JP6853265B2 - 核酸に組み込むための５−（ｎ−保護−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンホスホロアミダイトの化合物及び合成方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３０８，１３２号の優先権の利益を主張するものであり、これは、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、改良された合成方法及び修飾されたヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドなどの、修飾された塩基、ヌクレオチド、及びホスホロアミダイトの分野に関する。

３−（２−アミノエチル）−インドール側鎖を有する化学的に修飾されたヌクレオチドであるＴｒｐｄＵ（及びその２’−修飾アナログ）は、例えばタンパク質などの標的分析物の高親和性アプタマーの開発において有用である。ＴｒｐｄＵのインドール環は電子豊富かつ分極可能であり、これは標的分析物との二次構造及び相補的な疎水性界面の形成を促進することができる。これまで、固相オリゴヌクレオチド合成におけるホスホロアミダイト試薬として、ＴｒｐｄＵだけでなく他の修飾されたヌクレオチドも使用されておらず、そのためその使用は限定的であった。

改良されたＴｒｐＵホスホロアミダイト、及び改良されたＴｒｐＵホスホロアミダイトの製造方法が当該技術分野では未だ必要とされている。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物またはその塩が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される。

いくつかの実施形態においては、Ｒ_１はｔｅｒｔ−ブチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−プロピルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−シアノフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロペンチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロヘキシルである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_１及びＸ_２はメトキシである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は水素である。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３はメトキシである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３はフルオロである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシである。

いくつかの実施形態においては、以下：

から選択される化合物及びその塩が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物及びその塩が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される。

いくつかの実施形態においては、Ｒ_１はｔｅｒｔ−ブチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−プロピルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−シアノフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロペンチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロヘキシルである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_１及びＸ_２はメトキシである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は水素である。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３はメトキシである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３はフルオロである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシである。

いくつかの実施形態においては、化合物は、以下：

、及びその塩から選択される。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物またはその塩が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１はｔｅｒｔ−ブチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−プロピルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−シアノフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロペンチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロヘキシルである。

いくつかの実施形態においては、化合物は、以下：

、及びその塩から選択される構造を有する。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１はｔｅｒｔ−ブチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−プロピルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−シアノフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロペンチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロヘキシルである。

いくつかの実施形態においては、化合物は、以下：

から選択される構造を有する。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物またはその塩の製造方法が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１はｔｅｒｔ−ブチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−プロピルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−シアノフェニルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロペンチルである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロヘキシルである。いくつかの実施形態においては、方法は、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させることを含む。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１はｔｅｒｔ−ブチルであり、酸塩化物はピバロイルクロリドである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−プロピルであり、酸塩化物は２，２−ジメチルブチロイルクロリドである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１，１−ジメチル−ブチルであり、酸塩化物は２，２−ジメチルバレロイルクロリドである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−クロロフェニルであり、酸塩化物は２−クロロベンゾイルクロリドである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は２−シアノフェニルであり、酸塩化物は２−シアノベンゾイルクロリドである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロペンチルであり、酸塩化物は１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリドである。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は１−メチル−シクロヘキシルであり、酸塩化物は１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリドである。

いくつかの実施形態においては、方法は、以下：

から選択される化合物及びその塩を製造する。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物の製造方法が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、方法は、次の化合物：

をトリフルオロ酢酸と反応させることを含む。

いくつかの実施形態においては、方法は、以下：

から選択される化合物を製造する。

いくつかの実施形態においては、方法は、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：

を形成することを更に含む。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物またはその塩の製造方法が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される。いくつかの実施形態においては、方法は、次の化合物：

を、５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と反応させることを含む。

いくつかの実施形態においては、方法は、以下：

から選択される化合物及びその塩を製造する。

いくつかの実施形態においては、方法は、次の化合物：

をトリフルオロ酢酸と反応させて、次の化合物：

を形成することを更に含む。いくつかの実施形態においては、方法は、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：

を形成することを更に含む。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する化合物またはその塩の製造方法が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される。いくつかの実施形態においては、方法は、次の化合物：

を、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロ−アミダイトと反応させることを含む。

いくつかの実施形態においては、方法は、次の化合物：

を５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と反応させて、次の化合物：

を形成することを含む。いくつかの実施形態においては、方法は、次の化合物：

をトリフルオロ酢酸と反応させて、次の化合物：

を形成することを含む。いくつかの実施形態においては、方法は、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：

を形成することを含む。

いくつかの実施形態においては、方法は、以下：

から選択される化合物及びその塩を製造する。

いくつかの実施形態においては、次の構造を有する化合物：

または、その塩
（式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される）
の製造方法であって、
ａ）ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：

を形成する工程；
ｂ）次の化合物：

をトリフルオロ酢酸と反応させて、次の化合物：

を形成する工程；
ｃ）次の化合物：

を５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と反応させて、次の化合物：

を形成する工程：及び
ｄ）次の化合物：

を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロ−アミダイトと反応させる工程；
を含む。

いくつかの実施形態においては、方法は、以下：

から選択される化合物またはその塩を製造する。

いくつかの実施形態においては、少なくとも１つの保護されているＴｒｐＵヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが提供され、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの保護されているＴｒｐＵヌクレオチドは、次の構造：

を有する。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_４は、ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のＺ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒは、オリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_５は、−Ｏ−ｓｓ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒはオリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、固体支持体は、調節多孔質ガラス（ＣＰＧ）である。いくつかの実施形態においては、Ｚ’はＳであり、Ｚ”はＯである。いくつかの実施形態においては、Ｚ’及びＺ”はＯである。

いくつかの実施形態においては、次の構造：

を有する少なくとも１つのヌクレオチドを、固体支持体上のヌクレオチド配列に組み込むこと；及びオリゴヌクレオチドの中に組み込まれた少なくとも１つのＴｒｐＵヌクレオチドから保護基：

を外すこと；を含む、少なくとも１つのＴｒｐＵヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの製造方法が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される。いくつかの実施形態においては、Ｘ_４は、ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のＺ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒは、オリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、Ｘ_５は、−Ｏ−ｓｓ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒはオリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、固体支持体は、調節多孔質ガラス（ＣＰＧ）である。いくつかの実施形態においては、Ｚ’はＳであり、Ｚ”はＯである。いくつかの実施形態においては、Ｚ’及びＺ”はＯである。

