JP6609641B2

JP6609641B2 - クラスターにおける表面プライマーの高度な利用

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Publication number: JP6609641B2
Application number: JP2017558661A
Authority: JP
Inventors: マークバウテルジョナサン; マークスキナーグレイ
Original assignee: イルミナケンブリッジリミテッド
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2019-11-20
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Description

ヒトの遺伝的変異を分類整理し、病気に対する感受性に対してこの変異を相関させる作業は手間とコストがかかる。このコストを大幅に引き下げることが、健康及び病気の理解を深めるに当たっては急務である。シークエンシングコストを削減するには、当該技術分野における多数の技術的進歩を必要とする。ゲノム分析のコストを削減し得る技術的進歩としては、（１）ライブラリー作成、（２）高並列クローン増幅及び分析、（３）ロバストなサイクルシークエンシング生化学の開発、（４）超高速画像化技術の開発、及び（５）短リードから配列アセンブリングを行うアルゴリズムの開発、が挙げられる。

シークエンシングコストの削減には、クローン増幅を高並列で作成することが重要である。シークエンシングは、一般に、ＤＮＡ分子のクローン集団について行われるが、ＤＮＡ分子は個々の細菌コロニーの採集物から成長させたプラスミドから作成することが慣例である。ヒトゲノムプロジェクトにおいて、各クローンを個々に採集し、成長させ、そのクローンからＤＮＡを抽出又は増幅させる。近年、ＤＮＡクローンの高並列分析を可能とする技術革新であって、特に、配列に基づく手法を用いた数多くの技術革新がなされている。この最も簡潔な手法において、まさにその本質においてクローンである単一分子レベルでライブラリーの分析を行うことができる。単一分子シークエンシングの主な利点は、各分子が個々に読みだされるため、サイクル配列が非同期的に起こり得ることである。これとは対照的に、クローン増幅の分析には、各配列サイクルを近定量的に完了する必要がある。そうしないと、その後の各サイクルにおいて背景ノイズが累進的に大きくなり、リード長が厳しく制限されるからである。そうであるから、クローン分析は、シークエンシング生化学のロバスト性に対する負荷が大きくなり、リード長が潜在的に制限される場合がある。

よって、ゲノム分析を向上する方法を開発すること、及び費用効率のより高い配列分析方法を提供することが要求されている。本発明は、この要求を満たし、また、関連する利点等を提供するものである。

本明細書に記載の方法及び組成物によれば、表面増幅の密度を向上することができる。本明細書には、表面増幅プロセス中において表面プライマーの利用を促進する方法が記載されている。各方法は、向上した密度での表面増幅に有用である。本明細書に記載の方法及び組成物によれば、標準的なクラスター増幅を用いて現在達成されるのと同じ密度で、より明瞭なクラスターの作成が可能となる。明瞭なクラスターには多数の利点があり、例えば、リードの質向上、リード長の伸長、シークエンシングのための走査時間の短縮、及びシステムのロバスト性の向上等がある。

本明細書に開示の核酸シークエンシング反応のための固定化鋳型を作製する方法及び組成物であり、該方法は、（ａ）固体支持体を設けるステップであって、該固体支持体はその上に固定化した複数の順方向増幅プライマー及び逆方向増幅プライマーを有し、前記複数の増幅プライマーのサブセットは開裂部位を含む、固体支持体を設けるステップ、（ｂ）前記支持体上のプライマーのサブセットを用いて鋳型を増幅し、複数の二本鎖核酸分子を生成するステップであって、各二本鎖核酸分子の両鎖はその５’末端にて固体支持体に結合される、生成するステップ、（ｃ）開裂部位にてプライマーのサブセットを開裂するステップ、及び（ｄ）部分変性条件下に開裂鎖を置いて、固定化相補増幅プライマーを用いて増幅産物の非固定化鎖のハイブリダイゼーションを促進した後、固定化増幅プライマーを伸長して、増幅産物の非固定化鎖のコピーを生成するステップを含む。

いくつかの実施形態において、部分変性条件とは、リコンビナーゼ／ポリメラーゼ増幅反応の成分を１つ以上添加してストランド侵入を促進することを含む。いくつかの実施形態において、部分変性条件は、鋳型ウォーキングに適した条件下に鋳型を置くことを含む。

いくつかの実施形態において、ステップ（ｄ）は、溶液中にプライマーを加えて、固定化増幅産物の非固定化端部まで該プライマーのハイブリダイゼーションを促進することを含む。

１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面及び以下の記載により説明する。その他の特徴、目的、及び利点は、発明の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１は、一実施形態による増幅方法の模式図である。図２は、一実施形態による増幅方法の模式図である。図３は、種々の方法により増幅したクラスターをＳｙＢｒＧｒｅｅｎ染色した比較結果を示す図である。図４は、種々の方法により増幅したクラスターの比較結果を示す図であり、同図中、上部パネル画は、ヌクレオチド取り込みの第１周期後の画像スキャンを示す図であり、下部パネル画は、各レーンにおけるクラスターのＣｙ３染色及びＣｙ５染色を示す図である。図５は、ペアエンドターン（a paired end turn）を生成する別のアプローチを示す模式図である。図６は、図５に示すアプローチにおける追加のステップを示す模式図である。

本明細書において、表面増幅プロセス中において表面プライマーの利用を促進する方法及び組成物を開示する。本方法は、向上した密度での表面増幅に有用である。本明細書における方法及び組成物により、標準的なクラスター増幅を用いて現在達成されるのと同じ密度で、より明瞭なクラスターを作製することが可能となる。

現在利用可能なシークエンシング技術では、表面増幅を用いて、固体支持体上に増幅核酸を形成する。最も一般的な手法として架橋増幅及び等温増幅が挙げられ、両増幅は、動力学排除増幅（kinetic exclusion amplification（ＫＥＡ））、すなわち、排除増幅（exclusion amplification（ＥｘＡｍｐ））を用いて実施することができる。これらの増幅方法は、両方とも、２つの異なる表面プライマー、すなわち順方向プライマー及び逆方向プライマーを用い、これらは固体支持体上で固定化される。しかしながら、架橋増幅及び排除増幅（ＥｘＡｍｐ）クラスター増幅の両プロセスでは、この２つの表面プライマーの使用が非効率的である。現在の予想では、表面プライマーのうち、増幅後に鋳型鎖に変換されるのは１０％未満である。既存の表面プライマーをよりロバストに利用可能な表面増幅方法の改善が求められている。表面プライマーのさらなる部分を利用可能な方法によれば、シークエンシング中に結果として生じるクラスターの明瞭さの点及び信号制限されたシークエンシングプラットフォームにおけるシークエンシングクオリティ向上の観点から、大きな利点が得られる。

本明細書に記載の各方法は、表面プライマーの占有を向上し、クラスターにおける核酸増幅産物を高密度にすることが可能となり、その結果、合成によるシークエンシングの際の信号を大きく向上させるものである。本明細書に記載のある一定の実施形態おける各増幅方法は、標準的な架橋増幅又はＥｘＡｍｐ増幅法を実施することを含む。標準的な増幅が完了したら、当該２つのプライマーの一方を開裂して固体支持体から取り除く。増幅分子の結合は１末端においてのみ維持されるが、依然としてｄｓＤＮＡ形態のままとなる。続いて、部分変性条件下における次の増幅ラウンドが起こり、相補固定化増幅プライマーによって、非固定化鎖の一部のハイブリダイゼーションを促進した後、固定化増幅プライマーが伸長して増幅産物の非固定化鎖のコピーを生成する。

