JP6498115B2 - 下痢性病原体の存在を検出するための方法 - Google Patents
下痢性病原体の存在を検出するための方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、患者サンプル、食品サンプルまたは環境サンプルから下痢性病原体を検出する方法に関する。特に本発明は、下痢性病原体、特にＥＴＥＣおよびカンピロバクター属を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ法を提供する。更に本発明は、本発明の方法に用いるための材料となる、プライマー、プライマーペアおよびプローブ等も提供する。好ましくは、本発明の方法は、旅行者下痢に関連した臨床上重要な病原体の迅速な検出を実施するためのマルチプレックスリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイである。
下痢は、罹病を伴う、世界的に主要な健康問題であり、特に発展途上国の幼児にとっては致死的な症状となる。下痢は旅行者の直面する最も報告例の多い問題であり、汚染された食品や水によって発症することが一般的である。大部分の症例において、旅行者下痢は軽いものであり、期間も短いが、腹痛、血性下痢および敗血症を伴う重篤な感染症も存在する。
旅行者の急性下痢の原因は多様且つ多岐にわたる。古典的な下痢性細菌、例えば、Salmonella（サルモネラ）、Campylobacter（カンピロバクター）、Shigella（シゲラ）およびYersinia（エルシニア）や、下痢性大腸菌（E. coli）株、が旅行者下痢と関連づけられている（腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸内毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管接着性微絨毛消滅性（attaching and effacing）大腸菌（Ａ／ＥＥＣ）または腸管凝集性大腸菌（ＥＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、ベロ毒素産生性大腸菌（ＶＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管侵襲性大腸菌（ＥＩＥＣ））。Salmonella による感染は、軽度の潜在性感染症に始まり、重篤な全身性感染症である腸チフスへと移行する多様な臨床疾患を生じ得る。Salmonella sp は、ＩＩＩ型分泌系を用いて結腸上皮細胞、特にＭ細胞から宿主を侵襲する。この細菌はマクロファージの食胞内でも生き延びることが可能であり、いくつかの方法によって宿主の免疫機構を回避する（Coburn et al., 2007）。Campylobacter jejuni（カンピロバクター ジェジュニ）と Campylobacter coli（カンピロバクター コリ）は、大きな Campylobacter ファミリーの中でも、ヒト糞便に存在する主要な病原体であり、水様性下痢、発熱および典型的には重度の腹痛を発症させる。診断的な観点からは、これら細菌を下痢との関連のない他の Campylobacter 属と切り離すことが必須である。下痢性のカンピロバクターは結腸内壁の上皮細胞を侵襲し、細胞内で複製し、アポトーシスを起こすことができる（Poly and Guerry, 2008、Allos, 2001）。Yersinia enterocolitica（エンテロコリチカ菌）および Yersinia pseudotuberculosis（仮性結核菌）は、YadA 等の関連した接着性および侵襲性タンパク質を含有する病原性プラスミドを内包する（Bottone, 1999、El Tahir et al., 2001）。Y. enterocolitica の場合、臨床的疾患を発症させるためには病原性プラスミドが必要であるが、一方、Y. pseudotuberculosis の場合は、他にもゲノム内に病原性因子を有している。Yersinia pestis（ペスト菌）はペストの病原体であり、ゲノム上に病原性因子を有するだけでなく、臨床的疾患を発症させるために必要な３つの病原性プラスミドも有している（Bottone, 1999）。これらの伝統的な病原体は、反応性関節炎、仙腸骨炎および急性前部ブドウ膜炎などの後期に見られる症状とも関連づけられている。
Vibrio cholerae（コレラ菌）は、いくつかの熱帯諸国の自由水に生息する、強毒性の環境性病原体であり、特に災害地域で流行性の疾患を生じる。典型的には、多量の水様性下痢を起こし、十分な蘇生処置が行われない場合には、患者は死亡することとなる。必須病原性因子は、２つのサブユニットＡおよびＢからなるコレラ毒素である。コレラ毒素は、液体および電解質の取り込みを司る結腸上皮細胞内のＧタンパク質に不可逆的に結合し、腸管内腔への制御不能な連続的な分泌を生じる（Nelson et al., 2009）。
Shigella およびＥＩＥＣは遺伝的に近縁である。いずれの生物も、例えば、Ipa タンパク質とその転写調節因子である invE をコードする病原性プラスミド pINV 内に局在する遺伝子を介して結腸上皮を侵襲する（Lan and Reeves, 2002、Parsot, 2005）。ＥＡＥＣは、プラスミド上に存在し、AggR によって調節される遺伝子のコードする特定の線毛を介して、Hep-2 細胞に対して特徴的な接着パターンを示す（Flores and Okhuysen, 2009）。ＥＰＥＣは、腸細胞消滅遺伝子座（ＬＥＥ）と呼ばれる病原性アイランドを保有するものとして特徴付けられている。このアイランドには、ＥＰＥＣ株の腸内上皮細胞への密接な付着に必要な eae 等の遺伝子が含まれる。ＥＰＥＣは、その stx1 遺伝子および stx2 遺伝子のコードするシガ様毒素ＩおよびＩＩを産生する能力によって、ＥＨＥＣから区別することができる。これらの毒素は急性の炎症を腸内で起こし、腹痛および血性下痢を生じる。更にＥＨＥＣ感染は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）などの、まれではあるが重篤な二次感染症を起こす場合もある（Chen and Frankel, 2005、Karch et al., 2005）。上記細菌における毒素発現標的遺伝子は非常に類似性が高いため、マルチプレックスＰＣＲアッセイにおける課題は、シゲラ属／ＥＩＥＣ属との交差反応の起きない条件でＥＨＥＣ変異体を同定することである。
ジアルジア症は、鞭毛を有する原生動物であるランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）（G. intestinalis とも呼ばれる）に起因する小腸の感染である。ジアルジア症は世界で最も一般的な病原性原虫疾患である。旅行者、特に発展途上国への旅行者は、ジアルジア感染についての最大のリスクグループである。ジアルジア症は糞口経路で伝播する。この疾患の感染原因の大半は、汚染された水や食物を摂取することや、Giardia 嚢子に汚染された物体に触れた後に手洗いしないことによるものである。ジアルジア症の有病率は、先進国においては２〜７％であり、ほとんどの発展途上国においては２０〜３０％である。ＣＤＣの推定によると、ジアルジア症の発生数は年間２５０万件を超える。Giardia 感染の最も一般的な症状は、１０日を超える期間の下痢、腹痛、消化管内のガス貯留、腹部膨満、嘔吐、および体重減少などである。従来、ジアルジア症の診断は、糞便中の嚢子または栄養型の検出、小腸中の栄養型の検出、あるいは糞便中の Giardia 抗原の検出により行われる。
現在、下痢のルーチン診断は、ほとんどの場合、伝統的な培養法や免疫学的検定法に基づいており、これらはいずれも、労力と時間がかかる。これらの診断方法は、Salmonella、Campylobacter、Shigella および Yersinia、および腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）にしか用いることができず、主な下痢性大腸菌属（ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣおよびＥＩＥＣを含む）のための培養法は存在しない。近年、ＤＮＡに基づく、下痢性大腸菌の診断方法が公開された（Antikainen et al., 2009、Aranda et al., 2004、Brandal et al., 2007、Guion et al., 2008、Kimata et al., 2005、Muller et al., 2007、Vidal et al., 2005、Vidal et al., 2004）。
ＥＴＥＣは、熱不安定性（ＬＴ）の腸管毒および／または熱安定性（ＳＴ）の腸管毒を産生することにより水様性下痢を発症させる［２と３］。ＥＴＥＣは従来、旅行者下痢の最も一般的な原因であると考えられている（Qadri et al., 2005）。本発明は、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイにおけるＥＴＥＣの検出向上を特に意図するものである。本発明は、est 遺伝子がコードするＥＴＥＣの熱安定性腸管毒に特異的な２つのプライマーペアとプローブ、および elt 遺伝子がコードするＥＴＥＣの熱不安定性腸管毒に特異的な１つのプライマーペアとプローブを提供する。これらのプライマーとプローブは、ＥＴＥＣのグローバル変異体（global variant）の効率的検出を可能にするような該遺伝子中の標的配列を増幅するように設計されている。更なる問題は、標的遺伝子である est が複数の反復配列を含むことと、プライマーとプローブの両方のために十分な長さをもつ保存領域を見出すことが難しかったことである。