ＴｒｐｄＵの構造である。 Ｎ−１−保護トリプタミン化合物についての合成スキームである。 ＢＯＣの除去に続く保護されているトリプタミン中のアシル基の移動である。 ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＣＥＰ）、保護されていないＴｒｐｄＵ ＣＥＰ、及びＮａｐｄＵ ＣＥＰを使用して合成されたアプタマーのＨＰＬＣ分析結果である。 Ｎ−１−ｐｉｖ−トリプタミントリフルオロアセテートについての合成スキームである。 Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＣＥＰ）についての合成スキームである。

別段の指示がない限り、技術的な用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓより出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．より出版されたＫｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；及びＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．より出版されたＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）の中で見ることができる。

別途説明がない限り、本明細書で使用されている全ての技術的及び科学的な用語は、本開示が属する技術分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないとの明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」は、ＡもしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。更に、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさ、及び全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために示されていることを理解しなければならない。

また、本明細書中で示されている範囲は、範囲内の全ての値についての簡略化した表現であると理解しなければならない。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０（並びに文脈からそうでないとの明確な指示がない限りこれらの分数）からなる群から選択される任意の数、数の組み合わせ、または部分的な範囲を含むと理解しなければならない。任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、割合の範囲、または整数の範囲は、別段の指示がない限り、列挙されている範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合にはそれらの分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解しなければならない。同様に、ポリマーのサブユニット、大きさ、または厚さなどの任意の物理的特徴に関して本明細書で列挙されている任意の数の範囲も、別段の指示がない限り、列挙されている範囲内の任意の整数を含むと理解しなければならない。本明細書において、「約」または「本質的に〜からなる」は、別段の指示がない限り、指示されている範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書おいて、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ及びｃｏｍｐｒｉｓｅ）」はオープンエンドであり、同義語として使用される。

本明細書に記載のものと同様または均等な方法及び材料を本開示の実施または試験において使用できるものの、適切な方法及び材料は下に記載されている。本明細書で述べられている全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含み本明細書が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は例示的なものに過ぎず、限定することは意図されていない。

本明細書において、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはこれらの修飾形態だけでなく、これらのアナログも意味する。ヌクレオチドには、プリン（例えばアデニン、ヒポキサンチン、グアニン、並びにこれらの誘導体及びアナログ）を含む種だけでなく、ピリミジン（例えばシトシン、ウラシル、チミン、並びにこれらの誘導体及びアナログ）を含む種も含まれる。

本明細書において、用語「ＴｒｐＵ」は、通常、５位にＮ−（３−インドール−２−エチル）−カルボキサミド官能基を含むウリジリルヌクレオチドを指すために使用される。用語「ＴｒｐＵ」の使用は、リボースの２’位に関して限定することを意図しておらず、この用語は、具体的な２’部位が指示されていない限り、２’位に−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、または−Ｆを含むヌクレオチド（ただしこれらに限定されない）も含むと解釈すべきである。用語「ＴｒｐｄＵ」は、典型的には２’−Ｈを含むＴｒｐＵヌクレオチドを意味する。

本明細書において、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを表すために互換的に使用され、これには、任意の位置でのヌクレオチド単位への様々な構成要素または部位の結合が含まれる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、並びにこれらの種類の核酸の修飾物、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」には、二本鎖もしくは一本鎖の分子だけでなく、三重らせん分子も含まれる。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であり、そのため核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語には、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーが含まれる。しかし、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。

本明細書において、用語「少なくとも１つのヌクレオチド」は、核酸の修飾に関しての場合、核酸中の１つ、複数、または全てのヌクレオチドのことを意味し、これは、核酸中のＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、またはＵのうちのいずれかまたは全ての、いずれかまたは全ての存在が修飾されていてもいなくてもよいことを示す。

本明細書において、「ホスホロアミダイト（ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）」は、リボースの３’炭素、または別の糖部分の等価な位置に結合している次の基：

含むヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、ホスホロアミダイトは、リボースの５’−ＯＨ上に、トリチル保護基、例えばジメトキシトリチル保護基などの保護基を含む。

本明細書において、「固相合成」は、具体的な別の指示がない限り、ホスホロアミダイト化学を使用する固相オリゴヌクレオチド合成を意味する。

化合物
本開示は、表Ａに示されている化合物及びその塩、並びに化合物の製造方法及び使用方法を提供する。
表Ａ：本開示の化合物

表Ａ中の構造におけるＸ_３は、いくつかの実施形態においては、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択されてもよい。いくつかの実施形態においては、表Ａ中の化合物１〜７は、１つ以上のＴｒｐＵヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを製造するための固相オリゴヌクレオチド合成において使用されてもよい。本明細書では、リボースの３’炭素がリンカー部位によって調節多孔質ガラスなどの固相に結合している、化合物８〜１４から選択される構造を含む化合物も提供される。いくつかの実施形態においては、リボースの３’炭素は、コハク酸エステル、ジグリコール酸エステル、及びアルキルアミノから選択されるリンカー部位を介して固相に結合する。

表Ａ中の化合物は、いくつかの実施形態においては、本明細書の実施例中など本明細書に記載されている方法を使用して合成することができる。

塩
これは、化合物の対応する塩を合成、精製、及び／または取り扱うために好都合または望ましい場合がある。

例えば、化合物がアニオン性である場合、または化合物がアニオン性になり得る官能基（例えば−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ⁻になり得る）を有する場合、塩は好適なカチオンを用いて形成することができる。好適な無機カチオンの例としては、限定するものではないが、Ｎａ^＋及びＫ^＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋などのアルカリ土類金属カチオン、並びにＡｌ^＋３などの他のカチオンが挙げられる。好適な有機カチオンの例としては、限定するものではないが、アンモニウムイオン（すなわちＮＨ_４ ^＋）及び置換アンモニウムイオン（例えばＮＨ_３Ｒ^Ｘ＋、ＮＨ_２Ｒ^Ｘ _２ ^＋、ＮＨＲ^Ｘ _３ ^＋、ＮＲ^Ｘ _４ ^＋）が挙げられる。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、クロリン、メグルミン、及びトロメタミン、並びにリシン及びアルギニンなどのアミノ酸由来のものである。一般的な四級アンモニウムイオンの例はＮ（ＣＨ_３）_４ ^＋である。

化合物がカチオン性である場合、または化合物がカチオン性になり得る官能基（例えば−ＮＨ_２は−ＮＨ_３ ^＋になり得る）を有する場合、塩は好適なアニオンを用いて形成することができる。好適な無機アニオンの例としては、限定するものではないが、次の無機酸：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、亜リン酸；由来のものが挙げられる。