図１に、一実施形態による方法の概略を示す。図１に示すように、初期表面増幅プロセスは、表面上の順方向プライマー及び逆方向プライマーの両方を用いて実施する。順方向プライマー及び逆方向プライマーは、図１において、それぞれ参照符号「Ｐ７」及び「Ｐ５」を付して示すが、本明細書において開示する方法は、任意の表面結合の順方向増幅プライマー及び逆方向増幅プライマーを用いて実施できることを理解されたい。初期増幅プロセスは、当該技術分野において既知の任意の好適な増幅方法を用いて行うことができ、例えば、架橋増幅又はリコンビナーゼ／ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、すなわち図１におけるＥｘＡｍｐを介して行うことができる。増幅の初期ラウンド後、表面結合の順方向プライマー及び逆方向プライマーの大部分は非伸長のままである。理論に束縛されるものではないが、架橋増幅及び／又はＲＰＡ増幅中に表面プライマーの利用率が低いのは、この２つの表面プライマーを「架橋」する鋳型分子を必要とすることによる立体障害又は他の物理的制約によるものと考えられる。

次に、図１に示すように、表面結合プライマーのサブセットを表面から開裂する。開裂した表面結合プライマーのサブセットは、例えば、順方向プライマーであっても、又は、代案として、逆方向プライマーであってもよい。いくつかの実施形態において、順方向プライマー又は逆方向プライマーのすべてを開裂することになるわけではないことを理解されたい。例えば、逆方向プライマー（Ｐ５）の開裂後もＰ５の一部が表面に結合したままとなる場合がある。いくつかの実施形態において、当初から結合していた順方向プライマーの９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、又は５％未満は、表面に結合したままとなる。いくつかの実施形態において、当初から結合していた逆方向プライマーの９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、又は５％未満は表面に結合したままとなる。

図１に示す実施形態において、開裂ステップにより、非伸長Ｐ５プライマー及び伸長Ｐ５プライマーの両方を開裂する。よって、開裂後は、開裂されたプライマーの一部が、線状架橋構造を介して固体支持体に結合したままとなる。開裂された非伸長プライマーが溶液中に存在することになり、必要に応じて、洗浄ステップにより固体支持体から除去することができる。

符号Ｐ５及びＰ７は、本明細書を通して、逆方向プライマー及び順方向プライマーを指すが、本明細書において示す方法は、逆方向プライマーのみを開裂することに限定されるものではないことが理解されよう。図示例の代案としての実施形態において、順方向プライマーを開裂することができ、逆方向プライマーは固体支持体上で固定化したままとすることができる。

本明細書に開示の方法において、多数の開裂可能なオリゴヌクレオチド、開裂可能なリンカー、及び開裂可能な方法のいずれか１つを用いることができる。オリゴヌクレオチドを固体支持体から開裂する方法は、例えば、本明細書において参照により全体を参照する米国特許第８，７１５，９６６号明細書に記載されるように、当該分野において既知である。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを、化学的方法、光化学的方法、酵素的方法、又は、オリゴヌクレオチドプライマーの全部又は一部を固体支持体から開裂する任意の他の好適な方法により開裂することができる。開裂部位は、例えば、オリゴヌクレオチド合成中に所定の部位に位置させることができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成中に、１以上のジオール単位をプライマー中に取り込むか、又はオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合するリンカー中に取り込み、その後ジオール含有オリゴヌクレオチドを過ヨウ素酸塩等の化学開裂剤で処理することにより、化学的開裂を実施することができる。いくつかの実施形態において、固定化オリゴヌクレオチドをニック又は開裂可能な任意の酵素により酵素的開裂が生じ得る。いくつかの実施形態において、制限エンドヌクレアーゼ又はニッキングエンドヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの実施形態において、米国特許明細書第８，７１５，９６６号明細書に援用された資料に記載されているように、デオキシウリジン（Ｕ）又は任意の他の非天然デオキシリボヌクレオチド又は改変デオキシリボヌクレオチドを取り込むことにより、オリゴヌクレオチド中に非塩基部位を生成することができる。例えば、オリゴヌクレオチド合成中に、デオキシウリジン（Ｕ）、８−オキソ−グアニン、又はデオキシイノシンを所定の部位に取り込み、その後、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＰ）をデオキシウリジンとして、ＦＰＧグリコシラーゼを８−オキソ−グアニンとして、及びＡｌｋＡグリコシラーゼをデオキシイノシンとして用いて、非塩基部位を生成することができる。非塩基部位を含むポリヌクレオチド鎖は、その後、エンドヌクレアーゼ（例えば、エンドＩＶエンドヌクレアーゼ、ＡＰリアーゼ、ＦＰＧグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ、エンドＶＩＩＩグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼ）、熱、又はアルカリで処理することにより開裂することができる。追加又は代案として、開裂戦略としては、米国特許第８，７１５，９６６号明細書に援用された資料において記載されるように、リボヌクレオチド、光化学開裂、ヘミメチルＤＮＡ，又はＰＣＲ抑制剤の使用を挙げることができる。

開裂ステップに続き、初期増幅プロセスの増幅産物は固定化結合及び非固定化結合を含み、固定化結合は、固体支持体上で固定化した残存プライマーを用いてその後さらに増幅することができる。例えば、図１に示すように、二本鎖増幅産物を部分変性条件下に置き、非固定化鎖（Ｐ７’として示す）の一部の非伸長プライマー（Ｐ７）へのハイブリダイゼーションを促進する。その後、伸長に適した条件下で、Ｐ７プライマーをポリメラーゼにより伸長するにより、非固定化鋳型鎖のコピーを新たに生成することができる。鋳型を部分変性させ、新たな非伸長プライマーへハイブリダイズし、伸長する各ステップは、所望により何回でも繰り返すことができる。本プロセスは、利用可能な表面プライマーを実質的に使い果たすまで何回も繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、本プロセスを介したサイクリングは、例えば、化学的変性又は温度サイクルにより制御することができる。いくつかの実施形態において、サイクリングは、化学的条件の温度サイクルを必要とせずに、プロセスを連続的に繰り返すことが可能な条件下において継続する。よって、鋳型を一部変性させ、固定化プライマーとハイブリダイズする各ステップは、当該技術分野において既知の多数の方法のうち任意のものを用いて実施することができる。例えば、いくつかの実施形態において、リコンビナーゼプライマー増幅（ＲＰＡ）を用いて、ストランド侵入及びそれに続く固定化プライマーの伸長を促進する。ＲＰＡ用の方法及び化合物は、米国特許第５，２２３，４１４号明細書及び米国特許第７，３９９，５９０号明細書、及び米国特許出願公報第２０１３／０２２５４２１号明細書に記載されており、それぞれの内容はその全体を参照により本明細書に組み込む。

