JP6037445B2 - 蛍光測定装置および蛍光測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光測定装置およびこれを用い、特にＰＣＲに適した蛍光測定方法に関するものである。

ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法は、ごく微量のＤＮＡから目的とするＤＮＡ領域を短時間で増殖する方法として知られている。その原理は、２本鎖ＤＮＡ上の２つの既知配列を利用して、互いの合成方向が向かい合うような２つのプライマーＤＮＡを設計する。これらのプライマーに挟まれた領域のＤＮＡが合成されると、それが次のサイクルでは鋳型になる。このような反応を繰り返すことで、ＤＮＡ鎖を幾何級数的に増幅することができる。

このようなＰＣＲ法を用いることで、血清中のウィルス診断を行うことが可能である。例えば、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の検査では血清の中にどれくらいのＨＢＶが存在するかの濃度を測定することができる。この場合、１ｍｌの血清の中で、ウィルスのコピー数が１０^２〜１０^６の間での感度が特に重要であり、それ以上の場合は相当に重篤な状態といえる。これを測定するためには、ＨＢＶのウィルスのＤＮＡに蛍光のついたプライマーを付けて、ＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅して蛍光の増減を測定する方法が用いられる。

まず、血清からウィルスを溶解および抽出し、その中からＨＶＢのＤＮＡを取り出す。次に、ＨＢＶ中の特定のＤＮＡを増幅する。このためにはＨＢＶ−ＤＮＡに合うプライマー設計をしてＨＢＶ−ＤＮＡを増幅する。特にＨＢＶ−ＤＮＡの濃度が薄い場合にはこれを増やさないと計測することができない。この時にプライマーに特定の蛍光を付与して、この蛍光がＨＢＶ−ＤＮＡの増加と共に“比例して増加、又は減衰”することにより、ＨＢＶ−ＤＮＡの濃度計測が可能となる。ＨＢＶ−ＤＮＡの増加はＰＣＲ法によるが、理論的には１回で２倍になる。ＨＢＶ−ＤＮＡに適当なプライマーを設計すると、亜型であるＡ〜Ｈのどの型があっても、ＰＣＲを４０回ほど行えば蛍光増幅又は減衰するのでＨＢＶ−ＤＮＡを検出できる。

例えば、４０回のＰＣＲを行うとＨＢＶ−ＤＮＡは、初期に比べて２^４０倍となり、これは１０^１２倍（一兆倍）と略同等である。すなわち、ＰＣＲを４０回行うことは元のＨＢＶ−ＤＮＡを一兆倍に増やすことになる。したがって、ＰＣＲを４０回行えば、１００コピー数／ｍｌの希薄な核酸であっても、コピー数は１００×１０^１２／ｍｌになるので、プライマーに蛍光を付与することにより、蛍光増減を検出することが可能となる。たとえば、プライマーに付与する蛍光としては、Ｎ，Ｎ´―ビス−３−アミノプロピル−２、７−ジアミノー１、８−ナフチリジンいわゆるＤＡＮＰなどを用いることができる。

なお、ＰＣＲ装置は、３ステップ法では、５３〜５６℃で一本鎖のＤＮＡ（＝核酸）にプライマーを付与して、６０〜７０℃でこれを増幅し、９５℃で二本鎖から一本鎖に分解し、これを繰り返す。２ステップ法ではプライマー付与と増幅を同一温度（６０〜６５℃）で行うので、３ステップ法より短時間で行える。

このような蛍光標識を用いたリアルタイムＰＣＲ法としては、インターレーション法やハイブリダイゼーション法、ヘアピンプライマーＰＣＲ法がある。ハイブリダイゼーション法の方がインターカレション法よりも非特異的増幅の確率が低く、目的とする遺伝子鎖の増幅効率が高くなることが知られている。

図６は、ヘアピンプライマーＰＣＲ法の概念図である。この方法では、図６（ａ）に示すように、プライマーの末端にヘアピン構造を形成するＤＮＡ配列を付加したヘアピンプライマー１０３が用いられる。ヘアピン領域には低分子が特異的に結合するシトシンバルジ領域が導入されている。また、ＰＣＲ前には、シトシンバルジに結合すると蛍光を発する低分子化合物が結合されている。

図６（ｂ）に示すように、ポリメラーゼ１０７によるＤＮＡ鎖の合成が進行し、ＰＣＲによりヘアピンプライマー１０３のヘアピン構造が開かれると、シトシンバルジ構造が消失する。このため蛍光色素１０５が遊離する。したがって、蛍光強度が低下する。すなわち、反応系の蛍光強度の減少を検出することで、ＰＣＲの進行を把握することができる。

図７は、このようなリアルタイムＰＣＲによって、蛍光を測定するためのウェル近傍を示す概略図である。まず、ウェル１０９内に前述した各種の構成を含む反応溶液１１３が入れられる。この状態で、上方より照射・受光部１１１より光を照射する（図中矢印Ｅ方向）。照射・受光部１１１は、例えば光ファイバであり、図示を省略した光源および蛍光測定器に接続されている。

