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JP6268173B2 - 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体 - Google Patents

抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体 Download PDF

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Description

本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性フラグメントに関する。本発明は、とりわけ、ヒトへの投与に適した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体および／またはヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体に関する。本発明はまた、疾患もしくは病状の治療および／または診断を目的とする抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の使用にも関する。
本発明の抗体は、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の活性または機能を阻害するため、またはこのタンパク質を発現する細胞に治療薬を送達するために用いることができる。
骨は、骨の構造的、機械的および生化学的統合性およびヒト身体のミネラル恒常性を支持するために必要な、機能的に異なる細胞集団から構成される動的結合組織である。関連する主要な細胞型としては、骨形成および骨質量の維持を担う骨芽細胞、ならびに骨吸収を担う破骨細胞が挙げられる。骨芽細胞および破骨細胞は、骨の再構築と呼ばれる動的プロセスにおいて機能する。これらの細胞の、それらの前駆細胞からの発生および増殖は、骨の微小環境において生成される成長因子およびサイトカインのネットワークならびに全身ホルモンにより制御される。骨の再構築は、個体の生涯を通して持続するが、これは、健康な骨組織およびミネラル恒常性の維持のために必要である。このプロセスは、ほとんど平衡状態に維持され、全身ホルモン、ペプチドおよび下流シグナル伝達経路タンパク質、局所転写因子、サイトカイン、成長因子ならびにマトリックス再構築遺伝子の複雑な相互作用に支配される。
骨の再構築プロセス中に起こる妨害または不均衡は、骨系統疾患を引き起こし得るが、最も一般的な骨系統疾患は、骨質量の純減を特徴とする。骨質量の減少の第１の原因は、破骨細胞の数および／または活性の増加である。こうした疾患の最も一般的で、しかも恐らく最も知られているものは、特に、閉経期開始後の女性に起こる骨粗鬆症である。実際、骨粗鬆症は、壮年期および高齢の女性における骨折の最も有意な根本原因である。エストロゲン欠乏は、閉経後の骨粗鬆症の要因として深く関与しているが、Ｆｒｏｓｔが、４０年以上前に最初に記載している（Ｆｒｏｓｔ Ｈ．Ｍ．１９６４）ように、再構築は、骨格全体を通して離散群塊として起こることから、局所的に制御されるプロセスであるという長年にわたるエビデンスがある。
骨の再構築は、離散群塊として起こることから、局所で生成されたホルモンおよび酵素は、骨吸収の開始および正常な再構築プロセスのために全身ホルモンより重要であり得る。こうした局所的制御は、これらが作用する微小環境において骨芽細胞および破骨細胞により媒介される。例えば、破骨細胞は骨基質に結合し、それら自身と、波状縁を取り囲むアクチンの環により形成されるシーリングゾーンにより画定される骨表面との間に個別のコンパートメントを形成する。複数の小さな小胞は、骨基質に向けて酵素を輸送し、部分的に消化された骨基質を内在化する。シーリングゾーン内の微小環境は、リソソーム酵素が豊富に存在し、身体の正常な生理学的ｐＨと比較して高度に酸性である。波状縁膜は、ＲＡＮＫＬの受容体であるＲＡＮＫ、およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体（その両方が破骨細胞の分化を担う）、ならびに破骨細胞を急速に不活性化することができるカルシトニン受容体も発現する（Ｂａｒｏｎ，Ｒ．２００３）。
阻害および刺激の複雑なパターンにおいて、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、性ステロイド、甲状腺ホルモン、ＰＴＨおよびプロスタグラジンＥ２などのカルシウム調節ホルモン、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、および腫瘍壊死因子αなどの各種サイトカイン、ならびに１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（カルシトリオール）は、骨の再構築プロセスにおいて、協調的に作用する（Ｊｉｌｋａ ｅｔ ａｌ．１９９２；Ｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．１９９４；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．１９９８；ｄｅ Ｖｅｍｅｊｏｕｌ １９９６）。
従って、これらの特殊化した細胞により形成される独特な局所環境が、他の組織では発現されていない独特な遺伝子配列および／または他の組織に発現されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドのスプライス変異体のいずれかの発現によるものであることは理にかなっている。破骨細胞活性に特異的なポリヌクレオチド、ポリペプチドならびにそれらの変異体および誘導体の単離および同定は、再構築プロセスについてさらに明瞭な理解を可能にし、骨の再構築に関連する病態の治療を目的とする組織特異的治療標的を提供する。
骨再構築に関連する多くの疾患が、あまり理解されておらず、一般に、治療不可能であるか、または限られた範囲でしか治療可能ではない。例えば、骨関節炎は、治癒がないため治療が困難であり、治療は、痛みの軽減と、患部関節が変形するのを防止することに主眼が置かれる。痛みを軽減するために、一般に非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が用いられている。
別の例は、骨粗鬆症であり、これに関して、米国での使用についてＦＤＡにより承認されている唯一の現行の治療薬は、骨の分解を阻止する骨吸収抑制剤である。エストロゲン補充療法は、骨吸収抑制剤の一例である。他の例としては、アレンドロネート（Ｆｏｓａｍａｘ−ビホスホネート骨吸収抑制剤）、リセドロネート（Ａｃｔｏｎｅｌ−ビホスホネート骨吸収抑制剤）、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ−選択性エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ））、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｍａｒ−ホルモン）、および副甲状腺ホルモン／テリパラチド（Ｆｏｒｔｅｏ−ヒトホルモン（副甲状腺ホルモン）の合成形態であり、カルシウム代謝の調節を助ける）が挙げられる。
アレンドロネートおよびリセドロネートなどのビホスホネートは、骨の表面に永久に結合して、破骨細胞活性を妨害する。これは、骨芽細胞が吸収速度をしのぐことを可能にする。最も一般的な副作用は、吐き気、腹痛および軟便である。しかし、アレンドロネートは、食道の刺激および炎症、ならびに場合によっては食道の潰瘍も引き起こすことが報告されている。リセドロネートは、アレンドロネートとは化学的に異なり、食道の刺激を引き起こす可能性が低い。しかし、特定の食物、カルシウム、鉄補給食品、ビタミンおよびミネラル、またはカルシウム、マグネシウム、もしくはアルミニウムを含有する制酸剤が、リセドロネートの吸収を低減し、これにより、効果の損失がもたらされる。
Ｒａｌｏｘｉｆｅｎおよび他のＳＥＲＭＳ（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎなど）の最も一般的な副作用は、顔面潮紅である。しかし、Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅおよび他のホルモン補充療法は、血餅の危険性を増大することがわかっており、これには、深部静脈血栓および肺塞栓症、心血管疾患および癌が含まれる。
カルシトニンは、骨密度を高め、骨を強化する上でエストロゲンやその他の骨吸収抑制薬ほど有効ではない。注射または鼻噴霧カルシトニンのいずれも、共通の副作用として吐き気および顔面紅潮がある。患者は、鼻の炎症、鼻水、または鼻血を発症し得る。注射用カルシトニンは、注射部位の局所皮膚発赤、皮膚発疹、および顔面紅潮を引き起こし得る。
骨再構築を伴う複数の障害または病態の間の関連を立証する状況は、パジェット病を治療するために、ＦＤＡにより最初に承認されたエチドロネート（Ｄｉｄｒｏｎｅｌ）の使用のそれである。パジェット病は、骨の無秩序かつ加速的な再構築を特徴とする骨疾患であり、脆弱な骨および疼痛を引き起こす。Ｄｉｄｒｏｎｅｌは、「適応外で」使用されてきたが、研究によっては、定着した骨粗鬆症を有する閉経後の女性において骨密度を増大することが明らかにされている。また、長期ステロイド投薬治療（例えば、プレドニソン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）またはコルチゾン（Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ））を必要とする患者における骨量減少を阻止するのに有効であることも認められている。しかし、Ｄｉｄｒｏｎｅｌの高用量または連続的使用は、骨軟化症と呼ばれる別の骨疾患を引き起こし得る。骨粗鬆症と同様、骨軟化症は、脆弱な骨の原因となり、骨折の危険性を増大し得る。骨軟化症の懸念、ならびに骨折率の低下に関する十分な研究がまだ不足しているために、米国のＦＤＡは、骨粗鬆症の治療を目的とするＤｉｄｒｏｎｅｌを承認していない。
骨粗鬆症療法は、骨量減少の速度を低減する骨吸収抑制薬に主に重点を置いてきたが、先端治療は、単に骨ミネラル密度を維持する、またはその分解を遅らせるのではなく、骨ミネラル密度を増加する上で有望であることを示している。骨粗鬆症の早期パイプラインは、主として、新規治療クラスの薬物候補、とりわけカテプシンＫ阻害剤、オステオプロテゲリンおよびカルシリティック（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）ならびに新規のビスホスホネートから構成される。これらのいくつかは、ゲノミクスプログラムを利用する新規の薬物が、骨生物学のより深い理解に基づき開発されており、長期の骨障害の治療の局面を変える可能性を有する。
本発明は、特に、人への投与に適した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体に関する。本発明はまた、ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体（例えば、ヒト化、キメラまたは非ヒト化抗体）にも関する。いくつかの例において、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質に特有で、かつ、他の種の対応Ｓｉｇｌｅｃ−１５タンパク質に存在しない（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５オーソログまたは推定オーソログ）エピトープに結合し得る。他の例では、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質およびマウスＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質に共通のエピトープに結合し得る。さらに別の例では、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５および他のオーソログまたは推定オーソログに共通のエピトープに結合し得る（例えば、Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７を参照）。
本発明はまた、癌または骨量減少（例えば、骨関連疾患に関連するか、または破骨細胞の分化もしくは活性の増大に関連する重篤または過剰な骨量減少）の診断、予後、および治療（予防を含む）を目的とする、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的な抗体の使用について記載する。特に、本発明は、破骨細胞の分化の阻害、および／または骨吸収の阻害を目的とする、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の使用に関する。本発明はまた、破骨細胞の活性が増大している様々な他のタイプ疾患の診断、予後、および治療を目的とする、これらの抗体の使用にも関する。
シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）は、シアル酸と相互作用する能力を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである（ＭｃＭｉｌｌａｎおよびＣｒｏｃｋｅｒ，２００８；Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。全てが、特定の構造的特徴を共通して有する、とりわけ、シアル酸および様々な数のＣ２セットＩｇドメインに結合するアミノ末端ＶセットＩｇドメインを呈示する、複数のＳｉｇｌｅｃファミリーメンバーがある。これらの膜受容体は、一般に、高度に特異的な様式で発現され、ファミリーメンバーの多くが、造血細胞において発現される（ＭｃＭｉｌｌａｎおよびＣｒｏｃｋｅｒ，２００８）。これらタンパク質は、細胞同士の相互作用を促進し、シグナル伝達を媒介すると共に、グリカンの認識を通して免疫機能を調節する（Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。シアル酸は、典型的に、細胞の表面上の糖複合体の末端に位置する９炭素の糖である。これらは、非常に多様なタンパク質および脂質に結合することができる（ＭｃＭｉｌｌａｎおよびＣｒｏｃｋｅｒ，２００８）。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、Ｓｉｇｌｅｃ−１４との高い相同性を有する、最近記載されたＳｉｇｌｅｃファミリーメンバーの１つである（Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。これらの著者は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５が、シアリルＴｎ構造に優先的に結合すること、およびこれが、ＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０と相互作用することを報告した。これら相互作用の機能上の重要性は知られていないが、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、恐らく活性化機能を有することが提示されている（Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の哺乳動物おける潜在的役割へのこうした先行する見識にもかかわらず、破骨細胞分化の新たな調節因子を見出すためのスクリーンの一部としてこの配列が同定されたとき、タンパク質の生物学的機能の理解に重要な進歩がもたらされた（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本特許出願において、破骨細胞生成のマウスモデルにおけるＲＮＡ妨害によるＳｉｇｌｅｃ−１５転写物のアテニュエーションが、ＲＡＮＫＬ治療に応答して前駆体の分化の有意な低減を引き起こすことが明らかにされた。同様の結果が、ヒト破骨細胞において開示されている。さらに、本開示に示す研究から、細胞膜でのＳｉｇｌｅｃ−１５の局在化が、破骨細胞におけるその機能に必要であることも示された。さらに、近年の刊行物は、表面糖複合体の末端におけるシアル酸の存在は、適切な破骨細胞の分化に必要であり、さらには、破骨細胞前駆細胞の融合にとっても恐らく重要であることが示されている（Ｔａｋａｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この最後の観察結果は、シアル酸結合と、分化破骨細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−１５の発現との直接の機能的関連を形成するものであり、Ｓｉｇｌｅｃ−１５が、破骨細胞前駆細胞の早期分化プログラムにおいて特定の役割を果たすことを強く示唆している。
従って、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の発現プロフィール、破骨細胞の分化中のその強力な誘導性、膜の表面におけるその局在化、およびその構造的特徴は全て、モノクローナル抗体による細胞表面でこのタンパク質をターゲティングする実現可能性に寄与するものである。破骨細胞をターゲティングするモノクローナル抗体療法の唯一の他の例は、デノスマブ、すなわちＲＡＮＫＬに特異的なヒトモノクローナル抗体である（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２００８）。本発明は、破骨細胞の分化および／または骨吸収の遮断薬として、特に、骨関連疾患に関して、または破骨細胞の分化もしくは活性の増大に関して、骨量減少の検出または治療における、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体または抗原結合性フラグメントの使用に関する。本発明はまた、癌の検出もしくは治療における抗体または抗原結合性フラグメントの使用にも関する。
Ｆｒｏｓｔ Ｈ．Ｍ．１９６４ Ｂａｒｏｎ，Ｒ．２００３ Ｊｉｌｋａ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．１９９４ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．１９９８ ｄｅ Ｖｅｍｅｊｏｕｌ １９９６ Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７ ＭｃＭｉｌｌａｎおよびＣｒｏｃｋｅｒ，２００８ Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｏｏｋｎａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｔａｋａｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．２００８
本発明は、骨量減少または癌の治療（予防を含む）、検出および診断に有用な抗体および抗原結合性フラグメント、ならびにキットに関する。とりわけ、ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が考慮される。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、骨量減少または骨吸収の治療に有用であり得る。
抗体および抗原結合性フラグメントは、とりわけ、分化した破骨細胞または分化中の破骨細胞の検出にも有用であり得る。抗体および抗原結合性フラグメントは、さらに、骨量減少の検出および診断にも有用であり得る。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、骨量減少を治療するのにも有用であり得る。
抗体および抗原結合性フラグメントはまた、特に、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を発現する癌細胞、とりわけ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の高度発現を有する癌の検出または診断にも有用であり得る。抗体および抗原結合性フラグメントはさらに、とりわけ卵巣癌、腎臓癌、中枢神経系の癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、肺癌または結腸癌の検出にも有用であり得る。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントはさらに、卵巣癌、腎臓癌、中枢神経系の癌、前立腺癌、黒色腫、乳癌、肺癌または結腸癌の治療にも有用であり得る。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５（配列番号２）のアミノ酸２０〜２５９、またはＳｉｇｌｅｃ−１５変異体（配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体、例えば、配列番号４など）の対応する領域に結合し得る。より具体的には、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５（配列番号２）のアミノ酸４９〜１６５、またはＳｉｇｌｅｃ−１５変異体（配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体、例えば、配列番号４など）の対応する領域に結合し得る。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントとしては、例えば、配列番号２の９９位（Ｒ９９）に位置するアルギニンを含むエピトープなどの、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５に特有のエピトープに結合し得るものが挙げられる。
抗体または抗原結合性フラグメントは、ポリペプチドの破骨細胞の分化活性および／または骨吸収を阻害する能力を有し得る。
好ましくは、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５より、むしろヒトＳｉｇｌｅｃ−１５と結合する抗体の方が、マウス破骨細胞よりヒト破骨細胞の分化または活性を阻害する上で、有効となり得ることは理解すべきである。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５にみいだされ、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５には存在しないエピトープに結合する抗体は、ヒト破骨細胞の分化または活性を阻害し得るが、マウス破骨細胞のそれは阻害しない。カニクイザルのＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５アミノ酸のそれと酷似している。従って、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の効力を、サルにおいて、またはサルから単離した細胞を用いて、試験してもよい。ゆえに、効力アッセイを抗体の特異性に応じて適合させてもよい（例えば、ヒト、サルおよび／またはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５）。
本発明の実施形態によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、ポリペプチドが、破骨細胞の分化および／または骨吸収を促進する能力を妨害し得る。本発明の別の実施形態によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、ポリペプチドが腫瘍増殖を促進する能力を妨害し得る。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、破骨細胞前駆細胞の分化破骨細胞への分化を妨害（阻害）することができる。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ハイブリッド抗体またはその断片であってよい。
本発明に含まれる抗体の具体例としては、少なくとも１つの免疫グロブリン鎖（軽鎖または重鎖）を有する抗体が挙げられ、この抗体は、ヒト化可変ドメインを含むが、他の可変ドメインは、非ヒト化（例えば、マウス可変ドメイン）であってもよく、これにより、ハイブリッド抗体がもたらされる。本発明に含まれる抗体の別の例としては、ヒト化可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖および軽鎖を有する抗体が挙げられる。
本発明の他の具体的実施形態としては、非ヒトアミノ酸（例えば、マウス抗体対応部由来の１つまたは複数のアミノ酸）が再導入されたヒト化抗体が挙げられる。
ゆえに、本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合することができる非ヒト親抗体（例えば、マウス抗体）のヒト化抗体を提供する。
一実施形態において、ハイブリッド抗体またはそのフラグメントは、例えば、非ヒト抗体の軽鎖可変領域と、ヒト化抗体の重鎖可変領域とを含んでもよい。
別の実施形態において、ハイブリッド抗体またはそのフラグメントは、例えば、非ヒト抗体の重鎖可変領域と、ヒト化抗体の軽鎖可変領域とを含んでもよい。
本発明のヒト化またはハイブリッド抗体は、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基、および天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る重鎖可変領域と、相補的軽鎖とを含んでもよい。
本発明のヒト化またはハイブリッド抗体は、非ヒト相補性決定領域アミノ酸残基、および天然ヒト抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基を含み得る軽鎖可変領域と、相補的重鎖とを含んでもよい。
「ハイブリッド抗体」という用語は、少なくとも１つのヒト化またはヒト重鎖もしくは軽鎖可変領域（Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する親和性を有する）と、少なくとも１つの非ヒト重鎖もしくは軽鎖可変領域（例えば、マウス、ラット、ウサギ由来の）を含む抗体を指す。
非ヒト親抗体のヒト化のために選択される天然のヒト抗体は、非ヒト親抗体の（モデル化）可変領域のそれと類似した（重ね合わせ可能な）三次元構造を有する可変領域を含んでよい。従って、ヒト化またはハイブリッド抗体は、非ヒト親抗体のそれと類似した三次元構造を有する、より大きな可能性がある。
本発明によれば、ヒト化またはハイブリッド抗体軽鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、天然のヒト抗体軽鎖フレームワーク領域に由来する。ヒト化の目的で選択される天然のヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有してよい。好ましくは、ヒト化の目的で選択される天然のヒト抗体は、非ヒト親抗体の軽鎖相補性決定領域のそれと、同数か、またはほぼ同数のアミノ酸をその軽鎖相補性決定領域に有していてよい。
本発明の他の実施形態において、ヒト化またはハイブリッド抗体のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも７０、７５、８０、８５％の（またはそれを超える）同一性を有する天然のヒト抗体軽鎖フレームワーク領域に由来する。
また、本発明によれば、ヒト化またはハイブリッド抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０％の同一性を有する天然のヒト抗体重鎖フレームワーク領域に由来する。好ましくは、ヒト化の目的で選択される天然のヒト抗体は、非ヒト親抗体の重鎖相補性決定領域のそれと、同数か、またはほぼ同数のアミノ酸をその重鎖相補性決定領域に有していてよい。
本発明の他の実施形態において、ヒト化またはハイブリッド抗体重鎖のヒトフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト親抗体の重鎖フレームワーク領域と少なくとも７０、７５、８０、８５％の同一性を有する天然のヒト抗体重鎖フレームワーク領域に由来する。
従って、本発明の一実施形態において、ヒト化またはハイブリッド抗体の重鎖可変領域は、少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域を含んでもよい。
あるいは、本発明の他の実施形態において、ヒト化またはハイブリッド抗体の重鎖可変領域は、少なくとも２つの非ヒト相補性決定領域、または３つの非ヒト相補性決定領域を含んでもよい。
