JP5870369B2

JP5870369B2 - 血液脳関門障害改善剤

Info

Publication number: JP5870369B2
Application number: JP2013558713A
Authority: JP
Inventors: 植田　弘師; 弘師植田
Original assignee: Nagasaki University NUC; Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd
Current assignee: Nagasaki University NUC; Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd
Priority date: 2012-02-13
Filing date: 2013-02-13
Publication date: 2016-03-01
Anticipated expiration: 2033-02-13
Also published as: US20150166626A1; EP2816056A4; JPWO2013122116A1; US9617324B2; EP2816056A1; WO2013122116A1

Description

本発明は、プロサイモシンα由来のペプチド、及びそのペプチドを有効成分として含む血液臓器関門障害改善剤などに関する。

脳卒中は日本人の死亡率第４位、寝たきりの病因で第１位の重要疾患であり、脳虚血が原因で生じる疾患である。脳卒中をはじめとする脳虚血性の疾患に対しては、予後を改善する意味で、急性期治療が重要であるといわれている。現在注目されている主な治療方法はプラスミノーゲンアクチベータ（以下、「ｔＰＡ」と記載する）をはじめとした血栓溶解剤であるが、その使用は４．５時間以内に限られ、その恩恵をうけることができる患者は十数パーセント程度にすぎない（非特許文献１参照）。この一因として、脳虚血後の時間経過と共に血液脳関門が脆弱になること、ｔＰＡなどの血栓溶解剤の使用により出血性脳卒中の危険性が増すことが挙げられる。

発明者は近年、プロサイモシンαが神経細胞死保護作用を有する物質であり、この神経細胞死抑制効果によって脳卒中障害を軽減することができることを初めて見出した（特許文献１参照）。また発明者らはプロサイモシンαがマウス、ラットにおいて脳卒中および虚血性緑内障を抑制する効果を有することも見出した（非特許文献２〜４参照）。さらに発明者は、プロサイモシンαが、血液脳関門の脆弱化から血液脳関門を保護する作用を有することを見出すとともに、ラットプロサイモシンα中の３０アミノ酸からなる活性本体と、活性発現に重要な当該配列中の９アミノ酸とを明らかにした（特許文献２参照）。

国際公開２００４／０６４８６１号パンフレット国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット

最新医療：医療：医療と介護：読売新聞オンライン２００５年１０月２５日付記事、「脳梗塞に新薬ｔＰＡ」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｏｍｉｕｒｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｒｙｏｕ／ｍｅｄｉ／ｓａｉｓｉｎ／２００５１０２５ｉｋ１４．ｈｔｍＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ（２００７），１７６，８５３−８６２ＣｅｌｌＤｅａｔｈａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００７），１４，１８３９−１８４２ＣｅｌｌＤｅａｔｈａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００９），１６，３４９−３５８

虚血により生じうる血液臓器関門の脆弱化を抑制し、血液臓器関門を保護することができる物質であって、薬剤等への適用を見据えて、現在公知のペプチドよりも取扱いの容易な物質が望まれている。特に、製造の容易さ及び市場での採算性を考慮すると、長さを１０アミノ酸以下にすることが望ましい。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、プロサイモシンαの５１番目から５６番目の６アミノ酸からなるペプチド（ＰｒｏＴα６，Ｐ６ペプチド：配列番号１）及びこのペプチドと関連するペプチドが、血液脳関門障害改善活性などの特性を有することを見出した。本発明者はさらに鋭意検討し、本発明を完成するに至った。

上記の発明は，基本的には以下の知見に基づく。国際公開２０１１／０１９０２３号パンフレット（特許文献２）に開示されたＰｒｏＴα９と表記されるラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸から６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドにおいてアミノ酸配列から１個又は２個のアミノ酸が欠失，付加，置換，又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩ペプチド（特に配列番号３０又は３１で示されるペプチド）が，ＰｒｏＴα９よりも高い網膜虚血障害保護作用を示す事を見出した。これらのペプチドの例は，上記したＰｒｏＴα９を基にして，Ｎ末端及びＣ末端の残基を１〜数個移動させて得られる部分ペプチドである。

