ES2651483T3 - Método para preparar la forma activa de la proteína de fusión TNRF-Fc - Google Patents

Abstract

Un método para preparar una proteína activa de fusión TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) - Fc, que comprende: a) cargar una muestra que comprende una mezcla de proteínas de fusión TNFR-Fc producidas en células de mamífero en una cantidad de 10 a 14 g/L de lecho por volumen de resina de cromatografía, a una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) preequilibrada con un tampón de equilibrado que comprende una o más sales elegidas entre el grupo que consiste en citrato sódico, sulfato sódico y fosfato sódico; b) lavar la columna con un tampón de lavado que comprende la misma sal que en el tampón de equilibrado para eliminar las formas recortadas de la proteína de fusión TNFR-Fc de la mezcla de proteínas de fusión TNFR-Fc; y c) eluir de la columna las proteínas de fusión TNFR-Fc activas con un tampón de elución que tiene una concentración salina menor que el tampón de equilibrado, en donde la muestra que comprende la mezcla de proteínas de fusión TNFR-Fc se ajusta para que tenga una conductividad de 50 a 75 mS/cm, antes de la carga.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para preparar la forma activa de la protema de fusion TNRF-Fc Campo de la invencion.

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar una protema de fusion TNFR-Fc usando cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC). Mas en particular, la presente invencion se refiere a un metodo para preparar una protema activa de alta pureza a partir de una muestra que comprende una mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc y formas recortadas de las mismas debido al efecto de desplazamiento ajustando la conductividad de una muestra de protema con una alta concentracion de solucion de sal y ajustando una cantidad de carga de la misma.

Fundamentos de la tecnica.

Se sabe que la sobreexpresion de TNF alfa (factor de necrosis tumoral alfa) en el cuerpo humano es causa de enfermedades autoinmunitarias. El TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) es un receptor alfa del TNF y se une a un TNF alfa sobreexpresado para actuar como agente terapeutico para enfermedades autoinmunitarias. Ademas, el TNFR se fusiona con la region Fc de inmunoglobulina G (IgG) humana para expresarse como una protema de fusion con Fc, usandose de este modo como un farmaco proteico terapeutico.

El TNFR-Fc se puede preparar por fusion de 235 aminoacidos de TNFR con 232 aminoacidos de la region Fc que incluye una region bisagra. Cuando el TNFR-Fc se produce como un dfmero mediante tecnologfa de ADN recombinante, muestra actividad biologica.

El TNFR comprende 235 aminoacidos que poseen 4 dominios y una region transmembrana. El TNFR tiene 22 cistemas, y todas ellas forman enlaces disulfuro para tener una estructura esterica. Sin embargo, cuando el TNFR- Fc es producido a partir de celulas animales, las cistemas se unen entre sf al azar y por tanto no forman enlaces disulfuro identicos a los de una protema nativa. El TNFR tambien puede estar parcialmente truncado y no consigue formar un dfmero TNFR-Fc correcto.

El TNFR-Fc con enlaces disulfuro incorrectos no puede mostrar la actividad biologica apropiada debido a una reduccion drastica en la capacidad de union a TNF alfa. Cuando la totalidad o una parte del TNFR se trunca, tambien puede no exhibir actividad biologica.

Por tanto, cuando los dfmeros de TNFR-Fc se producen utilizando una tecnologfa de ADN recombinante y una tecnica de cultivo de celulas animales, las protemas activas, protemas inactivas con enlaces disulfuro incorrectos, agregados y formas recortadas se producen al mismo tiempo, y por ello se necesita una tecnica para aislar las protemas activas de la mezcla de protemas.

Las biomoleculas terapeuticas han de ser purificadas con mas del 99% de pureza antes del empleo en seres humanos. Este grado de purificacion puede conseguirse por medio del uso de tres o cuatro procesos de cromatograffa de ffquidos, como cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de fase inversa, cromatograffa de exclusion por tamanos, cromatograffa de afinidad (colorante, metal, anticuerpo, protema A, etc.) y cromatograffa de interaccion hidrofoba, que se requieren durante el proceso de aislamiento. El uso de cromatograffa de interaccion hidrofoba en la purificacion de protemas recombinantes tales como la protema recombinante TNFR-Fc se describe en los documentos WO2005/075498, WO2005/042569 y WO03/072060. El manual “Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography - Principles and Methods” (1 de febrero 2006 y disponible en Internet) describe metodos y condiciones para el uso de cromatograffa de interaccion hidrofoba en la purificacion de protemas. El tipo y la secuencia de los procesos cromatograficos seleccionados se basan en las caractensticas fisicoqmmicas de los contaminantes que coexisten con la biomolecula diana. Normalmente, la cromatograffa de exclusion por tamanos se emplea en una etapa final, porque elimina los agregados de protemas y tambien intercambia las protemas purificadas en el tampon de formulacion final.

Sin embargo, la cromatograffa de exclusion por tamanos afecta negativamente a la productividad debido al limitado volumen de muestra que se puede cargar. Un volumen de carga de muestra en la columna mayor que aproximadamente el 5% del volumen global de la columna tiene por resultado una extension y dilucion de banda relacionadas con la difusion a medida que la banda de soluto se desplaza a traves de la columna. La limitacion de volumen se puede eludir usando una etapa de concentracion por ultrafiltracion con anterioridad a la carga de la columna. La concentracion por ultrafiltracion tambien introduce perdidas de productividad debido a la union no espedfica a la membrana y a otros materiales del sistema, perdidas de volumen por tubos y bombas, y complicaciones asociadas con la preparacion, funcionamiento y limpieza del equipo. Por tanto, el proceso de purificacion puede ser claramente mas simple y se pueden evitar las perdidas de productividad aplicando una protema diana concentrada a la cromatograffa de interaccion hidrofoba para obtener un efecto de desplazamiento. Sin embargo, el metodo de separacion de la protema diana usando cromatograffa de interaccion hidrofoba requiere diferentes condiciones de separacion que dependen del tipo de protema diana, incluyendo el vector de expresion un polinucleotido que codifica la protema, etc. Frecuentemente, los metodos conocidos de separacion de la protema diana no pueden aplicarse en la separacion de otras protemas diana o en la separacion de la protema diana preparada bajo condiciones diferentes. En el mercado de farmacos proteicos, por tanto, es muy importante investigar

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las condiciones adecuadas para separar una protema diana deseada con una pureza y una concentracion elevadas. Descripcion de la invencion.

Problema tecnico.

Basandose en estos antecedentes, los presentes inventores han hecho grandes esfuerzos para separar una forma activa de la protema de fusion TNFR-Fc con una pureza y una concentracion elevadas. Como resultado, han encontrado que solamente la fraccion de protema de fusion TNFR-Fc activa puede ser recuperada con pureza elevada usando cromatograffa de interaccion hidrofoba que tiene la ventaja de una baja probabilidad de desnaturalizacion de la protema sin usar un solvente organico ajustando la cantidad de carga de una muestra de protema por unidad de volumen de medio y ajustando la conductividad de la misma, a diferencia de las tecnicas convencionales, rematando asf la presente invencion.