ＲＰＡに用いる試薬は、アンプリコン形成を促進し、場合によってはアンプリコン形成の速度を増大するさらなる成分を含み得る。一例として、リコンビナーゼがある。リコンビナーゼは、侵入／伸長の繰り返しを可能とすることによりアンプリコン形成を促進することができる。より詳細には、リコンビナーゼは、そのポリメラーゼによる標的核酸の侵入、及びアンプリコン形成の鋳型として当該標的核酸を使用する同ポリメラーゼによるプライマーの伸長を促進することができる。このプロセスは、侵入／伸長の各ラウンドから都度生成されたアンプリコンがその次のラウンドにおける鋳型となる連鎖反応として繰り返すことができる。このプロセスは、（例えば、加熱変性又は化学的変性を介した）変性サイクルを必要としないため、標準ＰＣＲよりも迅速に発生し得る。そうであるから、リコンビナーゼ促進性増幅は等温的に実施することができる。一般に、リコンビナーゼ促進性増幅試薬中には、増幅を促進するため、ＡＴＰ又はその他のヌクレオチド（又は、場合によってはその非加水分解性類似体）を含むことが望ましい。リコンビナーゼと一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質との混合物は、ＳＳＢが増幅をさらに促進し得るため、特に有用である。リコンビナーゼ促進性増幅用の製剤等の例として、ＴｗｉｓｔＡｍｐキットとしてＴｗｉｓｔＤｘ社（ケンブリッジ、英国）により市販されているものが挙げられる。リコンビナーゼ促進性増幅試薬の有用な成分及び反応条件は、米国特許第５，２２３，４１４号明細書及び米国特許第７，３９９，５９０号明細書に記載されており、各文献は、それぞれ、参照により本明細書に組み込む。

アンプリコン形成を促進し、場合によりアンプリコン形成の速度を増大する増幅試薬中に含まれ得る成分の別の例として、ヘリカーゼがある。ヘリカーゼは、アンプリコン形成の連鎖反応を可能にすることによってアンプリコン形成を促進し得る。このプロセスは、（例えば、加熱変性又は化学的変性を介した）変性サイクルを必要としないため、標準ＰＣＲよりも迅速に発生し得る。そうであるから、ヘリカーゼ促進性増幅は、等温的に実施することができる。ヘリカーゼと一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質との混合物は、ＳＳＢにより増幅をさらに促進することができるため、特に有用である。ヘリカーゼ促進性増幅用の製剤等の例として、ＩｓｏＡｍｐキットとしてＢｉｏｈｅｌｉｘ社（ビバリー、マサチューセッツ州、米国）から市販されているものが挙げられる。さらに、ヘリカーゼタンパク質を含む有用な製剤の例は、米国特許第７，３９９，５９０号明細書及び米国特許第７，８２９，２８４号明細書に記載されており、各文献は、それぞれ、参照により本明細書に組み込む。追加又は代案として、ヘリカーゼ及び／又はリコンビナーゼと同様に、トポイソミラーゼを使用することができる。

上述したＲＰＡ手法の代案又は追加として、新しい固定化プライマーに合わせて鋳型を部分変性及びハイブリダイズする各ステップは、鋳型ウォーキング技術を用いて実施し得る。いくつかの実施形態において、鋳型ウォーキングは、表面オリゴのＴｍが低いこと（一般にＡＴプライマーが６０％超）を利用して、ＤＮＡの各端部のブリージングを促進し、プライマー間を鎖が移動（ウォーク）できるようにする。表面オリゴヌクレオチド及び鋳型ウォーキングの条件を設計する方法は、本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１３／０２２５４２１号明細書に記載されている。

ＲＰＡ及び鋳型ウォーキングの追加又は代案として、新しい固定化プライマーに合わせて鋳型を部分変性及びハイブリダイズする各ステップは、変性条件とハイブリダイゼーション条件との間をサイクルする循環手法を用いて行うことができる。例えば、変性サイクル、及び化学変性剤等のサイクリングは、当技術分野において既知であり、本明細書に開示の方法において使用することができる。

上述した実施形態の追加又は代案として、ＲＰＡ混合物中に溶液プライマーを加えて、溶液中で鋳型／プライマー二本鎖を形成することができる。その一例を図２に示す。図２に示すように、プライマーセットのうちの１つ（Ｐ５）を開裂した後、Ｐ５プライマー存在下でＲＰＡを行う。よって、鋳型の両端部から伸長が生じる。伸長反応を一回行うことにより、非固定化Ｐ７プライマーを伸長させる。さらに、鎖侵入、ハイブリダイゼーション、及び伸長を行って、溶相Ｐ５プライマーを伸長させて、非固定化鎖の相補コピーを形成する。そうすることで、Ｐ５鎖のコピーが余分に生成されることになり、それを用いることで、図２に示すように、Ｐ７プライマーをさらに占有することができる。特定の実施形態において、プライマーの新しいセットを溶液中に添加する。いくつかの実施形態において、開裂反応後に開裂プライマーを収集して、溶液中で用いて増幅を促進する。

上記の方法を、以下に示す図面及び実施例においてさらに説明する。各図面及び各実施形態において、用語「横方向ブースト」とは、表面プライマーの一つを開裂後、残りの固定化プライマー用いて増幅の第２ラウンドを行うことを意味する。いくつかの実施形態において、溶液中に添加したプライマーを用いて横方向ブーストを行う。

本明細書において提案する増幅の第２ラウンドは、本明細書において援用する米国特許出願公開第２０１３／０２２５４２１号明細書に記載の鋳型ウォーキング増幅技術、又は「ワイルドファイア」増幅とも称される増幅技術と同様の点がいくつかある。しかしながら、いくつかの重要な相違点を以下に示す。ワイルドファイアは、単一分子から表面ＤＮＡを全体的に増幅するために鋳型ウォーキングを用いる。一方、本開示による増幅手法は、追加の強度ブーストとして用いられ、２プライマー表面増幅により予め形成したクラスター内分子の数百個〜数千個の分子をさらに増幅するものである。よって、結果として生じるクラスターにおける増幅産物の密度はずっと高く、クラスター内のヌクレオチドの撮像は、ブリッジ増幅又はワイルドファイア増幅のいずれかをそれぞれ単独で用いた場合に所期し得るものと比べて、何倍もロバストである。確かに、表面増幅に用いたプライマーの１つを開裂することは反直感的である。なぜなら、単一の固定化プライマーを用いた線状増幅と比べて、順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いた増幅が指数関数的に進行することが所期され得るからである。以下の実施例の項において明らかなように、驚くべきことに、標準ブリッジ又はＥｘＡｍｐ表面増幅をプライマーのうちの１つを開裂することと組み合わせることにより、横方向ブーストが起こり、何倍もロバストな増幅産物が得られ、光学走査分析中における表面プライマーの利用率を高め、数倍も明瞭なクラスターを生成可能となることがわかった。ブリッジ増幅プライマーの１つを開裂することに起因して占有が向上することは予想外であった。

ペアエンドシークエンシングの各実施形態
シークエンシング手法には、第１リードの対向鎖上に第２シークエンシングリードを含むペアエンドシークエンシングを含む場合があり、例えば、本明細書において参照によりそれぞれ組み込む米国特許第７，７５４，４２９号明細書及び同第８，０１７，３３５号明細書に記載されている。一般的な実施形態において、ペアエンド法は、２表面結合プライマーにより、シークエンシングした鎖のコピーを生成できる点で有利である。この、相補鎖を再生するプロセスは、多くの場合、ペアエンドターンと呼ばれる。しかしながら、上述した各方法においては、固体支持体の表面から２種のプライマーのうちの１つを開裂するものであり、従来の手法を用いるペアエンドアプローチは不可能な場合がある。

