JP6793996B2

JP6793996B2 - 目的とする含量で不純物を含むＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の製造方法

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Publication number: JP6793996B2
Application number: JP2017535373A
Authority: JP
Inventors: サン・ウー・パク; ファ・ヨン・イ; スン・ウォン・チェ; チュル・ホ・ジュン
Original assignee: LG Chem Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2020-12-02
Anticipated expiration: 2035-12-29
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Description

本発明は、目的とする含量で疎水性クロマトグラムのピーク３を含む、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合物を製造する方法及び疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節する方法に関するもので、具体的に、（ａ）哺乳類細胞で生産されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料を塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液で前−平衡化された芳香族官能基を含む疎水性クロマトグラフィー媒質を使用するＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合物の製造方法、及び所定の濃度の塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液を用いた疎水性クロマトグラフィーによる疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節する方法に関する。

エタネルセプト（Etanercept）は、体内で細胞表面のＴＮＦ-α受容体（ＴＮＦ-αreceptor）とＴＮＦ-αが結合することを競争的に阻害して、ＴＮＦ-αと関連された免疫反応を抑制する役割をする生物学的炎症調節剤（ biological inflaｍｍation modulator）である。このようなエタネルセプトは、水溶性のヒトｐ７５ＴＮＦ（tumor nectosis factor）受容体（ＴＮＦＲ）とヒト免疫グロブリンＧサブクラス（subclass）１のＦｃ部位が結合されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質であって、融合タンパク質の２つが二硫化結合（disulfide bond）で結合された同質二量体（homodimer）の形態を有し、分子量が１５０ｋＤａに及ぶ巨大分子である（非特許文献１及び非特許文献２）。

このような融合タンパク質の典型的な形態は１９９０年代初にテキサス大学、サウスウェスタンメディカルセンター（University of Texas Southwestern Medical Center）のブルースＡビュートラー（Bruce A. Beutler）などによって初めて合成され、２００２年にアムジェン（Amgen）社によりエンブレル（Enbrel(登録商標)）という商品名で発売された。エタネルセプトはＴＮＦ-α阻害剤として関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎などに使われており、血管炎、アルツハイマー病及びクローン病に適用するための臨床研究が進行中である。

ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲの２３５個のアミノ酸とヒンジを含むＦｃ部分の２３２個のアミノ酸を融合して作製することができ、遺伝子組換え技術を利用して生産する場合、二量体（dimer）の形態で存在して生物学的活性を示す。前記ＴＮＦＲは、４つのドメインと膜（transmembrane）領域に分けられ、これを構成する総計２３５個のアミノ酸のうちシステインの数が２２個であり、これらのシステインはすべてジスルフィド結合を成し立体構造を形成している。しかし、動物細胞などを用いてＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を生産する場合、システインがランダムに結合して天然タンパク質と同一なジスルフィド結合を成していない場合が発生する。また、一部のＴＮＦＲ部分が切断されて正しい形態のＴＮＦＲ-Ｆｃ二量体が生成されない場合が発生する。正しいジスルフィド結合を成していないＴＮＦＲ-Ｆｃの場合、ＴＮＦ-αとの結合能力が急激に減少して適切な生物学的活性を示さない。また、ＴＮＦＲの一部または全部が切断された場合も、同様に生物学的活性を示さないことがある。

したがって、ＴＮＦＲ-Ｆｃ二量体を遺伝子組換え技術と動物細胞の培養技術を利用して生産する場合、活性型タンパク質、ジスルフィド結合が正しくない非活性型タンパク質、凝集体及び切断された形態のタンパク質などが同時に生産されるため、これらのタンパク質を分離精製する技術が必要である。

さらに、エタネルセプトの開発会社であるＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社により開示された組換えタンパク質の生産方法に関する特許（特許文献１）によると、疎水性クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography; HIC）分析を通じて３つのピークで存在することを確認し、前記ピークが順番にＳ１８６とＤ２３５の位置でクリップされた（Clipped）形態のエタネルセプト、活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質及び凝集体、ジスルフィドスクランブルされたＴＮＦＲ-Ｆｃなどを含む非常に低い生物活性を有する多様な形態のエタネルセプトで構成されていることを確認した。これは組換えタンパク質の生産方法を利用して活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法を開示した特許文献２でも同一のピークパターンを開始しており、既存のＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の分離に使用されている疎水性クロマトグラフィーは不純物、例えば、凝集体、ジスルフィドスクランブルされたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質、切断型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質のような活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質以外の成分を除去して不純物を最小化し、活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を高純度で収得することだけを目的としていた。