本発明の更なる目的は、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける下痢性のCampylobacter 属の検出の向上である。本発明は、C. jejuni の rimM 遺伝子と C. coli の gyrB 遺伝子のためのプライマーペアとプローブを提供する。これらのプライマーとプローブを用いることにより、下痢性の Campylobacter を、他の非病原性 Campylobacter および他の下痢性病原体から識別することができる。この問題を解決するために、２つの異なるゲノム標的を組み合わせることが必要であった。
国際公開第 WO2005/005659 号においては、下痢性細菌（例えば、以下の大腸菌群：ＥＴＥＣ（腸内毒素原性大腸菌）、Ａ／ＥＥＣ（腸管接着性微絨毛消滅性大腸菌）、ＥＰＥＣ（腸管病原性大腸菌）、ＶＴＥＣ（ベロ毒素産生性大腸菌）、ＥＩＥＣ（腸管侵襲性大腸菌）、および Shigella spp）を同時にスクリーニングする方法が開示される。この方法は、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲアッセイであり、テンプレートＤＮＡは糞便サンプルから直接単離する。本発明と同様に、国際公開第 WO2005/005659 号も、病原性大腸菌群と他の下痢性病原体とを互いに区別するためにヒト病原性大腸菌をスクリーニングする問題に向けられている。しかし、本発明において用いるＥＴＥＣの est 遺伝子と elt 遺伝子における標的配列は、国際公開第 WO2005/005659 号において開示される標的とは異なる。更に、本発明は、３種類の特定のプライマーペアとプローブを用いてグローバルＥＴＥＣ変異体をカバーするものであるが、一方、国際公開第 WO2005/005659 号の表３においては、同じ目的で４種類のプライマーペアが開示されている。本願明細書の表８は、本発明の３種類のプライマーペアを用いることでＥＴＥＣ変異体を検出できることを示す。
国際公開第 WO2005/083122 号においては、糞便サンプル中の腸管病原性細菌（例えば、Shigella 属、Salmonella 属、Campylobacter 属、腸管出血性大腸菌、ベロ毒素産生性大腸菌、Vibrio cholerae、および Clostridium perfringens（ウェルシュ菌））の検出と定量のための方法が開示されている。この方法は、TaqMan（登録商標）プローブに基づくリアルタイムＰＣＲアッセイである。
国際公開第 WO2007/056463 号においては、複数の病原体特異的なプライマーペアを用いてサンプルを増幅して、病原体特異的なプライマーペアのそれぞれから異なるサイズのアンプリコンを生成することを含む方法が開示されている。この方法は、リアルタイムとマルチプレックスのＰＣＲ技術を用いる。この方法を Salmonella 属、Campylobacter 属、下痢性大腸菌、Vibrio cholerae、Yersinia属（Yersinia pestisなど）、およびGiardia lamblia の検出に用いることができる。
国際公開第 WO2005/090596 号においては、微生物、特に細菌を検出するためのアッセイが開示されており、このアッセイは、ヒトサンプル、動物サンプル、または環境サンプルからの細菌ＤＮＡのマルチジェノタイプ試験に基づいている。この方法は、TaqMan（登録商標）プローブを用いるリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ技術としても用いることができる。この方法をSalmonella 属、Campylobacter 属、下痢性大腸菌、Vibrio cholerae、Yersinia 属（Yersinia pestis など）の検出に用いることができる。
米国特許出願公開第 US2004/0248148 号においては、大腸菌群、大腸菌、毒素原性大腸菌 O157:H7、毒素原性 M. aeruginosa（ミクロシスチン肝臓毒素）、Giardia lamblia、および Cryptosporidium parvum（クリプトスポリジウム パルバム）の定量化のための５'ヌクレアーゼ リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を開示している。マルチプレックスＰＣＲアッセイを、２種類以上の病原体の同時検出に用いることもできる。
国際公開第 WO02/070728 号においては、「マルチプローブ」設計に基づくアッセイが開示されており、「マルチプローブ」設計においては、16S rRNA 遺伝子がコードする高度に保存された配列の単一のセットがプライマーペアの役割を果たし、それを、内部の高度に保存された配列、ユニバーサルプローブ、および内部可変領域である種特異的プローブと組み合わせて用いる。このリアルタイムシステムは１４種類の一般的な細菌種を信頼性よく同定できる。
中国特許出願公開 CN101113471 号、中国特許出願公開 CN101245384 号、および中国特許出願公開 CN101235410 号は、食品サンプルから下痢性病原体を迅速に検出するためのＰＣＲ法を開示している。
中国特許出願公開 CN101113471 号、中国特許出願公開 CN101245384 号、および中国特許出願公開 CN101235410 号は、食品サンプルから下痢性病原体を迅速に検出するためのＰＣＲ法を開示している。
Fukushima et al., 2003 は、１７種類の食品媒介性または水媒介性病原体を糞便サンプルから直接的に検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイを開示している。検出レベルは、糞便１グラム当たり約１０５個の病原性細菌であり、したがって、糞便１グラム当たり１０４個未満の病原性細菌が存在する糞便サンプルの場合についてのプロトコルでは、適当な感度を得るためには一晩の集積培養工程が要求されている。
Hidaka et al., 2009 は、下痢性大腸菌の網羅的検出のためのマルチプレックスリアルタイムＰＣＲを開示している。この方法は、食品サンプル、例えば肉サンプルからの病原性細菌の検出を特に意図したものである。
Wang et al., 1997 は、１３種類の食品媒介性病原体を食物からＰＣＲ検出するためのプロトコルを開示している。
マルチプレックスＰＣＲに基づく下痢性病原体検出用キットがいくつか市販されている（例えば、Luminex 社製の xTAP GPP や、Seegene 社製の Diarrhea ACE Detection）。いずれのシステムも、特定の生物特異的ヌクレオチド配列を増幅するための手段としてマルチプレックスＰＣＲを用いているが、最終的な検出は別の装置での解析に依存するものである。検出方式によって要求項目が異なるので、検出に用いられる手段は、アンプリコン、プライマーおよびプローブに影響する。更に、本発明でＥＴＥＣや Campylobacter の検出に用いられる遺伝子またはアンプリコンの配列は、従来開示されていない。
下痢を発症させる病原体の数は多く、下痢試験はその全てを同定できることが最適である。試験に付すサンプルの数は一般的に多いので、病原体の種類ごとにＰＣＲ反応を行うのは煩雑となり得る。１回の反応で複数種を検出できることが最適である。ＰＣＲの設定においては、「マルチプレックス」ＰＣＲ増幅とするのが望ましいのは明らかである。マルチプレックスＰＣＲにおいては、それぞれ１つの種または１つの種集団を増幅するために設計されたいくつかのオリゴヌクレオチドのセットが同一の反応容器に含まれ、各オリゴヌクレオチドセットが、同一のＰＣＲ反応中に、それぞれ対応する病原体ＤＮＡを増幅するために用いられる。本発明においては、旅行者下痢に関連した臨床上重要な病原体（特にＥＴＥＣおよび／または Campylobacter）の迅速な検出のための、ＰＣＲに基づく方法を説明する。本発明は、ＥＴＥＣと Campylobacter のグローバル変異体に保存されている標的配列のために設計されたプライマーとプローブを開示する。これらの標的部位はＥＴＥＣや Campylobacter に特有のものなので、これらのプライマーとプローブは、複数の下痢性病原体の存在を検出するためのいかなるマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲにも用いることができる。
マルチプレックスＰＣＲには、病原体ＤＮＡの定量に関する課題が存在する。すなわち、異なるアンプリコンが同じＰＣＲ反応成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼやMgCl2）について競合し、このために、反応の定量性が損なわれ得ること、特にサンプル間の定量的比較が損なわれ得ることである。量や長さが異なるテンプレート同士の間には増幅効率の偏りがあり、例えば、短いアンプリコンはより長いアンプリコンよりも優先されることは当業界では周知である。
同時に、マルチプレックスセットのオリゴヌクレオチドの組み合わせの、望ましくない交差反応も避けなければならない。また、サンプル中の他の配列へのミスプライミングのチェックも忘れずに行う必要がある。
多様な病原性微生物からなる集団を検出するために好適なプライマーとプローブの配列を見出すことは、全てのアンプリコンとテンプレートが同等の効率で増幅されるべきマルチプレックスの設定を設計する際には、決して容易ではない（例えば、ジアルジア）。微生物種の多くが比較的に近縁同士であるため、個々の種に特有の配列を特定することは難題である。また、グローバル変異体の数は相当に多いので、グローバル変異体において保存されている領域、または既知の全ての変異体を検出するための領域の最小集合における組み合わせを同定するのは、難しい（例えば、ＥＨＥＣ、ＥＴＥＣ、病原性エルシニア、病原性カンピロバクター、およびシゲラ／ＥＩＥＣに関して）。互いに密接に関連する反復配列を有する遺伝子もあり、これは、アンプリコンを設計する観点、特にマルチプレックスＰＣＲのアンプリコンを設計する観点からは難題である。例えば、反復配列と少数派変異体の存在により、ＥＴＥＣは単一のアンプリコンでは検出できない。