Solucion del problema.

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar una forma activa de protema de fusion TNFR (receptor de factor de necrosis tumoral) - Fc usando cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC).

Efectos ventajosos de la invencion.

La presente invencion ofrece un metodo para preparar una protema activa a partir de una muestra que comprende una mezcla de protema usando cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) ajustando la conductividad de la muestra de protema empleando una alta concentracion de solucion salina y ajustando la cantidad de carga de la misma. Por tanto, el metodo puede aplicarse para el aislamiento de una protema activa de alta pureza a partir de protemas recombinantes que se producen a partir de celulas animales mediante tecnologfa de ADN recombinante.

Breve descripcion de los dibujos.

La FIG. 1 es un diagrama esquematico que muestra el metodo de clonacion de pcDNA3.1-Kozak-TNFRII-Fc-IRES- GS de la presente invencion.

La FIG. 2 es un mapa de segmentacion que muestra pcDNA3.1-kozak-TNFRII-Fc-IRES-GS, que es un vector de expresion recombinante que incluye un gen que codifica TNFRII-Fc de la presente invencion.

La FIG. 3 muestra un cromatograma de interaccion hidrofoba (HIC) que utiliza el citrato sodico de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La FIG. 4 muestra un cromatograma de interaccion hidrofoba (HIC) que utiliza el sulfato sodico de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La FIG. 5 muestra un cromatograma de interaccion hidrofoba (HIC) que utiliza el cloruro sodico de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La FIG. 6 muestra el analisis de HPLC hidrofoba de cada fraccion de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La FIG. 7 muestra el analisis de exclusion por tamanos (SE)-HPLC de cada fraccion de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La FIG. 8 muestra la actividad biologica in vitro de cada fraccion de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La FIG. 9 muestra un ciclo de interaccion hidrofoba (HIC) cuando la protema se carga en una cantidad de 9,5 g/L de lecho de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. Y

La FIG. 10 muestra un cromatograma de interaccion hidrofoba (HIC) cuando la protema se carga en una cantidad de 13 g/L de lecho de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion.

En un aspecto para conseguir los objetos anteriores la presente invencion proporciona un metodo para preparar una forma activa de protema de fusion TNFR (receptor de factor de necrosis tumoral) - Fc utilizando cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC).

Preferiblemente, el metodo puede comprender a) cargar una muestra que comprende una mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc producidas en celulas de mairfffero en una cantidad de 10 a 14 g/L de lecho por volumen de resina de cromatograffa, en la columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) preequilibrada con un tampon de equilibrado que comprende una o mas sales elegidas en el grupo que consiste en citrato sodico, sulfato sodico y fosfato sodico; b) lavar la columna con un tampon de lavado que comprende la misma sal que en el tampon de

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equilibrado para eliminar las formas recortadas de la protema de fusion TNFR-Fc de la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc; y c) eluir de la columna la forma activa de la protema de fusion TNFR-Fc con un tampon de elucion que tiene una concentracion salina menor que la del tampon de equilibrado, en donde la muestra que comprende la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc se ajusta para que tenga una conductividad de 50 a 75 mS/cm antes de la carga, pero el metodo no esta limitado a ello.

Cuando la protema de fusion TNFR-Fc es producida por una celula hospedadora transformada con un vector de expresion que comprende un polinucleotido que codifica la protema de fusion TNFR-Fc, las cistemas de la protema TNFR se unen entre sf al azar, y asf no forman enlaces disulfuro identicos a los de una protema TNFR nativa o la protema TNFR tambien esta parcialmente truncada, y por tanto fracasa en la formacion de un dfmero TNFR-Fc correcto, ademas de la formacion de una forma dfmera de protema de fusion TNFR-Fc que se une a TNF-alfa y muestra actividad biologica. Por tanto, cuando la protema de fusion TNFR-Fc se produce en una celula hospedadora, existe la necesidad de separar solamente la protema de fusion TNFR-Fc activa que tiene una actividad biologica identica o correspondiente a la de la protema TNFR de tipo silvestre de la mezcla de la protema de fusion TNFR-Fc activa, protema de fusion TNFR-Fc inactiva o agregados de protema de fusion TNFR-Fc. El metodo de la presente invencion es un metodo capaz de separar la protema de fusion TNFR-Fc activa con alta pureza, de la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc usando cromatograffa de interaccion hidrofoba, y asf puede ser usada de manera efectiva para el aislamiento de la protema de fusion TNFR-Fc activa.

Como se usa en el presente texto, la expresion "protema TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral)" significa una protema receptora que se une a TNF-a. El TNFR incluye protema TNFRI(p55) o protema TNFRII(p75), preferiblemente puede ser una protema TNFRII, pero no esta limitado a ella. El TNFRII puede ser intercambiable con TNFRSF1B (miembro 1B de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral). La protema TNFRII puede ser una protema TNFRII que tiene 4 dominios y una region transmembrana, y que contiene 235 aminoacidos, pero sin limitarse a ello. Puede obtenerse informacion acerca la protema TNFRI y de la protema TNFRII a partir de las bases de datos conocidas, tales como US NIH GenBank y, por ejemplo, puede ser una protema que tiene el numero de registro NP_001056 o P20333, pero no se limita a ello.

La protema TNFR tiene una actividad biologica de union con TNF-a, de la cual se sabe que la sobreexpresion en el cuerpo humano es causa de diversas enfermedades, y por tanto puede usarse para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF-a tales como enfermedades autoinmunitarias. Para conseguir esto, la region Fc de la inmunoglobulina se fusiona con la protema TNF-a para preparar una protema de fusion que tiene una vida mitad mas alta.

Como se usa en el presente texto, la expresion "protema de fusion TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) - Fc" significa un producto resultante del enlace de la totalidad o de una parte de la protema TNFR con la region Fc de la inmunoglobulina mediante accion enzimatica, o resultante de la expresion de dos polipeptidos en un unico polipeptido por manipulacion genetica. En la protema de fusion TNFR-Fc, la protema TNFR y la region Fc de la inmunoglobulina pueden estar enlazadas directamente entre sf, o unidas por medio de un enlazador peptfdico, pero sin estar limitadas a ello.

