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CN103981275A - 用于同时检测海洋中四种致病菌的多重pcr引物及其设计方法 - Google Patents

用于同时检测海洋中四种致病菌的多重pcr引物及其设计方法 Download PDF

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CN103981275A
CN103981275A CN201410241775.8A CN201410241775A CN103981275A CN 103981275 A CN103981275 A CN 103981275A CN 201410241775 A CN201410241775 A CN 201410241775A CN 103981275 A CN103981275 A CN 103981275A
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CN
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vibrio parahaemolyticus
enterobacter cloacae
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CN201410241775.8A
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杨季芳
管峰
陈吉刚
毛芝娟
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Zhejiang Wanli College
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Zhejiang Wanli College
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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Abstract

本发明涉及一种用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物及其设计方法，设计方法，设计方法包括利用引物设计软件设计同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物组合、筛选竞争状态优势引物利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证，最后去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合，同时还公开了多重PCR的检测方法；与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明建立的多重PCR同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点，只需一个PCR反应就可同时检测出这四种细菌。

Description

用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物及其设计方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种用于同时检测海洋阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物及其设计方法。
背景技术
阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌，属于可以通过食物、水进行传播的病原菌。它们的生物学特性和致病性有一定的区别，但都可以引起食物中毒和消化系统疾病。
阴沟肠杆菌属于条件致病菌，一般条件下不会引起致病，但也可引起败血症、下呼吸道感染、伤口感染、软组织感染、心内膜炎、泌尿道感染等症状。阴沟肠杆菌能够引起人类重视，主要是因为其可产生超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶，耐药情况严重，并且具备多种其他耐药机制，给临床抗生素治疗带来新的挑战。阴沟肠杆菌耐药机制主要包括产生β-内酰胺酶、qnr基因介导耐药、整合子、主动外排泵系统作用、药物作用靶位的改变、外膜通透性改变等。这些复杂的耐药机制存在，对于其他细菌混合性感染的抗生素治疗造成无效或疗效甚微。阴沟肠杆菌广泛存在于自然界中，由其引起的海产品食物中毒偶有发生，但是在医院中的传播仅次于大肠杆菌和克雷伯菌。
产单核细胞增生李斯特菌是一种重要人畜共患病的病原菌。人感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多等。该菌广泛存在于自然界中，食品中存在的产单核细胞增生李斯特菌对人类的安全具有危险，在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。在欧美、日本由该菌造成的临床疾病和食物污染问题，已超过在细菌性食物中毒中占第1位的沙门氏菌。我国多地也有该菌引发疾病而住院和死亡的报道。因为该菌是一种细胞内寄生菌，抗生素治疗只能在一段时间内发挥作用，目前发现其耐药性呈现散状分布，对一些抗生素耐药性不断增强。
嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体中，是多种水生动物的原发性致病菌，对人而言为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病的病原菌。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，如：溶血素、组织毒素、坏死毒素、肠毒素和蛋白酶等，主要引起肠道性感染。嗜水气单胞菌感染人的病例少有记载，但是一旦发作，死亡率很高，治愈率较低，常会与其它菌(如温和产气单胞菌、弧菌等)混合感染使病情加重。在我国也发生过多次由嗜水气单胞菌引起的食物中毒。
副溶血弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有耐热性溶血素(TDH)和耐热溶血相关毒素(TRH)，这些毒素具有溶血活性、肠毒性和致死作用。该菌因在含食盐较浓(3％-4％以上)的培养基中生长，而在不含盐的培养基内不能繁殖，故而又称嗜盐菌。副溶血弧菌在世界各地均有分布，通常存在于海岸线区域以及海产品中，人多因食用污染本菌又未经良好加工的海产品，如蟹类、牡蛎、虾等而引起食物中毒。副溶血弧菌引起的食物中毒，在沿海地区细菌性食物中毒中所占比例较高，是沿海区域最主要的食物中毒细菌之一。其引起的细菌性食物中毒危害仅次于沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。我国沿海地区每年都有大量由副溶血性弧菌引起食物中毒报道。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR技术的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火(复性)、延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一段时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板与引物的结合物在72℃，Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性、退火(复性)、延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改造，在一个PCR反应体系中同时加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中能同时扩增多个目的片段的多个靶序列。