相補鎖を再生することに代えて、本明細書に記載の増幅方法、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許第８，１９２，９３０号明細書に記載のアプローチのうちの任意の１つ等と共に、代替的なアプローチを用い得る。

また、本明細書においては、第２リード用の相補鎖を生成する代替的な方法を開示する。いくつかの実施形態において、本方法は、第３の表面プライマーを提供することを含み得る。第３の表面プライマーは、全ての増幅ステップを通じてブロックされるが、ペアエンドターン生成前に非ブロック化される。当該追加の表面プライマーに対する相補シークエンスは、例えば、ライブラリーのアダプタ中に存在し得るが、クラスター増幅中の挿入に伴って単純に増幅されるであろう。表面プライマーを非ブロック化して初めて、ペアエンドターン分子生成に利用可能となる。

図５及び図６に、このペアエンドターン法の一実施例を示す。図５に記載するように、クラスタリングプロセスを通じて、第３の増幅プライマー（符号Ｐ９を付して示す）が固体支持体上に存在するが、増幅に好適な条件下では伸長を防止する可逆的３’ブロックを有している。図示するように、ライブラリーには、Ｐ５’アダプターシークエンスとシークエンス対象の内部部分との間に位置する、Ｐ９を補完するアダプタ（Ｐ９’を付して示す）も含まれる。開裂部位も、一本鎖とすれば開裂可能であるが、Ｐ９’アダプターシークエンスとＰ５’アダプターシークエンスとの間のアダプタ部分に位置する。よって、第１シークエンスリードが完了した後、第３’ブロックをＰ９プライマーから除去し、Ｐ５’シークエンスを放出しつつ、開裂部位を開裂する。結果として生じる開裂及び非ブロック化した生成物を図５のパネル画Ｂに示す。続いて図６を参照すると、Ｐ９’アダプターシークエンスは、表面上のＰ９プライマーにハイブリダイズすることができ、ペアエンドターン法において一般に行われるように、相補鎖を再生することができる。

固体支持体へのオリゴヌクレオチドの付着
本明細書に示した方法及び組成物において、ポリヌクレオチドは固体支持体に固定化されている。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは共有結合的に支持体に固定化されている。分子（例えば、核酸）の支持体への固定化というとき、本明細書における用語「固定化（immobilized）」及び「付着（attached）」は、それぞれ、区別なく用いられており、明示的又は文脈により特に指示しない限り、直接結合、間接結合、共有結合、又は非共有結合を包含することを意図している。本発明の特定の実施形態において、共有結合が好ましい場合があるが、一般に、支持体を使用しようとする条件下、例えば、核酸増幅及び／又はシークエンシングを必要とする用途において、分子（例えば、核酸）の支持体への固定化又は結合を維持することができればよい。

本発明のある一定の実施形態においては、官能化した不活性基板又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズ等）からなる固体支持体を利用することができる。官能化は、例えば、ポリヌクレオチド等の生体分子に共有結合可能な反応基を含む中間材の層又はコーティングを塗布することにより行う。そのような支持体の例として、限定はしないが、ガラス等の不活性基板上に支持されたポリアクリルアミド系水性ゲル、特に、国際出願公開公報第２００５／０６５８１４号明細書及び米国特許出願公報第２００８／０２８０７７３号明細書に記載のポリアクリルアミド系水性ゲルが挙げられ、各文献の内容は参照により全体を本明細書に組み込む。そのような実施形態において、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材（例えば、水性ゲル）に直接共有結合してしてもよいが、中間材自体は基板又はマトリックス（例えば、ガラス基板）に非共有結合してもよい。したがって、用語「固体支持体に共有結合する」とは、このような配置構成を包含するものと解釈する。

共有結合としては、例えば、クリックケミストリー手法を用いることにより生じるものを例示することができる。非共有結合の例としては、限定はしないが、非特異的相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファン・デル・ワールス相互作用等）、又は特異的相互作用（例えば、親和性相互作用、受容体−リガンド相互作用、抗体−エピトープ相互作用、アビジン−ビオチン相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、レクチン−炭水化物相互作用等）が挙げられる。例示的な結合としては、米国特許第６，７３７，２３６号明細書；同７，２５９，２５８号明細書；同７，３７５，２３４号明細書、及び同７，４２７，６７８号明細書；及び米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号明細書に明記されており、各文献は参照により本明細書に組み込む。

いくつかの実施形態において、固体支持体はパターニングした表面を含む。「パターニングした表面」とは、固体支持体の露出層の層中又は層上に異なる領域を配することをいう。例えば、増幅プライマーが１つ以上存在する１つ以上の領域をフィーチャとすることができる。各フィーチャは、増幅プライマーが存在しない介在領域により分離することができる。いくつかの実施形態において、当該パターンは、行と列を有するｘｙ形式のフィーチャとすることができる。いくつかの実施形態において、当該パターンは、フィーチャ及び／又は介在領域の繰り返し配置とすることができる。いくつかの実施形態において、当該パターンは、フィーチャ及び／又は介在領域のランダム配置とすることができる。本明細書に記載の方法及び化合物において使用可能なパターニングした表面は、米国特許出願第１３／６６１，５２４号明細書又は米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６号公報に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。

いくつかの実施形態において、固体支持体は、表面中にウェル又はデプレッションのアレイを含む。当該アレイは、当該技術分野において一般に知られるように、種々の手法を用いて作製することができる。各手法の例としては、限定はしないが、フォトリソグラフィ、スタンプ手法、成型手法、及びマイクロエッチング手法等が挙げられる。アレイ基板の組成及び形状により異なる手法を用いることが、当業者には理解されるであろう。

パターニングした表面におけるフィーチャは、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミドイルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）等の、パターニングされ共有結合したゲルを有するガラス、シリコン、プラスチック、又はその他の好適な固体支持体上のウェルのアレイ（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）中のウェルとすることができる（ＰＡＺＡＭ、例えば、参照により本明細書に組み込む米国仮特許出願第６１／７５３，８３３号明細書参照）。本プロセスにより、シークエンシング用のゲルパッドであって、多数回サイクルで実施するシークエンシング中にわたって安定なゲルパッドを作成する。ポリマーがウェルに共有結合することにより、種々の使用をする間、構造化基板の寿命にわたり構造化されたフィーチャ中のゲルを維持するのに資する。しかしながら、多くの実施形態において、ゲルはウェルに共有結合している必要はない。例えば、いくつかの条件において、構造化基板のどの部分にも共有結合していないシラン不含アクリルアミド（ＳＦＡ、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号明細書参照）をゲル物質として用いることができる。