好適な有機アニオンの例としては、限定するものではないが、次の有機酸：２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン（ｇｌｕｃｈｅｐｔｏｎｉｃ）酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸；由来のものが挙げられる。好適なポリマー有機アニオンの例としては、限定するモノではないが、以下のポリマー酸：タンニン酸、カルボキシメチルセルロース由来のものが挙げられる。

別段の規定がない限り、具体的な化合物への言及は、その塩形態も含む。

修飾されたオリゴヌクレオチド
本明細書において、用語「修飾する」、「修飾された」、「修飾」、及びこれらの任意の変形形態は、オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわちＡ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）のうちの少なくとも１つが天然に存在するヌクレオチドのアナログまたはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態においては、修飾されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。追加的な修飾としては、骨格の修飾、メチル化、イソ塩基であるイソシチジン及びイソグアニジン等などの通常ではない塩基対合の組み合わせを挙げることができる。修飾には、キャッピングなどの３’及び５’の修飾も含まれ得る。他の修飾としては、アナログによる１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の修飾（例えば電荷を持たない結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）によるもの、及び電荷を有する結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるものなど）、インターカレーター（アクリジン、ソラレン等）によるもの、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、並びに修飾された結合（例えばαアノマー核酸等）によるもの、を挙げることができる。更に、ヌクレオチドの糖上に通常存在する任意のヒドロキシル基は、ホスホネート基またはホスフェート基で置換されていてもよく；一般的な保護基で保護されていてもよく；あるいは追加的なヌクレオチドまたは固体支持体への追加的な結合を形成するために活性化されていてもよい。５’及び３’末端ＯＨ基は、リン酸化されていてもよく、あるいはアミン、約１〜約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部位、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のある実施形態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、約２０〜約６０ｋＤａの範囲の別の実施形態のＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性の生体もしくは合成ポリマー、で置換されていてもよい。

ポリヌクレオチドには、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−フルオロ、２’−ＮＨ_２、または２’−アジド、炭素環糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（アラビノース、キシロース、またはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリルアナログ、及び脱塩基ヌクレオシドアナログ（メチルリボシド等）などの、当該技術分野で一般的に公知のリボースまたはデオキシリボースのアナログ形態も含まれ得る。本明細書において、１つ以上のホスホジエステル結合は、代替の連結基に置き換えられていてもよい。これらの代替の連結基は、リン酸エステルがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ^Ｘ _２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ^Ｘ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ^Ｘ’、ＣＯ、またはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられた実施形態を含み、式中の各Ｒ^ＸまたはＲ^Ｘ’は、独立に、Ｈまたは任意選択的にエーテル（−Ｏ−）結合を含んでいてもよい置換もしくは無置換のアルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンのアナログ形態の置換は、例えばポリアミド主鎖のような代替の骨格構造をとることができるため、最終生成物の設計において有利な場合がある。

ポリヌクレオチドは、炭素環糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（アラビノース、キシロース、またはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリルアナログ、及び脱塩基ヌクレオシドアナログ（メチルリボシド等）などのアナログ形態も含み得る。

存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの骨格形成の前または後に行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチオ成分によって遮られていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識化成分との結合などにより更に修飾されてもよい。

オリゴヌクレオチドの合成
オリゴデオキシヌクレオシドの自動合成は、多くの研究機関で日常的に行われている（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１を参照のこと、この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）。オリゴリボヌクレオシドの合成も周知である（例えばＳｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３−５４４１を参照のこと、この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書において、ホスホロアミダイトは、化学合成によるオリゴヌクレオチドの中への修飾されたヌクレオシドの組み込みのために有用であり、トリホスフェートは、酵素合成によるオリゴヌクレオチドの中への修飾されたヌクレオシドの組み込みのために有用である。（例えばＶａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６：１１２３１−１１２３７；Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２， ４１４１−４１５１；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２００５）（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと、（これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態においては、本明細書で提供される化合物、特には表Ａの化合物１〜７は、市販の合成装置を使用する自動化方法などの標準的なホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成方法で使用することができる。合成の後、ＴｒｐＵヌクレオチド上の保護基は、ｔＢｕＮＨ_２／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ及びＭｅＮＨ_２（気体）などの標準的な脱保護方法により外される。

いくつかの実施形態においては、表Ａの化合物１〜７などの本明細書で提供される化合物をオリゴヌクレオチドの合成において使用すると、所望のオリゴヌクレオチド生成物の収率が改善される。例えば、実施例４に記載されているように、保護されていないＴｒｐｄＵ ＣＥＰの代わりにＰｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰを使用すると、１３個のＴｒｐｄＵヌクレオチドを含む５１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの収率が約１．７倍に改善した。表１０を参照のこと。より長いオリゴヌクレオチドについては、収率は２倍以上増加し得る。表１１を参照のこと。

実施例
以降の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために示されている。しかし、これらは本発明の幅広い範囲を限定するものとして決して解釈すべきではない。当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなしに、様々な化合物の設計に本発見の基本原理を容易に取り入れることができる。

実施例１：トリプタミンのための保護基の調査
標準的なオリゴヌクレオチド脱保護条件下での様々なスルホニル−及びアシル−保護基の反応性を決定するために、モデル系を使用した。ＴｒｐｄＵのモデルとして、化合物Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルトリプタミン（図２，（１））を使用した。様々なＮ−１誘導体は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で（１）をカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．１当量）で処理し、引き続き適切なスルホニルもしくはアシルクロリドもしくは無水物（１．０当量）を添加することにより、容易に合成することができる（図２）。Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５０（２３），５５３５−５５３８，２００７を参照のこと。得られたＮ−１誘導体（表１）は、結晶化、クロマトグラフィーにより精製するか、脱保護試験で直接使用した。

脱保護試験条件は、３７℃のｔｅｒｔ−ブチルアミンと水酸化アンモニウムの２つのプロトコルに基づいた。疎水性のモデル化合物を溶解させるために、メタノールを脱保護試薬（表２）に添加した。３７℃での各脱保護反応の試料を、１、４、及び２４時間の時点で分析した。いくつかの事例においては、物質を、７０℃で２４時間の「ストレス」脱保護条件下にもおいた。

モデル系における保護基のアルカリ切断のための目標速度は、数理モデルによって定義した。脱保護は、過剰の塩基の存在下で擬一次の反応速度論に従うと仮定した。最低許容可能速度は２４時間の時点で９９．９％の切断と定義した。好ましい反応速度は、変動のためにより大きなゆとりを与えるものであり、１２時間以内に９９．９％の切断と定義した。これらの基準に基づくと、望ましい保護基は１時間で２５〜４４％切断され、４時間で６８〜９０％切断され、２４時間で＞／＝９９．９％切断されるであろう。

