JP6309005B2 - アルブミンを精製するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、概して、溶液からアルブミンを精製する方法に関する。より具体的には、アルブミン濃縮溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通して精製する(polishing)方法に関する。

背景
市販のヒト血清アルブミン(HSA)の大部分は、最初にCohnら[1946]により開発されたものに基づくエタノール沈殿法及びKistler及びNitschmann[1962]のその後の改良を使用して製造される。これらの方法を使用する分離は、様々なエタノール濃度、pH、イオン強度及び温度での血漿タンパク質の溶解度に基づく。しかし、アルブミンの精製のためのCohn精製法の主要な不利な点は、40％体積／体積までのエタノール濃度の使用及びこの手順を０℃未満で行う必要があるということである。それにも関わらず、エタノール沈殿によるアルブミン精製の持続した成功は、これらの方法が現代の血漿分画プロセスにおいて遭遇する大量処理において非常に有効であるという事実に主に起因する。

より少量であるが増加する量のアルブミンは、最初のエタノール分画後の最終精製工程として[More及びHarvey、1991]又は完全に統合されたクロマトグラフィープロセス[Marrs、1993；Yapら、1993；Martinsら、2011；Berglofら、1983]のいずれかとして、クロマトグラフィープロセスを使用して今では分割される。HSAのクロマトグラフィー精製は、より高い収率、より高い純度[More及びHarvey、1991；Yapら、1993；Veronら、1993]、より少ない凝集体、並びに改善された認容性及び臨床上の安全性[Cheら、2006]を含む多数の利益を有する。例えばBerglofら[1983]により最初に開発されたクロマトグラフィー法は、最初に上清II＋III供給流に適用され、そして２つのイオン交換及びサイズ排除カラムの使用を含む。この方法は、Intragam Pのための高いIgG収量が得られるクロマトグラフィープロセスに適合するように脱脂された上清Ｉに後に適用された[Yapら、1993；Bertoliniら、1999]。

これらの利益にもかかわらず、ヒトアルブミンの分画のためのクロマトグラフィープロセスの幅広い適用は、工業規模でのこれらのプロセスの操作に関連する効率の悪さに起因して限定されてきた。さらに、Berglofら[1983]により報告されるような方法において使用されるアニオン及びカチオン交換クロマトグラフィーは、アルブミンの樹脂への捕捉／結合を含む。アルブミンのアニオン及びカチオン交換カラムへのポジティブな結合は、タンパク質ローディングが100ｇ／Ｌ以下に制限されるということを意味する。このことは、ヒト血漿がアルブミンを主たるタンパク質として含有する（総タンパク質の約60〜70％)ということ、従ってアルブミンのクロマトグラフィー精製が大きなカラム(200Ｌ以上)及び多重サイクルを必要とするということを考慮すると、工業適用を限定してきた。これは特に、高分子量不純物タンパク質を除去するためのHSAの最終精製のためのゲルろ過工程を使用する完全なクロマトグラフィープロセスについて明らかである。有効な分離を維持するために必要とされる低流量及び少量サンプルロードは、この工程を、クロマトグラフィーアルブミン製造方法における重大な障害にする。

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本発明は、アルブミン濃縮溶液を精製するためのより効率的な方法を提供することにより、当該分野における問題を解決するか、又は少なくとも部分的に軽減する。

発明の要旨
本発明の局面において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂にアルブミン濃縮溶液を通すこと、及び樹脂を通ったアルブミン溶液を回収することを含む、夾雑物を除去するためにアルブミンを精製する方法が提供される。

一実施態様において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂は、４−メルカプトエチルピリジンを含む。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は、コーン（Cohn）上清Ｉ、コーン上清II＋III、Kistler−Nitschmannからの上清又はろ液、コーン上清IV及びコーン画分Ｖから選択される。一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は透析ろ過された（diafiltered）コーン上清Iである。一実施態様において、Kistler−Nitschmann Nitschmannからの上清又はろ液は上清／ろ液Ａ又はＢである。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は、血漿又は透析ろ過されたコーン上清Ｉをアルブミンに対してネガティブモードで膨張床吸着樹脂に通した場合に回収される通過画分（flow through）溶液である。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は脱脂され、かつ真性グロブリンを枯渇している。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通す前に、前記方法は、（ａ）アルブミンに対してネガティブモードで該溶液をアニオン交換樹脂に通す工程、及び（ｂ）アルブミンに対してネガティブモードで該溶液をカチオン交換樹脂に通す工程を含む。一実施態様において、前記方法は、工程（ａ）のアニオン交換樹脂からの通過画分を、工程（ｂ）におけるカチオン交換樹脂に通すことを含む。別の実施態様において、該方法は、工程（ｂ）のカチオン交換樹脂からの通過画分を、工程（ａ）におけるアニオン交換樹脂に通すことを含む。

一実施態様において、該方法は精製アルブミン溶液を低温殺菌することを含む。

本発明の別の局面において、本明細書に開示される方法により回収された精製アルブミン溶液が提供される。

本発明の別の局面において、本明細書に開示される方法により製造された低温殺菌アルブミン溶液が提供される。

本発明の別の局面において、精製アルブミン溶液を含み、かつ５ＮＴＵ未満の濁度を有する組成物が提供される。一実施態様において、該組成物は:
（ａ） ８０ｍＭより多いナトリウム；
（ｂ） １９％質量／体積より多いアルブミン；
（ｃ） ４μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡ；
（ｄ） ０．１ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ；
（ｅ） ０．０３ｍｇ／ｍＬ未満のアポリポタンパク質Ａ１；
（ｆ） ０．０７ｍｇ／ｍＬ未満のα１−プロテイナーゼ阻害剤；及び／又は
（ｇ） １％質量／体積未満の凝集体／ポリマー
を含む。

本発明の別の局面において、
少なくとも19％質量／体積の総タンパク質、並びに以下:
（ａ） 総タンパク質のうち少なくとも９５％のアルブミン含有量；
（ｂ） ２％質量／体積未満の凝集体、好ましくは１％質量／体積未満の凝集体；
（ｃ） ２％質量／体積未満、より好ましくは１．５％質量／体積未満の二量体含有量；（ｄ） 少なくとも９７％質量／体積の単量体含有量；
（ｅ） ０．５％質量／体積未満のフラグメント含有量；
（ｆ） ２８．６ＩＵ／ｍＬ未満のプレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）、より
好ましくは１０ＩＵ／ｍＬ未満のＰＫＡ、なおより好ましくは１ＩＵ／ｍＬ未満のＰＫＡ；
（ｇ） ０．１％質量／体積未満のα₂−マクログロブリン；
（ｈ） ０．０１％質量／体積未満のアポリポタンパク質Ａ１；
（ｉ） ０．０５％質量／体積未満のトランスフェリン；
（ｊ） ０．０５％質量／体積未満のα₁−糖タンパク質；
（ｋ） ０．１％質量／体積未満のα₁−プロテイナーゼ阻害剤、好ましくは０．０５％質量／体積未満のα₁−プロテイナーゼ阻害剤；
（ｌ） ０．０５％質量／体積未満のハプトグロビン；
（ｍ） ０．１％質量／体積未満のインター−α−トリプシン（ｉｎｔｅｒ−α−ｔｒｙｐｓｉｎ）阻害剤；
（ｎ） 約４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウム、好ましくは約８０ｍｍｏｌ／Ｌ〜９０ｍｍｏｌ／；
（ｏ） ５μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡ、好ましくは２μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡ；
（ｐ） ０．２ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ；（ｑ） １１０μｇ／Ｌ未満のアルミニウム、８０μｇ／Ｌ未満のアルミニウム、より好ましくは３０μｇ／Ｌ未満のアルミニウム；
（ｒ） ４０ｍｍｏｌ／Ｌ未満のカプリレート；
（ｓ） 約１３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ〜約１４０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧；及び
（ｔ） ６ＮＴＵ未満、好ましくは３ＮＴＵ未満の濁度
のいずれか又はそれ以上を含む、精製アルブミン溶液が提供される。

図１は、pH調整CM溶出液のMEP Hypercel精製の間のα2−マクログロブリンについての不純物ブレイクスルー（break through）プロフィールを示す。これらの結果は、1000mLまでのサンプル体積にわたって調べた、通過画分において検出された不純物(α2−マクログロブリン)の量を示す。 図２は、pH調整CM溶出液のMEP Hypercel精製の間のIgGについての不純物ブレイクスループロフィールを示す。これらの結果は、1000mLまでのサンプル体積にわたって調べた、通過画分において検出された不純物(IgG)の量を示す。 図３は、pH調整CM溶出液のMEP Hypercel精製の間のIgAについての不純物ブレイクスループロフィールを示す。これらの結果は、1000mLまでのサンプル体積にわたって調べた、通過画分において検出された不純物(IgA)の量を示す。 図４は、pH調整CM溶出液のMEP Hypercel精製の間のIgMについての不純物ブレイクスループロフィールを示す。これらの結果は、1000mLまでのサンプル体積にわたって調べた、通過画分において検出された不純物(IgM)の量を示す。

詳細な説明
本明細書全体を通して、文脈が別のものを必要としなければ、語「含む（comprise）」、又は「含む（comprises）」もしくは「含むこと」のような変形は、記載された要素もしくは整数又は要素もしくは整数の群を含むことを示すが、他のいずれの要素もしくは整数又は要素もしくは整数の群も排除することは示さないと理解されるだろう。

本明細書における、いずれかの先行刊行物（又はそれに由来する情報）、又は公知であるいずれかの事柄への言及は、先行刊行物(又はそれに由来する情報)又は公知の事柄が、本明細書が関連する努力の分野における一般知識の一部を形成するということの承認でも了解でもなく、示唆のいずれの形態でもなく、承認とも了解とも示唆のいずれかの形態とも解釈されるべきではない。

本明細書において使用される単数形「ａ」、「an」及び「the」は、文脈が明確にそうではないと指示していなければ、複数形の状況を含むということに留意しなければならない。従って、例えば「樹脂（a resin）」への言及は、１つの樹脂も２つ又はそれ以上の樹脂も含み；「組成物（the composition）」への言及は、１つの組成物も２つ又はそれ以上の組成物も含むなどである。

