JP6547755B2 - ホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体 - Google Patents

Description

本発明は、ホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体に関する。

ホスホリルコリン（ＰＣ）は、血小板活性化因子のような炎症性リン脂質や酸化された低密度リポタンパク質において主要な成分であるだけでなく、肺炎連鎖球菌をはじめ多数の細菌の免疫原性成分としても主要な成分である。ＰＣ基を有する化合物は、ＰＣ特異的抗体の産生を目的としたＰＣ抗原として利用されている。例えば、特許文献１には、アテローム性動脈硬化症の免疫治療におけるＰＣ抗原の利用例が開示されている。アテローム性動脈硬化症は、大動脈および中動脈の最内側層（内膜）の肥厚を引き起こす慢性疾患であり、心筋梗塞をはじめとする心臓血管疾患の主な原因である。アテローム性動脈硬化症の患部では血流が減少し、影響を受けた血管によって供給されている組織において虚血および組織破壊が起こり得る。

特許文献１によれば、ＰＣ抗原として免疫学的担体蛋白質とＰＣを結合させたＰＣ−蛋白複合体を用いることにより、ＰＣ特異性を持つモノクローナル抗体およびその組成物が得られること、および、これらのＰＣ特異的モノクローナル抗体およびその組成物が、アテローム性動脈硬化症の免疫治療に有用であることが示されている。また、特許文献２には、肺炎連鎖球菌などの感染に対する免疫保護を誘導するためのワクチンとしてのＰＣ抗原の利用が開示されている。このようなワクチンを目指した研究としては、他に非特許文献１が挙げられる。非特許文献１においては、動物実験において免疫増強剤の存在下にてＰＣ−蛋白複合体を投与することにより、ＰＣ抗体価が上昇することを報告されている。

また、分子内にホスホリルコリン基を導入し高分子複合体を形成するための方法が種々提案されている（例えば特許文献３、４）が、ホスホリルコリン基含有化合物に基づくＰＣ−蛋白複合体の開発には至っていない。これは主に、ホスホリルコリン基含有化合物が機能を発現させるための構造に由来して、製造工程に複数段階の反応を要し、製造が容易とはいえないためである。このため、製造が容易でかつ、ＰＣ−蛋白複合体として機能するＰＣ基含有化合物が求められている。

国際公開第２００５／１００４０５号明細書 米国特許第５４５５０３２号明細書 特開２００７−１１９６４３号公報 国際公開第２００４／０７４２９８号明細書

Ｎｏｒｉｍｉｔｓｕ Ｔ． ｅｔ．ａｌ．，"Ｖａｃｃｉｎｅ"，２００７，２５（１４），ｐ．２６８０−２６８７．

上記の通り、本発明の目的は、製造が容易であり、かつホスホリルコリン抗原としての利用に適したホスホリルコリン複合体を生成可能なホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、芳香族カルボン酸構造を分子内に有するコンパクトな構造の化合物が意外にも上記課題を解決できることの知見を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記の〔１〕〜〔４〕である。

〔１〕下記の式（１）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物。

…（１）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくは下記の式（２）で表される構造を示す。）

…（２）
（Ｙは水素原子またはＳＯ_３Ｎａを示す。）

〔２〕下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン−蛋白複合体。

…（１'）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）

〔３〕下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、オリゴペプチドのアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン−ペプチド複合体。

…（１'）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）

〔４〕下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、アミノ酸のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン−アミノ酸複合体。

…（１'）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）

製造が容易であり、かつホスホリルコリン抗原としての利用に適したホスホリルコリン複合体を生成可能なホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体を提供することができる。

４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 ４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンの^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。 ４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 ＤＢＵ法により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 ＤＢＵ法により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。 ＤＢＵ法により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 ４−メチルフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 ４−メチルフェニルホスホリルコリンの^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。 ４−メチルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 過マンガン酸法により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 過マンガン酸法により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。 過マンガン酸法により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 ＰＣ−アミノ酸複合体合成における反応前のＨＰＬＣクロマトグラムである。 ＰＣ−アミノ酸複合体合成における反応後のＨＰＬＣクロマトグラムである。 ＰＣ−フェニルアラニン複合体のＭＳスペクトルである。 ４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 ４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルである。 ４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルのＭＳスペクトルである。