下痢の診断におけるサンプルマトリックスは一般に糞便サンプルまたは食品サンプルであるが、このようなサンプルマトリックスは数多くのＰＣＲ阻害剤を含有する可能性が高い。それによりＰＣＲ反応の増幅効率が低下するので、アンプリコン設計段階から、更に注意深い最適化を行い、全てのテンプレートとコピー数が均等に且つ充分効率的に増幅されることを確認することが期待される。従って、高いＰＣＲ効率（できる限り１００％に近いことが最適である）を可能にするオリゴヌクレオチド設計が必要である。用いられる検出方法も増幅効率および／または増幅の偏りに影響を与える。
本発明者らは、下痢性病原体（特にＥＴＥＣとカンピロバクター）を特異的且つ高感度に増幅および定量するのに好適なＤＮＡ配列領域を見出した。これにより、本発明では最適なプライマーおよび定量的ＰＣＲプローブを設計し、下痢性病原体の同定と定量が可能であることを確認した。アンプリコンは、どんなマルチプレックスセットにおいても互いに組み合わせ可能である特異性を持つように設計した。当然、その前提条件として、開示する全てのアンプリコンはまた、同じ反応およびサイクル条件において増幅するように設計した。
発明の詳細な説明
本発明は、下痢性病原体、特にＥＴＥＣおよびカンピロバクター属を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ法を提供する。更に本発明は、本発明の方法に用いるための材料となる、プライマー、プライマーペアおよびプローブ等も提供する。
本発明は、下痢性病原体、特にＥＴＥＣおよびカンピロバクター属を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ法を提供する。更に本発明は、本発明の方法に用いるための材料となる、プライマー、プライマーペアおよびプローブ等も提供する。
特に本発明は、生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
ｉ）サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、配列番号５５〜７２、好ましくは配列番号６１〜６３と配列番号６５〜６８で定義されるアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅するものであり、
ｉｉ）上記工程ｉ）で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
ｉｉｉ）反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法を提供する。
ｉ）サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、配列番号５５〜７２、好ましくは配列番号６１〜６３と配列番号６５〜６８で定義されるアンプリコンのそれぞれを少なくとも部分的に増幅するものであり、
ｉｉ）上記工程ｉ）で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
ｉｉｉ）反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法を提供する。
該生物学的サンプルは、糞便サンプル、食品サンプル（例えば肉サンプル）、あるいは環境サンプルであり得る。
本発明の方法の工程ｉ）におけるプライマーペアは、好ましくは、以下のプライマーペアＡ）〜Ｒ）、より好ましくは以下のプライマーペアＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ）、からなる群より選ばれ、以下のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を包含するか、または少なくとも１種からなる：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１）,
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３）,
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）。
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１）,
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３）,
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）。
標的生物における増幅した好ましいアンプリコンを表６に示す。しかし、当業者は、これらのアンプリコンは関連株においては当然に変異していることを知っている。この小さな変異は、本発明の方法において該アンプリコンを増幅するのに好適なプライマーを設計する際に考慮することができる。好ましくは、配列番号５５〜７２、好ましくは配列番号６１〜６３と配列番号６５〜６８、からなる群より選ばれる標的アンプリコンのそれぞれの少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個または少なくとも３５個の長さのヌクレオチド配列を本発明の方法において増幅する。
本発明の方法の特徴の１つは、工程ｉｉｉ）において、ＰＣＲ反応におけるプライマーペアＡ）〜Ｒ）のそれぞれの産物である増幅された標的配列の存在が、以下の基準に基づく、サンプル中の下痢性病原体の存在の指標となることである。
− プライマーペアＡ）またはＢ）の産物は、ＥＨＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＣ）の産物は、ＥＨＥＣ／ＥＰＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＤ）の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアＥ）またはＦ）の産物は、Shigella／ＥＩＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＧ），Ｈ）またはＩ）の産物は、ＥＴＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＪ）の産物は、ＥＡＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＫ）の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアＬ）の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアＭ）の産物は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアＮ）の産物は、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアＯ）の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアＰ）の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアＱ）の産物は、Entamoeba histolytica（赤痢アメーバ）の存在の指標となり、そして
− プライマーペアＲ）の産物は、Cryptosporidium sp の存在の指標となる。
− プライマーペアＡ）またはＢ）の産物は、ＥＨＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＣ）の産物は、ＥＨＥＣ／ＥＰＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＤ）の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアＥ）またはＦ）の産物は、Shigella／ＥＩＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＧ），Ｈ）またはＩ）の産物は、ＥＴＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＪ）の産物は、ＥＡＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＫ）の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアＬ）の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアＭ）の産物は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアＮ）の産物は、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアＯ）の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアＰ）の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアＱ）の産物は、Entamoeba histolytica（赤痢アメーバ）の存在の指標となり、そして
− プライマーペアＲ）の産物は、Cryptosporidium sp の存在の指標となる。
好ましくは、該プライマーペアの各プライマーの長さが３５ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、または５５ヌクレオチド未満であり、より好ましくは５０ヌクレオチド未満である。本発明のプライマーのそれぞれは、配列番号１〜３６からなる群より選ばれる1種のプライマー配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるものであると定義することもできる。