光が照射された反応溶液１１３からは、ＰＣＲの進行に応じた蛍光が発生（消失）する。反応溶液１１３から発生する蛍光の一部は、照射・受光部１１１で受光されて、蛍光が測定される。

特許文献１には、励起光を発生させるランプ１４から、光分波器５を介して励起光を光ファイバに導き、可動ミラー３２と光学レンズ２２、２４を介してマイクロ流路構造体２における流路３に近接配置した蛍光物質７に励起光を受光させて蛍光を発生させ、蛍光物質が発生した蛍光を可動ミラー３２で反射させ、光分波器５を介して、光検出部８に導き、蛍光強度を測定する測定装置において、光源及び光検出部と発光体との間の光路を切り変える光スイッチを有する蛍光測定装置が開示されている。そして、可動ミラー３２がベース部材１１の光路形成部の真上に配置されることが記載されている。

特許文献２には、励起光源から出射された励起光が、ダイクロイックミラーを経て、超薄基板上に存在する蛍光体標識されたアレイのスポットの上へ、斜め上方に配置されたミラーにより、斜め上方より、角度θで配置されたミラー１１６を通過する。放出された蛍光はレンズ１２７によって集められ、フィルター１２８を通り、そこから、コンピュータ制御１３２されたＣＣＤカメラの開口部１２６を通る蛍光測定装置が開示されている。

特許文献３には、試料プレート１０が試料プレート１０の下方に配置された加熱冷却用ブロック３に密に接するように構成され、試料プレート１０の斜め上方から、励起光をビームスプリッター６、ビーム方向変更ミラー７、フレネルレンズ８を通過させ、試料プレート１０に照射して、試料プレート１０から発生する蛍光をビーム方向変更ミラー７、ビームスプリッター６、放射フィルター１１、レンズ６を通過させて、試料プレートの斜め上方に設けたＣＣＤカメラ１３に入射させる蛍光測定が記載されている。

このような蛍光測定を行う装置は種々開発されており、たとえば、特許文献１は、光ファイバからの励起光をマイクロ流路構造体の蛍光物質に向けて照射させ、蛍光物質からの蛍光を光ファイバに向けて反射させる時に、ベース部材の上の可動ミラーを切り替えて使用する光スイッチを有する蛍光測定装置である。この場合には、光スイッチはマイクロ流路構造体の側部または上部に配置される。

特許文献２には、励起光源から出射された励起光が、ダイクロイックミラーなどの光学系を経て、超薄基板上の蛍光体標識されたアレイのスポットへ、斜め上方より照射され、逆にアレイのスポットから放出された蛍光はレンズ、フィルターを通り、そこから、超薄基板上に配置されたＣＣＤカメラの開口部を通る測定装置である。

特許文献３には、試料プレートが試料プレートの下側に配置された加熱冷却用ブロックに密に接するように構成され、励起光を試料プレートの斜め上方から、種々の光学部品を介して試料プレートに照射し、試料プレートから発生する蛍光を、試料プレートの斜め上方に設けたＣＣＤカメラに入射させる蛍光測定装置である。

以上のように、いずれの特許文献の場合でも、励起光を試料プレートやマイクロアレイの上方から照射し、試料プレート上のウェルやアレイから発生する蛍光を、試料プレートやアレイの上方で受光するものである。これは、図示の有無に関わらず、通常試料プレートの下側に加熱冷却用ブロックや、たとえば、ペルチェ素子やファンなどの加熱冷却部品が配置されるからである。

図８は、従来の一般的に用いられる蛍光測定器の概略図である。蛍光測定器の上部には、例えばアルミニウムブロックからなるウェル保持部１１９に配置された複数のウェル１０９が用いられる。ウェル保持部１１９の下部には、ペルチェ加熱部１１５が設けられる。ペルチェ加熱部１１５によって、ウェル１０９内の反応溶液を昇温することができる。さらに、ペルチェ加熱部１１５の下部には、冷却部１１７が設けられる。冷却部１１７は、例えば冷却ファンが内蔵されており、ペルチェ加熱部１１５を介して、ウェル１０９内の反応溶液を降温することができる。

特開２００３−２４７８９３号公報 特表２００５−５３５９０５号公報 特表２００３−５１４２２３号公報

しかし、従来の測定法では、図８に示すようにペルチェ加熱部１１５のペルチェ素子に孔を空けると、ペルチェ素子が破損することから、ペルチェ加熱部に孔を設けることが困難である。また、冷却部１１７ではファンが回転するため、冷却部１１７までウェル１０９を挿入することができない。このため、ウェル１０９の下方に光源や測定器を配置することはできなかった。