La protema de fusion TNFR-Fc se puede preparar por fusion de la totalidad o de una parte de la protema TNFR con la region Fc de la inmunoglobulina y, por ejemplo, por fusion de los aminoacidos de las posiciones 1 a 235 de la protema TNFRII con 232 aminoacidos de la region Fc de la inmunoglobulina que incluye una region bisagra, pero sin limitarse a ello. Ademas, la protema de fusion TNFR-Fc puede optimizarse con codones, para la expresion en las celulas hospedadoras. Por ejemplo, la protema de fusion TNFR-Fc puede ser una protema de fusion TNFR-Fc codon-optimizada para celulas CHO, definida por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO. 1, pero sin limitarse a ello. La protema de fusion TNFR-Fc incluye una protema que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO. 1, y todas las protemas que tienen secuencias de aminoacidos que tienen una homologfa con la secuencia del 70% o mas, preferiblemente una homologfa del 80% o mas, mas preferiblemente una homologfa del 90% o mas, mucho mas preferiblemente una homologfa del 95% o mas, y lo mas preferiblemente una homologfa del 98% o mas, siempre y cuando las protemas tengan actividad de union a TNF-a. Es evidente que cualquier tipo de variante de protema que tenga una delecion, modificacion, sustitucion o adicion de alguna secuencia puede estar dentro del alcance de la presente invencion, siempre y cuando la secuencia que tiene la homologfa sea una secuencia de aminoacidos que tenga una actividad biologica que sea o similar a la protema de fusion TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) - Fc. Ademas, el polinucleotido que codifica la protema de fusion TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) - Fc incluye una secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO. 2, y todas las secuencias de nucleotidos que tienen una homologfa con la secuencia del 70% o superior, preferiblemente una homologfa del 80% o superior, mas preferiblemente una homologfa del 90% o superior, mucho mas preferiblemente una homologfa del 95% o superior, y lo mas preferiblemente una homologfa del 98% o superior, siempre y cuando las secuencias de nucleotidos codifiquen sustancialmente las protemas que tienen una actividad de union a TNF-a. Tambien es evidente que cualquier tipo de secuencia de nucleotidos que codifica variantes de protemas que tienen una delecion, modificacion, sustitucion o adicion de alguna secuencia, puede estar dentro del alcance de la presente invencion, siempre y cuando la secuencia que tiene la homologfa sea una secuencia de nucleotidos que codifique un secuencia de aminoacidos que tiene una actividad biologica que es sustancialmente identica o que corresponde a la protema de fusion TNFR-Fc. En una realizacion de la presente invencion, se realizo una optimizacion de codones espedfica para celulas CHO.

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Como se usa en el presente texto, la expresion "region Fc de la inmunoglobulina (Ig)" se refiere a una parte de la inmunoglobulina que contiene la region constante de cadena pesada 2 (CH2), la region constante de cadena pesada 3 (CH3) y una region bisagra, excluyendo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, la region constante de cadena pesada 1 (CH1) y la region constante de cadena ligera 1 (CL1) de la inmunoglobulina. La region Fc de la inmunoglobulina de la presente invencion incluye una secuencia nativa de aminoacidos y una secuencia derivada de la misma. Un derivado de la secuencia de aminoacidos es una secuencia que es distinta de la secuencia nativa de aminoacidos debido a una delecion, una insercion, una sustitucion no conservadora o conservadora o combinaciones de las mismas de uno o mas restos de aminoacidos. Ademas, la region Fc de la inmunoglobulina puede ser una region Fc que se deriva de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, o que se hace mediante combinaciones de las mismas o Iffbridos de las mismas. Preferiblemente se deriva de IgG, que se sabe que potencia la vida mitad de las protemas de union. Mas preferiblemente, se deriva de IgG1, pero sin limitarse a ello.

Por otra parte, el termino "combinacion", como se usa en el presente texto, significa que los polipeptidos que codifican regiones Fc de la inmunoglobulina de cadena simple del mismo origen estan unidos a un polipeptido de cadena simple de un origen diferente para formar un dfmero o un mulffmero. Es decir, se puede formar un dfmero o un mulffmero a partir de dos o mas fragmentos elegidos entre el grupo que consiste en los fragmentos IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc e IgE Fc.

El termino "tnbrido", como se usa en el presente texto, significa que las secuencias que codifican dos o mas regiones Fc de la inmunoglobulina de origen distinto estan presentes en una region Fc de la inmunoglobulina de cadena simple. En la presente invencion, son posibles varios tipos de tnbridos. Es decir, los tnbridos de dominio pueden estar compuestos de uno a cuatro dominios elegidos entre el grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc e IgD Fc, y pueden incluir la region bisagra. Por otro lado, la IgG tambien se divide en subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y la presente invencion incluye combinaciones e tnbridos de las mismas.

La protema de fusion TNFR-Fc puede obtenerse introduciendo el vector de expresion que comprende el polinucleotido que codifica la protema de fusion en celulas de mairnfero, y luego expresandolo en ellas, y, por ejemplo, introduciendo un vector que comprende un polinucleotido que codifica la enzima GS (glutamina sintetasa) mutada y la protema de fusion TNFR-Fc en celulas de mai^ero, pero sin limitarse a ello.

La enzima GS mutada es una enzima que tiene una secuencia que contiene una sustitucion de Arginina (R) por Glicina (G) en la posicion 299 en la secuencia de aminoacidos de la enzima GS de tipo silvestre, y el vector de expresion que comprende el polinucleotido que codifica la protema de fusion TNFR-Fc de la presente invencion puede incluir la enzima GS mutada. Un ejemplo de ello puede ser un vector pcDNA3.1-Kozak-TNFRII-Fc-IRES-GS, pero sin limitarse al mismo.

En la presente invencion, se uso el vector pcDNA3.1-Kozak-TNFRII-Fc-IRES-GS como vector de expresion representativo que comprende el polinucleotido que codifica la protema de fusion TNFR-Fc, y se transformo en celulas CHO para expresar la protema de fusion TNFR-Fc. La mezcla de varias formas de protemas de fusion TNFR-Fc tales como la protema de fusion TNFR-Fc activa, las formas recortadas de la protema de fusion TNFR-Fc, la protema de fusion TNFR-Fc inactiva, y/o el agregado de protema de fusion TNFR-Fc se incluyen en las protemas de fusion TNFR-Fc obtenidas por el metodo anterior. Por tanto, es necesario aislar solo la protema de fusion TNFR- Fc activa que tiene una actividad biologica de union a TNF-alfa. Cuando se usa el metodo de preparacion de la presente invencion, la protema de fusion activa y el agregado pueden obtenerse como fracciones separadas, y por tanto solo la protema de fusion activa se puede obtener con alta pureza.

El metodo para preparar la protema de fusion TNFR-Fc activa de la presente invencion comprende a) cargar una muestra que comprende una mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc en la columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) preequilibrada con un tampon de equilibrado.

La etapa a) es una etapa de carga de la muestra en la columna HIC preequilibrada con un tampon de equilibrado.

El preequilibrado de la columna se realiza tratando dicha columna con una alta concentracion de solucion salina para equilibrar la resina de la columna de cromatograffa.