反対のいずれの指示もない場合は、本明細書全体を通して「％」含有量は、％w／ｖ(質量／体積)を意味すると解釈されるべきである。

アルブミン及びIgGは、血漿から抽出される最も商業的に重要な製品のうちの２つである。Cohn法により、エタノール濃度、温度、伝導率及びｐHの特定の条件下で、IgG及びアルブミンが豊富な中間画分(上清（Supernatant）I)が生成される。次いで画分（Fraction）II＋III及び上清II＋IIIが生成され、これらはそれぞれIgG及びアルブミンが豊富である。次いで、上記のパラメータを操作することによりさらなる精製が達成される。しかし、Cohn精製法の主な不利な点は、エタノールの使用、及び手順を０℃未満の温度で行う必要性である。特にアルブミンの精製は、高濃度のエタノール(コーン画分IV及びＶには40％質量／体積まで)を必要とする。

本発明は、アルブミンに対してネガティブモードでアルブミン濃縮溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通すこと、及び樹脂を通過したアルブミン溶液を回収することが、溶液中のアルブミンを精製する（polishing (purifying)）ための既存のクロマトグラフィープロセスの有効な代替であり、得られた精製アルブミン溶液が既存のクロマトグラフィープロセスを使用して入手可能なものより高い純度を有するという発見に一部基礎を置く。疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通して精製する前にイオン交換クロマトグラフィー工程を組み合わせることにより、本発明の方法は、既存の方法よりもなおより高いレベルの純度を有するアルブミン溶液を提供し得るということも見出された。これらのクロマトグラフィー工程がアルブミンの精製のための既存の下流産業プロセスに組み込まれ得るという事実と組み合わせた場合、これは、血漿分別産業に、他の分別工程を補完する有効な分離技術を提供する。

本発明の局面において、高分子量夾雑物を除去するためにアルブミンを精製する方法が提供され、該方法は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂にアルブミン濃縮溶液を通すこと、及び該樹脂を通過したアルブミン溶液を回収することを含む。

クロマトグラフィーを使用してアルブミンのような血液由来品を不純物（例えば、免疫グロブリンのような高分子量不純物）から分画する方法は、当業者によく知られているだろう。大部分のクロマトグラフィープロセスは、樹脂又はマトリックスとも本明細書において交換可能に言及される固体支持体を使用する。適切な固体支持体は当業者によく知られており、そして選択は精製しようとする製品の種類に常に依存する。適切な固体支持体の例としては、無機担体、例えばガラス及びシリカゲル、有機、合成又は天然に存在する担体、例えばアガロース、セルロース、デキストラン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、二官能性アクリレート及び様々なヒドロキシル化モノマーのビニルコポリマーなどが挙げられる。市販の利用可能な担体は、Sephadex^TM、Sepharose^TM、Hypercel^TM、Capto^TM、Fractogel^TM、MacroPrep^TM、Unosphere^TM、GigaCap^TM、Trisacryl^TM、Ultrogel^TM、Dynospheres^TM、Macrosorb^TM及びXAD^TM樹脂の名称で販売されている。

クロマトグラフィー工程は、一般的には非変性条件下でかつ約−10℃〜＋30℃の範囲の都合の良い温度で、より通常には周囲温度付近で行われる。クロマトグラフィー工程は、都合に応じてバッチ式又は連続的に行われ得る。遠心分離、ろ過、デキャンティングなどのようないずれかの都合の良い分離方法が使用され得る。

疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(HCIC)は当業者によく知られている。HCICは固体支持体に結合された結合部分を使用し、ここで結合部分は、本発明の方法に従って、高分子量不純物（例えば免疫グロブリン）である検体に対する特異性を有する。HCICは、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のような他の種類のアフィニティークロマトグラフィーとは異なり、タンパク質の表面疎水性の差異に基づいて血漿タンパク質を分離するための選択性を提供する[Goheen & Matson、1985; Ramos−Clamont et al.、2006]。HICにより得られる選択性は、ヒト血漿[Rucheton et al.、1997]、ヒト胎盤[Cabrera−Crespo et al.、2000]からのアルブミンの精製及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）由来の組換えHSA[Ohmura et al.、1995]のためにHICを首尾良く使用することを可能にした。しかし、アルブミンのクロマトグラフィー精製のために使用されるイオン交換工程に分離の直交モード（orthogonal mode）を提供するHICにもかかわらず、これらのマトリックス又は樹脂は、市販の血漿成分分画器（plasma fractionators）のいずれによっても使用されない。ラージスケールでのHICの採用を制限する要因は、これらの方法が、適切な分離条件を達成するために相当量の離液性塩の使用を必要とするという事実[Burton & Harding、1998]である。いくつかの適用は、所望の分離を達成するために平衡緩衝液及びサンプルのために高濃度でのこれらの塩の使用を必要とする。さらに、アルブミン画分中の高濃度の塩の存在は、様々なウイルス不活化及び最終製剤化工程の前に大規模な透析／透析ろ過（diafiltration）を必要とする。

当業者に公知のいずれかの適切なHCIC樹脂を使用することができる。一実施態様において、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂は、４−メルカプトエチルピリジン(MEP)(例えば、MEP Hypercel)を含む。MEPリガンドは、タンパク質の表面疎水性に基づいた分離を可能にするが、他のアルブミン精製方法においてしばしば見られる離液性塩の添加を必要としないという利点を有する[Burton & Harding、1998; Schwartz et al.、2001]。MEP Hypercelは、免疫グロブリンに対して高い選択性を有することが示されており、そしてこの理由のために、モノクローナル抗体の単離のためのこの媒体の使用に焦点が合わせられてきた[Schwartz et al.、2001; Ghose et al.、2006; Arakawa et al.、2010; Pezzini et al.、2011]。さらに、MEP Hypercelは、ペニシリンアシラーゼ[Coulon et al.、2004]及びFc−融合タンパク質[Arakawa et al.、2009]の分離に有効であることが判明した。

伝統的な疎水性相互作用クロマトグラフィーと対照的に、HCICは塩濃度でなくｐHに基づいて制御される。

MEP Hypercel樹脂は、４−メルカプト−エチル−ピリジン(4−MEP)が連結されたセルロースマトリックスから構成される。セルロースビーズは、高多孔率、化学的安定性、及び低い非特異的相互作用をもたらす。MEP Hypercelのビーズサイズは、容量と流動性との間の良好な妥協を可能にするために約80〜100μmである。MEPはまた、高分子量免疫グロブリン不純物に対して高い選択性及び能力を示し、そして約4.8のpKaを有する。これは疎水性テール及びイオン性（ionizable）ヘッド基を含有する。生理的pHで、芳香族ピリジン環は非荷電であり疎水性である。結合へのさらなる寄与は、脂肪族スペーサーアームによりもたらされる。例えば免疫グロブリンに対する結合は、他の基との相互作用によりさらに強調される。リガンド構造及びリガンド密度の両方は、離液性又は他の塩が存在しない場合に有効な結合をもたらすように設計される。移動相のpHが4.8未満(典型的にはpH4.0)の値に調整される場合、リガンドは明確な正電荷を帯びる。このような条件下で、免疫グロブリンもまた正電荷を有する。静電反発が誘導され、そして免疫グロブリンが脱着される。イオン性MEPリガンドのpH依存性挙動はデュアルモード特性をもたらし、これによりタンパク質が疎水性相互作用を通じて相互作用し、そして静電反発により溶離が起こることが可能となる。伝統的な疎水性相互作用媒体は、非イオン性であるアルキル基に基づくものである。

従ってMEP Hypercelは、アルブミンの製造における精製工程として使用され得る。この方法は、イオン交換クロマトグラフィーにより最初に精製されたアルブミンの精製に適用され得る。従って統合された実験室規模のバッチがMEP Hypercelを使用して製造され得、得られるアルブミンはSephacryl S200HRのような樹脂を利用する既存の方法より高い純度を有する。

MEP Hypercel樹脂は、高い結合能力及び高い流量をもたらし、小規模及び大規模抗体精製適用のために理想的である。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は、コーン上清Ｉ、コーン上清II＋III、上清／ろ液Ａ、コーン上清IV及び画分Ｖから選択される。一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は透析濾過されたコーン上清Ｉである。

従って、一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は、血漿又は透析ろ過されたコーン上清Ｉをアルブミンに対してネガティブモードで膨張床吸着樹脂に通した場合に回収される通過画分溶液である。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液は脱脂され、かつ真性グロブリンを枯渇している。

本明細書で使用される表現「アルブミン濃縮溶液」は、アルブミンと免疫グロブリンのような高分子量不純物とを含む溶液を示すために「粗製アルブミン画分」のような表現と交換可能に使用される。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通す前に、前記方法は、（ａ）アルブミンに対してネガティブモードで該溶液をアニオン交換樹脂に通す工程、及び（ｂ）アルブミンに対してネガティブモードで該溶液をカチオン交換樹脂に通す工程を含む。

イオン交換(アニオン又はカチオン交換)クロマトグラフィーは、当業者によく知られており、そして溶液からタンパク質及び他の荷電した分子の精製のための最も一般的な方法の１つを代表する。カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、正に荷電した分子は負に荷電した固体支持体に引きつけられる。逆に、アニオン交換クロマトグラフィーでは、負に荷電した分子が正に荷電した固体支持体に引きつけられる。

