JP6250545B2 - 表面プラズモン共鳴分析用微細構造チップ、前記微細構造チップを含む分析装置、および前記装置の使用 - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴分析用微細構造チップ、前記微細構造チップを含む分析装置、分析方法、および前記装置の使用に関する。

表面プラズモン共鳴（または「ＳＰＲ」）は、表面のごく近傍で物理的特性の微細な変化を検出することを可能にする光学的技術である。この技術は特に、生体分子間相互作用をリアルタイムで、ラベル付け（たとえば蛍光または放射性染料による）せずにモニタできることで知られている。これによって、特に表面上に固定化されたリガンドと標本内溶液中の分析対象物質の間の相互作用を説明し、定量化することができる。

ＳＰＲは、金属誘電媒体（前記誘電媒体は一般に、液体媒体または気体である）表面上の金属電子の集団励起の物理的現象である。この界面（本明細書の他の部分では「表面」とも呼ぶ）上の入射光の特定の偏光（横方向磁気、または「ＴＭ」偏光）と「プラズモン共鳴角度」と呼ばれる角度により、入射光エネルギーと界面に平行に伝播する表面波（「表面プラズモン」と呼ばれる）との結合により反射される共鳴現象が発生する。この物理的現象は、表面で反射された光の強度の低下に反映される。この励起が起こるのは、表面への入射角が全反射（これは、照射光が光学指数ｎ１の屈折力の大きいほうの媒体から光学指数ｎ２の屈折力の小さいほうの媒体（ｎ１＞ｎ２）へと入射する場合にのみ存在しうる）の臨界角度以上の場合のみである。この場合、表面プラズモンは金属表面の誘電媒体側の光学的厚さを「検知」することになり、この光学的厚さとは、反射率に厚さを乗じたものと定義される。これらの条件が合わされると、その表面はプラズモン効果を発生しやすいということができる。

一般に入射光は、ある入射角に応じて、その面のうちの１つが金属層で被覆されたチップ（先行技術では一般にプリズムであり、これは感応面での光結合のための最も単純な方法であるからである）の側面の１つに到達し、前記入射光は、それがプリズムに入る際に屈折し（プリズムを構成する媒体とそこに入る前の光学的媒体、一般に空気、との間の光学指数の差による）、前記金属表面で反射される。この構成は当業者の間で、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ構造（Ｅ．Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔｈｅ ｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ Ｍｅｔａｌｓ ｂｙ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ，Ｚ Ｐｈｙｓｉｋ ２４１：３１３−３２４（１９７１））としてよく知られている。プリズムの代わりに光結合のための回折構造体を用いた場合にも、同様の構造が存在する（“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｏｌａｒｉｔｏｎｓ”，ｅｄｓ．Ａｇｒａｎｏｖｉｃｈ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｉ．Ｃｏｍｐ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８２に記載されているＨ．ＲａｅｔｈｅｒのＲａｅｔｈｅｒ構造）。

ＳＰＲ現象により、生体分子間相互作用の観察も可能となる。この場合、リガンドがプリズムの金属表面上の所定の領域に事前に固定化される。それゆえ、その後、これらのリガンドに他の分子を付着させると、前記所定の領域のレベルで光学的厚さが局所的に変化し、したがって、共鳴条件の変化および、したがって共鳴角度のシフトが起こる。このシフトは、一次近似として、リガンドと相互作用するようになった生体材料の量に比例する。それゆえ、小さな分子は入射角を小さくシフトさせ、その一方で、より大きな分子はより大きな角度シフトをもたらす。共鳴現象に関連する光反射率の変化の観察により、生体分子間相互作用とその経時的変化を、所定の領域のレベルで検出し、測定することが可能となる。

これに加えて、その他の光学的方法によっても、このような現象をラベル付けせずに実行することが可能となるが（共鳴ミラー、干渉法、弾性表面波、水晶発振子マイクロバランス）、これらの技術には高額で産業実用には適さない機器が必要となる。

現在のＳＰＲシステムは嵩張り、高価であり、実装が困難であり、したがって低コストで分析を行うことができない。実際に、現在販売されているシステムのほとんどは、複雑な測定方法を必要とし、表面における非常に精密な（事実上、点状の）領域の測定しかできない。複数の領域の平行した分析が可能な装置はきわめて複雑で、移動可能な機械的部品を有し、それゆえ、システムが嵩張り、使いにくい。

このような理由により、何年間にもわたり、有効で経済的な、使いやすいＳＰＲ光学装置の開発に向けた科学的研究が盛んに行われてきた。

文献、米国特許第５３１３２６４号明細書（Ｉｖａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ）には、観察対象の表面を収束ビームで励起し、反射ビームの強度を検出器で観察する「角度」検出を用いるＳＰＲ装置が記載されている。しかしながら、この技術では、検出器を何台か並置しないかぎり、複数の領域を平行して観察することができない（基本的に「１点」分析について言及されている）。

文献、“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａ ｃｕｒｖｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ＳＰＲ ｄｅｖｉｃｅ，Ｊ．Ｒｏｏｎｅｙ ａｎｄ Ｅ．Ａ．Ｈ．Ｈａｌｌ，Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ１１４（２００６） ８０４−８１１”は、凹状湾曲球面基板上の生体分子間相互作用の検出を可能にする装置を開示している。前記文献は、前記装置を８回並置することを提案しているが、装置の検出素子もまた８倍とされ、その結果、最終的な装置は高価で嵩張る。

文献、米国特許第６８６２０９４号明細書（Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ）と米国特許第７５７６８６３号明細書（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ）は、角度検出ではなく、モノクロメータと白色光光源を利用する波長検出を用いるＳＰＲ装置を開示している。これらの装置により、複数の生体分子間相互作用を平行して観察できるが、可動部品を含むため、システムの保守作業、およびしたがって、使用者にとっての全体的なコストが増大する。

また、固定された入射角と固定された波長で、チップ上の所定の領域での生体分子間相互作用の変化を映像化し、モニタすることが可能なＳＰＲ装置もある。文献、米国特許第７６７８５８４号明細書（Ｇｕｅｄｏｎ ｅｔ ａｌ）、米国特許第７５７６８６３号明細書（Ｗｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ）、米国特許第７５５１２８６号明細書（Ｔａｎｉ ｅｔ ａｌ）は、このようなＳＰＲ機器を提案している。これらの機器では、複数の相互作用を平行して分析できるが、可動部品を有するか、または部品が動かなければ相互作用の微細分析ができない。

さらに、前述の機器の何れにおいても、１つの同じチップ上で異なる大きさの生物学的種を同時に観察することは事実上不可能であり、これは、検出感度が検出対象の物体の大きさに依存するが、１つの同じ分析角度を、小さな分子（直径約数ｎｍ〜数十ｎｍ）と大きな要素、たとえば細菌（直径約数百ｎｍ〜数μｍ）の両方を検出するように最適化することができないからである。これに加えて、現在利用可能なシステムの設計によって固定される角度測定ダイナミクスでは、性質または濃度が大きく異なる生物学的種を観察するのに十分な柔軟性を持つことができないという事実がある。実際に、チップ上の各々の所定の領域における生体分子間相互作用を観察するための最適な角度位置は異なる可能性があり、（少なくとも）３種類のパラメータ、すなわち（ｉ）捕捉対象の生物学的な種の固定化に使用される界面化学の種類、（ｉｉ）そのように形成された所定の分析領域の（光学的）厚さ、（ｉｉｉ）固定化された種と相互作用しうる標的の種類（たとえばリガンド）と関連性がある。