该技术可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。多重PCR最大的问题在于引物的设计和反应条件的优化。和一般PCR相比较，多重PCR在同一PCR反应管内需要同时扩增出多个病原菌的目的片段，一次完成多个模板的扩增。在本发明中，在同一反应管内检出阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌，将大大节省时间和试剂，节约经费，为检测提供更多更准确的信息。多重PCR的引物设计要求总体上与一般PCR的引物一致，如引物自身需要有稳定的二级结构，引物之间也不能形成发夹和引物二聚体等。这是因为单对引物扩增单个模板都能扩增出条带清晰的目的片段，但是各种引物混和后扩增会有条带丢失现象出现。各引物之间还存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物，导致目的片段丢失。甚至引物之间相互作用产生严重的引物二聚体，导致目的片段丢失。
多重PCR以其快速、高效、特异性好、灵敏度高的特点，在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物等检测中具有重要作用，符合口岸、卫生、质检等部分快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR势在必行。这对于加强水产品中这些致病菌的快速检验检疫、水产养殖病害的调查和防治、无公害水产品检测和生产以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有提示和警示的作用。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物及其设计方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR检测方法，其具有简单、灵敏、快速、特异性强的特点。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：该用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物，其特征在于：该四种致病菌的多重PCR引物分别包括阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物；
其中，阴沟肠杆菌的上下游引物为：
P1：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’；
P2：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’；
产单核细胞增生李斯特菌的上下游引物为：
P3：5’-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’；
P4：5’-CATATTCCACTTTAACCGTG-3’；
嗜水气单胞菌的上下游引物为：
P5：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’；
P6：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’；
副溶血弧菌的上下游引物为：
P7：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’；
P8：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’；
进一步地，用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物，其特征在于：所述阴沟肠杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，所述产单核细胞增生李斯特菌引物对应的PCR扩增片段大小为768bp和272bp，所述嗜水气单胞菌引物对应的PCR扩增片段大小为483bp，所述副溶血弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为454bp。
本发明中用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，利用引物设计软件设计同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20-24个，引物的熔解温度Tm值为55℃-65℃，引物的GC％为40％-60％；
步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；
步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；
步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；
步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。
本发明中用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)细菌的初步分离：从培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板；
2)多重PCR扩增包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述DNA模板溶液38-60ng/μL，用上述试剂盒进行检测，反应体系为20-30.0μL，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶0.02U/μL，PCR缓冲液2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，引物P1、P2各0.5-2μL，P3、P4各0.75-1.5μL，P5、P6各0.75-1.5μL，P7、P8各0.25-1.0μL，余量用重蒸水补足；b、扩增反应条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸40s，循环30次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
作为优选，所述步骤a中引物P1、P2各2μL，P3、P4各0.75μL，P5、P6各0.75μL，P7、P8各0.25μL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明建立的多重PCR同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的方法，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点，只需一个PCR反应就可同时检测出这四种细菌，通过应用该方法对不同环境海水样品和养殖海水样品的检测，同时与常规方法检测进行比较多重PCR检出结果，与常规细菌分离鉴定结果完全吻合；采用本发明多重PCR同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的方法，能提示和警示样品是否具有危害性，这对于预防和控制我国水产品和海洋环境安全具有重要的现实意义。目前未见国内外利用该技术检测海洋及其水产品中阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的报道，该技术有望为多部门检测这四种细菌提供一种快速灵敏、简便可靠的方法，特别适合检疫、卫生等部门实施快速检验需要。