１．ホスホリルコリン（ＰＣ）基含有化合物
本発明のホスホリルコリン基含有化合物は、下記の式（１）で表される構造を有する。

…（１）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくは下記の式（２）で表される構造を示す。）

…（２）
（Ｙは水素原子またはＳＯ_３Ｎａを示す。）

上記の１価のカチオン残基としては、特に限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、またはアンモニア、イミダゾール、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、ジアザビシクロオクタン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）等がプロトン化された含窒素有機化合物等が挙げられる。
さらに、Ｘが前記の（２）式で表される構造を有するヒドロキシスクシンイミド体であるとき、活性カルボキシル基としてアミド化反応を有利に進行させ、ＰＣ複合体を導くのにより有利となる。ヒドロキシスクシンイミドは、アミド化後速やかに脱離する。また、式（１）中の−ＣＯＯＸ基は、ベンゼン環上のいずれかの炭素上に結合しているが、ホスホリルコリン基に対して、パラ−位で結合していることが好ましい。

本発明のＰＣ基含有化合物は、ベンゼン核に１つのＰＣ基と１つのカルボキシル基とが結合した構造を有する。すなわち、１分子内に１つのカルボキシル基を有することにより、蛋白質、オリゴペプチド、またはアミノ酸と結合させる際に架橋反応が起こらない。これにより、ＰＣ複合体の原料として本発明のＰＣ基含有化合物を用いることで、ＰＣ抗原としての利用に適した、水に可溶なＰＣ−蛋白複合体、ＰＣ−ペプチド複合体、またはＰＣ−アミノ酸複合体を得ることができる。

２．ＰＣ基含有化合物の製造方法
本発明のＰＣ基含有化合物は、次の製造方法１または２により製造することができる。
・製造方法１：
下記の式（３）で表される構造を有する化合物を、塩基性化合物を用いて加水分解することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。

…（３）
（Ｒは、炭素原子数１〜６のアルキル基、またはベンジル基を示す。）

・製造方法２：
下記の式（４）で表される構造を有する化合物を、酸化剤を用いて酸化することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。

…（４）

＜ＰＣ基含有化合物の製造方法１＞
ＰＣ基含有化合物の製造方法１は、具体的には、次の工程Ａ１〜Ａ３を含む。
工程Ａ１：カルボン酸エステル含有フェノール性化合物と２−クロロ−２−オキソ−１，３，２−ジオキサホスホラン（ＣＯＰ）とを、溶媒中で脱塩素化剤を用い反応させることにより、カルボン酸エステル含有オキサホスホラン（ＯＰ）化合物を生成する。
工程Ａ２：工程Ａ１で得られたカルボン酸エステル含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を生成する。
工程Ａ３：工程Ａ２で得られたカルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を、塩基性化合物存在下、水中でエステルを加水分解することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。

（工程Ａ１）
工程Ａ１は、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物とＣＯＰとを、溶媒中で脱塩素化剤を用いて反応させることにより、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物を生成する工程である。上記カルボン酸エステル含有フェノール性化合物としては、例えば、オキシ安息香酸エステルのようなベンゼン核に１個のカルボン酸エステルが結合した構造の化合物を用いることができ、また、オルト、メタ、パラ、いずれの位置異性体でも用いることができる。上記オキシ安息香酸エステルとしては、例えば、メチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸メチル）、エチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸エチル）、プロピルエステル型（ヒドロキシ安息香酸プロピル）、ブチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ブチル）、ペンチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ペンチル）、ヘキシルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ヘキシル）、ベンジルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ベンジル）等が挙げられる。さらに、上記オキシ安息香酸エステルは、入手性や経済性から、例えば、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、パラヒドロキシ安息香酸ブチル、パラヒドロキシ安息香酸ベンジル等のパラオキシ安息香酸エステルであることが好ましい。

工程Ａ１は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ａ１において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御といった観点から、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１０質量部であることがさらに好ましい。工程Ａ１において、反応温度は溶媒の凝固点以下でなければ特に限定されないが、温度制御が容易な−２０℃〜５０℃であることが好ましく、さらに、副反応を抑制する観点から−２０℃〜０℃であることがより好ましい。

工程Ａ１の反応時間は特に限定されないが、通常１時間〜８時間とすることができる。工程Ａ１において、ＣＯＰの使用量は、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物１モルに対して通常０．７モル当量〜３．０モル当量であり、０．８モル当量〜２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量〜１．２モル当量であることがより好ましい。工程Ａ１に用いられる脱塩化水素剤としては、有機塩基または無機塩基が挙げられる。さらに、溶媒に対する溶解性、生成する塩のろ過性の観点等から、脱塩化水素剤はトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン等であることが好ましい。

上記脱塩化水素剤の使用量は、ＣＯＰに対して通常０．７モル当量〜３．０モル当量であり、０．８モル当量〜２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量〜１．２モル当量であることがより好ましい。

（工程Ａ２）
工程Ａ２は、工程Ａ１で得られたカルボン酸エステル含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を生成する工程である。工程Ａ２は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ａ２において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応を制御といった観点から、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜２０質量部であることがさらに好ましい。