脱保護反応は、２５％酢酸エチル／７５％ヘキサンで溶離させるシリカゲルプレート上での古典的な薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により追跡した。最も正確なＴＬＣ可視化技術は過マンガン酸アルカリ染色であることが分かった。ヨウ素染色は保護されていないインドールが過剰に示され得る一方で、ＵＶ光による可視化は保護されているＮ−１アセチル誘導体が過剰に示され得る。

最初にスルホニル保護基について調査した。様々な構造及び反応性を表すために、トリフルオロメタンスルホニル（トリフリル）；メタンスルホニル（メシル）；及びベンゼンスルホニル（べシル）の３つの誘導体を合成した（表１）。３つ全てのスルホニル誘導体は、モデルのオリゴ脱保護条件下で完全に安定（０％切断）であることが分かった（表３）。Ｎ−１−インドールスルホニル保護基を切断するためには文献に記載されている過酷なアルカリ条件（ＮａＯＨ＋熱）が必要であり、高い反応性のトリフルオロメタンスルホニル（Ｔｆ）基でさえもそれより穏やかなオリゴ脱保護条件に対して安定であると結論付けた。

一連の１６個のアクリルアナログ（４個のアリールと１２個のアルキル）を、ＢＯＣ−トリプタミン及び適切な酸塩化物試薬から合成した。１６個の酸塩化物は、商業的に入手するか、商業的に入手可能なカルボン酸から塩化チオニルとの反応により合成するか、２〜３段階で最初から合成した（表１）。

アシル保護基は、アルカリ脱保護条件に対する様々な反応性を示した。４つのアリールアシル誘導体は、幅広い反応性を示した（表４）。無置換のベンゾイル基は反応性が高すぎて１時間で完全に切断された一方で、２，４，６−三置換アナログであるＭｅｓ及びＴｃｂは過度に安定であり、標準条件下では検出可能な切断を示さなかった。これら両極端の間にあるのが中程度に立体障害を有する２−メトキシベンゾイル（Ｔｏｌ）アナログであり、これは望ましい目標切断速度内に収まった。更に詳しい評価のためにＴｏｌ基を選択した。

１２個のアルキルアシル保護基のいずれも望まれる目標速度を満たさなかった。アナログは、反応性が過度に高い（表５）または過度に安定（表６）のいずれかであることが分かった。わずかに構造を変化させることでアルカリによる切断速度が劇的に変化することが分かった。例えば、ジメチルエチルアセチル（Ｄｍｂ）は速すぎる一方で、ジエチルメチルアセチル（Ｍｅｂ）は遅すぎる。

不完全な脱保護は通常オリゴヌクレオチドの合成においては受け入れられないことから、安定すぎるアナログ（表５）のいずれも、更なる開発の対象とはみなされなかった。

ほぼ等しい反応性を有する速すぎる群の５つのアナログ：Ｐｉｖ、Ｍｃｐ、Ｍｃｈ、Ｄｍｖ、及びＤｍｂ（表５）が存在する。全て１時間で約９０％の切断及び４時間で１００％の切断を示した。これは、望まれる目標速度よりも速かった。しかし、更に詳しい評価のためにＰｉｖとＤｍｂを選択した。

まとめると、最初のＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンモデル系によって、可能性のあるＮ−１保護基として３つの有力候補：Ｔｏｌ、Ｄｍｂ、及びＰｉｖの特定ができた。３つの有力候補は、アルカリＳＯＳ脱保護条件に対して様々な反応性を示した：Ｐｉｖ＞Ｄｍｂ＞Ｔｏｌ。

実施例２：選択した保護基のＴｒｐＵ中での使用
異なる反応性の３つのＮ−１保護基（Ｐｉｖ＞Ｄｍｂ＞Ｔｏｌ）を、Ｎ−α−ＢＯＣ基の除去後及び遊離塩基形態への変換後に観察した。Ｎ−１が保護されている遊離塩基は、Ｎ−１アシル基（芳香族アミン）がＮ−ａ（１級アルキルアミン）へと移動し、これがより強いアミド結合を形成することから不安定である（図４）。この自動劣化転移は、標準的なアルカリによる脱保護と類似している。

３つのアナログ、Ｐｉｖ＞Ｄｍｂ＞Ｔｏｌをジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸により処理することで、Ｎ−α−ＢＯＣ保護基を切断した。反応は５％の炭酸ナトリウムでクエンチし、Ｎ−１−保護トリプタミン遊離塩基は酢酸イソプロピルで抽出した。安定性試験は、遊離塩基抽出物（約１００ｍＭ）を７０℃で一晩加熱することにより行った。Ｐｉｖ化合物は完全に分解し、Ｄｍｂ化合物は約５０％分解し、Ｔｏｌ化合物は＜５％分解したことが分かった。同程度の分解が、抽出物をロータリーエバポレーター上で濃縮した場合、及び純粋なアミンを室温に一晩置いた場合に観察された。抽出物は、冷凍庫の中で貯蔵した場合には安定であることが分かった。

次に、ＢＯＣ基を外し、Ｎ−１保護されているトリプタミンを５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と縮合してＮ−１保護されているＴｒｐｄＵヌクレオシドを得ることにより、３つの有力候補（Ｔｏｌ、Ｄｍｂ、Ｐｉｖ）を対応する５’−ＤＭＴ−２’デオキシウリジン−５−カルボキサミド（Ｔｏｌ−ＴｒｐｄＵ、Ｄｍｂ−ＴｒｐｄＵ、及びＰｉｖ−ＴｒｐｄＵ）へと変換した。アミンの自動劣化を最小限にするために、ロータリーエバポレーター上での濃縮前の脱ＢＯＣ反応からの乾燥抽出物にＴＦＥｄＵを直接添加した。この方法を使用することにより、望ましい反応経路が優勢であり、純粋な５’−ＤＭＴ−２’デオキシウリジン−５−カルボキサミドが得られることが分かった。これはシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。

その後、これらのヌクレオシドを、アルカリによる脱保護のモデル試験で評価した（表７）。アシル保護基であるＴｏｌ及びＤｍｂの切断は、最初のＢＯＣ−トリプタミンモデルにおいてよりもＴｒｐｄＵヌクレオシド化合物においてのほうが遅いことが分かった（表６）。

実施例３：Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰの合成
Ｎ−１−Ｐｉｖ−トリプタミン側鎖（安定なトリフルオロアセテート［ＴＦＡ］塩として）を調整するために効率的な３段階プロセスを開発した。これは３つの結晶性中間体を含み、クロマトグラフィーを必要としない。その後、ＴＦＡ塩はＴＦＥｄＵとカップリングされる。完全な工程は図５及び６に示されている。