それゆえ、最適なプラズモン感度、およびその角度測定ダイナミクスは、特定の先行技術の装置では実現不能であるか、またははるかに高度で高価な分析戦略、すなわち、移動する可動部品、または、何度も調整をしなければならず、装置を制御および使用しにくくするようなより複雑なイメージングシステムの設定が必要となる。

さらに、前述の装置はすべて、その製造工程から高額となるチップを使用する。さらに、装置の大多数が「１点」用装置であるため、分析地点当たりの価格も高い。

さらに、先行技術では文献、国際公開第２００９／０２１９６４Ａ２号パンフレット（Ｍａｃｃｒａｉｔｈ ｅｔ ａｌ）を挙げることもでき、これは、蛍光により分析対象物質を検出するための光学的プラットフォームを開示している。前記文献においては、網目状に構成された放物面形状の突起の上側平面を金属フィルムで被覆し、次に、生物学的な種で機能化する。次に、突起の放物面形状によって生成されるプラズモン効果により蛍光信号を励起し、これによって臨界角度以上の前記金属フィルムで被覆された平面上での入射ビームを得ることが可能となる。

しかしながら、前記文献では、プラズモン共鳴波自体の特徴から直接得られる情報がない。さらに、有効検出面は金属フィルムで被覆された平面であるため、正確な角度θでの分析しか実行できない。

最後に、先行技術においては、その表面にナノ構造を有するチップについて開示している文献も数多く存在し、その中のいくかは、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）の物理的現象を利用している。たとえば、文献、“Ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅｓ ｆｏｒ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｂ．Ｔｕｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｌａｓｅｒｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃｓ ２０１１”は、その表面に周期的な網目状構造に従って配置されたナノ構造を有するバイオチップを開示している。このナノ構造の網目状構造は、網目状構造の金属／誘電体界面のプラズモン波に入射光を結合させるために使用される。文献、“Ｌｏｃａｌｉｓｅｄ ｐｌａｓｍｏｎｓ ｉｎ ｇｏｌｄ ｐｈｏｔｏｎｉｃ ｎａｎｏｃａｖｉｔｉｅｓ，Ｓ．Ｃｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００２”は、その一部において、金微小共振器を有するナノ構造表面を開示している。これらの金微小共振器には、ＳＰＲ現象とは異なる局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）という物理的現象が関わり、それがプラズモン信号の増幅につながる。

それゆえ、上記の２件の文献では、ナノメートルレベルの網目状構造とキャビティの製造が難しいだけでなく、光ビームの入射角にしたがって金属層の反射率の変化を評価するために可動部品を使用する必要がある。

したがって、可動部品を持たず、使いやすく、複数の相互作用を平行して分析でき、適当で、最適化された測定感度を有する、小型で経済的なＳＰＲ装置が実際に求められている。

本願の発明者は、特別な構成を有する微細構造チップを含むＳＰＲ分析用装置によって、これらの要求事項を満足できることを発見した。

「チップ」または「微細構造チップ」という用語は、後述の説明文中、区別なく使用される。

「放射」または「ビーム」という用語は、後述の説明文中、区別なく使用される。

図１は、本発明の各種の実施形態のキャビティの断面図を示す。 図２は、本発明の各種の実施形態による突起の断面図を示す。 図３は、マトリクスの形態で配置されたキャビティを有する、本発明による微細構造チップを示す。 図４は、Ｘ軸に沿った溝の形態で配置されたキャビティを有する、本発明による微細構造チップを示す。 図５は、コリメート偏光単色入射放射により照射された、傾斜のないキャビティの断面図を示す。 図６は、コリメート偏光単色入射放射により照射された、角度βで傾斜されたキャビティの断面図を示す。 図７は、突起と底面との間の平面を分離する距離が異なる、本発明の１つの実施形態によるチップを示す。 図８は、キャビティ間表面と底面との間の距離が等しい微細構造チップを含む装置を示す。 図９は、キャビティ間表面と底面との間の距離が異なる微細構造チップを含む装置を示す。 図１０は、観察された各種の角度範囲の代表的なプラズモン曲線を示す（傾斜なし）。 図１１は、観察された各種の角度範囲の代表的なプラズモン曲線を示す（傾斜あり）。 図１２は、本発明による微細構造チップの３つのキャビティのカメラ画像の例を示す。 図１３は、１６のキャビティを含み、そのうちの少なくとも１つがそれ以外と異なるような、本発明によるチップを示す。 図１４は、入射角θに関する反射率を示す。 図１５は、大腸菌を、この細菌専用のリガンドで機能化された突起に付着させる前と付着させた後のプラズモン曲線を示す。 図１６は、志賀毒素を、志賀毒素専用のリガンドで機能化された突起に付着される前と付着させた後のプラズモン曲線を示す。 図１７は、チップがプリズムに接合された１つの実施形態によるチップの断面図を示す。

微細構造チップ
本発明の第一の主題は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析用の微細構造チップであり、これは底面と、少なくともその一部が金属層で被覆された上面と、少なくとも１つの側面と、からなる固体の形態であり、
− 前記上面には、分析対象の種を受け取るように意図された、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起から選択される、マイクロメートルサイズの少なくとも２つの領域が設けられ、前記領域は平面によって相互に分離され、
− 前記領域の少なくとも１つがそれ以外のものとは異なる
ことを特徴とする。

「微細構造チップ」という用語は、分析対象の種を受け取るように意図された、マイクロメートルサイズの領域を有するチップを意味するものとする。それゆえ、チップが必ずしもマイクロメートルサイズとは限らず、マイクロメートルサイズである領域を含む。

「マイクロメートルサイズの領域」という用語は、３つのうちの少なくとも２つの寸法がマイクロメートルサイズである領域を指すように意図され、前記マイクロメートルサイズは、１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは１０μｍ〜５００μｍの範囲である。

したがって、領域の第三の寸法は必ずしもマイクロメートルレベルとは限らず、たとえば１ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｍｍの距離を示すことができる。

本発明による領域は、キャビティおよび／または突起の形態の特定の形状を示し、これについては後述する。プラズモン効果が観察されるのは、これらの領域のうち、金属層で被覆されたレベルである。

本発明によれば、チップは２〜５００，０００、好ましくは１０〜１０，０００、より好ましくは２５〜４００の領域を含む。

本発明によれば、上面の少なくとも一部が金属層により被覆される。これは、有効検出面（以下、感応面とも呼ばれる）を表す。

本発明によれば、マイクロメートルサイズの少なくとも２つの領域が、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起から選択されて、金属層で被覆される。

１つの特定の実施形態によれば、チップの上面は完全に金属層で被覆される。

それゆえ、上記の実施形態と組み合わせた１つの特定の実施形態によれば、領域だけでなく、前記領域を分離する平面もまた、分析対象の種を受けるように意図される。

以下の説明をしやすくするために、正規直交座標系（ＸＹＺ）が使用され、この中では領域を分離する補遺面は平面（ＸＹ）に平行であり、Ｚ軸は下方に向かう。

「平面」という用語は、いくつかの欠陥を示しうる平坦な、または実質的に平坦な表面を意味するように意図される。

分析対象の種を受けるように意図される２つの領域を分離する平面は、領域間表面と呼ばれる。それゆえ、以下の用語は、区別なく使用される。平面または領域間表面、またはその他領域間平面。より具体的には、
− 平面がキャビティである２つの領域を分離する場合は、キャビティ間表面という用語が使用され、
− 平面が突起である２つの領域を分離する場合は、突起間表面という用語が使用され、
− 平面が、キャビティである領域と突起である他の領域を分離する場合、キャビティ突起間表面という用語が使用される。