工程Ａ２において、反応温度は特に限定されないが、通常４０℃〜８０℃とすることができる。工程Ａ２の反応時間は特に限定されないが、通常６時間〜２４時間とすることができる。工程Ａ２において、トリメチルアミンの使用量は、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物に対して、通常１モル当量〜２モル当量とすることができる。

（工程Ａ３）
工程Ａ３は、工程Ａ２で得られたカルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を、塩基性化合物存在下、水中でエステルを加水分解することにより、カルボキシル基含有ＰＣ化合物を合成する工程である。工程Ａ３は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒は、通常水のみまたは含水有機溶媒であり、水のみであることが好ましい。工程Ａ３において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応を制御といった観点から、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜２０質量部であることがさらに好ましい。

工程Ａ３に用いられる塩基性化合物としては、エステル結合を切断してカルボキシル基に転換できるものであれば特に限定されない。当該塩基性化合物としては、反応速度の観点から、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、トリエチルアミン等の強塩基性化合物が挙げられる。上記塩基性化合物の使用量は、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物に対して、通常１モル当量〜２モル当量とすることができる。工程Ａ３において、反応温度は特に限定されないが、通常０℃〜１００℃とすることができる。工程Ａ３の反応時間は、特に限定されないが、通常１時間〜６時間とすることができる。

＜ＰＣ基含有化合物の製造方法２＞
ＰＣ基含有化合物の製造方法２は、具体的には、次の工程Ｂ１〜Ｂ３を含む。
工程Ｂ１：アルキル基含有フェノール性化合物とＣＯＰとを、溶媒中で脱塩素化剤を用い反応させることにより、アルキル基含有ＯＰ化合物を生成する。
工程Ｂ２：工程Ｂ１で得られたアルキル基含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、アルキル基含有ＰＣ化合物を生成する。
工程Ｂ３：工程Ｂ２で得られたアルキル基含有ＰＣ化合物を、酸化剤を用いて酸化することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。

（工程Ｂ１）
工程Ｂ１は、アルキル基含有フェノール性化合物とＣＯＰとを、溶媒中で脱塩素化剤を用いて反応させることにより、アルキル基含有ＯＰ化合物を生成する工程である。 上記アルキル基含有フェノール性化合物としては、例えばクレゾ−ルのような、ベンゼン核に１個のアルキル基が結合した構造の化合物を用いることができ、また、オルト、メタ、パラ、いずれの位置異性体でも用いることができる。

工程Ｂ１は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ｂ１において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御といった観点から、アルキル基含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、アルキル基含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１０質量部であることがさらに好ましい。

工程Ｂ１において、反応温度は溶媒の凝固点以下でなければ特に限定されないが、温度制御が容易な−２０℃〜５０℃であることが好ましく、さらに、副反応を抑制する観点から−２０℃〜０℃であることがより好ましい。工程Ｂ１の反応時間は特に限定されないが、通常１時間〜６時間とすることができる。

工程Ｂ１において、ＣＯＰの使用量は、アルキル基含有フェノール性化合物１モルに対して通常０．７モル当量〜３．０モル当量であり、０．８モル当量〜２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量〜１．２モル当量であることがより好ましい。工程Ｂ１に用いられる脱塩化水素剤としては、有機塩基または無機塩基が挙げられる。さらに、溶媒に対する溶解性、生成する塩のろ過性の観点等から、脱塩化水素剤はトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン等であることが好ましい。上記脱塩化水素剤の使用量は、ＣＯＰに対して通常０．７モル当量〜３．０モル当量であり、０．８モル当量〜２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量〜１．２モル当量であることがより好ましい。

（工程Ｂ２）
工程Ｂ２は、工程Ｂ１で得られたアルキル基含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、アルキル基含有ＰＣ化合物を生成する工程である。工程Ｂ２は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ｂ２において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御性といった観点から、アルキル基含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、アルキル基含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜２０質量部であることがさらに好ましい。

工程Ｂ２において、反応温度は特に限定されないが、通常４０℃〜８０℃とすることができる。工程Ｂ２の反応時間は特に限定されないが、通常６時間〜２４時間とすることができる。工程Ｂ２において、トリメチルアミンの使用量は、アルキル基含有ＯＰ化合物に対して、通常１モル当量〜２モル当量とすることができる。

（工程Ｂ３）
工程Ｂ３は、工程Ｂ２で得られたアルキル基含有ＰＣ化合物を、酸化剤を用いて酸化することにより、カルボキシル基含有ＰＣ化合物を生成する工程である。工程Ｂ３は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、特に限定されないが、プロトン性溶媒であることが好ましく、特に、水であることがさらに好ましい。工程Ｂ３において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御といった観点から、アルキル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、アルキル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１０質量部であることがさらに好ましい。