本発明の１つの特定の態様においては、本発明の方法をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で行い、この場合は、プライマーペアＡ）〜Ｒ）（好ましくはＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ））のそれぞれとと共に、以下の配列を包含するか以下の配列からなる特定の核酸プローブを使用する。
− プライマーペアＡ）のためのプローブ：
5'-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3'（配列番号３７）
− プライマーペアＢ）のためのプローブ：
5'-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3'（配列番号３８）
− プライマーペアＣ）のためのプローブ：
5'-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3'（配列番号３９）
− プライマーペアＤ）のためのプローブ：
5'-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3'（配列番号４０）
− プライマーペアＥ）のためのプローブ：
5'-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3'（配列番号４１）
− プライマーペアＦ）のためのプローブ：
5'-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3'（配列番号４２）
− プライマーペアＧ）のためのプローブ：
5'-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3'（配列番号４３）
− プライマーペアＨ）のためのプローブ：
5'-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3'（配列番号４４）
− プライマーペアＩ）のためのプローブ：
5'-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3'（配列番号４５）
− プライマーペアＪ）のためのプローブ：
5'-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3'（配列番号４６）
− プライマーペアＫ）のためのプローブ：
5'-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3'（配列番号４７）
− プライマーペアＬ）のためのプローブ：
5'-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3'（配列番号４８）
− プライマーペアＭ）のためのプローブ：
5'-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3'（配列番号４９）
− プライマーペアＮ）のためのプローブ：
5'-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3'（配列番号５０）
− プライマーペアＯ）のためのプローブ：
5'-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3'（配列番号５１）
− プライマーペアＰ）のためのプローブ：
5'-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3'（配列番号５２）
− プライマーペアＱ）のためのプローブ：
5'-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3'（配列番号５３）
− プライマーペアＲ）のためのプローブ：
5'-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3'（配列番号５４）
− プライマーペアＡ）のためのプローブ：
5'-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3'（配列番号３７）
− プライマーペアＢ）のためのプローブ：
5'-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3'（配列番号３８）
− プライマーペアＣ）のためのプローブ：
5'-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3'（配列番号３９）
− プライマーペアＤ）のためのプローブ：
5'-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3'（配列番号４０）
− プライマーペアＥ）のためのプローブ：
5'-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3'（配列番号４１）
− プライマーペアＦ）のためのプローブ：
5'-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3'（配列番号４２）
− プライマーペアＧ）のためのプローブ：
5'-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3'（配列番号４３）
− プライマーペアＨ）のためのプローブ：
5'-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3'（配列番号４４）
− プライマーペアＩ）のためのプローブ：
5'-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3'（配列番号４５）
− プライマーペアＪ）のためのプローブ：
5'-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3'（配列番号４６）
− プライマーペアＫ）のためのプローブ：
5'-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3'（配列番号４７）
− プライマーペアＬ）のためのプローブ：
5'-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3'（配列番号４８）
− プライマーペアＭ）のためのプローブ：
5'-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3'（配列番号４９）
− プライマーペアＮ）のためのプローブ：
5'-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3'（配列番号５０）
− プライマーペアＯ）のためのプローブ：
5'-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3'（配列番号５１）
− プライマーペアＰ）のためのプローブ：
5'-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3'（配列番号５２）
− プライマーペアＱ）のためのプローブ：
5'-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3'（配列番号５３）
− プライマーペアＲ）のためのプローブ：
5'-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3'（配列番号５４）
上記のうちいくつかのプローブ（例えばプライマーペアＧ）、Ｈ）、Ｋ）およびＬ）のためのプローブ）の融解温度（Ｔｍ）は、修飾ヌクレオチドを加えることにより少なくとも５℃上昇させることが好ましい。１つのプローブにおける修飾ヌクレオチドの量は、１個、２個、３個、または好ましくは４個である。上記配列において、下線を引いたヌクレオチドは、プローブの融解温度（Ｔｍ）を上昇させる修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド（Exiqon A/S）、マイナーグルーブバインダー（MGB（登録商標））、SuperBase、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいはプローブの融解温度（Ｔｍ）を上昇させる他の修飾物である。
好ましくは、プローブは上記配列を包含し、その長さが４０ヌクレオチド未満、４５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、または５５ヌクレオチド未満であり、より好ましくは５０ヌクレオチド未満である。本発明のプローブのそれぞれは、配列番号３７〜５４からなる群より選ばれる1種のプローブ配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるものであると定義することもできる。
本発明の方法は、プライマーペアを個別のＰＣＲ反応に分けるマルチプレックスＰＣＲ技術に基づく。一般的な指標としては、マルチプレックスアッセイは、最も頻繁に現れる病原体（例えば、Antikainen et al, 2009）がそれぞれ別のＰＣＲ反応に含まれるように設計するべきである。
本発明の１つの態様において提供されるヌクレオチドプライマーは、上記プライマーペアＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ）からなる群より選ばれるプライマー配列の少なくとも１種を包含するか、または少なくとも１種からなる。
本発明の他の１つの態様において提供されるヌクレオチドプライマーペアは、上記プライマーペアＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ）からなる群より選ばれる配列の少なくとも１種を包含するか、または少なくとも１種からなる。
