JP6033798B2 - 蛍光顕微鏡検査法における照明位相制御のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Description

本出願は、２０１１年３月１日出願の仮特許出願第６１／４４７，７０７号に基づき優先権を主張する。

本開示は、蛍光顕微鏡検査法に関し、具体的には、試料を照明するために使用される励起光の位相を制御するためのシステムに関する。

顕微鏡器具中の光源の正確な位相制御は、別々のビームの干渉、さらにまた偏光光学系に関与する様々な光学的な技法のために重要である。たとえば、位相制御は、位相差顕微鏡検査法（phase contrast microscopy）、微分干渉顕微鏡検査法（differential interference microscopy）および偏光顕微鏡検査法（polarized light microscopy）において使用される。具体的には、正確で迅速な位相制御が、構造化照明顕微鏡検査法（structured illumination microscopy）において使用され、そこでは、干渉ビームの位相制御が、波長の分数のオーダで別々のビーム経路の経路長を正確に変化させることによって成し遂げられ、それは、可視光線については、１０ナノメートル以下の経路長の変化に対応する。通常、正確な位相制御をもたらすために、ミラーが取り付けられた圧電並進装置を使用することができる。ミラーをビーム経路に対して平行に並進させるので、ビーム経路が、ミラーの移動距離のほぼ２倍、延ばされる、または縮められる。ミラーの位置を１〜２ミリ秒のオーダで変化させることができるが、装置は、高価であり、入射角が０°の場合を除けば、検出可能であるビームの並進量が生成される。代替えのアプローチは、電子的に変形可能なウインドウを使用して位相を変調することである。ウインドウに印加される電圧によって、波長の分数でウインドウの厚さが変化し、その結果、ウインドウを透過する光の有効経路長が変化することになる。圧電装置と違って、変形可能なウインドウは、ビームの転換なしにビームを透過させる。しかし、変形可能なウインドウは、かなりより緩慢であって、切り替え時間が数十から数百ミリ秒のオーダであり、極端に低い光学的な歪を実現することは困難である、というのは、ウインドウが、物理的な変形を被るからである。

上記に述べた理由のために、エンジニア、科学者および顕微鏡製造業者は、試料を照明するために使用される光の位相を変化させるための、より迅速なシステムおよび方法を求め続けている。

構造化照明顕微鏡検査法で使用される構造化照明のパターンの正確で迅速な位相制御をもたらす照明位相制御部を述べる。コヒーレント光源を使用して、コヒーレント光のビームを発生し、それを、少なくとも３つのコヒーレント光のビームに分岐させる。一態様では、照明位相制御部は、ビームの少なくとも１つに少なくとも１つの位相シフトを加えるための、少なくとも１つのペアの回転可能なウインドウからなる。対物レンズが、ビームを受光して、干渉縞を形成するように、少なくとも３つのビームを合焦することになる。位相制御部は、少なくとも１つのビームに加えられる少なくとも１つの位相シフトを変化させることによって、干渉縞の位置を変更させるために使用することができる。

例示の３次元構造化照明の顕微鏡検査法器具の概略図である。 図２Ａは３つのコヒーレントビームを使用する３次元構造化照明のパターンを示す図である。図２Ｂは３つのコヒーレントビームを使用する３次元構造化照明のパターンを示す図である。図２Ｃは３つのコヒーレントビームを使用する３次元構造化照明のパターンを示す図である。 図３Ａは空間間隔の５つの周期を通じて段々と進められる干渉縞の輝線を示す図である。図３Ｂは空間間隔の５つの周期を通じて段々と進められる干渉縞の輝線を示す図である。図３Ｃは空間間隔の５つの周期を通じて段々と進められる干渉縞の輝線を示す図である。図３Ｄは空間間隔の５つの周期を通じて段々と進められる干渉縞の輝線を示す図である。図３Ｅは空間間隔の５つの周期を通じて段々と進められる干渉縞の輝線を示す図である。 図４Ａは対物レンズおよび干渉縞の角度方向位置の平面図である。図４Ｂは対物レンズおよび干渉縞の角度方向位置の平面図である。図４Ｃは対物レンズおよび干渉縞の角度方向位置の平面図である。 図５Ａは３つの実質的に平行なビームを回転させるために使用される干渉縞回転子の例示の図である。図５Ｂは３つの実質的に平行なビームを回転させるために使用される干渉縞回転子の例示の図である。図５Ｃは３つの実質的に平行なビームを回転させるために使用される干渉縞回転子の例示の図である。 干渉縞回転子の例示の実施を示す等角図である。 図７Ａは例示の照明位相制御部を示す拡大図である。図７Ｂは例示の回転可能なウインドウの等角図である。 図８Ａは２つの回転可能なウインドウのペアの透明プレートの図である。図８Ｂは２つの回転可能なウインドウのペアの透明プレートの図である。 照明位相制御部を通じて送られる光の２つのビームによって獲得される例示の位相シフトを示すスナップショットである。 図１０Ａは構造照明パターンの位置を変化させるように再構成される照明位相制御部を示す図である。図１０Ｂは構造照明パターンの位置を変化させるように再構成される照明位相制御部を示す図である。図１０Ｃは構造照明パターンの位置を変化させるように再構成される照明位相制御部を示す図である。 単一ペアの回転可能なウインドウを用いて実施される例示の照明位相制御部を示す図である。 ２つの別々の回転可能なウインドウを用いて実施される例示の照明位相制御部を示す図である。