工程Ｂ３に用いられる酸化剤としては、アルキル基をカルボキシル基に転換できるものであれば特に限定されない。当該酸化剤としては、反応速度の観点から、例えば、過マンガン酸塩等の強酸化剤であることが好ましく、入手性を考慮すると、過マンガン酸カリウムであることがさらに好ましい。上記酸化剤の使用量は、特に限定されないが、アルキル基含有ＰＣ化合物に対して１モル当量〜１０モル当量であることが好ましく、経済性や環境負荷を考慮すると、１モル当量〜３モル当量であることがさらに好ましい。

工程Ｂ３において、反応温度は特に限定されないが、反応速度の観点から、溶媒の沸点付近にて還流下、反応を行うことが好ましい。工程Ｂ３の反応時間は特に限定されないが、通常１時間〜８時間とすることができる。

前記のＸが（２）式で表される構造を有するヒドロキシスクシンイミドまたはヒドロキシスルホスクシンイミド硫酸ナトリウム（以下ＮＨＳ体と略記する）とするためには、上記で得られたＸがカルボン酸または塩であるカルボキシル基含有ＰＣ化合物に対して、さらに次の工程Ｃを行うことにより得られる。

（工程Ｃ）
工程Ｃは、工程Ａ３、Ｂ３にて得られたカルボキシル基含有ＰＣ化合物（Ｘがカルボン酸または塩）に縮合剤を用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド硫酸ナトリウムを縮合することにより、ＮＨＳ体を生成する工程である。工程Ｃは、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。特に、溶解性や反応速度を考慮すると、溶媒はアセトニトリルまたはジメチルホルムアミドであることが好ましい。

工程Ｃにおいて、溶媒の使用量は、特に限定されないが、温度制御や副反応を抑止するという観点から、カルボキシル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１００質量部が好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボキシル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部〜１０質量部であることがさらに好ましい。工程Ｃにおいて、反応温度は特に限定されないが、通常０℃〜５０℃とすることができる。工程Ｃの反応時間は、特に限定されないが、通常８時間〜９６時間とすることができる。

工程Ｃに用いられる縮合剤としては、例えば、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド等が挙げられる。特に、経済性を考慮すると、縮合剤は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドであることが好ましい。

上記縮合剤の使用量は、カルボキシル基含有ＰＣ化合物に対して、通常１モル当量〜５モル当量とすることができる。工程Ｃにおいて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド硫酸ナトリウムの使用量は、カルボキシル基含有ＰＣ化合物に対して、通常１モル当量〜５モル当量とすることができる。
以上の製造方法により、本発明のＰＣ基含有化合物を効率よく製造することが可能となる。

３．ＰＣ複合体の合成
本発明のホスホリルコリン基含有化合物は、蛋白質、ペプチド、またはアミノ酸のアミノ酸アミン部位と反応させてアミド結合させることにより、各々、ホスホリルコリン−蛋白複合体、ホスホリルコリン−ペプチド複合体、またはホスホリルコリン−アミノ酸複合体を得ることができる。

［ＰＣ−蛋白複合体の合成］
本発明のＰＣ基含有化合物を用いてＰＣ−蛋白複合体を合成する場合、蛋白質としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、トリγグロブリン（ＣＧＧ）、ジフテリアトキソイド、プロテインＤ等を用いることができる。

ＰＣ−蛋白複合体を合成する際の反応温度、反応時間、ｐＨについては、蛋白質が分解や変性を起こさない限り特に限定されない。例えば、大気圧下、緩衝水溶液中で反応を行う場合の反応温度は、通常０℃〜１００℃であり、２０℃〜６０℃であることが好ましい。この場合の反応時間は、通常１秒間〜１週間であり、１時間〜３日間であることが好ましい。また、この場合のｐＨは通常２〜１２であり、５〜９であることが好ましい。

ＰＣ−蛋白複合体の精製には、例えば、透析膜を用いることができる。合成および透析精製に用いる緩衝水溶液としては、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等の生化学分野で使用される緩衝水溶液を用いることができる。緩衝水溶液の塩濃度は、通常０．０００１ｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌであり、０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。

［ＰＣ−ペプチド複合体の合成］
本発明のＰＣ基含有化合物を用いてＰＣ−ペプチド複合体を合成する場合、オリゴペプチドとしては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンから選ばれる任意の組み合わせからなるアミノ酸２個〜１０個が結合したオリゴペプチドを用いることができる。

ＰＣ−ペプチド複合体を合成する際の反応温度、反応時間、ｐＨについては、オリゴペプチドが分解や変性を起こさない限り特に限定されない。例えば、大気圧下、緩衝水溶液中で反応を行う場合の反応温度は、通常０℃〜１００℃であり、２０℃〜６０℃であることが好ましい。この場合の反応時間は、通常１秒間〜１週間であり、１時間〜３日間であることが好ましい。また、この場合のｐＨは通常２〜１２であり、５〜９であることが好ましい。