特定の実施形態において、ウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）付き固体支持体材料をパターニングし、パターニングした支持体をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、又は、それらを化学的に変性した変異体（ＳＦＡのアジド化タイプ（アジド−ＳＦＡ）等）でコーティングし、ゲルコーティングした支持体を、例えば、化学的又は機械的に研磨することにより、構造化基板を作成することができ、それにより、ウェル中にゲルを保持しつつ、各ウェル間にある構造化基板表面上の各介在領域からのゲルをすべて除去又は不活性化することができる。プライマー核酸は、ゲル物質に付着させることが可能である。その後、標的核酸（例えば、断片化したヒトゲノム）の溶液を研磨した基板に接触させて、個々の標的核酸が、ゲル物質に付着させたプライマーとの相互作用により個々のウェルに播種されることになるようにすることができる。しかしながら、介在領域にはゲル物質が存在せず、又は存在したとしても不活性化されているため、標的核酸は介在領域を占有することはない。標的核酸の増幅は、ウェル内に限定されることになる。介在領域にはゲルが存在せず、又は存在したとしても不活性化されているため、成長中の核酸コロニーが外部へマイグレーションするのを防ぐからである。このプロセスは、スケーラブルかつ従来のマイクロファブリケーション法又はナノファブリケーション法を利用するものであり、便宜な製造が可能となる。

増幅及びクラスタリング
例えば、いくつかの実施形態において、米国特許第７，９８５，５６５号明細書及び同７，１１５，４００号明細書に例示されるクラスター増幅法を用いて固定化ＤＮＡ断片を増幅する。各文献の内容は、本明細書においてその全体を参照により組み込む。この組み込んだ米国特許第７，９８５，５６５号明細書及び同７，１１５，４００号明細書の各文献には、クラスター又は「コロニー」を含むアレイを形成するため、増幅産物を固体支持体上で固定可能な固相核酸増幅方法が記載されている。そのようなアレイ上の各クラスター又はコロニーは、それぞれ、複数の同一の固定化ポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化相補ポリヌクレオチド鎖から形成する。このように形成したアレイは、本明細書において、広く「クラスター化アレイ」と称する。米国特許第７，９８５，５６５号明細書及び同７，１１５，４００号明細書に記載されるような固相増幅反応の産物は、固定化ポリヌクレオチド鎖と固定化相補鎖の各対をアニーリングすることにより形成したいわゆる「ブリッジ化」された構造である。固定化ポリヌクレオチド鎖及び固定化相補鎖はいずれも、５’末端において固体支持体上に、好ましくは、共有結合を介して固定されている。クラスター増幅法は、固定化核酸鋳型を用いて固定化アンプリコンを製造する方法の例示である。他の好適な方法を用いて、本明細書に記載の方法により生成した固定化ＤＮＡ断片から固定化アンプリコンを製造することもできる。例えば、各増幅プライマー対のプライマーの一方又は両方が固定化されているか否かに関わらず、固相ＰＣＲを介して１つ以上のクラスター又はコロニーを形成することができる。

その他の実施形態において、固定化ＤＮＡ断片を溶液中で増幅する。例えば、いくつかの実施形態において、固定化ＤＮＡ断片を開裂するか、又はそうでなければ固体支持体から放出し、そして増幅プライマーを、溶液中で、放出された分子にハイブリダイズする。その他の実施形態において、１つ以上の初期増幅ステップにおいて増幅プライマーを固定化ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、次の増幅ステップを溶液中で行う。よって、いくつかの実施形態において、固定化核酸鋳型を用いて溶相アンプリコンを生成することができる。

シークエンシング方法
本明細書に記載の各方法は、種々の核酸シークエンシング方法と共に用いることができる。特に適用可能な技術としては、アレイ中の固定位置に核酸を付着して、各核酸の相対的な位置が変わらないようにし、そのアレイを繰り返し撮像するものである。異なるカラーチャネルにおいて画像が取得される実施形態においては、例えば、一のヌクレオチド系種を他から識別するのに使用する異なる標識と一致することが特に適用可能である。いくつかの実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を判定するプロセスは、自動化することができる。好ましい実施形態としては、１塩基合成（（Sequencing by Synthesis（ＳＢＳ）法がある。

ＳＢＳ法では、一般に、鋳型鎖に対してヌクレオチドを繰り返し添加することによる新生核酸鎖の酵素的伸長を含む。従来のＳＢＳ法においては、各送達において、ポリメラーゼの存在下で単一ヌクレオチド単量体を標的ヌクレオチドに与える。しかしながら、本明細書に記載の方法では、送達において、ポリメラーゼの存在下で、１種以上のヌクレオチド単量体を標的核酸に与えることができる。

ＳＢＳによれば、ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体又はターミネーター部分を全く持たないヌクレオチド単量体を利用することができる。ターミネーターを全く持たないヌクレオチド単量体を利用する方法としては、例えば、以下に詳述するようなγ−リン酸標識ヌクレオチドを用いるシークエンシング及びピロシークエンシングが挙げられる。ターミネーターを持たないヌクレオチド単量体を利用する方法においては、各サイクルにおいて添加するヌクレオチドの数は通常可変であり、鋳型配列及びヌクレオチドデリバリーの態様により異なる。ターミネーター部分を有するヌクレオチド単量体を利用するＳＢＳ法では、ターミネーターは、ジデオキシヌクレオチドを利用する従来のサンガー法シークエンシングに用いられるのと同様のシークエンシング条件下で効果的に不可逆的とすることができ、また、Ｓｏｌｅｘａ社（現イルミナ社）により開発されたシークエンシング方法と同様にターミネーターを可逆的とすることもできる。

ＳＢＳ手法では、標識部分を有するヌクレオチド単量体又は標識部分を持たないヌクレオチド単量体を利用することができる。したがって、組込イベントは、標識の蛍光性等の標識の特徴、分子量又は電荷等のヌクレオチド単量体の特徴、ピロリン酸塩等のヌクレオチド組込による副産物、に基づいて検出することができる。シークエンシング試薬において２つ以上の異なるヌクレオチドが存在する各実施形態において、異なるヌクレオチドは相互に判別することができ、又は代案として、異なる標識は、使用中の検出手法の下では相互に判別不能とすることができる。例えば、シークエンシング試薬中に存在する異なるヌクレオチドは異なる標識を有することができ、Ｓｏｌｅｘａ社（現イルミナ社）により開発されたシークエンシング方法により例示されるような適切な光学を用いて判別することができる。

好ましい実施形態としては、ピロシークエンシング技術が挙げられる。ピロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖中に組み込まれる時の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, M.、Karamohamed, S.、Pettersson, B.、Uhlen, M.及びNyren, P.（１９９６年）"Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1)、84-9；Ronaghi, M.（２００１年）"Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1)、3-11； Ronaghi, M.、Uhlen, M.及びNyren, P.（１９９８年）"A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375)、363；米国特許第６，２１０，８９１号明細書、同第６，２５８，５６８号明細書、及び同６，２７４，３２０号明細書；これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込む）。ピロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることによって検出することができ、生じたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼによって製造される光子を介して検出することができる。シークエンシングする核酸はアレイ中のフィーチャに付着させることができ、そのアレイを撮像して、アレイのフィーチャにおいてヌクレオチドが組み込まれたことにより生成された化学発光信号を捕捉する。撮像は、アレイを特定のヌクレオチド種（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧ）で処理した後に行うことができる。各ヌクレオチド種添加後に得られる画像は、アレイ中のフィーチャを検出したものとは異なることになる。画像中のこれらの差異は、アレイ上のフィーチャの配列内容の差異を反映する。しかしながら、各フィーチャの画像中における相対的な位置は依然として変化しないことになる。各画像は、本明細書に記載の方法を用いて、記憶し、処理し、分析を行うことができる。例えば、アレイをそれぞれ異なるヌクレオチド種で処理した後に得られる画像は、異なる検出チャネルから得られた画像について説明したのと同様の方法で処理することができる。