このように、従来の測定法では、ウェル上部からレーザ光を照射し、ウェル上部から蛍光を計測していたために、装置上部にスペースを広く取る必要が有り計測部が大きくなっていた。また、光ファイバを使用した測定装置では、光ファイバに取り込む蛍光強度が不足するために、多くの場合には集光のためのレンズ系を使用する必要があり、さらには、ウェル内で発生した蛍光がウェル上部の空間全体に均等に広がるため、レンズ内に集光できない蛍光が多く存在し、蛍光強度が低下する問題がある。

また、ウェルの上方に種々の光学部品を配置する測定装置の場合は、部品点数が多く、構造が複雑になるだけでなく、ウェルから直接蛍光を取り込むことができないため、蛍光を光学系に取り込む際に、蛍光強度が低下する問題があった。

本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、コンパクトで簡単な構造であると同時に、蛍光の集光効率が高く測定時間も短い蛍光測定装置等を提供することを目的とする。

前述した目的を達するために第１の発明は、蛍光測定装置であって、反応溶液を保持する複数のウェルと、前記ウェルの上部に設けられる蓋と、前記ウェルとは別体で設けられ、前記ウェルを並列させて保持する受熱ブロックとしての保持部と、前記ウェルの下方にそれぞれの前記ウェルに直接接続される複数の導波路と、前記保持部と接触し、反応溶液の温度調整が可能な温調器と、前記導波路を介して前記ウェル内の反応溶液に励起光を照射する光源と、前記ウェル内で発生する蛍光を測定する蛍光測定器と、を具備し、前記保持部には、前記ウェルの底面を露出させて保持するように貫通孔を設け、前記導波路の下方から前記光源により励起光を前記導波路に入射させ、前記導波路を介して前記ウェルの底面から前記ウェル内の反応溶液に励起光を照射し、前記ウェル内で発生する蛍光を、前記ウェルの底面から前記励起光を入射させた導波路と同一の導波路に入射させ、前記蛍光を、前記導波路を介して、前記導波路の下方で前記蛍光測定器により、測定可能な構造を有することを特徴とする蛍光測定装置である。

ここで、前記保持部は、前記保持部に設けた貫通孔に導波路の端部を挿入して、前記ウェルおよび前記導波路を並列させて保持することができる。

前記温調器は、ペルチェ素子とファンにより構成され、前記保持部の側部に接触して設けられる。さらに、前記導波路の上部の直径は、ウェルの底面の寸法と略同一であり、前記導波路は、前記ウェルの底面に対して押し付けられることで、前記ウェルの底面に前記導波路が密着する。

このような構造にすることで、ウェル底面からの蛍光を、ウェル底面直下に各ウェル位置に対応して配置した導波路に送る際の漏光やウェル底面からの光の拡散を少なくすることができる。また、必要に応じて、透明で光透過性の優れるマッチングオイルなどを極薄く導波路の上端面に塗布することも可能であるが、ウェル底面と導波路が密着するため、マッチングオイルは使用しなくても良い。

前記導波路は、上下に略同一径であってもよく、前記導波路は、下方が僅かに縮径するようにテーパ形状を有するか、あるいは前記ウェルと接続される端面と反対側の端面にレンズ加工されていてもよい。導波路がテーパ形状を有していることにより、蛍光測定器の開口径と一致させることで、蛍光測定器に蛍光を取り込みやすくなる。また、ウェルと接続される端面と反対側の端面にレンズ加工することで、蛍光測定器の蛍光取り込み部に焦点を略一致させることができ、導波路の出射側の蛍光の取り出し効率を向上させることができる。

前記蓋には反射膜が形成されることが望ましい。前記導波路の外周面には反射膜が形成されてもよい。前記導波路の外周面または前記蓋の少なくともいずれかには反射膜が形成されることで、ウェルの蓋や導波路の外周面からの漏光を防止できる。また、前記蓋の内側にゴム製の台座を設け、前記蓋をウェルに押圧することで、蓋をウェルに密着させ、反応溶液の漏れを確実に防止できる。

前記光源および前記蛍光測定器は、前記ウェルおよび前記導波路の配置に対応して移動可能であることを特徴とする蛍光測定装置である。蛍光測定器を移動することで、多数のウェルの測定が可能になる。前記蛍光測定装置が前記温調器の温度調節機能を利用してＰＣＲ用の蛍光測定に用いられる。

第１の発明によれば、ウェルを保持する保持部が温調器と接合され、前記保持部は受熱ブロックとしての役割を果たすため、熱変性による分離、一本鎖ＤＮＡへのプライマーの結合、ＤＮＡ合成による増幅および蛍光の測定を連続して行うことができる。また、蛍光測定器が、複数並列されたウェルおよび導波路の下方を移動可能であるため、一台の蛍光測定器によって複数のウェルの蛍光測定が可能である。

また、受熱ブロックである保持部の底部にウェルの底面を露出させて保持するように貫通孔を設けることで、前記貫通孔を通じて導波路をウェルに直接接続させることが可能になり、ウェルの下方から導波路を介して励起光を照射し、発生した蛍光を下方で検出するため、装置がコンパクトである。ウェルの交換作業時に励起光の光源や蛍光測定装置が交換作業の妨げになることがない。１回の測定が比較的短時間で行なうことができるため、光源と測定装置を高速で移動すれば、複数のウェルの蛍光測定を比較的短時間で行なうことができる。