本発明の別の実施形態において、軽鎖可変領域は、少なくとも１つの非ヒト相補性決定領域を含んでもよい。
あるいは、本発明のさらに別の実施形態において、軽鎖可変領域は、少なくとも２つの非ヒト相補性決定領域、または３つの非ヒト相補性決定領域を含む。
ヒト化抗体は、従って、有利には、非ヒト抗体の６つのＣＤＲ全てを含んでもよい。二価ヒト化抗体の場合、１２のＣＤＲは全て、非ヒト抗体由来であってもよい。
定常領域またはその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来してもよく、特に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するものであってよい。さらに具体的実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ２（例えば、ヒトＩｇＧ２）に由来するものであってよい。好ましい実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来するものであってよい。
軽鎖の定常領域は、λ定常領域またはκ定常領域であってよい。
特に有用であり得る抗原結合性フラグメントとしては、例えば、ＦＶ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）２が挙げられる。
抗体および抗原結合性フラグメントは、単離された哺乳動物細胞（ハイブリドーマ細胞以外のもの）において生成しても、これに由来するものであっても、ハイブリドーマ細胞において生成してもよい。単離された哺乳動物細胞の例示的実施形態は、ヒト細胞である。
本発明の一態様において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、分化したヒト破骨細胞へのヒト破骨細胞前駆細胞の分化を妨害（阻害）し得る。
例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、分化したヒト破骨細胞への一次ヒト破骨細胞前駆細胞の分化を妨害（阻害）し得る。
また、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、一般に、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を発現する、または過剰発現する細胞、例えば、骨細胞、ならびに乳房、結腸、肺、卵巣、前立腺、および腎臓癌細胞、さらには、黒色腫細胞および中枢神経系の癌細胞をターゲティングするのに用いてもよい。
より具体的には、分化中の破骨細胞をターゲティングするのに、抗体および抗原結合性フラグメントを用いてよい。
本発明は、その一態様では、配列番号２に特異的に結合することができる抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、単離または実質的に精製した）を提供する。
従って、本発明は、配列番号２に対する特異性を有する診断および／もしくは治療用抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。また、本発明には、本発明の抗体と同じエピトープ特異性を有する抗体または抗原結合性フラグメントも含まれる。候補抗体は、それが、本明細書に記載する抗体が結合するエピトープに結合するかどうかを決定することにより、および／または上記エピトープに結合することがわかっている抗体または抗原結合性フラグメントを用いた競合アッセイを実施することにより、同定してもよい。
ゆえに、本発明の別の態様は、本明細書に記載する抗体または抗原結合性フラグメントと競合することができる、単離された抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを用いた治療方法および検出方法を提供する。
用語「抗体」は、無傷抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。用語「抗体」はまた、二重特異的抗体などの多重特異的抗体を包含する。ヒト抗体は、通常、２つの軽鎖と２つの重鎖から成り、それぞれ可変領域および定常領域を含む。軽鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として同定されている３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として同定される３つのＣＤＲを含む。
本明細書において用語「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合する能力を保持している１つまたは複数のフラグメント（例えば、配列番号２またはその変異体）を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントによって実施され得ることが明らかにされてきた。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含される結合性フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、即ちＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、即ちヒンジ領域におけるジスルフィド架橋を介して連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一群（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＶＨ ＣＤＲ３が挙げられる。更にまた、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え方法を用いて、合成リンカーにより、これらを単一ポリペプチド鎖とすることができ、この単一ポリペプチド鎖内でＶＬ領域とＶＨ領域が対合することによって１価分子が形成される（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含されるように意図されたものである。更にまた、抗原結合性フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド（例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域に融合された重鎖可変領域）と、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域と、（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域と、を含んでなる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基で置換することによって、二量体化が防止されるように修飾してもよい。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は更に、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号明細書に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して取得され、これらのフラグメントは、無傷抗体と同じ方法で、利用のためにスクリーニングされる。
典型的な抗原結合部位は、軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを対にして形成された可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は非常に整合性がとれており、極めて類似した構造を呈する。これらの可変領域は典型的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのハイパー可変領域で離間された比較的相同的なフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合性フラグメントの全般的な結合活性は多くの場合、ＣＤＲの配列によって指令される。ＦＲは、往々にして、最適な抗原結合のために、ＣＤＲの３次元での適切な位置決めおよびアライメントにおいてある役割を果たす。
本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントは、例えば、マウス、ネズミもしくは他のいずれかの哺乳動物、または他の供給源（組み換えＤＮＡ技術によるものなど）に由来するものであってよい。
抗体または抗原結合性フラグメントは、骨量減少の治療における治療用途を有し得る。
ホルモン遮断療法（特定のホルモンの生成を停止する薬物を用いた治療）は、骨量減少による骨折の危険性を増大する。乳癌を有する女性に対するアジュバントホルモン療法は、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）およびアロマターゼ阻害剤を含むが、これらは、骨量減少を加速し、エストロゲン抑制による骨折の危険性を増大することが明らかにされている。さらに、前立腺癌を有する多くの男性が、その癌が進行すると、アンドロゲン遮断療法（ＡＤＴ）（例えば、ゴナドトロピン放出ホルモン［ＧｎＲＨ］アゴニスト）による治療を受ける。ＧｎＲＨアゴニストは、前立腺癌細胞の増殖因子として作用するテストステロンの生成を阻害する。しかし、この治療も、骨質量の減少を招き、これにより、骨粗鬆症による骨折の危険性が増大する。従って、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、癌治療に関連する骨量減少の治療における治療用途を有し得る。
抗体または抗原結合性フラグメントはまた、癌の治療における治療用途も有し得る。例示的実施形態において、抗体またはフラグメントは、癌治療に誘導される骨量減少における治療用途も有し得る。別の例示的実施形態では、抗体またはフラグメントは、破骨細胞の骨分解活性の増大が起こっている状態などの骨疾患に関連する骨量減少における治療用途を有し得る。場合によっては、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２を発現する細胞と相互作用し、ＡＤＣＣを媒介することによる免疫学的反応を誘導し得る。他の例では、抗体またはフラグメントは、配列番号２とその天然のリガンドとの相互作用を阻止し得る。さらに別の例では、抗体およびフラグメントは、タンパク質の内在化および／またはその分解を誘導し得る。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、骨量減少、骨吸収の治療に有用な、または骨量減少もしくは骨吸収に関連する疾患の治療に有用な別の薬物と一緒に（例えば、同時、逐次）投与してもよい。
骨量減少を阻害することができる抗体および抗原結合性フラグメントは、２０１１年４月１４日に国際公開第２０１１／０４１８９４号パンフレットとして公開された国際出願番号ＰＣＴ／カナダ特許出願公開第２０１０／００１５８６号明細書、および２００７年２月１３日に国際公開第２００７／０９３０４２号パンフレットとして公開された国際出願番号ＰＣＴ／カナダ特許出願公開第２００７／０００２１０号明細書（これらの全内容は、参照により本明細書に組み込むものとする）に記載されている。
抗体コンジュゲート
必ずしも必要ではないが、検出または治療目的のために、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可能部分（すなわち、検出もしくは診断目的に対応）または治療部分（治療目的に対応）とコンジュゲートしてもよい。
検出目的の場合、非コンジュゲート抗体（一次抗体）を、抗原との結合のために用いてもよいし、検出可能な部分を含み、かつ一次抗体と結合することができる二次抗体を付加してもよい。しかし、前述したように、抗ＳＩＧＬＥＣ１５抗体を検出可能な標識とコンジュゲートしてもよく、従って、このような場合、二次抗体は必要ないこともある。
「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、および／または他の物理的手段により検出できる部分である。検出可能部分は、直接的および／または間接的のいずれかで（例えば、限定はされないが、ＤＯＴＡ結合またはＮＨＳ結合などの結合を介し）、当該技術分野において周知の方法を使用して、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントとカップリングしてよい。非常に多様な検出可能部分を用いることができ、その選択は、要求される感度、結合容易性、安定性要件、および利用可能な計装に応じて異なる。好適な検出可能部分としては、限定はされないが、蛍光標識、放射性標識（例えば、限定はされないが、１２５Ｉ、Ｉｎ１１１、Ｔｃ９９、Ｉ１３１が挙げられ、ＰＥＴスキャナー用の陽電子放出アイソトープなどを含む）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（例えば、限定はされないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、量子ドットおよび／またはナノ粒子が挙げられる。検出可能部分は、検出可能なシグナルを誘発および／または生成することができ、それにより検出可能部分からのシグナルが検出可能になる。
本発明の別の例示的実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントを治療部分（例えば、薬剤、細胞傷害性部分）とカップリング（修飾）してもよい。
場合によっては、治療目的で、非コンジュゲート抗体は、それ自体で抗原を捕捉する；抗原と別の結合パートナーとの重要な相互作用を阻止する；エフェクター細胞を動員することなどができる。しかし、前述したように、抗体を治療部分とコンジュゲートしてもよい。
例証的実施形態において、抗体および抗原結合性フラグメントは、化学療法剤または細胞傷害性剤を含んでもよい。例えば、抗体および抗原結合性フラグメントを化学療法剤または細胞傷害性剤にコンジュゲートしてもよい。そのような化学療法剤または細胞傷害性剤としては、限定はされないが、イットリウム９０、スカンジウム４７、レニウム１８６、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、および当業者に認知されているその他多くのもの（例えば、ルテチウム（例えば、Ｌｕ１７７）、ビスマス（例えば、Ｂｉ２１３）、銅（例えば、Ｃｕ６７））が挙げられる。他の例においては、化学療法剤または細胞傷害性剤は、当業者に周知のもの中では、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、アウリスタチン、タキサン、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エンドトキシン、リシン、カリケアミシンならびに他の毒素を含み得る。例示的細胞傷害性剤は、とりわけ、非増殖細胞を死滅させることができる薬剤を含んでよい。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、特に、ＤＮＡをターゲティングする薬剤とコンジュゲートしてもよい。ＤＮＡをターゲティングする薬剤の例示的実施形態としては、例えば、デュオカルマイシンなどのアルキル化剤、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼレシンなどのデュオカルマイシン誘導体が挙げられる。ＤＮＡをターゲティングする薬剤の他の例示的実施形態としては、例えば、カリケアミシン、エスペラミシンおよび誘導体が挙げられる（例えば、米国特許第５，２６４，５８６号明細書、同第５，１０８，１９２号明細書、同第４，９７０，１９８号明細書、同第５，０３７，６５１号明細書、同第５，０７９，２３３号明細書、同第４，６７５，１８７号明細書、同第４，５３９，２０３号明細書、同第４，５５４，１６２号明細書、同第４，８３７，２０６号明細書、および米国特許出願公開第２００７２１３５１１号明細書に開示されている化合物を参照。各文献の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の具体的実施形態としては、例えば、デュオカルマイシンとコンジュゲートした、本明細書に開示の抗体または抗原結合性フラグメントがある。本発明の別の具体的実施形態としては、例えば、カリケアミシンとコンジュゲートした、本明細書に開示の抗体または抗原結合性フラグメントがある。
別法として、本発明の方法および当該技術分野において公知の方法を実施するために、本発明の抗体または抗原結合性フラグメント（結合または非結合）を本発明の抗体または抗原結合性フラグメントに特異的に結合でき、かつ所望される検出可能部分、診断部分または治療部分を有し得る第２の分子（例えば、二次抗体など）と組み合わせて使用できる。
抗体の医薬組成物およびその使用
抗体（結合または非結合）の医薬組成物もまた、本発明に包含される。医薬組成物は、抗体または抗原結合性フラグメントを含んでもよく、また薬学的に許容可能な担体も含んでいてもよい。
本発明の他の態様は、本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントと、担体とを含み得る組成物に関する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメントの、骨疾患もしくは癌の治療または診断における使用に関する。
活性成分に加えて、医薬組成物は、水、ＰＢＳ、生理食塩水、ゼラチン、油、アルコール類、ならびに他の賦形剤および助剤を含んでなる薬学的に許容可能な担体を含んでもよく、これらは、活性化合物を、薬学的に使用することができる調製物に加工し易くする。他の例においては、この種の調製物を滅菌してもよい。
本明細書において用いる「医薬組成物」は、薬学的に許容可能な希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と合わせた治療有効量の薬剤を意味する。本明細書において「治療有効量」とは、所与の状態および投与レジメンに関して治療効果が得られる量を指す。そのような組成物は、液体であるか、または凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥された配合物であり、様々なバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸着防止のためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質または等張性改良剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールのようなポリマーのタンパク質に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状調製物中への、もしくはその粒子状調製物上への、或いはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層膜リポソーム、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への物質の移入。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出の速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響し得る。制御放出組成物または持続放出組成物としては、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の配合物が挙げられる。また、ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も、本発明に包含される。本発明の組成物の他の実施形態は、粒子状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害物質、または非経口、肺、鼻、経口、膣、直腸経路を含めた様々な投与経路に対応した透過促進剤を取り入れている。一実施形態において、医薬組成物は、非経口、癌近傍、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内および腫瘍内投与される。
さらに、本明細書において「薬学的に許容可能な担体」または「医薬担体」は当該技術分野において公知であり、０．０１〜０．１Ｍもしくは０．０５Ｍのリン酸バッファー、または０．８％生理食塩水を包含するが、これらに限定されない。加えて、そのような薬学的に許容可能な担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンガーデキストロース系、およびこれらに類するものが挙げられる。保存料および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、照合剤、不活性ガスなどが存在してもよい。
どのような化合物についても治療有効量は、当初は細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、もしくはブタなどの動物モデルのいずれかで推定することができる。動物モデルはまた、濃度範囲および投与経路を決定するために使用してもよい。それゆえ、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決める場合にも使用され得る。これらの技術は当業者に周知であり、治療有効量とは、症状または状態を改善する活性成分の量を指す。治療効果および毒性は、細胞培養においてまたは実験動物を用い、標準の調剤手順で、例えばＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）統計を計算して比較対照することにより定量することができる。前述した治療組成物はいずれも、この種の治療を必要とするあらゆる被検対象（限定はされないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルおよびヒトなどの哺乳動物を含む）に適用することができる。
本発明において使用される医薬組成物は、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸手段などの任意の数の経路によって投与できる。
本発明の医薬組成物は、例えば、以下：ビスホスホネート、活性ビタミンＤ３、カルシトニンおよびその誘導体、エストラジオールなどのホルモン調製物、ＳＥＲＭ（選択的エストロゲン受容体モジュレータ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム調製物、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）調製物、非ステロイド抗炎症薬、可溶性ＴＮＦ受容体調製物、抗ＴＮＦα抗体もしくは当該抗体の機能性フラグメント、抗ＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質）抗体もしくは当該抗体の機能性フラグメント、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−６受容体抗体もしくは当該抗体の機能性フラグメント、抗ＲＡＮＫＬ抗体もしくは当該抗体の機能性フラグメント、およびＯＣＩＦ（破骨細胞生成阻害因子）からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤メンバーをさらに含んでもよい。
本開示の目的のための用語「治療」は、治療的処置と予防または防止的処置の両方を指し、ここで、目的は標的化された病的状態または障害を予防もしくは減速（軽減）させることにある。治療を必要としている人としては、既に障害を有する人、障害を有しがちな人、または障害を予防すべき人が挙げられる。
抗体または抗原結合性フラグメントは、各種の骨量減少または癌の治療における治療用途を有し得る。例示的実施形態において、抗体またはフラグメントは、破骨細胞の骨分解活性の増大が認められる状態などの骨疾患に関連する骨量減少における治療用途を有し得る。
場合により、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびフラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を発現する細胞（例えば、破骨細胞または破骨細胞前駆細胞）と相互作用し得る。場合によっては、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号２を発現する細胞と相互作用して、ＡＤＣＣを媒介することにより免疫反応を誘導し得る。他の例では、抗体およびフラグメントは、配列番号２とその天然のリガンドとの相互作用を阻止し得る。
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体または抗原結合性フラグメントは、様々な骨関連疾患に関して、骨量減少の治療に治療用途を有し得るが、このような疾患として、限定はしないが、骨粗鬆症、骨質減少、骨軟化症、上皮小体機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、性腺機能不全症、甲状腺中毒症、全身性肥満細胞症、成人型低ホスファターゼ症、副腎皮質機能亢進症、骨形成不全症、パジェット病、クッシング病／症候群、ターナー症候群、ゴーシェ病、エーラス・ダンロス症候群、マルファン症候群、メンケス症候群、ファンコニ症候群、多発性骨髄腫、高カルシウム血症、低カルシウム血症、関節炎、歯周病、くる病（ビタミンＤ依存性、ＩおよびＩＩ型、ならびにＸ染色体性低リン酸塩血症性くる病を含む）、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ ｏｓｓｉｕｍ）、濃化異骨症などの骨硬化性障害、ならびにマクロファージ媒介性炎症過程に起因する損傷が挙げられる。好ましい実施形態において、抗体およびフラグメントは、骨量減少が重篤な状態、特に、骨への転移性癌における治療用途を有する。
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびその抗原結合性フラグメントは、様々な骨再構築障害を原因とするか、または関連する癌もしくは骨量減少の治療に治療用途を有し得る。特に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびその免疫学的に機能性のフラグメントは、破骨細胞が過剰活性であり、骨表面の分解に寄与する状態において治療用途を有し得る。場合により、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびその抗原結合性フラグメントは、同じ病状のために投与される他の治療薬と組み合わせて一緒に投与してもよい。従って、当業者には公知の骨吸収抑制剤（例えば、ビスホスホネート）と一緒に抗体を投与してもよい。加えて、抗体は、有糸分裂阻害剤（例えば、タキサン）、白金製剤（例えば、シスプラチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ドキソルビシン）、ならびに当業者には公知の他の細胞傷害性剤と一緒に投与してよい。他の例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびその免疫学的に機能性のフラグメントを他の治療抗体と一緒に投与してもよい。これらの抗体として、限定はしないが、ＲＡＮＫＬ、ＥＧＦＲ、ＣＤ−２０、およびＨｅｒ２をターゲティングする抗体が挙げられる。
本発明の更なる範囲、適用可能性および利点は、以下に記載する非限定的な詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明は、本発明の例示的実施形態を示すが、添付の図面に関して、例として賦与されるにすぎないことは理解すべきである。