ＳＢＳの別の例示的種類において、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号及び米国特許第７，０５７，０２６号明細書に記載の開裂可能な顔料標識又は光脱色可能な顔料標識を含有する可逆的ターミネーターヌクレオチドを段階的に添加することにより、サイクルシークエンシングを行う。このアプローチは、Ｓｏｌｅｘａ社（現イルミナ社）により市販されており、また、国際公開第９１／０６６７８号及び国際公開第０７／１２３，７４４号に記載されている。各文献は、参照により本明細書に組み込む。ターミネーションを反転可能で、かつ蛍光標識を開裂した蛍光標識されたターミネーターを利用可能なため、効率的な周期的可逆的ターミネーション（ＣＲＴ）シークエンシングが容易になる。また、ポリメラーゼも共に設計（co-engineered）して、これらの修飾ヌクレオチドを効率的に組み込み、修飾ヌクレオチドから伸長させることもできる。

好ましくは、可逆的ターミネーターに基づくシークエンシング実施形態において、各標識は、ＳＢＳ反応条件下において、実質的に伸長を妨げない。しかしながら、検出標識は、例えば開裂又は分解により除去可能とすることができる。アレイ化した核酸フィーチャに標識を組み込んだ後、画像を捕捉することができる。特定の実施形態において、各サイクルは、４つの異なるヌクレオチド種を同時にアレイに送達することを含み、各ヌクレオチド種はスペクトル的に異なる標識を有する。そして、４つの画像を得ることができるが、各画像は、４つの異なる標識のうちの１つについて選択可能な検出チャネルを用いて得ることができる。代案として、異なるヌクレオチド種を連続的に添加して、各添加ステップの合間にアレイの画像を得ることができる。このような実施形態においては、各画像が、組み込まれた特定種のヌクレオチドを有する核酸フィーチャを示すことになる。各フィーチャのシークエンス内容が異なるため、異なる画像において、異なるフィーチャが存在又は欠如することになる。しかしながら、各画像中における各フィーチャの相対的位置は依然として変化しないことになる。このような可逆的ターミネーター−ＳＢＳ法により得られた画像は、本明細書に記載するように、記憶し、処理し、分析することができる。画像捕捉ステップの後、続くヌクレオチド添加及び検出サイクルを行うため、各標識を除去し、可逆的ターミネーター部分を除去することができる。特定のサイクルにおいて標識を検出した後、次のサイクルの前に各標識を除去することは、各サイクル間のクロストーク及びバックグラウンド信号を低減させるという利点がある。利用可能な標識及び除去方法の実施例を以下に示す。

特定の実施形態において、ヌクレオチド単量体の一部又は全部に可逆的ターミネーターを含むことができる。そのような実施形態において、可逆的ターミネーター／開裂可能な蛍光剤は、３’エステル結合を介してリボース部分に結合した蛍光剤を含み得る（Metzker、Genome Res. 15: １７６７〜１７７６頁（２００５年）、参照により本明細書に組み込む）。他のアプローチにより、蛍光標識の開裂からターミネーターを分離してきた（Ruparel et al.、Proc Natl Acad Sci USA 102：５９３２〜７頁（２００５年）、その全体を参照により本明細書に組み込む）。Ruparelらによれば、小さい３’アリル基を用いて伸長を阻止するが、短時間の処理でパラジウム溶媒を用いて容易にデブロックし得る可逆的ターミネーターの開発について記載している。光開裂可能なリンカーを介して蛍光体を塩基に付着させた。当該リンカーは、長波長ＵＶ光を３０秒露光することにより容易に開裂し得るものであった。よって、ジスルフィド還元又は光開裂のいずれかを開裂可能なリンカーとして用いることができる。可逆的ターミネーションの別のアプローチは、ｄＮＴＰ上にバルキー染料を置いた結果として発生する天然ターミネーションを利用することである。ｄＮＴＰ上に帯電したバルキー染料が存在することにより、立体障害又は静電障害により効果的なターミネーターとして作用することができる。１つの組込イベントの存在により、染料を除去しない限り、さらなる組込が妨げられる。染料の開裂により、蛍光体が除去され、ターミネーションを効果的に反転する。修飾ヌクレオチドの実施例は、米国特許第７，４２７，６７３号明細書、及び米国特許第７，０５７，０２６号明細書に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込む。

本明細書に記載の方法及びシステムと共に利用可能なＳＢＳシステム及び方法は、さらに、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号明細書、同第２００６／０１８８９０１号明細書、米国特許第７，０５７，０２６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０４３９号明細書、同第２００６／０２８１１０９号明細書、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、国際公開第０６／０６４１９９号、国際公開第０７／０１０，２５１号、米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５号明細書、及び米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７２号明細書に例示されており、その開示は参照により本明細書に全体を組み込む。

いくつかの実施形態において、４つ未満の異なる標識を用いて４つの異なるヌクレオチドを検出することを利用することができる。例えば、引例である米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書に記載の方法及びシステムを利用してＳＢＳを実施することができる。第１の例として、同一波長において１対のヌクレオチド種を検出することができるが、対の一方強度と他を比較した強度の差異に基づいて、又は対の一方の他に対する変化（例えば、化学修飾、光化学修飾、又は物理的修飾を介した変化）により、見かけの信号の出現又は消滅により、判別することができる。第２の例として、４つの異なるヌクレオチド種のうち３つを特定の条件下で検出する一方、第４番目のヌクレオチド種は同様の条件下で検出可能な標識を持たないか、又はこれらの条件下で最小検出される標識を有する（例えば、バックグラウンド蛍光発光によるし最小検出等）。最初の３つのヌクレオチド種が核酸に組み込まれていることは、その個々の信号の存在に基づいて測定することができ、また第４番目のヌクレオチド種が核酸に組み込まれていることは、何らかの信号の欠如又は最小検出に基づいて測定することができる。第３の例として、１つのヌクレオチド種は、２つの異なるチャネルにおいて検出される標識を含むことができるが、その他のヌクレオチドは各チャネルのうち１つのチャネルにおいてのみ検出される。上記の３つの例示的な構成は、互いに排他的なものとはみなされず、種々の組み合わせにおいて用いることができる。３つの実施例をすべて組み合わせる例示的な実施形態は、第１のチャネル中で検出される第１のヌクレオチド種（例えば、第１の励起波長で励起されると第１のチャネルにおいて検出される標識を有するｄＡＴＰ）と、第２のチャネル中で検出される第２のヌクレオチド種（例えば、第２の励起波長で励起されると第１のチャネルにおいて検出される標識を有するｄＣＴＰ）と、第１のチャネル及び第２のチャネルの両方で検出される第３のヌクレオチド種（例えば、第１及び／又は第２の励起波長で励起されると両方のチャネルにおいて検出される標識を有するｄＴＴＰ）と、標識を持たない第４のヌクレオチド種であって、いずれのチャネルにおいても検出されないか、又は最小検出される第４のヌクレオチド種（例えば、標識を有さないｄＧＴＰ）とを用いる、蛍光ベースのＳＢＳ法である。

