recep-torului alfa al folatului (FR) sunt ucise mai eficient de MORAb003-VCP-eribulină atunci când sunt co-cultivate cu celule FR ţintă-pozitive, menţionată în acest document ca uciderea vecinătăţilor. Uciderea vecinătăţilor se distinge de uciderea departe de ţintă, care este definită ca uciderea celulelor ţintă-negative pe cont propriu, în absenţa şi independent de co-cultivarea cu celule ţintă-pozitive. Creşterea observată a uciderii vecinătăţilor a fost, de asemenea, aproape identică cu creşterea observată după tratamentul celulelor HL-60 cu eribulină liberă, indicând un mecanism potenţial pentru efectul asupra vecinătăţilor. Fără a dori să fie legat de nicio teorie, MORAb003-VCP-eribulină poate fi scindat în, sau în apropierea celulelor IGROV1 FR-pozitive, care suferă, de asemenea, apoptoză şi eliberează eribulină liberă în cultură. Citotoxina eliberată poate ucide celulele HL-60 FR-negative.
În schimb, pentru MORAb003-ER-001161318 a fost observată doar o uşoară deplasare (Figura 6B), şi cu MORAb003-0285 nu a fost observată nicio deplasare (Figura 6C). Atunci când raportul HL-60:IGROV1 a fost micşorat de la 2:1 la 1:2 s-a observat uciderea măsurabilă a celulelor HL-60 relativ la celulele HL-60 singure, pentru MORAb003-ER-001161318, în timp ce efectul asupra vecinătăţilor a rămas totuşi scăzut, cu toate că detectabil, pentru MORAb003-0285. Aceste date sugerează că, în ceea ce priveşte uciderea vecinătăţilor, ADC-urile MORAb-003 evaluate pot fi clasificate ca VCP-eribulină > ER-001161318 > M-0285.
2.4 Analiza de stabilitate în ser
Având în vedere timpul de înjumătăţire circulant lung in vivo al ADC-urilor şi potenţialul de toxicitate dacă citotoxinele sunt eliberate în circulaţie, ADC-urile trebuie să demonstreze stabilitate în ser. ADC-urile MORAb-003 VCP-eribulină, ER-001161319, şi M-0285 au fost preincubate în ser uman sau de şoarece la 37°C timp de până la 48 de ore, apoi au fost evaluate într-o analiză de citotoxicitate cu celule IGROV1 şi SJSA-1. ER-001161319 este ADC pe bază de maitansină care cuprinde acelaşi linker care poate fi scindat ca VCP-eribulină, maleimido-PEG2-Val-Cit-pAB. Au fost incluse controale PBS şi serice pentru a corecta orice efecte serice asupra performanţei analizei. Rezultatele acestui studiu sunt arătate în Tabelul 18.
Tabelul 18. Stabilitatea în ser a ADC-urilor MORAb-003 selectate
Analiza de citotoxicitate pe bază de celule, EC50, nM MORAb-003-VCP eribulină MORAb-003-ER-001161319 MORAb-003-0285 Timp PBS Ser uman Ser de şoarece PBS Ser uman Ser de şoarece PBS Ser uman Ser de şoarece IGROV1 0 ore-PBS 0,021 0,013 0,02 0,28 0,15 0,2 0,074 0,089 ND 0 ore-ser 0,022 0,014 0,01 0,15 0,15 0,2 0,063 0,078 0,049 4 ore 0,03 0,018 0,019 0,14 0,17 0,25 0,065 0,075 0,049 24 de ore 0,024 0,019 ND ND 0,27 0,9 0,059 0,074 0,044 48 de ore 0,022 0,021 0,03 0,21 0,73 2,56 0,43 0,05 0,051 SJSA-1 0 ore-PBS > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 0 ore-ser > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 4 ore > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 24 de ore > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 48 de ore > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10 > 10
În timp ce VCP-eribulină şi M-0285 au fost stabili timp de cel puţin 48 de ore în oricare seruri, ER-001161319 a demonstrat o scădere semnificativă a potenţei după 48 de ore. Acest lucru se poate datora legăturii aziridino-carbamat cu maitansina, care nu a fost descrisă anterior în literatura de specialitate. Forma compusului eliberat poate să nu fie foarte potentă, deoarece nu s-a observat nicio creştere a citotoxicităţii pe celulele SJSA-1.
2.5 Studii in vitro cu MORAb003-VCP-eribulină
2.5.1 Analiza HIC-HPLC a DAR şi a eterogenităţii produsului
MORAb003-VCP-eribulină şi MORAb003-0285 au fost analizaţi prin HIC-HPLC pentru a evalua DAR printr-o metodă alternativă şi de a examina eterogenitatea pro-dusului şi conţinutul de anticorp neconjugat (concurent). S-a dovedit că MORAb003-VCP-eribulină are specii DAR de 0, 2, 4, şi 6, ceea ce este în concordanţă cu metoda utilizată pentru reducere şi conjugare (Figura 7A). Au fost observate cantităţi foarte mici de specie cu DAR = 0. DAR global, pe baza calculelor AUC, a fost de 3,80, în concor-danţă cu valorile determinate prin LC-MS. MORAb003-0285 a migrat ca un singur vârf prin HIC-HPLC, indicând o singură specie DAR (Figura 7B). Aceasta a fost atribuită ca DAR 4,0.
2.5.2 Specificitate prin analiza concurenţei
Specificitatea la antigen a citotoxicităţii MORAb-003-VCP-eribulină a fost de-monstrată pentru conjugatul VCP-eribulină utilizând un format de analiză a concurenţei (Figura 8). În acest experiment, titrările MORAb-003-VCP-eribulină (concentraţia iniţială de 100 nM) au fost co-incubate cu 2 µM MORAb-003 neconjugat. MORAb-003 necon-jugat a furnizat o deplasare de 2-log a potenţei pe celule IGROV1, similară cu rezulta-tele obţinute cu IMGN853, ADC-ul anti-receptorul alfa al folatului uman-maitansină de la Immunogen, acum în studii clinice de fază II, pe celule KB (Moore şi colab., Reuniunea anuală a American Society of Clinical Oncology (ASCO) din 2015, rezumatul 5518).
2.5.3 Citotoxicitate pe celulele NSCLC NCI-H2110
Folosind o analiză cu violet de genţiană a fost efectuată citotoxicitatea atât pentru MORAb003-VCP-eribulină, cât şi pentru MORAb003-0285 pe linia de celule de NSCLC uman NCI-H2110. Rezultatele acestei analize sunt arătate în Tabelul 16. MORAb003-VCP-eribulină a avut o IC50 de 0,73 nM, în timp ce MORAb003-0285 a avut o IC50 de 14 nM.
2.6 Studii in vivo
2.6.1 Doza maximă tolerată (MTD) de MORAb-003-VCP-eribulină (MORAb-202) în tulpina de şoarece CD-1
Şoareci CD-1 naпvi au fost injectaţi intravenos cu 200 µL de MORAb-202 în conformitate cu planificarea din Tabelul 19. Greutatea corporală a fost măsurată înainte de doză în ziua de dozare, după 24 de ore de la doză, şi de trei ori pe săptămână după aceea. Animalele au fost observate pentru bunăstare clinică pe toată durata studiului. După două săptămâni de la dozare, greutatea corporală terminală a fost măsurată şi înregistrată. Şoarecii eutanasiaţi la sfârşitul studiului (şi dacă vreun şoarece a fost eu-tanasiat sau găsit mort în timpul studiului) au fost prelucraţi pentru necropsie. Organele au fost examinate pentru semne de deteriorare a ţesuturilor.
Tabelul 19. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 3 Vehicul* 0 bolus unic i.v. 2 MORAb-202 10 3 20 4 40 5 80
În oricare dintre grupurile de tratament nu a fost observată nicio pierdere sem-nificativă de greutate corporală în comparaţie cu grupul de control tratat cu PBS, sau orice constatări clinice care să indice toxicitate în timpul tratamentului. Greutatea cor-porală a şoarecilor individuali este arătată în Tabelul 20, iar media grupului şi SEM sunt arătate în Tabelul 21. Cinetica schimbării greutăţii corporale pentru fiecare grup (media grupului şi SEM) sunt arătate în Figura 9. MORAb-202 la doze de până la 80 mg/kg prin intermediul administrării intravenoase în bolus nu a produs toxicitate. Prin urmare, MTD este peste 80 mg/kg.
Tabelul 20
Zile după Rx control PBS MORAb-202 10 mg/kg MORAb-202 20 mg/kg MORAb-202 40 mg/kg MORAb-202 80 mg/kg X A:Y1 A:Y2 A:Y3 B:Y1 B:Y2 B:Y3 C:Y1 C:Y2 C:Y3 D:Y1 D:Y2 D:Y3 E:Y1 E:Y2 E:Y3 0 22,50 20,60 21,20 22,60 23,50 21,80 27,40 26,20 21,00 23,80 23,30 21,70 21,80 26,50 25,80 1 23,60 21,50 22,00 22,80 23,80 23,00 28,80 27,50 21,40 23,60 23,50 21,60 23,10 27,80 27,80 2 23,30 21,90 22,00 23,30 24,00 22,90 29,30 29,00 22,10 23,60 24,60 21,80 23,30 28,30 28,30 4 23,30 21,90 22,00 23,30 23,90 23,30 30,20 31,00 23,00 24,40 24,10 22,70 23,50 29,50 28,60 7 23,90 23,10 22,70 24,80 25,20 24,90 29,60 32,00 24,00 25,10 25,50 23,40 23,30 30,40 30,10 9 24,60 22,50 22,80 24,90 25,30 25,00 30,80 31,70 23,40 25,80 25,20 23,70 23,60 31,00 30,20 11 24,20 23,40 23,20 24,30 25,10 24,30 31,00 32,40 23,80 25,30 25,00 23,80 23,10 29,10 29,40 14 24,00 23,50 24,40 25,80 25,60 25,70 33,20 32,40 24,10 25,70 25,30 26,30 21,70 28,40 28,90
Tabelul 21
zile după injecţii PBS MORAb-202 10 mg/kg MORAb-202 20mg/kg MORAb-202 40mg/kg MORAb-202 80mg/kg media (g) sem n media (g) sem n media (g) sem n media media (g) n media media (g) n 0 21,4 0,6 3 22,6 0,5 3 24,9 2,0 3 22,9 0,6 3 24,7 1,5 3 1 22,4 0,6 3 23,2 0,3 3 25,9 2,3 3 22,9 0,7 3 26,2 1,6 3 2 22,4 0,5 3 23,4 0,3 3 26,8 2,4 3 23,3 0,8 3 26,6 1,7 3 4 22,4 0,5 3 23,5 0,2 3 28,1 2,5 3 23,7 0,5 3 27,2 1,9 3 7 23,2 0,4 3 25,0 0,1 3 28,5 2,4 3 24,7 0,6 3 27,9 2,3 3 9 23,3 0,7 3 25,1 0,1 3 28,6 2,6 3 24,9 0,6 3 28,3 2,3 3 11 23,6 0,3 3 24,6 0,3 3 29,1 2,7 3 24,7 0,5 3 27,2 2,1 3 14 24,0 0,3 3 25,7 0,1 3 29,9 2,9 3 25,8 0,3 3 26,3 2,3 3
2.6.2 Doza maximă tolerată de eribulină la şoarecii CD-1
Şoareci CD-1 naпvi au fost injectaţi intravenos cu 200 µL de eribulină în con-formitate cu planificarea din Tabelul 22. Greutatea corporală a fost măsurată de trei ori pe săptămână, inclusiv înainte de doză în fiecare zi de dozare şi după 24 de ore de la fiecare doză. Animalele au fost observate pentru bunăstare clinică pe toată durata studiului (două săptămâni după ultima doză). Greutatea corporală terminală a fost măsurată şi înregistrată. Şoarecii eutanasiaţi la sfârşitul studiului (şi dacă vreun şoarece a fost eutanasiat sau găsit mort în timpul studiului) au fost prelucraţi pentru necropsie. Organele au fost examinate pentru semne de deteriorare a ţesuturilor.
Tabelul 22. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 3 PBS 0 q4dx3 i.v. 2 Eribulină 0,4 3 0,8 4 1,6 5 3,2
Nu au fost observate pierderi semnificative de greutate corporală sau constatări clinice care să indice toxicitate la animalele cărora li s-a administrat eribulină la doze de până la 1,6 mg/kg, utilizând regimul de dozare q4dx3 (o dată la fiecare patru zile pentru 3 doze în total). Administrarea a 3,2 mg/kg cu aceeaşi planificare a indus piloerecţia la toţi cei trei şoareci după cea de-a doua doză. S-a observat o scădere severă în greutate (23% scădere la un şoarece, #552, după cea de-a doua doză; 17% şi 8% în rest, #551 şi #552, după cea de-a treia doză), în comparaţie cu controlul tratat cu PBS. Nu s-au observat modificări grosolane în organele şoarecilor în timpul necropsiei. Greutatea corporală a şoarecilor individuali este arătată în Tabelul 23, iar media grupului şi SEM sunt arătate în Tabelul 24. Cinetica schimbării greutăţii corporale pentru fiecare grup (media grupului şi SEM) sunt arătate în Figura 10.
Eribulina la doze de până la 1,6 mg/kg, utilizând regimul de dozare q4dx3, nu a produs toxicitate, în timp ce 3,2 mg/kg a indus o scădere severă în greutate. Prin ur-mare, MTD a eribulinei, în acest studiu, este de 1,6 mg/kg, q4dx3.
Tabelul 23
Ziua PBS eribulină 0,4 mg/kg eribulină 0,8 mg/kg eribulină 1,6 mg/kg eribulină 3,2 mg/kg X A:Y1 A:Y2 A:Y3 B:Y1 B:Y2 B:Y3 C:Y1 C:Y2 C:Y3 D:Y1 D:Y2 D:Y3 E:Y1 E:Y2 E:Y3 0 26,50 24,40 23,40 22,40 24,60 23,10 23,90 25,50 25,10 21,90 24,40 23,70 24,30 25,00 22,00 1 28,13 25,11 24,36 21,84 24,02 22,43 23,03 23,60 24,46 21,13 24,10 24,15 22,31 23,47 20,57 4 25,60 25,10 24,40 22,70 24,00 24,00 23,80 24,40 24,50 21,70 24,10 23,30 20,90 22,20 17,50 5 26,40 24,80 24,50 22,30 24,10 23,40 24,10 24,00 24,80 21,50 24,50 24,10 20,90 22,70 16,90 8 27,50 25,70 24,50 23,30 23,70 25,20 24,00 24,80 25,90 21,90 24,50 24,20 21,80 23,90 9003,00* 9 27,50 25,50 24,40 22,90 23,40 25,40 24,00 24,70 25,30 21,80 24,80 24,30 20,20 23,00 11 27,50 25,60 24,40 22,60 23,90 25,60 24,70 25,10 26,00 22,20 25,70 24,70 20,00 23,30 13 27,40 26,80 25,40 23,70 23,93 26,50 25,30 25,60 26,60 22,80 25,80 25,20 21,40 23,70 16 27,30 26,80 26,20 24,70 24,10 26,70 25,40 25,80 26,40 23,40 26,70 26,10 23,60 24,30 18 27,00 27,40 27,30 24,30 24,90 27,90 26,20 28,00 27,90 24,70 27,90 26,20 25,90 25,90 20 28,10 27,60 26,50 26,10 25,70 28,50 25,40 28,20 28,10 25,40 29,00 26,00 26,80 26,00 Fiecare coloană reprezintă un animal individual. *9003: eutanasiat pentru pierdere în greutate > 20%.
Tabelul 24
zile după injecţii PBS eribulină 0,4 mg/kg eribulină 0,8 mg/kg eribulină 1,6 mg/kg eribulină 3,2 mg/kg media (g) sem n media (g) sem n media (g) sem n media media (g) n media media (g) n 0 24,8 0,9 3 23,4 0,6 3 24,8 0,5 3 23,3 0,7 3 23,8 0,9 3 1 25,9 1,2 3 22,8 0,7 3 23,7 0,4 3 23,1 1,0 3 22,1 0,8 3 4 25,0 0,3 3 23,6 0,4 3 24,2 0,2 3 23,0 0,7 3 20,2 1,4 3 5 25,2 0,6 3 23,3 0,5 3 24,3 0,3 3 23,4 0,9 3 20,2 1,7 3 8 25,9 0,9 3 24,1 0,6 3 24,9 0,6 3 23,5 0,8 3 22,9 0,9 2 9 25,8 0,9 3 23,9 0,8 3 24,7 0,4 3 23,6 0,9 3 21,6 1,1 2 11 25,8 0,9 3 24,0 0,9 3 25,3 0,4 3 24,2 1,0 3 21,7 1,3 2 13 26,5 0,6 3 24,7 0,9 3 25,8 0,4 3 24,6 0,9 3 22,6 0,9 2 16 26,8 0,3 3 25,2 0,8 3 25,9 0,3 3 25,4 1,0 3 24,0 0,3 2 18 27,2 0,1 3 25,7 1,1 3 27,4 0,6 3 26,3 0,9 3 25,9 0,0 2 20 27,4 0,5 3 26,8 0,9 3 27,2 0,9 3 26,8 1,1 3 26,4 0,3 2
2.6.3 Evaluarea dozei eficiente minime de MORAb003-VCP-eribulină (MORAb-202) în modelul de hNSCLC NCI-H2110 la şoareci CB17-SCID
Celule de NSCLC uman, NCI-H2110, pasajul 47 au fost implantate subcutanat la 30 de şoareci CB17 SCID (de sex feminin, cu vârsta de 5 până la 6 săptămâni, cân-tărind 20 de grame). După 14 zile de la implantare, şoarecii au fost randomizaţi în cinci grupuri. Volumul mediu al tumorii în fiecare grup în ziua tratamentului (Ziua 0) a variat între 154 - 175 mm3 (Tabelul 27). Şoarecii înrolaţi au fost trataţi cu MORAb003-VCP-eribulină (MORAb-202) (Lot # NB2900-87E 10/07/15) la 1, 2,5 sau 5 mg/kg, cu MORAb-003-0285 (Lot # 042-150-002) drept control la 5 mg/kg, sau cu PBS, în conformitate cu conceptul studiului (Tabelul 25). Fiecare grup a fost eliminat din studiu atunci când volumul tumorii la orice animal din grup a fost > 2000 mm3. Ultimul grup a fost terminat în ziua 61.
Tabelul 25. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 5 PBS 0 bolus unic i.v. 2 5 MORAb-003-VCP-eribulină 1 3 5 MORAb-003-VCP-eribulină 2,5 4 41 MORAb-003-VCP-eribulină 5 5 5 MORAb003-0285 5 1 Patru şoareci în acest grup. Un şoarece a fost exclus din acest grup din cauza erorii cu injecţie cu tratament, care a fost verificată prin absenţa compusului din serurile animale pe baza datelor de imunoanaliză prin electrochimioluminiscenţă (ECLIA). După un tratament cu doză unică, MORAb-003-0285 a cauzat TGI de 89,7% la 5 mg/kg (p < 0,0001 vs. soluţie salină).
Volumele tumorilor în şoarecii individuali sunt arătate în Tabelul 26, iar media grupului şi SEM sunt arătate în Tabelul 27. Cinetica creşterii tumorii pentru fiecare grup (media grupului şi eroarea standard a mediei, SEM) sunt arătate în Figura 11, iar vo-lumele tumorilor în şoarecii individuali, precum şi media grupului şi SEM, sunt arătate în Figura 12. Pe baza volumelor tumorilor în ziua 17 (atunci când a fost observat primul volum al tumorii > 2000 mm3), MORAb-202 a cauzat inhibare a creşterii tumorale (TGI) de 47% la 1 mg/kg (p = 0,002 faţă de soluţia salină), TGI de 96% la 2,5 mg/kg (p < 0,0001 faţă de soluţia salină). Cu toate acestea, tumorile regresate au crescut din nou după una sau două săptămâni de la terminarea tratamentului. Nu a fost detectată nicio tumoare la şoarecii trataţi cu 5 mg/kg de MORAb-202. Aceşti şoareci au rămas fără tumori mai mult de 60 de zile
Greutatea corporală a şoarecilor individuali este arătată în Tabelul 28, iar media grupului şi SEM sunt arătate în Tabelul 29. Cinetica schimbării greutăţii corporale pentru fiecare grup (media grupului şi SEM) este arătată în Figura 13.
Nu a fost observată nicio pierdere semnificativă în greutate corporală în niciunul dintre grupurile de tratament în comparaţie cu controlul.
MORAb-202 a arătat un efect semnificativ asupra creşterii tumorii NCI-H2110. Regresia tumorii a fost obţinută printr-un tratament în bolus la 2,5 mg/kg cu TGI de 94% (vs. PBS). Prin urmare, doza eficientă minimă de MORAb-202 este de 2,5 mg/kg, tes-tată în acest model. Eradicarea completă a tumorii a fost obţinută printr-o singură doză la 5 mg/kg. Nu s-a observat nicio creştere a tumorii timp de mai mult de 60 de zile.
Tabelul 26. Volumele tumorilor
zile după rando-mizare PBS MORAb-202 1 mg/kg MORAb-202 2,5mg/kg MORAb-202 5 mg/kg 003-0285 5 mg/kg 0 164 195 137 300 80 178 218 133 118 150 187 189 92 120 236 110 202 159 146 65 208 241 243 97 3 368 413 279 587 171 178 207 104 106 216 144 97 65 69 148 40 115 68 68 83 259 358 292 164 5 327 481 285 555 190 161 193 83 95 215 75 51 37 35 56 14 52 22 37 54 160 168 239 105 6 467 758 541 894 275 257 258 139 160 348 61 52 58 33 57 7 28 25 20 43 197 235 247 129 7 642 815 621 1055 395 317 306 182 167 476 64 54 53 36 57 8 48 16 20 52 192 255 266 128 10 891 1238 895 1328 662 506 494 230 285 708 24 37 35 15 71 0 0 0 0 39 155 240 181 86 12 993 1274 983 1519 1115 638 655 371 361 865 40 21 51 9 69 0 0 0 0 32 106 206 223 83 14 981 1410 1131 1695 971 848 812 402 418 901 41 30 37 0 89 0 0 0 0 31 115 235 157 79 17 1320 1723 1319 2089 1466 955 980 727 592 946 46 33 64 0 161 0 0 0 0 28 114 346 251 74 19 838 1030 856 602 953 56 37 90 0 282 0 0 0 0 27 144 438 359 94 24 102 37 197 0 702 0 0 0 0 46 391 1244 824 187 26 168 102 319 0 790 0 0 0 0 103 564 1470 1030 287 28 269 54 474 9 990 0 0 0 0 125 703 1898 1112 375 31 362 105 558 13 1187 0 0 0 0 225 1144 2427 1413 657 33 496 124 588 9 1461 0 0 0 0 35 573 212 669 16 1847 0 0 0 0 38 764 348 952 20 2367 0 0 0 0 40 0 0 0 0 42 0 0 0 0 45 0 0 0 0 47 0 0 0 0 52 0 0 0 0 54 0 0 0 0 59 0 0 0 0 61 0 0 0 0
Fiecare coloană reprezintă un animal individual.
Tabelul 27
zile după rando-mizare PBS MORAb-202 1mg/kg MORAb-202 2,5mg/kg MORAb-202 5mg/kg MORAb-003-0285 5mg/kg MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N 0 175,2 36,41527 5 159,4 17,68781 5 164,8 25,8917 5 154,25 16,95792 4 170,8 37,46065 5 3 363,6 69,3831 5 162,2 24,14101 5 104,6 17,7581 5 72,75 13,88661 4 231,2 48,4055 5 5 367,6 66,21275 5 149,4 26,13343 5 50,8 7,242607 5 31,25 7,500133 4 145,2 31,14683 5 6 587 108,7468 5 232,4 37,74183 5 52,2 5,005179 5 20 4,140008 4 170,2 37,81015 5 7 705,6 109,7441 5 289,6 55,74694 5 52,8 4,611415 5 23 7,76666 4 178,6 40,08123 5 10 1002,8 122,532 5 444,6 85,61518 5 36,4 9,499597 5 0 0 4 140,2 35,30937 5 12 1176,8 100,25 5 578 95,18355 5 38 10,62087 5 0 0 4 130 36,5513 5 14 1237,6 138,8994 5 676,2 109,4307 5 39,4 14,30871 5 0 0 4 123,4 34,69758 5 17 1583,4 146,0629 5 840 76,78507 5 60,8 27,09899 5 0 0 4 162,6 58,96373 5 19 855,8 72,16584 5 93 49,35207 5 0 0 4 212,4 79,06236 5 24 207,6 127,8177 5 0 0 4 538,4 219,5123 5 26 275,8 138,3498 5 0 0 4 690,8 249,2466 5 28 359,2 177,874 5 0 0 4 842,6 310,8641 5 31 445 208,4929 5 0 0 4 1173,2 373,2365 5 33 535,6 255,2269 5 0 0 4 35 663,4 318,1881 5 0 0 4 38 890,2 402,5237 5 0 0 4 40 0 0 4 42 0 0 4 45 0 0 4 47 0 0 4 52 0 0 4 54 0 0 4 59 0 0 4 61 0 0 4
Tabelul 28
zile după rando-mizare PBS MORAb-202 1 mg/kg MORAb-202 2,5mg/kg MORAb-202 5 mg/kg MORAb-003-0285 5 mg/kg 0 19,1 18,2 18,4 18,9 18,8 19,1 18,6 19,3 20,6 18,4 17,8 18,1 18 19,8 16,3 17,6 18,7 16,1 19,7 20,5 17,4 18 17,4 18,8 3 19,6 18,2 18,9 18,9 19,3 19,3 18,4 20,2 20,9 18,6 18,4 19,1 18,6 19,9 16,4 17,5 18,8 15,9 19,9 20,8 17 18,1 16,3 18,5 6 19,7 18,4 18,4 19,1 19,1 19 18,3 20,3 21,3 19 18,5 19,4 18,7 20 16,4 17,5 19,3 16,3 19,6 20,8 17,7 18,2 16,8 18,7 7 19,7 18 18,9 18,8 18,9 18,9 18 20 21,2 18,9 18,7 18,7 18,7 19,7 16,5 17,4 19,4 16,5 19,2 20,6 17,7 18,5 16,8 19 10 19,7 18 19,2 18,5 19,1 18,4 18 20,1 20,9 19 19,3 19,7 18,8 19,8 16,6 17,6 19,4 16,7 20 20,5 18,2 18,6 17,5 20,3 12 19,8 17,7 19,1 18,4 19 18,3 17,8 20,5 20,9 19,5 18,9 20 19,7 20,2 17,2 17,9 19,6 16,9 20,2 20,4 18,3 18,8 18,1 20,4 14 18,8 17,4 18,4 18,2 17,5 17,9 17,7 20,3 21,2 19,9 18,8 19,6 19 19,3 17 17,5 19,3 17 19,2 20 18,2 18,9 18,4 19,7 17 18,8 17,2 18,3 17,5 17,2 17,4 17,7 20,4 20,7 19,2 18,8 19,8 19,7 19,2 17,3 17,9 20 17,3 19,7 19,8 17,9 18,9 18,6 19,5 19 16,7 17,2 19,9 20,7 18,9 18,3 19,8 18,7 19,5 16,8 18,1 20 17,1 20,2 19,7 18 19,3 18,4 19,6 24 18,8 20,2 19,2 19,9 16,9 18,5 20,7 17,5 20,2 20,1 18,5 20 19,1 18,9 26 18,9 19,6 18,9 19,5 16,5 18,3 20,7 17,6 19,7 20,6 18,4 19,9 18,6 19,1 28 18,8 19,6 19,5 19,6 16,6 18,6 21,3 17,6 20,1 20,8 18,5 19,9 18,8 19,5 31 18,9 20,1 19,6 20,7 17 18,6 20,4 17,9 20,9 20,7 18,2 20,9 19,6 19,5 33 18,9 19,8 19,4 21,2 17,6 18,8 19,6 18,2 21,3 35 19,2 19,7 19,5 20,7 17,4 18,7 20,2 18,1 19,6 38 19,6 20 19,7 20,6 18 18,8 20,4 19 17,2 40 19,4 20,4 18,7 19,3 42 19,9 20,4 18,8 20,6 45 19,8 21 18,3 21,7 47 19,7 20,7 18,3 21,1 52 20,2 21,1 18,5 21,9 54 20,3 21,4 18,6 22,6 59 20 21,6 18,8 21,7 61 20,5 22,1 19,2 21,3
Tabelul 29
zile după rando-mizare PBS MORAb-202 1 mg/kg MORAb-202 2,5 mg/kg MORAb-202 5 mg/kg MORAb-003-durostatină 5 mg/kg MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N 0 18,68 0,165239 5 19,2 0,385328 5 18 0,554902 5 18,025 0,689078 4 18,42 0,578982 5 3 18,98 0,234959 5 19,48 0,47393 5 18,48 0,579842 5 18,025 0,769253 4 18,14 0,76975 5 6 18,94 0,245739 5 19,58 0,537015 5 18,6 0,609665 5 18,175 0,694839 4 18,44 0,667108 5 7 18,86 0,268971 5 19,4 0,549488 5 18,46 0,525953 5 18,125 0,628577 4 18,52 0,638721 5 10 18,9 0,29444 5 19,28 0,537015 5 18,84 0,585996 5 18,425 0,68618 4 19,02 0,590063 5 12 18,8 0,352933 5 19,4 0,600608 5 19,2 0,545849 5 18,65 0,678513 4 19,2 0,502108 5 14 18,06 0,267112 5 19,4 0,685817 5 18,74 0,454832 5 18,25 0,523801 4 19,04 0,352368 5 17 17,8 0,320373 5 19,08 0,673649 5 18,96 0,451533 5 18,725 0,592675 4 18,94 0,33497 5 19 18,68 0,764423 5 18,62 0,527655 5 18,85 0,670634 4 19 0,338521 5 24 19 0,579498 5 19,225 0,663539 4 19,32 0,313137 5 26 18,68 0,563279 5 19,075 0,621135 4 19,32 0,41086 5 28 18,82 0,573795 5 19,4 0,728103 4 19,5 0,407939 5 31 19,26 0,636533 5 19,45 0,638148 4 19,78 0,484329 5 33 19,38 0,585826 5 19,475 0,60047 4 35 19,3 0,536644 5 19,15 0,416401 4 38 19,58 0,430983 5 18,85 0,584918 4 40 19,45 0,314619 4 42 19,925 0,359691 4 45 20,2 0,665164 4 47 19,96 0,549137 4 52 20,425 0,651414 4 54 20,725 0,758819 4 59 20,525 0,620064 4 61 20,775 0,552051 4
2.6.4 Evaluarea dozei eficiente minime de eribulină în modelul de hNSCLC NCI-H2110 în şoareci CB17-SCID
Celule de NSCLC uman, H2110, pasajul 46, au fost implantate subcutanat în 30 de şoareci CB17 SCID (de sex feminin, cu vârsta de 5 până la 6 săptămâni, cântărind 20 de grame). După 11 zile de la implantare, şoarecii au fost randomizaţi în cinci gru-puri. Cele cinci animale cu volumele tumorale care se abat cel mai mult de la medie au fost excluse. Volumul mediu al tumorii în fiecare grup în ziua tratamentului (Ziua 0) a variat între 87,6 - 89,4 mm3 (Tabelul 32). Şoarecii înrolaţi au fost trataţi cu eribulină (Lot # N1201193) la 0,05, 0,2, 0,8, sau 1,6 mg/kg, sau cu PBS, în conformitate cu conceptul studiului (Tabelul 30). Fiecare grup a fost terminat, respectiv, atunci când în cadrul grupului a fost observat pentru prima dată volumul tumorii > 2000 mm3. Studiul a fost încheiat în Ziua 38 (30 de zile după ultima doză).