一方、バイオシミラーは、既存の許可された製品に比べて品質、安全性、効能の面において同等な物質を意味し、更に詳細には、オリジネーター製品（Originator product）の不純物成分及び含量においても類似な組成を持たなければ、生物医薬品として使用することができない。例えば、エタネルセプト（Pfizer）の場合、生物学的活性が低い、前記の従来技術を通じて疎水性クロマトグラフィーのピーク３を構成するものと公知された、成分（以下、ピーク３と称する）を約９〜１８％含有しており、これらの成分は薬効（potency）だけでなく、薬理にも影響を与えることができる。したがって、これをバイオシミラー製品として開発するためにはオリジネーター製品と同様の水準でピーク３の含量を調節することが必要である。しかし、従来組換えタンパク質の生産方法で製造されたＴＮＦＲ-Ｆｃを含む試料をＨＩＣを用いて精製する方法が試みられていたが（特許文献２）、これは不純物を除去して活性型のＴＮＦＲ- Ｆｃ、つまりピーク２の成分を高純度で収得するためのものにすぎず、不純物の一種である生物活性が低いピーク３の含量をオリジネーター製品と同様の水準に調節しようとする試みはなかった。

米国特許７，２９４，４８１号韓国登録特許第１０-１４５４３１６号

Goldenberg, Clinical Therapeutics, 21(1): 75-87, 1999 Moreland et al., Ann. Intern. Med., 130(6): 478-486, 1999

本発明者らは、疎水性クロマトグラフィーを用いてＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を生産するにあって、ピーク３の含量を調節し、これを一定の水準で含むＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の製造方法を開発するために鋭意研究努力した結果、芳香族官能基を含む疎水性クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography; HIC）媒質（medium）を利用し、これを所定の濃度の塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液で前−平衡化した後、試料をローディングして溶出させることにより、既存のオリジネーター製品と同様の水準でピーク３の含量が調節されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を生産しうることを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、目的とする含量で疎水性クロマトグラムのピーク３を含む、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合物を製造する方法、及び疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節する方法を提供することにある。

本発明は、疎水性クロマトグラフィーを用いて、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を生産するにあって、所定の濃度の塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液で平衡化して疎水性クロマトグラフィーを行うことにより、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節し、これを目的とする含量で含むようにＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法を提供することができる。したがって、前記提示された方法は、動物細胞の培養から遺伝子組換え技術で生産されたエタネルセプトのような組換えタンパク質を含む生物医薬品の製造において有用に使用することができる。

本発明の一実施例によるフェニルセファロース高性能レジン（Phenyl Sepharose High Performance resin）を用いたＨＩＣフロースルー工程クロマトグラムを示した図である。

前記課題を解決するための本発明の一つの態様として、目的とする含量で疎水性クロマトグラムのピーク３を含む、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合物を製造する方法を提供する。

前記方法は、好ましくは（ａ）哺乳類細胞で生産されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料を塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液（equilibration buffer; EQ buffer）で前−平衡化された芳香族官能基を含む疎水性クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography; HIC）媒質が充填されたカラムに注入する段階；及び（ｂ）前記平衡緩衝液と同じ濃度で塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液でタンパク質を溶出させ、溶出液を収集する段階を含めて行うことができる。