Un ejemplo de solucion salina de alta concentracion puede ser una solucion tampon que comprende una o mas sales seleccionadas entre el grupo que consiste en citrato sodico, sulfato sodico y fosfato sodico, pero el tipo de solucion salina no esta particularmente limitado siempre y cuando sea capaz de equilibrar la columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba de la presente invencion. Por ejemplo, se puede usar citrato sodico o sulfato sodico como sal, pero la sal no se limita a ellos. Si el tampon de equilibrado comprende citrato sodico como sal, su concentracion puede ser de 0,45 a 0,55 M, y el tampon de equilibrado puede comprender ademas de 50 a 100 mM de fosfato sodico, pero sin limitarse a ello. Ademas, si el tampon de equilibrado comprende sulfato sodico como sal, su concentracion puede ser de 0,70 a 0,72 M, y el tampon de equilibrado puede comprender ademas de 50 a 100 mM de fosfato sodico, pero sin limitarse a ello. Ademas, el pH del tampon de equilibrado puede ser preferiblemente de 6,5 a 7,0, pero no se limita a ello. Mas preferiblemente, el tampon de equilibrio puede ser un tampon que comprende de 0,48 a 0,52 M de citrato sodico y de 50 a 70 mM de fosfato sodico a pH de 6,7 a 6,9, o un tampon que comprende 0,71 a 0,72 M de sulfato sodico y de 50 a 70 de fosfato sodico a pH de 6,7 a 6.9, y lo mas

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preferiblemente puede ser un tampon que comprende citrato sodico 0,5 M y fosfato sodico 50 mM a pH 6.8, o un tampon que comprende 0,72 M de sulfato sodico y 50 mM de fosfato sodico a pH 6.8, pero sin limitarse a ello.

En una realizacion de la presente invencion, el tampon que comprende citrato sodico 0,5 M y fosfato sodico 50 mM a pH 6,8, y el tampon que comprende 0,72 M de sulfato sodico y 50 mM de fosfato sodico a pH 6,8 se usaron como tampon de equilibrado.

Como se usa en el presente texto, la expresion "cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC)" se usa en el proceso de purificacion de biomoleculas, y se basa en una interaccion reversible entre la superficie de una protema y un adsorbente de cromatograffa de interaccion hidrofoba. Es muy util en la separacion de contaminantes que tienen un punto isoelectrico o un peso molecular similar al de la protema isoforma, en comparacion con la cromatograffa de intercambio ionico o la cromatograffa de exclusion por tamanos.

El tipo de ligando utilizado en la columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba no esta limitado particularmente, siempre y cuando el ligando se pueda usar para la separacion de la protema de fusion TNFR-Fc activa de la presente invencion, y los ejemplos de los mismos pueden incluir un grupo butilo, un grupo octilo, un grupo fenilo y un grupo alquilo. El ligando puede ser preferiblemente el grupo butilo o fenilo, y mas preferiblemente, el grupo butilo, pero no se limita a ellos. En una realizacion de la presente invencion, se uso butil Sepharose 4 Fast Flow que contiene ligandos de butilo, fabricada por GE Healthcare. La Butil Sepharose 4 Fast Flow utilizada se basa en perlas de 90 pm de matriz de agarosa al 4% altamente entrecruzada con ligandos de butilo acoplados por medio de enlaces eter, y tiene elevadas estabilidades qmmicas, ffsicas y termicas. Debido a la alta hidrofobicidad del medio, puede usarse para separar protemas hidrofilas.

El metodo para preparar la protema de fusion TNFR-Fc activa de la presente invencion comprende la etapa de a) cargar una muestra que comprende una mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc en la columna preequilibrada.

Como se usa en el presente texto, la expresion "una muestra que comprende una mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc" puede ser un sobrenadante de cultivo de celulas que comprende las protemas de fusion TNFR-Fc, un extracto celular o el sobrenadante del cultivo celular o extracto celular parcialmente purificado, pero no se limita a ello. Cuando las protemas de fusion TNFR-Fc se producen en las celulas hospedadoras, la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc activas, protemas de fusion TNFR-Fc recortadas que tienen deleciones parciales de las protemas de fusion TNFR-Fc, protemas de fusion TNFR-Fc inactivas con enlaces disulfuro incorrectos, y/o los agregados de protema de fusion TNFR-Fc estan incluidos en el sobrenadante del cultivo celular o extracto celular.

La protema de fusion TNFR-Fc se expresa preferiblemente en las celulas de mairnfero introducidas con el vector de expresion que comprende el polinucleotido que codifica la protema de fusion, y se recupera el sobrenadante. Luego se puede purificar parcialmente por uno o mas metodos seleccionados entre el grupo que consiste en cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico y desalacion, antes de cargarla en la cromatograffa de interaccion hidrofoba, pero sin limitarse a ello.

Como se usa en el presente texto, la expresion "parcialmente purificado" significa que existen protemas distintas de la protema de fusion TNFR-Fc activa deseada, incluso despues de realizar uno o mas procedimientos de fraccionamiento tales como cromatograffa. En una realizacion de la presente invencion, la purificacion parcial del sobrenadante de cultivo se llevo a cabo usando cromatograffa de Protema A.

La mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc puede ser una muestra de protemas mixta, cuya conductividad se ajusta con la concentracion elevada de solucion salina, antes de cargarla en la columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba. La solucion salina puede ser una solucion que comprende una sal elegida entre el grupo que consiste en citrato sodico, sulfato sodico y sulfato amonico, pero sin limitarse a ellos. La conductividad de la muestra de protema de fusion TNFR-Fc tratada con la elevada concentracion de solucion salina, se ajusta preferiblemente en el margen de 50 a 75 mS/cm.

Cuando la alta concentracion de solucion salina es una solucion que comprende citrato sodico, la conductividad se ajusta preferiblemente en el margen de 50 a 55 mS/cm, y cuando la alta concentracion de la solucion salina es una solucion que comprende sulfato sodico, la conductividad se ajusta preferiblemente dentro del margen de 65 a 75 mS/cm, pero sin limitarse a ello. La muestra de protema tiene preferiblemente la concentracion de citrato sodico de 0,45 a 0,55 M, mas preferiblemente 0,48 a 0,52 y lo mas preferiblemente 0,5 M. La muestra de protema tiene preferiblemente la concentracion de sulfato sodico de 0,70 a 0,72 M, mas preferiblemente 0,71 a 0,72, y lo mas preferiblemente 0,72 M. Ademas, el pH de la muestra de protema puede ser de 6,5 a 7,0, pero sin limitarse a ello.

En una realizacion de la presente invencion, la muestra de protema de fusion TNFRII-Fc se ajusto para tener una conductividad de 50 a 52 mS/cm usando una solucion salina que contiene citrato sodico, y en ese momento la concentracion final de citrato sodico era 0,5 M. Ademas, la muestra se ajusto para tener una conductividad de 65 a 75 mS/cm usando una solucion de sal que contema sulfato sodico, y en ese momento la concentracion final de sulfato sodico era 0,72 M (Ejemplo experimental 1). En la presente invencion, la cromatograffa de interaccion hidrofoba tambien se llevo a cabo usando cloruro sodico como sal, ademas de citrato sodico y sulfato sodico. Sin embargo, las protemas de fusion TNFRII-Fc activas no se unieron a la columna incluso a una alta concentracion de cloruro sodico desde 0,75 M a 1,5 M, y se recuperaron como una fraccion de flujo dinamico (Figuras 3 a 5), lo que

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indica que el tipo y la concentracion de sal utilizada tambien son factores importantes en el metodo de la presente invencion.

En la etapa a), la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc puede cargarse en una cantidad de 10 a 14 g/L de lecho por volumen de resina de cromatograffa para facilitar la separacion de protemas por efecto de desplazamiento.

