JP6399987B2 - 抗β２−ＧＰＩ抗体の測定法 - Google Patents

Description

本発明は、抗β２−グリコプロテインI(β２−ＧＰＩ)抗体の測定法およびそれに使用するキットに関する。

β２−ＧＰIを用いて抗カルジオリピン抗体などの自己抗体を測定する方法は既に知られている（特許文献１，２参照）

特許第２８８６９８３号公報 特許第３３５９４１５号公報

しかしながら、β２−ＧＰIを用いて検体中の自己抗体を測定する場合、吸光度のバックグランドが上昇し、正確に測定できないという問題が度々生じることが明らかとなった。

発明者らは、この問題を克服すべく、鋭意検討を重ねた結果、β２−ＧＰIに混在するＩｇＧがバックグランド上昇の原因であることを突き止め、これを除去することで、バックグランドが上昇せず、ロット間差がなく、安定した測定法を提供できることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。従って、本発明は以下の発明を提供するものである。
（１）
β２−ＧＰＩを用いて検体中の抗β２−ＧＰＩ抗体を測定する方法であって、測定に用いるβ２−ＧＰＩとしてＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを用いる抗β２−ＧＰＩ抗体の測定法。
（２）
ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩが、プロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などで処理したβ２−ＧＰＩである、（１）記載の測定法。
（３）
ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを固相化された形態で用いる、（１）記載の測定法。
（４）
β２−ＧＰＩを用いて検体中の抗β２−ＧＰＩ抗体を測定するためのキットであって、測定に用いるβ２−ＧＰＩとしてＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを用いる抗β２−ＧＰＩ抗体の測定キット。
（５）
ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩが、プロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などで処理したβ２−ＧＰＩである、（４）記載のキット。
（６）
ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩが、固相化されたものである、（４）記載のキット。

本発明の抗β２−ＧＰＩ抗体の測定法及びキットにおいては、プロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などで処理したβ２−ＧＰＩを用いる、すなわちＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを用いるため、測定時におけるバックグランド上昇を抑制できる。さらに、使用するβ２−ＧＰIのロット間差もほとんどないキットを提供できるため、臨床検査において重要な安定した測定に大いに貢献することができる。

本発明の特徴は、上述したように、プロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などで処理したβ２−ＧＰＩ、すなわちＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを用いることにある。
本明細書において、「ＩｇＧフリー」とは、抗β２−ＧＰＩ抗体の測定に悪影響を及ぼさないことを意味し、ＩｇＧが極微量含まれていても、抗β２−ＧＰＩ抗体の測定に悪影響を及ぼさなければ、実質的にＩｇＧフリーの範疇に入る。具体的には、以下の方法によって抗β２−ＧＰＩ抗体を測定する際のバックグラウンドの吸光度（４５０ｎｍ）が０．２０以下、好ましくは０．１５以下であればよい。
（方法）
陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離基を表面に導入した担体（たとえば、Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に、β２−ＧＰＩを１〜２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、１００μＬ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置して結合させる。作製したβ２−ＧＰＩ結合担体を３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、３００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え、室温で２時間静置する。ＢＳＡ溶液を除き、３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間反応させる。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質溶液（３、３’、５、５’―テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）および過酸化水素含有溶液）を１００μＬ加え、室温で３０分反応させ、反応停止液（１Ｎ硫酸）を１００μＬ加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定する。

本発明に使用するβ２−ＧＰＩとしては、ヒトβ２−ＧＰＩ、ウシβ２−ＧＰＩなどを使用することができ、既に市販されており、購入して使用すればよい。
また、市販のヒトを含む動物の血清中にβ２−ＧＰＩが存在することから、公知の方法で血清から単離することも可能である。
さらに、β２−ＧＰＩのＤＮＡ配列は既に公知であり、公知の組換え法で調製することも可能である。

β２−ＧＰＩ精製に使用するプロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体は市販されており、市販品を使用すれば良く、特にセファロースなどの担体に結合され、カラム等に充填されたものを使用することが、β２−ＧＰＩの精製に便宜である。

プロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などを用いたβ２−ＧＰＩの精製処理は、カラムなどを利用した連続法でも、接触後分離するバッチ法であってもかまわない。
精製処理自体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などのｐＨ ４．０〜９．０の緩衝液を用い、プロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などとβ２−ＧＰＩを接触させることにより実施することができる。

このようなプロテインＧ、プロテインＡ、抗ＩｇＧ抗体などで処理したβ２−ＧＰＩは実質的にＩｇＧフリーであり、抗β２−ＧＰＩ抗体の測定に悪影響を及ぼさないため、抗β２−ＧＰＩ抗体の測定に最適である。

ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを結合させる担体としては、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離基を表面に導入したものであれば特に限定されない。また、担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレートなど）、粒子状（磁性ビーズ、ラテックスなど）などが例示され、測定法に応じて適宜選択すればよい。
抗β２−ＧＰＩ抗体の測定自体は、既に多くの方法が報告されており、適宜公知の方法（例えば、特許文献１及び２記載の方法など）を適用すればよい。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。

プロテインＧ処理によるＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩの調製
方法
ＰｒｏｔｅｉｎＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を５ｍＬ用いて、プロテインＧカラムを作製、ＰＢＳを１５ｍＬ流してカラムを平衡化した。平衡化したプロテインＧカラムに精製β２−ＧＰＩ溶液（１１ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬを流し、さらにＰＢＳを５〜１０ｍＬ流して素通り画分を回収した。０．１Ｍグリシン緩衝液（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ ２．８）をプロテインＧカラムに１０ｍＬ流し、吸着したタンパク質を溶出して溶出画分を得た。素通り画分と溶出画分の吸光度２８０ｎｍを測定し、各画分におけるタンパク質濃度を確認して素通り画分をプロテインＧ処理画分とした。
９６ウェルイムノモジュールプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にプロテインＧ未処理のヒト精製β２−ＧＰＩおよびプロテインＧ処理画分（１μｇ／ｍＬ：ＰＢＳ）を１００μＬ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置した。３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、３００μＬの１％ウシ精製アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを加え、室温で２時間静置した。ＢＳＡ溶液を除き、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間反応させた。３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、基質溶液（３、３’、５、５’―テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）および過酸化水素含有溶液）を１００μＬ加え、室温で３０分反応させ、反応停止液（１Ｎ硫酸）を１００μＬ加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。

結果
その結果を表１に示す。表中のＰｒｏｔｅｉｎＧ（−）はプロテインＧ未処理のβ２−ＧＰＩを用いたとき、ＰｒｏｔｅｉｎＧ（＋）はプロテインＧ処理したβ２−ＧＰＩ画分を用いたときを示している。表１からプロテインＧ処理により、β２−ＧＰＩに含まれていたＩｇＧが減少し、ＥＩＡ法での吸光度レベルが劇的に低減したことが明らかとなった。なお、溶出画分を用いた測定では、吸光度４５０ｎｍの検出限界以上（吸光度４．０）となった。したがって、上記方法によるβ２ＧＰＩのプロテインＧ処理画分をＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩとした。

抗ＩｇＧ抗体結合担体処理によるＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩの調製
（１）方法
抗ヒトＩｇＧ抗体（３．７ｍｇ）をＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にカップリングさせ、抗ヒトＩｇＧ抗体アフィニティーカラムを２ｍＬ作製した。
作製した抗ヒトＩｇＧアフィニティーカラム２ｍＬに、ＰＢＳを４ｍＬ流してカラムを平衡化した。平衡化したカラムに精製β２−ＧＰＩ溶液（１０．２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを流し、さらにＰＢＳを２〜４ｍＬ流して素通り画分を回収した。０．１Ｍグリシン緩衝液（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ ２．８）をアフィニティーカラムに１０ｍＬ流し、吸着したタンパク質を溶出して溶出画分を得た。素通り画分と溶出画分の吸光度２８０ｎｍを測定し、各画分におけるタンパク質濃度を確認して素通り画分を抗ヒトＩｇＧ抗体アフィニティー処理画分とした。
上記１）と同様のＥＩＡ法で、抗ヒトＩｇＧ抗体アフィニティーカラム処理画分に含まれるＩｇＧを検出した。

結果
その結果を表２に示す。表中の抗ＩｇＧアフィニティー（−）は抗ヒトＩｇＧ抗体アフィニティーカラム未処理のβ２−ＧＰＩを用いたとき、抗ＩｇＧアフィニティー（＋）は抗ヒトＩｇＧ抗体アフィニティーカラム処理したβ２−ＧＰＩ画分を用いたときを示している。表２から明らかなように、抗ヒトＩｇＧ抗体アフィニティーカラム処理により、β２−ＧＰＩに含まれていたＩｇＧが減少し、ＥＩＡ法での吸光度レベルが劇的に低減したことが明らかとなった。

ＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩを用いた抗β２−ＧＰＩ抗体測定におけるバッググランド低減の検討
（１）目的
プロテインＧ処理によるバックグラウンド低減効果の確認。
（２）方法
９６ウェルイムノモジュールプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）にプロテインＧ未処理およびプロテインＧ処理したヒト精製β２−ＧＰＩ（１０μｇ／ｍＬ：ＰＢＳ、純度９５％以上）を１００μＬ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置した。３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、３００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え、室温で２時間静置した。ＢＳＡ溶液を除き、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで適宜希釈した被験血清を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間静置した。３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質溶液（３、３’、５、５’―テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）および過酸化水素含有溶液）を１００μＬ加え、室温で３０分反応させ、反応停止液（１Ｎ硫酸）を１００μＬ加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。

