JP6034261B2 - 生体分子検出用チップの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体分子を検出するための生体分子検出用チップの製造方法に関する。

極微量の試料から同時に複数の化学成分を検出し、また、類似の化学反応を精度よく比較する測定を行う技術として、分子認識機能を有する核酸分子（アプタマー）や抗体や酵素といったタンパク質などの生体分子検出用分子を微小領域に配置したアレイチップを用いた分析方法が注目されている。

このようなアレイチップを用いる分析方法では、どの微小領域にどの生体分子検出用分子が配置されているかという情報に基づいて分析を行う。このため、位置制御性よく、かつ微細なパタンで生体分子検出用分子を固定する技術が必要となる。加えて、分析を行う際にも、精確な位置情報の取得が必要となる。このように、位置制御性よく、かつ微細な領域に生体分子検出用分子を固定するためには、大掛かりで複雑な装置を必要とし、熟練したオペレーションが必要という問題がある。

このような煩雑な工程を必要とせずに、極微量の試料から同時に複数の化学成分を検出し、また類似の化学反応を精度よく比較測定を行うオンチップ分析手法として、異なる色で発光する色素を独立にプローブとして用いる光検出法が考えられる。

１つの例は、測定対象である標的物質をラベル化する方法である。標的物質の種類ごとに異なる色素分子でラベル化すれば、選択性のよい高感度な検出が可能である。しかしながら、標的物質のラベル化は煩雑な前処理工程を必要とするという問題がある。

別の方法は、より好ましいラベルフリーな検出である。これは、分子認識機能を有する核酸分子や抗体や酵素といったタンパク質などの生体分子検出用分子を、予め異なる色で発光する色素で種類ごとに標識しておき、色別の検出を行うものである。色別検出により、基板表面の異なる所望の箇所に生体分子検出用分子のパタンを固定することなく、複数の化学成分を同時に検出することが可能である。

「ＯＰＴＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＦＥＲＥＮＣＥ ＦＩＬＴＥＲ」、OMEGA OPTICAL社 日本語カタログ 第１４版、２６−２７頁。 E. Treossi et al. ,"High-Contrast Visualization of Graphene Oxide on Dye-Sensitized Glass, Quartz, and Silicon by Fluorescence Quenching",J. AM. CHEM. SOC. , vol.131, pp.15576-15577, 2009. J. Kim et al. ,"Visualizing Graphene Based Sheets by Fluorescence Quenching Microscopy",J. AM. CHEM. SOC. , vol.132, pp.260-267, 2010. S. Husale et al. ,"ssDNA Binding Reveals the Atomic Structure of Graphene", Langmuir, vol.26, no.23, pp.18078-18082, 2010. D. Li et al. ,"Processable aqueous dispersions of graphene nanosheets", Nature nanotechnology, vol.3, pp.101-105, 2008.

ここで、異なる色で発光する色素で標識した生体分子検出用分子は、標的物質が存在しない場合には発光が観測されない、すなわち消光している状態であることが必要であり、消光特性を示す分子や材料と組み合わせて用いる必要がある。従来の消光特性を示す多くの分子および材料においては、特定の色素に対してのみ良好な消光特性を示すものが多い。このため、標識に用いる色素と組になる消光材料が色素の種類ごとに必要となり、同一のプラットホームにおいて多色化することが困難であるという問題がある（非特許文献１）。

また、消光特性を示す分子および材料自身も発光を示すものが多いため、多色化の際に妨害となるという問題がある。更に、消光特性を良好に示すためには、色素で標識した生体分子検出用分子の近傍に、消光特性を示す分子を設置する必要があるため、分子間距離の制御など、作製上の制約が大きいという問題がある。以上に説明したように、１つのチップで、異なる複数の生体分子検出用分子を用いて異なる複数の検出対象を分析することが用意ではないという問題があった。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、１つのチップで、異なる複数の生体分子検出用分子を用いた異なる複数の検出対象の分析が容易に実施できるようにすることを目的とする。