Tabelul 30. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 PBS 0 2 5 0,05 3 Eribulină 0,2 q4dx3 i.v. 4 4* 0,8 5 5 1,6
Volumele tumorale la şoarecii individuali sunt arătate în Tabelul 31, iar media grupului şi SEM sunt arătate în Tabelul 32. Cinetica creşterii tumorii pentru fiecare grup (media grupului şi SEM) este arătată în Figura 14, iar volumele tumorale în şoarecii individuali, precum şi media grupului şi SEM în ziua 24 (atunci când la şoareci trataţi cu PBS au fost observate volume tumorale > 2000mm3), sunt arătate în Figura 15. Eribu-lina a cauzat TGI de 50,5% (fără regresie tumorală observată) la 0,05 mg/kg (p = 0,0026 vs. soluţie salină); TGI de ~ 99% la 0,2, 0,8, sau 1,6 mg/kg (valorile p au fost < 0,0001 pentru toate cele 3 grupuri atunci când se compară cu soluţia salină). Doza eficientă minimă care a indus regresia tumorii este de 0,2 mg/kg. Cu toate acestea, majoritatea tumorilor regresate în aceşti şoareci (3/5 în grupul 0,2 mg/kg, 4/5 în grupul 0,8 mg/kg, şi 2/5 în grupul 1,6 mg/kg) au crescut din nou sau au rămas măsurabile pe toată durata studiului (30 de zile după ultima doză).
Greutatea corporală a şoarecilor individuali este arătată în Tabelul 33, iar media grupului şi SEM sunt arătate în Tabelul 34. Cinetica schimbării greutăţii corporale pentru fiecare grup (media grupului şi SEM) sunt arătate în Figura 16.
Nu au fost observate pierderi semnificative de greutate corporală în niciunul dintre grupurile de tratament în comparaţie cu grupul de control tratat cu soluţie salină. Nu au fost observate constatări clinice care să indice toxicitate în timpul tratamentului.
Eribulina, la 0,2 mg/kg şi mai mult, administrată q4dX3 i.v., a arătat un efect semnificativ asupra creşterii tumorii H2110. a fost obţinută regresia tumorală. Atunci când a fost administrată o doză mai mică (la 0,05 mg/kg), nu a fost obţinută nicio re-gresie tumorală. Prin urmare, doza eficientă minimă testată în acest studiu este de 0,2 mg/kg.
Tabelul 31
zile după prima doză vehicul eribulină 0,05 mg/kg eribulină 0,2mg/kg eribulină 0,8 mg/kg eribulină 1,6 mg/kg 0 59 91 118 88 91 105 101 94 61 77 103 68 78 130 62 111 104 81 93 54 70 116 74 91 91 3 62 179 219 236 173 175 149 117 161 64 68 62 52 79 61 54 55 40 51 33 50 44 44 44 47 5 80 255 436 283 257 231 157 228 261 132 60 60 48 90 51 32 29 34 42 25 25 22 32 24 24 7 111 433 440 472 446 357 171 269 247 102 48 47 39 49 47 26 34 17 21 24 19 12 31 15 11 10 230 555 747 622 489 370 200 413 376 226 33 39 28 36 47 17 22 19 5 21 15 0 29 14 0 12 263 677 722 877 620 539 265 448 350 135 19 41 23 13 14 15 23 16 12 24 13 0 14 0 0 17 720 959 960 1158 885 725 514 751 620 531 0 0 0 0 13 17 38 0 0 26 0 0 0 0 0 19 862 1314 940 1097 941 869 437 908 776 837 27 39 29 29 16 0 20 18 0 27 0 0 19 0 0 24 1886 2308 1854 2760 1671 712 718 1489 1225 1040 0 15 19 23 11 14 0 20 0 33 18 0 19 0 0 26 0 24 0 11 14 0 8 14 14 15 8 0 17 0 0 28 0 7 0 14 83 0 16 20 14 17 0 0 16 0 0 31 0 16 0 10 31 0 10 15 26 29 11 0 17 0 0 33 0 27 0 13 22 0 13 8 18 44 8 0 28 0 0 35 0 19 0 16 42 0 13 0 22 50 14 0 17 0 0 38 0 19 0 14 45 0 11 13 13 54 11 0 20 0 0
Tabelul 32
PBS eribulină 0,05mg/kg eribulină 0,2mg/kg eribulină 0,8mg/kg eribulină 1,6mg/kg zile după prima doză MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N 0 89,4 9,34 5 87,6 8,18 5 88,2 12,56 5 88,6 10,02 5 88,4 8,11 5 3 173,8 30,31 5 133,2 19,74 5 64,4 4,45 5 46,6 4,31 5 45,8 1,20 5 5 262,2 56,43 5 201,8 24,37 5 61,8 7,43 5 32,4 2,83 5 25,4 1,72 5 7 380,4 67,55 5 229,2 43,40 5 46 1,79 5 24,4 2,83 5 17,6 3,62 5 10 528,6 85,83 5 317 43,21 5 36,6 3,17 5 16,8 3,07 5 11,6 5,42 5 12 631,8 101,42 5 347,4 70,14 5 22 5,07 5 18 2,34 5 5,4 3,30 5 17 936,4 70,46 5 628,2 48,40 5 2,6 2,60 5 16,2 7,39 5 0 0,00 5 19 1030,8 80,29 5 765,4 84,75 5 28 3,65 5 13 5,50 5 3,8 3,79 5 24 2095,8 195,76 5 1036,8 149,24 5 13,6 3,94 5 13,4 6,26 5 7,4 4,53 5 26 9,8 4,54 5 10,2 2,83 5 5 3,37 5 28 20,8 15,74 5 13,4 3,48 5 3,2 3,19 5 31 11,4 5,77 5 16 5,29 5 5,6 3,55 5 33 12,4 5,53 5 16,6 7,45 5 7,2 5,42 5 35 15,4 7,72 5 17 9,22 5 6,2 3,82 5 38 15,6 8,25 5 18,2 9,25 5 6,2 4,05 5
Tabelul 33
zile după prima doză vehicul eribulină 0,05 mg/kg eribulină 0,2mg/kg eribulină 0,8 mg/kg eribulină 1,6 mg/kg 0 18,5 16,7 19,1 20,4 19,6 19,1 16,4 18,6 20,1 17,9 18,2 18,5 16,7 19,8 18,9 18,6 17,8 18,4 17,8 18,1 18,2 18,3 19,4 16,3 19,0 3 18,8 16,6 19,6 20,9 20,0 19,4 17,1 18,5 20,4 18,7 18,6 18,5 16,9 19,6 19,8 18,8 18,0 18,4 18,1 19,0 17,8 18,3 20,1 15,8 19,6 5 18,8 16,8 19,3 21,2 20,0 19,4 16,5 18,4 20,4 19,4 18,5 19,1 16,9 20,2 20,1 18,9 18,1 18,5 17,6 18,2 18,1 18,1 19,5 16,0 19,3 7 18,6 16,5 19,3 21,2 19,8 19,4 16,3 18,7 20,3 19,1 18,5 18,5 17,1 19,6 20,7 19,1 18,1 19,0 17,8 19,0 18,1 18,2 19,5 16,3 19,4 8 18,3 16,7 18,8 21,1 19,6 19,3 16,3 18,4 20,4 19,4 18,6 19,1 17,0 19,6 19,9 19,2 18,0 19,0 17,7 18,8 18,0 18,3 20,1 16,2 19,4 9 18,4 16,4 18,5 21,0 19,5 18,8 16,1 18,6 19,9 19,1 18,3 20,0 16,8 19,5 19,5 19,2 17,7 18,5 17,5 18,5 17,4 18,0 19,6 15,8 19,4 10 19,0 17,2 19,2 21,6 20,3 19,7 16,3 19,4 20,5 20,0 18,7 19,4 17,1 20,0 20,1 19,0 17,7 18,9 17,8 19,1 18,1 18,5 21,0 16,1 20,0 12 19,0 15,9 18,5 21,3 19,2 18,8 15,9 18,6 19,6 19,7 18,3 19,3 16,9 19,7 19,9 18,9 17,8 19,0 17,8 19,0 18,0 18,8 20,5 16,3 20,1 17 18,8 15,5 17,8 20,4 18,3 17,5 16,0 18,5 18,0 19,7 19,0 19,3 17,4 20,5 20,0 19,2 18,0 18,8 18,1 19,1 19,0 19,2 21,0 16,4 19,4 19 18,9 15,6 17,2 20,6 18,1 17,8 16,3 18,4 18,0 19,4 19,1 19,0 17,1 21,1 21,0 19,1 17,7 19,4 18,7 19,1 19,1 19,5 21,1 16,3 19,8 24 18,2 15,8 17,4 20,3 18,2 18,8 16,5 18,8 17,4 18,0 19,3 20,2 18,8 21,7 22,0 20,1 18,5 20,3 19,1 20,3 19,4 20,6 21,7 18,1 20,7 26 19,8 20,9 18,6 22,0 20,4 20,3 18,1 19,9 19,3 20,9 19,5 20,7 21,6 18,3 20,6 28 20,1 20,6 18,1 21,5 21,0 20,3 17,8 20,2 19,6 20,6 19,6 20,3 21,2 17,6 21,1 31 18,7 20,1 18,7 22,0 21,2 20,1 18,2 20,3 19,5 20,7 19,8 20,4 21,9 18,1 21,9 33 20,0 20,3 18,4 22,2 21,8 20,2 18,3 21,0 19,2 20,2 20,1 19,9 21,7 17,9 20,7 35 19,5 20,1 18,7 22,1 21,4 20,1 17,8 21,0 19,3 20,3 20,3 18,2 21,8 18,2 20,9 38 19,8 20,8 18,3 21,6 21,6 20,4 18,1 21,4 19,4 21,2 20,0 21,0 21,9 18,4 20,3
Fiecare coloană reprezintă un animal individual.
Tabelul 34
PBS eribulină 0,05 mg/kg eribulină 0,2 mg/kg eribulină 0,8 mg/kg eribulină 1,6 mg/kg zile după prima doză MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N MEDIA SEM N 0 18,9 0,62 5 18,4 0,62 5 18,4 0,51 5 18,1 0,16 5 18,2 0,53 5 3 19,2 0,73 5 18,8 0,54 5 18,7 0,51 5 18,5 0,19 5 18,3 0,75 5 5 19,2 0,73 5 18,8 0,66 5 19,0 0,60 5 18,3 0,22 5 18,2 0,62 5 7 19,1 0,77 5 18,8 0,67 5 18,9 0,60 5 18,6 0,27 5 18,3 0,58 5 10 18,9 0,72 5 18,8 0,69 5 18,8 0,51 5 18,5 0,29 5 18,4 0,67 5 12 18,8 0,76 5 18,5 0,65 5 18,8 0,59 5 18,3 0,30 5 18,0 0,69 5 17 19,5 0,73 5 19,2 0,74 5 19,1 0,55 5 18,5 0,32 5 18,7 0,84 5 19 18,8 0,86 5 18,5 0,68 5 18,8 0,56 5 18,5 0,28 5 18,7 0,77 5 24 18,2 0,79 5 17,9 0,60 5 19,3 0,53 5 18,6 0,24 5 19,0 0,73 5 26 19,5 0,74 5 18,8 0,30 5 19,2 0,79 5 28 20,4 0,63 5 19,7 0,36 5 20,1 0,62 5 31 20,3 0,56 5 19,7 0,48 5 20,1 0,57 5 33 20,3 0,59 5 19,7 0,50 5 20,0 0,66 5 35 20,1 0,66 5 19,8 0,43 5 20,4 0,71 5 38 20,5 0,68 5 19,8 0,47 5 20,1 0,62 5
EXEMPLUL 2
1. Materiale şi metode
MORAb003-VCP-eribulină (MORAb-202) a fost sintetizat prin conjugarea MORAb-003 (anti-receptorul alfa al folatului uman umanizat) la compusul MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569) descris în secţiunea 1.1 din Exemplul 3. Metoda de conjugare este descrisă în secţiunea 1.4.1 din Exemplul 4.
1.1 Modele tumorale
Liniile de celule tumorale umane utilizate în evaluarea suplimentară in vitro a MORAb-202 includ IGROV1 (carcinom ovarian uman, FRhi (+++)), OVCAR3 (carcinom ovarian uman, FRmed(++)), NCI-H2110 (carcinom pulmonar cu celue non-mici uman, FRmed(++)), A431-A3 (linia celulară parentală A431 transfectată stabil cu mezotelină umană, FRlo(+/-)), SJSA-1 (osteosarcom uman, FRneg(-)), şi HL-60 (leucemie umană, FRneg(-)).Toate aceste linii celulare au fost obţinute direct de la American Type Culture Collection (ATCC). Pentru studiile in vivo au fost stabilite modele de şoareci cu xeno-grefă derivată de la pacienţi cu cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer de sân triplu negativ, şi cancer endometrial, şi au fost menţinute la Oncotest GmbH (Freiburg, Germania), Oncodesign (Dijon, Franţa), şi EPO Berlin-Buch GmbH (Berlin, Germania), respectiv.
1.2 Analize de citotoxicitate in vitro
1.2.1 Analiza cu violet de genţiană
Celule IGROV1 (FRhi(+++)), A431-A3 (FRlo(+/-)), şi SJSA-1 (FRneg(-)) au fost sub-cultivate şi însămânţate la 10.000 de celule/godeu în mediu de creştere complet în plăci de cultură de ţesut cu 96 de godeuri, incubate la 37°C, CO2 5% pe parcursul nopţii (16 ore). De obicei, reactivii de test au fost diluaţi în serie 1:4 în plăci de diluţie cu godeuri adânci de 2 mL, începând de la 1 µM (10 diluţii în total). La plăcile de celule s-au adă-ugat 100 µL de probe diluate (concentraţia iniţială a probelor de test la 100 nM). Plăcile au fost incubate la 37°C, CO2 5% o perioadă suplimentară de 48 de ore. Mediul a fost aruncat, plăcile au fost spălate o dată cu 200 µL de DPBS, colorate cu 50 µL de soluţie de violet de genţiană 0,2% la temperatura camerei timp de 15 min, şi apoi spălate intens cu apă de la robinet. Plăcile au fost uscate la aer, şi violet de genţiană a fost dizolvat cu 200 µL de soluţie SDS 1%. Plăcile au fost citite la 570 nm. Datele au fost analizate fo-losind GraphPad Prism 6. Pentru OVCAR3 (FRmed(++))şi NCI-H2110 (FRmed(++)), celulele au fost însămânţate la 3.000 de celule/godeu şi incubate timp de 5 zile cu MORAb-202.
1.3 Studii in vivo
1.3.1 Modelul de xenogrefă NCI-H2110
Pregătirea animalelor: Şoareci CB17 SCID (de sex feminin, în vârstă de 6 săp-tămâni) au fost adăpostiţi într-un număr de 5 şoareci per cuşcă ventilată. Pentru animale au fost disponibile, ad lib, peleţi de alimente sterilizaţi şi sticle de apă. Animalele au fost aclimatizate timp de 5 - 7 zile înainte de implantarea tumorii.
Cultura de celule: Celule NCI-H2110 umane au fost decongelate din stoc con-gelat (NB2813-65) şi cultivate în mediu RPMI-1640 suplimentat cu ser fetal bovin 10% (FBS) în CO2 5% la 37°C. După două pasaje, la atingerea confluenţei la aproximativ 70%, celulele au fost recoltate folosind soluţie de disociere a celulelor, spălate de două ori cu mediu fără ser, şi numărate.
Implantarea tumorii: Suspensia de celule în mediu fără ser a fost amestecată cu matrigel rece ca gheaţa la 1:1 (v:v) la o concentraţie finală de 1,0 x 108 celule/mL. Fie-care şoarece a fost injectat subcutanat cu 100 µL de amestec la 1,0 x 107 celule/şoa-rece. Pentru toate injecţiile a fost folosit un ac de 27G. Şoarecii au fost monitorizaţi pentru bunăstarea clinică şi tumorile au fost măsurate cu şubler digital de trei ori pe săptămână, începând din Ziua 3 după implantare. Volumul tumorii (mm3) a fost calculat utilizând formula: W (mm) × L (mm) × D (mm) × π/6. Atunci când tumorile au atins ~100 mm3 (cu o medie de > 70 până la ~130 mm3), animalele au fost randomizate la 4 - 5 per grup. Au fost excluse cele 5 animale cu volumele tumorale care se abat cel mai mult de la medie.
Conceptul studiului: Şoarecii experimentali înrolaţi au fost injectaţi intravenos cu 200 µL de vehicul sau MORAb-202 la 1,0, 2,5, şi 5 mg/kg, în conformitate cu conceptul studiului (Tabelul 35), în ziua randomizării. Greutatea corporală a fost măsurată înainte de doză, şi de două ori pe săptămână pe parcursul studiului. La sfârşitul studiului, gre-utatea corporală terminală a fost măsurată şi înregistrată. Animalele au fost eutanasiate atunci când volumul individual al tumorii a depăşit 2000 mm3. Criteriile de terminare timpurie înainte de atingere a volumului tumoral maxim permis au inclus: (1) ulceraţii tumorale mai mari de 50% din tumoră (v:v); (2) paralizie; (3) pierdere în greutate cor-porală > 20%; şi (4) 50% dintre animalele din cadrul grupului au îndeplinit terminarea. Orice şoarece eutanasiat sau găsit mort pe parcursul studiului a fost procesat urmând procedura terminală descrisă mai sus.
Tabelul 35. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 5 Vehicul 0 bolus unic i.v. 2 MORAb-202 1 3 2,5 4 5
1.3.2 Modele de xenogrefe derivate de la pacient (PDx)
1.3.2.1 Modelul de PDx de cancer pulmonar cu celule non-mici (NSCLC): LXFA-737 (Oncotest)
Implantarea tumorii: Fragmente tumorale de NSCLC au fost obţinute de la xe-nogrefele tumorale LXFA-737 cu pasaje în serie în şoareci nud. După îndepărtarea de la şoareci donori, tumorile au fost tăiate în fragmente (lungimea marginii de 3 - 4 mm) şi plasate în soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) conţinând 10% penicilină/strepto-micină. Animalele primitoare au fost anesteziate prin inhalare de izofluran şi au primit implanturi tumorale unilaterale sau bilaterale subcutanat în flanc. Xenogrefele tumorale au fost implantate cu una sau două tumori per şoarece cu o raţă de achiziţie < 65%. În cazul unei achiziţii bilaterale, una dintre aceste tumori a fost explantată înainte de ran-domizare. Animalele şi implanturile tumorale au fost monitorizate zilnic până când creşterea tumorii solide a fost detectabilă la un număr suficient de animale. La rando-mizare a fost determinat volumul tumorilor în creştere. Animale care îndeplinesc criteriile de randomizare (adică purtătoare de tumori de 50 - 250 mm3, preferabil 80 - 200 mm3) au fost distribuite în grupuri experimentale formate din 5 - 6 animale per grup, având ca scop volume tumorale de grup mediane şi medii comparabile, de aproximativ 100 - 120 mm3. Animalele care nu au fost utilizate pentru experimente au fost eutanasiate. Ziua randomizării a fost desemnată ca Ziua 0 a experimentului.
Conceptul studiului: Şoarecii experimentali înrolaţi au fost injectaţi intravenos cu vehicul, MORAb-003 la 5 mg/kg, sau MORAb-202 la 5 mg/kg, în conformitate cu con-ceptul studiului (Tabelul 36), în ziua randomizării. Greutatea corporală a fost măsurată înainte de doză în fiecare zi de dozare, şi de două ori pe săptămână pe parcursul stu-diului. La sfârşitul studiului, greutatea corporală terminală a fost măsurată şi înregistrată. Animalele au fost eutanasiate atunci când volumul individual al tumorii a depăşit 2000 mm3.
Tabelul 36. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 6 Vehicul 0 bolus unic i.v. 2 6 MORAb-003 5 3 6 MORAb-202 5
1.3.2.2 Modelul de PDx de cancer de sân triplu negativ (TNBC): OD-BRE-0631 (Oncodesign)
Implantarea tumorii: Nouă şoareci SWISS nud de sex feminin au fost injectaţi subcutanat în flancul drept cu fragmente tumorale de TNBC derivate de la pacient. Şoarecii purtători de tumori au fost eutanasiaţi atunci când volumul tumorii a atins 500 - 1000 mm3, iar tumorile au fost excizate chirurgical. Fragmente tumorale (30 - 50 mg) au fost implantate ortotopic în regiunea pernei de grăsime mamară a 34 de şoareci SWISS nud de sex feminin după 24 până la 72 de ore de la o iradiere a întregului corp cu o sursă gamma (2 Gy, 60Co, BioMEP, Franţa). Atunci când tumorile au atins un volum mediu de 200 - 300 mm3, 24 dintre cele 34 de animale totale au fost randomizate în două grupuri (n = 12 animale) în conformitate cu volumul individual al tumorii lor utili-zând software-ul Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Franţa). Pentru a evalua omogenitatea între grupuri a fost efectuat un test statistic (analiza varianţei). Ziua ran-domizării a fost desemnată ca Ziua 0 a experimentului.
Conceptul studiului: În Ziua 1 (o zi după randomizare şi două zile înainte de tratament), 3 şoareci din fiecare dintre cele două grupuri netratate au fost terminaţi. Şoarecii experimentali rămaşi au fost injectaţi intravenos cu vehicul sau MORAb-202 la 5 mg/kg, în conformitate cu conceptul studiului (Tabelul 37), în Ziua 3. În Ziua 8 (cinci zile după tratament), 3 şoareci din fiecare dintre cele două grupuri de tratate au fost terminaţi. Imediat după terminare, ţesutul tumoral a fost colectat şi fixat în 4% formalină tamponată neutră timp de 24 până la 48 de ore, şi apoi încorporat în parafină (Histosec®, Merck, Darmstadt, Germania). Proba încorporată în parafină a fost depo-zitată la temperatura camerei pentru analiza imunohistochimică ulterioară.
Tabelul 37. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută 1 3 n/a n/a n/a n/a 9 Vehicul 0 bolus unic i.v. 2 3 n/a n/a n/a n/a 9 MORAb-202 5 bolus unic i.v.
Analiza imunohistochimică (IHC): Colorarea IHC a ţesuturilor tumorale încor-porate în parafină, fixate în formalină, a fost efectuată pentru a evalua atât ocuparea MORAb-202, cât şi exprimarea fibroblastelor asociate cancerului. Înainte de colorare, lamelele au fost deparafinate şi antigenul a fost recuperat într-un Lab Vision™ PT Module (Thermo Scientific), în tampon citrat (pH 6,0) pre-încălzit la 85°C, utilizând ur-mătorul program: încălzire la 97°C; incubare la 97°C timp de 30 min; şi răcire la 60°C. Lamelele au fost apoi transferate în apă dublu distilată la temperatura camerei timp de 5 min. Colorarea a fost efectuată într-un Lab Vision™ Autostainer 360 (Thermo Scientific). Pe scurt, lamelele au fost spălate de două ori în soluţie salină tamponată cu Tris 1X/Tween-20 (TBST) timp de 6 min/spălare. Secţiunile de ţesut au fost apoi incubate în tampon de blocare (300 µL) (ser de capră 10% (Jackson Immunoresearch Laboratory Inc., nr. cat. 005-000-121) diluat în 3% albumină serică bovină (BSA) - soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS)) timp de 1 oră, incubate în anticorp conjugat (200 µL) (Ta-belul 38) timp de 1 oră, şi spălat de cinci ori în TBST 1X timp de 6 min/spălare. Lamelele au fost colorate cu o culoare contrastantă cu DAPI în medii de montare, iar lamelele acoperite cu lamele au fost lăsate să se întărească timp de 30 de min. Lamelele au fost procesate pe un scaner Panoramic MIDI (3DHISTECH), iar imaginile IHC au fost ana-lizate folosind software-ul Halo (Indica Labs). Anticorpii utilizaţi în această analiză au ţintit α-actina muşchiului neted (SMA), care este un marker specific pentru fibroblastele asociate cancerului, şi IgG umană, care poate detecta prezenţa MORAb-202.
Tabelul 38. Anticorpi IHC
Anticorp Conjugat Vânzător Nr. cat. Lot Soluţie stoc Soluţie de lucru α-actina muşchiului neted (SMA)-FITC FITC Sigma F3777 124M4775V 2,0 mg/mL 5,0 µg/mL IgG1 de şoarece, controlul izotipului κ AF488 Biolegend 400129 B 128493 0,2 mg/mL 1:1000 anti-IgG umană de capră AF555 Mol. Probes A21433 1709318 n/a 1:200
1.3.2.3 Modele de PDx de cancer endometrial: Endo-12961 şi Endo-10590 (EPO Berlin)
Implantarea tumorii: Fragmente de tumoră de cancer endometrial au fost obţi-nute din xenogrefe tumorale Endo-12961 şi Endo-10590 cu pasaje în serie, şi depozi-tate ca stoc în azot fluid. Fragmentele tumorale au fost implantate subcutanat în flancul stâng al 40 de şoareci de sex feminin NMRI nu/nu, şi a fost monitorizat volumul tumorii. Şoareci cu un volum al tumorii de 100 - 160 mm3 au fost randomizaţi în unul dintre cele patru grupuri (Grupurile A - D, Tabelul 39). Şoarecii satelit pentru randomizare au fost incluşi într-un al cincilea grup (Grupul E, Tabelul 39). Fiecare grup a fost alcătuit din 8 animale. Ziua randomizării a fost desemnată ca Ziua 0 a experimentului.
Conceptul studiului: Şoarecii experimentali înrolaţi au fost injectaţi intravenos cu PBS, eribulină la 3,2 mg/kg sau 0,1 mg/kg, sau MORAb-202 la 5 mg/kg, în conformitate cu conceptul studiului (Tabelul 39), în ziua randomizării. Creşterea tumorii a fost eva-luată prin măsurarea a două diametre perpendiculare de două ori pe săptămână, şi au fost calculate valorile volumului tumorii (TV), volumului relativ al tumorii (RTV) şi tratat/control (T/C). Greutatea corporală a fost evaluată, de asemenea, de două ori pe săptămână ca un parametru pentru toxicitate, cu calcularea greutăţii corporale per grup şi a modificărilor greutăţii corporale (BWC) faţă de începutul tratamentului. Animalele au fost sacrificate atunci când volumul tumorii individuale a depăşit 1 cm3, sau la sfârşitul studiului.
Tabelul 39. Conceptul studiului
Grup # Şoareci Tratament Doză (mg/kg) Regim Rută A 8 PBS 0 bolus unic i.v. B Eribulină 3,2 C Eribulină 0,1 D MORAb-202 5 E n/a n/a n/a n/a
1.4 Mecanism de acţiune
1.4.1 Sistem de co-cultură tridimensional (3D) în zPredicta
Toate experimentele de co-cultură 3D care conţin celule stem mezenchimale (MSC) au fost efectuate în zPredicta, utilizând sisteme de matrice extracelulară 3D specifică organului, cum ar fi rStomach™. Celulele stem mezenchimale ale măduvei osoase (BM-MSC-uri) în rStomach™ au fost co-cultivate cu linia de celule de cancer gastric Nuc Red Light MKN-74 în cvadruplicat în format de 48 de godeuri timp de 12 zile. S-a demonstrat anterior că celulele MKN-74 exprimă suficient receptorul alfa al folatului (FR) pentru tratamentul MORAb-202 pentru a induce apoptoza celulară. Înainte de cultură, BM-MSC-urile au fost evaluate pentru exprimarea antigenului ţintă şi pentru markerii diferenţierii MSC (Tabelul 40) prin citometrie în flux.
Tabelul 40. Markerii diferenţierii MSC
Populaţia de celule Markeri Celule stem mezenchimale (MSC-uri) Stro-1+/CD105+ Pre-adipocite CD34+/CD31- Adipocite Oil red Fibroblaste asociate cancerului (CAF-uri) alfa-actina muşchiului neted (αSMA), vimentină Pre-pericite/pericite NG2+, CD13+, CD146+ Toate FRA
Culturile rStomach™ au fost tratate fie cu MORAb-202, anticorp MORAb-003 neconjugat, eribulină, fie cu control, aşa cum este descris în Tabelul 41. Controalele au inclus culturi netratate şi tratate cu vehicul (PBS şi DMSO). Diferenţierea MSC a fost monitorizată prin microscopie cu lumină. Odată ce s-a observat diferenţierea vizibilă, probele au fost recoltate pentru colorare şi analiză de citometrie în flux.
Tabelul 41. Tratamente de co-cultură
Agent Concentraţie (concentraţii) de lucru MORAb-202 10 nM MORAb-003 (anticorp neconjugat) 10 nM Eribulină 1,7 nM şi 0,2 nM PBS DMSO 0,1% Control netratat
1.4.2 Analiza cursului în timp a efectului MORAb-202 asupra fibroblastelor asociate cancerului
Şoareci purtători de tumori de xenogrefă H2110 subcutanată au fost preparaţi aşa cum este descris în secţiunea 1.3.1. Probele tumorale au fost recoltate în Zilele 0, 3, 5, 7, şi 9 după administrarea vehiculului sau a MORAb-202 la 5 mg/kg. Probele tumo-rale colectate au fost prelucrate pe lamele, iar exprimarea fibroblastelor asociate can-cerului a fost analizată prin IHC aşa cum este descris în secţiunea 1.3.2.2.
2. Rezultate
2.1 Analize de citoxicitate in vitro
2.1.1 Citotoxicitatea MORAb-202
Potenţa in vitro a MORAb-202 a fost evaluată folosind o analiză cu violet de genţiană, aşa cum este detaliat în secţiunea 1.2.1. Screening-ul a fost efectuat pe celule IGROV1 (FRhi(+++)), OVCAR3 (FRmed(++)), NCI-H2110 (FRmed(++)), A431-A3 (FRlo(+/-)), şi SJSA-1 (FRneg(-)). Rezultatele acestui screening sunt furnizate în Figura 17 şi Tabelul 42.
Tabelul 42. Screening-ul de citotoxicitate (CE50) al MORAb-202
pe diferite linii de celule tumorale
EC50 (nM) IGROV I OVCAR3 NCI-H2110 A431-A3 SJSA-1 (FR+++) (FR++) (FR++) (FR+/-) (FR-) 0,01 0,16 0,74 23 > 100
MORAb-202 a prezentat citotoxicitate dependentă de exprimarea receptorului alfa al folatului împotriva liniilor celulare tumorale, şi niveluri scăzute de ucidere departe de ţintă. MORAb-202 a demonstrat cel mai înalt nivel de potenţă (0,01 nM) pe celule IGROV1, cu citotoxicitate redusă (> 100 nM) pe celulele SJSA-1 negative la receptorul alfa al folatului. Potenţa intermediară a fost observată în celulele OVCAR3 şi NCI-H2110 (0,16 nM şi 0,74 nM).