(カチオン交換クロマトグラフィーにおいて使用されるような)負に荷電した固体支持体及び（アニオン交換クロマトグラフィーにおいて使用されるような）正に荷電した固体支持体は、当業者に公知のいずれかの手段により製造され得、そして通常は固体支持体上への荷電官能基の共有結合を含む。適切な荷電官能基は当業者によく知られており、そして使用される官能基の種類は溶液から分離しようとする分子に常に依存するだろう。適切なカチオン交換樹脂の例は、スルホン官能基(S又はSP)又はカルボキシメチル官能基(CM)を含むものである。適切なアニオン交換樹脂の例は、第四級アミン官能基(Ｑ)及び／もしくは第三級アミン基(DEAE)、又はジエチルアミノプロピル基(ANX)を含むものである。本発明の実施態様において、アニオン交換マトリックスは、多糖ポリマーに共有結合で連結されたジエチルアミノエタノールを含む。本発明の実施態様において、カチオン交換マトリックスは、多糖ポリマーに共有結合で連結されたカルボキシメチル基を含む。

本発明の実施態様において、イオン交換クロマトグラフィー工程を行うための条件は、免疫グロブリン(例えば、IgG、IgA及びIgM)のような不純物のアルブミン溶液からの除去に有利に働く。

アルブミン濃縮溶液中の荷電した不純物の、固体支持体に結合された反対に荷電した官能基への結合を最適化するために、アルブミン溶液は一般的には低伝導率から中程度の伝導率(すなわち、低塩濃度から中程度の塩濃度を有する)のものである。アルブミン溶液中の荷電した不純物の固体支持体への吸着は、不純物中の反対に荷電したイオン性基と支持体上の官能基リガンドとの間のイオン相互作用により駆動される。相互作用の強度は不純物上及び官能基上の電荷の数及び位置により決定される。塩濃度を増加させることにより(一般的に線形塩グラジエントを使用することにより)、最も弱いイオン相互作用を有する分子(すなわち、アルブミン)は最初にカラムから溶出し始め、そして通過画分で回収される。より強いイオン相互作用を有する分子(例えば、免疫グロブリンのような不純物)は、より高い塩濃度を必要とし、グラジエントのより後方で溶出する。イオン交換樹脂の結合能は一般的には非常に高い。このことは工業規模のクロマトグラフィーにおいて重大であるが、分析規模の適用にはそれほど決定的ではない。

当業者は、ｐHの変化もまたイオン交換クロマトグラフィーによる分離に影響を及ぼし得るということを理解する。例えばカチオン交換クロマトグラフィーにおいて、移動相緩衝液のｐHを上げることにより、分子のプロトン化を減少させ、そしてそれ故、正電荷が減少する。この結果は、タンパク質がもはや負に荷電した固体支持体とイオン相互作用を形成できなくなり、最終的に分子のカラムからの溶出を生じるということである。アニオン交換クロマトグラフィーにおいて、移動相緩衝液のpHを下げることにより、分子のプロトン化を増加させ、そしてそれ故、より正に(かつ負により少なく)荷電される。この結果は、タンパク質がもはや正に荷電した固体支持体とイオン相互作用を形成できなくなり、分子のカラムからの溶出を生じるということである。

移動相緩衝液のpHは、荷電分子のpI(等電点)又はpKa(酸解離定数)と固体支持体上の荷電基のpKaとの間であり得る。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、1.2のpKaを有する固体支持体上の官能基を使用して、8.2のpIを有するサンプル分子はpH6.0の移動相緩衝液中を移動し得る。アニオン交換クロマトグラフィーにおいて、6.8のpIを有する分子は固体支持体のpKaが10.3である場合にpH8.0で移動相緩衝液中を移動し得る。

直線的に増加する塩濃度のグラジエントもまた、必要に応じて、アルブミン濃縮溶液が回収された後に固体支持体から結合した化合物（すなわち不純物）を溶出させるために適用され得る。線形グラジエントを使用することの代替は段階グラジエントを使用することである。これはより複雑でない装置を必要とし、そして通常は線形グラジエント実験から塩の適切な濃度が既知である場合には、異なる画分を溶出させるために非常に効果的であり得る。本発明に従うクロマトグラフィー工程は、アルブミンに対してネガティブモードで行われ、この場合、出発アルブミン溶液中の不純物は荷電した固体支持体上に保持され、そしてアルブミンは通過画分中に回収される。不純物(アニオン又はカチオン)は固定相(すなわち、固体支持体)上に保持され、そして必要に応じて、不純物イオンを置き換える同様に荷電した化学種の濃度を増加させることによりその後固定相から溶離され得る。例えば、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、正に荷電した不純物は、正に荷電したナトリウムイオンの添加により置き換えられ得る。

クロマトグラフィーは、GE Healthcare、Pall Corporation及びBio−Radから入手可能なもののような軸流カラムを使用して、又はProxcysから入手可能なもののような放射状流カラムのいずれかを使用して行われ得る。クロマトグラフィーはまた、膨張床技術を使用して行われ得る。

本発明の方法はまた、アルブミンの精製を改善するための多段階イオン交換クロマトグラフィーの使用を採用し得る。多段階イオン交換クロマトグラフィー工程の使用は、１つより多くのアニオン交換樹脂又は１つより多くのカチオン交換樹脂を使用し得る。この方法はまた、複数のアニオン及びカチオン交換樹脂も使用し得る(すなわち、１つより多くのアニオン交換樹脂及び１つより多くのカチオン交換樹脂)。

当業者には当然のことながら、本発明の多段階イオン交換クロマトグラフィー工程をどの順番で行うかは問題にならない。従って、一実施態様において、工程(ａ)のアニオン交換樹脂からの通過画分を工程(ｂ)のカチオン交換樹脂に通す。別の実施態様において、工程(ｂ)のカチオン交換樹脂からの通過画分を工程(ａ)のアニオン交換樹脂に通す。

一実施態様において、アルブミン濃縮溶液をイオン交換樹脂に通す場合、本発明の方法に従って、工程(ａ)及び／又は(ｂ)からのアルブミン濃縮通過画分を集めて、その後の分画（精製）のために無期限に貯蔵することができる。別の実施態様において、工程(ａ)及び(ｂ)から回収されたアルブミン濃縮通過画分を、本発明の方法に従って疎水性電荷誘導樹脂に直接通す。

本発明に従うクロマトグラフィー工程はアルブミンに対してネガティブモードで行われるべきなので、当業者には当然のことながら、本発明に従うイオン交換クロマトグラフィー工程のための条件は、固体支持体への不純物の保持に有利に働き、通過画分中へのアルブミンの回収を可能にする。血漿中のアルブミン純度が最初は約60〜70％であることを考えると、より少ない不純物タンパク質を結合するクロマトグラフィー工程は、アルブミンを捕捉するよりも相当効率的である。DEAE Sepharose−FFのようなイオン交換樹脂でのアルブミン捕捉のための典型的なタンパク質ロードは50〜65ｇ／Ｌであり、そしてCM Sepharose−FFのようなイオン交換樹脂でのアルブミン捕捉については50〜100ｇ／Ｌである。アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー工程のためのネガティブモードクロマトグラフィーの使用は、500ｇ／Ｌ以上のローディングを可能にし得る。

本発明の実施態様において、本方法は、工程(ａ)及び工程(ｂ)の間にアルブミンに対してポジティブモードでの介在するクロマトグラフィー工程を含まない。しかし、本発明の方法は、アルブミンに対してポジティブモードで行われるさらなる工程を含んでいてもよく、この場合、これらのさらなる工程はイオン交換クロマトグラフィー工程(ａ)又は(ｂ)の間に行われない。例えば、Capto DEAE樹脂は、通過画分中の粗製IgG画分を分離し、ついで本発明の方法によるその後の精製のためにCapto DEAE樹脂からアルブミンを溶出するために、ポジティブモード（すなわち、アルブミンを捕捉するため）で使用され得る。

本発明の別の局面において、本明細書において開示される方法により回収された精製アルブミン溶液が提供される。

一実施態様において、本方法はさらに、精製アルブミン溶液を低温殺菌することを含む。本発明の方法は、既存のクロマトグラフィー方法により製造された精製アルブミン溶液において見出される濁度レベル(比濁分析濁度単位（Nephelometric Turbidity Units）；NTUにより測定)と比較して、低温殺菌された場合により低い濁度を有する精製アルブミン溶液を生じるということが見出された。濁度レベルは、アルブミン溶液中の高分子量不純物（例えば、免疫グロブリン）の存在の尺度である。一実施態様において、低温殺菌されたアルブミン溶液は5NTU未満の濁度を有する。

本発明の別の局面において、本明細書に開示される方法により製造された低温殺菌アルブミン溶液が提供される。

いくつかの実施態様において、本発明の組成物又は精製アルブミン溶液は、少なくとも４％質量／体積の精製アルブミンを含む。いくつかの実施態様において、本発明の組成物又は精製アルブミン溶液は、４％〜５％質量／体積の精製アルブミンを含む。いくつかの実施態様において、本発明の組成物又は精製アルブミン溶液は、19％質量／体積より多くの精製アルブミンを含む。いくつかの実施態様において、本発明の組成物又は精製アルブミン溶液は、20％〜25％質量／体積の精製アルブミンを含む。

本発明の別の局面において、低温殺菌アルブミン溶液を含み、かつ5NTU未満の濁度を有する組成物が提供される。さらなる実施態様において、本組成物は:
（ａ） ８０ｍＭより多いナトリウム;
（ｂ） １９％質量／体積より多いアルブミン；
（ｃ） ４μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡ；
（ｄ） ０．１ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ；
（ｅ） ０．０３ｍｇ／ｍＬ未満のアポリポタンパク質Ａ１；
（ｆ） ０．０７ｍｇ／ｍＬ未満のα１−プロテイナーゼ阻害剤；及び／又は
（ｇ） １％質量／体積未満の凝集体／ポリマー
を含む。