生体分子検出用チップは、検出対象となる各々異なる複数の生体分子の各々と特異的に結合する複数の生体分子検出用分子と、複数の生体分子検出用分子の各々の一端に結合した各々異なる色の複数の色素と、基板の上に形成されて酸化グラフェン還元体から構成され、複数の生体分子検出用分子の他端が固定される固定層とを備える。

上記生体分子検出用チップにおいて、生体分子検出用分子の他端に結合して生体分子検出用分子の他端と固定層とを接着する接着分子を備えるようにしてもよい。なお、基板は透明であるとよい。

本発明に係る生体分子検出用チップの製造方法は、基板の上に酸化グラフェン還元体から構成された固定層を形成する固定層形成工程と、検出対象となる各々異なる複数の生体分子の各々と特異的に結合する複数の生体分子検出用分子の各々の一端に各々異なる色の色素を結合させる色素結合生体分子検出用分子形成工程と、各々異なる色の色素が結合された生体分子検出用分子を含む複数の水溶液を混合した混合溶液を固定層に接触させることにより、各々異なる色の色素が結合された複数の生体分子検出用分子の他端を固定層に固定する色素形成生体分子検出用分子固定工程とを備える。

上記生体分子検出用チップの製造方法において、複数の生体分子検出用分子の他端に固定層に接着する接着分子を結合させる接着分子結合工程を備え、色素形成生体分子検出用分子固定工程では、生体分子検出用分子の他端に結合した接着分子により生体分子検出用分子の他端と固定層とを接着させて固定するようにしてもよい。なお、基板は透明であるとよい。

以上説明したことにより、本発明によれば、１つのチップで、異なる複数の生体分子検出用分子を用いた異なる複数の検出対象の分析が容易に実施できるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出用チップの一部構成を示す構成図である。 図２は、本発明の実施の形態における生体分子検出用チップの一部構成を示す構成図である。 図３は、本発明の実施の形態における生体分子検出用チップの製造方法について説明するフローチャートである。 図４は、マイクロ流路の構成を示す構成図である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出用チップの一部構成を示す構成図である。この生体分子検出用チップは、複数の生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂと、複数の色素１０２ａ，１０２ｂと、基板１０３の上に形成されて生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂが固定される固定層１０４とを備える。生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂの一端に、色素１０２ａ，１０２ｂが結合している。また、生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂの他端が、固定層１０４に固定されている。なお、色素１０２ａは色素１０２ｂとは異なり、また、これらは、既知のものである。

生体分子検出用分子１０１ａ，生体分子検出用分子１０１ｂは、検出対象となる各々異なる複数の生体分子の各々と特異的に結合する。例えば、図２に示すように、生体分子検出用分子１０１ａは、検出対象の生体分子２０１ａと複合体を形成するアプタマーであり、生体分子検出用分子１０１ｂは、生体分子２０１ａとは異なる生体分子２０１ｂと複合体を形成するアプタマーである。また、色素１０２ａ，色素１０２ｂは、各々異なる波長の蛍光を発光する蛍光色素分子である。

固定層１０４は、酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体から構成されている。グラフェンは、炭素ｓｐ²結合で構成された炭素原子が２次元に結合した構造であり、層状物質グラファイトを構成する原子層を１層から数層取り出したものと言える。このようなグラフェンが酸化した物質が酸化グラフェンである。また、酸化グラフェンをある程度還元した状態の物質が酸化グラフェン還元体である。酸化グラフェン還元体は、完全なグラフェンの状態にはなっていない。

酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体は、幅広い波長帯の発光色素に対して極めて効率のよい消光特性を示す消光材料である（非特許文献２，非特許文献３参照）。このため、上述した構成の固定層１０４を用いた実施の形態における生体分子検出用チップによれば、色素の種類に関係なく、多色化検出が可能となる。特に、酸化グラフェン還元体は、無発光体であるため、自身の発光による検出の妨害が発生しないという利点がある。