2.2 Studii in vivo
2.2.1 Eficacitatea MORAb-202 în modelul de xenogrefă NC1-H2110
Şoareci purtători de tumori H2110 subcutanate au fost injectaţi intravenos cu vehicul sau MORAb-202 la 1, 2,5, şi 5 mg/kg. Regresia semnificativă a tumorii a fost observată după o doză unică de MORAb-202 la 5 mg/kg (Figura 18 şi Tabelul 43). Fo-losind acest model de xenogrefă cu exprimare ridicată a receptorului alfa al folatului şi administrări de doză unică, fereastra terapeutică pentru MORAb-202 s-a dovedit a fi 1 mg/kg pentru întârzierea creşterii tumorii (cu boală stabilă) şi ≥ 2,5 mg/kg pentru regresia tumorii. În acest studiu, MORAb-202 la o doză de 2,5 mg/kg a avut ca rezultat un răspuns parţial, iar MORAb-202 la o doză de 5 mg/kg a avut ca rezultat un răspuns complet.
Tabelul 43. Activitatea antitumorală a MORAb-202 în modelul
de xenogrefă NC1-H2110
Volumul tumorii, mm3 (Inhibarea creşterii tumorii, %) Ziua 17 Ziua 31 Vehicul (n = 5) 1583,4 ± 146,1 (100) n/a MORAb-202, 1 mg/kg, doză unică (n = 5) 840,0 ± 76,8 (53,1) n/a MORAb-202, 2,5 mg/kg, doză unică (n = 5) 60,8 ± 27,1 (3,8) 1173,2 ± 373,2 MORAb-202, 5 mg/kg, doză unică (n = 4) 0,0 (0,0) 0 (0,0)
2.2.2 Eficacitatea MORAb-202 în modelul de PDx de NSCLC: LXFA-737
Şoareci purtători de tumori de PDx de NSCLC subcutanate au fost injectaţi intravenos cu vehicul, MORAb-003 la 5 mg/kg, sau MORAb-202 la 5 mg/kg. O singură doză de MORAb-202 (5 mg/kg) a avut ca rezultat regresia semnificativă a tumorii în acest model, spre deosebire de o singură doză de anticorp MORAb-003 neconjugat (5 mg/kg), care nu a demonstrat activitate anti-tumorală semnificativă (Figura 19A). Cinci dintre cei şase şoareci în total trataţi cu MORAb-202 au fost consideraţi fără tumori în Ziua 32 a studiului (Tabelul 44), şi patru au rămas fără tumori până în Ziua 74 (termi-narea studiului). În plus, nu a fost observată nicio pierdere de greutate corporală sem-nificativă în grupul de tratament în comparaţie cu grupul de control tratat cu vehicul, indicând nicio toxicitate pe parcursul tratamentului (Figura 19B).
Tabelul 44. Activitatea antitumorală a MORAb-202
în modelul de PDx de NSxLC
Volumul tumorii, mm3 (Inhibarea creşterii tumorii, %) Ziua 21 Ziua 32 Ziua 74 Vehicul (n = 6) 1004,5 (100) 1561,3 (100) n/a MORAb-003, 5 mg/kg, doză unică (n = 6) 860,7 (85,7) 1572,1 (100,7) n/a MORAb-202, 5 mg/kg, doză unică (n = 6) 22,9(2,3) 4,7 (0,3) 418,3 (4/6 fără tumori)
2.2.3 Eficacitatea relativă a MORAb-202 şi eribulinei în modelele de PDx de cancer endometrial: Endo-12961 şi Endo-10590
Xenogrefele de Endo-12961 şi Endo-10590 exprimă niveluri ridicate ale recep-torului alfa al folatului. Şoareci purtători de tumori de PDx de cancer endometrial sub-cutanate au fost injectaţi intravenos cu PBS, eribulină la 3,2 mg/kg sau 0,1 mg/kg, sau MORAb-202 la 5 mg/kg. Doza maximă tolerată (MTD) de eribulină în acest model este de 3,2 mg/kg, în timp ce 0,1 mg/kg este echivalent cu doza de eribulină furnizată de MORAb-202 administrat la 5 mg/kg. În tot începutul studiului s-a observat activitate antitumorală semnificativă în urma tratamentului cu MORAb-202 (5 mg/kg) şi doza MTD de eribulină (3,2 mg/kg) în ambele modele animale, în timp ce nu a fost observată nicio activitate anti-tumorală semnificativă în urma tratamentului cu eribulină la 0,1 mg/kg (Figurile 20A şi 20C). Cu toate acestea, tumorile regresate la şoareci trataţi cu eribulină la 3,2 mg/kg au început să crească din nou pe parcursul duratei studiului, în timp ce nu s-a remarcat nicio re-creştere semnificativă a tumorii la şoarecii trataţi cu MORAb-202. În acest studiu s-a constatat că MORAb-202 este semnificativ mai eficient decât eribu-lina. Tratamentul cu eribulină a afectat, de asemenea, temporar greutatea corporală în prima săptămână post-tratament (Figurile 20B şi 20D). În schimb, la animalele tratate cu MORAb-202 nu a fost observată nicio pierdere de greutate corporală.
2.3 Mecanismul de acţiune al MORAb-202
2.3.1 IHC şi eficacitatea MORAb-202 în modelul de PDx de TNBC: OD-BRE-0631
Şoareci purtători de tumori de PDx de TNBC subcutanate au fost injectaţi in-travenos cu vehicul sau MORAb-202 la 5 mg/kg. Ţesutul tumoral a fost colectat de la şoareci din fiecare grup înainte de tratament (Ziua 1) şi după tratament (Ziua 8). Ana-lizele IHC ale ţesuturilor tumorale colectate au arătat că MORAb-202 ocupă celule tu-morale care exprimă receptorul alfa al folatului după cinci zile de la tratament (Ziua 8), în urma administrării în Ziua 3 ca doză unică (5 mg/kg). Ocuparea celulei a fost evaluată folosind un anticorp anti-IgG umană (Figura 21A). De asemenea, s-a arătat că trata-mentul cu MORAb-202 diminuează structura fibroblastelor asociate cancerului, aşa cum se arată prin colorarea IHC cu un anticorp anti-α-actină a muşchiului neted (SMA)-FITC (Figura 21B). În ceea ce priveşte eficacitatea, tratamentul cu MORAb-202 a avut ca rezultat regresia tumorală maximă la 11 zile după tratament, măsurată printr-un volum tumoral relativ (RTV) de 0,62 (Figura 21C).
2.3.2 Efectul MORAb-202, MORAb-003, şi eribulinei asupra sistemului de co-cultură 3D
Celulele stem mezenchimale ale măduvei osoase (BM-MSCs) în rStomach™ (zPredicta) au fost co-cultivate cu linia de celule de cancer gastric MKN-74 timp de 12 zile. Înainte de cultură, BM-MSC-urile au fost evaluate pentru exprimarea receptorului alfa al folatului şi pentru markerii diferenţierii MSC prin citometrie în flux. Culturile rStomach™ au fost apoi tratate fie cu MORAb-202, anticorp MORAb-003 neconjugat, eribulină, fie cu control. Odată ce diferenţierea MSC vizibilă a fost observată prin mi-croscopie cu lumină, probele au fost recoltate pentru colorare şi analiză de citometrie în flux. Rezultatele acestor analize sunt arătate în Figura 22.
O durată totală a tratamentului de 7 zile, cu completarea tratamentului pe par-cursul acestei perioade, a fost suficientă pentru a produce un efect măsurabil asupra diferenţierii BM-MSC-urilor umane în cultură cu celule MKN-74. În raport cu controlul cu vehicul, tratamentul cu MORAb-202 (10 nM) a avut ca rezultat o creştere a MSC şi populaţiilor de adipocite, şi o scădere a populaţiilor de pericite (Tabelul 45). Aceste date indică faptul că MORAb-202 poate avea un efect semnificativ asupra micromediului tumoral.
Tabelul 45. Efectul MORAb-202, MORAb-003 şi eribulinei asupra
sistemului de co-cultură 3D
Procentul de celule vii Tratament MSC-uri Adipocite Pericite PBS 32,3% 0,72% 14,6% MORAb-202 43,7% 22,6% 11,4% MORAb-003 37,1% 0,69% 24,0% Eribulină 29,9% 2,68% 25,8%
2.3.3 Analiza cursului în timp a efectului MORAb-202 asupra fibroblastelor asociate cancerului
Probe tumorale au fost recoltate de la şoareci purtători de tumoră din xenogrefă H2110 subcutanată în Zilele 0, 3, 5, 7 şi 9 după administrarea vehiculului, sau a MORAb-202 la 5 mg/kg. Probele tumorale colectate au fost prelucrate pe lamele, iar exprimarea fibroblastelor asociate cancerului (CAF) a fost analizată prin IHC. Structura de reţea CAF, aşa cum a fost evaluată şi cuantificată prin colorare cu un anticorp anti-α-actină musculară netedă (SMA)-FITC, a fost proeminentă în Ziua 3 şi Ziua 5, după administrarea unei doze unice de MORAb-202 la 5 mg/kg (Figura 23). Cu toate acestea, până în Ziua 7, majoritatea acestei structuri a fost diminuată în mod semnificativ.
EXEMPLUL 3
1. Materiale şi metode
Compuşii de eribulină care pot fi conjugaţi, având structurile arătate în Tabelul 46, au fost sintetizaţi în conformitate cu următoarele proceduri, şi au fost utilizaţi în prepararea ADC-urilor (Exemplul 4).
Toţi solvenţii utilizaţi în reacţiile de sinteză au fost de grad anhidru (EMD Millipore). Toţi solvenţii utilizaţi pentru prelucrare sau purificare au fost de grad de cro-matografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC) (EMD Millipore). Cu excepţia cazului în care este indicat în alt fel, toate substanţele chimice au fost disponibile în comerţ. Cro-matografia pe coloană a fost efectuată folosind un Biotage® SP4. Eliminarea solventului a fost efectuată utilizând fie un evaporator rotativ (Büchi Labortechik AG), fie un eva-porator centrifugal (Genevac, SP scientific). Cromatografia lichidă preparativă-spectro-metria de masă (LC/MS) a fost efectuată utilizând Waters AutoPurification System şi o coloană C18 XTerra MS (5 µm, 19 mm x 100 mm) în condiţii de fază mobilă acidă. Spectrele de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) au fost prelevate folosind cloroform deuterat (CDCl3) cu excepţia cazului în care este declarat în alt fel, şi au fost înregistrate la 400 sau 500 MHz folosind un instrument Varian (Agilent Technologies). Spectrele de masă au fost prelevate folosind un Waters Acquity Ultra Performance LC/MS. Aşa cum este utilizat în acest document, termenul "inert" se referă la înlocuirea aerului dintr-un reactor (de exemplu, un vas de reacţie, un balon, un reactor din sticlă) cu un gaz inert, în esenţă lipsit de umiditate, cum ar fi azotul sau argonul. Multiplicităţile sunt indicate folosind următoarele abrevieri: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = cvartet, quint = cvintet, sxt = sextet, m = multiplet, dd = dublet de dublete, ddd = dublet de dublete de dublete, dt = dublet de triplete, br s = un singlet larg.
Tabelul 46. Compuşi de eribulină care pot fi conjugaţi
MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569) NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236940) NHS-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236941) Mal-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001235638) Mal-PEG8-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001242287) NHS-PEG9-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001242288) NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001243700) Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231679) Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulină (ER-001231690) NHS-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231691) Azidă-PEG3-disulfidă-PAB-eribulină (ER-001237508) Mal-PEG4-triazol-PEG3-disulfidă-PAB-eribulină (ER-001237504) NHS-PEG3-triazol-PEG3-disulfidă-PAB-eribulină (ER-001244129) Azidă-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001138856) Mal-PEG4-triazol-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001237505) NHS-PEG3-triazol-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001244623) Mal-PEG2-eribulină Mal-PEG4-eribulină Azido-PEG2-eribulină Azido-PEG4-eribulină Azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulină
1.1 Preparare de MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569)
În N,N-dimetilformamidă (DMF) (6,0 mL) s-a dizolvat eribulină (ER-000086526) (61,5 mg, 0,074 mmol) şi apoi s-a amestecat cu bază Hunig (0,027 mL, 0,156 mmol) şi Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP (86 mg, 0,112 mmol). Reacţia a fost agitată la temperatura camerei timp de 18 ore până când cuplarea a fost completă, aşa cum a fost determinat prin analiza cromatografiei lichide de înaltă performanţă (HPLC). La amestec a fost adăugată dietilamină (0,078 mL, 0,745 mmol), şi amestecul a fost agitat o perioadă suplimentară de 2 ore până când reacţia a fost completă. Solventul a fost îndepărtat prin evaporare, şi reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă pentru a obţine Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001228950) sub forma unui solid de culoare albă (60 mg, randament 71%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,06 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 5,01 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,57 (dd, J = 4,8, 8,8 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,32 - 4,27 (m, 2H), 4,18 (dd, J = 4,8, 6,4 Hz, 1H), 4,13 - 4,07 (m, 2H), 3,98 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,88 - 3,82 (m, 3H), 3,76 - 3,70 (m, 4H), 3,60 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 3,38 (s, 3H), 3,26 - 3,10 (m, 3H), 2,93 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,91 - 2,84 (m, 1H), 2,75 - 2,64 (m, 2H), 2,44 - 2,29 (m, 5H), 2,21 - 1,97 (m, 8H), 1,93 - 1,83 (m, 3H), 1,79 - 1,72 (m, 5H), 1,68 - 1,29 (m, 8H), 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,07 - 1,01 (m, 1H), 1,06 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,02 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1135,7.
În DMF (1 mL) s-a dizolvat Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001228950) (16 mg, 14 µmol). La această soluţie au fost apoi adăugate N,N-diizopropiletilamină (7,2 µL, 41 µmol) şi Mal-PEG2-NHS (9,7 mg, 27 µmol) la temperatura camerei, şi amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 1 oră. La finalizarea reacţiei, amestecul brut a fost purificat prin HPLC cu fază inversă utilizând o fază mobilă ace-tonitril-apă conţinând acid formic 0,1%. Fracţiile colectate au fost concentrate sub vid la temperatura camerei într-o baie de apă neîncălzită pentru a rezulta Mal-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569) (7,1 mg, 5,2 µmol, randament 38%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,59 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,81 (s, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,06 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,01 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 5,2, 9,2 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,32 - 4,27 (m, 2H), 4,19 (dd, J = 6,8, 11,6 Hz, 1H), 4,13 - 4,07 (m, 2H), 3,98 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,88 - 3,82 (m, 3H), 3,76 - 3,64 (m, 6H), 3,62 - 3,51 (m, 6H), 3,38 (s, 3H), 3,22 - 3,08 (m, 4H), 2,93 (dd, J = 2,4, 9,6 Hz, 1H), 2,92 - 2,84 (m, 1H), 2,76 - 2,63 (m, 2H), 2,52 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,44 - 2,29 (m, 5H), 2,21 - 1,97 (m, 8H), 1,93 - 1,83 (m, 3H), 1,80 - 1,66 (m, 5H), 1,66 - 1,28 (m, 10H), 1,11 (d, J = 6,4 Hz, 3H), 1,07 - 1,01 (m, 1H), 0,99 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,97 (d, J = 6,4 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1374,9.
1.2 Preparare de NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236940)
Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001228950) (45 mg, 0,04 mmol) şi 3,3'-(etan-1,2-diilbis(oxi))dipropanoat de bis(2,5-dioxopirolidin-1-il) (79 mg, 0,198 mmol) au fost amestecate în DMF (1,5 mL), şi apoi s-a adăugat Et3N (44,2 µl, 0,317 mmol). Amestecul a fost agitat timp de 18 ore până când reacţia a fost completă, aşa cum a fost deter-minat prin analiza HPLC. Solventul a fost evaporat şi reziduul a fost purificat prin cro-matografie rapidă pentru a obţine NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236940) sub forma unui solid de culoare albă (38 mg, randament 68%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,05 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 5,01 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 4,8, 8,8 Hz, 1H), 4,50 - 4,47 (m, 1H), 4,32 - 4,27 (m, 2H), 4,21 (dd, J = 4,8, 6,4 Hz, 1H), 4,14 - 4,08 (m, 2H), 3,99 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,88 - 3,82 (m, 3H), 3,78 - 3,70 (m, 4H), 3,62 (s, 2H), 3,62 - 3,58 (m, 1H), 3,50 - 3,46 (m, 2H), 3,39 (s, 4H), 3,36 (s, 3H), 3,22 - 3,08 (m, 3H), 2,93 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,91 - 2,87 (m, 1H), 2,84 (s, 2H), 2,80 (s, 2H), 2,75 - 2,64 (m, 2H), 2,59 - 2,52 (m, 2H), 2,44 - 2,29 (m, 5H), 2,21 - 1,97 (m, 10H), 1,93 - 1,83 (m, 3H), 1,79 - 1,72 (m, 5H), 1,68 - 1,29 (m, 8H), 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,08 - 0,98 (m, 1H), 1,00 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,98 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1421,0.
1.3 Preparare de NHS-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236941)
În tetrahidrofuran (THF) (100 mL) a fost dizolvat acid heptandioic (1,6 g, 9,99 mmol), şi s-a adăugat apoi 1-hidroxipirolidin-2,5-dionă (2,299 g, 19,98 mmol), după care a urmat adăugarea de DCC (4,12 g, 19,98 mmol). Amestecul a fost agitat la tempera-tura camerei timp de 18 ore până când analiza HPLC a indicat finalizarea reacţiei. So-lidul a fost îndepărtat prin filtrare printr-un strat de celite, şi a fost spălat cu THF (3 x 2 mL). Filtratul combinat a fost concentrat şi purificat prin cromatografie rapidă pentru a rezulta bis(2,5-dioxopirolidin-1-il) heptandioat (ER-001236140) sub forma unui solid de culoare albă (2,5 g, randament 71%). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 2,83 (s, 8H), 2,64 (t, J = 7,6 Hz, 4H), 1,80 (dt, J = 7,6 Hz, 4H), 1,59 - 1,51 (m, 2H), LCMS (M+H) = 355,2.
NHS-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236941) a fost preparat (8,5 mg, randament 47%) din VCP-eribulină (ER-001228950) şi bis(2,5-dioxopirolidin-1-il) hep-tandioat (ER-001236140) utilizând aceeaşi procedură ca aceea descrisă mai sus pentru prepararea de NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236940). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,30 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,04 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,00 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,70 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,60 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 4,8, 8,8 Hz, 1H), 4,46 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 4,36 - 4,25 (m, 2H), 4,17 (dd, J = 4,8, 6,4 Hz, 1H), 4,13 - 4,06 (m, 2H), 3,97 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,87 - 3,80 (m, 3H), 3,74 - 3,68 (m, 2H), 3,37 (s, 3H), 3,20 - 3,06 (m, 4H), 2,94 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,90 - 2,82 (m, 1H), 2,82 (s, 4H), 2,74 - 2,65 (m, 2H), 2,61 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 2,46 - 2,26 (m, 7H), 2,24 - 1,81 (m, 13H), 1,78 - 1,28 (m, 19H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,06 - 0,96 (m, 1H), 0,97 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,95 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1375,1.
1.4 Preparare de Mal-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001235638)
În DMF (1 mL) a fost dizolvată eribulină (ER-000086526) (10 mg, 0,012 mmol), şi s-a amestecat cu MC-Val-Cit-PAB-PNP (9,02 mg, 0,012 mmol) şi bază Hunig (4,44 µL, 0,025 mmol). Amestecul a fost apoi agitat la temperatura camerei timp de 12 ore până când analiza HPLC a indicat finalizarea reacţiei. Amestecul de reacţie a fost con-centrat şi purificat prin cromatografie rapidă pentru a rezulta Mal-(CH2)5-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001235638) sub forma unui solid de culoare albă (11,3 mg, randament 63%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,79 (s, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,05 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,00 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,56 - 4,46 (m, 3H), 4,35 - 4,27 (m, 2H), 4,20 - 4,07 (m, 4H), 3,98 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,87 - 3,83 (m, 3H), 3,73 - 3,70 (m, 2H), 3,48 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,20 - 3,08 (m, 4H), 2,93 (dd, J = 1,6, 9,6 Hz, 1H), 2,89 - 2,85 (m, 1H), 2,69 (dt, J = 11,2, 16,8 Hz, 2H), 2,44 - 2,33 (m, 5H), 2,27 - 1,83 (m, 13H), 1,78 - 1,68 (m, 5H), 1,66 - 1,27 (m, 14H), 1,11 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,07 - 0,98 (m, 1H), 0,98 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,96 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1328,9.
1.5 Preparare de Mal-PEG8-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001242287)
VCP-eribulină (ER-001228950) (10 mg, 8,808 µmol) şi 2,5-dioxopirolidin-1-il 1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-3-oxo-7,10,13,16,19,22,25,28-octaoxa-4-azahen-triacontan-31-oat (6,07 mg, 8,808 µmol) au fost amestecate în DMF (1 mL), după care a urmat adăugarea de Et3N (9,82 µl, 0,07 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore până când analiza HPLC a indicat finalizarea re-acţiei. Solventul a fost îndepărtat prin evaporare, şi reziduul a fost purificat prin croma-tografie rapidă pentru a rezulta Mal-PEG8-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001242287) sub forma unui solid de culoare albă (3,0 mg, randament 20%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,80 (s, 2H), 5,12 (s, 1H), 5,04 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,99 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,69 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,59 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,50 - 4,42 (m, 2H), 4,32 - 4,24 (m, 2H), 4,20 - 4,14 (m, 2H), 4,12 - 4,04 (m, 3H), 3,96 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,86 - 3,80 (m, 3H), 3,76 - 3,57 (m, 4H), 3,48 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 3,36 (s, 3H), 3,20 - 3,08 (m, 3H), 2,91 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,90 - 2,82 (m, 1H), 2,74 - 2,60 (m, 2H), 2,44 - 2,29 (m, 5H), 2,21 - 1,97 (m, 10H), 1,93 - 1,83 (m, 3H), 1,79 - 1,20 (m, 19H), 1,09 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,04 - 0,98 (m, 1H), 0,99 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,97 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1711,6.
1.6 Preparare de NHS-PEG9-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001242288)
NHS-PEG9-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001242288) s-a preparat (13 mg, ran-dament 85%) din VCP-eribulină (ER-001228950) şi BisNHS-PEG9 utilizând aceeaşi procedură ca aceea descrisă mai sus pentru prepararea de NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236940). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,61 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,16 (s, 1H), 5,06 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,00 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,52 - 4,45 (m, 2H), 4,34 - 4,26 (m, 2H), 4,20 - 4,19 (m, 1H), 4,14 - 4,06 (m, 2H), 3,98 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,88 - 3,80 (m, 3H), 3,76 - 3,70 (m, 4H), 3,66 - 3,58 (m, 37H), 3,38 (s, 3H), 3,24 - 3,10 (m, 3H), 2,93 (dd, J = 2,0, 11,2 Hz, 1H), 2,91 - 2,84 (m, 1H), 2,84 (s, 4H), 2,76 - 2,64 (m, 2H), 2,58 - 2,50 (m, 4H), 2,46 - 2,28 (m, 5H), 2,22 - 1,96 (m, 8H), 1,91 - 1,82 (m, 3H), 1,79 - 1,68 (m, 5H), 1,64 - 1,24 (m, 8H), 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,08 - 0,96 (m, 1H), 0,99 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,97 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1729,7.
1.7 Preparare de NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001243700)
În DMF (2,5 mL) s-a dizolvat VCP-eribulină (ER-001228950) (25 mg, 0,022 mmol), şi apoi s-a amestecat cu Et3N (24,55 µl, 0,176 mmol) şi Azidă-PEG3-NHS (8,34 mg, 0,024 mmol). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore până când analiza HPLC a indicat finalizarea reacţiei. Amestecul a fost concentrat sub vid, şi reziduul a fost purificat prin prep-HPLC (MeCN şi apă cu acid formic 0,1%). Fracţiile care conţin azidă-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină au fost extrase cu diclormetan (CH2Cl2) (3 x 20 mL), şi CH2Cl2 a fost evaporat pentru a obţine azidă-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001243116) sub forma unui solid de culoare albă (18,9 mg, randament 63%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,58 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,30 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,14 (s, 1H), 5,04 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,03 (s, 1H), 5,01 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,70 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,52 - 4,48 (m, 2H), 4,31 - 4,25 (m, 2H), 4,20 - 4,15 (m, 1H), 4,13 - 4,07 (m, 2H), 3,99 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,84 - 3,79 (m, 3H), 3,77 - 3,65 (m, 4H), 3,64 - 3,56 (m, 13H), 3,38 (s, 3H), 3,20 - 3,05 (m, 3H), 2,95 - 2,80 (m, 2H), 2,75 - 2,60 (m, 2H), 2,55 - 2,50 (m, 2H), 2,43 - 2,25 (m, 5H), 2,21 - 1,97 (m, 8H), 1,93 - 1,83 (m, 3H), 1,79 - 1,72 (m, 5H), 1,68 - 1,29 (m, 10H), 1,08 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,05 - 0,95 (m, 1H), 0,98 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,95 (d, J = 7,2 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1365,1.
Azidă-PEG3-VCP-eribulină (ER-001243116) (9,6 mg, 7,035 µmol) şi 3-(2-(2-(prop-2-in-1-iloxi)etoxi)etoxi)propanoat de 2,5-dioxopirolidin-1-il (6,61 mg, 0,021 mmol) au fost amestecate în apă (0,6 mL) şi t-Butanol (1,8 mL). Amestecul a fost barbotat cu N2 timp de 45 de min. La amestec s-a adăugat iodură de cupru pe amberlyst-21 (1,23 mmol/g, 10 mg) şi prin amestec a fost barbotat N2 timp de alte 30 de min. Amestecul de reacţie a fost apoi agitat la temperatura camerei timp de 72 de ore până la consumul complet al materiei prime. Prin analiza LCMS nu s-a observat niciun produs ester NHS dorit, doar acidul carboxilic hidrolizat. Amestecul a fost filtrat printr-un strat scurt de celite pentru a îndepărta răşina CuI. Filtratul a fost concentrat în vid, iar reziduul rezultat a fost purificat prin cromatografie în strat subţire preparativă (prep-TLC) (20% MeOH/CH2Cl2) pentru a obţine acid-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001243701) sub forma unui solid de culoare albă (3,7 mg, randament 33%). LCMS (ES) (M+H) = 1581,2.
Acid-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001243701) (3,0 mg, 1,898 µmol) a fost dizolvat în DMF (200 µL) şi s-a adăugat 1-hidroxipirolidin-2,5-dionă (0,437 mg, 3,796 µmol), după care a urmat adăugarea de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)car-bodiimidă (EDC) (0,728 mg, 3,796 µmol). Reacţia a fost aproximativ 50% completă după agitare la temperatura camerei timp de 18 ore. S-a adăugat EDC (1,46 mg, 7,8 µmol), şi amestecul a fost agitat timp de încă 18 ore până când analiza HPLC a indicat o con-versie > 95% la NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină. Amestecul a fost con-centrat în vid, şi reziduul a fost purificat prin prep-TLC (15% MeOH/CH2Cl2) pentru a rezulta NHS-PEG3-triazol-PEG3-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001243700) sub forma unui solid de culoare albă (2,2 mg, randament 69%). 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 8,00 (s, 1H), 7,59 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,04 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,00 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,71 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,63 (s, 2H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,57 - 4,55 (m, 2H), 4,51 - 4,45 (m, 1H), 4,32 - 4,28 (m, 2H), 4,21 - 4,17 (m, 2H), 4,13 - 4,10 (m, 2H), 3,98 (t, J = 10,8 Hz, 1H), 3,88 - 3,80 (m, 5H), 3,75 - 3,70 (m, 4H), 3,68 - 3,55 (m, 18H), 3,45 - 3,40 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,20 - 3,08 (m, 4H), 2,93 - 2,80 (m, 2H), 2,75 - 2,50 (m, 2H), 2,68 (s, 4H), 2,48 - 2,30 (m, 7H), 2,28 - 1,92 (m, 10H), 1,90 - 1,68 (m, 8H), 1,65 - 1,27 (m, 8H), 1,11 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,05 - 0,95 (m, 1H), 0,99 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 0,97 (d, J = 6,8 Hz, 3H), LCMS (M+H) = 1678,3.
1.8 Preparare de Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231679) şi Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulină (ER-001231690)
În DMF (0,5 mL) a fost dizolvată eribulină (ER-000086526) (10 mg, 0,014 mmol), şi s-a amestecat cu bază Hunig (3,59 µL, 0,021 mmol). A fost apoi adăugat ((S)-1-(((S)-1-(((S)-4-amino-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1,4-dioxo-butan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)carbamat de (9H-fluoren-9-il)metil (15,76 mg, 0,021 mmol), şi soluţia rezultată de culoare galbenă a fost agitată la temperatura camerei timp de 3 zile până când analiza HPLC a indicat consumul complet al materiei prime. La amestecul de reacţie s-a adăugat dietilamină (14,23 µL, 0,137 mmol), amestec care a fost apoi agitat la temperatura camerei o perioadă suplimentară de 2 ore până când a existat scindare 100% a protecţiei Fmoc. Amestecul de reacţie a fost concentrat pentru a îndepărta dietilamina, şi reziduul a fost re-dizolvat în DMF (1,5 mL). S-a adăugat Et3N (0,015 mL, 0,11 mmol) la temperatura camerei, după care a urmat adăugarea de 3-(2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etoxi)etoxi)propanoat de 2,5-dioxopirolidin-1-il (9,71 mg, 0,027 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la tem-peratura camerei timp de 16 ore până când reacţia a fost completă, aşa cum a fost de-terminat prin analiza LCMS. Amestecul a fost concentrat sub vid înalt, şi purificat prin cromatografie rapidă pentru a obţine Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231679) (9,2 mg, randament 49%) şi Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulină (ER-001231690) (6,0 mg, randament 18%) sub formă de uleiuri incolore.
Mal-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulinăă (ER-001231679): 1H RMN (400 MHz) δ ppm 9,23 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,13 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,68 (s, 2H), 6,30 (s l, 1H), 6,04 - 6,00 (m, 1H), 5,77 (s l, 1H), 5,42 (s l, 1H), 5,07 (s, 1H), 5,06 - 4,98 (m, 2H), 4,93 (s, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,90 - 4,82 (m, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,69 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,60 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 4,49 - 4,42 (m, 1H), 4,38 - 4,25 (m, 4H), 4,19 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,15 - 4,08 (m, 1H), 4,03 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,97 - 3,85 (m, 3H), 3,83 - 3,50 (m, 12H), 3,41 (s, 3H), 3,50 - 3,10 (m, 3H), 3,02 - 2,64 (m, 6H), 2,52 - 2,30 (m, 7H), 2,30 - 1,65 (m, 14H), 1,65 - 1,20 (m, 12H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,13 - 1,05 (m, 1H), LCMS (M+Na) = 1396,6.
Mal-PEG2-(Ala-Ala-Asn-PAB)2-eribulinăă (ER-001231690): 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ ppm 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,60 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,28 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,23 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,79 (s, 2H), 5,13 (s, 1H), 5,02 (s, 1H), 5,06 - 4,98 (m, 4H), 4,87 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,85 - 4,72 (m, 2H), 4,71 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 4,30 - 4,06 (m, 9H), 3,97 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,89 - 3,80 (m, 3H), 3,75 - 3,48 (m, 12H), 3,38 (s, 3H), 3,17 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 2,94 - 2,62 (m, 8H), 2,50 - 2,28 (m, 7H), 2,22 - 1,65 (m, 14H), 1,58 - 1,30 (m, 18H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,06 - 0,97 (m, 1H), LCMS (M+Na) = 1802,8.
1.9 Preparare de NHS-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231691)
Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231678) s-a preparat (15 mg, randament cantitativ) din eribulină (ER-000086526) şi Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB-PNP utilizând aceeaşi procedură ca aceea descrisă mai sus pentru prepararea de Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001228950). LCMS (M+H)=1135,5.