附图说明
图1为多重PCR鉴别阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的电泳检测结果。
具体实施方式
以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
1)利用primer express2.0引物设计软件设计同时扩增阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重引物组合；
2)筛选多重引物组合中PCR检测阴沟肠杆菌的引物；
3)筛选多重引物组合中PCR检测产单核细胞增生李斯特菌的引物；
4)筛选多重引物组合中PCR检测嗜水气单胞菌的引物；
5)筛选多重引物组合中PCR检测副溶血弧菌的引物；
6)筛选多重PCR同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的引物组合。
所述的步骤1)，其中涉及的引物参照实验室海洋分离株相应的基因序列和GenBank上发表(E.bact.gyrB为GenBank AF302677、AY370837，L.mono.ppbp为GenBankFR733647、HE999705，A.hydr.hlyA为GenBank L36462、GU229025，V.para.tlh为GenBankGU971655、AB012596)的四种细菌对应的基因序列，应用primer express2.0设计的同时检测四种细菌的特异性引物组合。
在本专利文本中，E.bact.为阴沟肠杆菌的英文缩写，L.mono.为产单核细胞增生李斯特菌的英文缩写，A.hydr.为嗜水气单胞菌的英文缩写，V.para.为副溶血弧菌的英文缩写；E.bact.(gyrB)P1和E.bact.(gyrB)P2为根据阴沟肠杆菌gyrB基因设计的上游引物P1和下游引物P2，L.mono.(ppbp)P3和L.mono.(ppbp)P4为根据产单核细胞增生李斯特菌ppbp基因设计的上游引物P3和下游引物P4，A.hydr.(hlyA)P5和A.hydr.(hlyA)P6为根据嗜水气单胞菌hlyA基因设计的上游引物P5和下游引物P6，V.para.(tlh)P7和V.para.(tlh)P8为根据副溶血弧菌tlh基因设计的上游引物P7和下游引物P8。
所述的步骤2)、3)、4)、5)和6)，经过筛选，得出阴沟肠杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，产单核细胞增生李斯特菌引物对应的PCR扩增片段大小为768bp和272bp，嗜水气单胞菌引物对应的PCR扩增片段大小为483bp，副溶血弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为454bp。具体引物序列如下：
阴沟肠杆菌的上下游引物为：
E.bact.(gyrB)P1：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’；
E.bact.(gyrB)P2：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’；
产单核细胞增生李斯特菌的上下游引物为：
L.mono.(ppbp)P3：5’-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’；
L.mono.(ppbp)P4：5’-CATATTCCACTTTAACCGTG-3’；
嗜水气单胞菌的上下游引物为：
A.hydr.(hlyA)P5：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’；
A.hydr.(hlyA)P6：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’；
副溶血弧菌的上下游引物为：
V.para.(tlh)P7：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’；
V.para.(tlh)P8：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’；
所述的步骤6)，多重PCR同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌方法最佳反应条件的测定，分别利用4对引物进行4种细菌模板多重PCR最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等的测定，然后根据实验结果进行多重PCR最佳循环次数的测定。
所述的步骤6)，多重PCR同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌方法的反应体系为25μL，具体如下：10×PCR Buffer(含25mmol/L MgCl2)2.5μL，10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP)3μL，10mmol/L E.bact.(gyrB)上下游引物各0.5μL，10mmol/L L.mono.(ppbp)和A.hydr.(hlyA)上下游引物各1.5μL，10mmol/L V.para.(tlh)上下游引物各1.0μL，5U/μL Taq酶0.25μL，E.bact.的DNA模板3μL，L.mono.的DNA模板4μL，A.hydr.的DNA模板5μL，V.para.的DNA模板2μL，ddH2O补足至25μL。扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃60s，循环30次；终延伸72℃10min；4℃保存。反应结束后取反应液各5μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：Tris硼酸(TBE)、电流50mA,电压150v，电泳时间30min后以Bio-Rad凝胶成像系统拍摄成像，图1中显示了对本实施例样品分别进行多重和单重PCR的检测结果，其中M号泳道为DL2000DNA Marker；1号泳道为四重PCR扩增结果，在分子量约为1250bp、768bp与272bp、483bp和454bp处分别呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的样品中存在阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌；2号泳道为阴沟肠杆菌的检测结果，呈现分子量约为1250bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有阴沟肠杆菌；3号泳道为产单核细胞增生李斯特菌的检测结果，呈现分子量约为768bp和272bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品中含有产单核细胞增生李斯特菌；4号泳道为嗜水气单胞菌的检测结果，呈现分子量约为483bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有嗜水气单胞菌；5号泳道为副溶血弧菌的检测结果，呈现分子量约为454bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有副溶血弧菌。
实施例1
用于同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物设计方法，该方法包括以下步骤：
步骤1，利用引物设计软件Oligo6.0设计同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为24个，引物的熔解温度Tm值为65℃，引物的GC％为40％；