Como se usa en el presente texto, la expresion "efecto de desplazamiento" significa un fenomeno en el que un analito que tiene una capacidad de union mas debil no se retiene en la resina de la columna y se eluye rapidamente cuando existe un analito que tiene una capacidad de union mas fuerte a una concentracion elevada. En la presente invencion, el analito diana, la protema de fusion TNFR-Fc activa, puede separarse facilmente de la protema inactiva y de los agregados de protema solamente ajustando la conductividad porque hay una gran diferencia de hidrofobicidad entre ellos. Sin embargo, la protema activa no puede separarse facilmente de las protemas recortadas usando la cromatograffa de interaccion hidrofoba existente, debido a una pequena diferencia de hidrofobicidad entre ellas. La presente invencion se caracteriza porque la fraccion de protema recortada puede eliminarse facilmente de la protema activa mediante el efecto de desplazamiento cuando la cantidad de carga de la muestra de protema se ajusta dentro del margen de 10 a 14 g/L de lecho por volumen de resina de cromatograffa. Mas preferiblemente, la muestra de protema puede cargarse en una cantidad de 12 a 14 g/L de lecho por volumen de resina de cromatograffa. En una realizacion de la presente invencion, los efectos del desplazamiento se compararon de acuerdo con la cantidad de carga de protema. Cuando la muestra de protema se cargo en una cantidad de 9,5 g/L de lecho inferior a 10 g/L de lecho, la fraccion de protema de fusion TNFRII-Fc recortada y la fraccion de protema de fusion TNFRII-Fc activa no se separaron facilmente. En cambio, cuando la muestra de protema se cargo en una cantidad de 13 g/L de lecho, la fraccion recortada y la fraccion activa se separaron claramente (Ejemplo Experimental 5, Figuras 9 y 10).

Ademas, el metodo de la presente invencion comprende la etapa de b) lavado de la columna con un tampon de lavado para separar y eliminar la fraccion de protema de fusion TNFR-Fc recortada.

El tampon de lavado puede tener la misma composicion que en el tampon de equilibrado, pero no se limita a ello. Cuando la columna se lava con el tampon de lavado, las protemas de fusion TNFR-Fc recortadas se eluyen. En este momento, el pico eluido se designa como Pico 1 en la presente invencion.

En una realizacion de la presente invencion, la columna se lavo con el tampon de equilibrado utilizado, para eliminar las protemas recortadas. A este respecto, el tampon de equilibrado utilizado fue un tampon que comprendfa citrato sodico 0,5 M y fosfato sodico 50 mM a pH 6,8, o un tampon que comprendfa sulfato sodico 0,72 M y fosfato sodico 50 mM a pH 6,8.

Ademas, el metodo de la presente invencion incluye la etapa de c) elucion de la columna de la protema de fusion TNFR-Fc activa con un tampon de elucion que tiene una concentracion de sal menor que el tampon de equilibrado.

En la cromatograffa de interaccion hidrofoba, cuanto mas hidrofoba es la molecula menor cantidad de sal se necesita para promover la union a la columna. Asf pues, las protemas de fusion TNFR-Fc activas pueden separarse de las protemas de fusion TNFR-Fc inactivas o los agregados de protema de fusion TNFR-Fc ajustando la concentracion de sal, porque hay una diferencia de hidrofobicidad entre ellas. En la etapa anterior, por tanto, la protema de fusion TNFR-Fc activa se eluye de la columna reduciendo la interaccion entre la protema de fusion TNFR-Fc activa y el ligando hidrofobo usando el tampon de elucion que tiene una concentracion de sal menor que el tampon de equilibrado. En la presente invencion, el pico que tiene la protema de fusion TNFR-Fc activa se designa como Pico 2.

El tampon de elucion es un tampon que tiene una concentracion de sal menor que el tampon de equilibrado y el tampon de lavado, y su conductividad puede ser de 40 a 47 mS/cm. Cuando se utiliza un tampon de elucion que comprende citrato sodico, el tampon de elucion puede comprender citrato sodico a una concentracion de 0,35 a 0,4 M, mas preferentemente de 0,38 a 0,4 M, y lo mas preferentemente 0,4 M, pero sin limitarse a ello. Cuando se usa un tampon de elucion que comprende sulfato sodico, el tampon de elucion puede comprender sulfato sodico a una concentracion de 0,35 a 0,56 M, mas preferentemente de 0,38 a 0,4 M y lo mas preferentemente 0,4 M, pero sin limitarse a ello. Ademas, el tampon de elucion comprende tambien 50 a 100 mM de fosfato sodico, pero no se limita a ello. En una realizacion de la presente invencion, se uso un tampon de elucion que comprendfa 0,4 M de citrato sodico y 50 mM de fosfato sodico a pH 6,8 y un tampon de elucion que comprendfa 0,4 M de sulfato sodico y 50 mM de fosfato sodico a pH 6,8. El pH del tampon de elucion puede estar dentro del intervalo de 6,5 a 7,0, pero sin limitarse a ello. Despues de realizar la etapa c), la conductividad pasa a ser de 40 a 47 mS/cm.

El metodo para preparar la protema de fusion TNFR-Fc activa puede comprender ademas la etapa de d) separacion de una fraccion que comprende las protemas de fusion TNFR-Fc inactivas o los agregados de protema de fusion TNFR-Fc de la columna.

La etapa anterior es una etapa de elucion de la fraccion que comprende las protemas inactivas y los agregados de protemas con un tampon que comprende una concentracion de sal menor que el tampon de elucion o un tampon que no tiene citrato sodico o sulfato sodico. En este momento, el pico eluido se designa como Pico 3 en la presente invencion. El tampon a usar puede tener un pH de 6,5 a 7,0 y citrato sodico de 0 a 0,1 M o sulfato sodico de 0 a 0,1

5

10

15

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30

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40

45

50

55

M, pero sin limitarse a esto. Ademas, el tampon puede tener un pH que oscila entre 6,5 y 7,0, pero sin limitarse a ello. Ademas, el tampon puede tener una conductividad de 4 a 6 mS/cm, puede comprender fosfato sodico de 50 a 70 mM, y/o puede tener un pH de 6,7 a 6,9, pero sin estar limitado a esto. En una realizacion de la presente invencion, se uso un tampon que comprendfa fosfato sodico 50 mM y pH 6,8, y la conductividad se ajusto entre 4 y 6 mS/cm.

Como se describio anteriormente, la presente invencion proporciona un metodo para separar las protemas activas de la mezcla de las protemas recortadas, los agregados de protemas, las protemas inactivas y las protemas activas, usando cromatograffa de interaccion hidrofoba. Este metodo se caracteriza porque las protemas recortadas que tienen una capacidad de union mas debil se pueden eliminar de las protemas activas debido al efecto de desplazamiento ajustando la conductividad de la muestra cargada en la columna usando una alta concentracion de solucion salina y aumentando la cantidad de carga de la misma. Este metodo tambien se caracteriza porque las protemas de fusion TNFR-Fc activas deseadas se pueden separar y preparar a una alta concentracion ajustando la concentracion de una sal particular de cromatograffa de interaccion hidrofoba.