［ＰＣ−アミノ酸複合体の合成］
本発明のＰＣ基含有化合物を用いてＰＣ−アミノ酸複合体を合成する場合、アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンを用いることができる。
ＰＣ−アミノ酸複合体の合成方法としては、水または緩衝溶液中、縮合剤を用いて結合反応を行う方法が挙げられる。
上記縮合剤としては、特に限定されないが、例えば、水溶性の高いエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩を用いることができる。

ＰＣ−アミノ酸複合体を合成する際の反応温度、反応時間、ｐＨについては、アミノ酸が分解しない限り特に限定されない。例えば、大気圧下、緩衝水溶液中で反応を行う場合の反応温度は、通常０℃〜１００℃であり、２０℃〜６０℃であることが好ましい。この場合の反応時間は、通常１秒間〜１週間であり、１時間〜３日間であることが好ましい。また、この場合のｐＨは通常２〜１２であり、５〜９であることが好ましい。

ＰＣ−アミノ酸複合体は、他のオリゴペプチドや蛋白質と結合させて、ＰＣ−蛋白複合体、またはＰＣ−ペプチド複合体を得るための原料として用いることができる。

以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の範囲に限定されるものではない。なお、例中の各種測定は以下の通り行った。

（１）ＰＣ基含有化合物の分析方法
＜^１Ｈ ＮＭＲ測定＞
日本電子株式会社製、商品名「ＪＮＭ−ＡＬ４００」を用い、溶媒：Ｄ_２Ｏ、標準物質：ＨＯＤ、試料濃度：１０ｍｇ／ｇ、積算回数：３２回の条件で測定を行った。

＜^３１Ｐ ＮＭＲ測定＞
日本電子株式会社製、商品名「ＪＮＭ−ＡＬ４００」を用い、溶媒：Ｄ_２Ｏ、標準物質：Ｈ_３ＰＯ_４、試料濃度：１０ｍｇ／ｇ、積算回数：３２回の条件で測定を行った。

＜質量分析＞
Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名「Ｑ−ｍｉｃｒｏ２６９５」を用い、試料濃度：１００ｐｐｍ、検出モード：ＥＳＩ＋、キャピラリー電圧：３．５４Ｖ、コーン電圧：３０Ｖ、イオン源ヒーター：１２０℃、脱溶媒ガス：３５０℃の条件で測定を行った。

＜高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）＞
カラムに、Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名「Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ ３μｍ ４．６×１００ｍｍ」を用い、流速：０．９ｍＬ／ｍｉｎ、温度：４０℃、試料注入量：１０μＬ、検出波長：２５４ｎｍ、移動相：０．１ｖｏｌ％トリフルオロ酢酸含有蒸留水／０．１ｖｏｌ％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル、グラジエント条件：蒸留水／アセトニトリル＝１００／０（０分），８５／１５（０分〜２０分），８５／１５（２０分〜３０分）の条件で測定を行った。

＜吸光度の測定＞
モレキュラーデバイス社製、商品名「ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３」を用い、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ_４５０）を測定した。

（２）ＰＣ基含有化合物の製造方法および複合体の合成
［実施例ａ１−１］
＜カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物の合成（工程Ａ１、Ａ２）＞
４−ヒドロキシ安息香酸メチル２０ｇにアセトニトリル１６０ｇ、トリエチルアミン１５ｇを加えて溶解させ、０℃に冷却した。その後、ＣＯＰ２１ｇを滴下した。滴下終了後、０℃で５時間反応させ、生成したトリエチルアミン塩酸塩をろ過で除いた。得られたろ液に、アセトニトリル２００ｇとトリメチルアミン１２ｇとを加えた後、７５℃で１５時間反応させた。その後、６０℃まで冷却し、窒素を吹き込みながら溶液量が約２００ｍｌになるまで濃縮した。濃縮後、溶液を２５℃まで冷却し、析出した結晶をろ別、減圧乾燥することにより、反応中間体として式（５）で表される構造を有する４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンを３５．２ｇ（収率８５％）得た。

…（５）

図１は、上記により得られた４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図２は^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図３は、上記により得られた４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。

得られた生成物についての^１Ｈ ＮＭＲ測定、^３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ：δ＝８．０４ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｄ），７．３０ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），４．４１ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｃ），３．９１ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ：ｆ），３．６８ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｂ），３．１８ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ）
^３１Ｐ ＮＭＲ：−４．５９ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３１７．９１，［Ｍ＋Ｎａ］^＋＝３４０．０１