一方、酸化グラフェンは赤色領域で微弱な発光を示すが、酸化グラフェン自身の発光と比較して非常に強い発光強度を有する色素を選択すれば、検出の妨害はほぼ無視できる。赤色以外の色素については酸化グラフェン自身による検出の妨害を全く起こさない。なお、酸化グラフェン自身の微弱な赤色発光は、標的物質の濃度が薄い場合など、微弱な検出信号を観測する場合に妨害を起こすおそれがある。このような場合は、無発光体である酸化グラフェン還元体を用いることが好ましい。

また、酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体は、生体分子検出用分子の中でも、特にアプタマーに対して強い親和性を有するため、標的物質が存在しない場合には、アプタマーは自発的にこれらの表面に近接して吸着する（非特許文献４）。これにより、定常状態では、図１に示すように、標識に用いる色素分子である色素１０２ａ，１０２ｂと酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体からなる固定層１０４表面の距離が近接し、酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体は、消光特性を十分発揮する。

一方、アプタマーに対する標的物質が存在する場合は、アプタマーと標的物質が複合体を形成し、酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体表面において立体構造を形成する。図２に示すように、生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂが、生体分子２０１ａ，２０１ｂとの複合体を形成すると、他端が固定層１０４に固定されている生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂは、固定層１０４より脱離することはない。しかし、生体分子２０１ａ，２０１ｂとの複合体を形成することにより、生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂの一端は、ここに固定されている色素１０２ａ，１０２ｂとともに、固定層１０４より離間していく。

酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体の消光効率は、色素と酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体表面との距離に大きく依存する。このため、距離が遠くなるのに従って著しく消光効率が低下し、色素１０２ａ，色素１０２ｂの発光が観測されるようになる。種々の標的物質に対するアプタマーを異なる色で発光する色素で標識し、予め混合して酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体表面に固定しておけば、ある標的物質の存在下においては、特定の色の発光が観測される。このような色別の検出を行うことにより、微小領域へのパターニングを必要としない状態で、複数の分子の検出が可能となる。

なお、生体分子検出用分子１０１ａ，生体分子検出用分子１０１ｂの固定層１０４への固定は、接着分子（リンカー分子）を介して実施してもよい。接着分子は、例えば、ピレンブタジエン酸などのピレンが骨格に含まれている分子を用いればよい。生体分子検出用分子１０１ａ，生体分子検出用分子１０１ｂの他端（末端）アミノ基などを導入し、ここに接着分子に導入したカルボキシル基もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を反応させて化学結合を形成させればよい。このような、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を有する接着分子を固定層１０４に接着（吸着）させておき、一端に色素１０２ａ，１０２ｂが結合している生体分子検出用分子１０１ａ，１０１ｂの他端を接着分子に結合させればよい。

次に、製造方法について説明する。酸化グラフェンは、グラフェン状の炭素原子１層のシートの状態で水に分散する分散溶液が形成可能である。このため、酸化グラフェン（この小片）が分散した水溶液を用いて、スピンコート法などにより固体基板に塗布することによって、単層〜５層以下程度の酸化グラフェンの小片からなる層を、基板上に均一形成することができる。

酸化グラフェン還元体は、酸化グラフェンを化学的に還元することにより得ることができる。なお、酸化グラフェン分散溶液の状態で還元反応を行うと、酸化グラフェン還元体は凝集し、炭素原子１層のシートの状態を保持することが困難となる。このため、酸化グラフェン還元体から固定層を形成する場合、酸化グラフェンの状態で層を形成してから還元するとよい。還元方法としては、還元性の蒸気（ヒドラジンなど）に暴露すればよい。また、水素，窒素，アルゴンなどのガス雰囲気化で高熱処理する、真空加熱するなどの還元方法を用いてもよい。