１つの実施形態によれば、領域はチップの上面にマトリクスの形態で配置される。それゆえ、平面は、Ｘ軸とＹ軸の両方に沿って領域を分離する。

他の実施形態によれば、領域はチップの上面に沿った連続する溝の形態で配置される。それゆえ、この実施形態によれば、平面は、Ｘ軸上またはＹ軸に沿って領域を分離する。

１つの実施形態によれば、領域は、Ｙ軸に沿って距離Ｄだけ、Ｘ軸に沿って距離Ｄ’だけ、平面（すなわち、領域間表面）によって分離され、ＤとＤ’は、０μｍ（ＸまたはＹ軸の一方に沿った連続する溝の場合）〜５ｍｍ、好ましくは５０μｍ〜５ｍｍ、好ましくは２００〜１０００μｍ、特に好ましくは３００〜７００μｍである。

１つの実施形態によれば、領域は、１０μｍ〜２５，０００μｍ、好ましくは５０μｍ〜５０００μｍ、より好ましくは１００μｍ〜１０００μｍの中心間ＣＴＣ距離だけ分離される。

１つの実施形態によれば、複数の平面は面（ＸＹ）な平行な複数の面内にあり、すると上面は階段状となる。

他の実施形態によれば、複数の平面は同じ面（ＸＹ）内にある（すなわち、Ｚが一定）。

「前記領域の少なくとも１つはそれ以外のものと異なる」という表現は、以下を意味する。
− 少なくとも１つの領域が、チップの他の領域と比較して異なる性質を有する、および／または
− 少なくとも１つの領域が、チップの他の領域と比較して異なる寸法を有する、および／または
− 少なくとも１つの領域が、チップの他の領域と比較して異なる方位を有する、および／または
− チップの領域間表面と底面との間の少なくとも１つの距離が、チップの他の領域間と底面の距離とは異なる。「チップの領域間表面と底面との間の距離」という用語は、チップの高さ、すなわち、領域間表面と底面または底面の延長線をつなぐ垂線の長さを指す。

「異なる性質」と言う用語は、キャビティの形態である領域か突起の形態である領域の何れかを意味するように意図される。

「異なる寸法」という用語は、たとえばそれ以外の領域とは、長さＬが異なる、および／または幅Ｗが異なる、および／または直径ｄが異なる、および／または平均曲率半径Ｒが異なる領域を意味するように意図される。

それゆえ、領域Ｚ１が他の領域Ｚ２と同じ形状を有する（たとえば、Ｚ１とＺ２が長方形で、Ｚ１は幅Ｗ１と長さＬ１を有し、Ｚ２は幅Ｗ２と長さＬ２を有する）が、異なる寸法（たとえば、Ｗ１＝Ｗ２かつＬ１＜Ｌ２）であれば、この領域Ｚ１は、本発明の解釈においては、領域Ｚ２とは異なると考えられる点に留意するべきである。

「異なる方位」という用語は、隣接する平面に関して角度β１’の傾斜を示し、そのチップの、角度β２’の傾斜を有する他の領域Ｚ２’とは異なる領域Ｚ１’を意味するように意図され、角度β１’≠β２’である。

それゆえ、１つの実施形態によれば、チップにはキャビティである領域のみ提供される。この場合、領域は同じ性質であるため、当然のことながら、キャビティの少なくとも１つはそれ以外のものとは異なる寸法、および／またはそれ以外のものとは異なる方位、および／またはそのチップのキャビティ内面と底面との間の距離の少なくとも１つが異なる。

他の特定の実施形態によれば、チップには、突起である領域だけが提供される。この場合、領域は同じ性質であり、当然のことながら、突起の少なくとも１つはそれ以外のものとは異なる寸法、および／またはそれ以外のものとは異なる方位を有し、および／またはチップの突起間表面と底面との間の距離の少なくとも１つが異なる。

最後に、また別の特定の実施形態によれば、チップには、少なくとも１つがキャビティであり、他が突起である領域が設けられる。この特定の実施形態において、１つの領域はそれ以外のものから、その性質だけが異なる。

１つの実施形態によれば、チップが少なくとも１つのキャビティと少なくとも１つの突起を含む場合、キャビティおよび／または突起の少なくとも１つは、それ以外のものとは異なる寸法、および／またはそれ以外のものとは異なる方位を有し、および／または突起間および／またはキャビティ間、および／またはチップのキャビティ突起間表面と底面との間の距離が異なる。

「キャビティ」という用語は、チップの上面のへこみを意味するように意図され、前記へこみは２つの平面（また、領域間表面とも呼ばれる）の間にある。

キャビティは、三次元（ＸＹＺ座標系）または二次元（１つの面内に断面がある）の何れかで画定することができる。

それゆえ、「キャビティ」という用語には、すべての座標が前記キャビティに隣接する２つの領域間平面を接続する想像上の平面内にあるような体積が付与される。

キャビティはしたがって、面（ＹＺ）で説明される。

それゆえ、面（ＹＺ）で説明される本発明によるキャビティは、平均曲率半径Ｒの少なくとも１つの曲線および／または少なくとも１つの直線によって定義される。

キャビティが１つの曲線だけで定義される場合、この曲線は必然的に凹状（すなわち、曲率半径は−Ｚ軸に沿う）となる。

キャビティが少なくとも１つの曲線と少なくとも１つの直線で定義される場合、この曲線は凹状または凸状（すなわち、曲率半径は＋Ｚ軸に沿う ）の何れかでありうる。

１つの特定の実施形態によれば、キャビティは１つの曲線により分離される２つの直線によって定義される。

上記の実施形態と組み合わせた１つの特定の実施形態によれば、２つの直線が平行である。

上記の実施形態と組み合わせることのできる他の実施形態によれば、２つの直線は異なる寸法を有する。

「突起」という用語は、チップの上面の突出を意味し、前記突出は２つの平面（また、領域間表面とも呼ばれる）の間にある。

突起は、三次元（ＸＹＺ座標系）または二次元（断面が１つの面内にある）で定義することができる。

それゆえ、「突起」という用語には、その座標のすべてが、前記突起に隣接する２つの領域間平面をつなぐ想像上の面より上の体積が付与される。

突起はしたがって、面（ＹＺ）で説明される。

それゆえ、本発明によれば、面（ＹＺ）で説明すると、曲率半径Ｒを有する少なくとも１つの曲線および／または少なくとも１つの直線によって定義される。

突起が１つの曲線によってのみ定義される場合、曲線は必然的に凸状（すなわち、曲率半径は＋Ｚ軸に沿う）となる。

突起が少なくとも１つの曲線と少なくとも１つの直線によって定義される場合、この曲線は凹状（すなわち、曲率半径が−Ｚ軸に沿う）または凸状の何れかでありうる。

１つの特定の実施形態によれば、突起は１つの曲線により分離される２つの直線によって定義される。

上記の実施形態と組み合わせた１つの特定の実施形態によれば、２つの直線は平行である。

上記の実施形態と組み合わせることのできる他の実施形態によれば、２つの直線は異なる寸法を有する。

それゆえ、１つの特に好ましい実施形態によれば、面（ＹＺ）で説明されるチップの領域（キャビティおよび／または突起）は、平均曲率半径Ｒを有する曲線（キャビティの場合は凹状、突起の場合は凸状）によってのみ定義され、曲率半径Ｒは０．１ｍｍ〜６００ｍｍ、好ましくは０．３ｍｍ〜３００ｍｍである。