De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, el vector de expresion que comprende los polinucleotidos que codifican GS que tiene una sustitucion de aminoacidos en la posicion 299 y la protema de fusion TNFRII-Fc fue transformado en celulas animales, CHO (Ejemplos 1 a 4) y las protemas de fusion TNFRII-Fc fueron obtenidas a partir del mismo. A continuacion, se realizo una cromatograffa de interaccion hidrofoba para separar la protema de fusion TNFRII-Fc activa (Ejemplo Experimental 1). Cuando las protemas de fusion TNFRII-Fc se separan por el metodo de la presente invencion, la protema de fusion TNFRII-Fc recortada, la protema de fusion TNFRII-Fc activa y los agregados de protema de fusion TNFRII-Fc se separaron como Picos 1, 2 y 3, respectivamente (Figuras 3, 6 y 7). Ademas, cuando la muestra de protema fue cargada en la columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba en una cantidad de 12 g/L de lecho o mas, el pico correspondiente a las protemas recortadas no separadas cuando se cargo en una cantidad de 9,5 g/L de lecho o menos se separo del pico de protema activa (Figuras 9 y 10), y se encontro que el analito correspondiente al pico de protema activa obtenido tema una actividad similar a la de la forma activa pura (FIG. 8). De acuerdo con las tecnicas convencionales de purificacion de los dfmeros de TNFRII-Fc, se separaron dos fracciones, es decir, una fraccion que incluye las protemas activas y una fraccion que incluye todas las protemas inactivas, los agregados de protemas y las protemas recortadas. Sin embargo, no ha habido publicaciones acerca de la separacion de tres fracciones, es decir, una fraccion que incluye una gran cantidad de protemas recortadas, una fraccion que incluye las protemas activas, y una fraccion que incluye las protemas inactivas y los agregados de protemas. En la presente invencion, estas tres fracciones fueron separadas, y se encontro que la actividad de la fraccion que comprende la protema de fusion TNFRII-Fc activa era similar a la de la forma activa pura, lo que indica que el metodo de la presente invencion es capaz de preparar la protema de fusion TNFRII-Fc activa con alta pureza, en comparacion con las tecnicas convencionales.

Por tanto, el metodo de la presente invencion se puede usar para purificar las protemas de fusion TNFRII-Fc activas de alta pureza (por ejemplo, etanercept) que tienen actividad biologica, mediante la eliminacion de las protemas de fusion TNFRII-Fc recortadas, que se separan con dificultad por metodos convencionales.

Las descripciones del metodo y de la protema de fusion TNFR-Fc son las mismas que antes.

Modo para la invencion.

En adelante, la presente invencion se describira con mas detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solamente para fines ilustrativos, y la invencion no pretende limitarse a ellos.

Ejemplo 1: Smtesis del gen que codifica la protema de fusion TNFRII-Fc.

Para examinar el nivel de expresion de una protema recombinante producida usando un sistema de vector de expresion de protema recombinante, se uso una protema de fusion TNFRII-Fc como protema deseada.

El gen que codifica la protema de fusion (SEQ ID NO. 2) fue sintetizado por GeneArt Inc., para satisfacer los siguientes criterios: (1) debe incluir una secuencia senal TNFR, (2) debe expresar los aminoacidos de TNFR en posicion de 1 a 235, (3) debe ser codon-optimizado para celulas CHO con el fin de transfectarse en celulas CHO, (4) debe tener un sitio de restriccion NheI en el extremo 5 ' y un sitio de restriccion NotI en el extremo 3', considerando la insercion en un vector pcDNA3.1 de Invitrogen.

La secuencia de bases del gen que codifica la protema de fusion sintetizada fue finalmente analizada usando un programa VectorNTI.

Ejemplo 2: Construccion del vector de expresion que incluye el gen que codifica la protema de fusion TNFRII-Fc.

Con el fin de adquirir un sistema de DHFR, que es un sistema comun de expresion de protema recombinante, se clono un gen de DHFR (dihidrofolato reductasa) de hamster.

Espedficamente, para obtener el gen de DHFR de hamster, se adquirio un vector pSVA3 (ATCC 77273) que tema un tipo mutante de gen DHFR de hamster, y luego se obtuvo un gen de DHFR de tipo silvestre mediante la mutacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

puntual utilizando el gen DHFR como plantilla. Ademas, se obtuvo una secuencia IRES por PCR a partir de un vector de Clontech (Cat. n° 6029-1, PT3267-5) que tiene la secuencia de ADN correspondiente.

El gen DHFR obtenido y la secuencia IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) se clonaron en un vector pCR2.1 para construir un vector de expresion pCR2.1-IRES-DHFR.

El vector pCDNA3.1-TNFR-Fc insertado con TNFR-Fc obtenido en el Ejemplo 1 y el vector pCR2.1-IRES-DHFR obtenido fueron digeridos con enzimas de restriccion, SalI y Xbal, y se ligaron para obtener un vector de expresion pcDNA3.1 insertado en Fc-TNFR-Fc-IRES-DHFR. Con el fin de clonarlo en un vector que tiene un gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la kanamicina se obtuvo a partir de un vector pAC-GFP (n° 632483) de Clontech, para introducir un gen Kan/Neo. El vector es un vector que tiene una secuencia de Kozak en una secuencia de iniciacion de la transcripcion del gen de TNFR-Fc y el gen Kan/Neo como marcador de seleccion de antibiotico, y se uso como un marco basico para clonar 4 sistemas de vectores de expresion diferentes con el fin de comparar los niveles de expresion de la protema recombinante usando celulas CHO.

Ejemplo 3: Clonacion del gen GS de hamster y preparacion del vector de expresion de protema de mairnfero pcDNA3.1-Kozak-TNFRII-Fc-IRES-GS.

Con el fin de adquirir el ADN de GS, se cultivo una lmea celular de hamster, CHO DG44 (Invitrogen, 12609-012), y luego se aislo un ARN total usando un reactivo TRIZOL (Invitrogen). Se llevo a cabo la RT-PCR usando el ARN total obtenido para obtener ADNc. Se llevo a cabo la PCR (25 ciclos de desnaturalizacion a 94 °C durante 5 minutos, desnaturalizacion a 94 °C durante 30 segundos, reasociacion a 50 °C durante 30 segundos, alargamiento a 72 °C durante 90 segundos y alargamiento a 72 °C durante 7 minutos) usando el ADNc obtenido como plantilla y un par de cebadores (cebador Gs SalI-F, cebador GS XbaI-R) para la adquisicion del siguiente gen GS, para obtener un producto de PCR.