様々な照明位相制御（ＩＰＣ：illumination phase control）を、３次元構造化照明の顕微鏡検査法（３Ｄ−ＳＩＭ：three-dimensional structured illumination microscopy）の一般的な記述とともに述べる。３Ｄ−ＳＩＭは、細胞生物学で使用される従来の広視野蛍光顕微鏡に比べて、横方向および軸方向の分解能において２つの向上の要因を実現する。３Ｄ−ＳＩＭは、いくつかの競合する超分解能技法と違って、特殊化された蛍光性染料またはタンパク質を必要としない。生物学者は、３Ｄ−ＳＩＭを用いて高分解能を実現するが、都合がよく精通した蛍光標識技法を保持している。照明位相制御は、シフトし回転する照明パターンによって、対象物の多数の像を捕らえるようにさせる。通常は回折によって不鮮明になった微細な空間的な細部を復元するために、方程式系を解くことによって、より高い分解能を得ることができる。

図１に、例示の３Ｄ−ＳＩＭ器具１００を概略的に示す。多くの異なるタイプのＳＩＭ器具および対応する光学経路が存在する。器具１００は、ＳＩＭの顕微鏡検査法で使用される器具のすべての異なるよく知られる変形内の光学経路を表す意図はないが、その代わりに、ＩＰＣを含むＳＩＭの一般的な主要点を例示するように意図する。コヒーレント光の高輝度の実質的に単色であるビーム１０２が、レーザなどの光源１０４から出力されて、ビーム１０２を平行に整えるレンズまたは一連のレンズ１０６を透過する。ビーム１０２は、源１０４から特定の偏光によって出力することができる。次いで、ビーム１０２は、スプリッタ１０８を通過し、それは、ビームを３つの別々のコヒーレントビーム１１０〜１１２に分岐させる。たとえば、スプリッタ１０８は、１次元の透過型回折格子とすることができ、それは、光を、３つの発散した同一平面（すなわち、ｘｚ平面）上にあるコヒーレントビーム１１０〜１１２に分岐させ、それらは、それぞれ０次、＋１次および−１次のオーダの回折ビームとして言われる。スプリッタ１０８は、様々な異なるタイプの透過型格子のいずれか１つとすることができる。たとえば、スプリッタ１０８は、ガラスの透明なプレートからなる１次元透過型格子とすることができ、一連の実質的に平行な溝がその格子の一方の表面に形成されている、またはスプリッタ１０８は、一連の実質的に平行な細いスリットを有する、不透明なプレートとすることができる。あるいは、スプリッタ１０８は、レンズ１０６から出力される光のビームを３つ以上の別々のコヒーレントビームに分岐させるように配列される２つ以上のビームスプリッタとすることができる。３つのビーム１１０〜１１２は、レンズまたは一連のレンズ１１４を通過し、それは、ビームが、ｘｚ平面上に配置されて、＋１次および−１次のオーダの回折したビーム１１１および１１２が、０次オーダの回折したビーム１１０に対してほぼ平行になるように、ビーム１１０〜１１２を再び方向付ける。図１の実施例では、ビーム１１１および１１２は、ＩＰＣ１１６を通過し、それは、ビーム１１０〜１１２の１つまたは複数の位相を制御する。次いで、ビーム１１０〜１１２は、照明パターン回転子（ＩＰＲ：illumination pattern rotator）１２４を通過し、ダイクロイックミラー１２６から反射されて対物レンズ１２８に入る。図１の実施例では、ビーム１１０〜１１２は、ビームが互いに干渉して、試料１３０の容積内で高コントラストの３次元構造化照明のパターンを発生するように、試料１３０内に合焦される。