上述した還元方法によれば、酸化グラフェンとして基板表面に固定された形状を保持したまま、剥がれ落ちたりすることなく酸化グラフェン還元体を得ることができる。この結果、単層〜５層以下程度の酸化グラフェン還元体の複数の小片からなる層を基板上に均一形成することが可能となる。このような形成方法によって酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体を固定して固定層とした基板を用いれば、消光特性を示す分子を基板の所定に位置に固定するよりもはるかに簡便に、色素標識した生体分子検出用分子の近傍に昇降手段を設置することが可能である。

ところで、各々異なる色で発光する色素で標識した種々のアプタマー（生体分子検出用分子）を混合して固定する領域には、特に制約はない。酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体からなる固定層には、従来の代表的な手法を用いて微小領域へのアプタマーのパターニングを行うことが可能であるため、複数のアプタマーによる配列を作製してもよく、また、予め、酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体を膜状に形成し、これをパターニングして形成した固定層を用いるようにしてもよい。

以下、より詳細に説明する。はじめに、生体分子検出用チップの製造方法について、図３のフローチャートを用いて説明する。まず、ステップＳ３０１で、基板の上に固定層を形成する。基板は、シリコンやガラスから構成すればよいが、特に材料の制約はない。固定層は、まず、酸化グラフェンが分散した水溶液を、スピンコート法などにより基板に塗布することにで得ることができる。酸化グラフェン分散溶液は、既報の合成法により作製することができる（非特許文献５参照）。この酸化グラフェン分散溶液の塗布により、単層〜５層程度の酸化グラフェンの小片からなる固定層が、基板の上に均一に形成できる。

次に、固定層を酸化グラフェン還元体から構成する場合、上述したように作製した酸化グラフェンからなる固定層を、還元雰囲気に晒せばよい（ステップＳ３０２）。例えば、上記基板を、ヒドラジンを５％程度含む水溶液を少量封入した密閉容器に入れ、６０〜９５℃で３０〜６０分処理を行う。基板表面に形成されている固定層を構成する酸化グラフェンは、ヒドラジン蒸気に暴露することにより還元反応が起こり、酸化グラフェン還元体に変化する。このようにして生成する酸化グラフェン還元体は、酸化グラフェンとして基板表面に固定された形状を保持するため、溶液中の還元反応でみられるような凝集を起こさない。このように固定層を形成してから還元することで、単層〜５層程度の酸化グラフェン還元体の小片からなる固定層が均一に形成できる。

一方で、色素を結合した生体分子検出用分子を作製する（ステップＳ３０３）。生体分子検出用分子としては、標的物質に特異的に結合する核酸（アプタマー）や、標的物質に特異的に結合する抗体または標的物質と特異的な化学反応を行う酵素を用いることができる。この生体分子検出用分子は、種類ごとに異なる色素で標識されていてもよく、種類が異なっていても同じ種類の色素で標識されていてもよい。なお、色素を結合した生体分子検出用分子は、予め作製しておいてもよい。

また、上述したような色素結合生体分子検出用分子の予め設計した部位に、固定層によく吸着する性質を有するリンカー分子を結合してもよい。リンカー分子を用いる場合は、例えば、ピレン酪酸などを用いることができる。この場合は、ステップＳ３０４で、ピレン酪酸スクシンイミドエステルを含む溶液を固定層表面に浸し、この溶液と固定層表面が接している状態を保ち、例えば、室温ないし３７℃の恒温状態で、所定の時間（通常は３０分〜６０分）静置する。この後、固定されなかった余剰のリンカー分子を基板表面から洗浄により除去する。

次に、ステップＳ３０５で、所定の部位にアミノ基を導入した色素結合生体分子検出用分子を含む（混合）溶液を、固定層に接触させる。例えば、固定層の上に上述した色素結合生体分子検出用分子を含む混合溶液を滴下すればよい。この状態を、例えば、室温ないし３７℃の恒温状態で、所定の時間（通常は３０分〜６０分）静置する。また、これらの処理においては、上記溶液が乾燥しないように、飽和蒸気圧下で静置するとよい。このようにすることで、ピレン酪酸（リンカー分子）と色素結合生体分子検出用分子を共有結合させることができる。次いで、色素結合生体分子検出用分子を含む(混合)溶液を取り除き、固定されなかった余剰の生体分子検出用分子を基板表面から洗浄により除去する。なお、生体分子検出用分子自体が固定層に吸着するなどの機能を備えている場合、リンカー分子を用いる必要はない。