前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞でＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を生産する場合、ＴＮＦ-αに結合する生物学的活性を示す二量体（dimer）形態のＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質が形成されること以外に、ＴＮＦＲタンパク質のシステインがランダムに結合して天然型ＴＮＦＲタンパク質と同一でないジスルフィド結合を形成したり、ＴＮＦＲタンパク質の一部分が切断されて正しい形態のＴＮＦＲ-Ｆｃ二量体が形成されていないという問題点があった。これらの成分は、疎水性クロマトグラムでそれぞれ分離されたピークに表れ、既存の研究ではこれをそれぞれピーク１、ピーク２及びピーク３と定義し、各ピークは切断型タンパク質、活性型タンパク質及びその他の凝集体またはジスルフィドスクランブルされたＴＮＦＲ-Ｆｃなどの生物活性が低い成分を含んでいることが確認された。このようなＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質はエタネルセプトを含み、ブロックバスター医薬品として販売されている。しかし、既存の臨床的または市販用で許可された製品は、前記ピーク３を９〜１８％で含有しており、これは薬効及び/または薬理に影響を与えることができる水準であり、特に、バイオシミラー医薬品の許可に当たっては既存の許可された製品またはオリジネーター製品との同等性を要求し、さらに、バイオシミラーの場合、生産に使用される分離精製工程などの製造工程により不純物の含有程度などが異なり、これは医薬品の効能に影響を与える可能性があるため、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を同等に調節することは非常に重要である。しかし、前記組換えタンパク質の生産技術を利用してＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を生産する場合、提供される各成分の含量は一定でなく、調節が不可能である。したがって、前記様々な形態のＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を含む混合液を精製する過程により単純に生物活性が低い成分を除去するのではなく、これを一定の水準に含有するように調節することができる方法を必要とする。本発明の前記方法は、疎水性クロマトグラフィーを用いてＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合液から活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を分離することにあたって、目的とする含量で凝集体またはジスルフィドスクランブルされたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質などを含む疎水性クロマトグラムのピーク３を含有するように精製するのに有用に使用することができる。

本発明の方法は、既存の不純物の除去にのみ使用されていた疎水性クロマトグラフィーを哺乳類細胞で生産されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料を様々な濃度の塩、特に塩化ナトリウムで平衡化させた場合、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を所望の水準に調節しうることを最初に究明し、このような結果は報告されたことない。

本発明において、用語「ＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor）タンパク質」は、ＴＮＦ-αに結合する受容体タンパク質を意味する。前記ＴＮＦＲタンパク質はＴＮＦＲＩ（ｐ５５）タンパク質またはＴＮＦＲＩＩ（ｐ７５）タンパク質の両方を含み、好ましくはＴＮＦＲＩＩタンパク質であるが、これに限定されない。また、前記ＴＮＦＲＩＩはＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B）と混用することができる。前記ＴＮＦＲＩＩタンパク質は４つのドメイン及び膜通過（transmembrane）領域に分けられ、その例として２３５個のアミノ酸から構成されている４つのドメイン及び膜通過領域を含むＴＮＦＲＩＩタンパク質であってもよいが、これに限定されない。前記ＴＮＦＲＩタンパク質及びＴＮＦＲＩＩタンパク質についての情報は、米国国立衛生研究所ＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができ、その例としてＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒがＮＰ_００１０５６またはＰ２０３３３のタンパク質であってもよいが、これらに限定されない。

前記ＴＮＦＲタンパク質は人体内に過発現されると多様な疾患を起こすものとして知られているＴＮＦ-αに結合する活性を有するため、これを利用して自己免疫疾患のようなＴＮＦ-αにより媒介される疾病の治療に利用することができる。そのため、免疫グロブリンのＦｃ領域をＴＮＦＲタンパク質に融合させて半減期を増大させた融合タンパク質の形態で製作して利用することができる。

本発明において、用語、「ＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor）-Ｆｃ融合タンパク質」は、ＴＮＦＲタンパク質すべてまたは一部分が免疫グロブリンのＦｃ領域と酵素作用によって結合されるか、または遺伝子操作を通じて前記二つのポリペプチドが一つのポリペプチドで発現された結果物を意味する。前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質はＴＮＦＲタンパク質と免疫グロブリンのＦｃ領域とが直接結合されたり、ペプチドリンカー（peptide linker）を通じて結合されてもよいが、これに限定されない。前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の例としてエタネルセプトが含まれてもよい。