図２Ａ〜２Ｃに、３つのコヒーレントビームを使用する、３次元構造化照明のパターンの生成を示す。図２Ａに示すように、ビーム１１０〜１１２は、対物レンズ１２８の背面中に透過させる。ビーム１１０〜１１２がコヒーレント光源１０２から生じるので、ビーム１１０〜１１２は、平面波を有し、そこでは、ビームの成分波の位相が、ビーム方向に対して法線方向の平面２０２などのいずれもの平面を横切っても同一である。ビーム１１０〜１１２は、コヒーレントであるが、各ビームは、他の２つのビームと異なる位相変位を有することができる。対物レンズ１２８は、入射ビームを焦点２０４に合焦し、それによって、図２Ａに示すように、２つの非軸方向ビーム１１１および１１２の方向が変化する。その結果、３つの平面波は、もう平行でなくなり、波動ベクトルは、方向が異なっており、３つのセットの平面波は、互いに交差して、建設的干渉のために輝線の３次元パターンが形成され、それは、減殺的干渉による暗領域が囲繞する。言い換えると、図２Ｂの実施例に示すように、静止した干渉縞２０６が、対物レンズ１２８の焦点面中に位置決めされる。線２０８が、より暗い領域によって分離される励起光の輝線を表す。励起光の輝線の格子が干渉縞２０６を含み、試料１３０（図示せず）中の蛍光団から光の蛍光発光を引き起こす。図２Ｃに、対物レンズ１２８の側面図および３次元干渉縞２０６を含む輝線の末端図（end-on view）を示す。白丸２１０が、より暗い領域２１２によって分離される励起光の輝線の末端図を表す。各輝線が、試料２２０の成分に取り付けられた蛍光団の蛍光を励起し、それは、輝線と交差する。輝線２１０の間の暗領域２１２中に位置決めされる試料２２０の成分に取り付けられた蛍光団は、蛍光を発しない。

図１に戻ると、対物レンズ１２８は、蛍光団から放射される蛍光光の一部分を捕らえて、それをダイクロイックミラー１２６に導く。蛍光光は、ダイクロイックミラー１２６を通過してフィルタおよび結像光学系１３２に進み、それは、迷励起光をフィルタリングして蛍光光を検出器１３４のセンサ上に合焦する。たとえば、検出器１３４は、光検出器アレイ、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラとすることができる。

３Ｄ−ＳＩＭの像データは、干渉縞によって励起される蛍光像を取り込み、対物レンズ１２８の光軸に垂直な周期によって干渉縞を移動し、その後もう１つの像を取り込み、そしてトータルでｎ個の像を得るために、これらのステップを繰り返すことによって、獲得される。スプリッタ１１２は、図１に示すように、ｘ方向に並進させることができて、周期によって、対物レンズの光軸に対して垂直に段々と干渉縞を進める。図３Ａ〜３Ｅに、対物レンズ１２８の光軸３０２のまわりを中心にする空間間隔の５つの周期を通じて、干渉縞２０６を段々と進める実施例を示す。図３Ａ〜３Ｅの実施例では、干渉縞２０６の輝線は、図２を参照して上記に述べたように、ｚ軸に対して実質的に垂直に導かれる。図３Ａ〜３Ｅで１〜５と付けられたマークが、光軸３０２のまわりを中心にする空間間隔の５つの周期を表す。点線３０４が、干渉縞２０６の中心を同定する。図３Ａ〜３Ｅに、干渉縞２０６を、光軸３０２に対して実質的に垂直に並進させる５つの別個のステップを示す。たとえば、図３Ａでは、干渉縞２０６は、「１」によって示す第１の周期にあり、そして、図３Ｂでは、干渉縞２０６は、「２」によって示す第２の周期に進められる。図３Ａ〜３Ｅに表す５つの周期のそれぞれで、干渉縞２０６によって励起される蛍光像が捕らえられる。最後のステップは、次のサイクルのために干渉縞をリセットするように巻き戻す。