マウス２５Ｄ８可変ドメインの分子モデルである。軽鎖についてはＬ１、Ｌ２およびＬ３の矢印で、重鎖についてはＨ１、Ｈ２およびＨ３の矢印でＣＤＲループを示す。 マウス２５Ｅ９可変ドメインの分子モデルである。軽鎖についてはＬ１、Ｌ２およびＬ３の矢印で、重鎖についてはＨ１、Ｈ２およびＨ３の矢印でＣＤＲループを示す。 ２５Ｄ８抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのマウス、ヒト化および選択されたヒトフレームワーク配列の配列アラインメントである。ＣＤＲは、薄いグレーで表示され、配列番号５３、５４および５５に対応する。 ２５Ｄ８抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインのマウス、ヒト化および選択されたヒトフレームワーク配列の配列アラインメントである。ＣＤＲは、薄いグレーで表示され、配列番号５６、５７および５８に対応する。 ２５Ｅ９抗体の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのマウス、ヒト化および選択されたヒトフレームワーク配列の配列アラインメントである。ＣＤＲは、薄いグレーで表示され、配列番号４７、４８および４９に対応する。 ２５Ｅ９抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインのマウス、ヒト化および選択されたヒトフレームワーク配列の配列アラインメントである。ＣＤＲは、薄いグレーで表示され、配列番号５０、５１および５２に対応する。 ヒト化完全長ＩｇＧ２ ２５Ｄ８（配列番号２３および２７）とキメラ完全長ＩｇＧ２（配列番号２１および２５）２５Ｄ８抗体のアセンブルされた配列である。 ヒト化完全長ＩｇＧ２ ２５Ｅ９（配列番号７および２９）とキメラ完全長ＩｇＧ２ ２５Ｅ９（配列番号５および３０）抗体のアセンブルされた配列である。 マウスおよびヒト化２５Ｄ８ ＩｇＧ２抗体のＳＰＲクロマトグラムである。 マウスおよびヒト化２５Ｅ９ ＩｇＧ２抗体のＳＰＲクロマトグラムである。 ２５Ｅ９マウス軽鎖可変ドメインと２５Ｅ９ヒト化軽鎖可変ドメイン変異体１とのアラインメントを示す。アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて実施した。ここで、「＊」は、この列に示す残基が、アラインメントにおける全ての配列で同一であることを意味し、「：」は、保存置換が認められたことを意味し、「．」は、半保存置換が認められることを意味する。（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７〜２９４８）。これらのアラインメントを用いて、配列番号３３、３４および３５に記載されるコンセンサス配列を作製した。 ２５Ｅ９マウス重鎖可変ドメインと２５Ｅ９ヒト化重鎖可変ドメイン変異体１とのアラインメントを示す。アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて実施した。ここで、「＊」は、この列に示す残基が、アラインメントにおける全ての配列で同一であることを意味し、「：」は、保存置換が認められたことを意味し、「．」は、半保存置換が認められることを意味する。（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７〜２９４８）。これらのアラインメントを用いて、配列番号３６、３７および３８に記載されるコンセンサス配列を作製した。 ２５Ｄ８マウス軽鎖可変ドメインと２５Ｄ８ヒト化軽鎖可変ドメインとのアラインメントを示す。アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて実施した。ここで、「＊」は、この列に示す残基が、アラインメントにおける全ての配列で同一であることを意味し、「：」は、保存置換が認められたことを意味し、「．」は、半保存置換が認められることを意味する。（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７〜２９４８）。これらのアラインメントを用いて、配列番号３９、４０および４１に記載されるコンセンサス配列を作製した。 ２５Ｄ８マウス重鎖可変ドメインと２５Ｄ８ヒト化重鎖可変ドメインとのアラインメントを示す。アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて実施した。ここで、「＊」は、この列に示す残基が、アラインメントにおける全ての配列で同一であることを意味し、「：」は、保存置換が認められたことを意味し、「．」は、半保存置換が認められることを意味する。（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７〜２９４８）。これらのアラインメントを用いて、配列番号４２、４３および４４に記載されるコンセンサス配列を作製した。 ２５Ｅ９が、濃度依存的に、細胞の表面に発現されたヒトＳｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果である。 ２５Ｅ９が、ヒト破骨細胞の分化および骨吸収活性を阻害する能力を示す画像である。 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の存在下で、ビオチン化Ｓｉｇｌｅｃ−１５の内在化を示すウェスタンブロットである。 共焦点顕微鏡法によるＳｉｇｌｅｃ−１５エンドサイトーシスの特性決定である。 Ｓｉｇｌｅｃ−１５タンパク質レベルを示すウェスタンブロットである。 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の存在または非存在下で、ＲＡＮＫｌ刺激後のＲＡＷ２６４．７におけるＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質発現を示すウェスタンブロットである。 Ｓｉｇｌｅｃ−１５クラスター形成により誘導される細胞シグナル伝達の解析である。４℃で、対照（Ｃ）または分化（Δ）ＲＡＷ２６４．７細胞を一次抗体（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５または対照ヒトＩｇＧ）で処理した後、３７℃で、表示の時間にわたり二次架橋抗体で処理した。表示の抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、全溶解物を解析した。 ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１（左側パネル）およびヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２（右側パネル）の結合パラメータの差を示すＳＰＲクロマトグラムである。精製したＦｃ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５を固定化し（１５０ＲＵ）、ヒト化２５Ｅ９を、表示濃度（１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭおよび１．２３ｎＭ）で注入した。１：１の比で曲線をあてはめた。 破骨細胞の分化の阻害に関し、ヒト化２５Ｅ９ ＩｇＧ２と比較して、ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１の増大した効力を示す典型的画像である。 ヒト化完全長ＩｇＧ１ ２５Ｄ８（配列番号２３および４６）およびキメラ完全長ＩｇＧ１ ２５Ｄ８（配列番号２１および４５）抗体のアセンブルされた配列である。 ヒト化完全長ＩｇＧ１ ２５Ｅ９（配列番号７および１３）およびキメラ完全長ＩｇＧ１ ２５Ｅ９（配列番号５および１１）抗体のアセンブルされた配列である。 ２５Ｅ９−ＡＤＣが、非コンジュゲート抗体と酷似した様式で、細胞の表面に発現されるヒトＳｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合することを示すフローサイトメトリーの結果である。 成熟した多核化破骨細胞に対する２５Ｅ９−ＡＤＣの生存曲線を示す。この応答は、生存に影響することなく、破骨細胞の活性を強力に阻害する非コンジュゲート２５Ｅ９とは非常に異なる。 成熟した多核化破骨細胞に対する２５Ｅ９−ＡＤＣの細胞傷害性効果を示すＴＲＡＰ染色破骨細胞の画像を示す。この応答は、生存に影響することなく、破骨細胞の活性を強力に阻害する非コンジュゲート２５Ｅ９とは非常に異なる。対照ＡＤＣは、破骨細胞に対して影響を有していない。
本発明に包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、挿入、欠失またはアミノ酸置換（保存的もしくは非保存的）を含み得るものである。これらの変異体は、そのアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されていてもよい。
置換による突然変異誘発のために興味深い部位としては、高頻度可変性領域（ＣＤＲ）があるが、フレームワーク領域、または定常領域における修飾も考慮される。保存的置換は、以下に挙げるグループ（グループ１〜６）の１つからのアミノ酸（ＣＤＲ、可変鎖、抗体などの）を同じグループの別のアミノ酸に交換することにより実施してよい。
一般に、ＣＤＲにおける突然変異は、フレームワーク領域内での突然変異より、抗体または抗原結合性フラグメントの抗原結合活性に大きな影響をもたらし得る。フレームワーク領域内の突然変異は、抗体の「ヒト性」を増大するために実施してもよい。本発明により包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、本明細書に記載されるものと実質的に同一の抗原結合能力（類似した、同一、または若干低い能力を含む）を有するか、または本明細書に記載されるものより優れた抗原結合能力を有するものである。
保存的置換の他の例示的実施形態を、表１Ａの「好適な置換（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」という見出しの下に示す。そのような置換の結果、所望されない特性が得られた場合は、表１Ａで「例示的置換」と呼ぶより実質的な変更、またはアミノ酸のクラスに関して更に詳しく後述するような変更を導入して、生成物をスクリーニングすることもできる。
変異体が置換変異によって生成され、かつ本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持し得ることは、当該技術分野において公知である。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されている。例えば、置換型突然変異に重要な部位の１つとして、異なる種から採取される特定の残基どうしが同一である部位を挙げることができる。「保存的置換」と同定される置換の例を表１Ａに示す。そのような置換の結果、望ましくない変更が生じた場合、表１Ａ中で「例示的な置換」と呼ばれる、または、更に本明細書においてアミノ酸クラスを参照して詳述されているような他のタイプの置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
機能または免疫学的同一性における実質的な修正は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド主鎖の（例えば、シート立体配座またはヘリックス立体配座としての）構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果に有意な違いのある置換を選択することによって達成される。天然残基は、一般の側鎖特性に基づいて次の群に分類される。
（１群）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２群）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）
（３群）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４群）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５群）鎖配向に影響する残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、および
（６群）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
非保存的置換は、これらの部類のメンバーの相互交換を伴う。
Figure 0006268173
変異体抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列の改変としては、アミノ酸付加、欠失、挿入、置換など、１個または複数個のアミノ酸の骨格または側鎖における１つまたは複数の修飾、または１個または複数個のアミノ酸（側鎖または骨格）への１つの基もしくは別の分子の付加が挙げられる。
元の抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列と比べて、変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、そのアミノ酸配列において実質的な配列類似性および／または配列同一性を有し得る。２つの配列間の類似性の度合いは、同一性（同一のアミノ酸）および保存的置換のパーセンテージに基づく。
本明細書において可変鎖間の類似性および同一性の度合いは一般的に、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用い、既定の設定を使用して、即ち、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（開始ギャップ１１およびギャップ伸張のペナルティ１；ｇａｐｘドロップオフ５０、期待値１０．０、ワードサイズ３）および活性化フィルタを使用して、定量されてきた。
ゆえに、同一性パーセントは、元のペプチドと比較して同一なアミノ酸であり、かつ同じまたは類似する位置を占有し得るアミノ酸を示し得る。
類似性パーセントは、同じ位置または類似の位置にある元のペプチドと比較して同一なアミノ酸であり、かつ保存的なアミノ酸置換で置換されるアミノ酸を示し得る。
ゆえに、本発明の変異体（すなわち、類似体）（ＶＬ変異体、ＶＨ変異体、ＣＤＲ変異体、抗体変異体、ポリペプチド変異体など）は、元の配列または元の配列の一部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得るものを含む。
本発明によれば、配列番号２の変異体は、配列番号２のアミノ酸４９〜１６５またはアミノ酸２０〜２５９に対して少なくとも８０％同一な領域を有するポリペプチドを含む。配列番号２の変異体は、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドも含む。配列番号２の好ましい変異体は、破骨細胞および／または骨吸収を阻害することができるものを含む。このような変異体は、例えば、その破骨細胞分化および／または骨吸収活性をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験することにより同定することができる。Ｓｉｇｌｅｃ−１５変異体の活性を試験するのに用いることができる方法またはアッセイの例は、本明細書に記載されており、また、国際出願番号ＰＣＴ／カナダ特許出願公開第２００７／００１１３４号明細書にも記載されている。本明細書に記載するアッセイを実施するのに用いられる破骨細胞は、例えば、好ましくはヒトに由来するが、マウス由来のものであってもよいことを理解されたい。配列番号２の好ましい変異体として、例えば、配列番号２のアルギニン９９（Ｒ９９）を含むエピトープが保存されているものが挙げられる。
変異体の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８１％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８２％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の更なる例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の付加的な例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の更なる付加的な例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
簡潔にするために、本出願者は本発明に包含される個々の変異体の例示的実施形態を示した表１Ｂを提供している。この表１Ｂには、特定の配列同一性（％）および配列類似性（％）が含まれている。各「Ｘ」は所定の変異体を定義するものと解釈すべきである。
Figure 0006268173
本明細書で用いる「同一」という用語は、ある配列が、別の配列に対して１００％の配列同一性を有することを意味する。
本明細書で用いる「実質的に同一」という用語は、ある配列が、別の配列または別の配列の一部分に対して７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有することを意味する。
本発明は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも７０％の同一性（７０％から９９％までの任意の範囲を含む）を有するＣＤＲ、軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、軽鎖、重鎖、抗体および／または抗原結合性フラグメントを包含する。
本発明は、破骨細胞の活性増大により重篤な骨量減少が認められる様々な骨関連疾患に存在する破骨細胞のターゲティングを目的とするモノクローナル抗体の使用に関する。抗体を破骨細胞に向けて指令するために、細胞の細胞表面に発現される破骨細胞特異的抗原の同定を実施しなければならない。細胞特異的抗原を同定するのに利用可能ないくつかの技術があり、ＲＡＮＫＬで処理した分化中の破骨細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−１５を同定するのに用いた方法である、サブトラクティブ・トランスクリプションベースのｍＲＮＡの増幅（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ（ＳＴＡＲ））と呼ばれる新規のディスカバリー・プラットフォームが、公開特許出願：ＰＣＴ／カナダ特許出願公開第２００７／０００２１０号明細書に記載されている。
ヒト破骨細胞ＳＴＡＲライブラリーの解析により、分泌タンパク質および細胞表面タンパク質をコードする多くの遺伝子が得られた。０３２６−ＳＬ１０９と呼ばれるこれらの１つは、３２８アミノ酸のポリペプチドをコードしたオープンリーディングフレームを含有していたが、これは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む９８７塩基対のｃＤＮＡによりコードされた配列番号２に対応する。一般に入手可能なデータベースの検索から、０３２６−ＳＬ１０９ヌクレオチド配列が、ＣＤ３３抗原様３（ＣＤ３３Ｌ３）と呼ばれるヒト遺伝子のそれと同一であることが明らかにされた。ＣＤ３３Ｌ３は、後に、シアル酸結合タンパク質のＳｉｇｌｅｃファミリーのメンバーであることが判明し、他のＳｉｇｌｅｃに対する相同性に基づき、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と改名された（Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この情報に基づき、マウスオーソログを単離して、配列決定したところ、アミノ酸レベルでヒト配列に対して約８５％同一であることが判明した。配列番号３および配列番号４は、それぞれ、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡおよびポリペプチドの配列を示す。バイオインフォーマティック解析から、その機能性ドメインを細胞外コンパートメントに提示するＩ型膜結合タンパク質が予測された。他のＳｉｇｌｅｃ配列と同様に、アミノ末端シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１とアミノ酸１９との間に位置する）は、このタンパク質を細胞の膜に対してターゲティングし、最終加工タンパク質は、カルボキシ末端（配列番号２のアミノ酸２６１とアミノ酸２８３との間に位置する）に位置する１回膜貫通へリックスを介して、膜に結合される。ＶセットＩｇドメインは、配列番号２のアミノ酸４９とアミノ酸１６５との間に位置するが、Ｃ２セットＩｇドメインは、配列番号２のアミノ酸１７８とアミノ酸２４４との間に位置する。
以前の知見（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ ｅｔ ａｌ．２００７）は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５をコードする転写物が、ＲＡＮＫＬに応答して有意に上方制御されたことを確認した。この決定は、様々なヒトＰＢＭＮＣドナーからの複数の異なるヒト破骨細胞分化実験からのスポットした全ＲＮＡサンプルを含むＲＮＡマクロアレイ上で実施された。さらに、これらの研究（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ ｅｔ ａｌ．２００７）は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５転写物が、非常に多様な３０のヒト正常組織のうち、ただ１つの正常組織において発現され、これは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子発現の非常に高度な破骨細胞特異性を示している。半定量ＲＴ−ＰＣＲなどの、より高感度の方法を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５ｍＲＮＡの発現は、多くの破骨細胞サンプルにおいて、ＲＡＮＫＬ処理で１日以内に刺激されたが、これは、上記遺伝子が、破骨細胞前駆細胞において、細胞融合の開始前の早期に発現されることを示すものである。最終的に、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の組織発現プロフィールを半定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価したところ、単一の正常なヒト組織にしか発現されないことが判明し、これにより、Ｓｏｏｋｎａｎａｎらのマクロアレイ結果が確認された。以上を考え合わせると、これらの発現の結果は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５によって例示されるように、分化中の破骨細胞に高度に限定される標的を同定する能力における本出願人の発見手法の強みを強調するものである。
破骨細胞の分化の早期段階でのＳｉｇｌｅｃ−１５の発現、正常組織におけるその限定された発現、および破骨細胞の活性におけるＳｉｇｌｅｃ−１５の重要な生物学的役割に基づき、癌誘導性骨量減少、骨粗鬆症、癌治療に関連する骨量減少などの骨吸収障害または骨関連疾病の検出、予防および治療を目的とするモノクローナル抗体の開発のための治療標的としてＳｉｇｌｅｃ−１５を選択した。
ゆえに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をターゲティングするための様々な抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体およびその免疫学的に機能性のフラグメント、例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ドメイン抗体、および抗原結合性領域を有するポリペプチドが提供される。
本発明によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、とりわけ、破骨細胞の分化を阻害することができるものでよい。
さらに、本発明によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、破骨細胞の形成を阻害することができるものであってもよい。
また、本発明によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、破骨細胞の活性を阻害することができるものであってもよい。
さらにまた、本発明によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、骨吸収（例えば、破骨細胞の骨吸収活性）を阻害することができるものであってもよい。
従って、本発明は、一形態において、配列番号６に対して少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域および／または配列番号１２に対して少なくとも８０％同一である重鎖可変領域を有し得るＳｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合する能力がある、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号６または配列番号１２と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
本発明は、別の形態において、配列番号２２に対して少なくとも８０％同一である軽鎖可変領域および／または配列番号２６に対して少なくとも８０％同一である重鎖可変領域を有し得る、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２２または配列番号２６と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
本発明によれば、アミノ酸置換は、天然のヒト抗体において対応する位置に存在するアミノ酸であってよい。
本発明の一実施形態によれば、アミノ酸置換は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側にあってもよい。
本発明の一実施形態によれば、抗体のアミノ酸置換は、例えば、軽鎖可変領域に位置してもよい。
本発明の別の実施形態によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、少なくとも２つまたは少なくとも３つのアミノ酸置換を含んでもよい。このようなアミノ酸置換は、同じ可変領域に位置するか、または異なる可変領域に位置してもよい。
さらに本発明によれば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域に１〜２５のアミノ酸置換を含んでもよい。より具体的には、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、その軽鎖可変領域における１〜２２のアミノ酸置換、および重鎖可変領域における１〜２５のアミノ酸置換を有してもよい。
特に、配列番号６の相補性決定領域と、配列番号１２の相補性決定領域を含むと共に、ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含む抗体または抗原結合性フラグメント、例えば、ヒト化抗体が考慮される。
特に、配列番号２２の相補性決定領域と、配列番号２６の相補性決定領域を含むと共に、ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含む抗体または抗原結合性フラグメントが考慮される。
本発明の例示的実施形態としては、例えば、配列番号３３に記載される軽鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列１））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントが挙げられる。
ＤＩＶＭＴＱＸＸＸＳＸＰＶＴＰＧＥＸＸＳＩＳＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹＷＸＬＱＸＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＸＦＴＬＸＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＸＥＩＫ（配列番号３３）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号６（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は、保存的であってよい。
本発明の別の例示的実施形態は、例えば、配列番号３４に記載される軽鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列２））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＤＩＶＭＴＱＸａ１Ｘａ２Ｘａ３ＳＸａ４ＰＶＴＰＧＥＸａ５Ｘａ６ＳＩＳＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹＷＸａ７ＬＱＸａ８ＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＸａ９ＦＴＬＸａ１０ＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＸａ１１ＥＩＫ（配列番号３４）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号６（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ１、Ｘａ４、Ｘａ７、Ｘａ８、Ｘａ１０およびＸａ１１は、各々独立に、配列番号６と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ２、Ｘａ５、Ｘａ６は、各々独立に、配列番号６と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ３は、ＰまたはＬであってよく；