上述した色素結合生体分子検出用分子を固定する工程を繰り返すことにより、生体分子検出用分子の固定を数回に分けて実施してもよい。繰り返しの際に、生体分子検出用分子を含む（混合）溶液の種類を変えてもよい。これにより、固定層の表面に、種類の異なる複数の生体分子検出用分子が固定されている基板が得られる。この後、ステップＳ３０６で、得られた基板の固定層の形成箇所に、試料溶液を導入するための測定用マイクロ流路を搭載してもよい。マイクロ流路を用いることにより、極微量の試料についての応答が観測可能となる。また複数の流路を具備することにより、異なる溶液についての応答を同時に比較することが可能となる。以上の工程により、本発明の実施の形態における生体分子検出用チップが完成する。

［実施例１］
以下、実施例を用いて説明する。はじめに、実施例１について説明する。まず、基板として、カバーガラスを用意した。次に、酸化グラフェンが分散した水溶液を、スピンコート法を用いて基板に塗布し、塗布層を形成する。酸化グラフェン分散溶液は、既報の合成法により作製することができる（非特許文献５参照）。なお、分散溶液を超音波処理することにより、酸化グラフェンの大きさは、数１００ｎｍ程度の小片に調整可能である。この塗布により、単層〜５層程度の酸化グラフェンの小片からなる塗布層が、基板の表面に均一に形成できる。また、分散溶液における酸化グラフェンの濃度は、０．０１〜１ｗｔ％程度とすればよい。

次に、上述したようにして塗布層を形成した基板を、３５％ヒドラジン水溶液および２８％アンモニア水溶液が体積比１：７で混合された溶液とともに密閉容器に封入する。これにより、塗布層を構成している酸化グラフェンがヒドラジン／アンモニア蒸気にさらされる状態となる。この状態を９５℃で１時間静置することで、酸化グラフェンを還元し、酸化グラフェン還元体からなる固定層を形成することができる。このとき生成する酸化グラフェン還元体は、酸化グラフェンとして基板表面に固定された形状を保持するため、溶液中の還元反応でみられるような凝集を起こさない。以上により、単層〜５層程度の酸化グラフェン還元体の小片が均一に分散した固定層が形成できる。

次に、ピレン酪酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレン酪酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を、基板の上の固定層に滴下し、室温（２５℃程度）で１時間静置し、固定層表面に吸着させる。これをジメチルホルムアミドで洗浄し、風乾する。ピレンは、酸化グラフェン還元体と、後の工程で用いる生体分子検出用分子であるアプタマーを強固に固定するためのリンカー分子として機能する。

次に、色素が結合した生体分子検出用分子を用意する。生体分子検出用分子としては、アプタマー構造を有する分子を用いた。アプタマー部分のＤＮＡ配列としては、まず、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に特異的に結合するものとして５’−ＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣ−３’を用意した。また、トロンビンに特異的に結合するものとして５’−ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ−３’を用意した。なお、「Ａ」は、アデニン（adenine）であり、「Ｇ」は、グアニン（guanine）であり、「Ｃ」は、シトシン（cytosine）であり、「Ｔ」は、チミン（thymine）である。

また、ＰＳＡに特異的に結合するアプタマーには、検出可能な信号変化を引き起こす色素として、３末端に緑色蛍光分子（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＦＡＭ）を結合させ、色素が結合した生体分子検出用分子とする。また、トロンビンに特異的に結合するアプタマーには、検出可能な信号変化を引き起こすシグナル材料として、３末端に赤色蛍光分子（ＴＡＭＲＡ）を結合させ、色素が結合した生体分子検出用分子とする。なお、アプタマー配列と色素分子との間に、特異的結合機能を持たないスペーサの配列として、チミン１０個程度を結合してもよい。