GS SalI-F: 5'-gtcgacatggccacctcagcaagttccc-3 ' (SEQ ID NO. 3)

GS XbaI-R: 5'-tctagattagtttttgtattggaaaggg-3 ' (SEQ ID NO. 4)

El producto de la PCR obtenido se sometio a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, y luego se corto la banda correspondiente, seguido de limpieza usando un kit de limpieza Quiagen (n° 28204). Luego, el resultante se inserto en un vector de clonacion genica, vector pGEMT (Promega, EE. UU.). El vector de pGEMT insertado en el producto de PCR se introdujo en una celula TOP10 para obtener un total de 10 colonias. Se analizaron una secuencia de bases (SEQ ID NO. 5) y una secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO. 6) codificada por la secuencia de bases. Como resultado, se descubrio que un aminoacido difiere de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen GS de hamster (GenBank: X03495.1) conocido en el NCBI GenBank. El gen GS clonado codifica una enzima GS que tiene una secuencia que contiene una sustitucion de Arginina (R) por Glicina (G) en la posicion 299 de la secuencia de aminoacidos de la enzima GS de tipo silvestre.

Un fragmento obtenido tratando pGEMT-GS con enzimas de restriccion SalI y XbaI se inserto en un vector TOPO- IRES-DHFR que se digirio previamente con enzimas de restriccion SalI y XbaI, para obtener un gen pCR2.1-TOPO- IRES-GS.

A continuacion, para conectar el gen TNFR-Fc y el gen IREF-GS, se ligaron el gen TNFRII-Fc-IRES-DHFR y el fragmento IRES-GS digerido con XhoI y XbaI para construir un vector kozak-TNFR-Fc-IRES-GS ("vector IRES-GS") (FIG. 1). La FIG. 1 es un diagrama esquematico que muestra el metodo de clonacion de pcDNA3.1-Kozak-TNFRII- Fc-IRES-GS de la presente invencion. Ademas, se muestra un diagrama esquematico del vector en la FIG. 2.

Ejemplo 4: Preparacion de la muestra a aplicar a la cromatograffa de interaccion hidrofoba.

Se introdujeron celulas CHO (ovario de hamster chino) con el vector pcDNA3.1-Kozak-TNFRII-Fc-IRES-GS que comprende un gen productor de TNFRII-Fc mediante lipofectamina 2000 (Invitrogen). La lmea celular CHO introducida con el gen se cultivo en un matraz o biorreactor usando un medio DMEM/F12 (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco: Mezcla de nutrientes F-12) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). El caldo de cultivo se filtro usando un filtro de profundidad para eliminar las celulas, y se realizo de nuevo una microfiltracion para eliminar los restos de celulas. El sobrenadante se recogio y se purifico parcialmente por cromatograffa de Protema A. El pH de la fraccion de purificacion se ajusto dentro del intervalo de 3,6 a 3,8 usando acido cftrico 100 mM o acido fosforico (pH 2,1).

Se mezclo una solucion de citrato sodico 1 M y fosfato sodico 75 mM (pH 6,8) a una relacion en volumen de aproximadamente 1:1. La solucion se anadio bajo agitacion hasta que la conductividad alcanzo de 50 a 52 mS/cm a temperatura ambiente. Despues de la adicion, la mezcla se filtro usando un filtro de 0,2 pm.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplo Experimental 1:

Cromatograffa de interaccion hidrofoba.

Ejemplo Experimental 1-1: Cromatograffa de interaccion hidrofoba usando citrato sodico.

Se empaqueto una columna de vidrio con Butil Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) en una longitud de 8 cm o mas. Se preparo una solucion tampon (pH 6,8) de citrato sodico 0,5 M y fosfato sodico 50 mM (denominado tampon I) y una solucion tampon (pH 6,8) de fosfato sodico 50 mM (denominado tampon J).

Se aplicaron a la columna empaquetada tres volumenes de columna de Tampon I como tampon de equilibrado para equilibrar la columna. Una vez terminado el equilibrado, la solucion preparada en el Ejemplo 4 se aplico a la columna en una cantidad de 12 gramos por litro de columna o mas. Despues de completarse la inyeccion, la columna se lavo con 2 veces el volumen de la columna de Tampon I como tampon de lavado. En este momento, la fraccion eluida se designo como Pico 1.

A continuacion, se hizo que el tampon de elucion tuviera una composicion de 80% de Tampon I y 20% de Tampon J, y depues se ajusto la conductividad usando el tampon. Cuando aumentaron las senales del detector UV, se recogio una fraccion. En este momento, la fraccion eluida se designo como Pico 2. El Pico 2 se pudo recoger entre 1,5 a 3,5 veces el volumen de la columna.

A continuacion, se hizo que el tampon tuviera una composicion de 100% de tampon J, y luego la columna se lavo con 3 veces el volumen de la columna de Tampon J. En este momento, la fraccion eluida se designo como Pico 3.

Como resultado de la cromatograffa de interaccion hidrofoba, se obtuvo el cromatograma de la FIG. 3. Como se muestra en la FIG. 3, el Pico 1, el Pico 2 y el Pico 3 fueron separados. Puede verse que la forma recortada se incluyo en el Pico 1, la forma activa se incluyo en el Pico 2 y la forma inactiva y los agregados de protema se incluyeron en el Pico 3.

Ejemplo experimental 1-2: Cromatograffa de interaccion hidrofoba usando sulfato sodico.

Se empaqueto una columna con Butil Sepharose 4 Fast Flow en una longitud de 10 cm o mas. Se prepararon una solucion tampon (pH 6,8) de sulfato sodico 0,72 M y fosfato sodico 50 mM (denominada en adelante "Tampon S") y una solucion tampon de fosfato sodico 50 mM (denominada en adelante "Tampon J").

Se aplico 3 veces el volumen de la columna de Tampon S a la columna empaquetada, para equilibrar la columna. Despues de terminar el equilibrado, la solucion de protema, en la que se ajusto la concentracion final de sulfato sodico en 0,72 M con un tampon (pH 6,8) de 1,2 M de sulfato sodico y 50 mM de fosfato sodico, fue aplicada a la columna en una cantidad de 11 gramos por litro de columna o mas. La solucion de protema tema una conductividad que oscilaba entre 65 y 75 mS/cm. Despues de completar la inyeccion, la columna se lavo con 2 veces el volumen de columna de Tampon S. A continuacion, la composicion del Tampon S se redujo a 100-30% para 30 veces el volumen de la columna y posteriormente se redujo a 30-0% para 3 veces el volumen de la columna. El cromatograma resultante de la cromatograffa de interaccion hidrofoba anterior se muestra en la FIG. 4.

Como se muestra en la FIG. 4, se descubrio que la protema de fusion TNFRII-Fc se adsorbe sobre la columna a una concentracion de sulfato sodico de 0,72 M.

Este resultado indica que la protema de fusion TNFRII-Fc activa puede separarse usando sulfato sodico como la sal de la presente invencion, ademas del citrato sodico.

Ejemplo experimental 1-3: Cromatograffa de interaccion hidrofoba usando cloruro sodico.

Una columna se empaqueto con Butil Sepharose 4 Fast Flow en una longitud de 10 cm o mas. Se preparo una solucion tampon (pH 7,2) de cloruro sodico 0,75 M y Tris-HCl 50 mM (denominada en adelante "Tampon X"), una solucion tampon (pH 7,2) de cloruro sodico 1,0 M y Tris-HCl 50 mM (denominada en adelante “Tampon Y”), una solucion tampon (pH 7,2) de cloruro sodico 1,5 M y Tris-HCl 50 mM (denominada en adelante "Tampon Z") y una solucion tampon (pH 7,2) de Tris-HCl 50 mM (denominada en adelante "Tampon T").