本発明の更なる１つの態様において提供されるヌクレオチドプローブは、上記プローブ配列の少なくとも１種を包含するか、または少なくとも１種からなる。
本発明は、好ましくは、サンプル中の下痢性病原体の存在を検出する方法に関するものであり、少なくともＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の、サンプル中の存在の有無を確認する方法に関するものである。更なる標的病原体は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis、および、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis であり得る。
本発明は更に、上記のヌクレオチドプライマー、プライマーペア、またはプローブの、サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための使用に関する。
本発明はまた、サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するためのキットに関する。そのようなキットは、上記プライマーペアＡ）〜Ｒ）（好ましくはＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ））からなる群より選ばれるプライマーペアを含む。そのようなキットは、上記のプローブから選ばれるプローブを含んでもよい。プライマーペアとプローブの使用は、上記してあり、また、以下の実施例にも記載してある。好ましくは、そのようなキットは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法のための手段、例えば、標識プローブ、ポリメラーゼ酵素、バッファーおよびヌクレオチドを含む。好ましくは、そのようなキットは、少なくともＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の、サンプル中の存在を検出するためのものである。
本明細書において、本発明の背景説明や、特に、本発明の実施についての詳細を追加するために引用される文献やその他の資料は、引用により本明細書に組み込まれるものである。本発明を以下の実施例において更に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
材料と方法
患者サンプル 対照用の糞便サンプルを、標準的な生化学的方法によって、Salmonella、Yersinia、Shigella、Campylobacter および ＥＨＥＣ についてＨＵＳＬＡＢにおいて培養した。全部で１４６人の旅行者をトラベルクリニック（Travel Clinic）（フィンランド国、ヘルシンキ、メディシティ）で募集し、６ヶ月の期間、本研究に参加してもらった。年齢は、１歳から７２歳にわたった（平均は、３９．２歳）で、８４人（５７．５％）が女性で、６２人（４２．５％）が男性であった。渡航の目的地の内訳は、ヨーロッパが７．５％、アジアが３２．９％、アフリカが４４．５％、オーストラリアが１．４％、アメリカが１３．７％であった。
患者サンプル 対照用の糞便サンプルを、標準的な生化学的方法によって、Salmonella、Yersinia、Shigella、Campylobacter および ＥＨＥＣ についてＨＵＳＬＡＢにおいて培養した。全部で１４６人の旅行者をトラベルクリニック（Travel Clinic）（フィンランド国、ヘルシンキ、メディシティ）で募集し、６ヶ月の期間、本研究に参加してもらった。年齢は、１歳から７２歳にわたった（平均は、３９．２歳）で、８４人（５７．５％）が女性で、６２人（４２．５％）が男性であった。渡航の目的地の内訳は、ヨーロッパが７．５％、アジアが３２．９％、アフリカが４４．５％、オーストラリアが１．４％、アメリカが１３．７％であった。
糞便サンプルから全核酸を、Antikainen et al., 2009 の記載に従って easyMAG プラットフォームを用いる NucliSENS キットを用いて精製した。簡単に述べれば、糞便を採取した綿棒を１００μｌの Tris-EDTA バッファーに懸濁し、easyMAG プラットフォームの一般的方法によって精製し、２５μｌの容積に溶出させた。溶出物（０．５μｌ）をＰＣＲにおけるテンプレートとして用いた。
上記の方法とは別に、上記綿棒を直接に溶解バッファーに懸濁することもできる。この場合は、サンプルを容積１００μｌに溶出させ、２μｌの溶出物をＰＣＲにおけるテンプレートとして用いる。このプロトコルは、完全に自動化・統合化されたサンプル作製とＰＣＲプレートのセットアップ工程に適する。
単離物の同定 Salmonella、Shigella、Yersinia、Campylobacter およびＥＨＥＣについてＰＣＲにおいて陽性であった糞便サンプルを培養し、通常の診断的方法で同定した。下痢性大腸菌株については培養のためのルーチン方法は存在しないので、陽性サンプルは、以前に開発されたマルチプレックスＰＣＲ（Antikainen et al., 2009）によって分析した。
ハールトマン研究所（Haartman Institute）（フィンランド国、ヘルシンキ）の配列解析コア施設（Sequence Core Facility）において、細菌株の単離ができなかったサンプルから、対応する遺伝子の個別的な増幅とシークエンシングを、表１に記載されたプライマーを用いて行った。配列はＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によって同定した。
リアルタイムＰＣＲの設計 特異的な毒性の遺伝子、種特異的な遺伝子、および、確立された普遍的遺伝子の種特異的領域を同定するためにＰＣＲの設計を行った（表１）。正しい標的遺伝子およびそれらのグローバル変異体（global variant）を認識する（ＮＣＢＩデータベースを用いたＢＬＡＳＴ検索および二次構造予測を含む）ために、Allele ID ソフトウェアおよび Beacon Designer ソフトウェア（米国、カリフォルニア州、パロアルト）を用いて、リアルタイムＰＣＲ のプライマーとプローブを設計した。
リアルタイムＰＣＲを Mx3005P 検出システム（米国、カリフォルニア州、ガーデングローブ、Agilent Technologies 社製）で行った。熱サイクル条件は、９５℃で１５分、９４℃で１分を４０サイクル、６０℃で１分、であった。各アニーリング工程で、蛍光を記録した。２０μｌ反応は、１ × Qiagen Multitect NoROX マスター混合物（ドイツ国、ヒルデン、Qiagen 社製）、１μｌのプライマー／プローブ混合物（表１および２）および０．５μｌのテンプレートＤＮＡを含むものであった。
ＰＣＲの特異性 ＰＣＲの分析特異性を、２４９個の細菌株（Salmonella 株、Shigella 株、Campylobacter 株、Yersinia 株および Vibrio 株 並びに下痢性大腸菌株を含む）(表１および２)を正の対照として用いて分析した。これらの細菌株は、ヘルシンキ大学病院研究室（Helsinki University Hospital Laboratory；ＨＵＳＬＡＢ）、国立健康福祉研究所（National Institute of Health and Welfare；ＴＨＬ）に由来し、さらに厚意を受けた Ｍ．アレグザンダー シュミット氏およびインガ ベンツ氏（ドイツ国、ミュンスター、ベストフェリシェ ビルヘルムス大学（Westfalische Wilhelms-Universitat））、イサベル スカレツキー氏（ブラジル国、サンパウロ連邦大学（Universidade Federal de Sao Paulo））並びにリン トルステンセン ブランダル氏（ノルウェー国、ノルウェー国立公衆衛生研究所（The Norwegian Institute of Public Health））に由来するものであった。負の対照として、すべての主要な属からとった２４３個の細菌株を Antikainen et al., 2009 の記載に従って用いた。
ＰＣＲ分析のために、細菌細胞を１００μｌの水に集め、１５分間煮沸し、１分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄液（０．５μｌ）をＰＣＲ反応に用い、細菌 ＤＮＡを、easyMAG 自動核酸精製プラットフォームを用いる NucliSENS キットを製造者（フランス国、マルシレトワール、bioMerieux社）の説明に従って用いて精製した。
ＰＣＲの分析感度 臨床用途のための感度を分析するために、各アンプリコンについて easyMAG によって精製したすべてのテンプレートを含むＤＮＡの混合物を１０倍に希釈し、ＰＣＲで分析した。さらに、各レポーターの増幅を、煮沸した細菌塊を用いる１０倍希釈液の中で個別に分析した。簡単に述べると、細菌を寒天プレートの上で成長させ、ＴＥバッファーに集め、生細胞数（コロニー形成単位（colony forming unit；ＣＦＵ））を定量した。細菌を１０倍に希釈し、１５分間煮沸し、１分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄液（０．５μｌ）をＰＣＲ反応に用いた。
臨床感度および臨床特異性 臨床感度および臨床特異性を、Salmonella、Shigella、Campylobacter、Yersinia またはＥＨＥＣについて陽性であることが分かっている臨床サンプル（ｎ＝１１９）を用いて、ＨＵＳＬＡＢにおいてルーチンの培養方法によって分析した。さらに、６５個の培養陰性サンプルも分析した。
結果
リアルタイムＰＣＲ法の有効性の確認 ２４９個の陽性株と他の主要な属に属する２４３個の株とを含む参照株を用いて、リアルタイムＰＣＲアッセイを最適化し、有効性を確認した（表５）。すべての正の対照株は正しく同定され、偽陽性の増幅はなかった。したがって、アッセイは１００％の分析特異性を達成した。