本発明の別の局面において、少なくとも１９％質量／体積の総タンパク質、並びに以下：
（ａ） 総タンパク質のうち少なくとも９５％のアルブミン含有量；
（ｂ） ２％質量／体積未満の凝集体、好ましくは１％質量／体積未満の凝集体；
（ｃ） ２％質量／体積未満、より好ましくは１．５％質量／体積未満の二量体含有量；（ｄ） 少なくとも９７％質量／体積の単量体含有量；
（ｅ） ０．５％質量／体積未満のフラグメント含有量；
（ｆ） ２８．６ＩＵ／ｍＬ未満のプレカリクレイン活性化因子（ＰＫＡ）、より好ましくは１０ＩＵ／ｍＬ未満のＰＫＡ、なおより好ましくは１ＩＵ／ｍＬ未満のＰＫＡ；
（ｇ） ０．１％質量／体積未満のα₂−マクログロブリン；
（ｈ） ０．０１％質量／体積未満のアポリポタンパク質Ａ１；
（ｉ） ０．０５％質量／体積未満のトランスフェリン；
(j) 0.05％質量／体積未満のα₁−糖タンパク質;
（ｋ） ０．１％質量／体積未満のα₁−プロテイナーゼ阻害剤、好ましくは０．０５％質量／体積未満のα₁−プロテイナーゼ阻害剤；
（ｌ） ０．０５％質量／体積未満のハプトグロビン；
（ｍ） ０．１％質量／体積未満のインター−α−トリプシン（ｉｎｔｅｒ−α−ｔｒｙｐｓｉｎ）阻害剤；
（ｎ） 約４５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約１００ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウム、好ましくは約８０ｍｍｏｌ／Ｌ〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ；
（ｏ） ５μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡ、好ましくは２μｇ／ｍＬ未満のＩｇＡ；
（ｐ） ０．２ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のＩｇＧ；（ｑ） １１０μｇ／Ｌ未満のアルミニウム、８０μｇ／Ｌ未満のアルミニウム、より好ましくは３０μｇ／Ｌ未満のアルミニウム；
（ｒ） ４０ｍｍｏｌ／Ｌ未満のカプリレート；
（ｓ） 約１３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ〜約１４０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧；及び
（ｔ） ６ＮＴＵ未満、好ましくは３ＮＴＵ未満の濁度
のいずれか１つ又はそれ以上を含む精製アルブミン溶液が提供される。

当業者には当然のことながら、本明細書に記載される発明は、具体的に記載されるもの以外の変形及び改変を受け入れる余地がある。本発明が精神及び範囲内に含まれる全てのこのような変形及び改変を包含するということが理解されるべきである。本発明はまた、個別に又は集合的に、本明細書において言及されるか又は示される工程、特徴、組成物、及び化合物のすべて、並びに上記工程又は特徴のうちのいずれか２つ又はそれ以上のいずれか及び全ての組み合わせを包含する。

本発明の特定の実施態様は、ここで以下の実施例を参照して記載され、これら実施例は、説明の目的のみであり、本明細書に前記した一般概念の範囲を限定することを意図されない。

材料及び方法
タンパク質溶液：精製ヒト血清アルブミン(HSA)及び精製ヒト免疫グロブリンＧ(IgG)をCSL Biotherapies(Broadmeadows、Victoria、Australia)から入手した。脂質及び真性グロブリンを枯渇したコーン上清I(SNI)、CM Sepharose−FFクロマトグラフィーからのアルブミン溶出液、及びSephacryl S200HRクロマトグラフィーからの精製アルブミンを含む加工中間体をCSL Biotherapies(Broadmeadows、Victoria、Australia)から入手した。全てのタンパク質溶液を、クロマトグラフィー前に0.22μm膜(Durapore^(R)、Millipore Corporation、Bedford、MA、USA)に通してろ過した。

抗体及びELISA試薬: 免疫電気泳動に使用した、トランスフェリン、α₂−マクログロブリン、α₁−糖タンパク質、α₁−アンチトリプシン、インターαトリプシン阻害剤、ハプトグロビン、アポリポタンパク質A1、アポリポタンパク質Ｂ及びセルロプラスミンのヒト血漿タンパク質に対する抗体をThe Binding Site(Birmingham、England)、Siemens Healthcare Diagnostics、Inc. (New York、USA)及びDako Denmark A／S (Glostrup、Denmark)から入手した。IgG、IgM、AMGのためのELISAキットをBethyl Laboratories Inc.(Texas、USA)から入手した。IgA ELISAのための抗体及びIgA標準をDako Denmark(Glostrup、Denmark)から入手した。比濁分析に使用した、アルブミン、IgG、IgA及びIgMのヒト血漿タンパク質に対する抗体を(Beckman−Coulter Inc. (Fullerton、CA、USA)から入手した。

クロマトグラフィー樹脂: MEP Hypercel樹脂をPall Life Sciences (East Hills、NY、USA)から入手した。DEAE Sepharose−FF、Capto DEAE、CM Sepharose−FF及びSephacryl S200HR樹脂をGE Healthcare BioSciences AB(Uppsala、Sweden)から入手した。

実施例１: Sephacryl S200HRプロセスの特徴付け
MEP Hypercelについての開発研究を開始する前に、アルブミン中間体中に存在する主な夾雑物タンパク質を同定し、そしてこれらの夾雑物の除去におけるSephacryl S200HRの有効性を理解するために、現在のSephacryl S200HR精製工程を十分特徴づけした。Sephacryl S200HRクロマトグラフィー前後のアルブミン中間体を、比濁分析(IMMAGE Immunochemistry system、Beckman−Coulter Inc.、Fullerton、CA、USA)を使用して特徴づけし、アルブミン、IgG、IgA及びIgMのレベルを決定し、そして免疫電気泳動を使用してトランスフェリン、α₂−マクログロブリン、α₁−糖タンパク質、α₁−アンチトリプシン、インターαトリプシン阻害剤、ハプトグロビン、アポリポタンパク質A1、アポリポタンパク質B及びセルロプラスミンのレベルを決定した。

Sephacryl S200HRにロードされる濃縮イオン交換アルブミン中間体は、1.42％の不純物タンパク質を含有しており、そのうちα₂−マクログロブリン、IgG及びIgAが主なタンパク質であった(表1)。これらの主要な不純物タンパク質は全て、アルブミンの分子量より相当高い分子量を有し、従ってSephacryl S200HRゲルろ過媒体をこれらの夾雑物の除去に十分の適したものにしている。Sephacryl S200HRクロマトグラフィー工程は、高分子量不純物の除去において有効であり、α₂−マクログロブリン、IgA及びIgMについて94％より高いクリアランス率、そしてIgGの74.0％クリアランスが観察された。Sephacryl S200HR
クロマトグラフィー後に、総不純物含有量は0.19％まで減少し、IgGが存在する最も豊富な不純物タンパク質であった。

実施例２: アルブミン溶液の濁度に対する加熱の影響
市販のアルブミン溶液の安全性記録は主として低温殺菌工程(60℃10時間)を原因とする[More & Harvey、1991]。アルブミン溶液はカプリル酸ナトリウムの添加により安定化されるが、しかしカプリレートにより保護されない夾雑物タンパク質の存在は、低温殺菌の間の熱により誘導される変性に影響を受けやすい。CM Sepharose−FFクロマトグラフィーから溶出されたアルブミン中間体の対照サンプル及びSephacryl S200HRクロマトグラフィー由来の精製アルブミンの中間体サンプルを、限外ろ過(10kDa OMEGA膜；Pall Life Sciences、USA)により15−20％質量／体積まで濃縮し、そして32mMカプリル酸ナトリウムを調合した。これらのサンプルは低pHカプリレートインキュベーション工程にかけなかった。次いでサンプルを60℃で10時間加熱することにより低温殺菌した。低温殺菌の完了時に、サンプルの濁度をHach 2100AN濁度計(Hach Company、Loveland、CO、USA)を使用して評価した。

98％を超す純度を有し、従ってタンパク質組成(及び純度)についてのアルブミンの薬局方要件に適合する、CM Sepharose−FFクロマトグラフィーに由来するアルブミン溶出液にもかかわらず、高分子量不純物の除去は最終アルブミン製品の品質に重要である。このことは、CM Sepharose−FFクロマトグラフィー由来のアルブミンが濃縮され、カプリル酸ナトリウムを調合され、そして60℃で10時間定温殺菌された場合に、濁度の有意な増加が観察されるという事実により明確に実証される(表2)。Sephacryl S200HR由来の精製されたアルブミンを低温殺菌する場合には濁度の増加は見られなかった。

実施例３: MEP Hypercel操作条件の決定
MEP Hypercelクロマトグラフィーのための操作パラメーターを、アルブミン及びIgGの精製サンプルを使用して検討した。アルブミン及びIgGの結合及び溶出を；50mMリン酸ナトリウム(pH7.0);50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)；50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)＋150mM NaCl；50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)＋300mM NaCl；50mM酢酸ナトリウム(pH7.0);及び110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)を含む様々な平衡条件を使用して別々に決定した。精製IgG及び精製アルブミンサンプルを約５〜10mg／mLの濃度で適切な平衡緩衝液中で調製し、そしてクロマトグラフィー前に0.22μm膜(Durapore^(R)、Millipore Corporation、Bedford、MA、USA)に通して濾過した。サンプルを平衡化MEP Hypercelカラム(17.5cm x 1.6cm ID;GE Healthcare BioSciences AB、Uppsala、Sweden)に樹脂１リットルあたり20ｇでロードした。未結合のタンパク質を、サンプルローディング期間及びその後のサンプル後洗浄の間に平衡緩衝液を使用して回収した。結合したタンパク質を酢酸ナトリウム緩衝液を使用してpH3.0で溶出した。全てのクロマトグラフィー工程を100cm／時の流量で行い、そして280nmでUnicornソフトウェア(GE Healthcare BioSciences AB、Uppsala、Sweden)を備えたAKTA Explorer 900を使用してモニタリングした。流出画分及び溶出液画分中に回収されたタンパク質の量を、比濁法を使用して決定した。

上述の実験からの最も適切な平衡緩衝液条件を、アルブミンとIgGとの９：１混合物を含有するサンプルを使用して検証した。精製アルブミン及び精製IgGを110mM酢酸ナトリウム(pH 7.0)中で９：１の比で混合して約５〜10mg／mLの最終タンパク質濃度にした。100、200及び300ｇ／Ｌのタンパク質ローディングでサンプルを平衡化MEP Hypercelカラムにロードした。未結合のタンパク質を110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)平衡緩衝液を使用して回収し、そして結合したタンパク質を酢酸ナトリウム緩衝液を使用してpH3.0で溶出した。通過画分中のアルブミン及びIgGの量を比濁法を使用して決定した。