次いで、干渉縞２０６は、ｘｙ平面上で回転し、ｎステップの結像プロセスが繰り返され、それにもう１つの回転が続き、そして新たなｎ個の像を捕らえて、トータルで３ｎ個の像を得る。３ｎ個の像が得られた後、干渉縞２０６をｚ方向に移動して、新たなセットの３ｎ個の像を得る。図４Ａ〜４Ｃに、対物レンズ１２８および干渉縞２０６の平面図（すなわち、ｘｙ平面）を示す。図４Ａに、干渉縞２０６の輝線が、最初、−６０°の角度に置かれる。図３を参照して上記に述べたように、干渉縞２０６を、空間間隔の５つの周期を通じて段々と進めて、蛍光性像を各ステップで捕らえる。図４Ｂでは、輝線が０°の角度に置かれるように、干渉縞２０６を６０°回転させる。図３を参照して上記に述べたように、干渉縞２０６を、再び、空間間隔の５つの周期を通じて段々と進めて、蛍光性像を各ステップで捕らえる。図４Ｃでは、輝線が６０°の角度に置かれるように、干渉縞２０６は、最終的に６０°回転させる。図３を参照して上記に述べたように、干渉縞２０６を、再び、空間間隔の５つの周期を通じて段々と進めて、蛍光性像を各ステップで捕らえる。干渉縞２０６は、ｘｙ平面上において６０°で３回、回転させ、各回転の後に、５個の像を捕らえて、トータルで１５個の像を得る。これらの蛍光性像は、従来の広視野顕微鏡検査法によって得られる分解能のほぼ２倍の分解能を有する、３次元の光学的な断面像を復元するために、線形方程式系を解くために使用される。

ＩＰＲ１２４は、ｙｚ平面上において光軸３０２のまわりで干渉縞を回転させるために使用される。図５Ａ〜５Ｃに、ビーム１１０〜１１２を回転させるためのＩＰＲ１２４の使用、およびビーム１１０〜１１２のそれぞれと関連する偏光を示す。図５Ａでは、ＩＰＲ１２４は、ビーム１１０〜１１２がｘｚ平面を進み、各ビームと関連する偏光がｘ軸に対して垂直に方向付けられるように、ビーム１１０〜１１２の方向付け機能を持ち続けている。図５Ｂでは、ＩＰＲ１２４は、中心の０次オーダの回折したビームの軸（すなわち、ｚ軸）のまわりで角度ψだけビーム１１０〜１１２を回転させ、かつ各ビームと関連する偏光を同じ角度だけ回転させる。図５Ｃでは、ＩＰＲ１２４は、中心の０次オーダの回折ビーム軸のまわりで角度θだけビーム１１０〜１１２を回転させ、かつ各ビームに関連する偏光を同じ角度だけ回転させる。