さらに、本明細書に組み込む米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書に記載されるように、シークエンシングデータは、単一チャネルを用いて得ることができる。そのような、いわゆる１染料シークエンシング法において、第１のヌクレオチド種に標識を付するが、第１の画像が生成されたら標識を除去し、第２のヌクレオチド種は、第１の画像が生成された後にだけ標識を付す。第３のヌクレオチド種は、その標識を第１及び第２の画像の両方において保持し、第４のヌクレオチド種は、両方の画像において標識されないままである。

いくつかの実施形態において、ライゲーション法によるシークエンシングを利用することができる。そのような手法は、ＤＮＡリガーゼを利用してオリゴヌクレオチドを組み込み、オリゴヌクレオチドが組み込まれたことを識別する。オリゴヌクレオチドは、一般に、異なる標識を持ち、各標識は、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするシークエンス中の特定のヌクレオチドのアイデンティティーと相関する。他のＳＢＳ法同様、標識したシークエンシング試薬で核酸フィーチャのアレイを処理した後に画像を得ることができる。各画像は、特定の種の組み込まれた標識を有する核酸フィーチャを示すことになる。各フィーチャのシークエンス内容が異なるため、異なる画像には異なるフィーチャが存在又は欠如することになるが、各フィーチャの相対的な位置は依然として変化しないことになる。ライゲーションベースのシークエンシング法から得られた画像は、本明細書に記載の方法を用いて、記憶し、処理し、分析を行うことができる。本明細書に記載の方法及びシステムと共に利用可能なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許第６，９６９，４８８号明細書、米国特許第６，１７２，２１８号明細書、及び米国特許第６，３０６，５９７号明細書に例示されるが、その開示は参照により本明細書にその全体を組み込む。

いくつかの実施形態は、ナノポアシークエンシング（Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18、１４７〜１５１頁（２０００年）；Deamer, D.及びD, Branton、"Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem. Res. 35:817-825（２００２年）；Li, J.、M. Gershow、D. Stein、E. Brandin、及びJ. A. Golovchenko、"DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2: ６１１頁〜６１５頁（２００３年）、その開示は参照により全体を本明細書に組み込む）を利用することができる。そのような実施形態において、標的核酸はナノポアを通過する。ナノポアは、合成ポア又は、α−ヘモリジン等の生体膜タンパク質とすることができる。標的核酸がナノポアを通過するため、各塩基対は当該ポアの導電率の変動を測定することにより識別することができる（米国特許第７，００１，７９２号明細書；Soni, G. V. & Meller、"A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 5、１９９６〜２００１頁（２００７年）；Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2、４５９〜４８１頁（２００７年）；Cockroft, S. L.、Chu, J.、Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130、８１８〜８２０頁（２００８年）、その開示は参照により全体を本明細書に組み込む）。ナノポアシークエンシングから得られたデータは、本明細書に記載のように、記憶し、処理し、分析することができる。特に、データは、本明細書に記載されるような、光学画像及び他の画像の例示的な処理にしたがって画像として処理することができる。

いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを実施する方法を利用することができる。ヌクレオチド組み込みは、例えば、米国特許第７，３２９，４９２号明細書及び米国特許第７，２１１，４１４号明細書（各文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、フルオロフォア保有ポリメラーゼとγ−リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用によって、又は、米国特許第７，３１５，０１９号明細書（参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、及び、例えば、米国特許第７，４０５，２８１号明細書及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書（各文献は、参照により本明細書に組み込む）に記載されるように、蛍光ヌクレオチド類似体及び改変ポリメラーゼを用いて、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。照明は、表面凍結ポリメラーゼ周囲のゼプトリットルスケール（zeptoliter-scale）体積に限定して、蛍光標識したヌクレオチドの組込を低バックグラウンドで観測できるようにする（Levene, M. J.ら"Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299、６８２〜６８６頁（２００３年）；Lundquist, P. M.ら"Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33、１０２６〜１０２８頁（２００８年）; Korlach, J.ら、"Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105、１１７６〜１１８１頁（２００８年）、各文献は参照によりその全体を本明細書に組み込む）。上記の方法により得られた画像を、本明細書に記載のように、記憶し、処理し、分析する。

いくつかのＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドの伸長生成物への組み込みの際に放出されたプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシークエンシングは、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術又は各々、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書；米国特許出願公開第第２００９／０１２７５８９号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号明細書；もしくは米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７号明細書に記載のシークエンシング法及びシステムを使用できる。動力学排除を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に示される方法は、プロトンを検出するために使用される基板に容易に適用され得る。より詳しくは、本明細書に示される方法は、プロトンを検出するために使用されるアレイの部位でアンプリコンのクローナル集団を製造するために使用され得る。

上記のＳＢＳ方法は、複数の異なる標的核酸を同時に操作できるよう、複合的なフォーマットにおいて有利に実行することができる。特定の実施形態において、異なる標的核酸を共通の反応槽内又は特定の基板の表面上で処理することができる。そうすれば、シークエンシング試薬の簡便な送達、未反応の試薬の除去、組込イベントの検出を多重的に行うことができる。表面結合した標的核酸を用いる実施形態において、標的核酸をアレイフォーマットとすることができる。アレイフォーマットにおいて、標的核酸は、一般に、空間的に判別可能なように表面非結合し得る。標的核酸の結合は、直接の共有結合により、ビーズ又は他の粒子への付着により、又は表面に付着したポリメラーゼその他の分子への結合により行うことができる。アレイは、各部位（フィーチャともいう）における標的核酸の単一コピーを含むことができ、又は同一シークエンスを有する複数のコピーが各部位又はフィーチャに存在してもよい。複数のコピーは、以下にさらに詳述するように、ブリッジ増幅又はエマルジョンＰＣＲ等の増幅方法により生成することができる。

本明細書に記載の方法は、フィーチャを種々の密度で有するアレイを使用することができるが、当該フィーチャの密度は、例えば、少なくとも約１０フィーチャ／ｃｍ^２、１００フィーチャ／ｃｍ^２、５００フィーチャ／ｃｍ^２、１，０００フィーチャ／ｃｍ^２、５，０００フィーチャ／ｃｍ^２、１０，０００フィーチャ／ｃｍ^２、５０，０００フィーチャ／ｃｍ^２、１００，０００フィーチャ／ｃｍ^２、１，０００，０００フィーチャ／ｃｍ^２、５，０００，０００フィーチャ／ｃｍ^２、又はそれより高密度である。