前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質はＴＮＦＲタンパク質の全部または一部を免疫グロブリンＦｃ領域と融合して製作することができ、その例としてＴＮＦＲＩＩタンパク質の１〜２３５番のアミノ酸部位とヒンジ（hinge）部位を含む免疫グロブリンＦｃ領域の２３２個のアミノ酸を融合することができるが、これらに限定されない。また、前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は発現しようとする宿主細胞に応じてコドン最適化（codon optimization）することができ、その例として前記ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列と定義されるＣＨＯ細胞に特異的にコドン最適化されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質であってもよいが、これらに限定されない。前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すアミノ酸配列であり、実質的にＴＮＦ-αに結合する活性を有するタンパク質であれば、すべて含む。また、このような類似性を有する配列として前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体も本発明の範囲内に含まれることは自明である。また、前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列だけではなく、前記配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の類似性を示すヌクレオチド配列として、実質的にＴＮＦ-αに結合する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば、すべて含む。また、このような類似性を有する配列として前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体をコードするヌクレオチド配列も、本発明の範囲内に含まれるは自明である。前記本発明の一実施例では、ＣＨＯ細胞に特異的にコドンを最適化した。

本発明において、用語、「免疫グロブリン（iｍＭunoglobulin; Ig）のＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた部分を除外した、重鎖不変領域２（ＣＨ２）、重鎖不変領域（ＣＨ３）及びヒンジ（hinge）部分を含む免疫グロブリンの一部分を意味する。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然型アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来であり、さらに好ましくはＩｇＧ１由来であるが、これらに限定されない。

一方、本発明において用語、「組み合わせ（combination）」は、二量体または多量体を形成するとき、同一起源短鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧＦｃ、ＩｇＡＦｃ、ＩｇＭＦｃ、ＩｇＤＦｃ及びＩｇＥＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。

本発明において、用語、「混成（hybrid）」は、短鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。つまり、ＩｇＧＦｃ、ＩｇＭＦｃ、ＩｇＡＦｃ、ＩｇＥＦｃ及びＩｇＤＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなるグループから１〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせ、またはこれらの混成化も可能である。

前記ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを哺乳類細胞に導入して発現させることにより得ることができる。

本発明では、ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとしてｐＣＵＣＢｉｎ-ｍＳｉｇ-ＴＮＦｃｅｐｔベクターを使用し、これをＣＨＯ細胞に形質導入してＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。前記の方法で得られたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質は、活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質、切断型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質、非活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質及び/またはＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質凝集体など多様な形態のＴＮＦＲ- Ｆｃ融合タンパク質が混合されており、このことから、活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質だけでなく、非活性型ＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を所定の割合で含有するように精製する必要がある。本発明の製造方法を用いる場合には、端片、前記活性型融合タンパク質と一緒に精製された凝集体などを含むピーク３の含量を調節することができるため、これを目的とする含量で含有するように調節することができる。

一般的に哺乳類細胞の培養液は、目的とするタンパク質以外に様々なタンパク質などをさらに含むため、これらを除去するために、好ましくは、前記哺乳類細胞で生産されたＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合液を含む試料は細胞培養液を親和性クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、またはこれらの両方を利用して部分精製して準備することができる。

本発明の具体的な実施例では、形質転換させたＣＨＯ細胞の培養液について、まず親和性クロマトグラフィーを行い、その溶出液に対して陰イオンクロマトグラフィーを行って得られた溶出液を試料として使用した。

その例として、前記疎水性クロマトグラフィーに使用されるカラムに充填された媒質は、芳香族官能基としてフェニル基を含む媒質を使用してもよい。本発明の具体的な実施例では、ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から生産されたフェニルセファロース高性能レジン（Phenyl Separose High Performance resin）を充填したカラムを使用したが、これに限定されない。

その例として、前記目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の目的とする含量は９〜１８％であってよい。例えば、前記（ａ）段階のＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質の混合液の疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が２０％を超過する場合は、本発明の方法を適用して精製することにより、ピーク３の含量は９〜１８％の水準に下げることができる。

その例として、前記使用される平衡緩衝液と溶出緩衝液は７〜１５ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液であってもよい。本発明の具体的な実施例では１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液を使用したが、これに限定されない。

その例として、前記使用される平衡緩衝液と溶出緩衝液のｐＨは６〜８．５の範囲であってもよい。前記範囲外のｐＨの緩衝液は、標的タンパク質の変性を引き起こす可能性があるので、組換えタンパク質の疎水性クロマトグラフィーに使用に困難がありうる。