また、ウェルには蓋が設けられるため、ＤＮＡの増幅のための昇温時に、反応溶液が蒸発して飛散することを防止することができる。また、ウェルの蓋を加熱する必要がある。この理由は、ウェルの蓋を加熱しないと、ＰＣＲ時などのウェル過熱時にウェルとウェルの蓋に温度差が生じて、ウェル内での反応が均一に進行しない可能性があるからである。ここで、ウェルの蓋には、耐熱性樹脂を使用することが望ましく、耐熱性が優れるテフロン（登録商標）などが使用できる。ＰＣＲの加熱時の温度履歴に伴う圧力の増加に対しても、蓋が外れないような構造とする必要がある。

たとえば、そのための機構としては、回転軸に垂直に設けたアームの一端を回転軸に固定し、蓋を回転軸とは反対のアームの他端部に固定し、この蓋を取付けたアームの回転軸をモータ駆動により、１８０°回転させることにより、反転してウェルにかぶせる開閉する機構や、蓋の外周部の側面に嵌合用の凹凸を形成して、さらにこれと嵌合する蓋固定枠を設けて蓋を圧入して取り付ける機構、さらに、中空形状の金属管を利用して、管内部を真空または負圧にするよう減圧し、蓋をウェル直上に移動しウェルに蓋をかぶせた後、金属管の先端で蓋を押圧する機構などが考えられる。

このようにすることで、ウェルと蓋を強固に固定することができ、測定中の反応溶液の漏れを防止することができる。ここで、アームとモータを用いる方法では、蓋をかぶせた後もモータの駆動力を押圧力として加えることで、反応溶液の漏れをより確実に防止することができる。

また、蓋をかぶせる装置には、ゴム製の台座を設けて、台座を介してウェルを押圧することで、蓋に対する押圧力を均等にしてウェルと蓋の密着性を改善することができる。

また、導波路が、ウェルの底面に押し付けられるため、導波路とウェルの境界部における光の反射や拡散による漏れを抑制することができる。

また、蓋に反射膜を設けることで、反応溶液で発生した蛍光が、蓋を透過して外部に漏れ、または、蓋に蛍光が吸収されることを抑制することができる。また、導波路の外周面に反射膜を形成することで、導波路の途中で光が漏れることを抑制することができる。

本発明では、励起光源は、少なくとも１個あればよいことから、導波路の外周に反射膜を設けなくとも、蛍光強度測定時に隣接する導波路間の漏光による影響を受けることがない。

なお、導波路の外径が上下方向でほぼ一定であれば、光の漏れを抑制可能であるとともに、製造も容易である。また、導波路の下方が縮径するようなテーパ形状とすれば、ウェルの容積を大きくし、測定部を小さくすることができる。

第２の発明は第１の発明に係る蛍光測定装置を用い、前記ウェルに反応溶液を注入し、前記ウェルの上部を前記蓋で密封した状態で、前記導波路は、前記ウェルの底面に対して押し付けて密着させることで、前記ウェルの底面に前記導波路を直接接続して、前記ウェル内で発生する蛍光を測定することを特徴とする蛍光測定方法である。

前記光源および前記蛍光測定器は、前記ウェルおよび前記導波路の配置に対応して移動させて測定することができる。また、前記ウェル内で発生した蛍光を、前記蛍光測定器によって測定した後、前記ウェルのみを交換することで、新たな測定を繰り返すことができる。

さらに、前記温調器によって前記反応溶液の温度を調整することで、反応溶液中でＤＮＡの熱変性による分離、一本鎖ＤＮＡへのプライマーの結合、およびＤＮＡの合成による増幅を行い、上記工程を複数回繰り返した後、前記光源と前記蛍光測定器を前記導波路の下部で相対移動させながら、前記ウェル内で発生した蛍光を、前記蛍光測定器によって測定することができる。

第２の発明によれば、コンパクトな測定装置を用いて、蛍光測定器を移動させることで、短時間で多数のウェルの蛍光測定が可能となる。また、ウェルを交換するだけで、新たに測定を繰り返すことができることから、蛍光測定を利用したリアルタイム蛍光測定を行なうことができ、リアルタイムでのＰＣＲに適用できる測定方法を提供できる。

本発明によれば、コンパクトであると同時に、測定時間も短い蛍光測定装置等を提供することができる。

蛍光測定装置１を示す分解斜視図。 蛍光測定装置１の断面図。 蛍光測定装置１に対する蛍光測定器２３の動作を示す図。 蛍光残存率とＤＮＡコピー数との関係を示す図。 蛍光測定装置１ａの断面図。 ヘアピンプライマーを用いたＰＣＲの工程を示す概念図。 従来の蛍光測定を示す概念図。 従来の蛍光測定器を示す概念図。