たとえば、半球形、半楕円形、または半円柱形（座標系（ＸＹＺ）のキャビティおよび／または突起から成ってもよい。

１つの好ましい実施形態によれば、キャビティおよび／または突起は座標系（ＸＹＺ）において半円柱形である。

１つの特定の実施形態によれば、領域の（すなわち、キャビティおよび／または突起の）曲率半径は面（ＸＹ）に垂直、すなわちＺ軸に沿っている。

他の実施形態によれば、領域の曲率半径は面（ＸＹ）に垂直ではない（すなわち、キャビティおよび／または突起は傾斜する）。

本発明によれば、チップの底面は平面または曲面でも、または隆線または頂点でもよい。

１つの好ましい実施形態によれば、チップの底面は平面であり、好ましくは平面（また領域間表面とも呼ばれる）に平行である。

上記の実施形態と組み合わせることのできる他の実施形態によれば、複数の平面が同じ面（ＸＹ）内にある。換言すれば、底面が前記平面に平行であると、平面とチップの底面との間の距離は同じである。この場合、上面は底面と平行と言われる。

他の実施形態によれば、複数の平面が面（ＸＹ）に平行な複数の平面内にある。換言すれば、底面が前記平面と平行であると、平面とチップの底面との間の距離は異なる（上面は階段状の形態となる）。

本発明によれば、チップの側面は平面（チップの底面および／または上面に対して垂直または垂直でない）でも曲面でもよい。

１つの好ましい実施形態によれば、チップの側面は平坦である。

他の好ましい実施形態によれば、チップの少なくとも１つの側面は、底面および／または上面に対して垂直である。

本発明の１つの特定の実施形態によれば、チップは先行技術からよく知られたプリズムに接合される。

それゆえ、１つの特定の実施形態によれば、チップは平行六面体の形状である（すなわち、同じ面（ＸＹ）内の平面と前記平面に平行な底面を有するチップ）。この実施形態によれば、側面の高さは約０．１ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｍｍの小さな寸法を有する。

「分析対象の種」という用語は、たとえば材料、気体または生物学的な種、たとえば一本鎖または二重鎖ＤＮＡ、蛋白質、細菌、毒素、ウイルス、マイコプラズマ、化学物物質、または他の生物学的または化学的種と相互作用しうるその他のあらゆる生物学的または化学的種を意味するように意図される。

１つの好ましい実施形態によれば、分析対象の種は生物学的な種であり、たとえば病原菌、たとえばサルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス、クロストリジウム・ディフィシル、またはカンピロバクター属菌である。

本出願の発明者は、本発明によるチップを使用することによって、志賀毒素を生成する大腸菌（ＳＴＥＣ）株を有利に観察できることを証明しており、これは、それによって大型分子（細菌自体）だけでなく、それが生成する小型の毒素も同時に分析できるからである。

本発明の他の好ましい実施形態によれば、キャビティおよび／または突起は、各種の生体マーカ特定のモノクローナル抗体で機能化される。

図１は、各種の実施形態によるキャビティの、面（ＺＹ）に沿った断面を示す。これらの図面の各々において、キャビティは、キャビティに隣接する２つの平面をつなぐ、破線で示される想像上の直線（または体積の場合はＸＹＺ座標系の中の想像上の面）より下に（プラスのＺ）そのすべての点があるような面（ＸＹ）内の表面によって（またはＸＹＺ座標系内の体積によって）次のように表される。
− ａ）の場合、キャビティは曲率半径Ｒの凹状曲線（すなわち、−Ｚ軸に沿って曲率半径を有する）のみによって定義される、
− ｂ）の場合、キャビティは曲率半径Ｒの凹状曲線によって分離される２つの平行な直線によって定義される、
− ｃ）の場合、キャビティは曲率半径Ｒの凸状曲線（すなわち、＋Ｚ軸に沿って曲率半径を有する）により分離される２つの直線によって定義される。

図２は、各種の実施形態による突起の、面（ＺＹ）に沿った断面を示す。これらの図の各々において、突起は、突起に隣接する２つの平面をつなぐ、破線で示される想像上の直線（または体積の場合はＸＹＺ座標系の中の想像上の面）より上に（マイナスのＺ）そのすべての点があるような面（ＸＹ）内の表面によって（またはＸＹＺ座標系内の体積によって）次のように表される。
− ａ）の場合、突起は曲率半径Ｒの凸状曲線（すなわち、＋Ｚ軸に沿って曲率半径を有する）のみによって定義される、
− ｂ）の場合、突起は曲率半径Ｒの凸状曲線によって分離される２つの平行な直線によって定義される、
− ｃ）の場合、突起は曲率半径Ｒの凹状曲線（すなわち、−Ｚ軸に沿って曲率半径を有する）により分離される２つの直線によって定義される。

図３は、微細構造チップ３を示しており、その上面４はキャビティ間平面を含み、チップ３の底面５に平行である。上面４は金属層２によって被覆され、分析対象の種を受けるように意図された、プラズモン効果を発生させやすいキャビティ１が設けられている。

図３において、キャビティ１はＹ軸に沿って距離Ｄだけ、およびＸ軸に沿って距離Ｄ’だけ、平面（または、キャビティ間表面とも呼ばれる）によって相互から離間される。

微細構造チップ３は、光を伝播できるどのような種類の材料で作製することもできる。たとえば、ガラス、水晶またはプラスチックを挙げることができる。

１つの好ましい実施形態によれば、コスト面から、チップ３はプラスチック、たとえばＰＭＭＡ（ポリ（メチルメタクリレート））、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＳＵ−８（エポキシ系ネガ型感光樹脂）またはＰＤＭＳ（ポリジメチルシルコキサン）で作製される。

１つの特定の実施形態によれば、チップがプリズムに接合される場合、これはプリズムのそれとは異なる材料で作製されてもよい。

チップ３の上層４（および特にキャビティ１）を被覆する金属層２は、金、銀、プラチナ、またはアルミニウム等の各種の金属で作製できる。

１つの好ましい実施形態によれば、金属層２は金で作製されるがこれは、その耐食特性が非常に優れているからである。

金属層２の厚さは１０〜２００ｎｍ、好ましくは３０〜１００ｎｍ、さらにより好ましくは４０ｎｍ〜５０ｎｍである。

上記の実施形態と組み合わせた他の実施形態によれば、クロムの薄い層をチップ３の上面４への金のための前処理層として使用する。

図４は、本発明による微細構造チップの上面を示しており、これは完全に金属層２で被覆され、前記微細構造チップにはＸ軸に沿った溝の形態で配置されたキャビティが設けられ、それによって４つの列Ｃ_１〜Ｃ_４が形成されている。図４において、ｄは溝の径を示し、ＣＴＣは２つの連続する溝間の中心間距離を示す。

本発明によるチップによって、各領域（すなわち各キャビティおよび／または突起）の感度を調整して、違いの大きい生物学的な種を観察できるようにすることが可能である。

１つの実施形態によれば、前記領域の少なくとも１つは、それ以外のものと異なる曲率半径を有する。図５は、チップ３の（金属層２で被覆された）曲面キャビティ１を示した図３の拡大断面を図示し、これに入射角θの、ＴＭ偏光による線形偏光コリメート単色ビームが照射される。