NHS-PEG2-Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231691) s-a preparat (12,4 mg, randament 64%) din Ala-Ala-Asn-PAB-eribulină (ER-001231678) şi BisNHS-PEG2 utilizând aceeaşi procedură ca aceea descrisă mai sus pentru prepararea de NHS-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001236940). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 9,21 (s, 1H), 7,95 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,58 - 7,52 (m, 1H), 7,28 (s l, 1H), 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,10 (s l, 1H), 6,29 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 5,83 (s l, 1H), 5,38 (s l, 1H), 5,07 (s, 1H), 5,05 - 4,95 (m, 2H), 4,93 (s, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,90 - 4,83 (m, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,69 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,60 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,46 - 4,41 (m, 1H), 4,36 - 4,25 (m, 4H), 4,19 (dd, J = 4,8, 6,0 Hz, 1H), 4,15 - 4,09 (m, 1H), 4,03 (dd, J = 4,8, 6,0 Hz, 1H), 3,99 - 3,89 (m, 3H), 3,85 - 3,50 (m, 10H), 3,41 (s, 3H), 3,40 - 3,10 (m, 3H), 3,01 - 2,60 (m, 10H), 2,60 - 2,35 (m, 7H), 2,35 - 1,65 (m, 14H), 1,65 - 1,20 (m, 14H), 1,10 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,15 - 1,03 (m, 1H), LCMS (ES) (M+H) = 1442,7.
1.10 Preparare de azidă-PEG3-disulfură-PAB-eribulină (ER-001237508)
Acid 4-(((tert-butildimetilsilil)oxi)metil)benzoic (1,0 g, 3,754 mmol) a fost dizolvat în diclormetan (DCM) (25 mL) răcit la 0°C. S-a adăugat apoi trietilamină (0,549 mL, 3,941 mmol), urmată de fosforazidat de difenil (1,085 mg, 3,941 mmol). Amestecul de reacţie a fost încălzit lent la temperatura camerei şi agitat timp de 14 ore. Amestecul brut a fost diluat cu acetat de etil (EtOAc)/Hep (1:1, 100 mL), şi a fost trecut printr-un dop scurt de silice eluând cu EtOAc/Hep (50%). Solventul a fost îndepărtat sub vid pentru a rezulta 1,10 g de azidă de 4-(((tertbutildimetilsilil)oxi)metil)benzoil (ER-001131970). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 7,98 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,40 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 4,79 (s, 2 H), 0,94 (s, 9 H), 0,10 (s, 6 H).
Azidă de 4-(((tert-butildimetilsilil)oxi)metil)benzoil (ER-001131970) (1,1 g, 3,775 mmol), dizolvată în toluen (20 mL), a fost încălzită la 110°C timp de 3 ore. Cu toate că produsul nu a arătat ca o singură pată, analiza prin cromatografie în strat subţire (TLC) a indicat că materia primă a fost consumată. Amestecul de reacţie a fost apoi răcit la temperatura camerei, şi transferat într-un flacon sigilat sub azot şi depozitat sub formă de soluţie în toluen (1 mL = 32,6 mg) la -20°C.
S-a adăugat trietilamină (0,099 mL, 0,709 mmol) la o soluţie de tert-butil((4-izo-cianatobenzil)oxi)dimetilsilan (165 mg, 0,626 mmol) în toluen (5 mL), urmată de alcool (90,0 mg, 0,591 mmol), şi amestecul de reacţie a fost agitat timp de 6 ore la 36°C. Progresul reacţiei a fost monitorizat prin UPLC/MS. S-a adăugat apoi o soluţie saturată de hidrogen carbonat de sodiu (NaHCO3) (10 mL), s-a extras cu EtOAc/Hep (1:1, 60 mL), s-a spălat cu soluţie salină, s-a uscat pe sulfat de sodiu, şi s-a concentrat. Mate-rialul brut a fost purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 10% până la 40%) pentru a obţine 215 mg de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil(4-(((tertbutildimetilsilil)oxi) metil)fenil)carbamat (ER-001131973). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 7,34 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 7,6 Hz), 6,63 (s l, 1 H), 4,69 (s, 2 H), 4,17 (s, 2 H), 2,42 (s, 3 H), 1,35 (s, 6 H), 0,93 (s, 9 H), 0,08 (s, 6 H).
2-metil-2-(metildisulfanil)propil (4-(((tertbutildimetilsilil)oxi)metil)fenil)carbamat (ER-001131973) (198 mg, 0,476 mmol) şi 4-metilbenzenesulfonat de 2-(2-(2-(2-azido-etoxi)etoxi)etoxi)etil (325 mg, 0,87 mmol) s-au dizolvat în DMF (6,6 mL). S-a adăugat apoi carbonat de cesiu (621 mg, 1,905 mmol), urmat de iodură de tetrabutilamoniu (45 mg, 0,122 mmol), şi amestecul de reacţie a fost agitat timp de 15 ore la 36°C. Progresul reacţiei a fost monitorizat prin UPLC/MS. S-a adăugat apoi o soluţie saturată de NH4Cl (30 mL), s-a extras cu EtOAc/Hep (2:1, 150 mL), s-a spălat cu soluţie salină (10 mL), s-a uscat pe sulfat de sodiu, şi s-a concentrat sub vid. Materialul brut a fost purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 20% până la 50%) pentru a obţine 248 mg de (2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)(4-(((tertbutildimetilsilil)oxi)metil)fenil)carbamat de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (ER-001140141). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 7,28 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,20 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 4,73 (s, 2 H), 4,06 (s l, 2 H), 3,83 (dd, 2 H, J = 6,4, 5,6 Hz), 3,68 - 3,56 (m, 12 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 5,6, 5,2 Hz), 2,33 (s, 3 H), 1,14 (s l, 6 H), 0,93 (s, 9 H), 0,09 (s, 6 H).
(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)(4-(((tertbutildimetilsilil)oxi)metil)fenil)car-bamat de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (ER-001140141) (81 mg, 0,131 mmol) a fost dizolvat într-un amestec de metanol (5 mL) şi apă (0,5 mL). La amestecul de reacţie s-a adăugat apoi acid acetic (0,5 mL, 8,734 mmol), şi s-a agitat timp de 14 ore la 38°C. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura camerei, şi solventul a fost îndepărtat sub vid. Reziduul a fost diluat cu EtOAc (30 mL), spălat cu apă (2 X 5 mL), NaHCO3, şi soluţie salină (3 mL), uscat pe sulfat de sodiu, şi concentrat sub vid. Materialul brut a fost purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 30% până la 90%) pentru a obţine 61,0 mg de (2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi) etil)(4-(hidroximetil)fenil)carbamat de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (ER-001140549). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 7,34 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 4,69 (d, 2 H, J = 4,4 Hz), 4,06 (s l, 2 H), 3,84 (dd, 2 H, J = 6,2, 6,2 Hz), 3,66 - 3,56 (m, 12 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 2,33 (s, 3 H), 1,74 (s l, 1 H), 1,14 (s l, 6 H).
(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)(4-(hidroximetil)fenil)carbamat de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (ER-001140549) (60 mg, 0,119 mmol) a fost dizolvat în DCM (2 mL) şi Py (0,019 mL, 0,239 mmol) răcit la 0°C. S-au adăugat apoi carbonocloridat de 4-nitrofenil (38,5 mg, 0,191 mmol) în DCM (2 mL) şi dimetilaminopiridină (DMAP) (2,9 mg, 0,024 mmol), şi amestecul de reacţie a fost agitat timp de 30 min la 0°C. Amestecul de reacţie a fost încălzit lent la temperatura camerei, şi agitat până când a fost consumată materia primă (aproximativ 2,5 ore). Solventul a fost apoi îndepărtat sub vid, şi reziduul a fost purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 10% până la 35%) pentru a obţine 78 mg de (2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi) etil)(4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil) fenil)carbamat de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (ER-001140550). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 8,27 (dd, 2 H, J = 6,8, 2,4 Hz), 7,41 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,37 (dd, 2 H, J = 7,2, 2,4 Hz), 7,33(d, 2 H, J = 8,8 Hz), 5,27 (s, 2 H), 4,08 (s l, 2 H), 3,85 (dd, 2 H, J = 5,8, 5,8 Hz), 3,66 - 3,57 (m, 12 H), 3,36 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 2,33 (s l, 3 H), 1,19 (s l, 6 H).
(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)(4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil) carbamat de 2-metil-2-(metildisulfanil)propil (ER-001140550) (30 mg, 0,045 mmol) în DCM (3 mL, 46,625 mmol) a fost plasat într-un balon de 25 ml sub azot, şi a fost răcit la 0°C. S-au adăugat amină (40,8 mg, 0,049 mmol) în DCM (2 mL) şi bază Hunig (0,024 mL, 0,135 mmol), urmate de DMAP (1,4 mg, 0,011 mmol). Amestecul de reacţie a fost apoi încălzit lent la temperatura camerei, agitat timp de 3 ore, concentrat sub vid, şi purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 50% până la 100%, urmat de MeOH/EtOAc 3% până la 8%) pentru a obţine 45,0 mg de azidă-PEG3-disulfură-PAB-eribulină pură (ER-001237508). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 7,32 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,25 (d, 2 H, J = 7,2 Hz), 5,28 (dd, 1 H, J = 5,6, 5,6 Hz), 5,11 - 5,04 (m, 3 H), 4,93 (s, 1 H), 4,88 (s, 1 H), 4,81 (s, 1 H), 4,69 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,60 (dd, 1 H, J = 4,2, 4,2 Hz), 4,36 (s l, 1 H), 4,33(dd, 1 H, J = 4,0, 2,0), 4,29 (ddd, 1 H, J = 9,6, 4,4, 4,4 Hz), 4,18 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 4,14 - 4,04 (m, 3 H), 4,03 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 3,97 - 3,89 (m, 3 H), 3,84 - 3,78 (m, 3 H), 3,67 - 3,56 (m, 14 H), 3,42 (s, 3 H), 3,40 - 3,35 (m, 1 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 3,27 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,20 (ddd, 1 H, J = 12,8, 6,0, 6,0 Hz), 2,91 - 2,83 (m, 2 H), 2,70 (dd, 1 H, J = 16,0, 10,0 Hz), 2,52 - 2,40 (m, 3 H), 2,35 - 2,13 (m, 9 H), 2,10 - 2,06 (m, 1 H), 2,01 - 1,89 (m, 4 H), 1,78 - 1,64 (m, 4 H), 1,60 - 1,52 (m, 4 H), 1,49 - 1,28 (m, 5 H), 1,22 - 1,07 (m, 6 H), 1,09 (d, 3 H, J = 6,0 Hz).
1.11 Preparare de Mal-PEG4-triazol-PEG3-disulfură-PAB-eribulină (ER-001237504)
Un amestec de azidă (9,0 mg, 7,151 µmol) şi 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-in-1-il)propanamidă (6,8 mg, 0,018 mmol) în tert-butanol (1,5 mL) şi apă (0,5 mL) a fost degazat timp de 45 min. S-a adăugat apoi iodură de cupru pe amberlyst-21 (1,23 mmol/g, 10 mg), şi s-a degazat o perioadă suplimentară de 30 min. Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore, şi monitorizat prin UPLC/MS. Majoritatea materiei prime a fost consumată, iar produsul dorit s-a arătat ca un vârf major. Amestecul a fost apoi separat de răşină, şi a fost purificat prin HPLC (acetonitril/apă cu acid formic 0,05%) pentru a obţine 1,5 mg de Mal-PEG4-triazol-PEG3-disulfură-PAB-eribulină (ER-001237504). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 7,74 (s, 1 H), 7,32 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 7,27 - 7,25 (m, 2 H), 6,69 (s l, 2 H), 5,43 (dd, 1 H, J = 5,6, 5,6 Hz), 5,14 - 5,06 (m, 3 H), 4,95 (s, 1 H), 4,89 (s, 1 H), 4,82 (s, 1 H), 4,70 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,66 (s, 2 H), 4,62 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,52(dd, 1 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 4,38 - 4,31 (m, 2 H), 4,30 (ddd, 1 H, J = 10,4, 4,0, 4,0 Hz), 4,20 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 4,16 - 4,05 (m, 3 H), 4,04 (dd, 1 H, J = 6,4, 4,4 Hz), 3,99 - 3,91 (m, 3 H), 3,87 - 3,80 (m, 6 H), 3,70 - 3,59 (m, 22 H), 3,53 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 3,44 (s, 3 H), 3,43 - 3,36 (m, 3 H), 3,29 (d, 1 H, J = 2,8 Hz), 3,18 (ddd, 1 H, J = 12,9, 6,2, 6,2 Hz), 2,92 - 2,84 (m, 2 H), 2,72 (dd, 1 H, J = 16,0, 10,0 Hz), 2,54 - 2,42 (m, 5 H), 2,37 - 1,90 (m, 19 H), 178 - 1,52 (m, 3 H), 1,50 - 1,14 (m, 16 H), 1,10 (d, 3 H, J = 6,0 Hz), LCMS (M+H) = 1642,1.
1.12 Preparare de NHS-PEG3-triazol-PEG3-disulfură-PAB-eribulină (ER-001244129)
Un amestec de azidă (9 mg, 7,151 µmol) şi 3-(2-(2-(prop-2-in-1-iloxi)etoxi)etoxi) propanoat de 2,5-dioxopirolidin-1-il (4,5 mg, 14,30 µmol) în tert-butanol (1 mL) şi apă (0,5 mL) a fost degazat timp de 45 min. S-a adăugat apoi iodură de cupru pe amberlyst-21 (1,23 mmol/g, 10 mg, 7,151 µmol), şi s-a degazat o perioadă suplimentară de 30 min. Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore, şi monitorizat prin UPLC/MS. Majoritatea materiei prime a fost consumată, iar produsul dorit s-a arătat ca un vârf major. Amestecul a fost apoi separat de răşină prin filtrare, a fost extras cu DCM (15 mL), spălat cu soluţie salină (3 X 3 mL), uscat pe sulfat de sodiu, şi concentrat sub vid. Reziduul (5 mg, 3,39 µmol) a fost azeotropat cu toluen, dizolvat în THF (1 mL), şi răcit la 0°C. S-a adăugat DCC (4,2 mg, 0,02 mmol), urmat de 1-hidroxipirolidin-2,5-diona (2,2 mg, 0,019 mmol), şi amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore. Majoritatea materiei prime a fost consumată, iar produsul dorit s-a arătat ca un vârf major, aşa cum a fost determinat prin UPLC/MS. Amestecul de reacţie a fost apoi concentrat şi purificat prin TLC preparativă (DCM/i-propanol, 8%) pentru a rezulta 2,5 mg de NHS-PEG3-triazol-PEG3-disulfură-PAB-eribulină (ER-001244129) sub forma unui ulei incolor. 1H RMN (400 MHz, CD2Cl2) δ ppm 7,72 (s, 1 H), 7,32 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,25 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 5,08 - 5,04 (m, 3 H), 4,93 (s, 1 H), 4,85 (s, 1 H), 4,78 (s, 1 H), 4,64 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,58 (s, 2 H), 4,55 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,48 (dd, 2 H, J = 5,0, 5,0 Hz), 4,32 (d, 1 H, J = 6,6 Hz), 4,27 - 4,22 (m, 2 H), 4,14 (dd, 1 H, J = 6,6, 4,8 Hz), 4,10 - 4,01 (m, 3 H), 4,00 (dd, 1 H, J = 6,8, 4,4 Hz), 3,92 - 3,78 (m, 9 H), 3,65 - 3,53 (m, 19 H), 3,44 - 3,39 (m, 4 H), 3,37 (s, 3 H), 3,26 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,13 (ddd, 1 H, J = 12,4, 6,0, 6,0 Hz), 2,91 - 2,73 (m, 11 H), 2,70 - 2,64 (m, 2 H), 2,54 - 2,41 (m, 3 H), 2,38 - 1,80 (m, 16 H), 1,74 - 1,52 (m, 3 H), 1,41 - 1,13 (m, 10 H), 1,07 (d, 3 H, J = 6,4 Hz), LCMS (M+H) = 1572,3.
1.13 Preparare de azidă-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001138856)
4-(((tert-butildimetilsilil)oxi)metil)anilină (315 mg, 1,327 mmol) a fost dizolvată în DCM (10 mL) răcit la 0°C. S-a adăugat apoi piridină (0,268 mL, 3,317 mmol), urmată de clorură de 5-cianopiridină-2-sulfonil (365 mg, 1,801 mmol) în DCM (10 mL) pe parcursul a 15 min. Amestecul de reacţie a fost încălzit lent la temperatura camerei pe parcursul a 1 oră, şi a fost agitat timp de 2 ore. Amestecul de reacţie a fost diluat cu EtOAc (50 mL), a fost spălat cu soluţie salină, uscat pe sulfat de sodiu, şi concentrat sub vid pentru a obţine 610 mg (103%) de N-(4-(((tert-butildimetilsilil)oxi)metil)fenil)-5-cianopiridină-2-sulfonamidă (ER-001137670). Produsul brut era destul de pur, deşi colorat. 1H RMN (400 MHz) δ ppm 8,94 (dd, 1 H, J = 1,8, 0,6 Hz), 8,10 (dd, 1 H, J = 8,4, 2,0 Hz), 7,99 (dd, 1 H, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,18 (d, 2 H, J = 8,2 Hz), 7,15 (s l, 1 H), 7,11 (dd, 2 H, J = 6,8, 0,8 Hz), 4,64 (s, 2 H), 0,90 (s, 9 H), 0,05 (s, 6 H).
N-(4-(((tert-butildimetilsilil)oxi)metil)fenil)-5-cianopiridină-2-sulfonamidă (ER-001137670) (105,0 mg, 0,26 mmol) şi 4-metilbenzenesulfonat de 2-(2-(2-(2-azidoe-toxi)etoxi)etoxi)etil (143 mg, 0,383 mmol) au fost dizolvate în DMF (4 mL). S-a adăugat apoi carbonat de potasiu (K2CO3) (144 mg, 1,041 mmol), urmat de iodură de tetrabu-tilamoniu (19,2 mg, 0,052 mmol), şi amestecul de reacţie a fost agitat timp de 36 de ore la 50°C. Progresul reacţiei a fost monitorizat prin UPLC/MS. S-a adăugat o soluţie sa-turată de NH4Cl (10 mL), s-a extras cu EtOAc/Hep (2:1, 30 mL), s-a spălat cu soluţie salină, s-a uscat pe sulfat de sodiu, şi s-a concentrat. Materialul brut a fost purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 25% până la 80%) pentru a obţine 118,0 mg de N-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-N-(4-(((tert-butildimetilsilil)oxi)metil)fenil)-5-cianopi-ridină-2-sulfonamidă (ER-001138452) (75%). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 8,99 (dd, 1 H, J = 1,8, 0,6 Hz), 8,08 (dd, 1 H, J = 8,2, 2,2 Hz), 7,86 (dd, 1 H, J = 8,0, 0,8 Hz), 7,24 (d, 2 H, J = 10 Hz), 7,09 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 4,69 (s, 2 H), 4,06 (dd, 2 H, J = 6,0, 6,0 Hz), 3,67 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 3,65 - 3,62 (m, 4 H), 3,58 (dd, 2 H, J = 6,2, 6,2 Hz), 3,56 - 3,53 (m, 4 H), 3,38 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz), 0,93 (s, 9 H), 0,08 (s, 6 H).
N-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-N-(4-(((tertbutildimetilsilil)oxi)metil)fenil)-5-cianopiridină-2-sulfonamidă (ER-001138452) (150 mg, 0,248 mmol) a fost dizolvată în metanol (6 mL). S-a adăugat apoi apă (0,60 mL), urmată de acid acetic (AcOH) (0,60 mL, 10,481 mmol). Amestecul de reacţie a fost încălzit lent la 38°C, şi agitat timp de 14 ore. Majoritatea solventului a fost îndepărtată sub vid. Reziduul a fost diluat cu EtOAc (30 mL), spălat cu apă (2 X 5 mL), NaHCO3, şi soluţie salină, uscat pe sulfat de sodiu, şi concentrat sub vid. Materialul brut a fost purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 35% până la 90%) pentru a obţine 105,0 mg de N-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-5-ciano-N-(4-(hidroximetil)fenil)piridină-2-sulfonamidă (ER-001138455) (84%). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 8,99 (d, 1 H, J = 1,2 Hz), 8,09 (dd, 1 H, J = 8,4, 2,0 Hz), 7,88 (dd, 1 H, J = 8,4, 0,8 Hz), 7,30 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,15 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 4,67 (s, 2 H), 4,06 (dd, 2 H, J = 6,2, 6,2 Hz), 3,66 (dd, 2 H, J = 5,0, 5,0 Hz), 3,65 - 3,58 (m, 6 H), 3,55 - 3,51 (m, 4 H), 3,38 (dd, 2 H, J = 5,2, 5,2 Hz.
N-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-5-ciano-N-(4-(hidroximetil)fenil)piridină-2-sulfonamidă (ER-001138455) (45 mg, 0,092 mmol) a fost dizolvată în DCM (3 mL), şi răcită la 0°C după adăugarea de piridină (0,015 mL, 0,183 mmol). S-au adăugat apoi carbonocloridat de 4-nitrofenil (20,3 mg, 0,101 mmol) în DCM (2 mL) şi DMAP (2,3 mg, 0,018 mmol). Amestecul de reacţie a fost încălzit lent la temperatura camerei şi agitat timp de 2 ore. UPLC/MS a indicat că au rămas unele materii prime. Amestecul de re-acţie a fost apoi concentrat sub vid, şi purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 12% până la 40%) pentru a obţine 35 mg de (4-nitrofenil)carbonat de 4-((N-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-5-cianopiridină)-2-sulfonamido)benzil (ER-001235286) (58%), şi 20 mg de materie primă. 1H RMN (400 MHz) δ ppm 8,99 (d, 1 H, J = 0,8 Hz), 8,27 (dd, 2 H, J = 9,2, 2,0 Hz), 8,12 (dd, 1 H, J = 7,6, 2,0 Hz), 7,92 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 7,38 (d, 4 H, J = 9,6 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 5,45 (s, 2 H), 4,06 (dd, 2 H, J = 5,8, 5,8 Hz), 3,67 - 3,58 (m, 8 H), 3,58 - 3,50 (m, 4 H), 3,38 (dd, 2 H, J = 6,1, 6,1 Hz).
(4-nitrofenil)carbonat de 4-(N-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-5-cianopi-ridină-2-sulfonamido)benzil (ER-001235286) (35,0 mg, 0,053 mmol) a fost plasat într-un balon de 25 mL sub azot, şi răcit la 0°C. S-au adăugat apoi amină (48,5 mg, 0,059 mmol) în DCM (3 mL, 46,625 mmol) şi bază Hunig (0,037 mL, 0,214 mmol), urmate de DMAP (2,61 mg, 0,021 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 30 min la 0°C, şi apoi agitat o perioadă suplimentară de 6 ore la temperatura camerei. Amestecul de reacţie a fost concentrat sub vid, şi purificat prin cromatografie rapidă (EtOAc/Hep 50% până la 100%, urmat de MeOH/EtOAc 3% până la 8%) pentru a obţine 61,0 mg de azidă-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină pură (ER-001138856). 1H RMN (400 MHz) δ ppm 8,98 (d, 1 H, J = 1,2 Hz), 8,10 (dd, 1 H, J = 8,2, 1,8 Hz), 7,87 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,26 (d, 2 H, J = 6,8 Hz), 7,13 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 5,29 (dd, 1 H, J = 5,6, 5,6 Hz), 5,08 - 5,00 (m, 3 H), 4,92 (s, 1 H), 4,87 (s, 1 H), 4,80 (s, 1 H), 4,68 (dd, 1 H, J = 4,6, 4,6 Hz), 4,59 (dd, 1 H, J = 4,6, 4,6 Hz), 4,38 - 4,30 (m, 2 H), 4,28 (ddd, 1 H, J = 10,4, 4,0, 4,0, Hz), 4,17 (dd, 1 H, J = 6,2, 4,6 Hz), 4,13 - 4,01 (m, 4 H), 3,97 - 3,88 (m, 3 H), 3,82 - 3,78 (m, 1 H), 3,67 - 3,50 (m, 15 H), 3,41 (s, 3 H), 3,40 - 3,33 (m, 1 H), 3,37 (dd, 2 H, J = 4,8, 4,8 Hz), 3,27 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,15 (ddd, 1 H, J = 12,8, 6,4, 6,4 Hz), 2,90 - 2,82 (m, 2 H), 2,70 (dd, 1 H, J = 16,0, 10,0 Hz), 2,51 - 2,40 (m, 3 H), 2,34 - 2,13 (m, 7 H), 2,10 - 2,05 (m, 1 H), 1,99 - 1,88 (m, 4 H), 1,78 - 1,64 (m, 5 H), 1,62 - 1,52 (m, 2 H), 1,50 - 1,29 (m, 4 H), 1,08 (d, 3 H, J = 6,8 Hz).
1.14 Preparare de Mal-PEG4-triazol-PEG3-sulfonamide-PAB-eribulină (ER-001237505)
Un amestec de azidă (10 mg, 8,023 µmol) şi 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-(3,6,9,12-tetraoxapentadec-14-in-1-il)propanamidă (9,20 mg, 0,024 mmol) în tert-butanol (2,1 mL) şi apă (0,7 mL) a fost degazat timp de 45 min. S-a adăugat apoi iodură de cupru pe amberlyst-21 (1,23 mmol/g, 15 mg), şi s-a degazat o perioadă suplimentară de 30 min. Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore, şi a fost monitorizat prin UPLC/MS. Majoritatea materiei prime a fost consumată, iar produ-sul dorit s-a arătat ca un vârf major. Amestecul de reacţie a fost apoi separat de răşină, şi purificat prin TLC preparativă (DCM/metanol, 7%) pentru a rezulta 5,5 mg de Mal-PEG4-triazol-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001237505). 1H RMN (400 MHz, CD2Cl2) δ ppm 9,01 (s, 1 H), 8,15 (dd, 1 H, J = 8,0, 1,8 Hz), 7,87 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,75 (s, 1 H), 7,28 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,14 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 6,68 (s, 2 H), 6,47 (s l, 1 H), 5,44 (s l, 1 H), 5,10 - 5,02 (m, 3 H), 4,94 (s, 1 H), 4,86 (s, 1 H), 4,80 (s, 1 H), 4,68 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,59 (s, 2 H), 4,56 (dd, 1 H, J = 4,4, 4,4 Hz), 4,51(dd, 2 H, J = 5,2, 5,2, Hz), 4,34(d, 1 H, J = 7,6, Hz), 4,30 - 4,23 (m, 2 H), 4,19 - 4,14 (m, 2 H), 4,08 (dd, 1 H, J = 4,0, 4,0 Hz), 4,03 - 3,98 (m, 2 H), 3,94 - 3,72 (m, 8 H), 3,68 - 3,46 (m, 28 H), 3,38 (s, 3 H), 3,38 - 3,33 (m, 3 H), 3,27 (d, 1 H, J = 3,2 Hz), 3,16 - 3,02 (m, 2 H), 2,90 - 2,81 (m, 2 H), 2,68 (dd, 1 H, J = 16,2, 9,8 Hz), 2,54 - 2,40 (m, 7H), 2,40 - 1,8 (m, 11 H), 1,80 - 1,50 (m, 3 H), 1,48 - 1,25 (m, 3 H), 1,09 (d, 3 H, J = 6,4 Hz), LCMS (M+H) = 1630,0.
1.15 Preparare de NHS-PEG3-triazol-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001244623)
Un amestec de azidă (14 mg, 0,011 mmol) şi 3-(2-(2-(prop-2-in-1-iloxi)etoxi) etoxi)propanoat de 2,5-dioxopirolidin-1-il (8,80 mg, 0,028 mmol) în terţ-butanol (2 mL) şi apă (1 mL) a fost degazat timp de 45 min. S-a adăugat apoi iodură de cupru pe am-berlyst-21 (1.23 mmol/g, 20 mg), şi s-a degazat o perioadă suplimentară de 30 min. Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore, şi a fost mo-nitorizat prin UPLC/MS. Majoritatea materiei prime a fost consumată, iar produsul dorit s-a arătat ca un vârf major. Amestecul de reacţie a fost apoi separat de răşină prin ex-tracţie cu DCM (2 x 10 mL). Stratul DCM a fost spălat cu soluţie salină (4 x 5 mL), uscat pe sulfat de sodiu, şi concentrat la produsul dorit (care a fost utilizat în etapa următoare fără nicio purificare suplimentară).
Acid brut (15,0 mg, 10,255 µmol) a fost dizolvat în THF (1,5 mL), şi răcit la 0°C. S-a adăugat apoi DCC (15,2 mg, 0,074 mmol), urmat de 1-hidroxipirolidin-2,5-dionă (8,3 mg, 0,072 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 18 ore. UPLC/MS a indicat că majoritatea materiei prime a fost consumată, iar produsul dorit s-a arătat ca un vârf major. Amestecul de reacţie a fost concentrat, şi purificat prin TLC preparativă (DCM/i-propanol, 8%) pentru a rezulta 2,5 mg de NHS-PEG3-triazol-PEG3-sulfonamidă-PAB-eribulină (ER-001244623). 1H RMN (400 MHz, CD2Cl2) δ ppm 9,00 (s, 1 H), 8,12 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 8,00 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,72 (s, 1 H), 7,26 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,12 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 5,37 (s l, 1 H), 5,08 - 5,02 (m, 3 H), 4,93 (s, 1 H), 4,85 (s, 1 H), 4,78 (s, 1 H), 4,66 - 4,62 (m, 1 H), 4,58 - 4,56 (m, 4 H), 4,33 (d, 1 H, J = 10,8 Hz), 4,29 - 4,21 (m, 2 H), 4,10 - 3,96 (m, 4 H), 3,93 - 3,76 (m, 6 H), 3,74 - 3,44 (m, 27 H), 3,36 (s, 3 H), 3,34 - 3,24 (m, 2 H), 3,15 - 3,06 (m, 1 H), 2,97 (s l, 1 H), 2,90 - 2,78 (m, 8 H), 2,74 - 2,08 (m, 13 H), 2,05 - 1,78 (m, 5 H), 1,73 - 1,50 (m, 2 H), 1,41 - 1,25 (m, 4 H), 1,07 (d, 3 H, J = 6,0 Hz), LCMS (M+H) = 1560,0.
1.16 Preparare de Mal-PEG2-eribulină
Eribulină (5 mg, 7 µmol) a fost dizolvată în DMF (0,5 mL), şi amestecată cu maleimido-PEG2-NHS (5 mg, 14 µmol; Broadpharm, nr. cat. BP-21680) şi bază Hunig (2,4 µL, 14 µmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Amestecul de reacţie a fost apoi purificat prin HPLC (gradient apă-acetonitril 30-70% conţinând acid formic 0,1%). Eluentul a fost colectat în masă, şi liofilizat la sec. Randamentul final a fost de 3,7 mg (3,8 µmol, 54%). Masa exactă anticipată a fost de 968,5 Da. Masa măsurată a fost de 969,6 Da [M+H].