Ｎ−α−ＢＯＣ−トリプタミン。シリカゲルクロマトグラフィーを回避するＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンの製造方法を開発した。溶媒として酢酸イソプロピルを使用することにより、反応混合物から生成物を直接結晶化させることができる。図５を参照のこと。

出発物質であるトリプタミンは、現在Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから市販されているもの（製品Ａ１１１１６）などの、肌色または淡褐色の顆粒状結晶性固体である。茶色い糞便の臭いがするトリプタミンは使用前に再結晶する必要がある。ＢＯＣ無水物（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート；製品２０５２４９）、並びに全ての他の溶媒及び試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったままの状態で使用した。

機械撹拌されている１Ｌの丸底フラスコに、トリプタミン（４９．３２ｇ，３０８ｍｍｏｌ）及び酢酸イソプロピル（２００ｍＬ）を入れた。アルゴンバブラーの下で混合物を高速で撹拌し、酢酸イソプロピル（１００ｍＬ）の中にジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（７０．５３ｇ，３２３ｍｍｏｌ）が入っている溶液を３０分かけて滴下した。約４０ｍＬ添加された後に気体が絶え間なく放出され始め、添加の終わり頃に全ての固体が溶解して黄色い溶液が得られた。撹拌をもう３０分継続し、ＴＬＣでチェックすることで出発物質のトリプタミンの消費を確認した（ＳＧ６０，１０％ＭｅＯＨ／９０％ジクロロメタン，Ｒｆ（ＳＭ）＝０．１，Ｒｆ（生成物）＝０．８）。

溶液を濾過して若干の粒状物及び小さなごみを除去した。濾液（約３９５ｇ）をロータリーエバポレーター上で約２５０ｇまで濃縮し、温かい（４０℃）溶液を、濁り始めるまでヘキサン（約２２０ｍＬ）でゆっくり希釈した。１０ｍｇの標品の種結晶を溶液に入れたところ、速やかに結晶化した。スラリーを室温で１時間、及び氷上で１時間撹拌することにより熟成させ、次いで濾過し、２５％ｉＰｒＯＡｃ／７５％ヘキサン（７５ｍＬ）ですすいだ。フィルターケーキをヘキサン（１００ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥させることでＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを白色結晶固体として得た（融点８６〜８８℃）、６１．７５ｇ、収率７７％。

Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｎ−１−トリメチルアセチル−トリプタミン。Ｃｏｌｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５０（２３），５５３５−５５３８，２００７の研究に基づいて、ＴＨＦ中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを反応のための塩基及び溶媒として最初に使用したが、約５％の極性二量体副生成物（正確な構造は決定せず）が生成した。これは結晶化により除去するのが困難であった。複数の溶媒と塩基の組み合わせを試してみたところ、二量体副生成物は、ジエチルエーテル中のナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを使用することによって抑制できることが明らかになった。最後に、過剰にアセチル化された副生成物が生成しないように、トリメチルアセチルクロリドを少量ずつ添加してＮ−１アニオンを滴定した。図５を参照のこと。

大きい（１．５”）磁気撹拌子を備えた乾燥したアルゴン充填されている１Ｌの丸底フラスコに、Ｎ−α−ＢＯＣ−トリプタミン（２８．６３ｇ，１１０ｍｍｏｌ）及びナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド粉末（１１．６３ｇ，１２１ｍｍｏｌ，注意：刺激性粉末）を入れた。アルゴン下、カニューレによってジエチルエーテル（無水，４００ｍＬ）を添加し、１０分間撹拌したところ、滑らかで白亜色のスラリーを得た。トリメチルアセチルクロリド（１４．６ｇ，１２１ｍｍｏｌ，理論値１１０％）のジエチルエーテル（約５０ｍＬ）溶液（総体積６０ｍＬ）が入っている目盛り付きの滴下漏斗を取り付けた。スラリーを氷の中で冷却し、酸塩化物溶液の大部分（５４．５ｍＬ，１１０ｍｍｏｌ，理論値１００％）を約４０分かけて滴下しながら高速で撹拌した。溶液を更に２０分撹拌し、ＴＬＣのために試料採取した［１ｍＬのジクロロメタン中の０．２ｍＬ分］（ＳＧ６０，２５％酢酸エチル／７５％ヘキサン；Ｒｆ（ＳＭ）＝０．２，Ｒｆ（生成物）＝０．４）。出発物質が検出できる（＞１％）場合、対応する追加分の酸塩化物溶液（ＴＬＣ分析により示される通り、１〜１０％の理論値）を添加し、１時間撹拌を継続した。

反応を５％の炭酸水素ナトリウム（２００ｍＬ）及び酢酸イソプロピル（１００ｍＬ）でクエンチした。有機層をＮａＣｌ食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で乾燥するまでエバポレーションすることで褐色固体を得た（約３７ｇ）。この粗生成物を、酢酸イソプロピル（７４ｍＬ）とヘキサン（２９６ｍＬ）の加熱溶液から再結晶した。約３５℃まで冷却した後、撹拌されている状態の溶液に標品の種結晶（５０ｍｇ）を溶液に入れたところ、速やかに結晶化した。スラリーを室温で１時間及び氷上で１時間、高速で撹拌した。スラリーを濾過し、濾液の一部（３０ｍＬ）で洗い出し、その後ケーキをヘキサン（６０ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥させた。Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｎ−１−トリメチルアセチル−トリプタミンを白色〜灰白色の結晶固体として得た（融点９５〜９７℃）、３０．７ｇ、収率８１％。

必要に応じて、生成物を酢酸イソプロピル（２ｍＬ／ｇ）及びヘキサン（８ｍＬ／ｇ）から追加的な再結晶によって再処理してもよい。

Ｎ−１−トリメチルアセチル−トリプタミントリフルオロ酢酸塩。この塩は、容易に濾過及び洗浄される白色結晶固体であり、安定かつ非吸湿性である。塩は、反応混合物から直接結晶化する。図５を参照のこと。

５００ｍＬの丸底フラスコに、クライゼンアダプター、及びアルゴンでヘッドスペースをゆっくりスイープするように構成されたオイルバブラーを装着した。これは反応混合物からのイソブチレンガスの除去を促進し、副生成物を低減する。