以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。図１は、蛍光測定装置１を示す分解斜視図である。蛍光測定装置１は主に、温調器３、ウェル保持部５、ウェル７、導波路１１、蛍光測定器および光源等から構成される。なお、簡単のため、図１においては、蛍光測定器および光源等は図示を省略し、詳細は後述する。

ウェル保持部５には、複数の孔１３が併設される。それぞれの孔１３には、ウェル７が挿入される。なお、図示した例では、複数のウェル７が一体で形成されているが、ウェル７は、個々に分割されていてもよい。また、ウェル７の配置数は、図示した例には限られず、通常は縦横に複数配列させることが多い。ウェル７は、例えば樹脂製であり、ポリスチレン、ポリカーボネイト、アクリル樹脂等を用いることができる。上記以外でも耐熱性と光透過性を有する樹脂であれば、その他の樹脂を用いることもできる。

それぞれのウェル７には、蓋９が被せられる。蓋９は、ウェル７内の反応溶液が、熱によって蒸発して飛散することを防止する。また、蓋９によって室内にウィルス等が拡散することを防止することができる。なお、図示した例では、複数の蓋９が一体で形成されているが、ウェル７と同様に、蓋９は個々に分割されていてもよい。また、詳細は後述するが、蓋９の内面には、金属などの反射膜が形成されていることが望ましい。反射膜は、ウェル７内の光が、ウェル７の上端から漏れだすことを防止するものである。反射膜としては、例えば、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化ニオブなどの物質を蒸着などによって形成すればよく、また、反射膜成分を塗布してもよい。

ウェル保持部５は、温調器３の側方に温調器と接触するように接合され、温度調節を行なう際の受熱ブロックとして用いることができる。温調器３としては、ペルチェ加熱器と冷却器（冷却ファン）によって温度調節が行われるが、ヒータブロックや抵抗加熱などのヒータなど用いることもできる。温調器３によって温度を調整することで、受熱ブロックであるウェル保持部５を介して、ウェル７およびウェル７内の反応溶液の温度を調整することができる。したがって、ウェル保持部５は熱伝導率の良好な剛性の高い材質が望ましく金属製であることが望ましい。この際、より温度調節の時間を短縮するためには、前述のように、蓋９の上方にも簡易な加熱装置を設けることができる。このようにすることで、ウェル７側部に設けた温調器と蓋の上方に設けた加熱装置により、２方向から加熱できるためより短時間で高精度の温度調整が可能になる。

ウェル保持部５のそれぞれの孔１３には、下方から導波路１１が挿入される。導波路１１は、ほぼ円柱状の形状である。なお、導波路１１は下方から上方に押し付けられる。すなわち、導波路１１はウェル７の底面に押し付けられて用いられる。導波路１１は、全体がほぼ均一な材質で構成され、材質としては、ガラスを用いることができる。ガラス材としては、不純物の少ないシリカ系ガラスが好ましい。さらには、導波路１１内部での反射特性を向上させるためには、前記シリカ系ガラスの外周にフッ素をドープしたガラス、あるいは前記シリカ系ガラスの中心にゲルマニウムをドープしたガラスを用いることができる。このように、シリカ系ガラスに不純物をドープすることで、ガラスの中心部の屈折率を、外周部より高くすることで、導波路１１からの励起光や蛍光の漏れを少なくでき、蛍光の測定感度がさらに向上することになる。ここで、導波路１１の材料としては、耐熱性を考慮するとガラスの方が好ましいが、ポリカーボネイト樹脂、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂などの樹脂を用いることもできる。なお、導波路１１の外周面には、蓋９と同様の反射膜を形成してもよい。このようにすることで、導波路１１から外部へ光が漏れることを防止できる。

次に、蛍光測定装置１の機能および詳細な構造について説明する。図２は、蛍光測定装置１のウェル７および導波路１１における断面図である。ウェル７の内部には、ＤＮＡ（核酸）と試薬などの反応溶液が入れられる。ウェル７に入れられる反応溶液は、例えば５０〜６０μｌ程度である。ウェル７の上方には、蓋９が被せられ、ウェル７が密閉される。

ウェル７は、下方が縮径するようなテーパ形状を有する。なお、ウェル７の外面のテーパ形状は、孔１３への挿入性も考慮すると５°〜１０°程度あればよい。ウェル７の内部形状は、図示したように、逆円錐型であってもよく、深さ方向にほぼ同一径で構成してもよい。なお、図に示す例では、各部の形状を簡略化して描いているが、ウェル７は、反応溶液が入れられる深さが約１５ｍｍ程度であり、上部の内径が約６ｍｍであり、下部の内径が１．０〜３．５ｍｍ程度である。