1.17 Preparare de Mal-PEG4-eribulină
Eribulină (5 mg, 7 µmol) a fost dizolvată în DMF (0,5 mL), şi amestecată cu maleimido-PEG4-NHS (6,2 mg, 14 µmol; Broadpharm, nr. cat. BP-20554) şi bază Hunig (2,4 µL, 14 µmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Amestecul de reacţie a fost apoi purificat prin HPLC (gradient apă-acetonitril 30-70% conţinând acid formic 0,1%). Eluentul a fost colectat în masă, şi liofilizat la sec. Randamentul final a fost de 3,7 mg (3,5 µmol, 50%). Masa exactă anticipată a fost de 1056,5 Da. Masa măsurată a fost de 1057,7 Da [M+H].
1.18 Preparare de azido-PEG2-eribulină
Eribulină (5 mg, 7 µmol) a fost dizolvată în DMF (0,5 mL), şi amestecată cu azido-PEG2-NHS (4,2 mg, 14 µmol; Broadpharm, nr. cat. BP-20524) şi bază Hunig (2,4 µL, 14 µmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Amestecul de reacţie a fost apoi purificat prin HPLC (gradient apă-acetonitril 30-70% conţinând acid formic 0,1%). Eluentul a fost colectat în masă, şi liofilizat la sec. Ran-damentul final a fost de 2,2 mg (2,4 µmol, 34%). Masa exactă anticipată a fost de 914,5 Da. Masa măsurată a fost de 915,7 Da [M+H].
1.19 Preparare de azido-PEG4-eribulină
Eribulină (5 mg, 7 µmol) a fost dizolvată în DMF (0,5 mL), şi amestecată cu azido-PEG4-NHS (5,5 mg, 14 µmol; Broadpharm, nr. cat. BP-20518) şi bază Hunig (2,4 µL, 14 µmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Amestecul de reacţie a fost apoi purificat prin HPLC (gradient apă-acetonitril 30-70% conţinând acid formic 0,1%). Eluentul a fost colectat în masă, şi liofilizat la sec. Ran-damentul final a fost de 3,0 mg (3,0 µmol, 43%). Masa exactă anticipată a fost de 1002,5 Da. Masa măsurată a fost de 1003,7 Da [M+H].
1.20 Preparare de azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulină
Eribulină (15 mg, 21 µmol) a fost dizolvată în DMF (1,5 mL), şi amestecată bine. Apoi s-au adăugat bază Hunig (5,5 µL, 32 µmol) şi Fmoc-VCP-PNP (24 mg, 22 µmol; Levena Biopharma, nr. cat. VC1003). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei pe parcursul nopţii (16 ore). La finalizarea reacţiei, la amestecul de reacţie a fost adăugată dietilamină (20 µL, 0,21 mmol), şi s-a agitat timp de 2 ore la temperatura camerei pentru a îndepărta gruparea de protecţie Fmoc. Reacţia de deprotejare a fost monitorizată utilizând un spectrometru de masă Waters SQD. La finalizarea reacţiei, amestecul de reacţie a fost transferat într-un tub de microcentrifugă de 1,5 mL pre-cântărit. Solventul a fost evaporat sub vid folosind un concentrator Centrivap refrigerat cu temperatura setată la 30°C. Randamentul a fost de 16 mg (14 µmol) de NH2-Val-Cit-pAB-eribulină brută (masa exactă 1134,6 Da, randament 67%).
NH2-Val-Cit-pAB-eribulină (16 mg, 14,1 µmol) s-a dizolvat în DMF (1,5 mL). Apoi s-au adăugat bază Hunig (7,2 µL, 41 µmol) şi azido-PEG4-NHS (11 mg, 28,2 µmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei timp de 3 ore. Ames-tecul de reacţie a fost apoi purificat prin HPLC (gradient apă-acetonitril 48-72% conţi-nând acid formic 0,1%). Eluentul a fost colectat la m/z 1409, şi liofilizat pentru a permite obţinerea de azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulină (masa exactă 1407,7 Da). S-au obţinut 13 mg (9,2 µmol) de azido-PEG4-Val-Cit-PAB-eribulină (randament de etapă 65%, 44% în total).
EXEMPLUL 4
1. Materiale şi metode
Toţi reactivii utilizaţi au fost obţinuţi de la furnizori comerciali la grad de cercetare sau mai mare, cu excepţia cazului în care se indică în alt fel.
1.1 Anticorpi
MORAb-003 (anti-receptorul alfa al folatului uman umanizat, 25 mg/mL) şi MORAb-009 (anti-mezotelină umană chimeric şoarece-uman, 25 mg/mL) utilizaţi în ur-mătoarele studii au fost din lotul #NB02962-19 şi lotul #030A14, respectiv. Trastuzumab a fost obţinut comercial (Clingen), şi a fost din lotul #503345.
Anticorpii chimeric iepure-uman şi anti-mezotelină umană umanizat având o cisteină neîmperecheată la LCcys80 (Tabelul 1) au fost exprimaţi în celule 293F în mod tranzitoriu sau ca reuniuni selectate în mod stabil. Mediul condiţionat a fost purificat şi decisteinilat aşa cum este descris în secţiunea 1.4.1.2.1.
1.2 Citotoxine
Compuşii de eribulină care pot fi conjugaţi au fost sintetizaţi aşa cum este des-cris în Exemplul 3 (Tabelul 46). Stocurile (10 mM) au fost preparate în DMSO şi depo-zitate la -20°C până la utilizare.
1.3 Linii celulare tumorale
Liniile de celule tumorale umane utilizate în analizele ADC-urilor MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab preparate cu compuşi maleimido/succinimidă (OSu)/azido-linker-eribulină (Tabelul 46) includ IGROV1 (carcinom ovarian uman, FRhi, MSLNneg), NCI-H2110 (carcinom pulmonar cu celule non-mici uman, FRmed, MSLNmed), A431 (FRneg, MSLNneg), NCI-N87-luc (carcinom gastric uman, FRlo, MSLNmed, her2hi), NUGC3 (adenocarcinom gastric uman, FRneg, MSLNneg, her2neg), ZR75 (carcinom ductal de sân uman, FRneg, MSLNneg, her2med), şi BT-474 (carcinom ductal de sân uman, FRneg, MSLNneg, her2hi). Liniile de celule tumorale umane utilizate în analizele anticorpilor anti-mezotelină umană LCcys80 chimerici iepure-uman şi umanizaţi conjugaţi cu MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569) au fost A3 (A431 transfectat stabil cu mezotelină umană, MSLNhi), OVCAR3 (carcinom ovarian uman, MSLNhi), HEC-251 (endometroid uman, MSLNmed), H226 (mezoteliom cu celule scuamoase pulmonar uman, MSLNlo), şi A431 parental (MSLNneg). Toate liniile celulare utilizate au fost obţinute direct de la American Type Culture Collection (ATCC), cu excepţia IGROV1 (obţinută de la National Cancer Institute, cu permisiune) şi A3 (generată la Morphotek din A431 parental).
1.4 Conjugare anticorp-medicament
1.4.1 Conjugare pe bază de cisteină folosind maleimide
1.4.1.1 Conjugarea la disulfuri intercatenare
1.4.1.1.1 Reducere parţială
MORAb-003 şi MORAb-009 au fost schimbaţi în tampon în soluţie salină tam-ponată cu fosfat Dulbecco (DPBS) şi apoi s-au concentrat la 20 mg/mL folosind con-centrarea centrifugă. S-a adăugat un volum egal de 270 µM tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP) în 1X DPBS cu EDTA 2 mM, şi reducerea a fost efectuată prin amestecare uşoară timp de 80 min la temperatura camerei. Trastuzumab a fost redus parţial într-o manieră similară, cu excepţia faptului că reducerea a fost efectuată prin amestecare uşoară timp de 40 de min. la temperatura camerei.
1.4.1.1.2 Conjugare
Compusul maleimido-linker-eribulină (în DMSO) a fost conjugat cu anticorpii parţial reduşi la un raport molar de 1:6 (mAb:compus). Compusul a fost adăugat la propilen glicol la 50% în DPBS şi amestecat profund. S-a adăugat apoi un volum egal de anticorp parţial redus, şi s-a amestecat uşor (concentraţie finală de propilen glicol de 25%). Conjugarea a continuat timp de 3,5 până la 4 ore la temperatura camerei.
1.4.1.2 Conjugarea la LCcys80
1.4.1.2.1 Decisteinilare
Folosind un ÄKTA Explorer (GE Healthcare), o coloană de proteină A (GE Healthcare) a fost echilibrată cu 10 volume de coloană (CV) de fosfat de sodiu 20 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2 (tampon de echilibrare). Mediul condiţionat a fost apoi încărcat, după care a urmat spălarea materialului nelegat cu 10 CV de tampon de echilibrare. Coloana a fost spălată cu 16 CV de fosfat de sodiu 20 mM, EDTA 10 mM, cisteină 5 mM, pH 7,2 la 0,5 mL/min timp de 16 ore pentru a îndepărta gruparea de acoperire. Coloana a fost apoi spălată cu 60 CV de Tris 20 mM, pH 7,5 la 0,5 mL/min timp de 60 de ore. Anticorpul decisteinilat a fost eluat utilizând 5 CV de glicină 0,1 M, pH 2,9 şi neutralizat imediat folosind 5% volum de 2 M Tris, pH 9,0. Fracţiile care conţin anticorpii au fost reunite şi dializate în DPBS folosind un MWCO 20K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher).
1.4.1.2.2 Conjugare
Anticorpul decisteinilat a fost adus la 5,0 mg/mL în DPBS, EDTA 1 mM, şi propilen glicol la 50% a fost preparat în DPBS, EDTA 1 mM. MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569) (12 mM în DMSO) a fost adăugat la propilen glicol la 50% şi amestecat bine. S-a adăugat apoi un volum egal de anticorp decisteinilat la un raport molar de 1:4 (mAb:compus), şi s-a amestecat uşor. Conjugarea a continuat timp de 3,5 până la 4 ore la temperatura camerei.
1.4.2 Conjugarea pe bază de amină folosind succinimide
1.4.2.1 Conjugare
Anticorpul (MORAb-003 sau MORAb-009, neredus) a fost adus la 10,0 mg/mL în bicarbonat de sodiu 0,1 M, pH 8,3. Propilen glicol la 50% s-a preparat în bicarbonat de sodiu 0,1 M, pH 8,3. Succinimidă (OSu)-linker-eribulină (în DMSO) s-a adăugat la propilen glicol la 50% şi s-a amestecat profund. Un volum egal de anticorp a fost apoi adăugat la un raport molar de 1:4 (mAb:compus) şi amestecat profund. Conjugarea a continuat timp de 1 oră la temperatura camerei. Reacţia de conjugare a fost stinsă cu adăugarea unui volum 1:20 de Tris 1 M, pH 8,0, şi ADC a fost purificat aşa cum este descris în secţiunea 1.4.4.
1.4.3 Conjugarea pe bază de amină în două etape utilizând chimia alchină-azidă promovată de tulpină (SPAAC)
1.4.3.1 Derivatizarea dibenzilciclooctinei (DBCO)
Anticorpul (MORAb-003 sau MORAb-009, neredus) a fost adus la 10,0 mg/mL în bicarbonat de sodiu 0,1 M, pH 8,3. Propilen glicol la 50% a fost preparat în bicarbonat de sodiu 0,1 M, pH 8,3. NHS-PEG4-DBCO (Click Chemistry Tools, 50 mM în DMSO) s-a adăugat la propilen glicol la 50% şi amestecat profund. Un volum egal de anticorp a fost apoi adăugat la un raport molar de 1:4 (mAb:compus) şi amestecat profund. Conjugarea a continuat timp de 1 oră la temperatura camerei. NHS-PEG4-DBCO care nu a reacţio-nat s-a îndepărtat, aşa cum este descris în secţiunea 1.4.4.
1.4.3.2 Conjugare
Propilen glicol la 50% a fost preparat în DPBS. Compuşi azido-linker-eribulină s-au adăugat la propilen glicolul la 50% şi s-a amestecat profund. La amestec a fost apoi adăugat un volum egal de MORAb-003 sau MORAb-009 modificat DBCO la un raport molar de 1:4 (mAb:compus), şi s-a amestecat profund. Conjugarea SPAAC a fost lăsată să se desfăşoare pe parcursul nopţii la temperatura camerei. NHS-PEG4-DBCO care nu a reacţionat s-a îndepărtat, aşa cum este descris în secţiunea 1.4.4.
1.4.4 Purificare
Anticorpul conjugat a fost purificat utilizând coloană (coloane) de desalinizare HiTrap (GE Healthcare). Cromatografia a fost efectuată pe o cromatogafie lichidă cu proteină rapidă (FPLC) (GE Healthcare), utilizând IX DPBS ca tampon de rulare, pentru a elimina maleimido/OSu/azido-linker-eribulina şi propilen glicolul. Conţinutul final de proteine a fost determinat prin analiza BCA, aşa cum este descris în secţiunea 1.3.1 din Exemplul 1.
1.5 Caracterizarea biofizică
1.5.1 Analiza SEC-HPLC
Agregarea ADC-urilor a fost analizată prin cromatografie lichidă de înaltă per-formanţă, cu excluderea dimensiunii (SEC-HPLC), utilizând un HPLC Agilent 1260. ADC a fost diluat la 1 mg/mL în DPBS. ADC (10 µL) a fost injectat apoi pe o coloană de siguranţă Advanced SEC 300A (4,6 mm x 3,5 cm, dimensiunea porilor de 2,7 µm, Agilent), urmată de o coloană AdvancedBio 300A (4,6 mm x 30 cm, dimensiunea porilor de 2,7 µm). ADC a fost eluat din coloană cu fosfat de sodiu 0,1 M conţinând NaCI 0,15 M şi IPA 5%, pH 7,4 la un debit de 0,25 mL/min timp de 28 min. Toate datele au fost analizate utilizând software-ul Agilent ChemStation. Procentul de agregare a fost calculat ca [PAagregat/PAtotal]∗100, unde PA = zona de vârf integrată.
1.5.2 Analiza HIC-HPLC a raportului medicament-anticorp (DAR)
DAR a fost analizat folosind HPLC cu interacţiune hidrofobă (HIC-HPLC). Pro-bele au fost injectate pe TSKgel® Butyl-NP5, 4,6 mm ID x 3,5 cm, coloană de dimen-siune neporoasă 2,5 µM (Tosoh Bioscience), şi eluate cu o echilibrare de 3 min în 100% din faza mobilă A, un gradient de 15 min (0-100% B), o menţinere de 5 min în 100% B, o schimbare de 1 min la 100% A, şi o re-echilibrare de 5 min în 100% din faza mobilă A, la 0,7 mL/min. Faza mobilă A a fost fosfat de sodiu 25 mM, sulfat de amoniu 1,5 M, pH 7,0. Faza mobilă B a fost fosfat de sodiu 25 mM, izopropanol 25%, pH 7,0. Detectarea a fost efectuată la 280 nm (referinţă 320 nm). DAR a fost determinat prin formula:
în care AUC+1 este aria de sub curbă pentru vârful anticorpului corespunzător ADC conjugat cu o citotoxină, AUC+2 este aria de sub curbă pentru vârful anticorpului co-respunzător ADC conjugat cu două citotoxine, etc. ∑AUCtot este aria de sub curbă combinată pentru toate vârfurile.
1.5.3 Analiza LC-MS DAR
DAR a fost analizat, de asemenea, folosind o metodă LC-MS cu un HPLC Alliance Waters cu detectare SQD/PDA. Probele au fost injectate pe o coloană Proteomix RP-1000 (5 µM, 1000A, 4,6 mm x 15 cm, Sepax) la 65°C, şi eluate cu o echilibrare de 3 min în 25% B, un gradient liniar de 27 min de la 25% - 55% B, o men-ţinere de 5 min la 55% B, o schimbare de 1 min la 90% B, o menţinere de 5 min la 90% B, o schimbare de 1 minut înapoi la 25% B, şi o reechilibrare de 5 min la 25% B. Faza mobilă A a fost TFA 0,1% în apă, iar faza mobilă B a fost TFA 0,1% în acetonitril. Eluatul a fost apoi divizat (10:1) în detectoare PDA şi SQD. Detectorul SQD a fost configurat ca ES pozitiv, tensiune capilară la 3,2 kV, tensiunea conului la 40 V, extractor la 3 V, şi lentilă RF la 0,2 V, temperatură sursei la 150°C, şi temperatură de desolvatare la 250°C. Datele de masă au fost achiziţionate la 200 - 2000m/z timp de 40 min, modul continuu, timp de scanare 1 secundă. Datele au fost analizate şi supuse deconvoluţiei offline folosind MassLynx şi MaxEnt1. DAR a fost calculat folosind formula:
în care AUCLC+1 este aria de sub curbă a vârfului lanţului uşor conjugat cu o citotoxină, AUCLC+2 este aria de sub curbă a vârfului lanţului uşor conjugat cu două citotoxine, etc. AUCHC este aria de sub curbă a lanţurilor grele corespunzătoare, şi ∑AUCLCtot şi ∑AUCHCtot sunt aria de sub curbă combinată a tuturor lanţurilor uşoare şi lanţurilor grele neconjugate şi conjugate, respectiv.
1.5.4 Analiza UPLC/ESI-MS DAR a ADC-urilor LCcys80
ADC (1 mg/mL) a fost redus prin adăugarea de DTT la o concentraţie finală de 20 mM, urmată de incubare la 60°C timp de 3 min. Probele au fost apoi analizate folo-sind o cromatografie lichidă de ultra performanţă Waters Acquity şi spectrometru de masă Q-Tof Premier. Probele (0,5 - 2 µg fiecare) au fost injectate pe o coloană de micro-desalinizare MassPrep la 65°C, eluate din coloană cu o echilibrare de 5 min în 95% din faza mobilă A, un gradient de 10 min (5-90% B), şi o re-echilibrare de 10 min în 95% din faza mobilă A, la 0,05 mL/min. Faza mobilă A a fost acid formic 0,1% în apă. Faza mobilă B a fost acid formic 0,1% în acetonitril. Spectrometrul de masă Q-Tof a fost rulat în modul V, ion pozitiv, cu detectare în intervalul 500-4000 m/z. Parametrii sursei au fost după cum urmează: tensiunea capilară, 2,25 kV (anticorp intact)-2,50 kV (anti-corp redus); tensiunea conului de eşantionare, 65,0 V (anticorp intact) sau 50,0 V (anticorp redus); temperatura sursei, 105°C; temperatura de desolvatare, 250°C; debitul gazului de desolvatare, 550 L/oră. Vârful proteinei lanţului uşor a fost supus deconvoluţiei utilizând funcţia MassLynx MaxEnt 1. Intensităţile relative ale maselor lanţului uşor neconjugat şi conjugat individual au fost utilizate pentru a calcula DAR-ul general folosind formula:
în care LC+1 este intensitatea masei lanţului uşor conjugat cu o citotoxină, şi ∑LCtot reprezintă intensităţile combinate ale lanţului uşor neconjugat şi conjugat.
1.6 Caracterizarea legării
1.6.1 BIAcore
Concentraţiile de anticorpi au fost ajustate la 2 µg/mL în tampon HBS-P+ (GE Healthcare). Anticorpi nemodificaţi, sau ADC-uri, s-au injectat pe un senzor anti-IgG umană pe un BIAcore T100 (GE Healthcare) timp de 1 min la un debit de 10 µL/min. Pentru a înregistra asocierea antigenului la anticorpul capturat, o serie de concentraţii crescătoare de antigen a fost injectată timp de 300 de sec la un debit de 30 µL/min. Pentru anticorpii anti-mezotelină, gama de concentraţii a fost de 10 nM - 0,041 nM. Pentru ADC-urile MORAb-003 şi MORAb-009, gama de concentraţii a fost de 100 nM - 0,41 nM. Disocierea antigenului a fost monitorizată timp de 30 de min. la acelaşi debit. Suprafaţa senzorului a fost regenerată prin injectare de MgCl2 3 M timp de 2 x 30 sec la un debit de 30 µL/min. Sensogramele au fost analizate cu software-ul de evaluare Biacore T100 utilizând un model de legare Langmuir 1:1.
1.6.2 ELISA - Receptorul alfa al folatului
Receptorul alfa al folatului uman recombinant a fost diluat la 115 ng/mL în tampon de acoperire (tampon carbonat-bicarbonat 50 mM, pH 9,6), şi acoperit pe plăci negre cu 96 de godeuri Maxisorp (Thermo, nr. cat. 43711, 100 µL/godeu) la 4°C, pe parcursul nopţii. Soluţia de acoperire a fost aruncată şi plăcile au fost spălate de trei ori folosind IX PBS cu tampon Tween-20 0,05% (PBST). Plăcile au fost blocate în 300 µL de tampon de blocare (BSA 1% în PBST) la temperatura camerei timp de 2 ore pe un agitator orbital. MORAb-003 şi ADC-urile MORAb-003 au fost diluate la 1000 ng/mL în tampon de blocare, apoi diluate în serie de 2 ori pentru a obţine un interval de la 1000 ng/mL până la 0,98 ng/mL. Tamponul de blocare a fost descărcat şi la plăci s-au adăugat 100 µL/godeu de anticorp diluat. Plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 2 ore pe un agitator orbital. Soluţia de anticorp a fost descărcată şi plăcile au fost spălate de trei ori folosind PBST. La plăci s-au adăugat 100 µL/godeu de soluţie de anti-IgG umană de capră (H+L)-HRP (diluţie 1:10.000 în tampon de blocare), şi plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 oră pe un agitator orbital. Soluţia de anticorp secundar a fost descărcată şi plăcile au fost spălate de trei ori folosind PBST. La plăci s-au adăugat 100 µL/godeu de soluţie de lucru de substrat fluorogenic de peroxidază QuantaBlu (Thermo, nr. cat. 15169), şi plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 30 de min. Fluorescenţa a fost citită la excitaţie 325 nm/emisie 420 nm folosind un SpectraMax M5 (Molecular Devices). Datele au fost analizate folosind software-ul SoftMaxPro 5.4.2 cu montare cu 4 parametri.
1.6.3 ELISA - Mezotelină
Mezotelina umană recombinantă a fost diluată la 1 µg/mL în tampon de aco-perire (tampon carbonat-bicarbonat 50 mM, pH 9,6), şi acoperită pe plăci negre cu 96 de godeuri Maxisorp (Thermo, nr. cat. 43711, 100 µL/godeu) la 4°C, pe parcursul nopţii. Soluţia de acoperire a fost descărcată şi plăcile au fost spălate de trei ori folosind tampon IX PBS cu Tween-20 0,05% (PBST). Plăcile au fost blocate în 300 µL de tampon de blocare (BSA 1% în PBST) la temperatura camerei timp de 2 ore pe un agitator orbital. MORAb009 şi ADC-urile MORAb-009 au fost diluate la 1000 ng/mL în tampon de blocare, apoi diluate în serie de 2,5 ori pentru a obţine un interval de la 1000 ng/mL până la 0,105 ng/mL. Tamponul de blocare a fost descărcat şi la plăci s-au adăugat 100 µL/godeu de anticorp diluat. Plăcile au fost incubate la temperatura ca-merei timp de 2 ore pe un agitator orbital. Soluţia de anticorp a fost descărcată şi plăcile au fost spălate de trei ori folosind PBST. La plăci s-au adăugat 100 µL/godeu de soluţie de anti-IgG umană de capră (H+L)-HRP (diluţie 1:10.000 în tampon de blocare), şi plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 oră pe un agitator orbital. Soluţia de anticorp secundar a fost descărcată şi plăcile au fost spălate de trei ori folosind PBST. La plăci s-au adăugat 100 µL/godeu de soluţie de lucru de substrat fluorogenic de peroxidază QuantaBlu (Thermo, nr. cat. 15169), şi plăcile au fost incu-bate la temperatura camerei timp de 30 de min. Fluorescenţa a fost citită la excitaţie 325 nm/emisie 420 nm folosind un SpectraMax M5 (Molecular Devices). Datele au fost analizate folosind software-ul SoftMaxPro 5.4.2 cu montare cu 4 parametri.
1.7 Analize de citotoxicitate
1.7.1 Analiza cu violet de genţiană
Celule IGROV1 (FRhi, MSLNneg), NCI-H2110 (FRmed, MSLNmed), şi A431 (FRneg, MSLNneg) au fost sub-cultivate şi însămânţate la 5.000 de celule/godeu în mediu de creştere complet în plăci de cultură de ţesut cu 96 de godeuri, incubate la 37°C, CO2 5% pe parcursul nopţii (16 ore). Reactivii de test au fost diluaţi în serie 1:3 în plăci de diluare cu godeuri adânci de 2 mL, începând de la 200 nM (10 diluţii în total). Probele diluate (100 µL) au fost adăugate la plăcile de celule (concentraţia iniţială a probelor de test la 100 nM). Plăcile au fost incubate la 37°C, CO2 5% o perioadă suplimentară de 5 zile. Mediul a fost apoi descărcat. Plăcile au fost spălate o dată cu 200 µL de DPBS, colorate cu 50 µL de soluţie de violet de genţiană 0,2% la temperatura camerei timp de 15 min, şi apoi spălate intens cu apă de la robinet. Plăcile au fost uscate la aer, şi violet de gen-ţiană a fost dizolvat cu 200 µL de soluţie SDS 1%. Plăcile au fost citite la 570 nm. Datele au fost analizate folosind GraphPad Prism 6.
2. Rezultate
2.1 Caracterizarea biofizică a ADC-urilor MORAb-003, MORAb-009 şi trastuzumab
ADC-uri MORAb-003 (anti-receptorul alfa al folatului uman umanizat), MORAb-009 (anti-mezotelină umană chimeric uman de şoarece), şi trastuzumab (anti-her2 uman umanizat) au fost preparaţi folosind compuşii de eribulină care pot fi conjugaţi enumeraţi în Tabelul 46 în conformitate cu una dintre cele trei metode de conjugare, incluzând: (1) reducerea parţială a disulfurilor intercatenare de anticorp folosind TCEP non-reductiv de tiol, urmată de conjugare utilizând constructe maleimido-distanţier-linker-eribulină tiol-reactive; (2) conjugarea directă la reziduuri de lizină de anticorp utilizând constructe succinimidă (OSu)-distanţier-linker-eribulină; şi (3) conjugarea la reziduuri de lizină de anticorp utilizând o abordare în doi paşi, prin care OSu-PEG4-dibenzilciclooctina a fost mai întâi conjugată la reziduuri de lizină, apoi conjugarea ortogonală a constructelor azido-distanţier-linker-eribulină a fost realizată utilizând SPAAC.
După purificare, nivelurile de agregare pentru toţi ADC MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab au fost determinate prin SEC-HPLC iar raportul medicament-anti-corp (DAR) a fost analizat folosind LC-MS în fază inversă şi/sau HIC-HPLC. DAR pentru toţi ADC pe bază de maleimidă a fost analizat utilizând atât LC-MS în fază inversă, cât şi HIC-HPLC. O diferenţă în valorile DAR de mai puţin de 0,3 a fost observată de obicei între cele două metode. În schimb, DAR pentru toţi ADC preparaţi prin intermediul conjugării prin reziduuri de lizină a fost analizat numai prin LC-MS, deoarece gradul ridicat de eterogenitate al acestor ADC împiedică rezolvarea speciilor DAR individuale prin HIC-HPLC. Legarea la antigenul ţintă a fost analizată, de asemenea, folosind ELISA, pentru ADC MORAb-003 şi MORAb-009. Rezultatele analizelor DAR şi de agregare sunt arătate în Tabelul 47 lângă ADC respectiv.
Tabelul 47. Analiza DAR Analiza SEC-HPLC Legarea la antigen Analize biofizice ale ADC MORAb-003, MORAb-009 şi trastuzumab ADC-uri anticorp chimia de conjugare distanţier chimia de scindare DAR (LC-MS) DAR (HIC-HPLC) % Agr. % Monomer % Frag. ELISA, EC50, ng/mL ELISA, EC50, nM MORAb003 N/A N/A N/A 3,62 96,38 0 6,29 0,04 MORAb009 N/A N/A N/A 0 100 0 42,60 0,28 trastuzumab N/A N/A N/A 3,52 96,48 0 N/A N/A MORAb003-ER1159569 (Lot NB3073-88L) MORAb-003 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 3,58 3,91 3,12 96,88 0 22,60 0,15 MORAb009-ER1159569 (Lot NB3073-88F) MORAb-009 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 3,63 3,93 3,23 96,77 0 43,70 0,29 MORAb003-ER1159569 (Lot NB3142-62A) MORAb-003 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 4,80 4,88 3,21 96,79 0 18,20 0,12 MORAb009-ER1159569 (Lot NB3142-62D) MORAb-009 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 4,68 4,57 0,90 99,10 0 33,10 0,22 trastuzumab-ER1159569 trastuzumab maleimidă PEG2 val-cit-pAB 3,10 3,11 1,26 98,74 0 N/A N/A MORAb003-ER1242287 MORAb-003 maleimidă PEG8 val-cit-pAB 2,31 2,35 18,63 81,37 0 21,50 0,14 MORAb009-ER1242287 MORAb-009 maleimidă PEG8 val-cit-pAB 1,13 2,00 11,24 88,76 0 58,60 0,39 MORAb003-ER1235638 MORAb-003 maleimidă pentil val-cit-pAB 3,65 3,89 3,95 96,05 0 15,30 0,10 MORAb009-ER1235638 MORAb-009 maleimidă pentil val-cit-pAB 3,99 4,10 4,5 95,5 0 65,60 0,44 MORAb003-ER1231679 MORAb-003 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 3,60 3,83 3,09 96,91 0 18,30 0,12 MORAb009-ER1231679 MORAb-009 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 3,27 3,94 4,39 95,61 0 41,40 0,28 MORAb003-ER1231690 MORAb-003 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB-ala-ala-asn-pAB 3,02 3,23 4,44 95,56 0 8,92 0,06 MORAb009-ER1231690 MORAb-009 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB-ala-ala-asn-pAB 2,36 3,17 6,22 93,78 0 58,70 0,39 MORAb003-ER1237504 MORAb-003 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,52 1,61 13,73 86,27 0 29,80 0,20 MORAb009-ER1237504 MORAb-009 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,72 1,03 9,78 90,22 0 55,90 0,37 MORAb003-ER123 7505 MORAb-003 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 sulfonamidă 1,85 3,88 5,72 94,28 0 18,30 0,12 MORAb009-ER1237505 MORAb-009 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 sulfonamidă 2,33 3,91 5,44 94,56 0 61,00 0,41 MORAb003-PEG2-eribulină MORAb-003 maleimidă PEG2 non-scindabilă 4,15 4,49 3,97 96,03 0 6,96 0,05 MORAb009-PEG2-eribulină MORAb-009 maleimidă PEG2 non-scindabilă 4,55 4,30 1,15 97,11 1,74 8,84 0,06 MORAb003-PEG4-eribulină MORAb-003 maleimidă PEG4 non-scindabilă 4,70 4,79 9,84 89,76 0 9,31 0,06 MORAb009-PEG4-eribulină MORAb-009 maleimidă PEG4 non-scindabilă 4,48 4,57 1,03 97,13 1,84 11,60 0,08 MORAb003-ER1236940 MORAb-003 succinimidă PEG2 val-cit-pAB 0,72 3,65 96,35 0 17,00 0,11 MORAb009-ER1236940 MORAb-009 succinimidă PEG2 val-cit-pAB 0,89 2,75 97,25 0 66,30 0,44 MORAb003-ER1242288 MORAb-003 succinimidă PEG9 val-cit-pAB 0,00 2,85 97,15 0 14,40 0,10 MORAb009-ER1242288 MORAb-009 succinimidă PEG9 val-cit-pAB 0,21 1,69 98,31 0 15,30 0,10 MORAb003-ER1236941 MORAb-003 succinimidă pentil val-cit-pAB 0,77 3,13 96,87 0 13,00 0,09 MORAb009-ER1236941 MORAb-009 succinimidă pentil val-cit-pAB 0,93 3,04 96,96 0 44,60 0,30 MORAb003-ER1243700 MORAb-003 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 val-cit-pAB 0,00 3,92 96,08 0 6,22 0,04 MORAb009-ER1243700 MORAb-009 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 val-cit-pAB 0,06 1,97 98,03 0 46,70 0,31 MORAb003-ER1231691 MORAb-003 succinimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 0,37 3,46 96,54 0 11,50 0,08 MORAb009-ER1231691 MORAb-009 succinimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 0,29 2,45 97,55 0 43,30 0,29 MORAb003-ER1244129 MORAb-003 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,24 10,87 89,13 0 14,30 0,10 MORAb009-ER1244129 MORAb-009 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,47 12,79 87,21 0 57,70 0,38 MORAb003-ER1244623 MORAb-003 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 sulfonamidă 0,55 5,21 94,79 0 4,54 0,03 MORAb009-ER1244623 MORAb-009 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 sulfonamidă 1,14 0 100 0 39,00 0,26 MORAb003-DBCO-ER1237508 MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 2,19 4,1 95,9 0 24,10 0,16 MORAb009-DBCO-ER1237508 MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 2,33 0 100 0 53,80 0,36 MORAb003-DBCO-ER1138856 MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 sulfonamidă 1,82 3,49 96,51 0 15,00 0,10 MORAb009-DBCO-ER1138856 MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 sulfonamidă 1,59 0 100 0 44,70 0,30 MORAb003-DBCO-PEG4 VCP eribulină MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 val-cit-pAB 3,09 2,87 97,13 0 16,00 0,11 MORAb009-DBCO-PEG4 VCP eribulină MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 val-cit-pAB 2,91 0,22 99,78 0 33,70 0,22 MORAb003-DBCO-PEG2 eribulină MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG2 non-scindabilă 3,43 3,88 96,12 0 19,10 0,13 MORAb009-DBCO-PEG2 eribulină MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG2 non-scindabilă 3,07 1,15 98,85 0 23,30 0,16 MORAb003-DBCO-PEG4 eribulină MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 non-scindabilă 2,96 3,64 96,36 0 13,30 0,09 MORAb009-DBCO-PEG4 eribulină MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 non-scindabilă 2,8 1,12 98,88 0 45,20 0,30 Abrevieri: % Agr., % agregare; % Frag, % fragmentare.