＜加水分解による４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ａ３、ＤＢＵ法）＞
上記により得られた４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリン１０ｇを蒸留水９０ｇに溶解させ、ＤＢＵを５．０ｇ加えて２５℃にて３時間撹拌した。その後、濃塩酸３．６ｇを加えることにより反応液を中和し、エバポレーターで濃縮乾固した。得られた固体をエタノール５０ｇで再結晶することにより、式（６）で表される構造を有する４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの固体を９．０ｇ（収率９４％）得た。

…（６）

図４は、上記により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図５は^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図６は、上記により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。

得られた生成物についての^１Ｈ ＮＭＲ測定、^３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。 ^１Ｈ ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｄ），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｂ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｃ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ）
^３１Ｐ ＮＭＲ：−４．５６ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３０４．１２

［実施例ａ１−２］
＜加水分解による４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ａ３、トリエチルアミン法）＞
上記により得られた４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリン５ｇを蒸留水４５ｇに溶解させ、トリエチルアミンを３．１９ｇ加え、還流下４時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、濃塩酸３．４ｇを加えることにより反応液を中和し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。得られた残留物に、２−プロパノール５０ｇを添加して減圧濃縮する操作を２回行い、さらに２−プロパノール５０ｇを加え、−１０℃で終夜攪拌して結晶を析出させた。溶液を加圧ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥することにより、固体を４．０ｇ得た。

得られた生成物について、^１Ｈ ＮＭＲ測定、^３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析を行い、４−カルボキシフェニルホスホリルコリンであることを確認した（収率８４％）。^１Ｈ ＮＭＲ測定の結果は以下の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）

［実施例ａ１−３］
＜加水分解による４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ａ３、ＮａＯＨ法）＞
上記により得られた４−メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリン１０ｇを蒸留水９０ｇに溶解させ、水酸化ナトリウムを１．２ｇ加え、２５℃にて２時間撹拌した。その後、濃塩酸３．６ｇで反応液を中和し、エバポレーターで濃縮乾固した。得られた固体をカラム精製後、溶媒を留去することにより、固体８．５ｇを得た。

得られた生成物について、^１Ｈ ＮＭＲ測定、^３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析を行い、４−カルボキシフェニルホスホリルコリンであることを確認した（収率８８％）。^１Ｈ ＮＭＲ測定の結果は以下の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）

［実施例ａ１−４］
＜アルキル基含有ＰＣ化合物の合成（工程Ｂ１、Ｂ２）＞
ｐ−クレゾール２０．０ｇに、アセトニトリル１００ｇとジイソプロピルアミン２２．５ｇとを加えて溶解させ、０℃に冷却した。その後、ＣＯＰ３１．６ｇを滴下した。滴下終了後、０℃にて３時間反応させ、生成したジイソプロピルアミン塩酸塩をろ過で除いた。得られたろ液に、アセトニトリル１００ｇとトリメチルアミン１６．４ｇとを加え、７５℃で１５時間反応させた。その後、６０℃まで冷却し、窒素を吹き込みながら溶液量が約２００ｍｌになるまで濃縮し、２５℃まで冷却した。析出した結晶をろ別し、アセトニトリル１００ｇで洗浄後にろ過、減圧乾燥することにより、反応中間体として式（７）で表される構造を有する４−メチルフェニルホスホリルコリンの固体を３２．８ｇ（収率６５％）得た。

…（７）

図７は、上記により得られた４−メチルフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図８は^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図９は、上記により得られた４−メチルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。

得られた生成物についての^１Ｈ ＮＭＲ測定、^３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ：δ＝７．２５ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８：ｂ），７．１１ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３：ｃ），４．３８ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｅ），３．６５ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｄ），３．１６ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ｆ），２．３２ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ：ａ）
^３１Ｐ ＮＭＲ：−３．７０ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝２９６．２３

＜酸化による４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ｂ３、過マンガン酸法）＞
上記により得られた４−メチルフェニルホスホリルコリン５ｇを蒸留水４５ｇに溶解させ、次いで過マンガン酸カリウム６．１ｇを加えた。この溶液を１００℃に加熱し、還流下３時間反応させた。２５℃に冷却後、不溶物をろ別し、得られた溶液に３５％塩酸４ｇを加えた。その後、溶液をエバポレーターにて減圧乾固し、得られた固体をカラム精製後、溶媒を留去することにより４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの固体を４．４ｇ（収率８０％）得た。

図１０は、上記により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図１１は^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図１２は、上記により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。

得られた生成物についての^１Ｈ ＮＭＲ測定、^３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｄ），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｂ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｃ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ）
^３１Ｐ ＮＭＲ：−４．５６ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝３０４．１２，［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋＝３２０．１３