キャビティは、（ＸＹＺ座標系において）半円柱形であり、その表面は図３と５の（面ＺＹ内の）１つの曲線によって定義され、その曲率半径Ｒと２つの半角α（それゆえ、全角２αを画定する）により特徴付けられる。

曲率半径Ｒと半角αはそれゆえ、弦ｄの長さ、または前記キャビティの直径を画定する。

感応面（またはキャビティ１）での反射によって、２つの端ＡとＣでの入射角はそれぞれ、コリメートビームの平均入射角をθとして、θ_１＝θ＋２α、θ_２＝θ、θ_３＝θ−２αとなる。それゆえ、前記キャビティ１によって反射されるビーム（点Ａについてはθ_１、点Ｂではθ_２、点Ｃではθ_３）の角度幅Δθ（Δθ＝θ_１−θ_３）は４αと等しく、その中心は角度θｍｅａｎ（図５の角度θ_２に対応する）にある。

本発明によるチップの各キャビティおよび／または突起の曲率半径Ｒの選択は肝要であり、それは、これが重要な物理的パラメータ（チップの光学指標ｎ_ｐ、外部誘電媒体の光学指標ｎ_ｅ、コリメートビームの入射角θ、分析したい生物学的種の大きさ）および各キャビティおよび／または突起に関する測定の角度と角度ダイナミクスに応じて決まるからである。

「測定の角度ダイナミクス」という表現は、分析中に視覚化可能な角度範囲を意味するように意図される。

「感度」という用語は、感応面上で測定可能となる光学的厚さの最小変化を意味するように意図される。

実際に、曲率半径が非常に大きいと、面に近付くため、角度θ_１とθ_３は非常に近くなる（分析角度範囲Δθはしたがって、非常に小さくなり、この構成は小さな分子の分析に特に適した（すなわち、良好な感度を有する）構成となる。逆に、曲率半径が非常に小さいと、より低いが、大型分子の分析にはより適していることが明らかな測定角度でプラズモン曲線全体を観察することが可能となる。

上記の実施形態と組み合わせることのできる他の実施形態によれば、前記領域の少なくとも１つは、角度βの傾斜を示す。

この実施形態によれば、曲率半径はＺ軸に関して偏向される。

図６は、チップ４３の曲面キャビティ４１（その上面は金属層４２によって被覆される）の拡大断面図を示し、これは角度βの傾斜を示し、横方向磁気ＴＭ方向にしたがって線形偏光された平均入射角θの単色コリメートビームによって照射される。

感応面（この場合、キャビティ）が、感応面の、キャビティ間平面に平行な面として定義される平均平面の垂線に関してβ傾斜している場合、反射光線の角度幅Δθは依然として４αと等しいが、今度はこの中心の平均角度はγ’_ｍｅａｎ（図６のθ’_２で示される）であり、凹面ではγ’_ｍｅａｎ＝θ−２βとなる。

１つの実施形態によれば、角度βは以下のように定義される。０°＜β≦８０°、好ましくは１５°≦β≦４５°。

それゆえ、本発明によれば、領域の各々について、（曲率半径の選択の結果として）観察される角度幅およびこの角度範囲の平均角度（すなわち、キャビティが傾斜しているか否かに応じて、図５と６に示されるθ_２またはθ’_２）の両方を調整することが可能であり、それゆえ、同じ実験中に同じチップ内の各種の種に関する測定角度を調整することが可能となる。

それゆえ、１つの特定の実施形態によれば、領域の少なくとも１つは、チップのそれ以外の領域と比較して、異なる曲津半径と異なる方位を有する。

上記の実施形態と組み合わせることのできる他の実施形態によれば、底面と領域間表面との間の少なくとも１つの距離は、それ以外のものと異なる。

図７はチップ３３を示し、その上面４４は金属層２２で被覆され、湾曲形状の突起１１が設けられている。チップ３３の側面（５５、６６）は底面７７と平面に対して垂直である。突起１１の間の平面（すなわち、突起間表面）と底面７７を分離する距離はすべて相互に異なっており、ｄ４＜ｄ３＜ｄ２＜ｄ１である。図７において、領域間表面は面（ＸＹ）に平行な複数の面内にある（５つの面が示されている）。

他の特定の実施形態によれば、領域のうちの少なくとも１つがそれ以外のものと異なる性質であり、および／またはそれ以外のものと異なる角度βの傾斜を示し、および／または底面を領域間の平面から分離する少なくとも１つの距離がそれ以外のものと異なる場合、領域は同じ寸法であってもよく、またたとえば、同一の曲率半径Ｒを有していてもよい。

実際に、本発明によれば、１つのみのパラメータが領域間で異なっていれば十分である（性質、寸法、底面と領域間平面との距離）。本発明によるチップは、様々な方法で製造することができ、これは当然、チップを製造するステップと、それに続き、少なくとも１の薄い金属層を堆積させるステップを含む。

製造方法の中では、高圧注入、直接的な機械加工、箔押し、プラズマエッチング、フォトリソグラフィまたはレーザアブレーションを挙げることができる。

薄い金属層を堆積させる方法の中では、スパッタリング、真空蒸着法、または冷間成膜法を挙げることができる。

冷間成膜法は、特にプラスチック製支持手段の場合に有用であり、これはプラスチックが高温に耐えられないからである。

分析装置
図８と９は、前述の微細構造チップを含む測定装置の異なる実施形態を示す。

それゆえ、本発明の他の主旨はＳＰＲ分析用装置であって、
− 入射ビームを生成するように意図された光源７と、
− 任意選択的に設置可能な光学的コリメーションシステム８と、
− 偏光システム６と、
− 前記入射ビームの光路内に設置された、前述の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）と、
− 任意選択的に設置可能な光学的イメージングシステム（９，６９）と、
− 検出器（１０、７０）と、
を含む。

１つの実施形態によれば、入射ビームのエネルギーとチップの金属表面の表面波の間の結合がチップ自体によって行われる。

他の実施形態によれば、結合手段はプリズム、導波管、または回折構造体である。

それゆえ、１つの特定の実施形態によれば、結合がプリズムによって行われる場合、本発明によるチップは前記プリズムに、チップの底面がプリズムの、金属表面を持たない上面と接触するように、当業者の間でよく知られている方法であるインデックスマッチングオイルによって接合される。

他の実施形態によれば、チップは導波管に接合される。

また別の特定の実施形態によれば、チップは回折構造体に接合される。

本発明によれば、光源７は、たとえば水銀灯、白熱灯、レーザダイオード、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、または誘起発光ダイオード（ＯＬＥＤ）であってもよい。

１つの好ましい実施形態によれば、光源７は単色ＬＥＤである。「単色」という用語は、その高さ方向中間部の幅が４０ｎｍを超えないＬＥＤを意味するように意図される。

本発明によれば、たとえば、視覚範囲または近赤外（ＩＲ）範囲等、各種の波長範囲を使用できる。

１つの好ましい実施形態によれば、７９０〜８２５ｎｍ（近ＩＲ）の波長が使用される。

本発明によれば、ビームはコリメートされてもよい。これを行うために、当業者の間でよく知られた各種の技術を使用してもよい。

たとえば、光学的コリメーションシステム８として、光源７から発せられた光を直径Φの穴に焦点を絞ることが可能な第一の収束レンズを利用してもよく、前記穴は収束レンズの焦点面にあり、それによってコリメートビームの生成が可能となる。