ここで、通常、樹脂は励起光を受けた時に、励起光より少し波長が長い光を放出する。特に、可視域で蛍光を強く発するものを自家蛍光があるという。このような自家蛍光は、４００ｎｍから７００ｎｍの波長帯の波長を有し、自家蛍光が長波長側になるほど低下する。したがって、ウェル７の自家蛍光の影響を小さくし、金属製のウェル保持部５からの熱伝導も考慮すると、ウェル７の底面の樹脂厚さは薄くする必要がある。したがって、ウェル７の底面および側面の厚みは、例えば０．５ｍｍ〜１．５ｍｍ厚程度とすることが望ましい。最近では、光透過性や自家蛍光性が低いシクロオレフィンなども提案されており、これらの材料もウェル７の材料として用いることができる。また、樹脂による自家蛍光は事前に自家蛍光の強度を測定してバックグランドとして除去することができる。

また、ウェル７の上面および内面には親水処理が施されてもよい。親水処理を施すことで、ウェル７と反応溶液との濡れ性を高めることができる。したがって、反応溶液をウェル７に入れやすくなる。このような親水処理としては、例えば、ウェル７の表面に親水性のポリマー等を塗布しても良く、または、樹脂の表面改質を行う方法もある。表面改質の方法としては、ＵＶ照射、コロナ放電、プラズマ処理、プライマー処理などの表面改質方法が知られており、これらの方法を用いることができる。

孔１３の上部であって、ウェル７が挿入される部位は、ウェル７の外形に対応した形状となる。すなわち、孔１３は、上部が拡径するようなテーパ形状を有する。ウェル７が孔１３に挿入されると、ウェル７はウェル保持部５と密着し、互いに嵌合する。例えば、図示したように、ウェル７の外周面に微小な凸部１９を形成し、孔１３の内面には、凸部１９に対応した形状の凹部２１が設けられる。このようにすることで、ウェル７が孔１３の上方に浮き上がることがない。

孔１３の下方からは、導波路１１が挿入される。導波路１１の一部には、フランジ１５が接着等によって取り付けられる。フランジ１５の下方には、弾性部材１７が配置され、フランジ１５を押し上げる（図中矢印Ａ）。すなわち、導波路１１が、上方に押し上げられる。ウェル７の底面と導波路１１の上面は、いずれも平滑に形成される。したがって、導波路１１が上方に押し上げられると、導波路１１の上面がウェル７の底面に押し付けられて密着する。このようにすることで、ウェル７と導波路１１の境界部に空気層が形成されることを防止することができる。なお、導波路１１をウェル７に対して押し付けることが可能であれば、その方法は限定されず、図示した例には限られない。

このような状態で、温調器３によって、所定の温度サイクルでウェル７内の反応溶液の温度を変化させる、例えば、ＤＮＡ（核酸）が増幅する温度（５５℃〜９５℃）に順次温度制御される。以上により、ＤＮＡ（核酸）を増幅させることができる。所定回数の増幅が完了すると、光源２５から所定波長の光を照射する。光源２５は、例えばレーザを照射可能である。レーザは特に限定されないが、例えば４０５ｎｍ±５ｎｍであり、５０ｍＷのレーザである。

光源２５は、導波路１１に対してほぼ垂直な方向に設けられる。光源２５と導波路１１の延長線上の交点近傍にはフィルター２７が設けられる。フィルター２７は、特定の波長の光のみを透過するものである。フィルター２７は、光源２５からの照射方向に対して略４５°の角度に配置される。また、フィルター２７の透過波長は、光源２５から照射される励起光の波長とは異なるため、光源２５から照射された光は、フィルター２７で反射し、導波路１１に導入する（図中矢印Ｂ）。なお、光路上には、適宜光を集光するためのレンズを配置してもよい。

導波路１１に導入した励起光は、導波路１１内をウェル７の方向に伝播し、ウェル７に導入され、さらに、ウェル７内部の反応溶液を照射する。なお、ウェル７と導波路１１とは密着しているため、境界部での励起光の反射を抑制することができる。

ウェル７内の反応溶液に励起光が照射されると、前述したように、ＤＮＡの増幅に応じた強度で所定波長の蛍光が発生する。ここで、通常蛍光波長は励起光の波長に対して、長波長側に２０〜５０ｎｍ程度シフトする。ウェル７内で生じた蛍光は、再び励起光が導波された導波路と同一の導波路１１に導入され、導波路内を下方に伝播する。

ここで、ウェル７で発生した蛍光の波長（例えば３８０〜４６０ｎｍ）は、フィルター２７の透過波長と一致する。したがって、導波路１１の下端から出射した蛍光の波長は、励起光と比べて長波長であるためフィルター２７を透過して、フィルター２７の下方に配置された蛍光測定器２３で測定可能である。このように、励起光を反射し、蛍光を透過するフィルター２７を光路に対して４５°の角度に配置することで、光源２５と蛍光測定器２３とを垂直な方向に配置し、蛍光強度を測定することができる。