図６に、例示のＩＰＲ６００の等角図を示す。ＩＰＲ６００は、走査ミラー６０２と、３つの別々のミラークラスタ６０４〜６０６とを含む。図６に、走査ミラー６０２の実施例を示し、それは、モータ６１２の回転可能なシャフトに取り付けられる平坦なミラー６１０を含む。モータ６１２は、検流計とすることができ、その場合、走査ミラー６０２は、検流計ミラーである、またはモータ６１２は、ミラー６１０の回転を一連の回転段階に分割するステッピングモータとすることができる、またはミラー６１０の正確な回転を与える、いずれもの他の種類のモータとすることができる。あるいは、走査ミラーは、圧電制御ミラーとすることができる。図６に示すように、モータ６１２を使用してミラー６１０の反射表面を回転させ、次いで、ミラークラスタ６０４〜６０６のそれぞれに直面させる。３つの平行な線６１４が、上記に述べたスプリッタ３０４などの格子から出力される、０次および±１次のオーダの回折したビームを表す。図６に示すように、ミラー６１０の３つの回転位置１、２および３が同定される。位置１、２および３は、ミラークラスタ１、２および３に対する、ミラー６１０の特定の回転位置に対応する。ミラークラスタのそれぞれが、異なる角度の回転をビーム６１４に与え、およびビームと関連する偏光の回転の角度に一致する角度を与える。ＩＰＲ６００は、次のように動作させる。ミラー６１０が位置１に回転したとき、ビーム６１４は、方向指示の矢印６１６によって表すように、ミラー６１０からミラークラスタ１ ６０４に向けて反射される。ミラークラスタ１ ６０４は、第１の回転角度だけ、ビームおよび関連するビームの偏光を回転させ、方向指示の矢印６１７によって表すように、ビームを反射してミラー６１０に戻す。ミラー６１０が位置２に回転したとき、ビーム６１４は、方向指示の矢印６１８によって表すように、ミラー６１０からミラークラスタ２ ６０５に向けて反射される。ミラークラスタ２ ６０５は、第２の回転角度だけビームを回転させ、方向指示の矢印６１９によって表すように、ビームを反射してミラー６１０に戻す。ミラー６１０が位置３に回転したとき、ビーム６１４は、方向指示の矢印６２０によって表すように、ミラー６１０からミラークラスタ３ ６０６に向けて反射される。ミラークラスタ３ ６０６は、第３の回転角度だけビームを回転させ、方向指示の矢印６２１によって表すように、ビームを反射してミラー６１０に戻す。方向指示の矢印６２２によって、回転して、ミラー６１０から反射されたビームを示す。図６は、ミラー６１０の反射表面の図６２４を含み、それには、ミラー６１０の表面から反射された回転したビームの相互の位置合わせを表す。ミラー６１０の反射表面から見た、ミラークラスタ６０４〜６０６によって３つのビームに与えられる３つの異なる回転を点線６２６〜６２８によって表す。点線６２６によって、ミラークラスタ１ ６０４によって生成されるビームの方向付けを表し、点線６２７によって、ミラークラスタ２ ６０５によって生成されるビームの方向付けを表し、そして、点線６２８によって、ミラークラスタ３ ６０６によって生成されるビームの方向付けを表す。ＩＰＲ６００は、また、ビーム６２２の経路中に位置決めされる出射経路ミラーを含むことができて、ビームがＩＰＲ６００から出力される方向に対する追加の制御をもたらす。

図７Ａは、図１に示すようなレンズ１１４とＩＰＲ１２４の間に位置決めされるＩＰＣ７００の例示の実施を示す拡大図である。ビーム１１０〜１１２は、実質的に平行な経路に沿ってレンズ１１４から出力され、ビームは、レンズ１１４によって、それぞれ焦点７０１−７０３に合焦される。図７Ａの実施例に示すように、システム７００は、４つの別々の回転可能なウインドウ７０５〜７０８からなる。回転可能なウインドウの２つ７０５および７０６は、外側ビーム１１１を横切り、それぞれ焦点７０２の反対側に位置決めされる。他の２つの回転可能なウインドウ７０７および７０８は、他の外側ビーム１１２を横切り、また、それぞれ焦点７０３の反対側に位置決めされる。図７Ｂに、例示の回転可能なウインドウ７１０の等角図を示し、それは、モータ７１４の回転可能なシャフトに取り付けられる平坦な透明プレート７１２を含む。透明プレート７１２は、ガラスまたは別の適切で透明な材料から構成することができ、モータ７１４は、プレート７１２の回転を一連の回転段階に分割する検流計またはステッピングモータ、あるいはプレート７１２を迅速に回転させるために使用することができる、いずれもの他の種類のモータとすることができる。