１つの実施形態によれば、光学コリメーションシステム８は光源７と一体化される。

本発明によれば、偏光システム６によって、横方向磁気（またはＴＭまたは偏光−ｐ）モードで動作させることができる。

たとえば、直線偏光子または偏光スプリッタキューブを挙げることができる。

１つの好ましい実施形態によれば、偏光システム６はＴＭ偏光からＴＥ（横方向電気）偏光へと、およびその逆に容易に切り替えることができる。

部品が少しも移動しないようにするために、これは電流と電圧により制御される液晶ストリップを使って実行できる。

本発明によれば、検出器（１０、７０）は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラであってもよく、または光検出器マトリクスであってもよい。

１つの好ましい実施形態によれば、カメラは８、１０、１２または１６ビット、好ましくは１０または１２ビットで動作する。

１つの実施形態によれば、装置はまた、光学イメージングシステム（９、６９）を含み、それによって検出器（１０、７０）上に微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の画像を生成することができる。

光学イメージングシステム（９、６９）は、微細構造チップから生じる放射のすべてを受けるように十分に開口していなければならない。さらに、光学イメージングシステム（９、６９）は、微細構造チップの２つのキャビティまたは突起の画像が検出器（１０、７０）上の２つの異なる位置に対応するように選択される。

最後に、有利な態様として、光学システムは検出器（１０、７０）上の有効画素数を最大限にする拡大機能を有する。

光学イメージングシステム（９、６９）の例としては、無限焦点式に取り付けられた２つの平凸レンズを挙げることができる。

本発明によれば、入射放射がチップに入る面は入射面と呼ばれ、感応面により反射された放射が出る面は射出面と呼ばれる。

図８では、光源７は単色入射放射を放出し、これはコリメーションシステム８によってコリメートされ、偏光子６によって偏光されてからチップ５３の入射面５４（金属層５２により被覆されている）にある入射角で到達する。放射はチップ５３に入射する時に屈折し、キャビティ５１で反射されることになる。

イメージングシステム９は前記チップ５３の射出面５７の後に配置され、これによって、反射放射の強度を収集し、照射された突起５１の画像を検出器１０の上に生成することができる。

図９に示される装置はチップ６１（金属層６２で被覆される）を含み、その側面は底面に垂直であり、キャビティ６１を底面から分離する表面間の距離は相互に異なる。

図９は、光源（図９では示されていない）から放出された入射放射が入射面６４（側面に対応する）に垂直に到達し、それがチップ６３を通過する時に偏向せず、各種のキャビティ６１のすべてを照射する実施形態を示している。

イメージングシステム６９と検出器７０は、この実施形態では前記チップ６３の底面に対応する射出面６７の後に配置され、それゆえ、これによって反射放射の強度を収集して、照射されたキャビティ６１の画像を生成することができる。

１つの実施形態によれば、光学イメージングシステム（９、６９）は、マイクロレンズのマトリクスの形態でチップ（５３、６３）の射出面（５７，６７）に直接組み込むことができる。

１つの好ましい実施形態によれば、コリメーションシステム８と、任意選択的に設置可能な偏光子６が入射面（５４、６４）に固定され、および／または光学イメージングシステム（９、６９）と検出器（１０、７０）が射出面（５７、６７）に固定される。

測定方法
本発明の他の主題はＳＰＲ測定方法に関し、これは、
− （ｉ）微細構造チップの入射面から、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起から選択された少なくとも２つの領域の感応面に、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射することにより、および（ｉｉ）前記領域の少なくとも２つの感応面によって反射され、射出面から出た放射の強度を同時に検出することによって、初期状態を検出するステップと、
− 少なくとも１種の流体を前記流域の少なくとも２つの感応面と接触させるステップと、
− 前記領域の少なくとも２つの、前記流体を含む感応面に、微細構造チップの入射面から、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射し、前記領域の少なくとも２つの感応面によって反射され、射出面から出た放射の強度を同時に検出して、前記領域の少なくとも２つにおける光学的厚さの変化をリアルタイムで継続的にモニタするステップと、
を含む。

本発明の別の主題はＳＰＲ測定方法に関し、これは、
− 前述の微細構造チップの、金属層で被覆された上面にリガンドを固定化するステップと、
− （ｉ）微細構造チップの入射面から、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起から選択された少なくとも２つの領域の感応面に、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射することにより、および（ｉｉ）前記領域の少なくとも２つの感応面によって反射され、射出面から出た放射の強度を同時に検出することによって、初期状態を検出するステップと、
− 少なくとも１種の流体を前記微細構造チップの前記流域の少なくとも２つの感応面と接触させるステップと、
− 前記領域の少なくとも２つの、前記流体を含む感応面に、微細構造チップの入射面から、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射し、前記領域の少なくとも２つの感応面によって反射され、射出面から出た放射の強度を同時に検出して、前記領域の少なくとも２つにおける光学的厚さの変化をリアルタイムで継続的にモニタするステップと、
を含む。

本発明によれば、上面へのリガンドの固定化は、当業者の間で知られている各種の技術、たとえば化学的共有結合、または金属面へのピロールの電解共重合によって行うことができる。

「流体」という用語は、気体または流体を意味するように意図される。

本発明の１つの好ましい実施形態によれば、流体は少なくとも１種の生物学的な種である。

これらの測定方法は、表面上に固定化された分子の構造変化、分子間相互作用、流体（気体または液体）の光学指数、表面の品質（平行度、微細表面粗さ、成膜品質）または表面近傍の金属ナノビーズの存在を非限定的な方法で測定するのに適している。

これらの測定方法によれば、外部媒体の光学指標等の外部パラメータの測定も可能となり、それによって屈折の制限角度の数値まで観察することが可能となる。

１つの実施形態によれば、入射ビームはチップ６３の入射面６４から垂直に入る。

検出器（１０、７０）による角度範囲Δθ（またはΔθ’）の反射放射の強度の検出により、プラズモン曲線の全部または一部を生成することが可能となり、その主な関心対象領域は以下のとおりである。
− 最小プラズモン感度、
− 「プラズモンの立ち上がり」とも呼ばれる、感度が最大となる（すなわち、プラズモン励起が最大となる）角度範囲、
− 屈折の制限角度範囲内の領域（屈折系から全反射系に変化する部分）

図１０と１１は、異なる観察角度範囲を有する３つのキャビティおよび／または突起に関するプラズモン曲線を示している（第一のキャビティおよび／または突起の角度範囲は、図１０ではΔθ_１、図１１ではΔθ’_１、第二のキャビティおよび／または突起の角度範囲は、図１０ではΔθ_２、図１１ではΔθ’_２、第三のキャビティおよび／または突起の角度範囲は、図１０ではΔθ_３、図１１ではΔθ’_３である）。

図１０は、β＝０（傾斜なし）の場合の３つのキャビティ／突起の角度範囲を示し、図１１は、β≠０（傾斜あり）の場合の３つのキャビティ／突起の角度範囲を示している。

図１０において、すなわちβ＝０（傾斜なし）の場合、観察対象の３つの角度範囲の中心は角度θにある。各範囲の幅は、各キャビティおよび／また突起の頂点の角度２αと曲率半径Ｒによって定義される。したがって、角度θの選択は、関心対象および可能なすべての範囲を観察する上で非常に重要である。それゆえ、観察対象の領域の曲率半径に応じて、プラズモン曲線の事実上大きな角度範囲を探索することが可能である。領域に傾斜βが全くない場合（図１０にあてはまる）、この角度範囲は常に中心が同じ数値θにある。