Ｘａ９は、ＡまたはＤであってよい。
本発明のまた別の例示的実施形態は、例えば、配列番号３５に記載される軽鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列３））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＤＩＶＭＴＱＸａ１Ｘａ２Ｘａ３ＳＸａ４ＰＶＴＰＧＥＸａ５Ｘａ６ＳＩＳＣＲＳＴＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＹＷＸａ７ＬＱＸａ８ＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＸａ９ＦＴＬＸａ１０ＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＸａ１１ＥＩＫ（配列番号３５）；
ここで、Ｘ（Ｘａ１〜Ｘａ１１）で識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号６（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ１は、ＡまたはＳであってよく；
Ｘａ２は、ＡまたはＰであってよく；
Ｘａ３は、ＰまたはＬであってよく；
Ｘａ４は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＬ）であってよく；
Ｘａ５は、ＳまたはＰであってよく；
Ｘａ６は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＡ）であってよく；
Ｘａ７は、芳香族アミノ酸（例えば、ＦまたはＹ）であってよく；
Ｘａ８は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘａ９は、ＡまたはＤであってよく；
Ｘａ１０は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘａ１１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよい。
別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号３６に記載される重鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列１））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＥＩＱＬＱＱＳＧＸＥＸＸＸＰＧＸＳＶＸＸＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＤＭＨＷＶＸＱＸＰＸＸＧＬＥＷＸＧＴＩＤＰＥＴＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧＸＸＴＸＴＡＤＸＳＸＸＴＡＹＭＥＬＳＳＬＸＳＥＤＸＡＶＹＹＣＴＳＦＹＹＴＹＳＮＹＤＶＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＸ（配列番号３６）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１２（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。
さらに本発明の別の実施形態は、例えば、配列番号３７に記載される重鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列２））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＥＩＱＬＱＱＳＧＸｂ１ＥＸｂ２Ｘｂ３Ｘｂ４ＰＧＸｂ５ＳＶＸｂ６Ｘｂ７ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＤＭＨＷＶＸｂ８ＱＸｂ９ＰＸｂ１０Ｘｂ１１ＧＬＥＷＸｂ１２ＧＴＩＤＰＥＴＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧＸｂ１３Ｘｂ１４ＴＸｂ１５ＴＡＤＸｂ１６ＳＸｂ１７Ｘｂ１８ＴＡＹＭＥＬＳＳＬＸｂ１９ＳＥＤＸｂ２０ＡＶＹＹＣＴＳＦＹＹＴＹＳＮＹＤＶＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＸｂ２１（配列番号３７）；
ここで、Ｘ（Ｘｂ１〜Ｘｂ２１）で識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１２（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ２、Ｘｂ４、Ｘｂ５、Ｘｂ７、Ｘｂ８、Ｘｂ９、Ｘｂ１１、Ｘｂ１２、Ｘｂ１３、Ｘｂ１５、Ｘｂ１６、Ｘｂ１７、Ｘｂ１８、Ｘｂ２０、およびＸｂ２１は、各々独立に、配列番号１２と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ１、Ｘｂ６、Ｘｂ１４は、各々独立に、配列番号１２（マウスＶＨ）と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ３は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｂ１０は、ＶまたはＧであってよく；
Ｘｂ１９は、ＴまたはＲであってよい。
本発明の別の実施形態は、例えば、配列番号３８に記載される重鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列３））を有する抗体または抗原結合性フラグメントを含む。
ＥＩＱＬＱＱＳＧＸｂ１ＥＸｂ２Ｘｂ３Ｘｂ４ＰＧＸｂ５ＳＶＸｂ６Ｘｂ７ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＤＭＨＷＶＸｂ８ＱＸｂ９ＰＸｂ１０Ｘｂ１１ＧＬＥＷＸｂ１２ＧＴＩＤＰＥＴＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧＸｂ１３Ｘｂ１４ＴＸｂ１５ＴＡＤＸｂ１６ＳＸｂ１７Ｘｂ１８ＴＡＹＭＥＬＳＳＬＸｂ１９ＳＥＤＸｂ２０ＡＶＹＹＣＴＳＦＹＹＴＹＳＮＹＤＶＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＸｂ２１（配列番号３８）；
ここで、Ｘ（Ｘｂ１〜Ｘｂ２１）で識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１２（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＡ）であってよく；
Ｘｂ２は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｂ３は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｂ４は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘｂ５は、ＡまたはＳであってよく；
Ｘｂ６は、ＴまたはＫであってよく；
Ｘｂ７は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｂ８は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｂ９は、ＴまたはＡであってよく；
Ｘｂ１０は、ＶまたはＧであってよく；
Ｘｂ１１は、塩基性アミノ酸（例えば、ＨまたはＱ）であってよく；
Ｘｂ１２は、疎水性アミノ酸（例えば、ＩまたはＭ）であってよく；
Ｘｂ１３は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｂ１４は、疎水性アミノ酸（例えば、ＡまたはＶ）であってよく；
Ｘｂ１５は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＩ）であってよく；
Ｘｂ１６は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘｂ１７は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｂ１８は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＴまたはＳ）であってよく；
Ｘｂ１９は、ＴまたはＲであってよく；
Ｘｂ２０は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｂ２１は、ＡまたはＳであってよい。
本発明の他の例示的実施形態は、例えば、配列番号３９に記載される軽鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列１））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＤＩＶＭＴＱＸＸＸＳＸＰＶＴＸＧＸＸＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＸＳＧＳＧＴＤＦＴＬＸＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＮＬＥＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＸＥＩ（配列番号３９）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２２（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。
さらに本発明の別の実施形態は、例えば、配列番号４０に記載される軽鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列２））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＤＩＶＭＴＱＸｃ１Ｘｃ２Ｘｃ３ＳＸｃ４ＰＶＴＸｃ５ＧＸｃ６Ｘｃ７ＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＸｃ８ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＸｃ９ＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＮＬＥＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＸｃ１０ＥＩＫ（配列番号４０）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２２（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ１、Ｘｃ３、Ｘｃ９およびＸｃ１０は、各々独立に、配列番号２２と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ２、Ｘｃ７、Ｘｃ８は、各々独立に、配列番号２２と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ４は、ＮまたはＬであってよく；
Ｘｃ５は、ＬまたはＰであってよく；
Ｘｃ６は、ＴまたはＥであってよい。
本発明のまた別の実施形態は、例えば、配列番号４１に記載される軽鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列３））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＤＩＶＭＴＱＸｃ１Ｘｃ２Ｘｃ３ＳＸｃ４ＰＶＴＸｃ５ＧＸｃ６Ｘｃ７ＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＱＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＸｃ８ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＸｃ９ＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＮＬＥＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＸｃ１０ＥＩＫ（配列番号４１）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２２（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ１は、ＡまたはＴであってよく；
Ｘｃ２は、ＡまたはＰであってよく；
Ｘｃ３は、ＦまたはＬであってよく；
Ｘｃ４は、ＮまたはＬであってよく；
Ｘｃ５は、ＬまたはＰであってよく；
Ｘｃ６は、ＴまたはＥであってよく；
Ｘｃ７は、ＳまたはＰであってよく；
Ｘｃ８は、ＳまたはＧであってよく；
Ｘｃ９は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘｃ１０は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよい。
さらに本発明の別の実施形態は、例えば、配列番号４２に記載される重鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列１））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＱＶＱＸＱＱＸＧＡＥＸＸＫＰＧＸＳＶＫＸＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＸＱＸＰＧＱＧＬＥＷＸＧＬＩＮＰＳＮＡＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴＸＸＴＸＴＸＤＫＳＸＳＴＡＹＭＸＬＳＳＬＸＳＥＤＸＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＧＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＸＴＶＳＳ（配列番号４２）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２６（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。
さらに別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号４３に記載される重鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列２））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＱＶＱＸｄ１ＱＱＸｄ２ＧＡＥＸｄ３Ｘｄ４ＫＰＧＸｄ５ＳＶＫＸｄ６ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＸｄ７ＱＸｄ８ＰＧＱＧＬＥＷＸｄ９ＧＬＩＮＰＳＮＡＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴＸｄ１０Ｘｄ１１ＴＸｄ１２ＴＸｄ１３ＤＫＳＸｄ１４ＳＴＡＹＭＸｄ１５ＬＳＳＬＸｄ１６ＳＥＤＸｄ１７ＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＧＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＸｄ１８ＴＶＳＳ（配列番号４３）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２６（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ１、Ｘｄ３、Ｘｄ５、Ｘｄ６，Ｘｄ７、Ｘｄ９、Ｘｄ１０、Ｘｄ１２、Ｘｄ１４、Ｘｄ１５、Ｘｄ１７、Ｘｄ１８は、各々独立に、配列番号２６と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ２、Ｘｄ１１、Ｘｄ１３は、各々独立に、配列番号２６と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ４は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｄ８は、ＲまたはＡであってよく；
Ｘｄ１６は、ＴまたはＲであってよい。
さらに別の実施形態において、本発明は、例えば、配列番号４４に記載される重鎖可変ドメイン（Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列３））を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
ＱＶＱＸｄ１ＱＱＸｄ２ＧＡＥＸｄ３Ｘｄ４ＫＰＧＸｄ５ＳＶＫＸｄ６ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＸｄ７ＱＸｄ８ＰＧＱＧＬＥＷＸｄ９ＧＬＩＮＰＳＮＡＲＴＮＹＮＥＫＦＮＴＸｄ１０Ｘｄ１１ＴＸｄ１２ＴＸｄ１３ＤＫＳＸｄ１４ＳＴＡＹＭＸｄ１５ＬＳＳＬＸｄ１６ＳＥＤＸｄ１７ＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＧＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＸｄ１８ＴＶＳＳ（配列番号４４）；
ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２６（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＬ）であってよく；
Ｘｄ２は、ＰまたはＳであってよく；
Ｘｄ３は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｄ４は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｄ５は、ＡまたはＳであってよく；
Ｘｄ６は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｄ７は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｄ８は、ＲまたはＡであってよく；
Ｘｄ９は、疎水性アミノ酸（例えば、ＩまたはＭ）であってよく；
Ｘｄ１０は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｄ１１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＡまたはＶ）であってよく；
Ｘｄ１２は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＩ）であってよく；
Ｘｄ１３は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＡ）であってよく；
Ｘｄ１４は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｄ１５は、ＱまたはＥであってよく；
Ｘｄ１６は、ＴまたはＲであってよく；
Ｘｄ１７は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｄ１８は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよい。
「ヒト化抗体」という用語は、完全にヒト化された抗体（すなわち、フレームワークが１００％ヒト化されている）および部分的にヒト化された抗体（例えば、少なくとも１つの可変ドメインが、ヒト抗体由来の１つまたは複数のアミノ酸を含むが、他のアミノ酸は、非ヒト親抗体のアミノ酸である）を包含する。典型的に、「ヒト化抗体」は、非ヒト親抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類など）のＣＤＲ、ならびに天然のヒト抗体またはヒト抗体コンセンサス配列のそれと同一であるフレームワークを含む。こうした場合、「ヒト化抗体」は、完全にヒト化されたものとして特性決定される。「ヒト化抗体」はまた、ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサス配列との対応がない１つまたは複数のアミノ酸置換も含んでもよい。このような置換として、例えば、抗体特性（例えば、親和性、特異性など）を保存し得る復帰突然変異（例えば、非ヒトアミノ酸の再導入）がある。こうした置換は、通常、フレームワーク領域内に存在する。「ヒト化抗体」は、任意選択で、定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含み、これは、典型的に、ヒト抗体のそれである。典型的には、「ヒト化抗体」の定常領域は、ヒト抗体のそれと同一である。
もちろん、本明細書に記載のものと同じアミノ酸配列を有する抗体、抗原結合性フラグメントまたは抗体部分（軽鎖または重鎖可変領域）は、それが、ヒト化技術、ハイブリドーマ技術、トランスジェニックマウス技術またはその他のいずれによって得られたかに関係なく、本発明に包含される。
本発明の抗体のフレームワークアミノ酸は、天然のヒト抗体のものと８０％〜１００％（例えば、８５〜１００％；９０〜１００％、９５〜１００％）同一であってよいことを本明細書においては理解されたい。通常、フレームワークアミノ酸が天然の抗体の対応するアミノ酸と同一でない場合には、こうしたアミノ酸は、元のアミノ酸（例えば、マウスアミノ酸）と同一のままであってもよい。
本明細書で用いる「１〜２５」という用語は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、および２５まで；１〜２５；１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９；１〜１８；１〜１７；１〜１６；１〜１５など；２〜２５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０；２〜１９；２〜１８；２〜１７など；３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０；３〜１９；３〜１８など；４〜２５、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９；４〜１８；４〜１７；４〜１６など；５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０；５〜１９；５〜１８；５〜１７などの範囲である。
同様に、その他の範囲、例えば、「１〜２２」は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、および２２まで；１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５；１〜１４；１〜１３；１〜１２；１〜１１；１〜１０など；２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５；２〜１４；２〜１３；２〜１２など；３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５；３〜１４；３〜１３など；４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５；４〜１４；４〜１３；４〜１２；４〜１１など；５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５；５〜１４；５〜１３；５〜１２などの範囲である。
本発明のより具体的実施形態では、配列番号６に由来する軽鎖可変領域に作成され得るアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１１のアミノ酸置換であってよい。
本発明のさらに具体的実施形態では、配列番号１２に由来する重鎖可変領域に作成され得るアミノ酸置換の数は、例えば、１〜２１のアミノ酸置換であってよい。いくつかの例では、配列番号１２を考慮する場合、少なくとも３つのアミノ酸置換を有するのが有用であり得る。
本発明のさらにまた具体的実施形態では、配列番号２２に由来するヒト化軽鎖可変領域に作成され得るアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１０のアミノ酸置換であってよい。
本発明のさらにまた具体的実施形態では、配列番号２６のヒト化重鎖可変領域に作成され得るアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１８のアミノ酸置換であってよい。
本発明の一実施形態によれば、アミノ酸置換は、例えば、軽鎖可変領域において存在し得る。
本発明の一実施形態によれば、アミノ酸置換は、例えば、重鎖可変領域において存在し得る。
ゆえに、抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号６または配列番号２２と比較して、２２以下のアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を有してもよく、また、配列番号１２または配列番号２６と比較して、２５以下のアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を有してもよい。抗体または抗原結合性フラグメントが、２つの軽鎖可変領域および２つの重鎖可変領域を有する場合、軽鎖可変領域の各々が、独立に２０以下のアミノ酸置換を有し、重鎖可変領域の各々が、２０以下のアミノ酸置換を有してよいことを理解されたい。
本明細書に記載するように、アミノ酸置換は、保存的または非保存的のいずれであってもよい。例示的実施形態では、アミノ酸置換は保存的であってよい。
本明細書において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、必要に応じて、配列番号６、配列番号１２、配列番号２２および／または配列番号２６と比べて、欠失を示す軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を有し得る。このような欠失は、例えば、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のアミノ基またはカルボキシ基に存在してよい。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態は、例えば、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号８または配列番号１０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を有する抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。
本明細書において、「配列番号３３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、または少なくとも１１２個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号３３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３３に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号３３の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３３のアミノ酸６〜１０８、５〜１０９、１３〜１０３、１４〜１１１を含む配列などを包含する。
本明細書において、「配列番号３４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、または少なくとも１１２個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号３４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３４に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号３４の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３４のアミノ酸７〜１０９、１２〜１０４、２２〜１１２、１８〜１１２などを含む配列を包含する。