［実施例ａ２−１］
＜ＰＣ−アミノ酸複合体の合成＞
まず、モルホリノエタンスルホン酸水和物（ＭＥＳ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を精製水に溶解し、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液を調製した。次に、実施例ａ１−１にて合成した４−カルボキシフェニルホスホリルコリン５０ｍｇ、フェニルアラニン５０ｍｇおよび縮合剤としてエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２５ｍｇを０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液１０ｍＬに溶解させ、２５℃にて２４時間撹拌することにより、式（８）で表される構造を有するＰＣ−フェニルアラニン複合体を得た。

…（８）

図１３は、上記ＰＣ−アミノ酸複合体の合成における、２４時間攪拌前（反応前）の溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを表しており、図１４は、２４時間攪拌後（反応後）の溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを表している。図１３，１４の比較から、４−カルボキシフェニルホスホリルコリンのピークが消失し、新たなピークが出現することを確認した。図１５は、上記により得られた生成物のＭＳスペクトルを表している。図１５から、ＰＣ−フェニルアラニン複合体の分子量に相当するピーク（［Ｍ＋Ｈ］^＋＝４５１．１６，［Ｍ＋Ｎａ］^＋＝４７３．１３）が得られたことから、生成物がＰＣ−フェニルアラニン複合体であることを確認した。

［実施例ａ２−２］
＜ＰＣ−蛋白複合体の合成＞
実施例ａ１−１にて得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリン４ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）４ｍｇおよび縮合剤としてエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業株式会社）２ｍｇを０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液１．６ｍＬに溶解させた。この溶液を、２５℃にて２時間攪拌した後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４℃で透析精製を行うことにより、ＰＣ−蛋白複合体（ＰＣ−ＢＳＡ）を得た。

［実施例ｂ１］
＜４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの合成（工程Ｃ）＞
実施例ａ１−１にて得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリン５．０ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド３．０ｇとを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５ｇに懸濁させた。この溶液を２５℃に保ち、１０ｇのＤＭＦに溶解させた１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド６．８ｇを加え、２５℃にて７２時間反応させた。反応後、溶液をろ過して固体を回収し、アセトニトリル１６０ｇで再結晶することにより、減圧乾燥後に式（９）で表される構造を有する４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルを４．５ｇ（収率６８％）得た。

…（９）

図１６は、上記により得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図１７は３１Ｐ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ示している。また、図１８は、４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルのＭＳスペクトルを示している。

得られた生成物についての１Ｈ ＮＭＲ測定、３１Ｐ ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ：δ＝８．２３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），７．４２ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３：ｄ），４．４５ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｂ），３．７２ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｃ），３．２２ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ），３．０４ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ：ｆ）
３１Ｐ ＮＭＲ：−４．９６ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４００．９９、［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４２３．０３

［実施例ｂ２］
＜ＰＣ−蛋白複合体の合成＞
実施例ｂ１にて得られた４−カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジル２０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）８ｍｇおよび炭酸水素ナトリウム８ｍｇを蒸留水２ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃、２４時間攪拌した後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４℃で透析精製を行うことにより、ＰＣ−蛋白複合体（ＰＣ−ＢＳＡ）を得た。

（３）ＰＣ基含有化合物の評価
＜検体の調製＞
年齢２０歳台〜４０歳台の健常な被験者５名から唾液を採取し、１０％ブロックエース（大日本住友製薬製）を用いて１６倍に希釈した溶液を検体とした。

＜抗ＰＣ抗体の測定＞
まず、カーボネート／バイカーボネート緩衝溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、上記実施例ａ２−２、ｂ２にてそれぞれ得られたＰＣ−ＢＳＡまたはＢＳＡを溶解させ、濃度５μＬ／ｍＬに調整した。これらの溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ダイナテック社製）に５０μＬ／ウェル分注し、４℃にて１６時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄した後、２５％ブロックエースを２００μＬ／ウェル分注し、３６℃にて１時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、検体を５０μＬ／ウェル注入し、２５℃にて１時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）２０００倍希釈品を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃にて１時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、ＨＲＰ基質液を１００μＬ／ウェル分注し、２５℃にて１５分間反応した。１５分後、希硫酸を１００μＬ／ウェル添加して反応を停止した後、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ_４５０）を測定した。

＜抗ＰＣ抗体価の算出方法＞
ＰＣ−ＢＳＡを吸着させたプレートから得られた吸光度（ａｎｔｉ−ＰＣ−ＢＳＡ（ＯＤ_４５０））と、陰性対象としてＢＳＡを吸着させたプレートから得られた吸光度（ａｎｔｉ−ＢＳＡ（ＯＤ_４５０））との差分（ａｎｔｉ−ＰＣ（ＯＤ_４５０））を式（１０）により算出した。測定毎に検量線を作成し、求めたａｎｔｉ−ＰＣ（ＯＤ_４５０）の値から各検体の抗ＰＣ抗体価（μｇ等量／ｍＬ）を算出した。
ａｎｔｉ−ＰＣ（ＯＤ_４５０）＝ａｎｔｉ−ＰＣ−ＢＳＡ（ＯＤ_４５０）−ａｎｔｉ−ＢＳＡ（ＯＤ_４５０）
…（１０）