その例として、本発明に係る製造方法は目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量に応じて平衡緩衝液中の塩化ナトリウムの濃度を調節することを特徴とする方法であり、目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が２〜１７％である場合、１〜１．４Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝液で平衡化させることによい達成しうる。具体的には、ピーク３の含量が２１％であるローディングサンプルについて１．１Ｍ塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を用いた場合、ピーク３の含量を５．３〜１７．０％に下げることができ、１．２Ｍ塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を用いた場合、２．９〜１５．７％、１．３Ｍ塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を用いた場合、２．５〜１４．８％、１．４Ｍ塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を用いた場合、２．２〜１３．７％に下げることができた。

また、本発明に係る製造方法は、目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量に応じて平衡緩衝液中の硫酸アンモニウムを添加することを特徴とする方法であって、試料の疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が４５％を超過する場合には、０．４５〜０．５５Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化させるのが特徴である。

例えば、組換えタンパク質の生産方法を通じて収得した培養液が疎水性クロマトグラムのピーク３を過量、例えば、４５％を超えるように含有した場合、硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液で平衡化して疎水性クロマトグラフィーを行い、２０〜３０％水準にピーク３の含量を下げた後、前述した塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を用いた疎水性クロマトグラフィーを行うことにより、ピーク３の含量を１０％台に下げることができる。

前記疎水性クロマトグラフィーは、順次ローディング、平衡化、ストリップ及びＣＩＰ（cleaning-in-place）工程で構成される一連の工程を経て行うことができる。

前記ストリップ工程は、カラム上に残留するタンパク質をすべて分離して溶出させるために行うものであり、前記のストリップ工程は塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含まないことを除いては、平衡緩衝液と同じ組成の緩衝液を用いて行うことができる。

ＣＩＰは、生物医薬品を製造するにあって、安全でコスト効率的な装置を管理するための過程でクロマトグラフィー媒質から不純物を効率的に除去してこれを再利用することができるようにする。前記ＣＩＰは約０．５Ｎ濃度の水酸化ナトリウム溶液を用いて行うことができるが、これに限定されない。必要に応じてＣＩＰは数回繰り返して実施することができるが、これに限定されない。

もう一つの様態として、１．０〜１．５Ｍの濃度の塩化ナトリウムまたは０．４５〜０．５５Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液で疎水性クロマトグラフィー媒質を前−平衡化する段階；及び前記前−平衡化されたクロマトグラフィー媒質に同じ塩濃度を有するように準備したＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質を含む試料をローディングする段階を含む、エタネルセプトに含有された疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節する方法を提供する。

その例として、前述したように、前記平衡緩衝液のｐＨは６〜８．５であってもよい。

本発明の塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液を利用する方法は、最終生成物におけるピーク３の含量が、ローディングする試料と比較して減少する方向に調節されたのが特徴である。

その例として、塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液を用いて、ピーク３の含量が２０％を超過する試料におけるピーク３の含量を２〜１７％の水準に減少させることができる。

他の例として、硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液を用いて、ピーク３の含量が４５％を超過する試料におけるピーク３の含量を１８％以下の水準に減少させることができる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。

[実施例１］エタネルセプトの製造及びＨＩＣフロースルー（Flow-Through）
エタネルセプトを製造するために、ＣＨＯ細胞にＴＮＦＲ-Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター（ｐＣＵＣＢｉｎ-ｍＳｉｇ-ＴＮＦｃｅｐｔ）を形質転換させて培養し、ＭＴＸを用いて選別したＣＨＯ細胞培養液に親和性クロマトグラフィー（affinity chromatography）と陰イオンクロマトグラフィー（anion chromatography）を順次的に適用した。

まず、親和性クロマトグラフィーは具体的には下記のように行った。親和性樹脂であるＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ(登録商標)（GE Healthcare）をＸＫ２６カラム（GE Healthcare）に充填し、１００〜２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有した２０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ８．０緩衝溶液を十分に流してカラムを平衡化した後、用意した培養液を流して親和樹脂と結合させてｐＨ３．４〜３．０の溶出緩衝液で溶出させた。２Ｍトリスを用いて溶出液のｐＨを７．０〜８．０に調節した。