図１１において、すなわちβ≠０（傾斜あり）の場合、３つの角度範囲Δθ’_１、Δθ’_２、Δθ’_３の中心はそれぞれ、角度γ’_１、γ’_２、γ’_３にあり、前記角度γ’_１、γ’_２、γ’_３は、各々、異なる角度βにより定義される。この場合（傾斜あり）、角度範囲の中心は同じ数値とならない。

それゆえ、同じ角度の入射ビームでプラズモン曲線の様々な角度範囲を探索することが可能であり、それゆえ、入射ビームの角度を回転させるために通常用いられる可動部品を不要にすることができる。

他の実施形態によれば、測定方法はまた、チップのキャビティおよび／または突起の画像が生成されるステップも含む。

図１２は、マトリクス検出器上の３つのキャビティおよび／または突起（図１１のプラズモン曲線）の画像を示しており、明るい帯状部（薄いグレイ）間の暗い帯状部は領域間表面（すなわち、キャビティ間および／または突起間および／またはキャビティ突起間表面）を示し、これらは平面であるため、反射率が反対となる。

本発明によれば、それゆえ、光学システムの構造によって一定で変化しない（機械的部品が何れも移動しないため）入射角θがわかっているため、任意選択的に検出器の上に画像形成できる角度範囲Δθを選択し（曲率半径Ｒと角度αまたは曲率半径Ｒと直径ｄを選択することによる。なぜならαとｄが曲率半径Ｒによって相互から推測可能であるため。）と、分析対象の様々な種に応じた微細構造の平均角度γ’_ｍｅａｎを選択する（傾斜βの選択による）凸面の場合γ’_ｍｅａｎ＝θ＋２β）ことが可能となる。この選択は、キャビティおよび／または突起の各々について行うことができ、その結果、同じチップ上に固定化された数種類の種に適応させることができる。

同様に、上記の選択は、チップ上に事前に固定化させた種と相互作用するタイプの種に応じて行うこともでき、それゆえ、キャビティおよび／または突起の各々を検出対象の種に「適応させる」ことが可能となる。

それゆえ、本発明の他の主題は、生体分子間相互作用を測定するための本発明による装置の使用に関する。

本発明を、単に例示的で非限定黄な例を挙げて説明する。

実施例１：プロテインチップ−相互作用動力学における外部媒体の指数のリアルタイムでのモニタと補正
ポリカーボネート（ＰＣ）製の、１６のキャビティを有する微細構造チップが図１３に示されている。

プラズモン効果を発生させるために、厚さ４８ｎｍの金の層を前記チップの上面にスパッタリングにより成膜した。

ＴＭ偏光では、最低反射率は角度θ＝２８°付近で得られる。

１６のキャビティは、直径ｄ＝５００μｍ、長さＬ＝５００μｍの半円柱面４×４個の規則的マトリクスにしたがって分散され、各々が１ｍｍの中心間（ＣＴＣ）距離だけ離間されている。

４種類の種を、関心対象のリガンドで機能化したポリピロールフィルムの電解共重合によって共有結合的に固定化した。

それゆえ、キャビティ内には以下の種が存在する。
− ラインＬ_１：モノクローナル抗マウス抗体
− ラインＬ_２：ヒト柔毛膜性ゴナドトロピンホルモン（ｈＣＧ、数種の腫瘍病理においてバイオマーカとして含められる）に対するマネクローナル抗体
− ラインＬ_３：バクテリウム属リステリアモノサイトゲネスに対するモノクローナル抗体
− ラインＬ_４：ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）

チップに偏光コリメート単色入射放射を照射し、キャビティにより反射される放射の強度をＣＭＯＳ検出器で検出する。

列Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３の半円柱面の曲率半径は９．５ｍｍ（プラズモン曲線上で約３°での角度観察領域Δθ_ａと等しい）であり、列Ｃ_４のキャビティの曲率半径は１．９ｍｍ（約１５°の角度観察領域Δθ_ｂと等しい）である。角度範囲Δθ_ａとΔθ_ｂはそれぞれ図１０の角度範囲Δθ_１とΔθ_３に対応する。

ｈＣＧプロテインを含む、光学指標が不明な液体をチップのキャビティと接触させる。ラインＬ_２のキャビティでの時間に関する信号の特徴的変化を観察するが、抗ｈＣＧモノクローナル抗体では特異な相互作用が起こるが他の固定化されたプロテインでは起こらないため、それ以外では観察しない。

さらに、（Ｌ_２、Ｃ_４）にあるキャビティの曲率半径は、プラズモン曲線全体を検出器上で視覚化できるような曲率半径を有するため、屈折の制限角度の角度値を容易に決定でき、それゆえ、液体媒体の不明な指標を推測することが可能である。

この指標がわかれば、（Ｌ_２、Ｃ_１）、（Ｌ_２、Ｃ_２）、（Ｌ_２、Ｌ_３）にあるキャビティ上の信号の変化は、外部媒体に関連する信号の変化を、ｈＣＧプロテインを抗ｈＣＧモノクローナル抗体に付着させたことに関連する信号の変化から分離することによって、正確に推測できる。

実施例２：志賀毒素生成大腸菌観察チップ
この例では、食品加工業界から得た標本中の志賀毒素生成大腸菌（ＳＴＥＣ）の存在を観察した。

この分類の細菌の例はＯ１５７：Ｈ７、Ｏ２６：Ｈ１１またはＯ１０３：Ｈ２型である。この種の細菌とそれらによって生成される志賀毒素は、重篤な腸障害の原因となり、命に係わることがある。これらの志賀毒素の大きさと分子量（直径数ナノメートル、分子量は約６８ｋＤａ）は大腸菌（重さは約１，０００万倍）と大きく異なる。その結果、これら２種類の族の付着によるプラズモン信号は非常に異なる。従来のＳＰＲ装置ではしたがって、これらの細菌とこれらの毒素の両方を同じ実験においてリアルタイムで検査することはできない。そのため、細菌を付着させた場合、曲線は０．１°近く角度的にシフトし、これに対し、毒素の場合は０．０１°未満しか移動しない（従来のＳＰＲ方法では容易に検出できない）。

この例は、特別な構造を有する本発明による微細構造チップを使用することによって、上記のような大きさの異なる２つの生物学的な種を単独の実験で検査できることを実証している。

直径６００μｍ、長さ８００μｍの半円柱形突起を含むポリカーボネート製チップを作製する。

プラズモン効果を得るために、前記チップの上面を、厚さ２ｎｍのクロムの層および厚さ４８ｎｍの金の層で被覆し、何れもスパッタリングで成膜した。

第一の突起は傾斜なし（β＝０）とし、第二の突起はβ＝０．５°で傾斜させた。

チップに、偏光コリメート単色入射放射を照射し、突起の感応面により反射された放射の強度をＣＣＤ検出器で検出する。

光学系の平均入射角はシステムの構造によって機械的に固定され、２６．５°である。

２つの突起の曲率半径もまた異なり、第一の突起は１１．５ｍｍ（角度観察範囲Δθ３°に対応）、第二の突起は１００ｍｍ（角度分析範囲Δθ’０．３°に対応）である（図１４）。