大きい磁気撹拌子を備えた５００ｍＬの丸底フラスコ（上の通りに構成）に、無水ジクロロメタン（９０ｍＬ）中に溶解しているＮ−α−ＢＯＣ−Ｎ−１−トリメチルアセチル−トリプタミン（３０．０ｇ，８７．１ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５３ｍＬ，６９３ｍｍｏｌ，８当量）を入れた。イソブチレンガスが発生し、これを、オイルバブラーを介して追い出しながら、溶液を高速で撹拌した。１時間後、混合物中で結晶が形成し始め、ＴＬＣ分析からは出発物質が完全に消費されたことが示された（ＳＧ６０，２５％酢酸エチル／７５％ヘキサン；Ｒｆ（ＳＭ）＝０．４；ＲＦ（生成物）＝０）。よく撹拌されている混合物にジエチルエーテル（約２７５ｍＬ）を滴下して粘度を高め、得られたスラリーを室温で１時間高速で撹拌した。少量の軟らかい壁のケーキ（ｗａｌｌ ｃａｋｅ）を撹拌子で崩し、スラリーを濾過し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗い出した。ケーキをジエチルエーテル（１００ｍＬ）で注意深く洗浄し、真空で乾燥させることで、Ｎ−１−トリメチルアセチル−トリプタミントリフルオロ酢酸塩を白色の結晶粉末として得た（融点１５０〜１５２℃）、３０．０ｇ、収率９６％。

Ｎ−１−トリメチルアセチル−トリプタミントリフルオロ酢酸塩はあまり吸湿性ではなく、密封された容器の中で光から保護しながら周囲温度で輸送することができる。非公式の安定性試験からは、塩が密封されたバイアルの中で、７０℃で１０日間安定であることが示された。長期間の貯蔵（＞１か月）に関しては、予防措置として冷蔵または冷凍貯蔵条件が使用されてもよい。

特定のトリプタミン化合物の^１Ｈ−ＮＭＲの特徴のまとめが表８に示されている。

５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［Ｎ−（（（Ｎ−１−トリメチアセチル）−３−インドール）−２−エチル）カルボキサミド］−−２’−デオキシウリジン（Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ）。２００ｍＬの丸底フラスコに、５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ，工業用グレード，約９０％，１３．１ｇ，２０ｍｍｏｌ補正なし）及びＮ−１−トリメチルアセチル−トリプタミントリフルオロ酢酸塩（９．２３ｇ，２６ｍｍｏｌ，１．３当量）を入れた。シリンジで無水アセトニトリル（１０４ｍＬ）を入れ、その後トリエチルアミン（５．６ｍＬ，４０ｍｍｏｌ，２．０当量）を入れた。得られたオレンジ色の溶液を、アルゴン下、６０℃で２４時間加熱した。０．１ｍＬ分を取り出し、ＴＬＣ分析（ＳＧ６０，溶離液：１：１のアセトン：ヘキサン）のためにジクロロメタンで希釈した。図６を参照のこと。ＴＦＥｄＵ出発物質が検出できる（＞１％）ままの場合、対応する追加分のＮ−１−トリメチルアセチル−トリプタミントリフルオロ酢酸塩（１〜５％）を添加し、加熱を継続する。ＴＦＥｄＵが消費された場合には（＜１％）、反応混合物をロータリーエバポレーター上で泡状物質までエバポレーションする。クロマトグラフィーのために、泡状物質（約３３ｇ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）中に再度溶解させる。

４”Ｄ×６”Ｈのフラッシュシリカゲルカラムを、２／２／９６のＴＥＡ／ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（４Ｌ）を用いて準備し、その後２／９８のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２Ｌ）で流した。粗生成物を載せ、１／９９のＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２Ｌ）、その後に２／９８のＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離させた。フラクション（２５０ｍＬ）を回収し、フラクション８〜１９を貯めることで、ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵヌクレオシドを１４．８ｇの淡黄色固体として得た（収率６６％）。黄変を最小限にするために濡れた状態の固体はアルゴン下で扱った。

^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＣＮ， ３００ ＭＨｚ）：δ８．７６ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６ Ｈｚ， ＣＯＮＨＣＨ_２）， ８．５４ （ｓ， １Ｈ， Ｈ−６）， ８．４１ （１Ｈ， ｂｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， Ｉ−７）， ７．７３ （１Ｈ， ｂｓ， Ｉ−２）， ７．６０ （１Ｈ， ｄｔ， Ｊ ＝ ８，１ Ｈｚ， Ｉ−４）， ６．８１−７．４３ （１５Ｈ， ｍ， トリチル並びに Ｉ−５及びＩ−６，重複）， ６．０９ （１Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， Ｈ−１’）， ４．２４−４．２８ （１Ｈ， ｍ， Ｈ−３’）， ３．９８ （１Ｈ， ｑ， Ｊ ＝ ４ Ｈｚ， Ｈ−４’）， ３．７０１ （３Ｈ， ｓ， ＭｅＯ）， ３．７００ （３Ｈ， ｓ， ＭｅＯ’）， ３．６２−３．６９ （２Ｈ， ｍ， ＣＨ_２− α）， ３．２５−３．２７ （２Ｈ， ｍ， Ｈ−５’及びＨ−５”）， ２．９５ （２Ｈ， ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ＣＨ_２−β）， ２．１８−２．３４ （２Ｈ， ｍ， Ｈ−２’及びＨ−２”）， １．４１ （９Ｈ， ｓ， Ｐｉｖ）。

^１３Ｃ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＣＮ， １００ ＭＨｚ， ３３ｘＣ）： δ１７７．０， １６３．０， １６１．８， １５８．６， １４９．５， １４５．６， １４５．１， １３７．１， １３５．８， １３０．１， １２９．５， １２８．０， １２７．９， １２６．８， １２５．０， １２３．８， １２３．２， １１８．７， １１８．６， １１７．０， １１３．１， １０５．７， ８６．３， ８６．２， ７１．０， ６３．６， ５４．８， ４０．９， ４０．２， ３８．３， ２７．８， ２４．８。

マススペクトル［Ｍ−Ｈ］⁻：Ｃ_４６Ｈ_４８Ｎ_４Ｏ_９についての計算値：８００．９１；実測値：７９９．３。

５’−Ｏ−（４，４’−ジメチルトリチル）−５−［Ｎ−（（（Ｎ−１−トリメチアセチル）−３−インドール）−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−２−シアノエチルホスホロアミダイト（Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰ）。全てのクロマトグラフィー溶媒は、微小ガス噴射管を使用してアルゴンを注入することにより酸素除去された。反応のための準備において、６”Ｄ×６”Ｈのフラッシュシリカゲルカラムを、２／３０／６８のＥｔ_３Ｎ／ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（８Ｌ）を用いて準備し、その後３０／７０のヘキサン／ＥｔＯＡｃ（４Ｌ）で流した。追加的な３０／７０溶離液（１６Ｌ）を調製し、脱気した。