前記親和性クロマトグラフィーを介して得られた溶出液について陰イオンクロマトグラフィーを下記のように行った。具体的には陰イオン樹脂であるＦｒａｃｔｏｇｅｌＥＭＤＴＭＡＥ（Merck）をＬＲＣ１５カラム（Pall Life Sciences）に充填し、ｐＨ７．５〜８．５のトリスを含有した緩衝溶液を十分に流してカラムを平衡化した後、親和性クロマトグラフィーからの溶出液を流してタンパク質を陰イオン樹脂と結合させて、１００〜２００ｍＭ塩化ナトリウム含有トリス溶出緩衝液で溶出させた。

前記親和性クロマトグラフィー及び陰イオンクロマトグラフィーを順番に実行して、得られた溶出液に下記のようにＨＩＣフロースルー工程を適用した。このとき、回収されるピーク３の含量はブチル-ＮＰＲ（TSK、14947）分析カラムを用いて、０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．０、１．８Ｍアンモニウム（Ａ緩衝液）及び０．１リン酸ナトリウムｐＨ６．０（Ｂ緩衝液）によって線形勾配で測定した。

[実験例１］塩化ナトリウムを使用したピーク３の含量の調節
ＨＩＣフロースルー工程のために、１０ｍＭリン酸ナトリウムの塩化ナトリウムをそれぞれ１．１〜１．４Ｍを含有する平衡緩衝液（EQ buffer）を準備し、すべての平衡緩衝液はｐＨが６．３になるようにした。ＨＩＣにローディングする試料も平衡緩衝液と同じ濃度のリン酸ナトリウムと塩化ナトリウムを含むように製造した。

フェニルセファロース高性能レジン（GE Healthcare）を用いたＨＩＣフロースルー工程は、図１に示されたように、ローディング、平衡化（EQ）、ストリップ及びＣＩＰ工程で行われ、ストリップ及びＣＩＰ段階の緩衝液としてはそれぞれ１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．３及び０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いた。

溶出液（elution pool）はローディング段階で２８０ｎｍで吸光度を基準に５０ｍＡＵ以上で収集し、平衡緩衝液の段階まで５ＣＶ（column volume）画分を収集して評価し、その結果を使用した塩化ナトリウム濃度に応じて下記表１に示した。

表１に示されたように、使用された塩化ナトリウム濃度が増加することに応じてピーク３の含量は減少する傾向を示し、結論的に塩化ナトリウムの使用濃度によりピーク３の含量を２．２〜１７．０％の範囲内で調節することができることを確認した。

[実験例２] 硫酸アンモニウムを用いたピーク３の含量調節
硫酸アンモニウムを用いたＨＩＣフロースルー工程のために、２０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ８．０緩衝液に０．５Ｍ硫酸ナトリウムを含有するように平衡緩衝液（EQ buffer）を準備した。ＨＩＣローディングサンプルも２０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ８．０及び０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有するようにしてローディングサンプルを製造した。

フェニルセファロース高性能レジン（GE Healthcare）をＸＫ１６（GE Healthcare）に５ｃｍ充填してＨＩＣフロースルー工程を実施した。実験例１のように、前記工程はローディング、平衡化、ストリップ及びＣＩＰ工程で行われ、ストリップ及びＣＩＰ段階の緩衝液としてはそれぞれ２０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ７．０及び０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いた。

溶出液（elution pool）はローディング段階で２８０ｎｍで吸光度を基準に５０ｍＡＵ以上から収集し、平衡緩衝液の段階まで５ＣＶ画分を収集して評価し、その結果、ピーク３を４６．１％含有したローディングサンプルについてＨＩＣフロースルー工程を行ったとき、前記工程の後、ピーク３の含量は１２％水準に調節されたことを確認した。