また、上述した２つのアプタマーの各々の５末端には、結合部位としてアミノ基を導入しておく。５末端のアミノ基は、ピレン酪酸のＣＯＯＨ基と反応してペプチド結合を形成し、これを介してアプタマー構造を含む分子を固定層表面に固定することができる。

上述した２種類の色素結合生体分子検出用分子の水溶液を混合し、各々の濃度が５０μＭとなるように調整した後、混合溶液を固定層表面に接触させる。この接触状態を、混合溶液が乾燥しないように、飽和蒸気雰囲気に配置し、室温で６０分維持する。これにより、ガラスからなる基板に形成した固定層表面に、５末端のアミノ基とリンカー分子であるピレンの結合により、２種類の色素結合生体分子検出用分子が、各々固定される。次いで、超純水を用いて基板を数回洗浄し、固定されなかった余剰の色素結合生体分子検出用分子を基板表面より除去する。

以上の工程によって作製した実施例１の生体分子検出用チップに、流路が並列している検出用のマイクロ流路を搭載する。マイクロ流路は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）など、透明で基板と密着性の良い高分子材料から構成すればよい。このマイクロ流路について、図４を用いて説明する。図４において、（ａ）は、平面図であり、（ｂ）は断面図である。

このマイクロ流路は、支持基板４０１と、流路基板４０３とから構成されている。支持基板４０１の表面に、図示しない固定層が形成されている。流路基板４０３には、３つの流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６が形成されている。流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６は、互いに並列に配列された測定領域を備える。流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６は、例えば、幅５０μｍに形成し、深さ１００μｍに形成する。また、測定領域を通る並列な箇所の長さは、５ｍｍとし、測定領域における各溝の間隔は、１００μｍとした。

また、流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６は、一端に流路基板４０３を貫通する孔部からなる導入口４０４ａ，４０５ａ，４０６ａが形成され、他端に流路基板４０３を貫通する孔部からなる排出口４０４ｂ，４０５ｂ，４０６ｂが形成されている。導入口４０４ａ，４０５ａ，４０６ａおよび排出口４０４ｂ，４０５ｂ，４０６ｂは、各々流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６に連続して形成されている。

また、流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６による検出部形成用流路において毛管現象を利用した送液がしやすいように、ＰＤＭＳに界面活性剤を導入して流路基板４０３を成型し、流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６における表面の親水性を向上させている。

上述したように構成した、流路基板４０３の流路形成用溝４０４，流路形成用溝４０５，流路形成用溝４０６を形成した面に、支持基板４０１の主表面を当接させて密着させることで、各溝による流路１，流路２，流路３を備える状態とする。前述したように、支持基板４０１の表面には固定層が形成されており、各流路の支持基板４０１側の面は、固定層で構成されていることになる。例えば、各々の表面をエタノールで洗浄したのちに酸素プラズマ処理をして密着させ、３０分室温で静置して、化学結合による貼り合わせを行えばよい。

上述した実施例１の生体分子検出用チップを、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察する。まず、流路１に、１００μｇ／ｍｌのＰＳＡ水溶液、１μＬ導入する。また、流路２に、１００μｇ／ｍｌのトロンビンを１μＬ導入する。また、流路３に、超純水を１μＬ導入する。

この３本の流路の直線部分が、共焦点レーザー蛍光顕微鏡の同一視野内に観測される位置において、固定層表面の蛍光像を測定する。流路１の内部では緑色蛍光が観測され、流路２の内部では赤色蛍光が観測される。これらの結果は、次に示すことによる。まず、ＰＳＡおよびトロンビンが、各々に特異的に結合するアプタマーと選択的に結合したことにより、各アプタマーの立体構造が変化する。この構造変化により、アプタマーに修飾されているＦＡＭおよびＴＡＭＲＡが、固定層へのエネルギー移動を起こさない程度に、固定層より離間する。この結果、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡが発光する。