図３は、このようにして複数のウェル７の蛍光を測定する方法を示す図である。まず、一つのウェル７に対して光源２５（図示省略）から光を照射して、蛍光測定器２３で蛍光を測定する。次に、隣の導波路１１の下部に蛍光測定器２３、光源２５およびフィルター２７が一体で移動し（図中矢印Ｄ）、同様に蛍光測定を行なう。すなわち、ウェル７内のＤＮＡ増幅等は、同時に行われるが、蛍光測定はそれぞれウェル７ごとに行われる。

なお、蛍光測定器２３等は、各導波路１１の下部で停止してもよく、連続して移動させてもよい。蛍光測定器２３等の移動速度は例えば３０〜８０ｍｍ／ｓｅｃ．である。このように、一式の蛍光測定器２３等を移動して蛍光を測定するため、ウェル７の個数分の蛍光測定器２３等が不要である。このため、蛍光測定装置１がコンパクトになる。また、同時に複数のウェル７の蛍光を測定することで、隣り合う導波路１１に蛍光が漏れ、蛍光の測定精度に影響を与えることがない。また、一つのウェル７の蛍光測定は極めて短時間で完了するため、短時間で複数のウェル７の蛍光測定を行うことができる。

次に、蛍光強度とＨＢＶ−ＤＮＡの個数（コピー数）の関係について説明する。図４は、蛍光残存率と反応溶液中のＨＢＶ−ＤＮＡ総コピー数との関係を示す図である。ウィルスを含まないダミー反応溶液に対して、光を照射して、蛍光の強度を測定したものを１００％とした。これに対し、ＨＢＶ−ＤＮＡのコピー数増幅をし、それぞれのコピー数において、蛍光を測定した。

前述したように、ＨＢＶ−ＤＮＡが増幅すると蛍光が消失していくため、蛍光残存率が低下する。したがって、ダミー測定値に対する蛍光残存率を測定することで、反応溶液中のＨＢＶ−ＤＮＡ総コピー数を推定することができる。例えば、図示は省略するが、複数回の同様の測定を行った結果、測定ばらつきを考慮すると、蛍光残存率が９０％では、３０〜１１０コピー程度であり、蛍光残存率が８０％では、２００〜８００コピーであり、蛍光残存率が５５％では、１００万〜２５０万コピーであり、蛍光残存率が４５％では、１０^８コピー程度であった。なお、蛍光残存率は、ある程度まで低下するとそれ以上は低下せずにほぼ一定となる。したがって、蛍光残存率が、４５％〜９０％の場合に、ウィルスが所定量だけ存在していたと判断することができる。

以上説明したように、本実施の形態によれば、ウェル７の下方から光を照射し、下方で蛍光を測定可能であり、さらに、一式の蛍光測定器２３等が移動しながら蛍光測定を行うことで、コンパクトであり短時間に測定が可能な蛍光測定装置１を得ることができる。また、ウェル７と導波路１１とが一体で形成されずに分離されているため、個々の部材の構造が簡易であり、さらにウェル７と導波路１１とが一体に接続されるため漏光も少ない。また、ウェル７のみを交換すれば、測定を繰り返すことが可能である。

また、励起光の入射と蛍光の受光を装置の下方で行うことができる。このため、蛍光測定器による蛍光測定部と試料配置部とを上下に分離することができる。したがって、蛍光測定部がウェル７の交換作業等の妨げとならず、迅速な測定が可能である。さらに、蛍光測定部と試料配置部とが空間的に分離されることで、ウェル７内の処理液で測定装置が汚染されることがない。

また、ウェル７には蓋９が被せられるため、反応溶液が蒸発して飛散することがない。この際、蓋９には反射膜が形成されるため、蓋９から蛍光が漏れることを防止することができる。同様に、導波路１１の外周面に反射膜を設けることで導波路１１から光が漏れることを防止することができる。

また、ウェル７に対して導波路１１を押し付けるため、境界部において励起光や蛍光が反射や拡散して漏れることを抑制することができる。また、ウェル７の蓋９を上方から押圧したり、下方から導波路１１を押圧することで、ウェル７の密閉性をより高めることができる。さらに、蓋９の上方からウェル７を加熱することで、ウェル７の温度を均一に保つことができ、ウェル７内の反応を安定させることができる。

次に、他の実施の形態について説明する。図５は、第２の実施の形態にかかる蛍光測定装置１ａを示す概略図である。なお、以下の説明において、蛍光測定装置１と同様の機能を奏する構成については、図１〜図４等と同様の符号を付し、重複する説明を省略する。

蛍光測定装置１ａは、蛍光測定装置１と略同様の構成であるが、導波路１１がウェル保持部５の孔１３に挿入されていない点で異なる。すなわち、ウェル保持部５の孔１３には、ウェル７のみが挿入される。導波路１１はガイド２９によって支持される。ガイド２９は、例えば断熱性を有し、内面で光を反射する部材であることが望ましい。

このように、導波路１１をガイド２９によって支持しても、前述した蛍光測定装置１と同様の効果を得ることができる。

以上、添付図を参照しながら、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の技術的範囲は、前述した実施の形態に左右されない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。