アルゴン下、乾燥している丸底フラスコに、Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ（４１．３ｇ，５１．５ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（８３ｍＬ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロ−アミダイト（１８．０ｍＬ，５６．７ｍｍｏｌ，１．１当量）を入れ、最後にピリジントリフルオロアセテート粉末（１０．９５ｇ，５６．７ｍｍｏｌ，１．１当量）を入れた。混合物を高速で撹拌することで黄色溶液を得た。３０分後、一定分量をＴＬＣ分析（ＳＧ６０，溶離液：１／１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）のために抜き出した。これは出発物質が消費され、２種の非極性生成物が形成されたことを示した。図６を参照のこと。

反応混合物全体を、準備したフラッシュカラムにかけ、３０／７０のヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶離し、１０×０．５Ｌ、その後１０×１Ｌを回収し、フラクションにアルゴンを充填し、ガラス瓶に栓をした。生成物（２つのジアステレオマー）を貯めておいたフラクション８〜１７から回収し、これをアルゴン下でエバポレーションし、仕上げ濾過し、無水ＡＣＮ（２×５００ｍＬ）で洗浄した。高真空で乾燥させることで、灰白色の泡状物質としてＰｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰを得た（４２．９％，収率８３％）。

^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＣＮ， ３００ ＭＨｚ） δ ９．６１ （１Ｈ， ｂｓ， ＮＨ−３）， ８．７３／８．７２ （１ Ｈ， ２ｂｔ， Ｊ ＝ ５．６／５．６ Ｈｚ， ＣＯＮＨＣＨ_２）， ８．５８／８．５６ （１Ｈ， ２ｓ， Ｈ−６）， ８．４３／８．４１ （１Ｈ， ２ｂｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， インドール−７）， ７．７４ （１Ｈ， ｂｓ， インドール−２）， ７．６０ （１Ｈ， ｂｄ， Ｊ ＝ ８ Ｈｚ， インドール−４）， ６．８３−７．４５ （１５ Ｈ， ｍ， １３×トリチル並びにインドール−５及びインドール−６， 重複）， ６．１１／６．０９ （１Ｈ， ２ｔ， Ｊ ＝ ６．６／６．６ Ｈｚ）， ３．７２ （３Ｈ， ｓ， ＯＭｅ）， ４．３８−４．４７ （１Ｈ， ｍ， Ｈ−３’）， ４．１２−４．１５ （１Ｈ， ｍ， Ｈ−４’）， ３．７１ （３Ｈ， ｓ， ＯＭｅ’）， ３．５１−３．７６ （６Ｈ， ｍ， ＣＯＮＨＣＨ_２， ２ ｘ Ｍｅ_２ＣＨ， ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ，重複）， ３．２９−３．３５ （２Ｈ， ｍ， Ｈ−５’及びＨ−５”）， ２．５０／２．６１ （２Ｈ， ２ｔ， Ｊ ＝ ６／６ Ｈｚ， ＣＨ_２ＣＮ）， ２．２７−２．５４ （２Ｈ， ｍ， Ｈ−２’及びＨ−２”）， １．４１ （９Ｈ， ｓ， Ｐｉｖ）， １．０１−１．１６ （１２Ｈ， ｍ， ２×［ＣＨ_３］_２ＣＨ）。

^３１Ｐ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＣＮ， １６１ ＭＨｚ） δ １４８．１２， １４８．０９。

３つのＮ−１−保護−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰアナログについての追加的な分析データのまとめ及び開発バッチの履歴は表９に示されている。

実施例４：ＴｒｐｄＵ ホスホロアミダイト中での選択された保護基の使用
３つの有力なＮ−１保護されているアナログであるＴｏｌ−ＴｒｐｄＵ、Ｄｍｂ−ＴｒｐｄＵ、及びＰｉｖ−ＴｒｐｄＵを、実質的に上で説明した通りにシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＣＥＰ）へと変換し、固相オリゴヌクレオチド合成におけるその使用を評価した。

３つ全ての保護されているＴｒｐｄＵ ＣＥＰは固相オリゴヌクレオチド合成においてよく機能したが、Ｔｏｌ−ＴｒｐｄＵは、いくつかの事例で不完全な脱保護を示し、これはヌクレオシドモデル系（表７）と一致した。Ｄｍｂ−ＴｒｐｄＵとＰｉｖ−ＴｒｐｄＵは共に、全ての標準条件（ｔＢｕＮＨ_２／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ；ＭｅＮＨ_２（気体））下で完全に脱保護された。

配列中のＵ塩基位置がそれぞれ修飾されたｄＵによって占められている、Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰ、元の保護されていないＴｒｐｄＵ ＣＥＰ、またはＮａｐｄＵ ＣＥＰ（陽性対照；表１０）を用いて、同じヌクレオチド配列を有するアプタマーを合成した。アプタマーは、１３個のｄＵ位置の残基を有する５１ｍｅｒであった。

図４は、組み込まれたＰｉｖ−ＴｒｐｄＵ、ＴｒｐｄＵ、及びＮａｐｄＵのいずれかを有する３つのアプタマーについての結果を示している。保護されていないＴｒｐｄＵ ＣＥＰは、多くの早く及び遅く溶離する副生成物を有する幅広いピークを与える。Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰは、ＮａｐｄＵ ＣＥＰを有する対照のアプタマーに匹敵する狭いピーク幅を有する特にきれいな分析結果を与える。

新規なホスホロアミダイトを使用することによる保護されていないＴｒｐｄＵと比べた収率の改善を示すために、Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰを使用して６個の異なるアプタマーを合成した。表１１中の最初の４つのアプタマー（アプタマー１〜４）は、１μｍｏｌスケールで標準条件を使用してＭｅｒＭａｄｅ合成装置（ＡＭＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で合成した。これは以前保護されていないＴｒｐｄＵを使用して低収率の結果が得られていた。表１１中の５番目のアプタマー（アプタマー５）は、標準的なワークフロー及び脱保護条件を使用してＡＢＩ合成装置上で合成した。これは、保護されていないＴｒｐｄＵで許容可能な収率を示した。６番目のアプタマー（アプタマー６）は、標準的なワークフロー及び脱保護条件を使用してＡＢＩ合成装置上で合成した。これは以前保護されていないＴｒｐｄＵを使用して低収率の結果が得られていた。

表１１はその実験の結果を示している。

アプタマー１〜４及び６についてのオリゴヌクレオチド合成でのＰｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰの使用は、保護されていないＴｒｐｄＵを用いたアプタマーの合成収率の約２５０〜３００％までアプタマーの合成収率を増加させた。アプタマー５についてのオリゴヌクレオチド合成においてＰｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰを使用すると、保護されていないＴｒｐｄＵを用いたアプタマーの合成収率に対して約２５％合成収率が増加した。したがって、異なる合成装置は異なる収率を与える場合があるものの、一般的な傾向として、Ｐｉｖ−ＴｒｐｄＵ ＣＥＰを使用すると、保護されていないＴｒｐｄＵを使用する場合と比較してオリゴヌクレオチドの合成収率が改善される。

Claims (50)

1. 