Claims

下記段階を含む、目的とする含量で疎水性クロマトグラムのピーク３を含む、エタネルセプトの混合物を製造する方法であって、前記疎水性クロマトグラムのピーク３の目的とする含量が、９〜１８％である方法：
（ａ）哺乳類細胞で生産されたエタネルセプトの混合液を含む試料を塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液（equilibration buffer; EQ buffer）で前−平衡化された芳香族官能基を含む疎水性クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography; HIC）媒質が充填されたカラムに注入する段階；及び
（ｂ）前記平衡緩衝液と同じ濃度で塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液でタンパク質を溶出させて溶出液を収集する段階。
前記芳香族官能基が、フェニル基である、請求項１に記載の方法。
前記（ａ）段階のエタネルセプトの混合液の疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が２０％を超えるものである、請求項１に記載の方法。
平衡緩衝液及び溶出緩衝液が、７〜１５ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液である、請求項１に記載の方法。
前記平衡緩衝液及び溶出緩衝液が、ｐＨ６〜８．５である、請求項１に記載の方法。
目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量に応じて平衡緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を調節することを特徴とする、下記段階を含む、疎水性クロマトグラムのピーク３を含む、エタネルセプトの混合物を製造する方法であって、
試料の疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が２０％超過〜４５％以下であり、目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が２〜１７％であり、１〜１．４Ｍ濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝液で平衡化させることを特徴とする、方法：
（ａ）哺乳類細胞で生産されたエタネルセプトの混合液を含む試料を塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液（equilibration buffer; EQ buffer）で前−平衡化された芳香族官能基を含む疎水性クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography; HIC）媒質が充填されたカラムに注入する段階；及び
（ｂ）前記平衡緩衝液と同じ濃度で塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液でタンパク質を溶出させて溶出液を収集する段階。
目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量に応じて平衡緩衝液中の硫酸アンモニウムを添加することを特徴とする、下記段階を含む、疎水性クロマトグラムのピーク３を含む、エタネルセプトの混合物を製造する方法であって、
試料の疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が４５％を超過し、目的とする疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が１０〜２０％であり、０．４５〜０．５５Ｍ濃度の硫酸アンモニウムを含む緩衝液で平衡化させることを特徴とする、方法：
（ａ）哺乳類細胞で生産されたエタネルセプトの混合液を含む試料を塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液（equilibration buffer; EQ buffer）で前−平衡化された芳香族官能基を含む疎水性クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography; HIC）媒質が充填されたカラムに注入する段階；及び
（ｂ）前記平衡緩衝液と同じ濃度で塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液でタンパク質を溶出させて溶出液を収集する段階。
前記哺乳類細胞で生産されたエタネルセプトの混合液を含む試料が、親和性クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、またはこれらの両方を利用して部分精製したものである、請求項１に記載の方法。
前記疎水性クロマトグラフィーが、順次ローディング、平衡化、ストリップ及びＣＩＰ工程から構成されるものである、請求項１に記載の方法。
１．０〜１．５Ｍ濃度の塩化ナトリウムまたは０．４５〜０．５５Ｍ濃度の硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液で疎水性クロマトグラフィー媒質を前−平衡化する段階；前記前−平衡化された疎水性クロマトグラフィー媒質と同じ塩濃度になるように準備したエタネルセプトを含む試料をローディングする段階；ならびに前記平衡緩衝液と同じ濃度で塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液でタンパク質を溶出させて溶出液を収集する段階を含む、エタネルセプトに含有された疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節する方法であって、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が２０％を超える試料において、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を２〜１７％の水準に減少させるものである、方法。
前記塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液が、ｐＨ６〜８．５である、請求項１０に記載の方法。
ローディングする試料と比較して、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が減少する方向に調節されたものである、請求項１０に記載の方法。
１．０〜１．５Ｍ濃度の塩化ナトリウムまたは０．４５〜０．５５Ｍ濃度の硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝液で疎水性クロマトグラフィー媒質を前−平衡化する段階；前記前−平衡化された疎水性クロマトグラフィー媒質と同じ塩濃度になるように準備したエタネルセプトを含む試料をローディングする段階；ならびに前記平衡緩衝液と同じ濃度で塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを含む溶出緩衝液でタンパク質を溶出させて溶出液を収集する段階を含む、エタネルセプトに含有された疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を調節する方法であって、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量が４５％を超える試料において、疎水性クロマトグラムのピーク３の含量を１０〜２０％の水準に減少させるものである、方法。