2.1.1 ADC-uri MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab
Nu au fost observate diferenţe semnificative între MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab, atât din punctul de vedere al eficienţei conjugării, cât şi al parametrilor biofizici. Toţi ADC au demonstrat valori DAR şi niveluri de formare a agregatului simi-lare.
2.1.2 ADC-uri pe bază de maleimidă
Pentru ADC pe bază de maleimidă, ambii distanţieri pentil şi PEG2 împerecheaţi cu un situs de scindare val-cit-pAB, şi un distanţier PEG2 împerecheat cu un situs de scindare ala-ala-asn-pAB, au furnizat valori DAR cuprinse între 3,5 şi 4,0 prin LC-MS în fază inversă şi HIC-HPLC, în plus faţă de nivelurile mici de agregat (< 5%). Cu toate acestea, atunci când distanţierul a fost prelungit la PEG-uri (împerecheat cu un situs de scindare val-cit-pAB), nivelurile de agregat au crescut (11-18%) şi eficienţa conjugării a scăzut, rezultând valori DAR cuprinse între 1,1 şi 2,3. A se vedea, de exemplu, pro-centul de agregare şi valorile DAR ale MORAb003/MORAb009-ER-001159569 (linker PEG scurt) şi MORAb003/MORAb009-1242287 (linker PEG lung) în Tabelul 47.
Pentru ADC preparaţi cu un situs de scindare disulfidil-pAB au fost observate valori DAR scăzute (1,0-1,6), împreună cu niveluri de agregat relativ ridicate (10-14%). Au fost observate valori DAR semnificativ mai mici atunci când aceste ADC au fost analizate prin LC-MS decât prin HIC-HPLC (a se vedea, de exemplu, valorile DAR LC-MS/HIC-HPLC pentru MORAb003/MORAb009-ER1237504 şi MORAb003/MORAb009-ER1237505 în Tabelul 47). Acest rezultat sugerează că situsul de scindare a linkerului prezintă instabilitate a pH-ului, deoarece faza mobilă a analizei LC-MS este de aproxi-mativ 3,0, în timp ce faza mobilă a analizei HIC-HPLC este neutră.
Pentru ADC preparaţi cu un situs de scindare sulfonamidă au fost observate niveluri de agregat mici (< 5%). Similar cu ADC-urile disulfidil-pAB, valori DAR mai mici au fost observate atunci când au fost analizate prin LC-MS (1,8 - 2,3) decât prin HIC-HPLC (3,9), ceea ce din nou indică faptul că situsul de scindare a linkerului prezintă instabilitate a pH-ului.
Pentru linkerii non-scindabili PEG2 şi PEG4 s-a observat o conjugare eficientă, rezultând valori DAR cuprinse între 4,0 şi 4,7. ADC-urile MORAb-009 cu aceşti linkeri non-scindabili au demonstrat, de asemenea, niveluri de agregare scăzute (< 2%), în timp ce nivelurile de agregare uşor mai mari au fost observate pentru ADC-urile MORAb-003 corespunzătoare (4% şi 10% pentru PEG2 şi PEG4, respectiv).
2.1.3 ADC-uri pe bază de succinimidă
Toţi ADC preparaţi folosind succinimidă cuplată cu distanţier-linker-eribulină au avut ca rezultat valori DAR < 1,0. Pentru a confirma că această eficienţă de conjugare mai mică (relativ la maleimide) nu a fost o consecinţă a procedurii de conjugare în sine, aceşti ADC au fost refăcuţi folosind un raport compus:anticorp mai mare şi reanalizaţi folosind aceleaşi metode de analiză DAR. Au fost obţinute rezultate similare, ceea ce sugerează, fără a fi legat de teorie, că valorile DAR mai mici sunt o proprietate inerentă a combinaţiei de succinimidă şi eribulină, şi că maleimidele pot fi conjugate mai eficient. Eficienţa conjugării cu succinimidă a fost crescută prin utilizarea unei metode în două etape, prin care DBCO a fost adăugată mai întâi la anticorp utilizând NHS-DBCO, după care a urmat adăugarea compuşilor azido. Această abordare are ca rezultat valori DAR mai mari, aşa cum sunt măsurate prin analiza HPLC cu fază inversă, în comparaţie cu conjugarea în mod direct la reziduurile de lizină de anticorp. Pentru ADC-urile pe bază de succinimidă având linkeri sulfonamidă (scindabil), val-cit-PAB (scindabil) sau PEG2/PEG4 (non-scindabil), valorile DAR rezultate din conjugarea în două etape au fost similare cu cele determinate pentru ADC-urile pe bază de maleimidă având un situs de scindare de sulfonamidă. Fără a fi legat de teorie, acest rezultat sugerează din nou că valori DAR mai mici pentru reacţiile de conjugare succinimidă-distanţier-linker-eribulină sunt o proprietate inerentă a combinaţiei de succinimidă şi eribulină.
2.2 Caracterizarea legării a ADC-urilor MORAb-003 şi MORAb-009
Pentru ADC-urile MORAb-003 nu au fost observate diferenţe semnificative între ADC-urile linker-eribulină pe bază de maleimidă care nu pot fi scindate şi MORAb-003 parental în ceea ce priveşte legarea la antigenul ţintă. Pentru alte ADC-uri MORAb-003 linker-eribulină pe bază de maleimidă, prin analiza ELISA a fost observată de obicei o pierdere de 2 până la 3 ori în legarea la antigenul ţintă în raport cu MORAb-003 pa-rental. Cu toate acestea, nu a existat nicio corelaţie aparentă fie între lungimea linker-ului, fie între compoziţia linkerului, şi valori EC50 mai mici. În mod similar, pentru ADC-urile MORAb-003 linker-eribulină pe bază de succinimidă a fost observată în general o pierdere de 0 până la 3 ori în legarea la antigenul ţintă în raport cu MORAb-003 ne-conjugat. Din nou, nu a fost evidentă nicio corelaţie fie între lungimea linkerului, fie între compoziţia linkerului, şi valori EC50 mai mici. Pentru ADC MORAb-009, toţi ADC au avut o scădere de mai puţin de 2 ori a valorilor EC50, în raport cu MORAb-009 parental.
2.3 Analizele de citoxicitate in vitro ale ADC-urilor MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab
Potenţa in vitro a ADC MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab preparaţi a fost evaluată utilizând o analiză de citotoxicitate pe bază de celule cu violet de genţiană. Liniile de celule selectate pentru screening-ul ADC MORAb-003 şi MORAb-009 au fost IGROV1, NCI-H2110, şi A431. Celulele IGROV1 au ca origine carcinom epitelial ovarian uman şi exprimă niveluri ridicate ale receptorului alfa al folatului, dar nu exprimă mezo-telină (adică, MORAb-003-reactiv). Celulele NCI-H2110 au ca origine carcinom pulmo-nar cu celule non-mici uman şi exprimă niveluri moderate atât ale receptorului alfa al folatului cât şi ale mezotelinei (adică, MORAb-003- şi MORAb-009-reactive). Celulele de control A431 au ca origine carcinom epidermic uman şi nu exprimă niciun antigen ţintă. Rezultatele acestui screening sunt arătate în Tabelul 48. ADC MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab care cuprind linker-toxina maleimido-PEG2-val-cit-pAB-eribulină (VCP-eribulină) au fost, de asemenea, evaluaţi în linii de celule de cancer gastric şi de sân suplimentare, inclusiv NCI-N87 (FRlo, MSLNmed, her2hi), BT-474 (FRneg, MSLNneg, her2hi), ZR-75 (FRneg, MSLNneg, her2med), şi NUGC3 (FRneg, MSLNneg, her2neg). Rezul-tatele acestui screening sunt arătate în Tabelul 49.
Tabelul 48. Screening-ul de citotoxicitate (IC50) al ADC MORAb-003 şi MORAb-009 pe celule IGROV1, NCI-H2110, şi A431 Analiza citotoxicităţii IGROV1 (FRhi, MSLNneg) NCI-H2110 (FRmed, MSLNmed) A431 (FRneg, MSLNneg) ADC anticorp chimia de conjugare distanţier chimia de scindare IC50 (nM) SD IC50 (nM) SD IC50 (nM) SD MORAb003 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A MORAb009 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A trastuzumab N/A N/A N/A eribulină N/A N/A N/A N/A 0,320 0,212 0,199 0,034 0,653 0,159 MORAb003-ER1159569 (Lot NB3073-88L) MORAb-003 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 0,155 0,064 3,685 0,417 > 100 MORAb009-ER1159569 (Lot NB3073-88F) MORAb-009 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 9,450 2,093 14,945 1,747 > 100 MORAb003-ER1159569 (Lot NB3142-62A) MORAb-003 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 0,020 1,550 > 100 MORAb009-ER1159569 (Lot NB3142-62D) MORAb-009 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 5,687 6,784 > 100 trastuzumab-ER1159569 trastuzumab maleimidă PEG2 val-cit-pAB MORAb003-ER1242287 MORAb-003 maleimidă PEG8 val-cit-pAB 0,115 0,035 7,065 0,417 85,960 MORAb009-ER1242287 MORAb-009 maleimidă PEG8 val-cit-pAB 25,765 8,478 34,455 3,033 > 100 MORAb003-ER1235638 MORAb-003 maleimidă pentil val-cit-pAB 0,105 0,092 3,920 1,032 > 100 MORAb009-ER1235638 MORAb-009 maleimidă pentil val-cit-pAB 6,830 0,962 13,965 6,611 > 100 MORAb003-ER1231679 MORAb-003 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 0,080 0,028 3,800 0,566 31,630 1,202 MORAb009-ER1231679 MORAb-009 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 8,890 0,976 7,080 1,867 34,390 3,536 MORAb003-ER1231690 MORAb-003 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB-ala-ala-asn-pAB 0,125 0,021 4,745 2,114 38,555 0,403 MORAb009-ER1231690 MORAb-009 maleimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB-ala-ala-asn-pAB 16,980 5,176 12,310 3,422 54,960 5,360 MORAb003-ER1237504 MORAb-003 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,265 0,092 0,845 0,177 7,005 0,290 MORAb009-ER1237504 MORAb-009 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 6,375 2,751 1,220 0,325 8,130 0,608 MORAb003-ER1237505 MORAb-003 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 sulfonamidă 0,370 0,269 0,690 0,283 6,800 0,834 MORAb009-ER1237505 MORAb-009 maleimidă PEG4-triazol-PEG3 sulfonamidă 6,370 3,012 0,990 0,453 9,030 1,527 MORAb003-PEG2-eribulină MORAb-003 maleimidă PEG2 non-scindabilă 0,330 38,300 > 100 MORAb009-PEG2-eribulină MORAb-009 maleimidă PEG2 non-scindabilă 42,770 50,040 > 100 MORAb003-PEG4-eribulină MORAb-003 maleimidă PEG4 non-scindabilă 0,277 21,630 > 100 MORAb009-PEG4-eribulină MORAb-009 maleimidă PEG4 non-scindabilă 76,320 31,600 > 100 MORAb003-ER1236940 MORAb-003 succinimidă PEG2 val-cit-pAB 0,325 0,106 30,545 3,132 > 100 MORAb009-ER1236940 MORAb-009 succinimidă PEG2 val-cit-pAB 31,915 2,510 36,500 11,031 90,060 MORAb003-ER1242288 MORAb-003 succinimidă PEG9 val-cit-pAB 38,105 45,601 64,010 8,075 > 100 MORAb009-ER1242288 MORAb-009 succinimidă PEG9 val-cit-pAB > 100 > 100 > 100 MORAb003-ER1236941 MORAb-003 succinimidă pentil val-cit-pAB 0,330 0,071 42,105 12,594 > 100 MORAb009-ER1236941 MORAb-009 succinimidă pentil val-cit-pAB > 100 49,485 13,569 > 100 MORAb003-ER1243700 MORAb-003 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 val-cit-pAB 1,150 > 100 > 100 MORAb009-ER1243700 MORAb-009 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 val-cit-pAB > 100 > 100 > 100 MORAb003-ER1231691 MORAb-003 succinimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB 12,320 31,795 4,448 > 100 MORAb009-ER1231691 MORAb-009 succinimidă PEG2 ala-ala-asn-pAB > 100 20,000 5,954 > 100 MORAb003-ER1244129 MORAb-003 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,370 0,184 0,750 0,071 12,005 1,534 MORAb009-ER1244129 MORAb-009 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 6,595 4,052 0,840 0,057 9,230 0,014 MORAb003-ER1244623 MORAb-003 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 sulfonamidă 0,980 0,396 1,820 0,410 37,235 15,733 MORAb009-ER1244623 MORAb-009 succinimidă PEG3-triazol-PEG3 sulfonamidă 24,505 4,702 2,235 0,629 36,665 14,206 MORAb003-DBCO-ER1237508 MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 0,545 0,389 0,900 0,071 9,670 0,382 MORAb009-DBCO-ER1237508 MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 disilfidil-dimetil-pAB 10,245 3,486 1,040 0,297 11,280 2,277 MORAb003-DBCO-ER1138856 MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 sulfonamidă 1,775 1,421 1,655 0,007 24,990 2,022 MORAb009-DBCO-ER1138856 MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG3 sulfonamidă 19,155 5,438 1,960 0,113 28,070 0,636 MORAb003-DBCO-PEG4 VCP eribulină MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 val-cit-pAB 0,038 4,281 > 100 MORAb009-DBCO-PEG4 VCP eribulină MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 val-cit-pAB 12,960 31,400 > 100 MORAb003-DBCO-PEG2 eribulină MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG2 non-scindabilă 4,250 38,070 > 100 MORAb009-DBCO-PEG2 eribulină MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG2 non-scindabilă 75,680 85,680 > 100 MORAb003-DBCO-PEG4 eribulină MORAb-003 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 non-scindabilă 1,323 46,280 > 100 MORAb009-DBCO-PEG4 eribulină MORAb-009 succinimidă/ click dibenzilciclo-octenă-triazol-PEG4 non-scindabilă 61,490 39,330 > 100 Toate valorile IC50 sunt în nM, şi reprezintă valorile medii ale experimentelor în replicat. SD - deviaţie standard.
Tabelul 49. Screening-ul de citotoxicitate (IC50) al ADC MORAb-003, MORAb-009, şi trastuzumab pe celule NCI-N87, BT-474, ZR-75, şi NUGC3 Analiza citotoxicităţii NCI-N87-Luc (FRlo, MSLNmed, her2hi) BT-474 (FRneg, MSLNneg, her2hi) ZR-75-1 (FRneg, MSLNneg, her2med) NUGC3-Luc (FRneg, MSLNneg, her2neg) ADC anticorp chimia de conjugare distanţier chimia de scindare IC50 (nM) IC50(nM) IC50 (nM) IC50(nM) MORAb003 N/A N/A N/A MORAb009 N/A N/A N/A trastuzumab N/A N/A N/A 0,78 0,641 > 100 > 100 eribulină N/A N/A N/A N/A 0,257 0,151 0,236 0,445 MORAb003-ER1159569 (Lot NB3073-88L) MORAb-003 maleimidă PEG2 val-cit-pAB MORAb009-ER1159569 (Lot NB3073-88F) MORAb-009 maleimidă PEG2 val-cit-pAB MORAb003-ER1159569 (Lot NB3142-62A) MORAb-003 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 4,528 11,46 14,74 20,45 MORAb009-ER1159569 (Lot NB3142-62D) MORAb-009 maleimidă PEG2 val-cit-pAB 0,013 10,21 12,8 29,93 trastuzumab-ER1159569 trastuzumab maleimidă PEG2 val-cit-pAB 0,006 0,003 0,023 20,06 Toate valorile IC50 sunt în nM, şi reprezintă valorile medii ale experimentelor în replicat. SD - deviaţie standard.
2.1.1
2.3.1 Citotoxicitatea ADC pe bază de maleimidă
Toţi ADC MORAb-003 şi MORAb-009 pe bază de maleimidă au afişat citotoxi-citate specifică pe celulele IGROV1, cu o diferenţă de 2-3 ordine de mărime în potenţă observată între anticorpi. ADC MORAb-003 val-cit-pAB-eribulină au demonstrat o po-tenţă mai mare pe linia de celule IGROV1 decât oricare dintre ADC MORAb-003 PEG2 sau PEG4 non-scindabile, dar specificitatea de pliere nu a fost modificată. Tendinţe similare au fost observate pentru ADC-urile MORAb-009, cu ADC-urile MORAb-009 care nu pot fi scindate demonstrând citotoxicitate mai mică pe celulele IGROV1 decât ADC-urile MORAb-009 val-cit-pAB-eribulină.
ADC-urile MORAb-009 pe bază de maleimidă cu linkeri pe bază de disulfidil şi sulfonamidă au demonstrat o potenţă mai mare pe linia de celule NCI-H2110 decât pe linia de celule IGROV1. Acest lucru se poate datora instabilităţii potenţiale a linkerilor în cultură, aşa cum este descris mai jos. Citotoxicitatea puternică a fost observată, de asemenea, cu ADC-urile MORAb-003 corespunzătoare. În schimb, ADC-urile MORAb-003 şi MORAb-009 pe bază de maleimidă cu linkeri non-scindabili au demonstrat o potenţă relativ mică pe celulele NCI-H2110. Fără a fi legat de teorie, acest rezultat sugerează că, cu o exprimare a ţintei mai mică, scindarea eficientă şi eliberarea sarcinii utile pot îmbunătăţi citotoxicitatea.
ADC-urile cu un linker care poate fi scindat cu enzimă val-cit-pAB sau un linker care nu poate fi scindat au demonstrat niveluri scăzute de ucidere departe de ţintă pe celulele de control A431 (IC50 > 100 nM), în timp ce ADC-urile cu un linker care poate fi scindat cu enzimă ala-ala-asn-pAB au afişat uciderea slabă, dar detectabilă, a acestor celule de control. Acest lucru indică faptul că linkerii care pot fi scindaţi cu enzimă val-cit-pAB pot fi mai stabili în cultură decât linkerii care pot fi scindaţi cu enzimă ala-ala-asn-pAB. În plus, ADC MORAb-009 cu un distanţier PEG2 mai scurt au demonstrat citoxicitate mai mare în celulele IGROV1 decât ADC corespunzători cu un distanţier PEG8 mai lung. Aceeaşi tendinţă a fost observată în celulele NCI-H2110 atât pentru ADC-urile MORAb-003, cât şi MORAb-009, cu lungimi ale distanţierului mai scurte având ca rezultat citotoxicitate mai mare.
ADC cu linkeri pe bază de sulfonamidă au demonstrat, în general, valori DAR mai mari şi niveluri de agregat mai mici decât ADC corespunzători cu linkeri pe bază de disulfidil. Cu toate acestea, uciderea la nivel de nM a celulelor de control A431 a fost observată în amândouă aceste categorii de ADC, sugerând că linkerii pe bază de di-sulfidil şi sulfonamidă au fost mai puţin stabili în cultură decât linkerii care pot fi scindaţi de enzimă în condiţiile de analiză examinate.
Linker-toxina specifică maleimido-PEG2-val-cit-pAB-eribulină (VCP-eribulină) s-a examinat în continuare pentru specificitate şi potenţă pe diferite linii de celule de cancer gastric şi de sân. VCP-eribulina a fost conjugată la MORAb-003 şi MORAb-009, în plus faţă de anticorpul anti-her2 uman trastuzumab. MORAb-003-VCP-eribulina a demon-strat ucidere slabă, dar specifică, pe celulele NCI-N87, care exprimă niveluri scăzute de receptor alfa al folatului (FR), şi ucidere mică pe cele trei linii celulare FR-negative ră-mase. MORAb-009-VCP-eribulina a demonstrat, de asemenea, citotoxicitate puternică pe celulele NCI-N87, care exprimă niveluri moderate de mezotelină. Trastuzumab-VCP-eribulina a fost foarte puternică (3 - 6 pM, IC50) pe celulele NCI-N87 şi BT-474, cele două linii de celule care exprimă niveluri ridicate de her2 şi, de asemenea, puternică pe celulele de cancer de sân ZR-75, care exprimă doar moderat her2. ADC MORAb-003, MORAb-009 şi trastuzumab VCP-eribulină au demonstrat, toţi, citotoxicitate scăzută pe celulele NUGC3, care nu exprimă FR, mezotelină, sau her2, respectivii antigeni ţintă.
2.3.2 Citoxicitatea ADC pe bază de succinimidă
Tendinţele citotoxicităţii ADC pe bază de succinimidă au fost similare cu cele ale ADC pe bază de maleimidă pentru celulele IGROV1, cu ADC cu distanţier PEG8 de-monstrând citotoxicitate scăzută în plus faţă de valorile DAR scăzute. Citotoxicitate mai scăzută atât pe celulele IGROV1, cât şi pe celulele NCI-H2110 a fost observată în general pentru ADC pe bază de succinimidă cu linkeri care pot fi scindaţi cu enzimă în comparaţie cu ADC pe bază de maleimidă corespunzători, ceea ce s-a datorat cel mai probabil valorilor lor DAR mai mici. Uciderea departe de ţintă a celulelor A431 a fost observată, de asemenea, cu linkeri pe bază de disulfidil şi sulfonamidă, similar cu ADC pe bază de maleimidă corespunzători. Acest lucru indică o instabilitate crescută care ar putea să apară în mod potenţial din locul de clivaj, mai degrabă decât din chimia con-jugării.
Atunci când a fost efectuată o conjugare în două etape, au fost observate valori DAR mai mari în raport cu cele obţinute cu abordarea cu conjugare directă cu succi-nimidă. Aceste valori DAR mai mari s-au corelat cu o potenţă mai mare. Pentru ADC MORAb-003 VCP-eribulină a fost observată citotoxicitate puternică atât pe celulele IGROV1, cât şi pe celulele NCI-H2110. În timp ce ADC-urile MORAb-003 non-scindabili au demonstrat potenţă pe celulele IGROV1 (1 - 4 nM), aceştia erau încă mai puţin potenţi decât ADC MORAb-003 VCP-eribulină preparat cu această metodă (38 pM), chiar dacă valorile DAR au fost comparabile. În plus, ADC-urile MORAb-003 non-scindabile care s-au preparat utilizând metoda în două etape au fost uşor mai puţin potenţi decât ADC pe bază de maleimidă corespunzători pe linia de celule IGROV1, ceea ce se poate datora valorilor lor DAR mai mici. Similar cu omologii lor pe bază de maleimidă, ADC non-scindabili preparaţi folosind metoda în două etape au pierdut, de asemenea, aproape toată citotoxicitatea pe celulele NCI-2110.
2.4 Caracterizarea biofizică a ADC-urilor anti-mezotelină umană (LCcys80)
MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-eribulină (ER-001159569) s-a conjugat la opt anticorpi diferiţi anti-mezotelină umană (Tabelul 1). Afinităţile de legare ale anticorpilor parentali au fost determinate prin analiza BIAcore, aşa cum este descris mai sus în secţiunea 1.6.1. Nivelurile de agregare pentru toţi ADC anti-mezotelină umană au fost determinate prin SEC-HPLC şi DAR a fost analizat utilizând HIC-HPLC. Potenţa in vitro a fost eva-luată utilizând o analiză de citotoxicitate pe bază de celule cu violet de genţiană în celule A3 (A431 transfectate în mod stabil cu mezotelină umană (MSLN), MSLNhi), OVCAR3 (ovarian uman, MSLNhi), HEC-251 (endometroid uman, MSLNmed), H226 (mezoteliom pulmonar uman cu celule scuamoase, MSLNlo), şi A431 parental (MSLNneg). Rezultatele analizelor DAR, de agregare şi de citotoxicitate sunt arătate în Tabelul 50.
Tabelul 50. Caracterizarea biofizică a ADC-urilor anti-mezotelină umană (LCcys80)
MAb parental ADC Afinitate Sarcină utilă HIC SEC-HPLC Analiza de citotoxicitate pe bază de celule. EC50, nM ka (103M-1sec-1) kd (10-3sec-1) KD (10-9 M) Medicament-linker DAR % agregat % mono-mer A431 OVCAR3 HEC-251 H226 A3 33011 xi ER-001159569-000 1,92 8,97 91,03 40,67 0,008 3,950 > 100 0,14 zu 2,2 0,65 3,4 ER-001159569-000 1,69 1,42 98,58 -100 0,064 26,500 > 100 0,28 111B10 xi 6,5 3,9 6,3 ER-001159569-000 1,90 4,25 95,75 38,10 0,004 13,960 -100 0,05 zu 5,1 3 6,5 ER-001159569-000 1,81 3,64 96,36 68,92 0,014 27,42 > 100 0,12 201C15 xi 2,4 0,26 1,1 ER-001159569-000 1,85 1,62 98,38 48,50 0,004 14,82 -100 0,27 zu 3,1 1,1 4,2 ER-001159569-000 1,80 5,84 94,16 68,88 0,290 20,42 > 100 0,41 346C6 xi 3,8 0,49 1,4 ER-001159569-000 1,56 5,28 94,72 34,49 0,087 5,73 -100 0,11 zu 133 93 8,9 ER-00115969-000 1,63 4,48 95,52 72,86 1,180 32,54 > 100 0,55 Abrevieri: xi - chimeric; zu - umanizat.
Toţi ADC anti-mezotelină umană au păstrat niveluri de agregare scăzute (< 10% agregat) şi au demonstrat o potenţă ridicată pe liniile de celule ţintă. Pe A3 şi OVCAR3 a fost observată potenţă ridicată, în timp ce celulele HEC-251 şi H226 au fost relativ rezistente la citotoxicitatea ADC.
Secvenţe selectate:
ID. SECV. NR.: 1 (Lanţ greu (HC) MORAb-003)
ID. SECV. NR.: 2 (CDR1 HC MORAb-003; Kabat): GYGLS
ID. SECV. NR.: 3 (CDR2 HC MORAb-003; Kabat): MISSGGSYTYYADSVKG
ID. SECV. NR.: 4 (CDR3 HC MORAb-003; Kabat): HGDDPAWFAY
ID. SECV. NR.: 5 (Secvenţă de aminoacizi pre-proteică de lungime completă a lanţului greu MORAb-003; secvenţa lider subliniată)
ID. SECV. NR.: 6 (Lanţ uşor (LC) MORAb-003)
ID. SECV. NR.: 7 (CDR1 LC MORAb-003; Kabat): SVSSSISSNNLH
ID. SECV. NR.: 8 (CDR2 LC MORAb-003: Kabat): GTSNLAS
ID. SECV. NR.: 9 (CDR3 LC MORAb-003; Kabat): QQWSSYPYMYT
ID. SECV. NR.: 10 Secvenţă de aminoacizi pre-proteică de lungime completă a lanţului uşor MORAb-003 (secvenţa lider subliniată)
ID. SECV. NR.: 11 (nt HC MORAb-003)
ID. SECV. NR.: 12 (nt LC MORAb-003)
ID. SECV. NR.: 13 (CDR1 HC MORAb-003; IMGT): GFTFSGYG
ID. SECV. NR.: 14 (CDR2 HC MORAb-003; IMGT): ISSGGSYT
ID. SECV. NR.: 15 (CDR3 HC MORAb-003; IMGT): ARHGDDPAWFAY
ID. SECV. NR.: 16 (CDR1 LC MORAb-003; IMGT): SSISSNN
ID. SECV. NR.: 17 (CDR2 LC MORAb-003; IMGT): GTS
ID. SECV. NR.: 18 (CDR3 LC MORAb-003; IMGT): QQWSSYPYMYT
ID. SECV. NR.: 19 (FRA uman)
ID. SECV. NR.: 20 (nucleotidă de FRA uman)
ID. SECV. NR.: 21 (her2 uman)
ID. SECV. NR.: 22 (nucleotidă de her2 uman)
LISTA DE SECVENŢE
<110> EISAI CO., LTD.
EISAI INC.
MORPHOTEK, INC.