＜測定結果＞
表１は、Ｘが水素原子または１価のカチオン残基であるＰＣ基含有化合物に係るＰＣ−ＢＳＡ（実施例ａ２−２）の抗ＰＣ抗体価の測定結果を示している。

表２は、Ｘがヒドロキシスクシンイミド基であるＰＣ基含有化合物に係るＰＣ−ＢＳＡ（実施例ｂ２）の抗ＰＣ抗体価の測定結果を示している。

表１、２より、いずれの被験者においても抗ＰＣ抗体価が確認された。このことから、本試験に用いたＰＣ−ＢＳＡはＰＣ抗原としての機能を示すことが明らかになった。以上の結果により、本発明のＰＣ基含有化合物を用いたＰＣ−蛋白複合体は、ＰＣ−蛋白質間の架橋反応が起こらないため、ＰＣ抗原としての利用に適した、水に可溶なＰＣ−蛋白複合体となっていることが明らかになった。

（４）比較例
［比較例ａ１］
比較例ａ１は、本発明のＸが水素原子または１価のカチオン残基であるＰＣ基含有化合物の比較例である。
国際公開第２００４／０７４２９８号明細書に記載の方法に従い、式（１１）で表される構造を有する化合物を合成した。得られた式（１１）で表される構造を有する化合物４ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）４ｍｇおよび縮合剤としてエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業社製）２ｍｇを０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝溶液１．６ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃で攪拌し、ＰＣ−蛋白複合体の合成を試みたが、生成物はゲル状であり、抗ＰＣ抗体価の測定に用いる０．１Ｍ，ＭＥＳ緩衝溶液に溶解させることができなかった。

…（１１）

［比較例ｂ１］
比較例ｂ１は、本発明のＸがヒドロキシスクシンイミド基であるＰＣ基含有化合物の比較例である。
国際公開第２００４／０７４２９８号明細書に記載の方法に従い、式（１１）で表される構造を有する化合物を合成した。得られた式（１１）で表される構造を有する化合物２０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）８ｍｇおよび炭酸水素ナトリウム８ｍｇを蒸留水２ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃、２４時間攪拌したが、生成物はゲル状であり、抗ＰＣ抗体価の測定に用いる０．１Ｍ，ＭＥＳ緩衝溶液に溶解させることができなかった。

［比較例ｂ２］
比較例ｂ２は、本発明のＸがヒドロキシスクシンイミド基であるＰＣ基含有化合物の比較例である。
国際公開第２００４／０７４２９８号明細書に記載の方法に従い、式（１１）で表される構造を有する化合物を合成した。得られた式（１１）で表される構造を有する化合物５．０ｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド６．０ｇとを、ＤＭＦ３５．０ｇに加えた。この溶液を２５℃に保ち、２０ｇのＤＭＦに溶解させた１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド１３．６ｇを加え、２５℃にて７２時間反応させた。反応後、溶液をろ過して固体を回収し、アセトニトリルで再結晶を行うことにより、減圧乾燥後に式（１２）で表される構造を有する化合物を４．４ｇ（収率５６％）得た。

…（１２）

得られた式（１２）で表される構造を有する化合物２０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）８ｍｇおよび炭酸水素ナトリウム８ｍｇを蒸留水２ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃、２４時間攪拌したが、生成物はゲル状であり、抗ＰＣ抗体価の測定に用いる０．１Ｍ，ＭＥＳ緩衝溶液に溶解させることができなかった。

式（１）で表される構造を有するカルボキシル基およびＰＣ基をそれぞれ１つずつ含む構造を有する芳香族化合物は、ＰＣ−蛋白複合体を得るための原料として、有効に利用することができる。また、得られたＰＣ−蛋白複合体、ＰＣ−ペプチド複合体、またはＰＣ−アミノ酸複合体は、ＰＣ抗原またはＰＣ抗原製造用の原料として利用することができる。さらに、得られたＰＣ抗原は、ＰＣ抗体を含む医薬品の製造において、ＰＣ抗体産生用原料として有効に利用することができる。

Claims (4)

1. 下記の式（１）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物。
   

   

   …（１）
   （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくは式（２）で表される構造を示す。）
   

   

   …（２）
   （Ｙは水素原子またはＳＯ_３Ｎａを示す。）
2. 下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン−蛋白複合体。
   

   

   …（１'）
   （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
3. 下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、オリゴペプチドのアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン−ペプチド複合体。
   

   

   …（１'）
   （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
4. 下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、アミノ酸のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン−アミノ酸複合体。
   

   

   …（１'）
   （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）

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