步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；
步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；
步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；
步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。
具体引物序列如下：
E.bact.(gyrB)P1：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’
E.bact.(gyrB)P2：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’
L.mono.(ppbp)P3：5’-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’
L.mono.(ppbp)P4：5’-CATATTCCACTTTAACCGTG-3’
A.hydr.(hlyA)P5：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’
A.hydr.(hlyA)P6：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’
V.para.(tlh)P7：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’
V.para.(tlh)P8：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’。
实施例2
用于同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物设计方法，该方法包括以下步骤：
步骤1，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20个，引物的熔解温度Tm值为55℃，引物的GC％为60％；
步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；
步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；
步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；
步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；
步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。
具体引物序列如下：
E.bact.(gyrB)P1：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’
E.bact.(gyrB)P2：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’
L.mono.(ppbp)P3：5’-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’
L.mono.(ppbp)P4：5’-CATATTCCACTTTAACCGTG-3’
A.hydr.(hlyA)P5：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’
A.hydr.(hlyA)P6：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’
V.para.(tlh)P7：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’
V.para.(tlh)P8：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’。
实施例3
1、设计合成阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌引物
参照海洋分离株相应的基因序列和GenBank上发表的四种细菌对应的基因序列(E.bact.gyrB为GenBank AF302677、AY370837，L.mono.ppbp为GenBank FR733647、HE999705，A.hydr.hlyA为GenBank L36462、GU229025，V.para.tlh为GenBank GU971655、AB012596)的四种细菌对应的基因序列，应用primer express2.0设计一对特异性引物，阴沟肠杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，产单核细胞增生李斯特菌引物对应的PCR扩增片段大小为768bp和272bp，嗜水气单胞菌引物对应的PCR扩增片段大小为483bp，副溶血弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；具体参见表1：
2、摸索细菌模板提取方法
采用传统方法(苯酚-氯仿提取法)、热裂解法和试剂盒提取法3种方法分别对细菌DNA进行提取，并将提取的DNA模板进行PCR扩增，对结果进行对照，选出最佳提取方法。试剂盒提取法、热裂解法和传统提取法提取效果基本相同，效果较好。但是传统方法操作较为烦琐，试剂盒提取法因为相对成本较高，因此最终选择热裂解法为最佳提取方法。
其中，热裂解法具体方案如下：将阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌菌株分别接种到以Luria Broth(LB)培养基和3.5％碱性蛋白胨水中，过夜培养16小时；将培养后菌液倒入1.5mLEp管中大约1.2mL，12000rpm离心约1min，倒去上清，再13000rpm离心约1min，吸去残液；用无菌PBS120μL重悬沉淀，放入沸水中悬浮加热10min后，立即冰浴5min；再放入沸水中悬浮加热5min，再冰浴5min；将冰浴后的Ep管，10000rpm离心1min，取上清液做模板。
3、多重PCR检测方法的建立
PCR扩增的反应体系为25μL，具体如下：10×PCR Buffer(含25mmol/L MgCl2)2.5μL，10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP)3μL，10mmol/L E.bact.(gyrB)上下游引物P1、P2各2μL，10mmol/L L.mono.(ppbp)上下游引物P3、P4和A.hydr.(hlyA)上下游引物P5、P6各0.75μL，10mmol/L V.para.(tlh)上下游引物P7、P8各0.25μL，5U/μL Taq酶0.2μL，E.bact.的DNA模板4μL，L.mono.的DNA模板5μL，A.hydr.的DNA模板6μL，V.para.的DNA模板2μL，ddH2O补足至25μL。扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃60s，35个循环；终延伸72℃10min；4℃保存。取PCR扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶(1.5％)电泳检测扩增结果；
将以上PCR产物在0.5×Tris硼酸(TBE)、2.0％琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察。
4、多重PCR最佳反应条件的摸索