<120> CONJUGAŢI ANTICORP-MEDICAMENT PE BAZĂ DE ERIBULINĂ ŞI METODE DE UTILIZARE
<130> 08061,0024-00304
<140> PCT/US2017/020529
<141> 02-03-2017
<150> 62/302,562
<151> 02-03-2016
<160> 368
<170> PatentIn versiunea 3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 3
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 4
<210> 5
<211> 468
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 5
<210> 6
<211> 217
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 7
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 8
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 9
<210> 10
<211> 236
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 10
<210> 11
<211> 1407
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 11
<210> 12
<211> 711
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 12
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 13
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 14
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 16
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 17
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 18
<210> 19
<211> 257
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 982
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 1255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 3768
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 119
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 23
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 24
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 25
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 26
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 28
<210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 29
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 30
<210> 31
<211> 126
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 31
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 32
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 33
<210> 34
<211> 108
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 34
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 35
<210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 36
<210> 37
<211> 114
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 37
<210> 38
<211> 110
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 38
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 39
<210> 40
<211> 110
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 40
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 41
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 42
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 43
<210> 44
<211> 112
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 44
<210> 45
<211> 357
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 45
<210> 46
<211> 330
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 46
<210> 47
<211> 357
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 47
<210> 48
<211> 318
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 48
<210> 49
<211> 369
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 49
<210> 50
<211> 336
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 50
<210> 51
<211> 378
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 51
<210> 52
<211> 336
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 52
<210> 53
<211> 354
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 53
<210> 54
<211> 324
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 54
<210> 55
<211> 363
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 55
<210> 56
<211> 324
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 56
<210> 57
<211> 342
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 57
<210> 58
<211> 330
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 58
<210> 59
<211> 351
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 59
<210> 60
<211> 330
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 60
<210> 61
<211> 366
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 61
<210> 62
<211> 336
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 62
<210> 63
<211> 375
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 63
<210> 64
<211> 336
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 64
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 66
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 67
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 68
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 70
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 71
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 72
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 74
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 76
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 77
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 78
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 79
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 80
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 81
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 82
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 83
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 84
<210> 85
<211> 18
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 85
<210> 86
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 86
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 87
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 88
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 89
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 90
<210> 91
<211> 13
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 91
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 92
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 93
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 94
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 95
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 96
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 97
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 98
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 99
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 100
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 101
<210> 102
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 102
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 103
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 104
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 105
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 106
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 107
<210> 108
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 108
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 109
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 110
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 111
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 112
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 113
<210> 114
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 114
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 115
<210> 116
<211> 13
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 116
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 117
<210> 118
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 118
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 119
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 120
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 121
<210> 122
<211> 13
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 122
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 123
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 124
<210> 125
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 125
ggctatgggt tgtct 15
<210> 126
<211> 51
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 126
atgattagta gtggtggtag ttatacctac tatgcagaca gtgtgaaggg t 51
<210> 127
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 127
catggggacg atcccgcctg gttcgcttat 30
<210> 128
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 128
agtgtcagct caagtataag ttccaacaac ttgcac 36
<210> 129
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 129
ggcacatcca acctggcttc t 21
<210> 130
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 130
caacagtgga gtagttaccc gtacatgtac acg 33
<210> 131
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 131
ggctacacca tgaac 15
<210> 132
<211> 51
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 132
cttattactc cttacaatgg tgcttctagc tacaaccaga agttcagggg c 51
<210> 133
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 133
gggggttacg acgggagggg ttttgactac 30
<210> 134
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 134
agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac 30
<210> 135
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 135
gacacatcca aactggcttc t 21
<210> 136
<211> 27
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 136
cagcagtgga gtaagcaccc tctcacg 27
<210> 137
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 137
agcgatgcaa taagc 15
<210> 138
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 138
atcattaatg gtggtggtaa cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48
<210> 139
<211> 54
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 139
ggcattcaac atggtggtgg taatagtgat tattattatt acggcatgga cctc 54
<210> 140
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 140
caggccagtc agagcattag tagtgtcttg tcc 33
<210> 141
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 141
ctggcatcca ctctggcatc t 21
<210> 142
<211> 42
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 142
caaaccaatt atggtactag tagtagtaat tatggttttg ct 42
<210> 143
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 143
tccgacgcga ttagc 15
<210> 144
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 144
atcatcaacg gcggcggaaa cacctactac gcctcctggg ccaagggc 48
<210> 145
<211> 54
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 145
ggcatccagc acggtggtgg aaacagcgac tactactact atgggatgga tctg 54
<210> 146
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 146
caggcgtccc agtcaattag cagcgtgctc tcc 33
<210> 147
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 147
ttggcctcca ctctggcctc g 21
<210> 148
<211> 42
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 148
caaaccaact acggaacctc cagctccaac tacggctttg cc 42
<210> 149
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 149
aactatgcaa tgagc 15
<210> 150
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 150
tccattagta ctggtggtct cgcattctac gcgaactggg caaaaggc 48
<210> 151
<211> 39
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 151
aatggtggtg gtagttatat tttctattat tttgacttg 39
<210> 152
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 152
caggccagtc agagcattag tagttactta tcc 33
<210> 153
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 153
tctgcatcca ctctggcatc t 21
<210> 154
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 154
caaagctatt atgatattgg tactagtact 30
<210> 155
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 155
aactacgcca tgtcc 15
<210> 156
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 156
tccatcagca caggcggcct ggccttctac gccaattggg ccaagggc 48
<210> 157
<211> 39
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 157
aacggcggag gctcctacat cttctactac ttcgacctg 39
<210> 158
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 158
caggcctccc agtccatctc ctcctacctg tcc 33
<210> 159
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 159
tctgcctcca cactggcctc c 21
<210> 160
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 160
cagtcctact acgacatcgg cacctccacc 30
<210> 161
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 161
agctatgcaa tgggc 15
<210> 162
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 162
accattaata ttggtggtcg cgtatattac gcgagctggg caaaaggc 48
<210> 163
<211> 27
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 163
tattataatg gtggtagtta tgacatc 27
<210> 164
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 164
caggccagtg agagcattta tcgcgtattg gcc 33
<210> 165
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 165
gatacatcca ctctggcatc t 21
<210> 166
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 166
caaggcggtt attatgctga tagttatggt attgct 36
<210> 167
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 167
tcctacgcta tgggc 15
<210> 168
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 168
accatcaaca tcggcggcag agtgtactac gcctcctggg ccaagggc 48
<210> 169
<211> 27
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 169
tactacaacg gcggctccta cgatatc 27
<210> 170
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 170
caggcctccg agtccatcta ccgggtgctg gcc 33
<210> 171
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 171
gacaccagca cactggcctc c 21
<210> 172
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 172
cagggcggct actacgccga ctcctacgga atcgct 36
<210> 173
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 173
agttatgcaa tgatc 15
<210> 174
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 174
accattagta ctggtggtat cacatactac gcgagctggg cgaaaggc 48
<210> 175
<211> 51
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 175
gggggatatg ctgctagtag tgcttattat ctcccgtact actttgactt g 51
<210> 176
<211> 39
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 176
cagtcctccc agtccgtgta taacaacaac aacctggcc 39
<210> 177
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 177
ctggcatcca ctctggcatc t 21
<210> 178
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 178
ctaggtggtt gtgatgatga tgctgatact tttgct 36
<210> 179
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 179
tcctacgcta tgatc 15
<210> 180
<211> 48
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 180
accatctcta ccggcggaat tacctactac gcctcctggg ccaagggc 48
<210> 181
<211> 51
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 181
ggcggctacg ccgccagctc cgcttactac ctgccctact acttcgacct g 51
<210> 182
<211> 39
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 182
cagtcctccc agtccgtgta taacaacaac aacctggcc 39
<210> 183
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 183
ctggcctcca cactggcctc t 21
<210> 184
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 184
ctgggcggct gcgacgacga cgccgatacc tttgct 36
<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 185
<210> 186
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 186
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 187
<210> 188
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 188
<210> 189
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 189
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 190
<210> 191
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 191
<210> 192
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 192
<210> 193
<211> 13
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 193
<210> 194
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 194
<210> 195
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 195
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 196
<210> 197
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 197
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 198
<210> 199
<211> 20
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 199
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 200
<210> 201
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 201
<210> 202
<211> 14
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 202
<210> 203
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 203
<210> 204
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 204
<210> 205
<211> 20
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 205
<210> 206
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 206
<210> 207
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 207
<210> 208
<211> 14
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 208
<210> 209
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 209
<210> 210
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 210
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 211
<210> 212
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 212
<210> 213
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 213
<210> 214
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 214
<210> 215
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 215
<210> 216
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 216
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 217
<210> 218
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 218
<210> 219
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 219
<210> 220
<211> 10
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 220
<210> 221
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 221
<210> 222
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 222
<210> 223
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 223
<210> 224
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 224
<210> 225
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 225
<210> 226
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 226
<210> 227
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 227
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 228
<210> 229
<211> 11
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 229
<210> 230
<211> 6
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 230
<210> 231
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 231
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 232
<210> 233
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 233
<210> 234
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 234
<210> 235
<211> 19
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 235
<210> 236
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 236
<210> 237
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 237
<210> 238
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 238
<210> 239
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 239
<210> 240
<211> 7
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 240
<210> 241
<211> 19
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 241
<210> 242
<211> 8
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 242
<210> 243
<211> 3
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 243
<210> 244
<211> 12
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 244
<210> 245
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 245
ggcttcacct tcagcggcta tggg 24
<210> 246
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 246
attagtagtg gtggtagtta tacc 24
<210> 247
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 247
gcaagacatg gggacgatcc cgcctggttc gcttat 36
<210> 248
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 248
tcaagtataa gttccaacaa c 21
<210> 249
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 249
ggcacatcc 9
<210> 250
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 250
caacagtgga gtagttaccc gtacatgtac acg 33
<210> 251
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 251
ggttactcat tcactggcta cacc 24
<210> 252
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 252
attactcctt acaatggtgc ttct 24
<210> 253
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 253
gcaagggggg gttacgacgg gaggggtttt gactac 36
<210> 254
<211> 15
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 254
tcaagtgtaa gttac 15
<210> 255
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 255
gacacatcc 9
<210> 256
<211> 27
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 256
cagcagtgga gtaagcaccc tctcacg 27
<210> 257
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 257
ggaatctccc tcagtagcga tgca 24
<210> 258
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 258
attaatggtg gtggtaacac a 21
<210> 259
<211> 60
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 259
gccagaggca ttcaacatgg tggtggtaat agtgattatt attattacgg catggacctc 60
<210> 260
<211> 18
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 260
cagagcatta gtagtgtc 18
<210> 261
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 261
ctggcatct 9
<210> 262
<211> 42
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 262
caaaccaatt atggtactag tagtagtaat tatggttttg ct 42
<210> 263
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 263
ggaatttccc tctcctccga cgcg 24
<210> 264
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 264
atcaacggcg gcggaaacac c 21
<210> 265
<211> 60
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 265
gcgcgcggca tccagcacgg tggtggaaac agcgactact actactatgg gatggatctg 60
<210> 266
<211> 18
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 266
cagtcaatta gcagcgtg 18
<210> 267
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 267
ttggcctcc 9
<210> 268
<211> 42
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 268
caaaccaact acggaacctc cagctccaac tacggctttg cc 42
<210> 269
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 269
ggattctccc tcaataacta tgca 24
<210> 270
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 270
attagtactg gtggtctcgc a 21
<210> 271
<211> 45
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 271
ggcagaaatg gtggtggtag ttatattttc tattattttg acttg 45
<210> 272
<211> 18
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 272
cagagcatta gtagttac 18
<210> 273
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 273
tctgcatcc 9
<210> 274
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 274
caaagctatt atgatattgg tactagtact 30
<210> 275
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 275
ggcttctccc tgaacaacta cgcc 24
<210> 276
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 276
atcagcacag gcggcctggc c 21
<210> 277
<211> 45
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 277
gccagaaacg gcggaggctc ctacatcttc tactacttcg acctg 45
<210> 278
<211> 18
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 278
cagtccatct cctcctac 18
<210> 279
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 279
tctgcctcc 9
<210> 280
<400> 280
000
<210> 281
<400> 281
000
<210> 282
<400> 282
000
<210> 283
<400> 283
000
<210> 284
<400> 284
000
<210> 285
<400> 285
000
<210> 286
<400> 286
000
<210> 287
<400> 287
000
<210> 288
<400> 288
000
<210> 289
<400> 289
000
<210> 290
<400> 290
000
<210> 291
<400> 291
000
<210> 292
<400> 292
000
<210> 293
<400> 293
000
<210> 294
<400> 294
000
<210> 295
<400> 295
000
<210> 296
<400> 296
000
<210> 297
<400> 297
000
<210> 298
<400> 298
000
<210> 299
<400> 299
000
<210> 300
<211> 30
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 300
cagtcctact acgacatcgg cacctccacc 30
<210> 301
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 301
ggaatcgacc tcagtagcta tgca 24
<210> 302
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 302
attaatattg gtggtcgcgt a 21
<210> 303
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 303
gccagatatt ataatggtgg tagttatgac atc 33
<210> 304
<211> 18
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 304
gagagcattt atcgcgta 18
<210> 305
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 305
gatacatcc 9
<210> 306
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 306
caaggcggtt attatgctga tagttatggt attgct 36
<210> 307
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 307
ggaatcgacc tgtcctccta cgct 24
<210> 308
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 308
atcaacatcg gcggcagagt g 21
<210> 309
<211> 33
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 309
gcccggtact acaacggcgg ctcctacgat atc 33
<210> 310
<211> 18
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 310
gagtccatct accgggtg 18
<210> 311
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 311
gacaccagc 9
<210> 312
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 312
cagggcggct actacgccga ctcctacgga atcgct 36
<210> 313
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 313
ggattctccc tcagtagtta tgca 24
<210> 314
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 314
attagtactg gtggtatcac a 21
<210> 315
<211> 57
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 315
gccagagggg gatatgctgc tagtagtgct tattatctcc cgtactactt tgacttg 57
<210> 316
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 316
cagagtgttt ataataataa caac 24
<210> 317
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 317
ctggcatcc 9
<210> 318
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 318
ctaggtggtt gtgatgatga tgctgatact tttgct 36
<210> 319
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 319
ggcttctccc tgtcctccta cgct 24
<210> 320
<211> 21
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 320
atctctaccg gcggaattac c 21
<210> 321
<211> 57
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 321
gctagaggcg gctacgccgc cagctccgct tactacctgc cctactactt cgacctg 57
<210> 322
<211> 24
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 322
cagtccgtgt ataacaacaa caac 24
<210> 323
<211> 9
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 323
ctggcctcc 9
<210> 324
<211> 36
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Oligonucleotidă sintetică"
<400> 324
ctgggcggct gcgacgacga cgccgatacc tttgct 36
<210> 325
<211> 449
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 325
<210> 326
<211> 213
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 326
<210> 327
<211> 451
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 327
<210> 328
<211> 214
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 328
<210> 329
<211> 453
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 329
<210> 330
<211> 219
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 330
<210> 331
<211> 456
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 331
<210> 332
<211> 219
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 332
<210> 333
<211> 448
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 333
<210> 334
<211> 215
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 334
<210> 335
<211> 451
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 335
<210> 336
<211> 215
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 336
<210> 337
<211> 444
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 337
<210> 338
<211> 217
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 338
<210> 339
<211> 447
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 339
<210> 340
<211> 217
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 340
<210> 341
<211> 452
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 341
<210> 342
<211> 219
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 342
<210> 343
<211> 455
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 343
<210> 344
<211> 219
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polipeptidă sintetică"
<400> 344
<210> 345
<211> 1350
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 345
<210> 346
<211> 654
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 346
<210> 347
<211> 1350
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 347
<210> 348
<211> 642
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 348
<210> 349
<211> 1362
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 349
<210> 350
<211> 660
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 350
<210> 351
<211> 1371
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 351
<210> 352
<211> 660
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 352
<210> 353
<211> 1347
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 353
<210> 354
<211> 648
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 354
<210> 355
<211> 1356
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 355
<210> 356
<211> 648
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 356
<210> 357
<211> 1335
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 357
<210> 358
<211> 654
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 358
<210> 359
<211> 1344
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 359
<210> 360
<211> 654
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 360
<210> 361
<211> 1359
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 361
<210> 362
<211> 660
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 362
<210> 363
<211> 1368
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 363
<210> 364
<211> 660
<212> ADN
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Polinucleotidă sintetică"
<400> 364
<210> 365
<211> 4
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 365
<210> 366
<211> 13
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 366
<210> 367
<211> 4
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 367
<210> 368
<211> 4
<212> PRT
<213> Secvenţă artificială
<220>
<221> sursă
<223> /notă="Descrierea secvenţei artificiale: Peptidă sintetică"
<400> 368

Claims (13)

1. Conjugat anticorp-medicament cu Formula (I):
Ab-(L-D)p (I) în care (i) Ab este un anticorp alfa al receptorului anti-folat de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând sec-venţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 2 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 3 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 4 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a com-plementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 7 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 8 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 9 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei re-giuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 13 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 14 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 15 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a com-plementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 16 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 17 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 18 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; (ii) D este eribulină; (iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi (iv) p este un număr întreg de la 1 până la 8.
2. Conjugat anticorp-medicament conform revendicării 1, în care anticorpul sau frag-mentul de legare la antigen cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24.
3. Conjugat anticorp-medicament conform revendicării 1 sau revendicării 2, în care p este un număr întreg de la 3 la 4.
4. Conjugat anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde un domeniu constant al lanţului greu de IgG1 umană şi un domeniu constant al lanţului uşor kappa de Ig umană.
5. Compoziţie care cuprinde mai multe copii ale conjugatului anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4, în care p mediu al conjugaţilor anticorp-medicament în compoziţie este de la aproximativ 3,2 până la aproximativ 3,8 sau de la aproximativ 3,6 până la aproximativ 4,4.
6. Conjugat anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4 sau compoziţie conform revendicării 5 pentru utilizare în tratamentul unui cancer care ex-primă receptorul alfa al folatului.
7. Conjugat anticorp-medicament pentru utilizare conform revendicării 6, unde cancerul este un cancer gastric, un cancer ovarian seros, un cancer ovarian cu celule clare, un cancer pulmonar cu celule non-mici, un cancer colorectal, un cancer mamar triplu ne-gativ, un cancer endometrial, un cancer endometrial seros, un carcinoid pulmonar, sau un osteosarcom.
8. Compoziţie farmaceutică ce cuprinde conjugatul anticorp-medicament conform ori-căreia dintre revendicările 1 până la 4 sau compoziţia conform revendicării 5, şi un transportor acceptabil din punct de vedere farmaceutic.
9. Metodă pentru producerea conjugatului anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4 sau compoziţiei conform revendicării 5, care cuprinde punerea în reacţie a unui anticorp sau a unui fragment de legare la antigen cu un linker care poate fi scindat legat la eribulină în condiţii care permit conjugare.
10. Metodă pentru a determina dacă un pacient va răspunde la tratamentul cu conju-gatul anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4 sau com-poziţia conform revendicării 5, cuprinzând furnizarea unei probe biologice de la pacient şi punerea în contact a probei biologice cu conjugatul anticorp-medicament conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4 sau compoziţia conform revendicării 5.
11. Metodă conform revendicării 10, în care proba biologică este o biopsie tumorală de la un cancer gastric, un cancer ovarian seros, un cancer ovarian cu celule clare, un cancer pulmonar cu celule non-mici, un cancer colorectal, un cancer mamar triplu ne-gativ, un cancer endometrial, un cancer endometrial seros, un carcinoid pulmonar, sau un osteosarcom.
12. Compoziţie care cuprinde mai multe copii ale unui conjugat anticorp-medicament cu Formula (I):
Ab-(L-D)p (I) în care (i) Ab este un anticorp alfa al receptorului anti-folat de internalizare sau fragment de legare la antigen de internalizare al acestuia care cuprinde trei regiuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând sec-venţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 2 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 3 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 4 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a com-plementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 7 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 8 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 9 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare Kabat; sau trei re-giuni de determinare a complementarităţii ale lanţului greu (HCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 13 (HCDR1), ID. SECV. NR.: 14 (HCDR2), şi ID. SECV. NR.: 15 (HCDR3); şi trei regiuni de determinare a com-plementarităţii ale lanţului uşor (LCDR-uri) cuprinzând secvenţele de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 16 (LCDR1), ID. SECV. NR.: 17 (LCDR2), şi ID. SECV. NR.: 18 (LCDR3), aşa cum este definit de sistemul de numerotare IMGT; (ii) D este eribulină; (iii) L este un linker care poate fi scindat care cuprinde Mal-(PEG)2-Val-Cit-pAB; şi (iv) p este numărul mediu de porţiuni indivizibile -L-D per Ab, unde p mediu al conjugaţilor anticorp-medicament în compoziţie este de la aproximativ 3,6 până la aproximativ 4,4.
13. Compoziţie conform revendicării 12, în care anticorpul sau fragmentul de legare la antigen cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de ami-noacizi având ID. SECV. NR.: 23, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o secvenţă de aminoacizi având ID. SECV. NR.: 24.
MDE20190061T 2016-03-02 2017-03-02 Conjugați anticorp-medicament pe bază de eribulină și metode de utilizare MD3423105T2 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662302562P 2016-03-02 2016-03-02
PCT/US2017/020529 WO2017151979A1 (en) 2016-03-02 2017-03-02 Eribulin-based antibody-drug conjugates and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3423105T2 true MD3423105T2 (ro) 2021-10-31

Family

ID=58347964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20190061T MD3423105T2 (ro) 2016-03-02 2017-03-02 Conjugați anticorp-medicament pe bază de eribulină și metode de utilizare

Country Status (35)

Country Link
US (4) US10548986B2 (ro)
EP (2) EP3824909A1 (ro)
JP (6) JP6599019B2 (ro)
KR (4) KR102702620B1 (ro)
CN (4) CN114272389B (ro)
AR (3) AR107787A1 (ro)
AU (1) AU2017225982B2 (ro)
BR (1) BR112018067379A2 (ro)
CA (1) CA3013791A1 (ro)
CL (3) CL2018002456A1 (ro)
CO (1) CO2018008667A2 (ro)
CY (1) CY1124628T1 (ro)
DK (1) DK3423105T3 (ro)
ES (1) ES2880402T3 (ro)
HR (1) HRP20211125T1 (ro)
HU (1) HUE054726T2 (ro)
IL (3) IL292946B2 (ro)
JO (3) JOP20170053B1 (ro)
LT (1) LT3423105T (ro)
MA (1) MA45280B1 (ro)
MD (1) MD3423105T2 (ro)
MX (4) MX2018010562A (ro)
MY (2) MY199595A (ro)
PE (3) PE20181953A1 (ro)
PH (1) PH12018501847A1 (ro)
PL (1) PL3423105T3 (ro)
PT (1) PT3423105T (ro)
RS (1) RS62108B1 (ro)
RU (1) RU2754369C2 (ro)
SG (2) SG10202007520WA (ro)
SI (1) SI3423105T1 (ro)
SM (1) SMT202100416T1 (ro)
TW (3) TWI825834B (ro)
UA (1) UA125024C2 (ro)
WO (1) WO2017151979A1 (ro)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009521206A (ja) * 2005-04-22 2009-06-04 モルフォテック、インク． 免疫エフェクター活性を有する葉酸受容体アルファ陽性細胞に内部移行する抗体
US11130815B2 (en) 2015-06-24 2021-09-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Fusion proteins containing a BDNF and an anti-human transferrin receptor antibody
KR20250073514A (ko) * 2015-06-24 2025-05-27 제이씨알 파마 가부시키가이샤 혈액뇌관문을 통과하는 항인간 트랜스페린 수용체 항체
WO2018124107A1 (ja) 2016-12-26 2018-07-05 Ｊｃｒファーマ株式会社 Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質
TWI761413B (zh) 2016-12-26 2022-04-21 日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司 通過血腦障壁之新穎抗人類運鐵蛋白受體抗體
JP7168580B2 (ja) 2017-04-05 2022-11-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 大環状化合物およびその使用
BR112020000141A2 (pt) 2017-07-06 2020-07-14 President And Fellows Of Harvard College síntese de halicondrinas
US11498892B2 (en) 2017-07-06 2022-11-15 President And Fellows Of Harvard College Fe/Cu-mediated ketone synthesis
CA3081539A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-16 Yafei Shanghai Biolog Medicine Science & Technology Co., Ltd. Conjugates of biomolecule and use thereof
WO2019099646A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic compounds and uses thereof
US12172986B2 (en) 2018-06-01 2024-12-24 Eisai R&D Management Co., Ltd Splicing modulator antibody-drug conjugates and methods of use
US11998544B2 (en) 2018-06-01 2024-06-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of using splicing modulators
KR20210042120A (ko) 2018-08-06 2021-04-16 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트와 튜불린 저해제의 조합
PE20211296A1 (es) * 2018-12-21 2021-07-20 Novartis Ag Anticuerpos anti-pmel17 y conjugados de los mismos
CN110568121A (zh) * 2019-07-11 2019-12-13 山东省药学科学院 一种艾日布林及含艾日布林的制剂中有关物质的检测方法
MY209745A (en) 2019-11-07 2025-07-31 Eisai R&D Man Co Ltd Anti-mesothelin eribulin antibody-drug conjugates and methods of use
CA3164797A1 (en) * 2019-12-23 2021-07-01 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method of producing eribulin based antibody-drug conjugate
MX2022009044A (es) * 2020-01-22 2022-08-11 Shanghai Senhui Medicine Co Ltd Conjugado de farmaco de derivado de eribulin, metodo de preparacion y aplicacion del mismo en medicina.
CN113274507B (zh) * 2020-02-20 2025-02-28 亚飞（上海）生物医药科技有限公司 靶向递送和激活的免疫刺激性偶联复合物的制备和用途
CN113509557A (zh) * 2020-04-09 2021-10-19 嘉兴优博生物技术有限公司 靶向蛋白酶降解平台(ted)
BR112022024833A2 (pt) 2020-06-05 2023-02-14 Eisai R&D Man Co Ltd Conjugados anticorpo anti-bcma-fármaco e métodos de uso
KR102810379B1 (ko) * 2020-08-07 2025-05-21 주식회사 피노바이오 데옥시사이티딘계 항암제 및 실릴 에테르 함유 링커를 포함하는 접합체 및 이의 용도
WO2022056278A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-ceruloplasmin antibodies and uses thereof
JP7759668B2 (ja) * 2020-09-28 2025-10-24 ナヴロジェン インコーポレイテッド がん治療のための代替的にフォーマット化された抗メソテリン抗体の組成物及び使用
EP4228705A1 (en) * 2020-10-18 2023-08-23 Ardeagen Corporation Anti-msln binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
CN114560940B (zh) * 2020-11-27 2023-07-14 缔码生物科技(武汉)有限公司 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用
KR20230117182A (ko) * 2020-12-04 2023-08-07 다인 세라퓨틱스, 인크. 항체-올리고뉴클레오티드 복합체 및 그의 용도
EP4241789A4 (en) * 2020-12-08 2025-04-02 Nona Biosciences (Shanghai) Co., Ltd. Protein-drug conjugate and site-specific conjugation method
US20230390411A1 (en) * 2021-01-28 2023-12-07 Nanjing Chempion Biotechnology Co., Ltd. Conjugate and use thereof
AU2022253902A1 (en) * 2021-04-10 2023-11-02 Genmab A/S Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2022253284A1 (zh) * 2021-06-02 2022-12-08 百奥泰生物制药股份有限公司 药物偶联物及其用途
JP2024525854A (ja) * 2021-07-22 2024-07-12 上海森▲輝▼医▲葯▼有限公司 エリブリン誘導体の薬物複合体
CN118043080A (zh) * 2021-08-13 2024-05-14 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种基于微管抑制剂的抗体偶联药物
JP2024532295A (ja) * 2021-08-24 2024-09-05 クンシャン シンユンター バイオテック カンパニー，リミティド 切断可能なリンカーを介して結合した抗体薬物複合体
CN117642186A (zh) * 2021-09-16 2024-03-01 正大天晴药业集团股份有限公司 抗her2抗体药物偶联物及其组合物和用途
WO2023055376A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Virtuoso Binco, Inc. Multispecific antibodies for targeting cd47 and icam1 and methods of use thereof
WO2023061466A1 (zh) * 2021-10-14 2023-04-20 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种艾日布林衍生物的制备方法
JP2024541058A (ja) 2021-11-03 2024-11-06 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ． 抗体の特異的共役
WO2023098691A1 (zh) * 2021-12-01 2023-06-08 上海生物制品研究所有限责任公司 抗体药物偶联物及其用途
EP4445919A1 (en) * 2021-12-09 2024-10-16 Kunshan Xinyunda Biotech Co., Ltd. Antibody-drug conjugate having improved affinity, and preparation method therefor and application thereof
WO2023124963A1 (zh) * 2021-12-27 2023-07-06 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种可逆反应减少的抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
WO2023143319A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 启德医药科技（苏州）有限公司 抗体药物偶联物、药物组合物及用途
WO2023143320A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 用于制备抗体药物偶联物的连接子、化合物及用途
WO2023155808A1 (zh) * 2022-02-16 2023-08-24 苏州宜联生物医药有限公司 抗体-艾日布林或其衍生物的偶联物、其中间体、制备方法、药物组合物和用途
CA3245732A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Mablink Bioscience ANTIBODY-DRUG CONJUGATIONS AND THEIR USES
CA3247662A1 (en) * 2022-04-12 2023-10-19 Eisai R & D Management Co., Ltd. Eribulin-based antibody-drug conjugates and methods of use
EP4509141A1 (en) * 2022-04-12 2025-02-19 Bio-Thera Solutions, Ltd. Method for treating her2-positive solid tumor
WO2024078612A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Genequantum Healthcare (Suzhou) Co., Ltd. Linker-payload compound, conjugates and applications thereof
CN117917248A (zh) 2022-10-20 2024-04-23 英诺湖医药(杭州)有限公司 酶裂解连接子及包含其的配体-艾瑞布林偶联物
WO2024107780A2 (en) * 2022-11-14 2024-05-23 Cornell University Anionically functionalized polypeptides, and methods of making same and uses thereof
TW202434308A (zh) * 2023-01-17 2024-09-01 大陸商成都百利多特生物藥業有限責任公司 一種艾日布林類藥物的偶聯物
EP4653012A1 (en) 2023-01-19 2025-11-26 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing eribulin derivative drug conjugate
WO2024173281A1 (en) * 2023-02-13 2024-08-22 Bliss Biopharmaceutical (Hangzhou) Co., Ltd. Antibody-drug conjugate for cancer treatment
TW202448519A (zh) * 2023-05-12 2024-12-16 大陸商蘇州宜聯生物醫藥有限公司 多彈頭抗體偶聯藥物及其製備方法和用途
CN120957757A (zh) * 2023-05-12 2025-11-14 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 大环类药物偶联物及其制备方法和用途
CN120957758A (zh) * 2023-05-12 2025-11-14 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 大环化合物及其制备方法和用途
JP2024165695A (ja) 2023-05-18 2024-11-28 セイコーエプソン株式会社 印刷方法、印刷ヘッドユニットおよびロボットシステム
US12319747B2 (en) 2023-07-03 2025-06-03 Medicovestor, Inc. Methods of using anti-SP17 immunotherapeutics
WO2025027529A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Advesya Anti-il-1rap antibody drug conjugates and methods of use thereof
WO2025078841A2 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Antikor Biopharma Limited Antibodies, conjugates, and uses thereof
TW202518024A (zh) 2023-10-13 2025-05-01 日商衛材R&D企管股份有限公司 抗體－藥物軛合物代謝物
TW202530697A (zh) 2023-10-13 2025-08-01 日商衛材R&D企管股份有限公司 用於基於艾日布林之抗體－藥物結合物之生物標記及使用方法
US12364777B2 (en) 2023-10-20 2025-07-22 Medicovestor, Inc. Homodimeric antibodies for use in treating cancers and methods of use
WO2025106586A1 (en) * 2023-11-13 2025-05-22 Luxvitae Therapeutics Inc. Macrocyclic ketone compounds and applications thereof
CN120131991A (zh) * 2023-12-13 2025-06-13 成都百利多特生物药业有限责任公司 抗人Claudin18.2抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
WO2025126157A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Advesya Anti-il-1rap binding domains and antibody-drug conjugates thereof
US12116410B1 (en) 2023-12-26 2024-10-15 Medicovestor, Inc. Methods of manufacturing dimeric antibodies
WO2025162492A1 (zh) * 2024-01-29 2025-08-07 甘李药业股份有限公司 一种连接子、配体-药物偶联物及其医药用途
US12258396B1 (en) 2024-02-02 2025-03-25 Medicovestor, Inc. Methods of using immunotherapeutics that bind folate receptor alpha
US12378314B1 (en) 2024-02-02 2025-08-05 Medicovestor, Inc. Proteins that bind folate receptor alpha including fully-human antibodies
US12240900B1 (en) 2024-02-02 2025-03-04 Medicovestor, Inc. Nucleic acids, vectors, and cells that encode antibodies and other proteins that bind folate receptor alpha
WO2025199464A1 (en) 2024-03-22 2025-09-25 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-trop2 antibody-drug conjugates and methods of use
WO2025228172A1 (zh) * 2024-04-28 2025-11-06 上海拓济医药有限责任公司 艾日布林衍生物及其抗体药物偶联物和医药用途

Family Cites Families (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
FI102355B1 (fi) 1988-02-11 1998-11-30 Bristol Myers Squibb Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
ATE221379T1 (de) 1991-05-01 2002-08-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur behandlung infektiöser respiratorischer erkrankungen
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
DE69626849T2 (de) 1995-12-22 2003-12-24 Bristol-Myers Squibb Co., Princeton Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
AU747231B2 (en) 1998-06-24 2002-05-09 Alkermes, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US6019963A (en) 1998-11-20 2000-02-01 D.S.C. Products, Inc. Deodorizing composition containing tea tree and eucalyptus oils
US7109019B2 (en) 1999-01-06 2006-09-19 The Regents Of The University Of California Gene cluster for production of the enediyne antitumor antibiotic C-1027
RU2316349C2 (ru) 2001-05-02 2008-02-10 Пердью Рисерч Фаундейшн Лечение и диагностика заболеваний, опосредованных макрофагами
US7297511B2 (en) 2001-10-10 2007-11-20 Neose Technologies, Inc. Interferon alpha: remodeling and glycoconjugation of interferon alpha
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7265085B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7226903B2 (en) 2001-10-10 2007-06-05 Neose Technologies, Inc. Interferon beta: remodeling and glycoconjugation of interferon beta
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7399613B2 (en) 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7265084B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7439043B2 (en) 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
US20050171014A1 (en) 2002-02-27 2005-08-04 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health Conjugates of ligand linker and cytotoxic agent and related composition and methods of use
JP4741838B2 (ja) * 2002-07-31 2011-08-10 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 癌、自己免疫疾患または感染症を治療するための薬物結合体およびその使用
JP2004119755A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Alps Electric Co Ltd 磁気検出素子及びその製造方法
US20040071540A1 (en) 2002-10-15 2004-04-15 Lucas Philip J. Disposable/recyclable pallet system and method
US20080025989A1 (en) 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
CA2538570A1 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Combinatorx, Incorporated Combinations of drugs for the treatment of neoplasms
US6997024B2 (en) 2003-10-01 2006-02-14 Truth Hardware Corporation Pull door lock
US8012944B2 (en) 2003-10-30 2011-09-06 Pharmascience Inc. Method for treating cancer using IAP antisense oligomer and chemotherapeutic agent
US20050148535A1 (en) 2003-10-30 2005-07-07 Lacasse Eric IAP nucleobase oligomers and oligomeric complexes and uses thereof
WO2005080431A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
US7117807B2 (en) 2004-02-17 2006-10-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Dynamically modifiable polymer coatings and devices
US20080253960A1 (en) 2004-04-01 2008-10-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Center For Technology Transfer Lipoprotein-Based Nanoplatforms
AU2005247346A1 (en) 2004-05-07 2005-12-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for cancer treatment relating to BRCA1 BRCT domain recognition of phosphorylated BACH1
HUE046436T2 (hu) 2004-06-03 2020-02-28 Eisai R&D Man Co Ltd Köztitermékek halikondrin B elõállításához
EP3088004B1 (en) 2004-09-23 2018-03-28 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US20060148014A1 (en) 2004-12-09 2006-07-06 Sergei Agoulnik Tubulin isotype screening in cancer therapy using hemiasterlin analogs
JP2008522623A (ja) 2004-12-09 2008-07-03 エーザイ株式会社 ハリコンドリンｂアナログを使用した癌治療でのチューブリンアイソタイプのスクリーニング
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
CA2614436C (en) 2005-07-07 2016-05-17 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
GB0515025D0 (en) 2005-07-21 2005-08-31 Novartis Ag Organic compounds
EP2374480A3 (en) 2005-08-19 2013-05-01 Endocyte, Inc. Mutli-drug ligand conjugates
US8129505B2 (en) 2005-09-14 2012-03-06 Ucb Pharma S.A. Comb polymers
EP1968607B1 (en) 2005-12-02 2014-01-15 Nabil Habib Lab Treatment of cancer and other diseases
WO2007128884A1 (en) 2006-05-09 2007-11-15 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers in type 2 diabetes and obesity
US20140037539A1 (en) 2012-07-27 2014-02-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Antibody cocktails for breast cancer radioimmunotherapy
US20150030534A1 (en) 2013-07-26 2015-01-29 Rutgers, The State University Of New Jersey Antibody cocktails for breast cancer radioimmunotherapy
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
WO2008101231A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Endocyte, Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease
NZ599239A (en) 2007-03-14 2013-10-25 Endocyte Inc Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
EP1977765A1 (en) 2007-04-03 2008-10-08 Diatos Peptide prodrugs
US8093410B2 (en) 2007-10-03 2012-01-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Intermediates and methods for the synthesis of halichondrin B analogs
JP5606916B2 (ja) * 2007-10-19 2014-10-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗ｔｅｎｂ２抗体および抗体薬物結合体
JP5065228B2 (ja) 2007-10-30 2012-10-31 富士通株式会社 携帯端末装置
EP2842575B1 (en) 2008-03-18 2017-09-27 Seattle Genetics, Inc. Auristatin drug linker conjugates
EP2279267A4 (en) 2008-03-27 2012-01-18 Vascular Biosciences Inc METHOD FOR IDENTIFYING NEW THERAPY CANDIDATES ON GENE EXPRESSION ANALYSIS IN DISEASES RELATED TO VACCINES
US20100260668A1 (en) 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP2899209A1 (en) 2008-04-29 2015-07-29 Abbvie Inc. Dual Variable Domain Immunoglobulins and uses thereof
CN102083461B (zh) * 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
EP2297208A4 (en) 2008-06-03 2012-07-11 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
BRPI0913406A2 (pt) 2008-06-03 2018-01-09 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
US8822645B2 (en) 2008-07-08 2014-09-02 Abbvie Inc. Prostaglandin E2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
MX2011002677A (es) 2008-09-12 2011-04-12 Santen Pharma Co Ltd Agonista del receptor de glucocorticoide que comprende nuevos derivados de 1,2,3,-4-tetrahidroquinoxalina que contienen un grupo fenilo que tiene una estructura de ester de acido sulfonico introducida en el mismo como sustituyente.