「配列番号３５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、または「配列番号１０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号８または配列番号１０に示す軽鎖可変領域を有していてもよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号３６、３７、３８、１４、１６、１８または２０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（または、さらに含む）。
本明細書において、「配列番号３６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１または少なくとも１２３個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号３６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３６に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号３６の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３６のアミノ酸１〜１０６、２〜１１２、１１〜１１３、７〜１０２などを含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号３７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２または少なくとも１２３個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号３７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３７に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号３７の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３７のアミノ酸６〜１０９、８〜１１３、１〜１０２、２〜１０５などを含む配列を包含する。
「配列番号３８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、または「配列番号２０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１４、１６、１８または２０に示す重鎖可変領域を有していてもよい。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、以下のものを含み得る：
ａ）配列番号３３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｂ）配列番号３４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｃ）配列番号３５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；
ｄ）配列番号８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域；または
ｅ）配列番号１０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域。
本発明のより具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号８または９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよく、また重鎖可変領域は、配列番号１４、１６、１８または２０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号８または１０に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１４、１６、１８または２０に示す通りであってよい。
より具体的には、配列番号８に記載される軽鎖可変領域と、配列番号１４に記載される重鎖可変領域とを含む抗体が考慮される。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの他の例示的実施形態は、配列番号３９、４０、４１、または２４のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を含むものであってよい。
本明細書において、「配列番号３９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１または少なくとも１１２個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号３９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号３９に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号３９の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号３９のアミノ酸６〜１０２、１〜１０６、３〜９５、５〜９５などを含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号４０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１または少なくとも１１２個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号４０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号４０に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号４０の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号４０のアミノ酸９〜１０６、１０〜１０１、１〜９８、３〜９９などを含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号４１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号２４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号２４に示す軽鎖可変領域を有していてもよい。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号４２、４３、４４または２６のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（または、さらに含む）。
本明細書において、「配列番号４２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７または少なくとも１１８個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号４２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号４２に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号４２の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号４２のアミノ酸６〜１１１、２〜１０４、５〜１０６、１０〜１０７などを含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号４３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７または少なくとも１１８個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号４３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号４３に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号４３の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号４３のアミノ酸３〜１０７、１〜１１５、１〜１１０、２２〜１１６、２０〜１１５などを含む配列を包含する。
「配列番号４４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号２６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号２６に示す重鎖可変領域を有していてもよい。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、以下のものを含み得る：
ａ）配列番号３９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号２６のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｂ）配列番号４０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号２６のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｃ）配列番号４１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号２６のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｄ）配列番号２４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４または配列番号２６のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域。
本発明のより具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号２４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を有してよく、重鎖可変領域は、配列番号２６のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を有してよい。
本発明のさらに具体的な実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号２４に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号２６に示す通りであってよい。
本発明の実施形態は、より具体的には、以下のものからなる群から選択される抗体または抗原結合性フラグメントを含む：
ａ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号１３に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｂ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号１５に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｃ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号１７に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｄ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号１９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｅ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号２９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｆ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号５９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｇ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号６０に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｈ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号６１に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｉ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号１３に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｊ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号１５に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｋ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号１７に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｌ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号１９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｍ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号２９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｎ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号５９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｏ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号６０に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｐ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号６１に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｑ．配列番号２３に記載の軽鎖と、配列番号２７に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｒ．配列番号２３に記載の軽鎖と、配列番号４６に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント。
本発明の他の実施形態は、以下のものからなる群から選択される抗体または抗原結合性フラグメントを含む：
ａ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号１３に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｂ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号１５に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｃ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号１７に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｄ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号１９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｅ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号２９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｆ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号５９に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｇ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号６０に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｈ．配列番号５に記載の軽鎖と、配列番号６１に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｉ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号１１に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｊ．配列番号７に記載の軽鎖と、配列番号３０に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；
ｋ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号１１に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント；および
ｌ．配列番号９に記載の軽鎖と、配列番号３０に記載の重鎖とを含む抗体またはその抗原結合性フラグメント。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、上に記載した軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでよく、また、定常領域のアミノ酸、例えばヒト抗体の定常領域のアミノ酸をさらに含んでもよい。
例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでよい。
例えば、対応するＩｇＧ２サブタイプ＊または他のサブタイプ）と比較して、少なくとも１０倍の活性の増大を有するＩｇＧ１サブタイプの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、特に考慮される。
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００倍以上のＩｇＧ１ベースの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の効力増大、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００倍以上のその親和性増大が特に有用となり得る。
同一またはほぼ同一のＣＤＲまたは可変領域を有する様々な抗体サブタイプと比較して、ＩｇＧ１ベース抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、破砕細胞分化または破砕活性を阻害する能力により、効力または親和性の増大を測定してもよい。状況によっては、ｉｎ ｖｉｔｒｏで破骨細胞分化および／または骨吸収を阻害する目的で、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌという低いＩｇＧ１抗体濃度を用いて考慮することも可能である。本明細書において、例えば、対応するＩｇＧ２ベース抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５と比較して、より低い用量のＩｇＧ１ベース抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、所望の治療効果を達成し得ることは理解されよう。
特に考慮される抗体は、κ軽鎖定常領域およびＩｇＧ１重鎖定常領域を有するものが挙げられる。
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、例えば本明細書に記載するアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体が挙げられる。ここで同定されるアミノ酸配列を有するヒトおよびヒト化抗体が、特に考慮される。
ａ）配列番号６に記載の軽鎖可変領域と、配列番号１２に記載の重鎖可変領域；またはｂ）配列番号２２に記載の軽鎖可変領域と、配列番号２６に記載の重鎖可変領域とから構成される抗体またはその抗原結合性フラグメントの配列は、マウス由来（すなわち、非ヒト抗体）であるとみなされることは理解すべきである。
本明細書に示すように、非ヒト抗体のヒト化は、例えば天然のヒト抗体の対応アミノ酸のフレームワークアミノ酸の置換により実施することができる。置換は、通常は抗原結合にマイナスの影響を与えない様式で実施される。
本発明の別の例示的実施形態によれば、抗原結合フラグメントは、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）２であってよい。
組換えＳｉｇｌｅｃ−１５との結合アッセイ、ならびにヒト破骨細胞の分化および活性を阻害するその能力についての評価に基づき、候補リード抗体２５Ｄ８および２５Ｅ９をヒト化のために選択した。この実験報告には、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏヒト化方法と、こうして得られる抗体のヒト化形態を記載する。
実施例１．マウス２５Ｄ８および２５Ｅ９モノクローナル抗体の可変領域の３Ｄモデル化
相同性モデル化により、このタスクを達成した。マウス２５Ｄ８（配列番号２２および配列番号２６）ならびに２５Ｅ９（配列番号６および配列番号１２）可変配列と最も類似した鋳型構造を、ＰＤＢに対するｂｌａｓｔ検索により同定した。マウス２５Ｄ８可変領域の初期モデルを構築するために、以下の鋳型構造を用いた（ＰＤＢコード）：軽鎖については３ＣＦＣ、および重鎖については１ＮＧＱ。マウス２５Ｅ９可変領域の初期モデルを構築するために、以下の鋳型構造を用いた：軽鎖については１ＡＥ６、および重鎖については１ＮＭＣ。これらの鋳型構造上に、マウス２５Ｄ８および２５Ｅ９配列に従って突然変異を操作した：３ＣＦＣ軽鎖（全てＣＤＲ内）において３つの突然変異、１ＮＧＱ重鎖において１７の突然変異（フレームワーク内で３つ、ＣＤＲ内で１４）、１ＡＥ６軽鎖において７つの突然変異（フレームワーク内で４つ、ＣＤＲ内で３つ）、および１ＮＭＣ重鎖において３４の突然変異（フレームワーク内で１７、ＣＤＲ内で１７）。ＣＤＲループは、各抗体におけるＣＤＲ−Ｈ３ループ（１ＮＧＱから２５Ｄ８に２残基欠失を、１ＮＭＣから２５Ｅ９に１残基挿入を実施した）を除いて、ＣＤＲループは、長さの調節を一切必要としないと思われた。それぞれの鋳型構造の重鎖および軽鎖を重ね合せることにより、マウス２５Ｄ８および２５Ｅ９可変ドメインの重鎖および軽鎖に対応する突然変異構造を実質的に２本鎖抗体構造にアセンブルした。まず初めに、ＡＭＢＥＲ力場、ならびに最初に弛緩したＣＤＲループから、最後の段階で初めて完全に弛緩したフレームワーク領域の骨格重原子まで変動する段階的な束縛開放を用いたエネルギー最小化により、アセンブルした２５Ｄ８および２５Ｅ９可変ドメインの得られる構造を精密化した。次に、各抗体可変ドメイン構造のＣＤＲ−Ｈ３ループをＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ最小化（ＭＣＭ）構造探索により精密化したが、ここで、ＣＤＲ−Ｈ３領域中の二面角をＭＣＭ周期毎にサンプリングした後、ＣＤＲ−Ｈ３ループの初期構造の周辺に１０Å延びる、予め定めた領域のエネルギー最小化を行った。
マウス２５Ｄ８および２５Ｅ９抗体のモデル化可変領域の表示をそれぞれ図１Ａおよび１Ｂに示す。マウス２５Ｄ８（図１Ａ）および２５Ｅ９（図１Ｂ）抗体の可変領域の相同性３Ｄモデル。ＣＤＲを標識する（軽鎖ではＬ１、Ｌ２、Ｌ３、および重鎖ではＨ１、Ｈ２、Ｈ３）。ヒトフレームワーク残基により置換されるマウスフレームワーク残基を青色の球体モデルとして示す。２５Ｅ９重鎖における保持されたマウス残基は、赤色の球体モデルで表し、標識している。
２５Ｄ８および２５Ｅ９可変配列の各々とほぼ類似したヒトまたはヒト化可変配列の構造もＰＤＢから同定し、マウス２５Ｄ８および２５Ｅ９可変ドメインのモデル化構造に重ね合せた。これは、モデル化マウス３Ｄ構造から開始するヒト化３Ｄ構造を構築するために、フレームワーク領域における側鎖突然変異のモデル化に役立つ。
実施例２．マウス２５Ｄ８および２５Ｅ９アミノ酸配列の特性およびモデル化構造
このステップを実施して、ヒト度指数（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ ｉｎｄｅｘ）、抗原接触傾向指数を推定し、ＣＤＲ、カノニカル残基（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｒｅｓｉｄｕｅ）、分子鎖間パッキング（ＶＨ／ＶＬ界面残基）、可変／定常領域パッキング（ＶＨ／ＶＬおよびＶＬ／ＣＬ界面残基）、特異フレームワーク残基、潜在的なＮおよびＯ−グリコシル化部位、埋没残基（ｂｕｒｉｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ）、バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）残基、およびＣＤＲとの隣接残基を画定した。インターネットで入手可能な試料およびローカルソフトウエアを用いて、これらの特性を評価した。
実施例３．マウスＣＤＲに対する最良のヒト軽鎖および重鎖フレームワークの選択
これは、ヒト生殖細胞系データベース（ＶＢＡＳＥ）の局所コピー、他の配列ライブラリー（ＧｅｎｂａｎｋおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、ならびにヒトフレームワークコンセンサス配列のセットとの標準配列相同性比較により実施した。ＢＬＡＳＴ検索を実施して、フレームワーク領域内のみ（従って、ＣＤＲは除外する）で最も高い相同性を有する配列マッチを検索すると共に、ＣＤＲループの長さをマッチングした。重鎖および軽鎖について同定したヒトフレームワークは、２５Ｄ８および２５Ｅ９抗体のいずれも、それぞれ、ｋ２およびｈ１クラスに対応する。突然変異の候補位置でのアミノ酸可変性を評価すると共に、ヒト化の際の親和性喪失のイベントにおけるバックアップとして好適なフレームワークのプールを提供するために、複数の高度に類似したヒトフレームワーク配列を保持した。
これらの相同性ヒトフレームワーク配列を、それぞれ図２および３に示すマウス２５Ｄ８および２５Ｅ９配列とアラインメントする。Ｋａｂａｔ番号付けおよび抗原接触傾向スコアを上部に示す。ＣＤＲをグレーで強調する。ＣＤＲへの近接、表面露出、および対合可変ドメインとの接触に応じて、復帰突然変異の候補残基を配列アラインメントの下に強調して示す。復帰突然変異の一次候補位置を矢印で示す。
実施例４．立体配座および抗原決定に影響を与え得るマウスフレームワーク残基の同定