分别用4对引物进行4种细菌模板多重PCR最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等的测定，然后根据实验结果进行多重PCR最佳循环次数的测定。结果测得多重PCR，退火温度为54℃-58℃均可，其中以56℃效果最佳；10mmol/L dNTP的剂量2μL、2.5μL、3μL、3.5μL均可，最终选择3μL为最佳使用量，因为使用量较少且条带清晰；25μL反应体系中所加的5U/μL Taq酶剂量0.25μL、0.20μL、0.15μL、0.10μL、0.05μL，其中以0.20μL和0.25μL效果最佳，因0.20μL用量较少作为最佳添加量；多重PCR循环次数28～35个均可，但35个循环次数效果明显。多重PCR反应条件范围：10mmol/L dNTP2-3.5μL，5U/μL Taq酶0.10-0.25μL，28～35个循环次数。多重PCR最佳反应条件：10mmol/L dNTP3μL，5U/μLTaq酶0.20μL，35个循环次数。
5、多重PCR灵敏度检测
取28℃培养18h的阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌菌液选择热裂解法提取各个菌体DNA模板，10倍梯度稀释后，相同稀释度不同菌的DNA模板同比例混合，采用优化好的多重PCR体系进行灵敏度的检测。多重PCR能同时检测反应体系中DNA最低浓度为阴沟肠杆菌3.42×102pg/mL，产单核细胞增生李斯特菌4.55×102pg/mL，嗜水气单胞菌4.20×102pg/mL，副溶血弧菌2.23×102pg/mL。
6、多重PCR特异性测定
分别对副溶血弧菌、溶藻弧菌、粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌属、苏云金杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等细菌DNA进行提取，利用优化的多重PCR条件分别对单个细菌DNA以及阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌与其他细菌的随机DNA组合进行扩增，以检测其特异性。结果10个菌株中只有阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌能扩增出相应的片段，大小分别为阴沟肠杆菌1250bp，产单核细胞增生李斯特菌768bp和272bp，嗜水气单胞菌483bp，副溶血弧菌454bp，均与预期相符，而其它均未扩增出相应的片段。说明本研究多重PCR方法特异性良好。
7、多重PCR稳定性测定
按照最优多重PCR条件将除模板以外的PCR反应体系混合后分装，放-20℃冻存，按照最佳PCR反应条件定期取出检测。检测期间将预先混合好的PCR混合液放置在-20℃条件下保存1、2、3、4、5个月仍能扩增出和现配的PCR混合液相似清晰的条带，此试验还在进行中，最终时间还没有最终确定。但通过将近半年的检测可以看出该试剂的稳定性较好，至少能保持5个月以上；
8、多重PCR海水样品检测
采取12份环境海水样品以及9份养殖海水样品，用多重PCR检测，同时与常规方法检测进行比较。PCR检测结果与常规细菌分离鉴定结果完全吻合。

Claims (5)

1.一种用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物，其特征在于：该四种致病菌的多重PCR引物分别包括阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物； 
其中，阴沟肠杆菌的上下游引物为： 
P1：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’； 
P2：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’； 
产单核细胞增生李斯特菌的上下游引物为： 
P3：5’-TTCCGCAGAGGACAGTGATG-3’； 
P4：5’-CATATTCCACTTTAACCGTG-3’； 
嗜水气单胞菌的上下游引物为： 
P5：5’-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’； 
P6：5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’； 
副溶血弧菌的上下游引物为： 
P7：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’； 
P8：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’。 
2.根据权利要求1所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物，其特征在于：所述阴沟肠杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，所述产单核细胞增生李斯特菌引物对应的PCR扩增片段大小为768bp和272bp，所述嗜水气单胞菌引物对应的PCR扩增片段大小为483bp，所述副溶血弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为454bp。 
3.一种根据权利要求1所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于：包括以下步骤： 
步骤1，利用引物设计软件设计同时检测阴沟肠杆菌、产单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20-24个，引物的熔解温度Tm值为55℃-65℃，引物的GC％为40％-60％； 
步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物； 
步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5； 
步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照 步骤3进行再次判断； 
步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证； 
步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。 
4.一种应用如权利要求1所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤： 
1)细菌的初步分离：从培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板； 
2)多重PCR扩增包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述DNA模板2～8μL，反应体系为20-30.0μL，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶5U/μL，0.1-0.25μL，PCR缓冲液2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μL，引物P1、P2各0.5-2μL，P3、P4各0.75-1.5μL，P5、P6各0.75-1.5μL，P7、P8各0.25-1.0μL，余量用重蒸水补足；b、扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。 
5.根据权利要求4所述的用于同时检测海洋中四种致病菌的多重PCR引物的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤a中引物P1、P2各2μL，P3、P4各0.75μL，P5、P6各0.75μL，P7、P8各0.25μL。 
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