リアルタイムＰＣＲ法の有効性の確認 ２４９個の陽性株と他の主要な属に属する２４３個の株とを含む参照株を用いて、リアルタイムＰＣＲアッセイを最適化し、有効性を確認した（表５）。すべての正の対照株は正しく同定され、偽陽性の増幅はなかった。したがって、アッセイは１００％の分析特異性を達成した。
臨床特異性および臨床感度を、ルーチンの診断的方法によって得た糞便サンプルを用いて分析した。Salmonella（ｎ＝５０）、Campylobacter（ｎ＝５０）、Yersinia（ｎ＝４）および Shigella（ｎ＝６）並びにＥＨＥＣ（ｎ＝９）について陽性であるルーチンのサンプルをＰＣＲで分析したところ、１つ以外のすべてが正しい増幅を示した (表５)。さらに、６４個の培養陰性サンプルを分析したところ、Salmonella、Campylobacter、Yersinia または Shigella については陽性であるものは１つもなかった。下痢性大腸菌株についてはルーチンの培養方法はないので、この方法では下痢性大腸菌株を同定することはできなかった。したがって、このアッセイの臨床感度は９９．２％であり、臨床特異性は１００％であった。
ＰＣＲの分析感度を、ＰＣＲによって分析したテンプレートＤＮＡ混合物の１０倍希釈液によって定義した。４０回の増幅サイクルの感度は、ＥＨＥＣおよびサルモネラ菌については０．１ｎｇ／ｍｌであり、他のものについては１ｎｇ／ｍｌであった。さらに、細菌株を煮沸して得られたＤＮＡから、感度を測定した。そのアッセイにおいて、検出限界は、１回の反応につき、５〜５０ＣＦＵであった。これらの結果は、正しい同定(＞９０％陽性)のために必要な最低の濃度を表す。
ＰＣＲの臨床有効性の確認 １４６人の旅行者の、外国旅行前および外国旅行後の糞便サンプルの分析において、リアルタイムＰＣＲ法を利用した。データを表３および４に示す。内部対照についてはすべてのサンプルが陽性であって、ＰＣＲ阻害は検出されなかった。旅行前のサンプルのうち、わずか３つ（２．１％）が陽性であって、これらはＥＡＥＣについて陽性であった。これらのサンプルから、ＰＣＲ結果が一致する大腸菌株を単離した。最もよくみられた検出物は下痢性大腸菌株（ＥＰＥＣ：４１．１％、ＥＡＥＣ：３８．４％、ＥＴＥＣ：１８．５％、ＥＨＥＣ：７．５％）であり、次いで Campylobacter（４．１％）、Salmonella（２．１％）および Shigella／ＥＩＥＣ（１．４％）であった。
Campylobacter、Yersinia、Shigella、Salmonella またはＥＨＥＣについて陽性であるすべてのサンプルは、培養、ＰＣＲ産物のシークエンシングのいずれにおいても陽性であることが確認された。
４５人の患者から、２つまたはそれより多い検出物が見られた。
下痢性大腸菌の種の分泌 ２ヶ月の追跡期間に外国旅行をしない６０人の患者について、下痢性大腸菌（ＤＥＣ）の動態を研究した。同一の検査結果が６０サンプルのうちの７件 (ＥＡＥＣが４回、ＥＰＥＣが２回) から得られ、以前のものとは異なる検査結果が５人の患者から得られたが、これらのすべての者は追跡期間に外国に旅行しており、一方、他の追跡サンプルは陰性であった。この動態は、以前に説明した他の Enterobacteriaceae 病原体と一致するものであった。
ノロウイルスが５．５％の患者に検出された。このことは、細菌が旅行者下痢における主要な病原体であることを示唆するものであった。
検討
本研究は、新たな分子的手法を用いて旅行者下痢に関連するすべての主要な病原体を分析する、初めての組織的な追跡研究である。旅行前の正常なサンプルが入手できたので、この研究設計では、本発明者らは、熱帯の国への旅行の結果を件ごとに追跡することができた。本研究の最も重要な達成は、簡単な現代の手法を用いて患者群の中のすべての主要な病原体を同定することができたことである。これは、様々な研究の結果に比べ、内在的な偏りを除去するものである。フィンランド国のような衛生の良い諸国において予想されるように、健常者における下痢性病原体の流行は非常に低かった（２．１％）。これと非常に対照的に、本発明者らは、症状を示す患者の７４％に病原体を同定した。この数値は、おそらく、ほぼすべての病原体は輸入されたものであってフィンランド人患者の正常な細菌叢には属しないことを確認させる、旅行者下痢の患者についての今までの最高の測定値であろう。すべての下痢性病原体（すべての下痢性大腸菌の種を含む）は、症状を示さない人よりも症状を示す人においてよく見られるものである。このことは、これらすべてが重要性のある下痢性病原体であって、単に正常な細菌叢の乱れを反映するというものではないということを示唆する。症状を示す患者のサンプルのうちの２６％が、研究したすべての細菌病原体において陰性であった。本研究は、下痢性大腸菌の種が旅行者下痢を有する患者における最も主要な細菌病原体であることを示唆する他の最近の研究と合致している。
本研究は、新たな分子的手法を用いて旅行者下痢に関連するすべての主要な病原体を分析する、初めての組織的な追跡研究である。旅行前の正常なサンプルが入手できたので、この研究設計では、本発明者らは、熱帯の国への旅行の結果を件ごとに追跡することができた。本研究の最も重要な達成は、簡単な現代の手法を用いて患者群の中のすべての主要な病原体を同定することができたことである。これは、様々な研究の結果に比べ、内在的な偏りを除去するものである。フィンランド国のような衛生の良い諸国において予想されるように、健常者における下痢性病原体の流行は非常に低かった（２．１％）。これと非常に対照的に、本発明者らは、症状を示す患者の７４％に病原体を同定した。この数値は、おそらく、ほぼすべての病原体は輸入されたものであってフィンランド人患者の正常な細菌叢には属しないことを確認させる、旅行者下痢の患者についての今までの最高の測定値であろう。すべての下痢性病原体（すべての下痢性大腸菌の種を含む）は、症状を示さない人よりも症状を示す人においてよく見られるものである。このことは、これらすべてが重要性のある下痢性病原体であって、単に正常な細菌叢の乱れを反映するというものではないということを示唆する。症状を示す患者のサンプルのうちの２６％が、研究したすべての細菌病原体において陰性であった。本研究は、下痢性大腸菌の種が旅行者下痢を有する患者における最も主要な細菌病原体であることを示唆する他の最近の研究と合致している。
本研究は、Aeromonas 属、Plesiomonas、腸内毒素原性の Bacteroides fragilis、Arcobacter およびＤＡＥＣ以外のすべての主要な細菌病原体を網羅する。本研究から除外したこれら病原体の相対比は、以前の研究によると低く、その病原体としての役割や発症率はまだ完全には理解されていない（von Graevenitz, 2007）。リアルタイムＰＣＲ法は、病原体の毒性遺伝子や種特異的遺伝子を認識する。たとえば、毒性ＥＡＥＣを同定するために、凝集パターンおよび下痢症状に寄与する最も特徴的な遺伝子であるという理由で、aggR 遺伝子が選ばれた(Monteiro et al., 2009); (Huang et al., 2007; Mohamed et al., 2007)。臨床的な重要性のある可能性があるすべての標的種を網羅するためには、アッセイの最適な感度および特異性のために多様な異なる標的遺伝子およびそれらが保存される領域のスクリーニングを行う必要があった。たとえば、ただ１つのプライマー−プローブセットを用いるだけでは、エルシニア菌やカンピロバクター菌のファミリーの中に病原性の種を検出することは不可能であった。独立の参照法に比べると、本研究におけるアッセイの感度および特異性は高く、約１００％であった。このことは、本研究におけるアッセイが旅行者下痢の主要なスクリーニング方法として糞便培養に代替し得ることを示唆する。どの場合にも、下痢患者におけるＤＥＣの高い比率は、少なくとも該患者を、ＤＥＣを同定することができるＰＣＲのような方法で分析すべきであることを示唆する。
本研究におけるアッセイは、最適の条件の下で同時に対照サンプルを用いることによって、１３種の病原体を同定することができる。本発明者らは、１つの患者サンプルから４つまでの異なる病原体を同定することができた。このことは、複数の病原体を同時に同定できることを示す。これは、複数の病原体が１つの病気を引き起こすことがしばしばあるという事実と適合する。それにもかかわらず、典型的なＰＣＲ反応は、本来、最も豊富にある標的に適する。偽陰性の標的の結果は、同一のマルチプレックス反応の中に、１つの非常に増幅度の低い病原体とともに１種または２種の非常に豊富にある病原体が存在している場合に、生ずる可能性が最も高い。この選択肢は、他の方法、および／またはリサンプリングによって制御しなければならず、また、このアッセイを診断目的に用いるときには警告を届け出なければならない。偽陰性の標的の結果の危険を最小にするために、最も頻繁に現れる病原体がそれぞれ異なるマルチプレックス反応に含まれるように、マルチプレックス組成を設計した。
推定されるＰＣＲ阻害剤の存在のモニタリングを行うために、１つの内部陽性対照を各サンプルとともに検査したが、阻害は検出されなかった。これは、半自動化されたＤＮＡ抽出プロセスが十分な質を有し、糞便病原体の分析に適切であることを示唆するものである。
まとめて言えば、本研究は、下痢性大腸菌の属が旅行者下痢における最も主要な糞便病原体であることを示唆する最近の研究と合致している。新たなリアルタイムＰＣＲ技術を適用することにより、それらは、糞便サンプルから直接に、他の糞便病原体とともにスクリーニングすることができる。
文献
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von Graevenitz, A. (2007). The role of Aeromonas in diarrhoea: a review. Infection 35, 59-64.