各ペアの回転可能なウインドウの透明プレートは、ビームの１つを横切り、回転したとき、ビームの経路長を変化させ、それによって、次いで、干渉縞を形成するように合焦されるビームの相対的な位相が変化することになる。ペアの回転可能なウインドウの透明プレートは、ビームの経路を維持するために、同じ角度の大きさであるが、しかし互いに反対方向に回転させる。図８Ａ〜８Ｂに、２つの回転可能なウインドウのペアの透明プレート８０１および８０２を示す。図８Ａの実施例では、プレート８０１および８０２は、平行であって、点線の光線８０４によって表すポイントＡからポイントＢに送られる、光の平行に整えられたビームに対して、垂直に方向付けられる。ビームは、全体の距離Ｄを進み、プレート８０１および８０２のそれぞれを通過する最小距離がｄである。図８Ｂの実施例では、同じプレート８０１および８０２を互いに反対方向に同じ角度の大きさθで回転させる。点線８０６によって、ビームが回転したプレート８０１に達するまで、ビームが進む最初の経路を表す。ビームは、回転したプレート８０１によって屈折し、最初の経路８０６に対して実質的に平行である経路８０８上に配置される。次いで、ビームは、回転したプレート８０２によって再び屈折し、最初の経路８０６と位置合わせされる経路８１０上に配置される。言い換えると、同じ角度の大きさであるが、しかし互いに反対方向にプレートを回転させることによって、ビームの最初の経路が維持される。しかし、プレート８０１および８０２を回転させるので、ビームは、屈折する。その結果として、ビームは、プレート８０１および８０２のそれぞれを通過する、より長い距離ｄ’（すなわち、ｄ’＞ｄ）を進み、それによって、ビームが、図８Ａに示すように、平行なプレート８０１および８０２を通過して進むときに比べて、位相シフトが、相対的により大きいことになる。言い換えると、ビームが、ポイントＡからポイントＢまで、図８Ａに示す平行に方向付けられるプレート８０１および８０２を通過して進むとき、ビームの位相が、それによって遅れる量は、プレート８０１および８０２の屈折率および距離ｄに依存する。その結果として、ビームは、プレートの２ｄおよび屈折率に比例する位相シフトを獲得する。しかし、図８Ｂに示すように、プレート８０１および８０２を回転させたとき、ビームがプレート８０１および８０２のそれぞれを通過する、より長い距離ｄ’によって、さらにより大きい位相シフトがもたらされることになる。たとえば、また、図８Ａ〜８Ｂに、最初の時間ｔ_０および後の時間ｔ_ｌで、波長λの電磁波の拡大した部分８１２のスナップを表す。図８Ａでは、時間ｔ_０において、部分８１２の最小部分８１４が、ポイントＡに位置決めされ、後の時間ｔ_ｌにおいて、同じ最小部分８１４が、ポイントＢに到達する。他方、図８Ｂでは、時間ｔ_０において、部分８１２の最小部分が、ポイントＡに位置決めされるが、しかし後の時間ｔ_ｌにおいて、同じ最小部分８１４は、ポイントＢから離れてλ／４にあり、それは、

の位相シフトに対応する。

図９に、角度の大きさαで互いに反対方向に、回転可能なウインドウ７０５および７０６のプレートを回転させ、かつ角度の大きさβで互いに反対方向に、回転可能なウインドウ７０７および７０８のプレートを回転させることに基づき、ビーム１１０〜１１２に加えられる例示の位相シフトのスナップを示す。図９の実施例では、回転可能なウインドウ７０５〜７０８を例示するために、ビーム１１１および１１２中の異なる相対的な位相シフトの生成、およびビーム１１０〜１１２と関連する電磁波の部分９０１〜９０３を、位相が分離されないでＩＰＣ７００に入るとき、そして同じポイントで、その部分のそれぞれを横切る点線９０４によって示す。後の時間では、図８を参照して上記に述べたように部分９０１および９０３が回転可能なウインドウ７０５〜７０８を通過したとき、部分９０１は、

の相対的な位相シフトを獲得しており、部分９０３は、ビーム１１０に対して

の相対的な位相シフトを獲得している。

上記に述べたＩＰＣ７００などのＩＰＣは、０.２ミリ秒のオーダの切り替え時間をもたらす。透明プレートが、垂直入射のほぼ１°の高精度範囲にあるとき、有効経路長は、０.１ナノメートルのオーダの精度で調節することができる。

図３を参照して上記に述べたように、回転可能なウインドウの透明プレートを特定の角度に回転させて、周期を通じて空間間隔に沿って干渉縞を段々と進める。図１０Ａ〜１０Ｃに、３つの仮定のセットの角度の実施例を示し、そこでは、図３を参照して上記に述べたように、回転可能なウインドウの透明プレートを回転させて、周期１、２および３で、干渉縞２０６を集中させる。図１０Ａの実施例では、ウインドウ７０５および７０６のプレートが０°にあり、そしてウインドウ７０７および７０８のプレートを、最大の回転角度−βおよびβでそれぞれ回転させて、周期１内で干渉縞２０６を集中させる。図１０Ｂの実施例では、ウインドウ７０５および７０６のプレートを、角度αおよび−αでそれぞれ回転させ、かつウインドウ７０７および７０８のプレートを、より小さい角度−γおよびγまで、それぞれ回転させ、それによって、ビーム１１０〜１１２の間に相対的な位相差を生成して、周期２内で干渉縞２０６を集中させる。図１０Ｃの実施例では、ウインドウ７０５および７０６のプレートを、角度φおよび−φまで、それぞれ回転させ、かつウインドウ７０７および７０８のプレートを０°まで回転させ、それによって、ビーム１１０〜１１２の間に相対的な位相差を生成して、周期３内で干渉縞２０６を集中させる。