（３）結果
その結果を表３に示す。表中のＰｒｏｔｅｉｎＧ（−）はプロテインＧ未処理のβ２−ＧＰＩを用いたとき、ＰｒｏｔｅｉｎＧ（＋）はプロテインＧ処理したβ２−ＧＰＩを用いたときを示している。表３からプロテインＧ処理により、被験血清非含有のバックグラウンドの吸光度が低下し、被験血清の各希釈倍率における吸光度の低下も確認された。

（４）考察
抗β２−ＧＰＩ抗体測定系は上記精製β２−ＧＰＩを固相化し抗原として用いるため、精製β２−ＧＰＩに混在するＩｇＧは、２次反応において酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体によって自己抗体の介在しない複合体を形成し、バックグラウンドとして検出されてしまうと考えられた。そこで、精製ヒトβ２−ＧＰＩをプロテインＧカラムに接触させることによって、精製β２−ＧＰＩに微量に混在するＩｇＧをプロテインＧで吸着除去したところ、表３の結果から明らかなように、抗β２−ＧＰＩ抗体の測定におけるバックグラウンドを低減できることが明らかとなった。

ＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩのロット間差の検討
目的
プロテインＧ処理によるβ２−ＧＰＩロット間差の低減効果の確認。
方法
上記１）と同様の方法で、プロテインＧ処理によるＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩを２ロット作製し、上記３）と同様の方法で抗β２ＧＰＩ抗体を測定した。

結果
その結果を表４に示す。表中のＬｏｔ１およびＬｏｔ２はＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩのロットを示す。表４より、０Ｕ／ｍＬのバックグラウンドはいずれのロットにおいても極めて低値を示し、各標準液の吸光度も同等の値を示した。また、複数の患者血清の吸光度も同等の値であった。したがって、ＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩを固相抗原として使用することで、β２−ＧＰＩのロット間差の影響を抑制できることが確認された。

考察
抗β２−ＧＰＩ抗体測定系の抗原としてβ２−ＧＰＩを使用するとき、β２−ＧＰＩのロットごとに標準曲線、特にバックグランドの吸光度レベルが異なることが問題となっていた。そこで、バックグラウンドの原因のＩｇＧをプロテインＧ処理によりβ２−ＧＰＩから除き、ＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩを抗原として使用したところ、表４の結果から明らかなように、抗β２−ＧＰＩ抗体の測定において、ＩｇＧフリーβ２−ＧＰＩの２つのロット間差はほとんど観察されなかった。したがって、ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを抗β２−ＧＰＩ抗体測定の抗原に用いることで、ロット間差を極めて小さくできることが明らかとなった。

Claims (4)

1. β２−グリコプロテインI(β２−ＧＰＩ)を用いて検体中の抗β２−ＧＰＩ抗体を測定する方法であって、測定に用いるβ２−ＧＰＩとして、下記の方法によって抗β２−ＧＰＩ抗体を測定した際のバックグラウンドの吸光度（４５０ｎｍ）が０．２０以下である、プロテインＧ、プロテインＡまたは抗ＩｇＧ抗体で処理したＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを用いる抗β２−ＧＰＩ抗体の測定法。
   （方法）陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離基を表面に導入した担体（たとえば、Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に、β２−ＧＰＩを１〜２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、１００μＬ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置して結合させる。作製したβ２−ＧＰＩ結合担体を３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、３００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え、室温で２時間静置する。ＢＳＡ溶液を除き、３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間反応させる。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質溶液（３、３’、５、５’―テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）および過酸化水素含有溶液）を１００μＬ加え、室温で３０分反応させ、反応停止液（１Ｎ硫酸）を１００μＬ加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定する。
2. ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを固相化された形態で用いる、請求項１記載の測定法。
3. β２−グリコプロテインI(β２−ＧＰＩ)を用いて検体中の抗β２−ＧＰＩ抗体を測定するためのキットであって、測定に用いるβ２−ＧＰＩとして、下記の方法によって抗β２−ＧＰＩ抗体を測定した際のバックグラウンドの吸光度（４５０ｎｍ）が０．２０以下である、プロテインＧ、プロテインＡまたは抗ＩｇＧ抗体で処理したＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩを用いる抗β２−ＧＰＩ抗体の測定キット。
   （方法）陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離基を表面に導入した担体（たとえば、Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に、β２−ＧＰＩを１〜２０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、１００μＬ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置して結合させる。作製したβ２−ＧＰＩ結合担体を３００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、３００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え、室温で２時間静置する。ＢＳＡ溶液を除き、３００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間反応させる。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質溶液（３、３’、５、５’―テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）および過酸化水素含有溶液）を１００μＬ加え、室温で３０分反応させ、反応停止液（１Ｎ硫酸）を１００μＬ加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定する。
4. ＩｇＧフリーのβ２−ＧＰＩが、固相化されたものである、請求項３記載のキット。