   を含む化合物またはその塩
   （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される）。
2. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１に記載の化合物。
3. Ｘ_１及びＸ_２がメトキシである、請求項１または２に記載の化合物。
4. Ｘ_３が水素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. Ｘ_３がメトキシである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
6. Ｘ_３がフルオロである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
7. 以下：
   

   

   

   及びその塩から選択される、請求項１に記載の化合物。
8. 

   を含む化合物またはその塩
   （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される）。
9. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項８に記載の化合物。
10. Ｘ_１及びＸ_２がメトキシである、請求項８または９に記載の化合物。
11. Ｘ_３が水素である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
12. Ｘ_３がメトキシである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
13. Ｘ_３がフルオロである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
14. 以下：
    

    

    

    及びその塩から選択される、請求項８に記載の化合物。
15. 

    を含む化合物またはその塩
    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される）。
16. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１５に記載の化合物。
17. 以下：
    

    

    及びその塩から選択される、請求項１５に記載の化合物。
18. 

    を含む化合物
    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される）。
19. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１８に記載の化合物。
20. 以下：
    

    

    から選択される、請求項１８に記載の化合物。
21. 

    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される）
    を含む化合物またはその塩の製造方法であって、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させることを含む、前記方法。
22. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルであり、前記酸塩化物がピバロイルクロリドである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記化合物が
    

    

    から選択される、請求項２１に記載の方法。
24. 

    （式中、Ｒ１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択される）
    を含む化合物の製造方法であって、次の化合物
    

    

    をトリフルオロ酢酸と反応させることを含む、前記方法。
25. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項２４に記載の方法。
26. 前記方法が：
    

    

    から選択される化合物を製造する、請求項２４に記載の方法。
27. 前記方法が、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
28. 

    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される）。
    を含む化合物またはその塩の製造方法であって、
    次の化合物：
    

    

    を、５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と反応させることを含む、前記方法。
29. 前記方法が：
    

    

    

    から選択される化合物を製造する、請求項２８に記載の方法。
30. 次の化合物：
    

    

    を、トリフルオロ酢酸と反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成することを更に含む、請求項２８または２９に記載の方法。
31. 前記方法が、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
32. 

    を含む化合物またはその塩
    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される）
    の製造方法であって、
    次の化合物：
    

    

    を、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロ−アミダイトと反応させることを含む、前記方法。
33. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項３２に記載の方法。
34. Ｘ_１及びＸ_２がメトキシである、請求項３２または３３に記載の方法。
35. Ｘ_３が水素である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
36. Ｘ_３がメトキシである、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
37. Ｘ_３がフルオロである、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記方法が、
    次の化合物：
    

    

    を、５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成することを含む、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記方法が、次の化合物：
    

    

    を、トリフルオロ酢酸と反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成することを含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記方法が、ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成することを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 

    

    

    から選択される化合物及びその塩を製造する、請求項３２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 

    を含む化合物またはその塩
    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ独立に、メトキシ及び水素から選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択される）
    の製造方法であって、
    ｅ）ピバロイルクロリド、２，２−ジメチルブチロイルクロリド、２，２−ジメチルバレロイルクロリド、１−メチルシクロペンタン−１−カルボニルクロリド、１−メチルシクロヘキサン−１−カルボニルクロリド、２−クロロベンゾイルクロリド、及び２−シアノベンゾイルクロリドから選択される酸塩化物とＮ−α−ＢＯＣ−トリプタミンを反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成する工程；
    ｆ）次の化合物：
    

    

    をトリフルオロ酢酸と反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成する工程；
    ｇ）次の化合物：
    

    

    を５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ−カルボニル）−２’−デオキシウリジン（ＴＦＥｄＵ）と反応させて、次の化合物：
    

    

    を形成する工程：及び
    ｈ）次の化合物：
    

    

    を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロ−アミダイトと反応させる工程；
    を含む、前記方法。
43. Ｒ_１がｔｅｒｔ−ブチルである、請求項４２に記載の方法。
44. Ｘ_１及びＸ_２がメトキシである、請求項４２または４３に記載の方法。
45. Ｘ_３が水素である、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
46. Ｘ_３がメトキシである、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
47. Ｘ_３がフルオロである、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記方法が：
    

    

    

    

    から選択される化合物及びその塩を製造する、請求項４２に記載の方法。
49. 少なくとも１つの保護されているＴｒｐＵヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの保護されているＴｒｐＵヌクレオチドが、次の構造：
    

    

    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択され；Ｘ_４は、ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のＺ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒは、オリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドであり；Ｘ_５は、−Ｏ−ｓｓ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒはオリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドである）
    を有する、前記オリゴヌクレオチド。
50. 少なくとも１つのＴｒｐＵヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの製造方法であって、次の構造：
    

    

    （式中、Ｒ_１は、ｔｅｒｔ−ブチル、１，１−ジメチル−プロピル；１，１−ジメチル−ブチル；２−クロロフェニル；２−シアノフェニル；１−メチル−シクロペンチル；及び１−メチル−シクロヘキシルから選択され；Ｘ_３は、メトキシ、フルオロ、水素、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシから選択され；Ｘ_４は、ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のＺ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒは、オリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドであり；Ｘ_５は、−Ｏ−ｓｓ、−ＯＲ、−ＳＲ、及び−Ｚ−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−Ｒから選択され、式中のｓｓは固体支持体であり、Ｚ、Ｚ’、及びＺ”は、それぞれ独立にＯ及びＳから選択され、Ｒはオリゴヌクレオチド中の隣接するヌクレオチドである）
    を有する少なくとも１つのヌクレオチドを、固体支持体上のヌクレオチド配列の中に組み込むこと；及び、前記オリゴヌクレオチドの中に組み込まれた前記少なくとも１つのＴｒｐＵヌクレオチドから、保護基である
    

    

    を外すこと；を含む、前記方法。

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