Se aplico 3 veces el volumen de la columna de Tampon X a la columna empaquetada para equilibrar la columna. Una vez completado el equilibrado, la solucion de protema, en la que se ajusto la concentracion final de cloruro sodico en 0,75 M con un tampon (pH 7,2) de cloruro sodico 1,5 M y Tris-HCl 50 mM, se aplico a la columna en una cantidad de 4 gramos por litro de columna o mas. Una vez completada la inyeccion, la columna se lavo con 2 veces el volumen de la columna de Tampon X. A continuacion, la composicion del Tampon X se redujo a 100 - 0% para 20 veces el volumen de la columna. Ademas, tambien se realizaron los mismos procedimientos para el Tampon Y y el Tampon Z. El cromatograma resultante de la cromatograffa de interaccion hidrofoba anterior se muestra en la FIG. 5.

Como se muestra en la FIG. 5, se encontro que la protema de fusion TNFRII-Fc no se adsorbfa en la columna a la concentracion de cloruro sodico elevada, y se recupero como una fraccion de flujo continuo.

Claims (28)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para preparar una protema activa de fusion TNFR (receptor del factor de necrosis tumoral) - Fc, que comprende:

   a) cargar una muestra que comprende una mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc producidas en celulas de mairnfero en una cantidad de 10 a 14 g/L de lecho por volumen de resina de cromatograffa, a una columna de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) preequilibrada con un tampon de equilibrado que comprende una o mas sales elegidas entre el grupo que consiste en citrato sodico, sulfato sodico y fosfato sodico;

   b) lavar la columna con un tampon de lavado que comprende la misma sal que en el tampon de equilibrado para eliminar las formas recortadas de la protema de fusion TNFR-Fc de la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc; y

   c) eluir de la columna las protemas de fusion TNFR-Fc activas con un tampon de elucion que tiene una concentracion salina menor que el tampon de equilibrado,

   en donde la muestra que comprende la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc se ajusta para que tenga una conductividad de 50 a 75 mS/cm, antes de la carga.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tampon de equilibrado de la etapa a) es

   (a) un tampon que comprende citrato sodico 0,45 a 0,55 M y fosfato sodico 50 a 100 mM; o

   (b) un tampon que comprende sulfato sodico 0,70 a 0,72 M y fosfato sodico 50 a 100 mM.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el tampon de equilibrado tiene un pH que se encuentra en el intervalo de 6,5 a 7,0.
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que el tampon de equilibrado de la etapa a) es

   (a) un tampon que comprende citrato sodico 0,48 a 0,52 M y fosfato sodico 50 a 70 mM a un pH de 6,7 a 6,9; o

   (b) un tampon que comprende sulfato sodico de 0,71 a 0,72 M y fosfato sodico de 50 a 70 mM a un pH de 6,7 a

   6,9.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que

   (a) un ligando de la columna se elige entre el grupo que consiste en un grupo butilo, un grupo octilo, un grupo fenilo y un grupo alquilo:

   (b) la protema de fusion TNFR-Fc de la etapa a) se produce en celulas de marnffero introducidas con un vector pcDNA3.1-Kozak-TNFRII-Fc-IRES-GS; o

   (c) la protema de fusion TNFR-Fc es purificada parcialmente por uno o mas metodos elegidos entre el grupo que consiste en cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico y desalacion, antes de cargarla en la columna.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la conductividad se ajusta con una o mas sales elegidas entre el grupo que consiste en citrato sodico, sulfato sodico y sulfato amonico.
7. 7. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la muestra que comprende la mezcla de protemas de fusion TNFR-Fc se ajusta con citrato sodico para tener una conductividad de 50 a 55 mS/cm antes de la carga, o se ajusta con sulfato sodico para tener una conductividad de 65 a 75 mS/cm antes de la carga.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tampon de lavado de la etapa b) tiene la misma composicion que en el tampon de equilibrado de la etapa a).
9. 9. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa c) es para eluir la protema de fusion TNFR-Fc activa con un tampon de elucion que tiene una conductividad de 40 a 47 mS/cm.
10. 10. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tampon de elucion de la etapa c) es

    (a) un tampon que comprende citrato sodico que esta en el intervalo de 0,35 a 0,4 M; o

    (b) un tampon que comprende sulfato sodico que esta en el intervalo de 0,35 a 0,56 M.
11. 11. El metodo segun las reivindicaciones 9 o 10, en el que el tampon de elucion tiene un pH que esta en el

    intervalo de 6,5 a 7,0.
12. 12. El metodo segun la reivindicacion 10, en el que el tampon de elucion de la etapa c) es

    (a) un tampon que comprende citrato sodico 0,38 a 0,4 M y fosfato sodico 50 a 70 mM a pH 6,7 a 6,9; o

    (b) un tampon que comprende sulfato sodico 0,38 a 0,4 M y fosfato sodico 50 a 70 mM a pH 6,7 a 6,9.
13. 13. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas d) separar de la columna una fraccion que

    5 comprende protemas de fusion TNFR-Fc inactivas o agregados de protema de fusion TNFR-Fc con un tampon que

    tiene pH 6,5 a 7,0 y una conductividad de 4 a 6 mS/cm .
14. 14. El metodo segun la reivindicacion 13, en el que el tampon usado en la etapa d) comprende fosfato de 50 a 70 mM a un pH de 6,7 a 6,9.

    imagen1

    TOPO-GS

    TNFR-Fc IRES OHFR

    TNFfcFe IRES OS

    peDNA-Kozak.TNm-Fc-IRES-GS

    Vector bi-cistronico

    [Fig-1]

    Saif Xf>a!

    Xbal

    Xhol

    Sail *bai

    Xhol

    Xbal

    IRES

    Xhol

    Xbal

    Sail Xbal

    Xhol

    Xhol

    Xbai

    Xbal

    Xhol

    TNFR*Fc

    IRES GS

    [Fig. 2]

    Promotor CMV

    Sad

    Intron

    Kozak

    Gen de interes

    Kml Neo

    mm

    Promotor SV40*

    Xball GS/GSPM

    imagen2

    imagen3

    imagen4

    imagen5

    imagen6

    [Fig. 9]

    SanitizingM2101:10 C1R102

    SanitizingM2101:10 A1R131UV1

    Pico 3

    mS/cm

    Pico 2
15. 70.0
16. 60.0
17. 50.0
18. 40.0
19. 30.0
20. 20.0
21. 10.0

    Pico 1

    160 L

    100

    120

    140

    Fig. 10

    HIC12 1028:10 CIR102

    HIC 12 1028:10 AIR131UV1

    mS/cm

    Pico 3

    Pico 2
22. 70.0
23. 60.0
24. 50.0
25. 40.0
26. 30.0
27. 20.0

    Pico 1
28. 10.0

    60 80 100 120 140 160 L