ＩＰＣは、図７を参照して上記に述べたような２つの外側ビームに沿って位置決めされる、２つのペアの回転可能なウインドウに限定されない。代替実施形態では、ＩＰＣは、３つのペアの回転可能なウインドウを用いて実施することができ、そこでは、各ペアの回転可能なウインドウが、３つのビームの１つに沿って位置決めされる。たとえば、ＩＰＣ７００は、第３のペアの回転可能なウインドウを含むように変更することができ、それは、回転可能なウインドウ７０５〜７０８がビーム１１１および１１２を横切るように位置決めされるのと同じように、ビーム１１０を横切る。あるいは、ＩＰＣは、わずか１つのペアの回転可能なウインドウを用いて実施することができ、それは、単一ペアの回転可能なウインドウ１１０２および１１０４がビーム１１１を横切る、図１１の実施例に示すように、レンズ１１４とＩＰＲ１２４の間でビームのいずれか１つに沿って位置決めされる。あるいは、ＩＰＣは、中心ビーム１１０を横切る１つのペアの回転可能なウインドウと、外側ビーム１１１および１１２のどちらか１つを横切る第２のペアとを用いて実施することができる。代替実施形態では、ＩＰＣは、ビーム経路のそれぞれ１つに、２つに、または３つすべてに配置される１個だけの回転可能なウインドウを用いて実施することができる。たとえば、図１２では、ＩＰＣは、ビーム１１１および１１２を横切る回転可能なウインドウ１２０２および１２０４からなる。なお、１つだけの回転可能なウインドウが、ビーム経路中に配置されて、ビームの相対的な位相を制御するとき、透明プレートをより急に急な入射角度まで回転させるので、感度が増加し、位相制御の精度が低下する恐れがある。さらに、図８Ｂを参照して上記に述べたように、少量のビームの並進が存在する。

前述の明細書は、説明の目的で、本開示を完全に理解してもらうために具体的な専門用語を使用した。しかし、具体的な細部が、本明細書に述べたシステムおよび方法を実施するために、必要でないことは、当業者に明らかなはずである。具体的な実施例による前述の明細書は、例示し記述する目的で提示する。この記述は、本開示を包括的に示す、またはそれを述べた正確な形態に限定するようには意図されない。明らかに、多くの修正形態および変形形態が、上記の教示を考慮すると、可能である。本開示の原理および実用的な用途を最善に述べるために、実施例を示し述べており、それによって、だれか他の当業者が、本開示および様々な実施例を最善に利用できるようになり、特定の使用に適するような様々な修正形態が、期待される。本開示の範囲は、次の特許請求の範囲およびその同等物によって定義されると意図される。

Claims (16)