Sephacryl S200HRクロマトグラフィー前後のアルブミンサンプルは主要な不純物タンパク質の１つとしてIgGを含有していたので、MEP Hypercelクロマトグラフィー工程の初期開発はIgGからアルブミンを分離するその能力に焦点を合わせた。MEP Hypercelのアルブミンを精製する有効性を、ヒトアルブミン及びヒトIgGの純粋サンプルの結合及び溶出特徴をリン酸ナトリウム(pH7.0)及び酢酸ナトリウム(pH5.5)平衡緩衝液を使用してモニタリングすることにより最初に評価した。Schwartzら[2001]による以前の研究は、MEP HypercelはサンプルpHが約pH7.0に調整された場合に最大結合能を有するということを示した。MEP Hypercelを使用するアルブミンとIgGとの分離もまた、現在アルブミンは酢酸ナトリウム緩衝液を使用してpH5.5でCM Sepharose−FFカラムから溶出されるので、pH5.5で評価した。

pH7.0でのリン酸ナトリウム緩衝液はIgGの結合に有効であり、通過画分中に回収されたIgGは検出できないレベルであった(表3)。同じ条件下で、少量のアルブミンしかMEP Hypercelに結合せず、85％より多くのアルブミンが通過画分中に回収された。pH 5.5の酢酸ナトリウム緩衝液を用いたMEP Hypercelの平衡化は、IgG及びアルブミンの両方の約半分が樹脂に結合する条件をもたらした。酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)への塩化ナトリウムの添加はIgG結合を改善し、通過画分中に回収されたIgGは検出できないレベルであった(表３)。塩化ナトリウムの添加もドロップスルー（drop through）画分中のアルブミン回収を改善した。しかし、この改善にもかかわらず、アルブミンの約15〜20％は溶出液画分中に回収され、これはMEP Hypercelをリン酸ナトリウム緩衝液を使用してpH7.0で平衡化した場合に得られた回収より有意に高かった。

酢酸ナトリウム緩衝液が現在イオン交換クロマトグラフィー工程の間のクロマトグラフィーアルブミンプロセスにおいて使用されることを考慮して、MEP Hypercel樹脂での精製アルブミン及びIgGの結合及び溶出特徴を、酢酸ナトリウム緩衝液を使用してpH7.0で評価した。50mM及び110mMの両方の酢酸ナトリウム緩衝液はpH7.0で、50mMリン酸ナトリウム緩衝液と同様のIgG及びアルブミン回収を生じ、通過画分中で検出されたIgGは検出できないレベルであり、そして溶出液中には少量のアルブミン(全体の約５％)しか検出されなかった(表３)。これらの結果は、平衡緩衝液及びサンプルのｐHがMEP Hypercel樹脂への不純物（例えば免疫グロブリン）の結合に影響を及ぼし得るが、緩衝液の種類並びに平衡化緩衝液及びサンプルの伝導率は最適ｐHでの操作の場合分離にほとんど影響を及ぼさないということを示唆する。

現在のクロマトグラフィーアルブミンプロセスにおいて、アルブミンはCM Sepharose−FFカラムから110mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を使用して溶出される。MEP Hypercelは110mM酢酸ナトリウム緩衝液を使用してpH7.0で平衡化された場合にアルブミンとIgGとの間の良好な選択性を示したので、この緩衝液をさらなる評価のために選択した。これらの条件を選択することにより、CM Sepharoseカラムから溶出されたアルブミンはMEP Hypercelカラムにロードする前にｐH調整工程しか必要としないだろうということを意味する。

表３から決定された最適な平衡化条件を使用して、MEP Hypercelの分離特徴をアルブミンとIgGとの９：１混合物を使用して評価した。MEP Hypercelは、アルブミンとIgGとの混合物の優れた分離を示した。200ｇ／Ｌまでのタンパク質ローディングでは、通過画分は、検出できないレベルのIｇG、及びロードされた総アルブミンのうち９０％超を含有していた(表４)。IgGの大部分は溶出液画分で回収され、そしてアルブミンはこの画分中に少量しか失われていなかった。これらの結果は、MEP Hypercelが、クロマトグラフィーアルブミンプロセスにおけるイオン交換溶出液と同様の組成を有するアルブミン溶液から相当量のIgGを除去することができるということを示唆する。

実施例４：MEP Hypercelを使用するイオン交換精製アルブミンの精製
MEP Hypercelが首尾良くアルブミン及びIgGの混合物を分離し得るということを実証した後、イオン交換精製アルブミンを精製するMEP Hypercelの能力を評価した。CM Sepharose−FFクロマトグラフィーからのアルブミン溶出液をpH 7.0±0.1に調整し、そしてMEP Hypercelカラムにロードする前に0.22μmフィルター(Durapore^(R)、Millipore Corporation、Bedford、MA、USA)に通して清澄化した。アルブミンサンプル(1000mL)を、110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化したMEP Hypercelカラム(17.5cm x 1.6cm ID)にロードし、続いて110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)でサンプル後洗浄を行い、未結合タンパク質を回収し、そして結合したタンパク質を100mM酢酸ナトリウム(pH3.0)及び１M NaOHで洗浄することにより除去した。通過画分を10mL間隔で採取し、そして主要不純物タンパク質のIgG、IgA、IgM及びα₂−マクログロブリンのレベルについてELISAにより評価した。

CM Sepharose−FFカラムからのアルブミン溶出液を精製するその能力を評価することによりMEP Hypercelをさらに評価した。以前に表１に示したように、Table 1、CM Sepharose−FFカラムからの溶出物と同じ組成を含有するSephacryl S200HRクロマトグラフィー前のアルブミンは、IgGに加えてα₂−マクログロブリン、IgA及びIgMを含む他の不純物タンパク質を含有していた。これらの４つの不純物タンパク質を、MEP Hypercelの評価のための純度マーカーとして使用して、クロマトグラフィーアルブミン中に存在する主要な不純物に対するMEP Hypercelの選択性を評価した。

CM Sepharose−FF由来のpH調整アルブミン溶出液(1000mL)をMEP Hypercelカラムにロードし、そして通過画分を10mL間隔で集めた。不純物ブレイクスルー（break through）プロフィールは、４つの不純物タンパク質によって有意に異なっていた(図１〜４)。サンプルローディングの初期段階の間、少量のIgGしか通過画分中に検出されなかった(図２)。ローディングの終盤の間のIgGブレイクスルーの有意な増加にもかかわらず、検出された最大IgG濃度はサンプルロード中のIgG濃度の1.1％にしか相当せず、MEP HypercelがIgGに対して高い選択性を有するということを示唆した。IgAについてのブレイクスループロフィールは、サンプルローディングの全体を通してほとんど直線的な増加に従った(図３)。通過画分において検出された最大IgA濃度は、サンプルロードにおけるIgA濃度の9.3％に相当した。

サンプルローディングの初期段階の間、通過画分中に少量のIgMしか検出されなかった(図４)。サンプルローディングの終盤に向かって、IgMの有意な増加が通過画分中に検出された。サンプルローディングの終盤において検出された最大IgM濃度はサンプルロードのIgM濃度のうち53.1％に相当し、IgMに対するMEP Hypercelの能力又は親和性はIgG及びIgAに対するよりも有意に低いということを示唆した。

相当量のα₂−マクログロブリンが、MEP Hypercelカラム上へのサンプルローディングの開始直後の通過画分中に検出された(図１)。α₂−マクログロブリンブレイクスルーの増加速度は、他の不純物のいずれよりも速く、そして結果として、通過画分において検出された最大α₂−マクログロブリン濃度はサンプルローディングにおけるα₂−マクログロブリンの76.0％であった。α₂−マクログロブリンはCM Sepharose−FFに由来するアルブミン溶出液中の最も豊富な不純物タンパク質であり、かつMEP Hypercelはこのタンパク質に最も弱い親和性を有するので、α₂−マクログロブリンが、MEP Hypercelカラム上へロードされ得るサンプルの量に関するその後の決定のための鍵となる不純物マーカーだろうということが示される。

不純物タンパク質ブレイクスルー曲線の初期分析は、35mL MEP Hypercelカラム上への1000mLまでのサンプルローディングが過剰であることを示した。アルブミンサンプルを、平衡化MEP Hypercelカラム上に100、200、300、400及び500mLでロードした。通過画分及びサンプル後洗浄液をpH3.0溶出液と共にバルクサンプルとして集めた。これらのバルク画分を、比濁分析によりアルブミンレベルについて、並びにIgG、IgA、IgM及びα₂−マクログロブリンの主要な不純物タンパク質についてELISAにより評価した。

CM Sepharose−FF由来のpH調整アルブミン溶出液のMEP Hypercelカラムへのローディングを、100〜500mLの間のサンプル体積で検討した。４つの不純物タンパク質についてのタンパク質回収データは、図１〜４に以前に示した不純物ブレイクスループロフィールと同様の傾向を示した。通過画分中のIgG回収は、最も高いサンプルローディングでロードされた総IgGの１％未満であった(表５)。最も高いサンプルローディングで、IgA及びIgMの回収もまたそれぞれ1.8％及び3.6％で比較的低かった。しかし、100mLの最も低いサンプルローディングでさえ、MEP Hypercel上にロードされた総α₂−マクログロブリンのうち5.2％が通過画分中に回収された。これはサンプルローディングに比例して増加し、総α₂−マクログロブリンのうち35.4％が最高サンプルローディングについて通過画分中に回収された。α₂−マクログロブリンはサンプルロード中の主たる不純物タンパク質であり、かつMEP Hypercelは全ての主要不純物のうちこの不純物タンパク質に対して最も弱い親和性を示すので、MEP Hypercelのα₂−マクログロブリンクリアランスを最適にする努力を行った。