これは、特に注意して、対応するヒト配列に対し、突然変異を実施すべきアミノ酸残基をフラッグする重要なステップである。これらの残基は、親和性損失の場合に、マウス配列への復帰突然変異のための一次候補を示す。これは、とりわけ、抗体−抗原複合体の実験構造の非存在下で、設計によるヒト化の最も困難かつ予測不可能なステップである。これは、以下のカテゴリー：カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）残基、ＣＤＲ−Ｈ３残基、バーニアゾーン（Ｖｅｒｎｉａ ｚｏｎｅ）残基、特異残基、ＣＤＲとの近接残基（５Å以内）、分子鎖間パッキング残基、およびグリコシル化部位残基の１つまたは複数における残基の同定を利用する。このような残基は、抗原結合部位および親和性に影響を直接または間接的に与え得る。また、各位置でのヒト生殖細胞系データベースにおける抗原接触傾向指数およびアミノ酸発生も、特定の残基がマウス配列からヒト配列へと安全に突然変異することができるかどうかを決定する上で、極めて重要である。２５Ｄ８および２５Ｅ９軽鎖および重鎖可変配列の、提案されるヒト化配列をそれぞれ図２および３に示す。各ヒト化配列およびそのドナーマウス配列、ならびにいくつかのアラインメントした候補アクセプター配列の間のフレームワーク突然変異の数も記載する（括弧内にフレームワークの割合（％）として示す）。突然変異残基および復帰突然変異のための候補残基も図１、２および３に示す。図からわかるように、２５Ｄ８および２５Ｅ９抗体の軽鎖は、各々の提案されたヒト化フレームワークに対して、それぞれ９および１１の突然変異を必要とすると考えられる。これは、軽鎖については１００％フレームワークヒト化の試みを表す。各抗体の重鎖は、ヒト化のためにその軽鎖より実質的に多くの突然変異、すなわち、２５Ｄ８の場合には１８、２５Ｅ９の場合には１７を必要とすると考えられる。さらに、重鎖のヒト化配列は、ヒトフレームワーク配列と完全には（１００％）対応しない。特に、２５Ｅ９重鎖の場合には、提案されたフレームワークヒト化の最高レベルは、最初の試みで９４％であり、これは、ヒト化配列が、最も近いヒトフレームワーク配列と５残基異なることを意味する。２５Ｅ９マウス配列由来のこれら残基のうち４つを保持する決定を、入念な構造および比較配列解析に基づいて行ったところ、抗原結合ＣＤＲとの近接（図１ｂを参照）により、突然変異が、次の位置：ＧｌｕＨ１、ＩｌｅＨ２、ＴｈｒＨ９３、およびＳｅｒＨ９４に導入されれば、抗原結合親和性が改変される高い確率を示した。Ｇｌｕは、ヒトフレームワーク配列においてＨ１位置にみいだされる共通の残基であることに留意しなければならない（図３参照）。ヒト化配列において直近のヒトフレームワークと異なる第５残基は、マウス配列におけるＨｉｓＨ４３であり、これは、ヒト化配列においてＧｌｎＨ４３に突然変異した（Ｇｌｎは、この位置で共通であるが、Ｈｉｓは、希有である）。２５Ｄ８可変重鎖フレームワークのヒト化の場合、これは、９９％に達した。すなわち、直近のヒトフレームワークに出現するＡｓｐＨ８１をマウス配列のＧｌｎ８１で置換したヒト化配列において、直近のヒトフレームワーク配列に対し、提案されたヒト化配列のフレームワークにおける１つの残基：ＧｌｕＨ８１が異なった。位置Ｈ８１のＡｓｐをＧｌｕに突然変異させる決定は、ヒトフレームワークにおいて考えられるこれら２つの置換の相対的発生頻度に基づいて行った（図２を参照）。全体として、２５Ｄ８抗体のヒト化は、２５Ｅ９抗体のそれより容易であると結論付けることができる。
実施例５．追加的構造解析
ヒト化配列を組換え発現に付す前の追加的構造解析は、シグナルペプチドの選択、アイソタイプの選択、可変／定常領域結合部での構造適合性の解析を含んだ。加えて、マウスおよびヒト化配列同士の鎖間パッキングおよび可変／定常領域パッキングの比較解析から、２５Ｄ８および２５Ｅ９ヒト化の場合に、ヒト化およびキメラ（マウス可変領域）鎖を組み合わせたハイブリッド抗体、すなわち軽鎖／重鎖ペアリングとしてのマウス／マウス（Ｍ／Ｍ）、マウス／ヒト化（Ｍ／Ｈ）、ヒト化／マウス（Ｈ／Ｍ）およびヒト化／ヒト化（Ｈ／Ｈ）抗体を作製することが実現可能となり得ることが判明した。２５Ｄ８および２５Ｅ９全長ＩｇＧ２抗体についてアセンブリングしたヒト化およびキメラ配列を図４Ａおよび図４Ｂにそれぞれ示す。２５Ｄ８および２５Ｅ９全長ＩｇＧ１抗体についてアセンブリングしたヒト化およびキメラ配列を図１２Ａおよび１２Ｂにそれぞれ示す。
本明細書に開示する軽鎖の各々と、本明細書に開示する重鎖変異体の各々とを混合することにより、抗体の他の例示的実施形態を作製してよい。例えば、２５Ｅ９軽鎖ヒト化変異体２可変ドメイン（配列番号１０）と、２５Ｅ９重鎖ヒト化可変ドメイン変異体１、２、３または４（配列番号１４、１６、１８もしくは２０）をそれぞれ含む軽鎖および重鎖の結合により、抗体を作製してもよい。２５Ｅ９軽鎖ヒト化変異体１可変ドメイン（配列番号８）と、２５Ｅ９重鎖ヒト化可変ドメイン変異体１、２、３または４（配列番号１４、１６、１８もしくは２０）をそれぞれ含む軽鎖および重鎖の結合により作製された抗体が特に考慮される。軽鎖ヒト化変異体１可変ドメイン（配列番号８）と、重鎖ヒト化可変ドメイン変異体１（配列番号１４）を含むヒト化２５Ｅ９抗体（別名：Ｌ１Ｈ１ＩｇＧ２変異体（配列番号７および２９）またはＬ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体（配列番号７および１３））をさらなる実験のために選択した。しかし、本明細書に開示する実験によれば、κ鎖定常領域およびＩｇＧ１重鎖定常領域を有する抗体は、興味深い特性を有すると考えられる（例えば、Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体（配列番号７および１３））。
配列番号７の軽鎖と配列番号１３、１５、１７、１９、２９、５９、６０もしくは６１に記載される重鎖のいずれかとの結合、または配列番号９の軽鎖と配列番号１３、１５、１７、１９、２９、５９、６０もしくは６１に記載される重鎖のいずれかとの結合が考慮される。
実施例６．ヒト化Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合パラメータの解析
一過性トランスフェクションにより、マウスおよび選択されたヒト化またはキメラ２５Ｄ８ ＩｇＧ２およびヒト化２５Ｅ９（Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２、Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１、Ｌ１Ｈ２ ＩｇＧ、Ｌ１Ｈ３およびＬ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体）抗体の小さなロットを生成して、いくつかの比較解析を実施することができるように、これらを精製した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法を用いて、組換えＳｉｇｌｅｃ−１５と様々な抗体の直接結合を測定した。ＥＬＩＳＡ方法と同様に、ＳＰＲ実験で用いたＳｉｇｌｅｃ−１５を２９３−６Ｅ細胞においてＦｃ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５融合タンパク質として発現させた。Ｆｃコンジュゲートとして、Ｆｃ領域でのホモ二量体相互作用により、タンパク質を二量体として発現させ得ることに留意すべきである。この事象は、結合中に結合活性効果を生み出すことができたが、これにより、親和性定数の直接決定を実施することができなかった。さらに、抗体およびＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質の両方にＦｃ領域が存在すると、直接親和性決定を行うことができない。従って、各抗体サンプルの結合結果は、互いに対する関連でのみ表示する。
試験を実施するために、キメラ（マウス可変領域）２５Ｄ８ ＩｇＧ２、キメラ２５Ｅ９ ＩｇＧ２、ヒト化２５Ｄ８ ＩｇＧ２またはヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２を直接用いた。比較のために、完全なマウス抗体の精製した調製物も試験した。抗体の精製バッチの場合、サイズ排除クロマトグラフィーを全てのタンパク質サンプルに対して実施することにより、調製物中の凝集体の割合を低減した。ＳＰＲの場合、Ｆｃ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５をセンサーチップ上に固定化した後、抗体希釈物をチップに注入した（流した）。２５Ｄ８および２５Ｅ９抗体についての典型的スキャンを図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示す。
２５Ｄ８抗体の場合、スキャンは、抗体のマウス、キメラおよびヒト化形態の間で非常に類似していた。これにより、この抗体のヒト化の最中に動態パラメータが有意には変化しないことが明らかにされた。クロマトグラムの間にわずかな差はあるが、精製抗体と細胞上澄みの間で比較を実施したことから、このことは予想されるものであった。
２５Ｅ９の場合、キメラおよびマウス抗体のクロマトグラムが酷似していた。ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２変異体の場合、オンおよびオフ速度は、他の形態と比較して、やや異なることがわかった。これは、恐らく、細胞上澄みからの妨害によるものと思われた。この相違にもかかわらず、ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２変異体の時細の親和定数は、マウス抗体のそれに非常に近いことが予想された。
培養細胞の表面に発現されたヒトＳｉｇｌｅｃ−１５と相互作用するヒト化抗体の能力を試験した。ヒト２９３−６Ｅ細胞を約１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖させ、全ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を回収して、計数し、１×１０５細胞を、２５Ｅ９のヒト化ＩｇＧ１変異体の濃度を高めながら４℃で１時間インキュベートした。低温ＰＢＳを用いた洗浄ステップの後、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ヒトκ軽鎖ＩｇＧで、結合した２５Ｅ９を検出した。蛍光標識した細胞をフローサイトメータに注入して、インタクトな細胞の表面上の蛍光シグナルを測定した。図８に示すように、ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体は、濃度依存的にヒトＳｉｇｌｅｃ−１５を発現する細胞に結合する。平均ＫＤは、低いナノモル範囲であった。さらに、結合パラメータは、ＣＨＯ細胞または２９３細胞のいずれかに生成されたヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体の存在下で非常に類似していた。対照として、ＰＢＣ、対照ＩｇＧまたは非トランスフェクト２９３細胞のいずれかと一緒にインキュベートしたトランスフェクト細胞も、蛍光シグナルを発生しなかったが、これは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５とヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体同士の相互作用の特異性を示している。他の２５Ｅ９ヒト化ＩｇＧ１抗体変異体（Ｌ１Ｈ２ ＩｇＧ１、Ｌ１Ｈ３ ＩｇＧ１、Ｌ１Ｈ４ ＩｇＧ１およびＬ１Ｈ１ ＩｇＧ２）またはヒト化２５Ｄ８ ＩｇＧ２抗体でも、同様の結果が得られた。
実施例７．抗体試験
細胞培養
破骨細胞分化を誘導するために、１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ中に増殖させたマウスＲＡＷ２６４．７細胞を擦り取り、ＰＢＳ中に再懸濁させた。１００ｎｇ／ｍｌマウスＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含む培地中で細胞を２×１０４細胞／ｃｍ２で平板培養した。細胞を３日間（免疫蛍光顕微鏡検査のために）または４日間（他の全ての実験のために）分化させた。ＣＤ１４マイクロビーズおよびＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の指示に従い、ヒト破骨細胞前駆細胞（ＣＤ１４＋末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ））を正常ヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から単離した。１０％胎仔ウシ血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２５ｎｇ／ｍｌのヒトＭＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのヒトＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＡｌｐｈａ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で、細胞を３．１×１０５細胞／ｃｍ２で平板培養した。第４日に培地の半分を取り換え、細胞を７日間分化させた。
細胞刺激
単一抗体による細胞刺激のために、様々な時点で細胞を溶解させる前に、表示した抗体濃度を含む新鮮な増殖培地（ＲＡＮＫＬを含まない）と分化培地を取り換えた。一次および二次（架橋）抗体による刺激のために、分化培地を、１０μｇ／ｍｌで一次抗体を含有する低温増殖培地と取り換えた後、細胞を４℃で２０分インキュベートした。次に、抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を含む温かい増殖培地と取り換えた後、３７℃で、表示した時間、溶解まで細胞をインキュベートした。
破骨細胞ＴＲＡＰ染色およびｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
破骨細胞分化および機能に対する抗体の作用を試験するために、表示した濃度の抗体を含む培地において、前述のように細胞を誘導して分化させた。ＴＲＡＰ染色により、培養して４日後に破骨細胞を視覚化した。手短には、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳで透過性にし、３７℃で約３０分ＴＲＡＰ染色バッファー（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、５０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．０１％ナフトールＡＳＭＸおよび０．０６％Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｖｉｏｌｅｔ）中にインキュベートした。ＴＲＡＰ酵素は、破骨細胞中に赤い反応産物を生成する。破骨細胞の吸収活性を試験するために、リン酸カルシウム基質でコーティングしたウェル（Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ，ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓまたはＯｓｔｅｏＡｓｓａｙ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）内に細胞を塗布した後、前述のように分化させた。７日後、ウェルを漂白剤で処理することにより、細胞を除去し、基質吸収の領域を光学顕微鏡検査により観察した。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の活性（破骨細胞または破骨細胞前駆細胞において）を阻止することができる抗体は、例えば、より少ないＴＲＡＰ陽性多核細胞を示すか、または改変形態のＴＲＡＰ陽性多核細胞をもたらし得る。これを図９に示す。上方のパネルに示すように、１μｇ／ｍｌのヒト化２５Ｅ９抗体（Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体）に暴露したヒト破骨細胞（上方の右側パネル）は、成熟した多核化破骨細胞を適正に形成することができなかった。対照的に、等量の対照抗体で処理したヒト破骨細胞は、正常に分化した（上方の中央パネル）。破骨細胞が、ミネラル化基質を活発に消化することから、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の活性（破骨細胞または破骨細胞前駆細胞において）を阻止することができる抗体は、例えば、対照（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合していない抗体、抗体の非存在など）と比較して、カルシウム基質が消化された領域（露出領域）が、より少ないと考えられる。ヒト破骨細胞を、骨様表面として作用するリン酸カルシウム基質上で分化させたところ（図９を参照）、対照抗体で処理した細胞（下方の中央パネル）は、広い面積の露出したリン酸カルシウムを生成したが、これは、破骨細胞が、骨吸収活性を発揮することを示している。対照的に、１μｇ／ｍｌの２５Ｅ９（Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体）で処理した細胞（下方の右側パネル）は、基質を吸収することができなかったが、これは、非分化前駆細胞（下方の左側パネル）と同様であった。
２５Ｄ８抗体が破骨細胞を阻害する能力は、ヒト化後も保存されたが、その効力は、２５Ｅ９抗体のそれ（ヒト化またはキメラ２５Ｅ９にかかわらず）より常に低いままであった。
別の方法は、破骨細胞に分化したＣＤ１４＋ＰＢＭＣをウシ皮質骨切片上に塗布することを含む（分化は、塗布前、塗布時、または塗布後のいずれに行ってもよい）。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５を添加し、反射型光学顕微鏡検査により、骨切片表面上に生成された吸収ピットを観察する。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の活性（破骨細胞または破骨細胞前駆細胞において）を阻止することができる抗体は、例えば、より少数またはより小さい骨吸収ピットをもたらし得る。
本発明者らの結果は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体が、破骨細胞分化および／または骨吸収を阻害することができることを示している。
内在化アッセイ
細胞表面タンパク質をビオンチン標識するために、分化ＲＡＷ２６４．７由来の破骨細胞を１ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＭｇＣｌ２（ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ，ＨｙＣｌｏｎｅ）含有の低温ＰＢＳで２回すすいだ後、ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇで１ｍｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識試薬：スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と一緒に４℃で１時間インキュベートした。グリシン（ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ中１００ｍＭ）で、未反応ビオチン標識試薬をクエンチングすることにより、反応を停止した。Ｓｉｇｌｅｃ−１５内在化を誘導するために、「細胞刺激」において前述したように、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で、もしくは対照ヒトＩｇＧ単独で、または二次架橋抗体と組み合わせて、細胞を処理した。抗体処理後、低温ＮＴバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２％ＢＳＡ）で細胞を２回すすいでから、低温ＮＴバッファー中２５ｍＭで調製したナトリウム−２−メルカプトエタンスルホネート（ＭｅｓＮａ）で２×２５分インキュベートすることにより、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンのジスルフィド結合を低減し、これによって、残留する細胞表面ビオチンを除去した。Ｓｉｇｌｅｃ−１５ビオチン標識の最大可能レベルを測定するために、１つの対照についてＭｅｓＮａ処理を省いた（これらの対照細胞は、ＮＴバッファー単独と一緒２×２５分インキュベートした）。次に、ＰＢＳ／Ｃａ／Ｍｇで５ｍｇ／ｍｌに希釈したヨードアセトアミドで、残留ＭｅｓＮａを１５分間クエンチングした。
破骨細胞により内在化されたビオチン標識Ｓｉｇｌｅｃ−１５の量を評価するために、細胞をｍＲＩＰＡ中で溶解した。ビオチン標識タンパク質をストレプトアビジンプルダウンにより回収した。すなわち、２５０μｇの溶解物を５０μｌのＤｙｎａｌ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒に、４℃で回転しながら、一晩インキュベートした。入念な洗浄後、ウェスタンブロッティングにより、沈殿物質中にＳｉｇｌｅｃ−１５を検出した。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５は内在化され、抗体との結合後に分解される
結合したリガンドおよび抗体のエンドサイトーシスを媒介する能力は、Ｓｉｇｌｅｃファミリーのいくつかのメンバーについて立証されたが、実際に、治療抗体の細胞取込みは、ＣＤ２２およびＣＤ３３Ｓｉｇｌｅｃをターゲティングする抗体薬剤コンジュゲートの作用のメカニズムの重要な要素である（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙおよびＰａｕｌｓｏｎ，２００９）。興味深いことに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５はまた、その細胞質ドメイン中にＹｘｘφ配列も含む（このチロシン、Ｙ３０９はまた、推定ＩＴＩＭモチーフの一部でもある）；Ｙｘｘｆモチーフは、クラスリンアダプターＡＰ−２と相互作用して、受容体内在化を調節することができる（Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７；ＢｏｎｉｆａｃｉｎｏおよびＴｒａｕｂ，２００３）。従って、本発明者らは、破骨細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−１５エンドサイトーシスに対する抗体結合の効果を調べた。
本発明者らは、最初に、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、単独または二次架橋抗体と組み合わせて、ＲＡＷ２６４．７由来の破骨細胞の表面から、ビオチンで標識したＳｉｇｌｅｃ−１５の内在化を誘導することができるか否かを試験した。抗体刺激後に、残留する一切の細胞表面ビオチンを、還元剤を用いた処理により放出させた。細胞を溶解した後、内在化して、ビオチン標識タンパク質をストレプトアビジンビーズで回収した。ウェスタンブロッティングにより、沈殿物質中のＳｉｇｌｅｃ−１５を検出した。興味深いことに、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体単独による処理で、対照ヒトＩｇＧと比較して、実質的内在化が誘導されたことが判明した（図１０Ａ、ランス（ｌａｎｃｅ）７および８を比較）が、受容体クラスター形成を誘導するための二次抗体の添加は、単一抗体より効果が低かった（図１０Ａ、レーン５）。
続いて、免疫蛍光顕微鏡検査により、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の抗体誘導エンドサイトーシスの特性決定を実施した。カバーガラス上で増殖するＲＡＷ２６４．７由来の破骨細胞に、正常な増殖培地中で希釈した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５を４℃で、抗体結合を可能にするが、エンドサイトーシスは可能にしない条件下、「低温ロード」した。次に、細胞を直ちに固定するか、または固定前の様々な時点で、抗体を含まない温かい培地中でインキュベートした。固定し、透過性にした破骨細胞でのＳｉｇｌｅｃ−１５の分布に基づいて予測されるように、インタクトな破骨細胞において、低温でロードしたＳｉｇｌｅｃ−１５抗体は、細胞表面に、強力に結合した。３７℃で１０分のインキュベーション後、染色パターンは明らかに変化した。すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、内部斑点内に存在したが、これらは、恐らくエンドソームであろう（図１０Ｂ、中央パネル）。１０分後では、Ｓｉｇｌｅｃ−１５シグナルは、依然として原形質膜付近にあったが、４５分後、ほとんど核周囲性となり、これは典型的に、リソソーム染色パターンである（Ｔｏｙｏｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これは、リソソームマーカＬＡＭＰ−２についてこれら細胞を共染色することにより確認した。実際、４５分で、核周囲領域におけるＳｉｇｌｅｃ−１５およびＬＡＭＰ−２の実質的共局在化がみられ、より早期の時点では、染色パターンは明らかに分散型であった（図１０Ｂ）。
リソソームは、エンドサイトーシス後の受容体分解の主な部位である。これが、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の運命であるかどうかを決定するために、長期間にわたってＲＡＷ２６４．７由来の破骨細胞を抗体で処理し、ウェスタンブロッティングにより全タンパク質抽出物を解析した。本発明者らの結果は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の添加から３時間以内に開始するＳｉｇｌｅｃ−１５タンパク質レベルに明らかな低下があったことを示している（図１０Ｃ、レーン４および６）。対照的に、破骨細胞を対照ＩｇＧに暴露しても、こうしたシグナルの低減を引き起こさなかった。特に、Ｓｉｇｌｅｃ−１５タンパク質レベルの同様の低下が、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５の存在下、ＲＡＮＫＬで分化させた（４ｄについて）ＲＡＷ２６４．７細胞において検出された（図１０Ｄ）。これらを考え合わせると、これらの結果は、二価抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、受容体の高速な内在化を含み、次に、これが分解のためにリソソームにターゲティングされる。
実施例８
細胞溶解物の調製および免疫沈降
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＮａＶＯ４および１ｘＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ非含有ホスファターゼ阻害剤）を含むｍＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコレート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、細胞溶解物を調製した。溶解物タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定した。全細胞溶解物のウェスタンブロッティングのために、等量のタンパク質（１０〜１５ｕｇ）を、βメルカプトエタノール含有ＳＤＳサンプルバッファー中で熱変性させ、１０または１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離してから、ＰＶＤＦに移した後、表示した抗体でプロービングした。免疫沈降のために、２ｍｇまたは１ｍｇの全溶解物を、４μｇの抗体および１５μｌのタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズと一緒に、４℃で回転しながら、４時間インキュベートした。ビーズをｍＲＩＰＡで４回洗浄した後、沈降物質の半分を前述したようにウェスタンブロッティングにより分析した。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５とＤＡＰ１２同士の相互作用およびＳｉｇｌｅｃ−１５の多量体化
近年の研究から、２９３Ｔ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−１５およびＤＡＰ１２のエピトープタグ付加形態の共発現時に、複合体を検出することができ、これは、Ｋ２７３の存在に依存することが立証された（Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明者らは、類似の過剰発現条件下で複合体を検出することもでき（データは示さず）、この複合体が、破骨細胞において内性発現レベルでも存在するかどうかを決定した。分化ＲＡＷ２６４．７由来の破骨細胞、ならびに非分化対照細胞からタンパク質溶解物を調製し、Ｓｉｇｌｅｃ−１５およびＤＡＰ１２抗体を用いて免疫沈降を実施した。ＤＡＰ１２は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５を用いて沈降したタンパク質複合体中に容易に検出され、同様に、抗ＤＡＰ１２も多量のＳｉｇｌｅｃ−１５を沈降した。予測した通り、Ｓｉｇｌｅｃ−１５タンパク質発現レベルに基づいて、この複合体は高度に破骨細胞特異的であり、非分化細胞中には検出されなかった。特に、ＤＡＰ１２発現は、ＲＡＷ２６４．７破骨細胞の分化中に著しく変化しなかった。