例えば、前述の例では、ヘアピンプライマーＰＣＲ法への適用について説明したが、本発明はこれに限られない。他のＰＣＲ法に対しても適用が可能である。また、導波路１１は、全長にわたって略一定の径で構成したが、下方に行くにつれて徐々に縮径するテーパ形状としてもよい。このようにすることで、ウェル７の容積を大きくし、測定部を小さくすることができる。また、導波路の下端部をレンズ加工することでも同様の効果が得られる。

１、１ａ………蛍光測定装置
３………温調器
５………ウェル保持部
７………ウェル
９………蓋
１１………導波路
１３………孔
１５………フランジ
１７………弾性部材
１９………凸部
２１………凹部
２３………蛍光測定器
２５………光源
２７………フィルター
２９………ガイド
１０３………ヘアピンプライマー
１０５………蛍光色素
１０７………ポリメラーゼ
１０９………ウェル
１１１………照射・受光部
１１３………反応溶液
１１５………ペルチェ加熱器
１１７………冷却部
１１９………ウェル保持部

Claims (13)

1. 蛍光測定装置であって、
   反応溶液を保持する複数のウェルと、
   前記ウェルの上部に設けられる蓋と、
   前記ウェルとは別体で設けられ、前記ウェルを並列させて保持する受熱ブロックとしての保持部と、
   前記ウェルの下方にそれぞれの前記ウェルに直接接続される複数の導波路と
   前記保持部と接触し、反応溶液の温度調整が可能な温調器と、
   前記導波路を介して前記ウェル内の反応溶液に励起光を照射する光源と、
   前記ウェル内で発生する蛍光を測定する蛍光測定器と、を具備し、
   前記保持部には、前記ウェルの底面を露出させて保持するように貫通孔を設け、
   前記導波路の下方から前記光源により励起光を前記導波路に入射させ、
   前記導波路を介して前記ウェルの底面から前記ウェル内の反応溶液に励起光を照射し、
   前記ウェル内で発生する蛍光を、前記ウェルの底面から前記励起光を入射させた導波路と同一の前記導波路に入射させ、
   前記導波路を介して、前記蛍光を、前記導波路の下方の前記蛍光測定器により測定可能な構造を有することを特徴とする蛍光測定装置。
2. 前記保持部は、前記保持部に設けた貫通孔に前記導波路の端部を挿入して、前記ウェルおよび前記導波路の両者を前記保持部内に並列させて保持することを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
3. 前記温調器は、ペルチェ素子とファンにより構成され、前記保持部の側部に接触して設けられることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光測定装置。
4. 前記導波路の上部の直径は、前記ウェルの底面と略同一であり、前記導波路を、前記ウェルの底面に押し付けて密着させることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の蛍光測定装置。
5. 前記導波路は、上下に略同一径であるかあるいは下方が縮径するようにテーパ形状を有するか、あるいは前記ウェルと接続される端面と反対側の端面にレンズ加工されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛍光測定装置。
6. 前記導波路の外周面または前記蓋の少なくともいずれかには反射膜が形成されることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の蛍光測定装置。
7. 前記蓋の内側にゴム製の台座が設けられ、前記台座を前記ウェルに押圧することで、前記蓋を前記ウェルに密着させ、反応溶液の漏れを防止することを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の蛍光測定装置。
8. 前記光源および前記蛍光測定器は、前記ウェルおよび前記導波路の配置に対応して移動可能であることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれかに記載の蛍光測定装置。
9. 前記蛍光測定装置が前記温調器の温度調節機能を利用してＰＣＲ用の蛍光測定に用いられることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれかに記載の蛍光測定装置。
10. 請求項１または請求項２に記載の蛍光測定装置を用い、前記ウェルに反応溶液を注入し、前記ウェルの上部を前記蓋で密封した状態で、前記導波路を、前記ウェルの底面に対して押し付けて密着させることで、前記ウェルの底面に前記導波路を直接接続して、前記ウェル内で発生する蛍光を測定することを特徴とする蛍光測定方法。
11. 前記光源および前記蛍光測定器は、前記ウェルおよび前記導波路の配置に対応して移動させて測定することを特徴とする請求項１０に記載の蛍光測定方法。
12. 前記ウェル内で発生した蛍光を、前記蛍光測定器によって測定した後、前記ウェルのみを交換することで、新たな測定を繰り返すことを特徴とする請求項１１記載の蛍光測定方法。
13. 前記温調器によって前記反応溶液の温度を調整することで、反応溶液中でＤＮＡの熱変性による分離、一本鎖ＤＮＡへのプライマーの結合よびＤＮＡの合成による増幅を行い、
    上記工程を複数回繰り返した後、前記光源と前記蛍光測定器を前記導波路の下部で相対移動させながら、前記ウェル内で発生した蛍光を、前記蛍光測定器によって測定することを特徴とする請求項１０に記載の蛍光測定方法。
    

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