Claims (26)
- 生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
ｉ）サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、配列番号６１で定義されるＥＴＥＣのアンプリコン、配列番号６２で定義されるＥＴＥＣのアンプリコン、および配列番号６３で定義されるＥＴＥＣのアンプリコンを増幅し、更に、配列番号６５で定義されるカンピロバクターのアンプリコンおよび配列番号６６で定義されるカンピロバクターのアンプリコン、及び／又は、配列番号６７で定義されるエルシニアのアンプリコンおよび配列番号６８で定義されるエルシニアのアンプリコンを増幅するものであって、該ＥＴＥＣのアンプリコンを増幅するプライマー、並びに、該カンピロバクターのアンプリコンを増幅するプライマーが存在する場合には該カンピロバクターアンプリコン増幅プライマー、および、該エルシニアのアンプリコンを増幅するプライマーが存在する場合には該エルシニアアンプリコン増幅プライマーは、該２つ以上の個別のＰＣＲ反応のうちの１つに存在するものであり、
ｉｉ）上記工程ｉ）で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして ｉｉｉ）反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法。 - 工程ｉ）において、該プライマーペアのプライマーが配列番号６５〜６６で定義されるカンピロバクターのアンプリコンのそれぞれを増幅することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 工程ｉ）において、該プライマーペアのプライマーが配列番号６７〜６８で定義されるエルシニアのアンプリコンのそれぞれを増幅することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 工程ｉ）において、以下の配列：
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー： 5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する、または少なくとも１種からなるプライマーペアと、サンプルまたはサンプルから単離した核酸を接触させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、それぞれが配列番号１３〜１８に示したヌクレオチド配列からなるプライマーと接触させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 該プライマーペアが、以下の配列：
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１），
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）、および
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３），
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を更に包含するか、または少なくとも１種からなることを特徴とする、請求項４に記載の方法。 - 工程ｉ）において、サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、以下の配列：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）
からなる群より選ばれる少なくとも１種を包含する、または少なくとも１種からなるプライマーペアと更に接触させることを特徴とする、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。 - 各核酸プライマーが、配列番号１〜３６に示したヌクレオチド配列中の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドからなるものであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- ＰＣＲ反応におけるそれぞれのプライマーペアの産物である増幅された標的配列の存在が、以下の基準に基づく、サンプル中の下痢性病原体の存在の指標となることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
− プライマーペアＡ）またはＢ）の産物は、ＥＨＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＣ）の産物は、ＥＨＥＣ／ＥＰＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＤ）の産物は、Salmonella の存在の指標となり、
− プライマーペアＥ）またはＦ）の産物は、Shigella／ＥＩＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＧ），Ｈ）またはＩ）の産物は、ＥＴＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＪ）の産物は、ＥＡＥＣの存在の指標となり、
− プライマーペアＫ）の産物は、Campylobacter jejuni の存在の指標となり、
− プライマーペアＬ）の産物は、Campylobacter coli の存在の指標となり、
− プライマーペアＭ）の産物は、Yersinia enterocolitica／Yersinia pseudotuberculosis の存在の指標となり、
− プライマーペアＮ）の産物は、Yersinia pseudotuberculosis／Yersinia pestis の存在の指標となり、
− プライマーペアＯ）の産物は、Vibrio cholerae の存在の指標となり、
− プライマーペアＰ）の産物は、Giardia lamblia の存在の指標となり、
− プライマーペアＱ）の産物は、Entamoeba histolytica の存在の指標となり、そして
− プライマーペアＲ）の産物は、クリプトスポリジウム属の存在の指標となる。 - 該生物学的サンプルが、糞便サンプルまたは食品サンプルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 該プライマーペアの各プライマーの長さが５０ヌクレオチド未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- マルチプレックスＰＣＲアッセイをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で行い、各プライマーペアと共に、以下の配列を包含するか以下の配列からなる特定の核酸プローブを使用することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
− プライマーペアＡ）のためのプローブ：
5'-TCCATGATARTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCC-3'（配列番号３７）
− プライマーペアＢ）のためのプローブ：
5'-TTGTCACTGTCACAGCAGAAGCCTTACGC-3'（配列番号３８）
− プライマーペアＣ）のためのプローブ：
5'-AGATTAACCTCTGCCGTTCCATAATGTTGTAACCA-3'（配列番号３９）
− プライマーペアＤ）のためのプローブ：
5'-CCAAACCTAAAACCAGTAAAGGCGAGCAGC-3'（配列番号４０）
− プライマーペアＥ）のためのプローブ：
5'-TCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTT-3'（配列番号４１）
− プライマーペアＦ）のためのプローブ：
5'-ACAAACAGCAAAAGAGCATAGCATCCGAGAACT-3'（配列番号４２）
− プライマーペアＧ）のためのプローブ：
5'-CAAATATCCGTGAAACAACATGAC-3'（配列番号４３）
− プライマーペアＨ）のためのプローブ：
5'-AGGATTACAACACAATTCACAGCAGT-3'（配列番号４４）
− プライマーペアＩ）のためのプローブ：
5'-AGCAGGTTTCCCACCGGATCACCA-3'（配列番号４５）
− プライマーペアＪ）のためのプローブ：
5'-TCCGTATATTATCATCAGGGCATCCTTTAGGCGT-3'（配列番号４６）
− プライマーペアＫ）のためのプローブ：
5'-AAGACCCACAGTTTTACCAAGTTTT-3'（配列番号４７）
− プライマーペアＬ）のためのプローブ：
5'-AACTTGGCTCTTCTTATGTGCGT-3'（配列番号４８）
− プライマーペアＭ）のためのプローブ：
5'-CCTGGATAAGCGAGCGACGTATTCTCTATGC-3'（配列番号４９）
− プライマーペアＮ）のためのプローブ：
5'-AAACCAAAGCCGCCCACACCACAG-3'（配列番号５０）
− プライマーペアＯ）のためのプローブ：
5'-AACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG-3'（配列番号５１）
− プライマーペアＰ）のためのプローブ：
5'-ACGAAGCCATGCATGCCCGCT-3'（配列番号５２）
− プライマーペアＱ）のためのプローブ：
5'-ACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAA-3'（配列番号５３）
− プライマーペアＲ）のためのプローブ：
5'-CCTCCTAATCCAGAATGTCCTCCAG-3'（配列番号５４）