以前の研究から、ＩＴＡＭモチーフ上でリン酸化すると、ＤＡＰ１２は、いくつかのシグナル伝達経路、例えば、Ｐｌ３Ｋ−Ａｋｔ、ＰＬＣｇおよびＧｒｂ２−Ｒａｓ−Ｅｒｋカスケードを活性化することができる（ＴｕｒｎｂｕｌｌおよびＣｏｌｏｎｎａ，２００７）。しかし、特定の状況におけるＤＡＰ１２のシグナル伝達出力は、その関連受容体に大きく依存する（ＴｕｒｎｂｕｌｌおよびＣｏｌｏｎｎａ，２００７）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５について同定された天然のリガンドまたは分子パートナーの非存在下で、本発明者らは、抗体架橋の手法を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５が、細胞内シグナル伝達を活性化する能力を評価した。初めに、本発明者らは、３０分までのいくつかの間隔で、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５でＲＡＷ由来の破骨細胞を処理したが、Ａｋｔ、ＰＬＣｇまたはＥｒｋの活性化は全く観察することはできなかった（データは示さず）。しかし、複数の他のＤＡＰ１２関連受容体の場合、二価抗体誘導二量体化ではなく、より高次の受容体のクラスター形成が、ＩＴＡＭ依存性シグナル伝達を誘導するのに必要である（ＴｕｒｎｂｕｌｌおよびＣｏｌｏｎｎａ，２００７；ＵｎｄｅｒｈｉｌｌおよびＧｏｏｄｒｉｄｇｅ，２００７）。多量体化を誘導するために、本発明者らは、一次Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で細胞を処理した後、二次の架橋用抗体で処理した。これらの条件下で、本発明者らは、シグナル伝達効果を観察し（図１１、レーン５、８および１１）、Ａｋｔが、二次抗体架橋の数分以内に強力にリン酸化した。Ａｋｔの最大リン酸化は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５による処理から５分後に達成された（図１１、レーン８）。対照的に、ホスホ−Ｅｒｋ（図１１）およびホスホ−ＰＬＣｇ（図示せず）は、調節されなかった。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の発現の欠如と一致して、同じ条件下で、非分化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＡｋｔの活性化がなかった。同様に、対照ヒトＩｇＧによる一次Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の置換は、シグナル伝達応答を排除した（図１１、レーン３、６、９および１２）。これらの結果から、Ｓｉｇｌｅｃ−１５架橋は、特異的にＡｋｔを活性化するが、ＤＡＰ１２の下流にいずれも位置する他の２つの経路、ＥｒｋまたはＰＬＣｇに影響しない（ＴｕｒｎｂｕｌｌおよびＣｏｌｏｎｎａ，２００７；ＵｎｄｅｒｈｉｌｌおよびＧｏｏｄｒｉｄｇｅ，２００７）。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５による細胞シグナル伝達の誘導が、ＤＡＰ１２ ＩＴＡＭモチーフに依存するのであれば、ＤＡＰ１２のチロシンリン酸化は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５クラスター形成時に検出可能であるはずである。これを試験するために、本発明者らは、ＤＡＰ１２を免疫沈降させ、ウェスタンブロッティングによりそのリン酸化を評価した。Ｓｉｇｌｅｃ−１５を架橋するために一次／二次抗体で刺激した（前述の通り）ＲＡＷ２６４．７由来の破骨細胞において、正にＤＡＰ１２と同様に、１２ｋＤａのチロシン−リン酸化バンドを検出した。同様に処理した非分化細胞、または対照ヒトＩｇＧで処理した破骨細胞においては、ほとんどまたは全くＤＡＰ１２リン酸化は検出されなかった。特に、分化破骨細胞由来のＤＡＰ１２と共に多量のＳｉｇｌｅｃ−１５が共沈降した（予測通り）が、その分子量（３７ｋＤａ）ではホスホチロシンシグナルは全く検出されず、これは、その推定ＩＴＩＭモチーフの一部であるＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞質チロシン残基のリン酸化が、シグナル伝達応答に関与していないことを示している（データは示さず）。このように、本発明者らの結果は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のシグナル伝達モジュールとして作用するＤＡＰ１２と一致し；ＤＡＰ１２は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５クラスター形成後にリン酸化して、そのＩＴＡＭモチーフへのシグナル伝達分子の動員、ひいてはＡｋｔ経路の活性化を引き起こすと考えられる。
このように、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の二量体化または多量体化を阻害することができる抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、破骨細胞または破骨細胞前駆細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−１５活性を阻害し得る。例えば、抗体が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の二量体化または多量体化を阻害する能力を決定するために、ＤＡＰ１２の活性化（例えば、ＤＡＰ１２リン酸化）および／またはその下流エフェクター（Ａｋｔ経路）のレベルを試験してもよい。
実施例９
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体変異体の比較
続いて、本発明者らは、ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ ＩｇＧ１抗体変異体と、対応するヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ ＩｇＧ２抗体変異体（すなわち、これらの抗体は、同じ可変ドメインを有するが、重鎖のヒト定常領域が異なる）とを比較して、以下に説明するｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＩｇＧ１が、対応するＩｇＧ２よりはるかに活性であることをみいだした。
より具体的には、本発明者らは、ＳＰＲを用いて、ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２（Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２変異体）の結合活性を比較した。この分析は、上に記載したもの（実施例６を参照）と類似の方法を用いて実施した。この例では、Ｆｃ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５をチップ上に固定化し、２５Ｅ９抗体変異体の濃度を減らしながら注入した（１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭおよび１．２３ｎＭ）。この結果は、比較ＫＤ値がそれぞれ０．１６４ｎＭおよび１．２６ｎＭと、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体の親和性が、ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２変異体よりほぼ１０倍高いことを示した（図１２を参照）。結合の差は、ほとんどが、ＩｇＧ２と比較してＩｇＧ１のオフ速度（ｋｄ）が遅いことに起因した。
ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体（Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体）およびＩｇＧ２変異体（Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２変異体）のヒト破骨細胞分化を阻害する能力も調べた。ヒト破骨細胞前駆細胞を濃縮し、抗体の濃度を増加しながら、その存在下で、前述のように分化させた（図１３を参照）。ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体の存在下の場合、このアッセイで破骨細胞の分化を完全に阻害するのに必要な抗体は、１００ｎｇ／ｍｌ未満である。対照的に、同じ程度の阻害を達成するのに、１０μｇ／ｍｌのヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ２変異体が必要である。これは、ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体と、対応するＩｇＧ２変異体の効力の約１００倍の差を表している。対照サンプルの場合、１０μｇ／ｍｌのビヒクルまたは対照ＩｇＧのいずれかに暴露した破骨細胞の分化は影響を受けなかった。ＩｇＧ１ベースの抗体の効力の増大は、Ｌ１Ｈ１変異体について立証されたが、このような増大は、他の２５Ｅ９ヒト化変異体、ハイブリッドまたはマウス抗体についても予測される。
実際、本発明者らは、別のＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体、２５Ｄ８の効力は、ＩｇＧ２に対して、ＩｇＧ１の場合に、高度に増大することもみいだした。他の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体も、他のタイプの定常領域ではなく、ヒトＩｇＧ１定常領域を有するものから利益を受けることが予測される。このような抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を発現する細胞または組換えＳｉｇｌｅｃ−１５に対するＩｇＧ１ベースの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の親和性の増大を測定するか、またはＩｇＧ１ベースの抗体が、破骨細胞分化または活性を阻害する能力（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）を試験することによって同定することができる。
これらの結果に基づき、ヒトＩｇＧベースの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、有利なことに、ヒトにおいてより低い用量で投与することができる。
実施例１０
Ｓｉｇｌｅｃ−１５をターゲティングする抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）
本出願人は、破骨細胞の表面上にＳｉｇｌｅｃ−１５との抗体の結合が効率的に内在化された後、分解されたことを明らかにした。また、別の研究から、内在化後にエンドソーム経路が続くため、Ｓｉｇｌｅｃ−１５／抗体複合体を、後期エンドソーム／リソソームのマーカであるＬＡＭＰ２と共局在化することができることも判明した。実験を実施して、ＡＤＣによりＳｉｇｌｅｃ−１５発現細胞をターゲティングする実現可能性を調べた。ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１変異体を、増殖細胞ならびに非増殖細胞、または完全に分化した細胞、とりわけ破骨細胞に有毒なペイロードとコンジュゲートした。ヒト化２５Ｅ９ Ｌ１Ｈ１ ＩｇＧ１コンジュゲート抗体を２５Ｅ９−ＡＤＣと呼ぶ。コンジュゲート形成は、２５Ｅ９が、ネイティブＳｉｇｌｅｃ−１５と相互作用する能力に影響を与え得ることから、フローサイトメトリーを実施して、２５Ｅ９−ＡＤＣとＳｉｇｌｅｃ−１５発現細胞の結合を測定した。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３−６Ｅ細胞を用いて、前述のように実験を実施した。図１５に示すように、非コンジュゲート２５Ｅ９および２５Ｅ９−ＡＤＣは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５トランスフェクト細胞と、よく似た親和性で相互作用した（黒い曲線、ｈ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５を参照）。これは、コンジュゲート形成反応が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と結合する２５Ｅ９−ＡＤＣの能力を変えないことを示した。対照として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５ｃＤＮＡを含まないプラスミドでトランスフェクトした細胞（図１５のグレーの曲線、ベクターを参照）は、２５Ｅ９と結合しなかったが、これは、抗体が、上記細胞と非特異的に結合しないことを示している。
次に、抗体の細胞傷害性を調べた。ヒト破骨細胞前駆細胞を単離し、前述したのと同様の方法で、Ｍ−ＳＣＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で、９６ウェルプレート内に接種した。完全に成熟した多核化ＴＲＡＰ陽性破骨細胞となるように、破骨細胞を７日かけて分化させた。分化後、非コンジュゲート２５Ｅ９、２５Ｅ９−ＡＤＣまたは対照−ＡＤＣと一緒に細胞を４日かけて処理した。標準的熱量測定法を用いて、残った細胞数（生存％）を決定した。予想通り、非コンジュゲート２５Ｅ９は、ヒト破骨細胞の生存に対し作用を及ぼさなかった（図１６参照）。この結果は、２５Ｅ９による破骨細胞分化の強力な阻害にもかかわらず、抗体が、細胞を死滅させないことを示す以前の結果と一致した。対照的に、２５Ｅ９−ＡＤＣは、生存細胞の数の用量依存的減少を示し（図１６）、送達した毒素の細胞傷害性と一致する結果を示した。この細胞傷害性のＩＣ５０値は、サブナノモルの範囲であった。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５と結合しない対照ＡＤＣは、このアッセイにおいて穏やかな非特異的活性を示した。試験の終了時に、破骨細胞に対する抗体の作用を視覚的に調べるために、実施例７に記載した方法を用いて、細胞を固定し、ＴＲＡＰ活性に関して染色した。図１７に示すように、非コンジュゲート２５Ｅ９による処理（上方のパネル）は、破骨細胞の形態に著しい作用を及ぼし、小型で、強度にＴＲＡＰ染色された細胞をもたらしたが、これは、既に示したように、非機能性で、骨吸収活性が完全に消失していた（図９参照）。２５Ｅ９−ＡＤＣによる処理では、破骨細胞の死滅が起こり、１μｇ／ｍｌでほぼ全ての細胞が死滅し（図１７、中央のパネルを参照）、図１６に示す細胞数決定と一致する結果であった。最後に、対照ＡＤＣは、成熟破骨細胞に何らの毒性作用も示さず（図１７、下部パネルを参照）、１０μｇ／ｍｌでも、破骨細胞の数は、非処理細胞で観察された数と同等であった。これらの結果は、２５Ｅ９−ＡＤＣを用いて観察された細胞毒性が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５陽性破骨細胞に特異的であることを示している。
以上を考え合わせると、これらの結果は、破骨細胞の表面に発現されるＳｉｇｌｅｃ−１５をターゲティングするＡＤＣが細胞傷害性を有することを示している。
実施例１１
ｉｎ ｖｉｖｏ機能アッセイ−マウス
ｉｎ ｖｉｖｏ効果の評価は、急速に成長する骨を有する非常に若いマウスを用いて、Ｓｃｈｅｎｋ（Ｍｕｈｌｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）により記載される方法から改変した。手短には、生後３〜４週の雄マウス（５匹／グループ）をＰＢＳ、対照マウスＩｇＧまたはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５と結合することができる抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のいずれかで処理した。抗体は、２６Ｇ針を用いて、４週間にわたり毎週２回腹腔内に投与した。マウスを死なせ、骨を切除し、２４時間にわたり４％パラホルムアルデヒド中に固定した。ＰＢＳで洗浄した後、ＰＩＸＩｍｕｓ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、骨をスキャンすることにより、大腿骨、脛骨および脊椎の骨ミネラル密度（ＢＤＭ）を決定した。骨の３次元画像をＳｋｙＳｃａｎ ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏＣＴ（ＳｋｙＳｃａｎ Ｉｎｃ．，Ｋｏｎｔｉｃｈ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で作成した。
これらの実験のために、生後３〜４週の雄マウスを抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で４週間にわたり処理した後、長骨および脊椎に対する処理の作用を評価した。若いマウスは、この週齢で急速に成長する骨を有することから、骨吸収抑制薬による破骨細胞活性のかく乱は、比較的短い期間で骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の急速かつ著しい増加を引き起こし得る。処理期間後、マウスを安楽死させ、骨を切除し、密度計によりスキャンして、ＢＭＤを計算した。対照マウスＩｇＧと比較して、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体を用いた処理により、これらマウスの大腿骨、脛骨および脊椎のＢＤＭの相当な用量依存的増加が起こった。ＢＭＤの変化をさらに調べるため、Ｘ線顕微鏡断層撮影法（ＭｉｃｒｏＣＴ）を用いて、選択した骨サンプルをスキャンして、そのマイクロアーキテクチャーを解析した。密度測定結果と一致して、対照ＩｇＧ処理マウスおよびＬ５脊椎と比較して、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で処理したマウスの大腿骨および脊椎の骨髄腔体積に顕著な増加が認められた。これら定性観察と一致して、ｍｉｃｒｏＣＴスキャンの定量測定により、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で処理したマウスの骨ミネラル密度の増加が確認された。特に、骨量、骨表面、骨梁数および連結密度において統計的に有意な増加が認められた。反対に、骨梁間隔は有意に低減し、この変化は、骨梁構造の密度増加と一致するものであった。
以下の試験の目的は、ラット卵巣摘出（ＯＶＸ）モデルにおいてＳｉｇｌｅｃ−１５をターゲティングする抗体の作用を測定することであった。
３２匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを擬似手術または卵巣摘出した後、１２週間後にＰＢＳ（ｑ２８ｄ）、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体（抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体、１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ２８ｄ）またはゾレドロン酸（ＺＯＬ、０．１ｍｇ／ｋｇ、単回注射）で処理した。処理から１２週間後、骨を密度測定、ｍｉｃｒｏＣＴ、組織形態計測、３点曲げ試験（大腿骨）および垂直圧力（ＬＶ４）により解析し、ＴＲＡＰ ５ｂおよびＡＬＰレベルについて血清を解析した。
予想通り、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）は、擬似手術したラットと比較して、ＯＶＸ−ＰＢＳグループにおいて顕著に低減したが、ＺＯＬ処理では、ＢＭＤが増大した。２５Ｂ２の投与により、全ての部位でＢＭＤの有意な増大が起こった。これらの変化は、ｍｉｃｒｏＣＴ解析により確認されたが、これは、対照グループと比較して、骨量、骨梁（Ｔｂ）数の有意な増加、ならびに対応するＴｂ間隔の低減を示した。相応して、抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体で処理したラットにおける骨強度の改善が生化学的解析により認められ；最大荷重、剛性および破壊エネルギーパラメータが全て増加した。脛骨セクションを調べたところ、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体処理により、破骨細胞の数が有意に増加したが、ＴＲＡＰ陽性細胞はより小さく、より強度に染色されたことが判明した。血清ＴＲＡＰ ５ｂは、抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体グループで低減したが、これは、破骨細胞によるこの酵素の分泌の低減と一致する。興味深いことに、血清レベルおよびＡＬＰの組織学的染色は、抗体処理ラットにおいて変化しなかった。これは、ＡＬＰ染色の有意な低減をもたらしたＺＯＬ処理の作用とは対照的であった。二重カルセイン標識を用いた動的組織形態計測解析から、骨内膜ミネラル添加速度が、ビヒクルおよびＺＯＬ処理グループの両方と比較して、抗体処理グループにおいて、より高いことが判明したが、これは、抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体による新しい骨形成の刺激を示している。
以上を考え合わせると、本発明者らの結果から、疾病性骨量減少におけるモノクローナル抗体を用いたＳｉｇｌｅｃ−１５のターゲティングは、恐らく、破骨細胞機能の阻害と、骨芽細胞活性の維持の組合せによって、骨質を改善し、強化することが明らかになった。
ｉｎ ｖｉｖｏ機能性アッセイ−サル
霊長類における骨バイオマーカに対するＳｉｇｌｅｃ−１５阻害の作用を調べるために、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をターゲティングするヒト化モノクローナル抗体、２５Ｅ９を、エストロゲン欠乏雌カニクイザルに投与した。
１０ｍｇ／ｋｇでのビヒクル（ＰＢＳ）または２５Ｅ９の２回の静脈内注射を８週間の間隔をあけて２つのグループに投与し、６ヵ月の追跡期間を置いた。４週毎のゴナドトロピン放出ホルモンアゴニストの反復皮下投与により、エストロゲン欠乏を誘導したが、これは２５Ｅ９を投与する３カ月前に開始し、追跡期間全体を通して行った。血清および尿サンプルを毎週回収し、骨吸収および形成バイオマーカを評価し、ＡＢ−２５Ｅ９のＰＫプロフィールを決定し、抗体−薬剤抗体（ＡＤＡ）の存在についてモニターした。
２５Ｅ９による処理は、骨吸収バイオマーカ（尿ＮＴｘ、血漿ＣＴｘおよびＴＲＡＰ５ｂ）を３０％〜４５％低減したが、これは、２５Ｅ９の骨吸収抑制特性を示している。驚くことに、骨形成バイオマーカ（オステオカルシンおよびＢＳＡＰ）は、急速に低減せず、受けた影響は最小限であった。骨吸収バイオマーカのレベルの低下は、ほぼ第６週で減衰し始めたが、これは、ＡＤＡの出現と一致した。興味深いことに、減衰は、ＡＤＡがほとんどまたは全く検出されないサルでは、第２０週まで認められなかった。これらの知見と一致して、ＡＢ−２５Ｅ９血清濃度の低減は、ＡＤＡが検出されたサルにおいて速くなった。ＡＤＡについて陰性であったサルでは、２５Ｅ９の最終排泄相の半減期は５〜１２日の範囲であった。
以上を考え合わせると、本明細書に示したバイオマーカプロフィールは、２５Ｅ９が、エストロゲン欠乏カニクイザルにおいて骨吸収抑制活性を有し、骨形成を維持することを示す。これらの結果は、２５Ｅ９の作用の新たな機構を強調するものであり、骨関連疾患の破骨細胞標的療法についてのその能力を明らかに示している。
マウスまたはサルにおける本発明者らの実験は、３０ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で処理したグループも含んだ。驚くことに、用量の増加は、付加利益に関連していなかった。反対に、場合によっては、１０ｍｇ／ｋｇの用量と比較して、この用量での抗体の作用の低減がみられた。
参照文献
本出願に記載する参照文献の全内容は、参照により本明細書に組み込むものとする。
− Ｓｔｕｉｂｌｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，米国仮特許出願第６１／６７３，４４２号明細書，２０１２年７月１９日出願
− Ｓｔｕｉｂｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，米国仮特許出願第６１／７７７，０４９号明細書，２０１３年３月１２日出願
− Ｓｔｕｉｂｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，米国仮特許出願第６１／８１０，４１５号明細書，２０１３年４月１０日出願
− Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ”，国際出願番号ＰＣＴ／カナダ特許出願公開第２００７／０００２１０（国際公開第２００７／０９３０４２号パンフレットの下、２００７年８月２３日公開）．
− Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｇ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．”Ｓｉｇｌｅｃ １５ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｂｏｎｅ Ｌｏｓｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ”，国際出願番号ＰＣＴ／カナダ特許出願公開第２０１０／００１５８６号明細書（国際公開第２０１１／０４１８９４号パンフレットの下、２０１１年４月１４日公開）；
− Ｈｉｒｕｍａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｇｌｅｃ−１５”；米国特許出願第１２／６７７，６２１号明細書，米国特出願公開第２０１０／０２０９４２８Ａ１号明細書の下、２０１０年８月１９日公開；
− Ｈｉｒｕｍａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，米国特許出願第１３／１４３，２５３号明細書，米国特許出願公開第２０１１／０２６８７３３Ａ１号明細書の下、２０１１年１１月３日公開；
− Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｇｌｅｃ−１５”，国際出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１１／００５２１９号明細書，国際公開第２０１２０４５４８１Ａ２号パンフレッの下２０１２年４月１２日公開；
Ａｎｇａｔａ，Ｔ．，Ｔ．Ｈａｙａｋａｗａ，Ｍ．Ｙａｍａｎａｋａ，ａ．Ｖａｒｋｉ，ａｎｄ Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒａ．２００６． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｉｇｌｅｃ−１４，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｉｇｌｅｃ−５ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０：１９６４−１９７３．
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配列
注：下線を引いた配列は、定常領域を示し、二重下線を引いた配列は、シグナル配列を示し、また、太字で記す配列は、相補性決定領域を示す。
配列番号１（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ｃＤＮＡ）
Figure 0006268173
 配列番号２（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ポリペプチド１〜３２８）
Figure 0006268173
 配列番号３（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ｃＤＮＡ）
Figure 0006268173
 配列番号４（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ポリペプチド）
Figure 0006268173