1. 光の単色ビームを受光して、前記単色ビームを少なくとも３つのコヒーレントビームに分岐させるためのスプリッタと、
   前記少なくとも３つのコヒーレントビームを受け取り、受け取ったコヒーレントビームのうちの第１のコヒーレントビームに位相シフトを加える照明位相制御部であって、前記第１のコヒーレントビームの経路に対して回転可能な第１のウィンドウと、前記第１のコヒーレントビームの経路に対して回転可能な第２のウィンドウとを含む第１の一対の回転可能なウィンドウを用いて前記位相シフトを加える照明位相制御部と、
   前記照明位相制御部から出力された少なくとも３つのビームに基づいて、干渉縞を形成するための対物レンズとを有する顕微鏡検査法器具であって、
   前記第１のウィンドウは、前記第１のコヒーレントビームの焦点に対して一方の側に位置決めされ、
   前記第２のウィンドウは、前記第１のコヒーレントビームの焦点に対して他方の側に位置決めされ、
   前記第１の一対の回転可能なウィンドウを用いて、前記干渉縞の位置を変化させることができる、顕微鏡検査法器具。
2. 前記照明位相制御部と前記対物レンズの間に配置される照明パターン回転子をさらに含み、
   前記照明パターン回転子は、前記照明位相制御部から出力された少なくとも３つのビームを回転させ、これにより、前記干渉縞が同じ角度だけ回転する、請求項１に記載の顕微鏡検査法器具。
3. 前記スプリッタは、１次元格子を含む、請求項１に記載の顕微鏡検査法器具。
4. 前記スプリッタは、少なくとも２つのビームスプリッタを含む、請求項１に記載の顕微鏡検査法器具。
5. 前記照明位相制御部は、前記受け取ったコヒーレントビームのうちの第２のコヒーレントビームの経路上に配置される第２の一対の回転可能なウィンドウを有する、請求項１に記載の顕微鏡検査法器具。
6. 前記第１のウインドウは、第１の透明プレートを回転させる第１のモータに取り付けられる前記第１の透明プレートを有し、
   前記第２のウィンドウは、第２の透明プレートを回転させる第２のモータに取り付けられる前記第２の透明プレートを有し、
   前記第１の透明プレートおよび前記第２の透明プレートは、前記第１のコヒーレントビームを横切る、請求項１または請求項５に記載の顕微鏡検査法器具。
7. 前記第１の透明プレートおよび前記第２の透明プレートは、前記第１のコヒーレントビームの経路に対して同一の角度の大きさで互いに反対方向に回転する、請求項６に記載の顕微鏡検査法器具。
8. 前記第１のモータおよび第２のモータの各々は、検流計モータ、圧電装置およびステッピングモータの１つを含む、請求項６又は７に記載の顕微鏡検査法器具。
9. 前記照明パターン回転子から出力された少なくとも３つのビームを前記対物レンズに反射し、かつ前記干渉縞によって照明される試料から放射される蛍光光を通過させるためのダイクロイックミラーと、
   光検出器アレイと、
   前記ダイクロイックミラーと前記光検出器アレイの間に配置され、前記蛍光光を前記光検出器アレイに合焦するためのフィルタおよび像光学系と、
   を更に有する、請求項２に記載の器具。
10. 顕微鏡検査法器具において干渉縞をシフトさせるための方法であって、
    スプリッタを使用して、光の単色ビームを少なくとも３つのコヒーレントビームに分岐させるステップと、
    前記少なくとも３つのコヒーレントビームを受け取る照明位相制御部を使用して、受け取ったコヒーレントビームのうちの第１のコヒーレントビームに位相シフトを加えるステップと、
    前記照明位相制御部から出力された少なくとも３つのビームに基づいて干渉縞を形成するためのステップとを有し、
    前記照明位相制御部は、前記第１のコヒーレントビームに対して回転可能な第１のウィンドウと、前記第１のコヒーレントビームに対して回転可能な第２のウィンドウとを含む第１の一対の回転可能なウィンドウを用いて前記位相シフトを加え、
    前記第１のウィンドウは、前記第１のコヒーレントビームの焦点に対して一方の側に位置決めされ、
    前記第２のウィンドウは、前記第１のコヒーレントビームの焦点に対して他方の側に位置決めされ、
    前記第１の一対の回転可能なウィンドウを用いて、前記干渉縞の位置を変化させることができる方法。
11. 前記照明位相制御部と前記干渉縞を形成するための対物レンズとの間に配置される照明パターン回転子を使用して、前記照明位相制御部から出力された前記少なくとも３つのビームを回転させるステップを更に有し、当該ステップにより、前記ビームと同じ角度だけ前記干渉縞が回転する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記スプリッタは１次元格子を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記スプリッタは少なくとも２つのビームスプリッタを含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記照明位相制御部は、前記受け取ったコヒーレントビームのうちの第２のコヒーレントビームの経路上に配置される第２の一対の回転可能なウィンドウを有する、請求項１０に記載の方法。
15. 前記第１のウインドウは、第１の透明プレートを回転させる第１のモータに取り付けられる前記第１の透明プレートを有し、
    前記第２のウィンドウは、第２の透明プレートを回転させる第２のモータに取り付けられる前記第２の透明プレートを有し、
    前記第１の透明プレートおよび前記第２の透明プレートは、前記第１のコヒーレントビームを横切る、請求項１０または請求項１２に記載の方法。
16. 前記第１の透明プレートおよび前記第２の透明プレートは、前記第１のコヒーレントビームの経路に対して同一の角度の大きさで互いに反対方向に回転する、請求項１５に記載の方法。