Ｏ１５７：Ｈ７型細菌に対するモノクローナル抗体は、第一の突起に共有結合により均一に固定化され、特に志賀毒素に対するモノクローナル抗体を第二の突起に固定化する。

これら２つの突起から得られた２つのプラズモン曲線は、反応前には同じプラズモン共鳴角度（約２６．７°）を示す。

大量の（すなわち、細菌濃度が１ｍｌ当たり１０^５より大きい）細菌Ｏ１５７：Ｈ７を含む混合物をチップの感応面（換言すれば、突起面）に接触させると、その中の一部が第一の突起の抗体と特異に相互作用する。細菌はＳＰＲによって検出しやすい分子であるため（重量が大きいため）、プラズモン曲線は十分にシフトし、このシフトは第一の突起の画像を形成する検出器によって抽出されやすい。さらに、この細菌は同じ実験中に志賀毒素も分泌する。

第二の突起は、わずかに傾斜し（β＝０．５°）、その観察対象角度幅ははるかに小さい（Δθ’＝０．３°）。それゆえ、第二の突起の測定角度はより大きく、第二の突起の抗体と結合した志賀毒素を検出することが可能である。図１５と１６は、それぞれ傾斜なしと傾斜ありの２つの突起について、突起の各々に固定化された抗体と、それぞれ細菌と毒素との相互作用の前と後に検出器で得られた信号を示している。

それゆえ、この例は、本発明によるチップによって、単独の実験で測定対象の種に合わせて測定ダイナミクスと感度を調整することが可能であることを実証している。

実施例３：プリズムに接合された微細構造チップの具体的構成
２つのキャビティを含む微細構造チップの、面（ＹＺ）に沿った断面図が図１７に示されている。２つのキャビティは、チップの全長に沿った溝の形態で形成されている（図４参照）。

チップ（図１７の斜線部で示される）は、ポリスチレン（ＰＳ）のプリズム上に直接形成されている。これを行うために、事前にＰＳプリズム上にスピンコーティングによってＣｌａｒｉａｎｔ社製ＡＺ４５６２型の感光性樹脂の層を厚さ１０μｍに成膜した。この層を次に、光によって＋Ｘ方向に分離し、図１７のキャビティを再現した。その後、事前に分離した樹脂の上面に厚さ４７ｎｍの金の層を真空蒸着により堆積させた。

２つのキャビティは面（ＹＺ）で説明され、曲線で分離された２つの直線により定義され、前記曲線は凸状の曲率半径（換言すれば、＋Ｚ軸に沿った曲率半径）を有する。この例によれば、キャビティを異なる曲率半径（Ｒ１≠Ｒ２）とすることにより、プラズモン曲線の２種類の角度範囲を観察できる。

Claims (16)

1. 底面（５、７７）と、少なくともその一部が金属層（２、２２、４２、５２、６２）で被覆された上面（４、４４）と、少なくとも１つの側面（５５、６６）と、からなる固体の形態の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析用の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   −前記上面（４、４４）には、分析対象の種を受け取るように意図された、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起から選択される、マイクロメートルサイズの少なくとも２つの領域（１、１１、４１、５１、６１）が設けられ、前記マイクロメートルサイズは、１μｍ乃至１０００μｍの範囲であり、前記領域は、面ＹＺにおける平均曲率半径Ｒを持つ曲面を形成しており、前記領域は平面によって相互に分離され、
   −前記領域の少なくとも１つがそれ以外のものとは異なり、
   −前記領域（１、１１、４１、５１、６１）間の平面と前記底面（５、７７）を分離する距離の少なくとも１つがそれ以外のものと異なる
   ことを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
2. 請求項１に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起から選択された前記少なくとも２つの領域が金属層で被覆されていることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
3. 請求項１または２に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   前記底面（５、７７）が平面であることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
4. 請求項１乃至３の何れか１項に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   前記上面（４、４４）が前記底面（５、７７）に平行であることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
5. 請求項１乃至４の何れか１項に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   少なくとも１つの側面（５５、６６）が平坦であることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
6. 請求項５に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   少なくとも１つの側面（５５、６６）が前記底面（５、７７）および／または前記上面（４、４４）に垂直であることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
7. 請求項１乃至６の何れか１項に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   前記領域（１、１１、４１、５１、６１）が０．１〜６００ｍｍの間の曲率半径Ｒを有する曲面を有することを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
8. 請求項７に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも１つの曲率半径Ｒがそれ以外のものと異なることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
9. 請求項１乃至８の何れか１項に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
   前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも１つが角度βだけ傾斜し、０°＜β≦８０°であることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
10. 請求項１乃至７の何れか１項に記載の微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）において、
    前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の曲率半径Ｒが同じであることを特徴とする微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）。
11. ＳＰＲ分析用の装置において、
    −入射ビームを生成するように意図された光源（７）と、
    −光学コリメーションシステム（８）と、
    −偏光システム（６）と、
    −前記入射ビームの光路内に設置された請求項１乃至１０の何れか１項に定義された微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）と、
    −光学イメージングシステム（９、６９）と、
    −検出器（１０、７０）と、
    を含むことを特徴とする装置。
12. 請求項１１に記載の装置において、
    前記コリメーションシステム（８）と前記偏光システム（６）が入射面（５４、６４）に固定され、および／または前記光学イメージングシステム（９、６９）と前記検出器（１０、７０）が射出面（５７、６７）に固定されることを特徴とする装置。
13. ＳＰＲ測定方法において、
    −（ｉ）請求項１乃至１０の何れか１項に定義された前記微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の前記入射面（５４、６４）から、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起（１、１１、４１、５１、６１）から選択された少なくとも２つの領域の感応面に、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射することにより、および（ｉｉ）前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの前記感応面によって反射され、前記射出面（５７、６７）から出た放射の強度を同時に検出することによって、初期状態を検出するステップと、
    −少なくとも１種の流体を前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの前記感応面と接触させるステップと、
    −前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの、前記流体を含む前記感応面に、前記微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の前記入射面（５４、６４）から、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射し、前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの前記感応面によって反射され、前記射出面（５７、６７）から出た放射の強度を同時に検出して、前記領域の少なくとも２つにおける光学的厚さの変化をリアルタイムで継続的にモニタするステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
14. ＳＰＲ測定方法において、
    −請求項１乃至１０の何れか１項に定義された前記微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の、金属層（２、２２、４２、５２、６２）で被覆された前記上面（４４、４）にリガンドを固定化するステップと、
    −（ｉ）前記微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の前記入射面（５４、６４）から、少なくとも１つのキャビティおよび／または少なくとも１つの突起（１、１１、４１、５１、６１）から選択された少なくとも２つの領域の感応面に、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射することにより、および（ｉｉ）前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの前記感応面によって反射され、前記射出面（５７、６７）から出た放射の強度を同時に検出することによって、初期状態を検出するステップと、
    −少なくとも１種の流体を前記微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの前記感応面と接触させるステップと、
    −前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの、前記流体を含む前記感応面に、前記微細構造チップ（３、３３、４３、５３、６３）の前記入射面（５４、６４）から、事前に偏光され、任意選択的にコリメートされた単色入射ビームを照射し、前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の少なくとも２つの前記感応面によって反射され、前記射出面（５７、６７）から出た放射の強度を同時に検出して、前記領域の少なくとも２つにおける光学的厚さの変化をリアルタイムで継続的にモニタするステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
15. 請求項１３または１４に記載の方法において、
    前記チップの前記領域（１、１１、４１、５１、６１）の画像が生成される最終ステップも含むことを特徴とする方法。
16. 生体分子間相互作用を測定するための、請求項１１または１２に定義される前記装置の使用。

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