 配列番号５
２５Ｅ９軽（κ）鎖キメラ（マウス可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号６
２５Ｅ９軽鎖マウス可変ドメイン（シグナル配列なしで示す：ＣＲＤは太字で記す）
Figure 0006268173
 配列番号７
２５Ｅ９軽（κ）鎖ヒト化変異体１（別名：Ｌ１）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号８
２５Ｅ９軽鎖ヒト化変異体１可変ドメイン（別名：ＶＬ１）（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号９
２５Ｅ９軽（κ）鎖ヒト化変異体２（別名：Ｌ２）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号１０
２５Ｅ９軽鎖ヒト化変異体２可変ドメイン（別名：ＶＬ２）（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号１１
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ１）鎖キメラ（マウス可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号１２
２５Ｅ９重鎖マウス可変ドメイン（シグナル配列なしで示す：ＣＲＤは太字で記す）
Figure 0006268173
 配列番号１３
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ１）鎖ヒト化変異体１（別名：Ｈ１）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号１４
２５Ｅ９重鎖ヒト化変異体１可変ドメイン（別名：ＶＨ１）（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号１５
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ１）鎖ヒト化変異体２（別名：Ｈ２）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号１６
２５Ｅ９重鎖ヒト化変異体２可変ドメイン（別名：ＶＨ２）（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号１７
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ１）鎖ヒト化変異体３（別名：Ｈ３）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号１８
２５Ｅ９重鎖ヒト化変異体３可変ドメイン（別名：ＶＨ３）（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号１９
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ１）鎖ヒト化変異体４（別名：Ｈ４）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号２０
２５Ｅ９重鎖ヒト化変異体４可変ドメイン（別名：ＶＨ４）（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号２１
キメラ２５Ｄ８軽（κ）鎖（マウス可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号２２
２５Ｄ８軽鎖マウス可変ドメイン（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号２３
ヒト化２５Ｄ８軽（κ）鎖（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号２４
ヒト化２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号２５
キメラ２５Ｄ８重（Ｉｇｇ２）鎖（マウス可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号２６
２５Ｄ８重鎖マウス可変ドメイン（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号２７
ヒト化２５Ｄ８重（Ｉｇｇ２）鎖（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号２８
ヒト化２５Ｄ８重鎖マウス可変ドメイン（シグナル配列なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号２９
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ２）鎖ヒト化変異体１（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号３０
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ２）鎖キメラ（マウス可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号３１（ヒトＩｇＧ１定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号３２（ヒトＩｇＧ２定常領域）
Figure 0006268173
配列番号３３ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス１）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号６（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は、保存的であってよい。
配列番号３４ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス２）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号６（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ１、Ｘａ４、Ｘａ７、Ｘａ８、Ｘａ１０およびＸａ１１は、各々独立に、配列番号６と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ２、Ｘａ５、Ｘａ６は、各々独立に、配列番号６と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ３は、ＰまたはＬであってよく；
Ｘａ９は、ＡまたはＤであってよい。
配列番号３５ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン（コンセンサス３）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘ（Ｘａ１〜Ｘａ１１）で識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号６（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘａ１は、ＡまたはＳであってよく；
Ｘａ２は、ＡまたはＰであってよく；
Ｘａ３は、ＰまたはＬであってよく；
Ｘａ４は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＬ）であってよく；
Ｘａ５は、ＳまたはＰであってよく；
Ｘａ６は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＡ）であってよく；
Ｘａ７は、芳香族アミノ酸（例えば、ＦまたはＹ）であってよく；
Ｘａ８は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘａ９は、ＡまたはＤであってよく；
Ｘａ１０は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘａ１１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよい。
配列番号３６ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９重鎖可変ドメイン（コンセンサス１）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１２（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。
配列番号３７ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９重鎖可変ドメイン（コンセンサス２）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘ（Ｘｂ１〜Ｘｂ２１）で識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１２（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ２、Ｘｂ４、Ｘｂ５、Ｘｂ７、Ｘｂ８、Ｘｂ９、Ｘｂ１１、Ｘｂ１２、Ｘｂ１３、Ｘｂ１５、Ｘｂ１６、Ｘｂ１７、Ｘｂ１８、Ｘｂ２０およびＸｂ２１は、各々独立に、配列番号１２と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ１、Ｘｂ６、Ｘｂ１４は、各々独立に、配列番号１２（マウスＶＨ）と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ３は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｂ１０は、ＶまたはＧであってよく；
Ｘｂ１９は、ＴまたはＲであってよい。
配列番号３８ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｅ９重鎖可変ドメイン（コンセンサス３）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘ（Ｘｂ１〜Ｘｂ２１）で識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号１２（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｂ１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＡ）であってよく；
Ｘｂ２は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｂ３は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｂ４は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘｂ５は、ＡまたはＳであってよく；
Ｘｂ６は、ＴまたはＫであってよく；
Ｘｂ７は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｂ８は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｂ９は、ＴまたはＡであってよく；
Ｘｂ１０は、ＶまたはＧであってよく；
Ｘｂ１１は、塩基性アミノ酸（例えば、ＨまたはＱ）であってよく；
Ｘｂ１２は、疎水性アミノ酸（例えば、ＩまたはＭ）であってよく；
Ｘｂ１３は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｂ１４は、疎水性アミノ酸（例えば、ＡまたはＶ）であってよく；
Ｘｂ１５は、塩基性アミノ酸（例えば、ＬまたはＩ）であってよく；
Ｘｂ１６は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘｂ１７は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｂ１８は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＴまたはＳ）であってよく；
Ｘｂ１９は、ＴまたはＲであってよく；
Ｘｂ２０は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｂ２１は、ＡまたはＳであってよい。
配列番号３９ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（コンセンサス１）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２２（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。
配列番号４０ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（コンセンサス２）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２２（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ１、Ｘｃ３、Ｘｃ９およびＸｃ１０は、各々独立に、配列番号２２と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ２、Ｘｃ７、Ｘｃ８は、各々独立に、配列番号２２と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ４は、ＮまたはＬであってよく；
Ｘｃ５は、ＬまたはＰであってよく；
Ｘａ６は、ＴまたはＥであってよい。
配列番号４１ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８軽鎖可変ドメイン（コンセンサス配列３）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２２（マウスＶＬ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｃ１は、ＡまたはＴであってよく；
Ｘｃ２は、ＡまたはＰであってよく；
Ｘｃ３は、ＦまたはＬであってよく；
Ｘｃ４は、ＮまたはＬであってよく；
Ｘｃ５は、ＬまたはＰであってよく；
Ｘｃ６は、ＴまたはＥであってよく；
Ｘｃ７は、ＳまたはＰであってよく；
Ｘｃ８は、ＳまたはＧであってよく；
Ｘｃ９は、塩基性アミノ酸（例えば、ＲまたはＫ）であってよく；
Ｘｃ１０は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよい。
配列番号４２ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列１）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２６（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的または非保存的のいずれであってもよい。本発明によれば、アミノ酸置換は保存的であってよい。
配列番号４３ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列２）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２６（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ１、Ｘｄ３、Ｘｄ５、Ｘｄ７、Ｘｄ９、Ｘｄ１０、Ｘｄ１２、Ｘｄ１４、Ｘｄ１５、Ｘｄ１７、Ｘｄ１８は、各々独立に、配列番号２６と比較して保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ２、Ｘｄ１１、Ｘｄ１３は、各々独立に、配列番号２６と比較して半保存的アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ４は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｄ８は、ＲまたはＡであってよく；
Ｘｄ１６は、ＴまたはＲであってよい。
配列番号４４ Ｇｅｎｅｒｉｃ ２５Ｄ８重鎖可変ドメイン（コンセンサス配列３）
Figure 0006268173
 ここで、Ｘで識別されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号２６（マウスＶＨ）に記載されるポリペプチドの対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換であってよく；
Ｘｄ１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＬ）であってよく；
Ｘｄ２は、ＰまたはＳであってよく；
Ｘｄ３は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｄ４は、ＶまたはＫであってよく；
Ｘｄ５は、ＡまたはＳであってよく；
Ｘｄ６は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよく；
Ｘｄ７は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｄ８は、ＲまたはＡであってよく；
Ｘｄ９は、疎水性アミノ酸（例えば、ＩまたはＭ）であってよく；
Ｘｄ１０は、塩基性アミノ酸（例えば、ＫまたはＲ）であってよく；
Ｘｄ１１は、疎水性アミノ酸（例えば、ＡまたはＶ）であってよく；
Ｘｄ１２は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＩ）であってよく；
Ｘｄ１３は、疎水性アミノ酸（例えば、ＶまたはＡ）であってよく；
Ｘｄ１４は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｄ１５は、ＱまたはＥであってよく；
Ｘｄ１６は、ＴまたはＲであってよく；
Ｘｄ１７は、中性親水性アミノ酸（例えば、ＳまたはＴ）であってよく；
Ｘｄ１８は、疎水性アミノ酸（例えば、ＬまたはＶ）であってよい。
配列番号４５ キメラ２５Ｄ８重（Ｉｇｇ１）鎖（マウス可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号４６ ヒト化２５Ｄ８重（Ｉｇｇ１）鎖（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号４７ ２５Ｅ９軽鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ１
Figure 0006268173
 配列番号４８ ２５Ｅ９軽鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ２
Figure 0006268173
 配列番号４９ ２５Ｅ９軽鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ３
Figure 0006268173
 配列番号５０ ２５Ｅ９重鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ１
Figure 0006268173
 配列番号５１ ２５Ｅ９重鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ２
Figure 0006268173
 配列番号５２ ２５Ｅ９重鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ３
Figure 0006268173
 配列番号５３ ２５Ｄ８軽鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ１
Figure 0006268173
 配列番号５４ ２５Ｄ８軽鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ２
Figure 0006268173
 配列番号５５ ２５Ｄ８軽鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ３
Figure 0006268173
 配列番号５６ ２５Ｄ８重鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ１
Figure 0006268173
 配列番号５７ ２５Ｄ８重鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ２
Figure 0006268173
 配列番号５８ ２５Ｄ８重鎖マウス可変ドメインのＣＤＲ３
Figure 0006268173
 配列番号５９
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ２）鎖ヒト化変異体２（別名：Ｈ２）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号６０
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ２）鎖ヒト化変異体３（別名：Ｈ３）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号６１
２５Ｅ９重（Ｉｇｇ２）鎖ヒト化変異体４（別名：Ｈ４）（ヒト化可変ドメインおよびヒト定常領域）
Figure 0006268173
 配列番号６２（２５Ｅ９軽鎖マウス可変ドメインのヌクレオチド配列）
Figure 0006268173
 配列番号６３（２５Ｅ９重鎖マウス可変ドメインのヌクレオチド配列）
Figure 0006268173
 配列番号６４（ヒト化２５Ｅ９軽鎖可変ドメイン−変異体１のヌクレオチド配列−シグナル配列のコード部分なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号６５（ヒト化２５Ｅ９重鎖可変ドメイン−変異体１のヌクレオチド配列−シグナル配列のコード部分なしで示す）
Figure 0006268173
 配列番号６６：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号６７：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号６８：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号６９：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインのヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７０：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７１：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７２：２５Ｄ８軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７３：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７４：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７５：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７６：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７７：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７８：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号７９：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８０：２５Ｄ８重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８１：２５Ｅ９軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８２：２５Ｅ９軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８３：２５Ｅ９軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８４：２５Ｅ９軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８５：２５Ｅ９軽鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８６：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８７：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８８：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号８９：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号９０：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号９１：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173
 配列番号９２：２５Ｅ９重鎖可変ドメインの候補ヒトモデル
Figure 0006268173

Claims (14)

  1. 配列番号７のアミノ酸２１〜２３９を有する軽鎖および配列番号１３のアミノ酸２０〜４７２を有する重鎖を含む抗体。
  2. 細胞傷害性部分または検出可能な部分とコンジュゲートされている、請求項１に記載の抗体。
  3. 骨量減少の治療における使用を目的とする、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸。
  5. 請求項４に記載の核酸を含むベクター。
  6. 請求項４に記載の核酸、請求項５に記載のベクターを含む、または請求項１に記載の抗体を含むもしくは発現する、単離された細胞。
  7. 請求項１または２に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  8. 請求項１または２に記載の抗体と、担体とを含む組成物。
  9. 請求項１または２に記載の抗体を含むキット。
  10. 骨量減少の治療のための薬剤の製造における、請求項１または２に記載の抗体の使用。
  11. 骨量減少が、癌、癌治療、骨粗鬆症、骨質減少、骨軟化症、上皮小体機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、性腺機能不全症、甲状腺中毒症、全身性肥満細胞症、成人型低ホスファターゼ症、副腎皮質機能亢進症、骨形成不全症、パジェット病、クッシング病／症候群、ターナー症候群、ゴーシェ病、エーラス・ダンロス症候群、マルファン症候群、メンケス症候群、ファンコニ症候群、多発性骨髄腫、高カルシウム血症、低カルシウム血症、関節炎、歯周病、くる病（ビタミンＤ依存性、ＩおよびＩＩ型、ならびにＸ染色体性低リン酸塩血症性くる病を含む）、骨性線維形成不全症、濃化異骨症などの骨硬化性障害、またはマクロファージ媒介性炎症過程に起因する損傷に関連する、請求項１０に記載の使用。
  12. 抗体を作製する方法であって、前記抗体が生成されるように請求項６に記載の単離された細胞を培養することを含む、方法。
  13. 骨量減少の治療のためのものである、請求項７に記載の医薬組成物。
  14. 骨量減少が、癌、癌治療、骨粗鬆症、骨質減少、骨軟化症、上皮小体機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、性腺機能不全症、甲状腺中毒症、全身性肥満細胞症、成人型低ホスファターゼ症、副腎皮質機能亢進症、骨形成不全症、パジェット病、クッシング病／症候群、ターナー症候群、ゴーシェ病、エーラス・ダンロス症候群、マルファン症候群、メンケス症候群、ファンコニ症候群、多発性骨髄腫、高カルシウム血症、低カルシウム血症、関節炎、歯周病、くる病（ビタミンＤ依存性、ＩおよびＩＩ型、ならびにＸ染色体性低リン酸塩血症性くる病を含む）、骨性線維形成不全症、濃化異骨症などの骨硬化性障害、またはマクロファージ媒介性炎症過程に起因する損傷に関連する、請求項１３に記載の医薬組成物。
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