一方、超純水を導入した流路３の内部では、蛍光はほとんど観測されない。これは、各アプタマーに結合する生体分子がなく、各アプタマーの構造変化が起きないため、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡと固定層との距離が近いためである。これら色素分子の蛍光が固定層の近くに配置されている状態では、固定層を構成する酸化グラフェン還元体によって消光される。また、アプタマーを固定している酸化グラフェン還元体自身が無発光であることを示している。なお、上述したような光学的な観察は、例えば、支持基板４０１および流路基板４０３が透明であれば、容易に行える。

以上に示したように、実施例１によれば、生体分子検出用分子であるアプタマーをパターニングすることなく、１つのチップで、ＰＳＡおよびトロンビンが同時に検出可能となった。実施例１によれば、色別の光検出法に基づいた微小領域へのパターニングを必要とせずに、極微量の試料から同時に複数の化学成分を検出可能な方法が提供可能なことが示される。

［実施例２］
次に、実施例２について説明する。実施例２では、酸化グラフェンを還元することなく固定層とする。基板に関する他の条件は、実施例１と同様である。

また、生体分子検出用分子として、まず、インフルエンザウイルス抗原性糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）に特異的に結合するＲＮＡ配列を備える５’−ＧＵＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＵＡ−３’を用いる。なお、「Ｕ」は、ウラシル（uracil）である。また、トロンビンに特異的に結合するＤＮＡ配列として、５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’を用いる。

また、ＨＡに結合するアプタマーには、色素として、３末端に緑色蛍光分子（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＦＡＭ）を結合させ、色素が結合した生体分子検出用分子とする。一方、トロンビンにするアプタマーには、色素として、３末端に赤色蛍光分子（ＴＡＭＲＡ）を結合させ、色素が結合した生体分子検出用分子とする。上述した２種類の色素結合生体分子検出用分子を用い、前述した実施例１と同様にして、マイクロ流路を備える生体分子検出用チップを作製した。

上述した実施例２の生体分子検出用チップを、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察する。まず、流路１に、１００μｇ／ｍｌのＨＡ水溶液、１μＬ導入する。また、流路２に、１００μｇ／ｍｌのトロンビンを１μＬ導入する。また、流路３に、超純水を１μＬ導入する。

これらの３本の流路の直線部分が、共焦点レーザー蛍光顕微鏡の同一視野内に観測される位置において、固定層表面の蛍光像を測定する。流路１の内部では緑色蛍光が観測され、流路２の内部では赤色蛍光が観測される。これらの結果は、次に示すことによる。まず、ＨＡおよびトロンビンが、各々に特異的に結合するアプタマーと選択的に結合したことにより、各アプタマーの立体構造が変化する。この構造変化により、アプタマーに修飾されているＦＡＭおよびＴＡＭＲＡが、固定層へのエネルギー移動を起こさない程度に、固定層より離間する。この結果、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡが発光する。

一方、超純水を導入した流路３の内部では、まず、緑色蛍光は観測されない。ただし、酸化グラフェンによる極微弱な赤色蛍光が観測される。なお、上述した流路２における赤色蛍光とは明確な強度差により区別可能であった。これは、各アプタマーに結合する生体分子がなく、各アプタマーの構造変化が起きないため、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡと固定層との距離が近いためである。これら色素分子の蛍光が固定層の近くに配置されている状態では、固定層を構成する酸化グラフェンによって消光される。