不純物タンパク質の全てについてのMEP Hypercelの選択性を改善する試みにおいて、上記の実験を、50mM NaClを平衡化緩衝液及びアルブミンサンプルに添加して繰り返した。アルブミンサンプルを平衡化MEP Hypercelカラムに100、200、300、400及び500mLでロードした。通過画分及びサンプル後洗浄液をpH3.0溶出液と共にバルクサンプルとして集めた。これらのバルク画分を、比濁法によりアルブミンレベルについて、そしてELISAによりIgG、IgA、IgM及びα₂−マクログロブリンの主要不純物タンパク質について評価した。

前のデータ(表３)は、NaClの添加が純粋なアルブミン及びIgGの溶液についてのMEP Hypercelの分離特徴を改善するということを示した。従って、pH調整アルブミンサンプル及び平衡化緩衝液への50mM塩化ナトリウム添加の、アルブミンからの不純物の除去に対する影響を評価した。通過画分中のIgG、IgA、IgM及びα₂−マクログロブリンの回収は、50mM塩化ナトリウムを添加して（表５）または添加せずに(表６)行われたMEP Hypercel分離についてほどんど同じであり、塩化ナトリウムの添加はアルブミン中の不純物に対するMEP Hypercelの選択性に対していずれの影響も有していないということを示した。

実施例５：MEP Hypercelの性能に対する流量の評価
４つの主要不純物タンパク質はMEP Hypercel樹脂に対して異なる親和性を有すると思われたので、不純物タンパク質の結合に対する流量の影響を調べるために研究を行った。上記からのクロマトグラフィー条件を使用して、アルブミンサンプル(100mL)を50、100及び150cm／時の流量でMEP Hypercelカラム上にロードした。通過画分及び溶出液をバルクサンプルとして集め、そして比濁法によりアルブミンのレベルについて、そしてELISAによりIgG、IgA、IgM及びα₂−マクログロブリンの主要不純物タンパク質について評価した。

MEP Hypercelによる不純物タンパク質の分離に対する流量の影響を、50と150cm／時との間で評価した。50cm／時では、各不純物タンパク質の１％未満が通過画分中に回収された(表７)。流量の増加は全ての不純物の増加したブレイクスルーを生じたが、これはIgA及びα₂−マクログロブリンについてより顕著であった。

実施例６：上流プロセス変化の影響
アルブミン精製工程の代替を調べることに加えて、ヒト血清アルブミンのクロマトグラフィー精製における最初のアニオン交換クロマトグラフィー工程の効率を改善する方法を評価した。Capto DEAE樹脂は、DEAE Sepharose−FFに対する代替として使用され得、そしてそのより高い能力のために、タンパク質ローディングを約５０％増加させることが可能となる。DEAE Sepharose−FF及びCapto DEAEの分離特徴が類似しているにも関わらず、いくつかの差異が観察された。最初にDEAE Sepharose−FFに由来する、CM Sepharose−FFからのアルブミン溶出液、及びCapto DEAE通過画分を、比濁法及びELISA分析により最初に特徴づけした。２つのアルブミンサンプルをpH7.0±0.1に調整し、そして0.22μm膜(Durapore)に通すことにより清澄化した。110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化されたMEP Hypercelカラムに100、200及び300mLのサンプル体積でロードした。通過画分及びサンプル後洗浄液をpH3.0溶出液と共にバルク画分として集めた。このバルク画分を、比濁法によりアルブミンレベルについて、そしてELISAによりIgG、IgA、IgM及びα₂−マクログロブリンの主要不純物タンパク質について評価した。

クロマトグラフィーアルブミンプロセスの代替の精製工程を特定する研究を、アルブミン捕捉工程の効率を最適化する研究と並行して行った。現在のDEAE Sepharose−FFをCapto DEAEと置き換えることにより、サンプルローディングの50％の増加が可能となるということが見出された[Gruvegard & Allmer、2009]。MEP Hypercelに対するこのプロセス変化の影響を評価した。初期捕捉工程のためのCapto DEAEの使用は、CM Sepharose−FFカラム由来の結果として得られたアルブミン溶出液に対していくらかの影響を有していた。Capto DEAEプロセス由来のアルブミンは、DEAE Sepharose−FFプロセス由来のアルブミン(1.91％)と比較してより低い不純物含有量を有していた(1.58％)(表８)。２つのサンプルのIgA及びα₂−マクログロブリン含有量において有意な差異が見られた。Capto DEAEプロセス由来のアルブミンは、DEAE Sepharose−FFプロセス由来のアルブミンと比較して２倍高いレベルのIgA、及び2倍低いレベルのα₂−マクログロブリンを有していた。

イオン交換精製アルブミンのMEP Hypercelクロマトグラフィー後に、Capto DEAEプロセスとDEAE Sepharose−FFプロセス由来のアルブミンとの間に有意な差異が観察された。DEAE Sepharose−FFプロセス由来のアルブミンの合計不純物含有量は、100mL MEP Hypercelサンプルロードについて0.0637％であり、そして300mLローディングでは0.2390％に増加した(表９)。これらのサンプルについての主要不純物はα₂−マクログロブリンであり、これは不純物全体の80％超を構成していた。Capto DEAEプロセス由来のMEP精製アルブミンは、全てのサンプルローディングについて検出できないレベルのα₂−マクログロブリンを有しており、DEAE Sepharose−FFプロセス由来のアルブミンと比較して有意に低い合計不純物含有量を生じた。これらの結果は、Capto DEAEプロセス由来のイオン交換精製アルブミンにおける有意に低いα₂−マクログロブリンレベルは、MEP Hypercelクロマトグラフィーに対して有益な影響を有しており、従ってより高いサンプルローディングが可能となったということを示唆する。

実施例７：プロセス効率の見積もり
MEP Hypercelのプロセス効率を既存のSephacryl S200HRと比較するために、MEP Hypercelパイロット規模処理に使用した条件をフルスケールバッチに推定した。これをSephacryl S200HR工程についての実際のデータと比較した。比較したパラメーターは;流量、カラムサイズ、サンプルローディング、緩衝液使用、及びプロセス及び工程所要時間を含んでいた。

実験室規模で決定され、そしてパイロット規模で検証されたMEP Hypercel条件を使用して、様々な処理パラメーターを計算するためにこれらをフルスケールプロセスに推定した。結果を10メートルトン（tonne）血漿バッチをSephacryl S200HRカラムに通す処理について実際のデータと比較した。Sephacryl S200HRに使用した少ないサンプルローディング及び低い流量は、10ｔのバッチを処理するために相当量のクロマトグラフィーサイクル及び時間が必要であるということを意味する(表10)。これは、Sephacryl S200HRカラムが1000Ｌを超えており、かつプロセス効率を上げるためにサンプルが約130〜135mg／mLまで濃縮されるという事実にかかわらずである。

MEP Hypercelカラムは、有意に高い量のサンプルをロードされ得、そしてSephacryl S200HRよりも３倍超速い流量で操作され得る(表10)。このことは、198 L MEP HypercelカラムがSephacryl S200HRよりも約半分の必要時間でアルブミンを処理し得るということを意味する。Sephacryl S200HRと同様のサイズを有するMEP Hypercelカラムを使用した場合(5つの個々の17.5x120cm IDカラム)、アルブミンの10トンバッチは558分で処理され得、これはSephacryl S200HRに必要とされる実際の処理時間と比較して８８％の節約に相当する。

MEP Hypercelクロマトグラフィーに必要な緩衝液の量は、バッチの終わりにしかクリーニング及び再生を行うことを必要としないSephacryl S200HRと比較してMEP Hypercelが各サイクル後にクリーニング及び再生を必要とすることの結果も大きく影響して、Sephacryl S200HRよりもわずかに高い。

MEP Hypercelのさらなる利益は、精製プロセス全体の合理化である。現在、イオン交換溶出液は、Sephacryl S200HRクロマトグラフィー工程の効率を最大にするために約25mg／mLから約135mg／mLまで限外ろ過により濃縮することを必要とする。しかし、この限外濾過工程はMEP Hypercelクロマトグラフィーの前には必要ない。イオン交換溶出液はMEP Hypercelカラム上へのローディングの前に7.0へのｐH調整しか必要としない。

実施例８：Capto DEAEクロマトグラフィー(アルブミンに対してポジティブモードで）を組み込んだ、脱脂されかつ真性グロブリンを枯渇したコーン上清Iからクロマトグラフィーにより分割されたアルブミンの特徴付け
脱脂されかつ真性グロブリンを枯渇したコーン上清Ｉ(15kg)を出発物質として使用した。この溶液を0.22μmフィルターを使用して清澄化した。Capto DEAE樹脂を充填したガラスカラム(1374mL)を10mM酢酸ナトリウム(pH5.2)を用いて平衡化した。Delip／Eug SNIを100ｇ／Ｌのタンパク質ローディング及び100cm／時の流量でロードした。サンプルローディングの終わりに、カラムを３カラム体積の10mM酢酸ナトリウム(pH5.2)で洗浄した。サンプル適用及びサンプル後洗浄の間に集められた未結合タンパク質を免疫グロブリン処理に回した。結合したタンパク質を選択的に溶出した。アルブミンを含有する第一の溶出は、３カラム体積の25mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で洗浄することにより起こる。結合タンパク質の残りを、２カラム体積の１M NaCl及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することにより溶出した。

CM Sepharose FF樹脂を充填したガラムカラム(1374mL)を25mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で平衡化した。Capto DEAEからのアルブミン溶出液全体をCM Sepharose FFカラムに100cm／時の流量でロードした。サンプルローディングの終わりに、カラムを２カラム体積の25mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で洗浄した。結合したタンパク質を選択的に溶出した。アルブミンを含有する第一の溶出は、３カラム体積の110mM酢酸ナトリウム(pH5.5)で洗浄することにより起こる。結合タンパク質の残りを、２カラム体積の１M NaCl及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することにより溶出した。CM Sepharose FFからのアルブミン溶出液を、１M NaOH及び１M酢酸を使用してpH 7.0に調整した。