本明細書に記載の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並行して行うことができることである。したがって、本開示内容は、先に例示したような当該技術分野で既知の手法を使用して核酸を作成及び検出可能な統合システムを提供する。よって、本開示の統合システムは、ポンプ、バルブ、リザーバー、流動ラインなどといった、増幅試薬及び／又はシークエンシング試薬を１つ以上の固定化ＤＮＡ断片に送達できる流動コンポーネントを備えることができる。標的核酸の検出のための統合システムにおいて、フローセルを構成及び／又は使用することができる。フローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号に例示されており、各文献は、それぞれ、参照により本明細書に組み込む。フローセルについて例示されるように、統合システムの１つ以上の流動コンポーネントが、増幅方法のために、また検出方法のために使用され得る。核酸シークエンシング実施形態を一例として挙げると、統合システムの１つ以上の流動コンポーネントを使用して、本明細書に示される増幅方法を実施し、また、上記で例示したようなシークエンシング方法におけるシークエンシング試薬の送達を行うことができる。代案として、統合システムは、増幅方法を実施するための、また、検出方法を実施するための別個の流動系を備えることができる。増幅核酸の作製及び核酸の配列の決定を行うことができる統合されたシークエンシングシステムの例として、限定はしないが、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（イルミナ社、サンディエゴ、カリフォルニア）及び参照により本明細書に組み込む米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載されたデバイスが挙げられる。

（実施例１）
シークエンシングの第１のサイクルを用いた増幅方法の比較分析
本実施例は、溶液中にプライマーを添加した場合と添加しない場合とにおける、標準ＥｘＡｍｐ増幅と、その後のプライマー開裂イベント及び部分的変性条件下での増幅を含む他の方法との比較を示すものである。

標準的なシングルリードＨｉＳｅｑフローセル（イルミナ）にＣＴ９８１４ヒトゲノムライブラリーを２ｐＭシーディング（播種）した。ｖ１ＥｘＡｍｐ（イルミナ、ＰＣＸ１／２／３）で１５分増幅させてクラスターを生成した。各レーンを過ヨウ素酸塩で処理して、ジオールリンカーを開裂し、それによって完全にＰ５プライマーを完全に除去することにより、Ｐ５を線状化した。続いてクラスターを３８℃に加熱し、イルミナ製のｖ１ＥｘＡｍｐ試薬（レーン２）又はＥｘＡｍｐ試薬及びＰ５／ＳＢＳ３オリゴ（レーン３）で１０分間線状流して、信号ブーストのために処理した。レーン１については、さらなる処理を行わず、コントロールとして用いた（ＥｘＡｍｐ制御なし）。このフローセルをＳＹＢＲＧｒｅｅｎ染色し（モレキュラープローブ（Molecular Probes）製、トリス０．１Ｍ／アスコルビン酸ナトリウム０．１Ｍ中に１／５０００で希釈）、蛍光顕微鏡上で撮像した。

図３の上部パネル画に示すように、コントロールレーン１のクラスターは、通常の強度を有する通常のクラスターである一方、表面Ｐ５プライマーを除去しＥｘＡｍｐを用いてさらなるインキュベーションを行った結果、レーン１を基準としてグレースケールを正規化することによってハイライトしたように、より明瞭なクラスターを生じることがわかった（レーン２、図３下部パネル画）。レーン３は、グレースケール正規化後に見られるホワイトアウト結果によって示すように、原クラスターから外側へ生じる余剰増幅を示した。

したがって、横方向ブーストされたクラスターは、各クラスターにおいて顕著に高い増幅産物を有するようであり、より一層ロバストな蛍光信号を生成する。

（実施例２）
シークエンシングの第１のサイクルを用いた増幅方法の比較分析
実施例１において説明した分析に続いて、フローセルをその後作製して、シークエンシングプライマーをハイブリダイズし、イルミナ製組込ミックスＩＭＸを用いて５分間５５℃で洗浄して、第１のシークエンシング組込を行った。組込ミックスは、ポリメラーゼ、及び３’−ブロック化ｄＮＴＰの標識化ミックスを含む。イルミナ製洗浄バッファＰＲ２で洗浄後、トリス０．１Ｍ／アスコルビン酸ナトリウム０．１Ｍのスキャンミックスをフローセルに流し、第１のサイクル画像を、図４に示すように、蛍光顕微鏡で撮影した。さらに、各レーンにおけるクラスターのＣｙ３染色及びＣｙ５染色を定量化することにより撮像分析を行った。図４の下部パネル画に示すように、定量化により、横方向ブースト（レーン２）だけでも、コントロールと比べて少なくとも２倍明瞭なクラスターを生成することが分かる。溶液プライマー（レーン３）を用いた横方向ブーストにより、コントロールと比べて６倍以上明瞭なクラスターを生じる。

本願全体を通じて、種々の刊行物、特許及び特許出願が参照されている。これら刊行物の開示内容はその全文が、本発明が関係する技術分野の最先端をより十分に説明するために参照により本願に組み込む。

用語「含む」は、本明細書において、制約のないものであるとし、列挙された要素だけでなく、任意のさらなる要素もさらに包含する。

本発明は、上記で提供された実施例に関連して記載されているが、本発明から逸脱することなく種々の改変が行われ得るということは理解されなければならない。したがって、本発明は特許請求の範囲のみによって限定される。

Claims

核酸シークエンシング反応のための固定化鋳型を作成する方法であって、
（ａ）固体支持体を設けるステップであって、該固体支持体はその上に固定化した複数の順方向増幅プライマー及び逆方向増幅プライマーを有し、前記複数の増幅プライマーのサブセットは開裂部位を含む、固体支持体上を設けるステップ、
（ｂ）支持体上の増幅プライマーのサブセットを用いて標的核酸鋳型を増幅し、複数の二本鎖核酸分子を生成するステップであって、各二本鎖核酸分子の両鎖はその５’末端にて固体支持体に結合される、生成するステップ、
（ｃ）開裂部位にて増幅プライマーのサブセットを開裂して、開裂非固定化鎖および相補固定化鎖を含む線状増幅産物を生成するステップ、及び
（ｄ）部分変性条件下に増幅産物を置いて、開裂非固定化鎖の３’末端部のハイブリダイゼーションを促進した後、固定化増幅プライマーを伸長して、増幅産物の非固定化鎖の固定化コピーを生成するステップ、
を含み、
前記増幅プライマーのサブセットは、順方向増幅プライマーまたは逆方向増幅プライマーである、方法。
部分変性条件は、リコンビナーゼ／ポリメラーゼ増幅反応の成分を１つ以上添加してストランド侵入を促進させることを含む、請求項１に記載の方法。
部分変性条件は、鋳型ウォーキングのための条件下に鋳型を置くことを含む、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｄ）は、溶液中にプライマーを加えて、固定化増幅産物の非固定化端部まで該プライマーのハイブリダイゼーションを促進することを含み、
用いたプライマーは、前記固定化増幅産物と対になる、請求項１に記載の方法。
増幅プライマーのサブセットは順方向増幅プライマーを含み、溶液中のプライマーは順方向増幅プライマーを含む、請求項４に記載の方法。
増幅プライマーのサブセットは逆方向増幅プライマーを含み、溶液中のプライマーは逆方向増幅プライマーを含む、請求項４に記載の方法。
標的核酸をシークエンシングするステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
標的核酸をシークエンシングするステップは、
１つ以上のシークエンシングプライマーを固定化核酸鎖にハイブリダイズするステップ、
１つ以上の標識ヌクレオチドを新生鎖に取り込むことにより、１つ以上のシークエンシングプライマーを伸長するステップ、及び
標識ヌクレオチドを検出することにより、標的核酸についての配列情報を得るステップ、を含む、請求項７に記載の方法。
固体支持体は平坦である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
固体支持体はマイクロウェルを備える、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
標的核酸は、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、又は少なくとも５００ヌクレオチド分の長さを有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。