以上の結果より、まず、緑色蛍光色素については酸化グラフェン自身による検出の妨害を全く起こないことが示された。一方、酸化グラフェンは赤色領域で微弱な発光を示すが、色素の発光強度は酸化グラフェン自身の発光と比較して非常に強いため、検出の妨害はほぼ無視できることが示された。以上の欠課から、生体分子検出用分子であるアプタマーをパターニングすることなく、１つのチップで、ＨＡおよびトロンビンを同時に検出可能な分析法が示された。酸化グラフェンによる固定層を用いた実施例２においても、色別の光検出法に基づいた微小領域へのパターニングを必要とせずに、極微量の試料から同時に複数の化学成分を検出可能な方法が提供可能なことが示される。

以上に説明したように、本発明によれば、各々異なる色素が結合した複数の生体分子検出用分子を、酸化グラフェンまたは酸化グラフェン還元体から構成された固定層に固定するようにしたので、異なる複数の生体分子検出用分子を用いた異なる複数の検出対象の分析が容易に実施できるようになる。本発明によれば、標識に用いる色素と組になる消光材料を色素の種類ごとに必要とせず、緑色や赤色蛍光などを用いた多色化が可能になる。また、酸化グラフェン還元体を用いた場合、自身の無発光特性により、多色化を妨害しないことが示される。

また一般的に、蛍光強度の絶対値は、色素分子の劣化や経時変化の影響が含まれるため、定量的比較が困難であるが、マイクロ流路を搭載したチップにおいては、これらの影響をキャンセルし、同じアプタマーに対する応答信号（流路１，２）と参照信号（流路３）の差を精度よく比較することが可能となる。従って、マイクロ流路を用いることで、１μＬ程度の極微量の試料から、異なる化学反応を、色素分子の劣化や経時変化の影響をキャンセルし、賞味の応答の差を精度よく同時に比較測定することが可能となるという効果が得られる。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、上述では、主に、２種類の生体分子検出用分子を固定層に固定する場合を例に説明したが、これに限るものではなく、検出対象となる各々異なる複数の生体分子の各々と特異的に結合する３つ（３種類）以上の生体分子検出用分子を用いるようにしてもよいことは、言うまでもない。

また、アプタマーは、核酸から構成したものに限らず、ペプチドから構成されたものであってもよい。また、シグナル分子や接着分子が結合しているアプタマーの端部に、更に、核酸やペプチドが配列した分子が結合していてもよい。

また、接着分子は、ピレンブタジエン酸などピレンが骨格に含まれているものに限らず、例えば、ベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）などであってもよい。また、接着分子をアプタマーと結合させる官能基（分子）は、ブタジエン酸に限るものではなく、「−ＣＯＯＨ」および「−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ」であってもよい。なお、ｎは、好ましくは２〜１０の範囲がよい。

１０１ａ…生体分子検出用分子、１０１ｂ…生体分子検出用分子、１０２ａ…色素、１０２ｂ…色素、１０３…基板、１０４…固定層。

Claims (3)

1. 基板の上に酸化グラフェン還元体から構成された固定層を形成する固定層形成工程と、
   検出対象となる各々異なる複数の生体分子の各々と特異的に結合する複数の生体分子検出用分子の各々の一端に各々異なる色の色素を結合させる色素結合生体分子検出用分子形成工程と、
   各々異なる色の色素が結合された前記生体分子検出用分子を含む複数の水溶液を混合した混合溶液を前記固定層に接触させることにより、各々異なる色の色素が結合された複数の前記生体分子検出用分子の他端を前記固定層に固定する色素形成生体分子検出用分子固定工程と
   を備えることを特徴とする生体分子検出用チップの製造方法。
2. 請求項１記載の生体分子検出用チップの製造方法において、
   複数の前記生体分子検出用分子の他端に前記固定層に接着する接着分子を結合させる接着分子結合工程を備え、
   前記色素形成生体分子検出用分子固定工程では、前記生体分子検出用分子の他端に結合した前記接着分子により前記生体分子検出用分子の他端と前記固定層とを接着させて固定する
   ことを特徴とする生体分子検出用チップの製造方法。
3. 請求項１または２記載の生体分子検出用チップの製造方法において、
   前記基板は透明であることを特徴とする生体分子検出用チップの製造方法。

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