MEP Hypercel樹脂を充填したガラスカラム(1343mL)を110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化した。pHを調整したCM溶出液を、571％のカラム体積及び100cm／時の流量でロードした。ローディング後に、カラムを２カラム体積の110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)で洗浄した。サンプルローディング及びサンプル後洗浄の間に溶出されたタンパク質をさらなる処理のために保持した。結合タンパク質を２カラム体積の100mM酢酸ナトリウム(pH3.0)及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することによりMEP Hypercelから溶出した。精製されたアルブミンをAlbumin 2VIについての手順に従って処理した。

上記のプロセス由来のアルブミン(20％溶液)を、バッチ出荷試験及び製品純度を評価するための様々なさらなる試験を使用して特徴づけした。現在の方法を使用して製造された対照バッチとデータを比較した(表11)。

新しい方法由来のアルブミンは、アルブミン対照と比較して、IgG(＜0.009mg／mL)、アポリポタンパク質A1(＜0.0032mg／mL)、IgA(1.7μg／mL)及びα₁−プロテイナーゼ阻害剤(0.039mg／mL)を含めてより低いレベルの不純物を含有していた(表11)。新しい方法に由来するアルブミンのより低い不純物含有量は、より低いレベルの凝集体(0.6％)及び濁度レベル(2.0NTU)ももたらした。

実施例９：CM Sepharoseクロマトグラフィーにより分割されたアルブミンの特徴付け
Capto DEAEまたはDEAE Sepharose FFクロマトグラフィー由来のアルブミン溶出液を１M
NaOH及び１M酢酸を使用してpH5.4及び伝導率5.0mS／cmに調整した。

CM Sepharose FF樹脂を充填したガラスカラムを酢酸ナトリウムを用いて平衡化した(pH5.4、伝導率5.0mS／cm)。調整したDEAE溶出液サンプルをタンパク質ローディング500ｇ／Ｌ及び流量100cm／時でロードした。ローディングの終わりに、カラムを２カラム体積の酢酸ナトリウム(pH5.4、伝導率5.0mS／cm)で洗浄した。サンプル適用及びサンプル後洗浄の間に集められた未結合タンパク質をさらなる処理のために保持した。結合したタンパク質を、２カラム体積の１M NaCl及び２カラム体積の１M NaOHを用いて洗浄することにより溶出した。アルブミンサンプルを、１M NaOH及び１M酢酸を使用してpH7.0に調整した。MEP Hypercel樹脂を充填したガラスカラムを酢酸ナトリウムで平衡化した(pH7.0、伝導率5.0mS／cm)。pHを調整したアルブミンを、タンパク質ローディング150ｇ／Ｌ及び流量75cm／時でロードした。ローディング後に、カラムを２カラム体積の酢酸ナトリウム(pH7.0、伝導率5.0mS／cm)で洗浄した。サンプルローディング及びサンプル後洗浄の間に溶出されたタンパク質をさらなる処理のために保持した。結合したタンパク質を、２カラム体積の100mM酢酸ナトリウム(pH3.0)で洗浄することによりMEP Hypercelから溶出した。

DEAE Sepharose FFクロマトグラフィー由来のアルブミンサンプルの純度を、CM Sepharose FFクロマトグラフィーの後に現在の手順及び最適化された手順（上に概説した）を使用して特徴づけした。これらの結果は、現在のCM Sepharose FF法がアルブミン純度の穏やかな増加を生じるということを示す(表12)。これは主にトランスフェリンの除去と関連がある。最適化されたCM Sepharose FFクロマトグラフィーは、IgG及びIgAのいくらかの減少に加えて、トランスフェリン及びα₂−マクログロブリンのレベルの有意な減少を生じた。α₂−マクログロブリンはMEP Hypercelを使用して除去することが最も困難な純度であるので、CM Sepharose FFについての最適化された条件はMEP Hypercel上へのより高いローディングを可能にする。

実施例10：Capro DEAEクロマトグラフィーを組み込んで、コーン上清II＋IIIまたはろ液Ａからクロマトグラフィーで分割されたアルブミンの特徴付け
SN II＋IIIまたはろ液Ａを限外濾過により濃縮し、次いで５体積のPFWに対して透析ろ過してエタノール及び塩レベルを減少させた。透析濾過したSN II＋IIIまたは画分Ａを、１M NaOH及び１M酢酸を使用してpH4.5及び伝導率2.0mS／cmに調整した。リポタンパク質を結合するためにAerosil 380を160ｇ／kgタンパク質で加えた。フィルタープレスを使用する清澄化を容易にするためにDiacelを400ｇ／kgで加えた。フィルタープレスは25mM酢酸ナトリウム(pH4.5、伝導率2.0mS／cm)を使用して回収され得る。

Capto DEAE樹脂を充填したガラスカラムを25mM酢酸ナトリウム(pH4.5、伝導率2.0mS／cm)で平衡化した。脱脂してかつ透析ろ過したSN II＋IIIサンプルを、タンパク質ローディング1000g／L及び流量100cm／時でロードした。ローディングの終わりに、カラムを２カラム体積の25mM酢酸ナトリウム(pH4.5、伝導率2.0mS／cm)で洗浄した。サンプル適用及びサンプル後洗浄の間に集められた未結合タンパク質をさらなる処理のために保持した。結合したタンパク質を、２カラム体積の１M NaCl及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することにより溶出した。アルブミンサンプルを、１M NaOH及び１M酢酸を使用してpH5.4及び伝導率5.0mS／cmに調整した。その後のCM Sepharose−FF及びMEP Hypercel工程のための手順は実施例１０において概説したもの同じである。SN II＋IIIのCapto DEAE(ネガティブモード)精製を、ポジティブモードで行われたCapto DEAEと比較した(表13及び14)。これらの結果は、ネガティブモードCapto DEAEからの画分のドロップスルー中に回収されたタンパク質(表14)が、ポジティブモードCapto DEAEのドロップスルー及び溶出液画分中に回収されたタンパク質の合計であるということを示す(表13)。ネガティブモードCapto DEAEの有効性は、SN II＋IIIのポジティブ及びネガティブモードの両方のCapto DEAE精製についての洗浄画分(1M NaCl)が同様の総タンパク質回収を有していたという事実によりさらに支持される。この洗浄画分は、典型的にはIgA、ハプトグロビン、セルロプラスミン及びα₁−糖タンパク質を含むタンパク質を含有し、これらの大部分はこの研究では測定されなかった。

SN II＋IIIサンプルが高レベルのトランスフェリンを含有すること、及びネガティブモードCapto DEAEクロマトグラフィーの間にトランスフェリンがアルブミンと共溶出することを考慮して、ネガティブモードCM Sepharose−FFのアルブミンからトランスフェリンを除去する能力を評価した。SN II＋IIIのネガティブモードCM Sepharose−FF精製についてのタンパク質回収は、高レベルのトランスフェリンが洗浄画分中に回収され(91.3％)、そしてアルブミン画分中には検出できないレベルが回収されるということを示す(表15)。全体的に、SN II＋IIIサンプルについてのタンパク質回収は、SNI由来アルブミンのネガティブモードCM Sepharose−FFについて観察されたものと同様であった。

実施例11：ANX Sepharose、CM Sepharose及びMEP Hypercelを利用してネガティブモードで脱脂コーン上清II＋IIIからクロマトグラフィーにより分離されたアルブミンの特徴付け
脱脂されたコーン上清II＋IIIを出発物質として使用し、pH4.7及び伝導率1.8mS／cmに調整した。この溶液を0.22μmフィルターを使用して清澄化した。ANX Sepharose−FF樹脂を充填したガラスカラム(35 mL)を酢酸ナトリウムで平衡化した(pH4.7、伝導率1.8mS／cm)。調整した脱脂SN II＋IIIを、タンパク質ローディング300ｇ／Ｌ及び流量100cm／時でロードした。サンプルローディングの終わりに、カラムを３カラム体積の酢酸ナトリウム(pH4.7、伝導率1.8mS／cm)で洗浄した。サンプル適用及びサンプル後洗浄の間に集められた未結合タンパク質を集めてアルブミン処理のために保持した。結合したタンパク質を、２カラム体積の１M NaCl及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することにより溶出した。

CM Sepharose FF樹脂で充填されたガラスカラム(35mL)を酢酸ナトリウムで平衡化した(pH5.4、伝導率5.0mS／cm)。ANX Sepharose−FFからのアルブミン通過画分をpH5.4及び伝導率5.0mS／cmに調整し、そして0.22μmフィルターを使用して清澄化した。調整したANX通過画分をCM Sepharose FFカラムに300ｇ／Ｌのローデンィングで流量100cm／時にてロードした。サンプルローデンィングの終わりに、カラムを２カラム体積の酢酸ナトリウム(pH5.4、伝導率5.0mS／cm)で洗浄した。サンプル適用及びサンプル後洗浄の間に溶出された未結合タンパク質を、アルブミン処理及び特徴付け試験のために集めて保持した。結合したタンパク質を、２カラム体積の１M NaCl及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することにより溶出した。

CM Sepharose FFからのアルブミン通過画分を、１M NaOH及び１M酢酸を使用してpH7.0に調整した。MEP Hypercel樹脂を充填したガラスカラム(35mL)を110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)で平衡化した。pH調整したCM通過画分を150ｇ／Ｌで流量75cm／時にてロードした。ローディング後、カラムを２カラム体積の110mM酢酸ナトリウム(pH7.0)で洗浄した。サンプルローディング及びサンプル後洗浄の間に溶出された未結合タンパク質を特徴付け試験のために保持した。結合したタンパク質を、２カラム体積の100mM酢酸ナトリウム(pH3.0)及び２カラム体積の１M NaOHで洗浄することによりMEP Hypercelから溶出した。

CM Sepharose−FF及びMEP Hypercel工程段階後の上記のプロセス由来のアルブミン溶液を、製品純度を評価するための特異的ELISAを使用して特徴づけした。データを、CSL Biotherapiesの現在のアルブミン精製法を使用して製造された濃縮CM溶出液及びサイズ排除後濃縮アルブミン単量体の対照サンプルと比較した。