但し、上記配列において、下線を引いたヌクレオチドは、プローブの融解温度（Ｔｍ）を上昇させる修飾ヌクレオチドである。 - 該核酸プローブのそれぞれが、配列番号３７〜５４に示したヌクレオチド配列からなるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
- プライマーペアＡ）〜Ｆ）とＧ）〜Ｎ）とがそれぞれ別のＰＣＲ反応に含まれることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
- 以下のＰＣＲ反応を包含することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
プライマーペアＡ）〜Ｄ）を用いた第１反応、プライマーペアＫ）〜Ｌ）を用いた第２反応、プライマーペアＥ）、Ｆ）、Ｍ）、Ｎ）とＯ）を用いた第３反応、そしてプライマーペアＰ）〜Ｒ）を用いた第４反応。 - 以下のＰＣＲ反応を包含することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
プライマーペアＡ）〜Ｄ）を用いた第１反応、プライマーペアＧ）〜Ｉ）とＫ）〜Ｎ）を用いた第２反応、プライマーペアＥ）、Ｆ）、Ｊ）とＯ）を用いた第３反応、そしてプライマーペアＰ）〜Ｒ）を用いた第４反応。 - 以下の配列：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１）,
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３）,
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）
からなる群より選ばれるプライマーからなるプライマーペアの、サンプル中の下痢性病原体の検出のための使用であって、該検出を２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイで実施し、ＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出するプライマーペアＧ）、Ｈ）、Ｉ）、Ｋ）およびＬ）は少なくとも必ず、検出のために使用し、ＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出するプライマーペアＧ）、Ｈ）、Ｉ）、Ｋ）およびＬ）のプライマーは該２つ以上の個別のＰＣＲ反応のうちの１つに存在することを特徴とする使用。 - 該サンプルが、糞便サンプルまたは食品サンプルであることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
- 配列番号１３〜１８および２１〜２４に示したプライマーペアからなるヌクレオチドプライマーペアセット。
- 配列番号４３〜４５および４７〜４８に示したプローブ配列からなるヌクレオチドプローブセット。
- 請求項１９において定義したヌクレオチドプライマーペアセットまたは請求項２０において定義したヌクレオチドプローブセットの、サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための使用。
- サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するためのキットであって、請求項２１のヌクレオチドプライマーペアセットまたは請求項２０のヌクレオチドプローブセットを包含するキット。
- ポリメラーゼ、ヌクレオチド、バッファー、塩類、界面活性剤および／または他の添加剤からなる群より選ばれる他のＰＣＲ用試薬成分を包含する、請求項２２に記載のキット。
- 少なくとも１種の対照用のプライマー、プローブまたはヌクレオチド配列を更に包含する、請求項２２または２３に記載のキット。
- 少なくともＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberculosis、および Yersinia pestis の存在を検出するためのキットであって、以下のプライマーペア：
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１），
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３），
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；および
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）
からなる群からなるプライマー配列からなることを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれかに記載のキット。 - 生物学的サンプル中の下痢性病原体の存在を検出するための方法であって、
ｉ）サンプルまたはサンプルから単離した核酸を、２つ以上の個別のＰＣＲ反応を包含するマルチプレックスＰＣＲアッセイ中のプライマーペアと接触させ、但し、該プライマーペアに含まれるプライマーは、以下の配列からなるプライマーであり：
Ａ）フォワードプライマー：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'（配列番号１），
リバースプライマー：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'（配列番号２）；
Ｂ）フォワードプライマー：5'-TGCATCCAGAGCAGTTCTGC-3'（配列番号３），
リバースプライマー：5'-CGGCGTCATCGTATACACAGG-3'（配列番号４）；
Ｃ）フォワードプライマー：5'-CCAGGCTTCGTCACAGTTGC-3'（配列番号５），
リバースプライマー：5'-CAGTGAACTACCGTCAAAGTTATTACC-3'（配列番号６）；
Ｄ）フォワードプライマー： 5'-GCTCTTCGGCACAAGTAATATCAAC-3'（配列番号７），
リバースプライマー：5'-TCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACG-3'（配列番号８）；
Ｅ）フォワードプライマー：5'-TGGTCCATCAGGCATCAGAAGG-3'（配列番号９），
リバースプライマー：5'-GGCAGTGCGGAGGTCATTTG-3'（配列番号１０）；
Ｆ）フォワードプライマー：5'-TGTCTTTATAGGACATCCCTGATACTTTC-3'（配列番号１１），
リバースプライマー：5'-TATCTACTCTTGATGCCAGAAAACTAGC-3'（配列番号１２）；
Ｇ）フォワードプライマー：5'-AAAATTGCAAAATCCGTTTAACTAATC-3'（配列番号１３），
リバースプライマー：5'-GACTGACTAAAAGAGGGGAAAG-3'（配列番号１４）；
Ｈ）フォワードプライマー：5'-TCCTGAAAGCATGAATAGTAGC-3'（配列番号１５），
リバースプライマー：5'-TTATTAATAGCACCCGGTACAAG-3'（配列番号１６）；
Ｉ）フォワードプライマー：5'-CCGGCAGAGGATGGTTACAG-3'（配列番号１７），
リバースプライマー：5'-TTGATTGATATTCCCTGAGATATATTGTG-3'（配列番号１８）；
Ｊ）フォワードプライマー：5'-GGAAGCAATACATATCTTAGAAATGAACTC-3'（配列番号１９），
リバースプライマー：5'-TCGGACAACTGCAAGCATCTAC-3'（配列番号２０）；
Ｋ）フォワードプライマー：5'-GAGTGAAAAAGATTTTGTTCAAGTTG-3'（配列番号２１）,
リバースプライマー：5'-AAAAGTCGCTCAGGTTATGC-3'（配列番号２２）；
Ｌ）フォワードプライマー：5'-AGTGCCTGAACCTCAATTTG-3'（配列番号２３）,
リバースプライマー：5'-TCGATAGGATTTTCTTCAAAATATTTAC-3'（配列番号２４）；
Ｍ）フォワードプライマー：5'-GTTTGGTACAGTTTATGGCATTTCAC-3'（配列番号２５），
リバースプライマー：5'-CATGGCAATATCAACAATACTCATCTTAC-3'（配列番号２６）；
Ｎ）フォワードプライマー：5'-CAGGAGCATGAGGTTCACAGTATG-3'（配列番号２７），
リバースプライマー：5'-TCTCTGGCCCCGCACAATG-3'（配列番号２８）；
Ｏ）フォワードプライマー：5'-GGGCTACAGAGATAGATATTACAGTAACTTAG-3'（配列番号２９），
リバースプライマー：5'-CCACGGCTCTTCCCTCCAAG-3'（配列番号３０）；
Ｐ）フォワードプライマー：5'-TTCCGGTCGATCCTGCC-3'（配列番号３１），
リバースプライマー：5'-GTTGTCCTGAGCCGTCC-3'（配列番号３２）；
Ｑ）フォワードプライマー：5'-AGACGATCCAGTTTGTATTAG-3'（配列番号３３），
リバースプライマー：5'-GGCATCCTAACTCACTTAG-3'（配列番号３４）；および
Ｒ）フォワードプライマー：5'-TCTGGAAAACAATGTGTTC-3'（配列番号３５），
リバースプライマー：5'-GGCATGTCGATTCTAATTC-3'（配列番号３６）、
ｉｉ）上記工程ｉ）で得た反応混合物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、下痢性病原体の標的配列がサンプル中に存在した場合には、該配列を特異的に増幅し、そして
ｉｉｉ）反応混合物中の増幅された標的配列の存在を検出し、いずれかの標的配列の存在を、下痢性病原体がサンプル中に存在することの指標とする
ことを包含する方法であって、
ＥＴＥＣ、Campylobacter jejuni および Campylobacter coli の存在を検出するプライマーペアＧ）、Ｈ）、Ｉ）、Ｋ）およびＬ）は該２つ以上の個別のＰＣＲ反応のうちの１つに存在することを特徴とする方法。
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