WO2010065882A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201613969A (en) 2009-03-05 2016-04-16 Abbvie Inc IL-17 binding proteins
US20140339088A1 (en) 2009-03-09 2014-11-20 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Dielectrophoresis methods for determining a property of a plurality of cancer cells
JP2012525155A (ja) 2009-05-01 2012-10-22 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびこの使用
US8686520B2 (en) * 2009-05-29 2014-04-01 International Business Machines Corporation Spin-torque magnetoresistive structures
TW201109438A (en) 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6088246B2 (ja) * 2009-08-15 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 以前に治療された乳癌の治療のための抗血管新生療法
RU2012112550A (ru) * 2009-09-01 2013-10-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
GB0917044D0 (en) 2009-09-29 2009-11-18 Cytoguide As Agents, uses and methods
US8716450B2 (en) 2009-10-15 2014-05-06 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
SG10201407129SA (en) 2009-11-06 2014-12-30 Plexxikon Inc Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
RU2579511C2 (ru) 2010-01-26 2016-04-10 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Производные фуро[3,2-в]пирана, применимые в синтезе аналогов
US9181162B2 (en) 2010-03-24 2015-11-10 Ohio University Compositions and methods for glucose transport inhibition
US8710035B2 (en) 2010-03-24 2014-04-29 The University Of Chicago Methods and compositions related to glucocorticoid receptor antagonists and breast cancer
US8841417B2 (en) 2010-05-14 2014-09-23 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
SMT201700547T1 (it) 2010-06-15 2018-01-11 Genmab As Coniugati di farmaco anticorpo umano contro il fattore tissutale
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TW201206473A (en) 2010-08-03 2012-02-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
PE20140229A1 (es) 2010-08-26 2014-03-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US9089570B2 (en) 2010-09-03 2015-07-28 Tactical Therapeutics Inc Compositions for treating cancers having acquired resitance to prior chemotherapeutic and targeted drugs using carboxyamidotriazole orotate
EP2613810B9 (en) 2010-09-07 2016-02-17 Johannes Kepler Universität Linz Biodegradable, water soluble and ph responsive poly(organo)phosphazenes
WO2012065019A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Exelixis, Inc. Pyridopyrimidinone inhibitors of p13k alpha
WO2012065057A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Exelixis, Inc. Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors and methods of their use
CN103221072A (zh) 2010-12-02 2013-07-24 免疫医疗公司 用于递送治疗剂和/或诊断剂的体内无铜催化的点击化学
KR20130133247A (ko) 2010-12-21 2013-12-06 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ-1-알파 및 -베타 이특이적 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
UY33826A (es) 2010-12-22 2012-07-31 Abbott Lab Proteínas de unión con dominios trivariables y sus usos
WO2012088302A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
ES2720659T3 (es) 2011-02-15 2019-07-23 Vaxiion Therapeutics Llc Composiciones terapéuticas y métodos para la administración dirigida, mediante minicélulas bacterianas, de moléculas bioactivas basadas en moléculas dirigidas que contienen Fc y anticuerpos
WO2012116277A1 (en) 2011-02-25 2012-08-30 Arena Pharmaceuticals, Inc. Cannabinoid receptor modulators
WO2012119077A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Morphotek Inc. Co -administration of eribulin and farletuzumab for the treatment of breast cancer
WO2012118978A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for treating oncovirus positive cancers
US20150072396A1 (en) 2011-03-04 2015-03-12 Life Technologies Corporation Compounds and Methods for Conjugation of Biomolecules
EP2685988A4 (en) 2011-03-15 2014-08-20 Univ North Carolina Methods of treating breast cancer with anthracycline therapy
CA2828959A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods and compositions for predicting response to eribulin
EP2670866A4 (en) 2011-04-05 2015-09-02 Translational Genomics Res Inst BIOMARKERS AND METHOD OF APPLICATION THEREFOR
EP2508525A1 (en) 2011-04-05 2012-10-10 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Substituted 2,3-dihydroimidazo[1,2-c]quinazoline salts
WO2012145098A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Saint Louis University Use of adenosine a3 receptor agonists for treatment of neuropathic pain
SG10201605293PA (en) 2011-05-27 2016-08-30 Ambrx Inc Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
US9796754B2 (en) 2011-05-27 2017-10-24 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
WO2012170640A1 (en) 2011-06-07 2012-12-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for trail-drug combination therapy
BR112013031819B1 (pt) 2011-06-10 2022-05-03 Mersana Therapeutics, Inc Suporte polimérico, composição farmacêutica, composto, e, uso do suporte
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
EP3321281B1 (en) 2011-08-05 2019-11-27 biOasis Technologies Inc P97 fragments with transfer activity
AU2012344697A1 (en) 2011-11-30 2014-07-10 Alphora Research Inc. Process for preparation of (3R)-2,4-di-leaving group-3-methylbut-1-ene
CN104024237B (zh) 2011-12-16 2016-02-24 阿方拉研究股份有限公司 用于制备3-((2s,5s)-4-亚甲基-5-(3-氧代丙基)四氢呋喃-2-基)丙醇衍生物的方法及其有用的中间体
US9717803B2 (en) 2011-12-23 2017-08-01 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
CA3111357A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
CN104080793B (zh) 2011-12-29 2017-09-19 阿方拉研究股份有限公司 2‑((2s,3s,4r,5r)‑5‑((s)‑3‑氨基‑2‑羟基丙‑1‑基)‑4‑甲氧基‑3‑(苯磺酰甲基)四氢呋喃‑2‑基)乙醛衍生物以及它们的制备方法
TWI573792B (zh) 2012-02-01 2017-03-11 歐陸斯迪公司 新穎治療劑
WO2013130093A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
WO2013138371A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating pancreatic cancer using combination therapies comprising an anti-erbb3 antibody
US9358235B2 (en) * 2012-03-19 2016-06-07 Plexxikon Inc. Kinase modulation, and indications therefor
KR20190134832A (ko) 2012-03-29 2019-12-04 알토 바이오사이언스 코포레이션 종양 형성 치료방법
US9278979B2 (en) 2012-03-30 2016-03-08 Alphora Research Inc. Synthetic process for preparation of macrocyclic C1-keto analogs of halichondrin B and intermediates useful therein
WO2013152034A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of monospecific and bispecific anti-igf-1r and anti-erbb3 antibodies
WO2013173391A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Concortis Biosystems, Corp Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof
IN2014DN09582A (ro) 2012-05-15 2015-07-17 Diatech Oncology Llc
EP3536700A1 (en) 2012-06-07 2019-09-11 Ambrx, Inc. Prostate-specific membrane antigen antibody drug conjugates
NZ702244A (en) 2012-06-08 2017-06-30 Hoffmann La Roche Mutant selectivity and combinations of a phosphoinositide 3 kinase inhibitor compound and chemotherapeutic agents for the treatment of cancer
IL278638B1 (en) 2012-06-19 2025-09-01 Ambrx Inc Anti-CD70 antibody drug conjugates
JP2015530072A (ja) 2012-06-29 2015-10-15 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド ゲムシタビン療法による乳癌の治療方法
WO2014005089A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Research Foundation Of State University Of New York Polyenolic zinc-binding agents (pezbins) actively promote inactivation of cancer stem cells and potentiate cytotoxic anti-tumor drug substances
PL2872157T3 (pl) 2012-07-12 2020-07-13 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Koniugaty wiążących komórkę cząsteczek ze środkami cytotoksycznymi
US20140069822A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Antec Leyden B.V. Electrochemical reduction of disulfide bonds in proteinaceous substances and electrochemical cell for carrying out such reduction
WO2014047199A1 (en) 2012-09-19 2014-03-27 The Research Foundation For The State University Of New York Novel prodrugs for selective anticancer therapy
EP2903616B8 (en) 2012-10-04 2018-02-07 AB Science Use of masitinib in combination with gemcitabine for treating a subgroup of patients suffering from pancreatic cancer
WO2014058317A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut-Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Methods and means for predicting resistance to anti-cancer treatment
CN103775148A (zh) 2012-10-22 2014-05-07 张玉良 自冷式热力做功方法
SMT202300208T1 (it) 2012-10-23 2023-09-06 Synaffix Bv Anticorpo modificato, coniugato di anticorpo e processo per la preparazione degli stessi
AU2013340449B2 (en) 2012-11-05 2017-11-30 Pfizer Inc. Spliceostatin analogs
JP6133431B2 (ja) 2012-11-24 2017-05-24 ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｄａｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 親水性連結体及び薬物分子と細胞結合分子との共役反応における親水性連結体の使用
CN105283182A (zh) 2012-12-03 2016-01-27 卡利泰拉生物科技公司 用谷氨酰胺酶的杂环抑制剂治疗癌症
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
JP6334553B2 (ja) 2012-12-10 2018-05-30 メルサナ セラピューティクス，インコーポレイティド タンパク質−高分子−薬剤コンジュゲート
EP2928503B1 (en) 2012-12-10 2019-02-20 Mersana Therapeutics, Inc. Conjugates of auristatin compounds
US9872918B2 (en) 2012-12-12 2018-01-23 Mersana Therapeutics, Inc. Hydroxyl-polymer-drug-protein conjugates
US20150314007A1 (en) 2012-12-21 2015-11-05 Glykos Finland Oy Linker-payload molecule conjugates
US20150182634A1 (en) 2012-12-28 2015-07-02 Cody P. Coyne Molecular Design and Chemical Synthesis of Pharmaceutical-Ligands and Pharmaceutical-Pharmaceutical Analogs with Multiple Mechanisms of Action
EP2964245A4 (en) 2013-01-19 2016-09-21 Univ New York HYDROGENIC SURROGATE PEPTIDES AND PEPTIDOMIMETICS FOR THE REACTIVATION OF P53
EP2945631A4 (en) 2013-01-19 2016-06-29 Univ New York OLIGOOXOPIPERAZINE FOR THE REACTIVATION OF P53
WO2014121235A2 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Zoneone Pharma, Inc. Transformation of drug cyclodextrin complex compositions into compositions of mixtures of lipid vesicle encapsulated drug and cyclodextrin drug complexes
HRP20231522T1 (hr) 2013-02-01 2024-03-01 Celator Pharmaceuticals, Inc. Daljinsko punjenje lijekova teško topljivih u vodi u liposome
WO2014124329A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Nanoparticles for drug delivery
US9333211B2 (en) 2013-02-22 2016-05-10 University Of Houston System Phosphaplatin mediated modulation of pigment epithelial derived factor and uses thereof
US9376437B2 (en) 2013-03-13 2016-06-28 Oncoceutics, Inc 7-benzyl-4-(2-methylbenzyl)-2,4,6,7,8,9-hexahydroimidazo[1,2-a]pyrido[3,4-e]pyrimidin-5(1H)-one, salts thereof and methods of using the same in combination therapy
BR112015023256A2 (pt) 2013-03-13 2017-07-18 Oncoceutics Inc terapia de combinação com 7-benzil-10-(2-metil-benzil)-2,6,7,8,9,10-hexaidroimidazol[1,2-a]pirido[4,3-d]pirimidin-5(3h)-ona.
WO2015073072A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Oncoceutics, Inc. 7-benzyl-4-(2-methylbenzyl)-2,4,6,7,8,9-hexahydroimidazo[1,2-a]pyrido[3,4-e]pyrimidin-5(1h)-one
ES2687439T3 (es) * 2013-03-13 2018-10-25 Medimmune Limited Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
US20140271923A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Christopher Brian Reid Compositions & formulations for preventing and treating chronic diseases that cluster in patients such as cardiovascular disease, diabetes, obesity, polycystic ovary syndrome, hyperlipidemia and hypertension, as well as for preventing and treating other diseases and conditions
CA2912518A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Regulation of cancer using natural compounds and/or diet
WO2014160360A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Mersana Therapeutics Inc. Tubulysin compounds and conjugates thereof
AU2014228489B2 (en) 2013-03-15 2018-11-15 Zymeworks Bc Inc. Cytotoxic and anti-mitotic compounds, and methods of using the same
US9295731B2 (en) 2013-04-01 2016-03-29 Mark Quang Nguyen Cleavable drug conjugates, compositions thereof and methods of use
US10233219B2 (en) 2013-04-12 2019-03-19 Tufts Medical Center Methods and systems for designing and/or characterizing soluble lipidated ligand agents
WO2014176284A1 (en) 2013-04-22 2014-10-30 Avelas Biosciences, Inc. Selective drug delivery compositions and methods of use
GB2513405A (en) 2013-04-26 2014-10-29 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising ADCs using affinity resins
WO2014177771A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
EP2997017B1 (en) 2013-05-15 2017-08-09 Alphora Research Inc. 3-((2s,5s)-4-methylene-5-(3-oxopropyl)tetrahydrofuran-2-yl)propanol derivatives, their preparation and intermediates useful thereof
GB201309807D0 (en) 2013-05-31 2013-07-17 Pharma Mar Sau Antibody drug conjugates
US11229711B2 (en) 2013-06-06 2022-01-25 Magenta Therapeutics, Inc. Linkers for antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use
WO2014197871A2 (en) 2013-06-06 2014-12-11 Igenica Biotherapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates, compositions and methods of use
US10071169B2 (en) 2013-06-20 2018-09-11 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
JP6744212B2 (ja) * 2013-06-21 2020-08-19 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． ポリペプチドの酵素的結合
WO2014206466A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Afg Technologies S.À.R.L Screening, diagnosis, prognostication and treatment of ovarian cancer
US9850254B2 (en) 2013-07-03 2017-12-26 Sandoz Ag Synthetic process for preparation of macrocyclic C1-keto analogs of Halichondrin B and intermediates useful therein including intermediates containing-SO2-(p-tolyl) groups
WO2015017729A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Dielectrophoresis methods for determining a property of a plurality of cancer cells
WO2015017034A1 (en) 2013-08-02 2015-02-05 Gourdie Robert G Methods of treating a cancer through targeted disruption of alpha connexin 43-zonula occludens-1 (zo-1) interaction
KR20160046914A (ko) 2013-08-28 2016-04-29 스템센트알엑스 인코포레이티드 신규한 ｓｅｚ6 조절물질 및 사용방법
US20150093399A1 (en) 2013-08-28 2015-04-02 Bioasis Technologies, Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
MX377339B (es) 2013-08-28 2025-03-06 Abbvie Stemcentrx Llc Metodos de conjugacion de anticuerpos especificos de sitio y composiciones.
AU2014317843A1 (en) 2013-09-09 2016-03-24 British Columbia Cancer Agency Branch Methods and kits for predicting outcome and methods and kits for treating breast cancer with radiation therapy
WO2015038426A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Asana Biosciences, Llc Self-immolative linkers containing mandelic acid derivatives, drug-ligand conjugates for targeted therapies and uses thereof
US20150093331A1 (en) 2013-10-01 2015-04-02 OncoLock Co., Ltd. Biomarkers for breast cancer
US9878049B2 (en) 2013-10-09 2018-01-30 The University Of Akron High drug loading system to co-deliver anticancer drugs and nucleic acids for cancer therapy
ES2960807T3 (es) 2013-10-11 2024-03-06 Us Health Anticuerpos contra TEM8 y su uso
KR102087850B1 (ko) 2013-10-11 2020-03-12 메르사나 테라퓨틱스, 인코포레이티드 단백질-고분자-약물 접합체
ES2754397T3 (es) 2013-10-11 2020-04-17 Asana Biosciences Llc Conjugados de proteína-polímero-fármaco
CA2965114A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Hemoshear, Llc In vitro model for a tumor microenvironment
EP3689881B1 (en) 2013-11-04 2022-01-12 Eisai R&D Management Co., Ltd. Macrocyclization reactions and intermediates useful in the synthesis of analogs of halichondrin b
KR20210063475A (ko) 2013-11-07 2021-06-01 데시페라 파마슈티칼스, 엘엘씨. 암치료에 유용한 tie2 키나아제의 억제 방법
US9457019B2 (en) 2013-11-07 2016-10-04 Deciphera Pharmaceuticals, Llc Methods for inhibiting tie-2 kinase useful in the treatment of cancer
CN106163524B (zh) 2013-11-15 2019-11-08 昂克希尔迪克斯有限公司 7-苄基-4-(2-甲基苄基)-2,4,6,7,8,9-六氢咪唑并[1,2-a]吡啶并[3,4-e]嘧啶-5(1H)-酮、其盐及应用方法
CN105744935B (zh) 2013-11-27 2022-09-30 雷德伍德生物科技股份有限公司 肼基-吡咯并化合物及用于生成缀合物的方法
SG10201805024YA (en) 2013-12-06 2018-07-30 Eisai R&D Man Co Ltd Methods useful in the synthesis of halichondrin b analogs
WO2015095784A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Luminus Biosciences, Inc. Solid nanoparticle formulation of microtubule inhibitors with reduced ostwald ripening for oral administration
US10548985B2 (en) 2014-01-10 2020-02-04 Birdie Biopharmaceuticals, Inc. Compounds and compositions for treating EGFR expressing tumors
EP3091970B1 (en) 2014-01-10 2020-10-28 Rgenix, Inc. Lxr agonists and uses thereof
WO2015106094A1 (en) 2014-01-10 2015-07-16 Atossa Genetics Inc. Transpapillary methods and compositions for diagnosing and treating breast conditions
CN104784699B (zh) 2014-01-20 2019-05-03 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 叶酸受体结合配体-药物偶联物
CA2937034A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 National Cancer Center Anti-tissue factor monoclonal antibody
CA3051737C (en) 2014-02-03 2022-05-10 Nikolaus KRALL Low molecular weight drug conjugates for binding to carbonic anhydrase ix
EP2913064A1 (en) 2014-02-26 2015-09-02 celares GmbH Branched drug-linker conjugates for the coupling to biological targeting molecules
TW201617326A (zh) 2014-03-06 2016-05-16 Ａｌｐｈｏｒａ研發股份有限公司 （ｓ）－１－（（２ｒ，３ｒ，４ｓ，５ｓ）－５－烯丙－３－甲氧－４－（對甲苯磺醯甲基）四氫呋喃－２－基）－３－氨基丙－２－醇之結晶衍生物
CA2941161A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for modulating estrogen receptor mutants
US9260478B2 (en) * 2014-04-04 2016-02-16 Shanghui Hu Potent and efficient cytotoxic peptides and antibody-drug conjugates thereof and their synthesis
CA2979530C (en) 2014-04-08 2023-10-03 The Methodist Hospital Inos-inhibitory compositions and their use as breast cancer therapeutics
WO2015160833A1 (en) 2014-04-14 2015-10-22 Endocyte, Inc. Drug delivery conjugates for treating resistant cancer and for use in combination therapy
WO2015161247A1 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 Igenica Biotherapeutics, Inc. Humanized anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof
EP3134125B1 (en) * 2014-04-25 2019-10-09 Pierre Fabre Medicament Antibody-drug-conjugate and its use for the treatment of cancer
KR101628872B1 (ko) * 2014-05-28 2016-06-09 주식회사 레고켐 바이오사이언스 자가-희생 기를 포함하는 화합물
TWI695011B (zh) * 2014-06-18 2020-06-01 美商梅爾莎納醫療公司 抗ｈｅｒ２表位之單株抗體及其使用之方法
WO2015195925A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates and methods of using same
WO2016008112A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Medshine Discovery Inc. Linkers and application towards adc thereof
EP3069734A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-21 Exiris S.r.l. Cryptophycin-based antibody-drug conjugates with novel self-immolative linkers
US10975112B2 (en) * 2015-06-16 2021-04-13 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Linkers for conjugation of cell-binding molecules
CN107921144B (zh) 2015-06-20 2023-11-28 杭州多禧生物科技有限公司 澳瑞他汀类似物及其与细胞结合分子的共轭偶联物

Also Published As

Publication number Publication date
ES2880402T3 (es) 2021-11-24
JP6870051B2 (ja) 2021-05-12
KR20240007722A (ko) 2024-01-16
MX2018010562A (es) 2019-02-20
TWI772288B (zh) 2022-08-01
US20180193478A1 (en) 2018-07-12
US10548986B2 (en) 2020-02-04
WO2017151979A1 (en) 2017-09-08
CN114191428A (zh) 2022-03-18
CN114191428B (zh) 2024-09-24
KR20180115330A (ko) 2018-10-22
HUE054726T2 (hu) 2021-09-28
CO2018008667A2 (es) 2018-08-31
JP2019516664A (ja) 2019-06-20
EP3824909A1 (en) 2021-05-26
CN114272389B (zh) 2023-04-18
JP7254861B2 (ja) 2023-04-10
TW202241524A (zh) 2022-11-01
MX2023003806A (es) 2023-04-12
JP6599019B2 (ja) 2019-10-30
TWI825834B (zh) 2023-12-11
IL261428A (en) 2018-10-31
SI3423105T1 (sl) 2021-12-31
NZ785232A (en) 2025-05-30
JOP20210073A1 (ar) 2023-01-30
PT3423105T (pt) 2021-07-19
EP3423105B1 (en) 2021-05-05
KR20220101204A (ko) 2022-07-19
SMT202100416T1 (it) 2021-09-14
IL261428B2 (en) 2025-10-01
IL320940A (en) 2025-07-01
TW201800110A (zh) 2018-01-01
MY189113A (en) 2022-01-26
JP2024174991A (ja) 2024-12-17
KR102445255B1 (ko) 2022-09-22
PH12018501847A1 (en) 2019-05-15
US20200297860A1 (en) 2020-09-24
DK3423105T3 (da) 2021-07-26
JOP20210074A1 (ar) 2023-01-30
CN114272389A (zh) 2022-04-05
MX2023003809A (es) 2023-04-12
LT3423105T (lt) 2021-09-10
RU2754369C2 (ru) 2021-09-01
RU2018134331A (ru) 2020-04-02
TWI871094B (zh) 2025-01-21
CY1124628T1 (el) 2022-07-22
MA45280A (fr) 2019-01-09
IL292946B2 (en) 2024-11-01
JP2023082096A (ja) 2023-06-13
EP3423105A1 (en) 2019-01-09
IL292946B1 (en) 2024-07-01
PE20231049A1 (es) 2023-07-11
BR112018067379A2 (pt) 2019-01-15
PE20231050A1 (es) 2023-07-11
TW202408592A (zh) 2024-03-01
NZ744808A (en) 2024-04-26
HRP20211125T1 (hr) 2021-10-15
AU2023285804A1 (en) 2024-01-18
AR121301A2 (es) 2022-05-04
IL261428B1 (en) 2025-06-01
JP2020128413A (ja) 2020-08-27
CN108883198A (zh) 2018-11-23
SG10202007520WA (en) 2020-09-29
IL292946A (en) 2022-07-01
PE20181953A1 (es) 2018-12-17
RS62108B1 (sr) 2021-08-31
KR20220101203A (ko) 2022-07-19
CN108883198B (zh) 2022-08-09
JP7556086B2 (ja) 2024-09-25
AU2017225982B2 (en) 2023-10-05
MX2023003808A (es) 2023-04-12
RU2021125492A (ru) 2022-04-05
AR107787A1 (es) 2018-06-06
RU2018134331A3 (ro) 2020-08-14
CA3013791A1 (en) 2017-09-08
CL2021000048A1 (es) 2021-05-28
US20230398228A1 (en) 2023-12-14
US10322192B2 (en) 2019-06-18
MY199595A (en) 2023-11-08
KR102456433B1 (ko) 2022-10-19
AR121302A2 (es) 2022-05-04
PL3423105T3 (pl) 2021-10-25
JP2021185176A (ja) 2021-12-09
CN114191563A (zh) 2022-03-18
AU2017225982A1 (en) 2018-08-16
MA45280B1 (fr) 2021-08-31
CL2018002456A1 (es) 2018-12-21
JP2020019787A (ja) 2020-02-06
US20170252458A1 (en) 2017-09-07
UA125024C2 (uk) 2021-12-29
CL2021000049A1 (es) 2021-05-28
SG11201806515RA (en) 2018-09-27
KR102702620B1 (ko) 2024-09-05
JOP20170053B1 (ar) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7556086B2 (ja) エリブリンをベースとする抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
ES2991607T3 (es) Anticuerpo anti-CDH6 y conjugado de anticuerpo anti-CDH6 y fármaco
ES2795818T3 (es) Anticuerpos CD48 y conjugados de los mismos
KR101783529B1 (ko) 항체-약물 접합체
JP7657213B2 (ja) 抗メソテリンエリブリン抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
KR20200131840A (ko) 항-her2 2파라토프 항체-약물 접합체 및 이의 사용 방법
JP2025109708A (ja) Ｂリンパ球特異的アマトキシン抗体コンジュゲート
HK40053532A (en) Eribulin-based antibody-drug conjugates and methods of use
AU2023285804B2 (en) Eribulin-based antibody-drug conjugates and methods of use
HK1261001B (en) Eribulin-based antibody-drug conjugates and methods of use
JP2025531990A (ja) ｃ－Ｍｅｔを標的とする抗体薬物コンジュゲート及び使用方法
CN118873678A (zh) 抗体偶联药物及其用途