脱脂したSN II＋IIIをネガティブモードで操作されたANX Sepharose−FF及びCM Sepharose−FFにロードした後得られたアルブミン中間体は、現在の方法由来の等価なアルブミン中間体(98.41％)より高い純度(99.16％)を有していた(表16)。この差異は、α₂−マクログロブリン及びα₁−アンチトリプシンの有意に低いレベルに主に起因する。しかし、ネガティブモードANX Sepharose及びCM Sepharose由来のアルブミンは、現在の方法に由来するアルブミン(0.28％)よりも多くIgG(0.46％)を含有する。

MEP Hypercel由来のアルブミンは、現在の方法由来のアルブミンについて観察されたもの(99.90％)を超える高い純度(99.96％)を有していた(表17)。MEP Hypercelを使用して精製したアルブミンは低IgGレベルを含有していた(0.01％)。

データは、様々な供給源(例えば、SNI、II＋IIIまたはろ液Ａ)及び先行するイオン交換クロマトグラフィー工程についての様々な条件由来のアルブミンの精製のための、MEP Hypercelのような親和性マトリックを使用するクロマトグラフィー工程（アルブミンに対してネガティブモードで）の使用を支持する。不純物タンパク質のネガティブモードイオン交換工程標的結合は、膜クロマトグラフィーをより魅力的なものにし、そして工業的膜クロマトグラフィー形式へと移行され得る。

既存の工業規模プロセスにおいて使用されるイオン交換クロマトグラフィー工程(例えば、DEAE Sepharose−FF及びCM Sepharose−FFを含むCSL、Australia to manufacture Albumexにより使用されるもの）は、ヒト血清アルブミンの精製に非常に有効である。最初のDEAE Sepharose−FFカラムにロードされる、脱脂され、かつ真性グロブリンを枯渇したコーンSNI中間体は約７０％の純度を有し、そして２つのイオン交換カラムを通して処理した後に９８％を超えるまで増加する。このイオン交換プロセスは、4.5と5.2との間のｐI値を有するタンパク質を選択する。Prinら[1995]は、IgG、IgA及びIgMの等電点(pI)範囲が広く、かつAlbumexプロセスにおいてDEAE Sepharose−FF及びCM Sepharose−FFカラムにより選択されるpI範囲と重なるということを示した。免疫グロブリンのこの広いｐI範囲を考えると、イオン交換クロマトグラフィーがアルブミンから全ての免疫グロブリン夾雑物を除去するとは期待することができず、従って、アルブミン精製の直交モード（orthogonal mode）の必要性を強調する。

本明細書に記載される実験は、平衡化及びサンプルのpHが特定の条件下でMEP Hypercel上でのアルブミン及びIgGの分離のための重要なパラメーターであり得るということを示す。緩衝液のモル濃度及び種類は、pH7.0での分離に対していずれの顕著な影響も有していないようである。アルブミンは110mM酢酸ナトリウム緩衝液中pH5.5でCM Sepharose−FFカラムから溶出されるので、MEP Hypercelカラムでのローディング前の少しのｐH調整しか必要としないだろう。

pH5.5での酢酸ナトリウム緩衝液への塩化ナトリウムの添加はIgGとアルブミンとの間の選択性を改善した。以前の研究は、MEP HypercelのIgG結合能が塩の添加により増強されないか[Schwartzら、2001]、または減少さえされ得る[Chenら、2008]ということを示した。しかし、これらの以前の研究は、4.8でのMEPリガンドのpKaに比較的近い現在の研究で使用されるpH5.5と比較して、中性ｐH値でサンプルを使用して行われた[Burton及びHarding、1998]。pH7.0での酢酸ナトリウム緩衝液への50mM塩化ナトリウムの添加はCM Sepharose−FF由来のアルブミンからの不純物タンパク質の除去を改善しなかったということが示された。

CM Sepharose−FF由来pH調整アルブミン溶出液のMEP Hypercelへのローディングの間のブレイクスルー分析は、調査された４つの主要な不純物タンパク質の結合における有意な差異を示した。MEP Hypercelは、IgG及びIgAの両方に対して最も高い能力を示し、そしてIgM及びα₂−マクログロブリンに対してはるかに低い能力を示した。減少した能力は、少なくとも部分的に、立体障害及びサイズ排除効果に起因するかもしれない。このことは、IgMと同様の分子量を有するα₂−マクログロブリンもまたMEP Hypercelに対して低い結合能を有していたという事実によりさらに支持される。α₂−マクログロブリンに対するMEP Hypercelの低い能力に関する別の可能な要因は、それがエタノール中でガンマグロブリン(IgG、IgA、及びIgM)より高い溶解度を有しながら、α−グロブリンはコーン画分IV中に単離される[Cohnら、1946]ということである。

MEP Hypercelは、クロマトグラフィーで精製されたアルブミン中の不純物に対してより広い選択性を有するようである。MEP Hypercelは高分子量不純物を除去できるだけでなく、相当量のアポリポタンパク質A1も除去できる。アルブミンのクロマトグラフィー精製（精製（polishing））のための多くの既存の方法において使用されるSephacryl S200HRは、その分子量(28kDa)がアルブミンより小さく、従ってアルブミン単量体画分と共溶出されるので、アルブミンからいずれのアポリポタンパク質A1も除去しない。

Albumex 20^TM製造方法(CSL、Australia)のような既存の方法へのMEP Hypercelの組み込みは、上流及び下流プロセスに対して非常に小さい影響しか有していない。例えば、現在のAlbumex 20プロセスにおいて、Sephacryl S200HRカラムから溶出されるアルブミンは、50mM酢酸緩衝液中であり、アセテート及びナトリウムイオンを除去するために水に対して透析濾過される。MEP Hypercelカラム由来の精製アルブミンは、110mM酢酸ナトリウム緩衝液中にあり、従って既存の方法と等価な製品を達成するためにはさらなる透析ろ過体積を必要とするだろう。しかし、余分な透析ろ過を行うために必要とされるさらなる時間は重要ではない。MEP Hypercelにより得られるプロセス有効性の有意な増加に対するさらなる利益は、精製されたアルブミン製品がCM Sepharose−FF(イオン交換)カラムからの溶出後にもはや濃縮を必要としないということである。この工程の省略はまた、もはや限外ろ過装置を維持する必要がないということと関連して相当な時間の節約及びかなりの維持費の節約をもたらす。タンパク質の疎水性に基づく分離のための媒体としてのMEP Hypercelの使用の主要な関心のうちの１つは、離液性塩を加える必要なく分離できるその能力である。アルブミンの10メートルトンバッチについてのプロセス有効性計算に基づいて、そしてHIC分離がサンプル及び平衡化緩衝液中１Mのアンモニウム移動濃度を必要とするであろうと仮定すれば、３メートルトンを超える硫酸アンモニウムが必要とされるだろう。このことは、費用、取り扱い、塩及び廃棄を除去するため、特に水路へ放出された場合に富栄養化を引き起こし得るのでアンモニウム移動のためのさらなる下流処理を含む様々な問題を提示する。MEP Hypercelにより得られる効率の増加は、この精製工程がもはやこの方法の障害ではないということを意味する。また、カラムサイズがかなり減少され得、これにより製造施設におけるより小さな接地面積、及び在庫に保持されるべきより少ない樹脂をもたらす。

アルブミンと比較した不純物タンパク質の疎水性の差異を利用することにより、イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたアルブミンについての精製工程として、(アルブミンに対して)ネガティブモードでの親和性クロマトグラフィー、特に、MEP Hypercelクロマトグラフィーの有効性が本明細書において実証される。

MEP Hypercelは他の精製スキーム、特に画分Vを沈殿させないものに由来するヒト血清
アルブミンを精製する方法を提供すると予測される。この方法は、例えば、Albumex 20プロセスと類似した既にクロマトグラフィー精製プロセスを有するより小さな血漿成分分画器に特に関連する。また、クロマトグラフィー精製プロセスがよく適しているそれら自身の血漿分画プロセスを確立しようと計画している小さな企業及び国にとって魅力的であると分かるはずである。

本発明は、既存のゲルろ過クロマトグラフィーと比較してプロセス効率において相当な改善を提供し、そして先行する工程で既に使用され、かつ離液性塩の添加を必要としない、酢酸ナトリウム緩衝液を使用して所望の分離が達成され得るので、既存のアルブミン製造方法に途切れなく統合され得る。この精製方法は、クロマトグラフィー法を採用するより小さい体積の血漿成分分画器に即時の利益を有するが、MEP Hypercelにより得られる相当な効率増加は、中程度から大量の商業用血漿成分分画器にとってアルブミンのクロマトグラフィー精製をより魅力的なものにし得る。

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Claims (9)

1. 疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂にアルブミン濃縮溶液を通すこと、及び樹脂を通ったアルブミン溶液を回収することを含む、夾雑物を除去するためにアルブミンを精製する方法。
2. 疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂が４−メルカプトエチルピリジンを含む、請求項１に記載の方法。
3. アルブミン濃縮溶液が、コーン上清Ｉ、コーン上清ＩＩ＋ＩＩＩ、上清／ろ液Ａ、コーン上清ＩＶ及び画分Ｖから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. アルブミン濃縮溶液が透析ろ過されたコーン上清Ｉである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. アルブミン濃縮溶液が脱脂され、かつ真性グロブリンを枯渇している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. アルブミン濃縮溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通す前に、前記方法は、（ａ）アルブミンに対してネガティブモードで該溶液をアニオン交換樹脂に通す工程、及び（ｂ）アルブミンに対してネガティブモードで該溶液をカチオン交換樹脂に通す工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 工程（ａ）のアニオン交換樹脂からの通過画分を、工程（ｂ）におけるカチオン交換樹脂に通すことを含む、請求項６に記載の方法。
8. 工程（ｂ）のカチオン交換樹脂からの通過画分を、工程（ａ）におけるアニオン交換樹脂に通すことを含む、請求項６に記載の方法。
9. 精製アルブミン溶液を低温殺菌することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の
   方法。

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