P+1N/-1C:
NEVDEEEEE（配列番号３０）
P+2N/-2C:
D NEVDEEEE（配列番号３１）

また，先に説明したＰｒｏＴα６（Ｐ６ペプチド）やプロサイモシンαの５１番目から５７番目の７アミノ酸からなるペプチド（ＰｒｏＴα７，Ｐ７ペプチド：配列番号３２）が網膜虚血障害保護作用を有することを見出した。

P7ペプチド NEVDEEE（配列番号３２）

Ｐ６ペプチドは，静脈内投与により脳梗塞虚血障害作用が認められた。

P6ペプチドの誘導体のうち網膜虚血モデルにおいてP6と同等あるいはそれ以上の高活性を示すものとしてA,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K,M,N,O,P,Q,R,S,T,Uペプチドの20種のものが見出された。

全身（静脈内）投与で特に高い脳保護作用を示すものにはP6の他、AとBペプチド、tPAによる脳梗塞時の出血作用抑制作用を示すAペプチド、tPAによる脳梗塞抑制作用有効時間を延長させるAとFペプチドが特に優れた有用性を示した。

本発明の第１の側面は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列，又は配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個又は２個のアミノ酸が欠失，付加，置換，又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩ペプチドに関する。このペプチドは，配列番号１であらわされるアミノ酸配列を有するペプチドと，実質的に同等の機能を有するペプチドであるものが好ましい。

この側面のペプチドまたはその塩の好ましいものは，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号１２又は配列番号１３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。そして，特に好ましいものは，配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる，ペプチドまたはその塩である。

本発明の第２の側面は，上記したいずれかのペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤に関する。このように，本発明のペプチドまたはその塩を有効成分として含む治療剤を，本発明の治療剤ともよぶ。この治療剤は，上記したいずれかのペプチドまたはその塩をその機能を発揮できる程度の有効量含むものである。具体的に説明すると，この治療剤は，血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤といえる。さらに具体的に説明すると，この治療剤は，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，又は脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患の治療剤である。また，本発明の治療剤の好ましい態様は，虚血性疾患の治療剤である。さらに，本発明の治療剤の好ましい態様は，脳梗塞の治療剤である。本発明の治療剤の好ましい態様は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤である。本発明の治療剤の好ましい態様は，神経細胞死抑制剤である。

本発明の第３の側面は，本発明のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，脳虚血性疾患用治療剤である。本発明のペプチドまたはその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血を治療又は予防できるので，血栓溶解剤との併用が有効である。この側面において，好ましい血栓溶解剤は，プラスミノーゲンアクチベータである。さらに，この側面において，好ましい適応症は脳梗塞である。この側面において，本発明のペプチドまたはその塩と血栓溶解剤とは，対象となる患者に同時に投与されても良い。また，本発明のペプチドまたはその塩を血栓溶解剤投与の1時間前に前投与することにより，脳梗塞後６時間における血栓溶解剤による治療効果を高めることが期待される。また，同時投与することにより脳梗塞４時間後に投与した血栓溶解剤による出血作用を抑制するなどの重要な副作用を軽減できるという特性も期待できる。血栓溶解剤は，様々な副作用を惹起する場合がある。例えば，脳梗塞の疑いがある患者に対し，本発明のペプチドまたはその塩を投与することで，血栓溶解剤を投与する時間的余裕を多くすることができる。このため，精密検査を行って脳梗塞であると判明した後に，血栓溶解剤を投与できることとなる。

本発明の血液臓器関門障害改善剤は、虚血により生じうる血液臓器関門の脆弱化を抑制し、血液臓器関門障害を改善することができる。特に脳虚血（脳卒中など）により生じうる血液脳関門の脆弱化の抑制や、網膜虚血により生じうる血液網膜関門障害の改善に有用である。よって本発明の剤は血液臓器関門障害に起因する疾患の治療剤となり得る。
あるいは、各臓器の虚血により血液臓器関門が脆弱化した場合であって、血栓溶解剤の適用対象外と判断されるような場合であっても、従来公知の血栓溶解剤と本発明の剤とを併用することによって、血栓溶解剤による血液臓器関門からの出血といった副作用を心配することなく虚血性疾患を治療することができる。
本発明の血液臓器関門障害改善剤の有効成分は、プロサイモシンαの５１番目から５６番目の６アミノ酸からなるペプチド（本明細書中、「ＰｒｏＴα６」や「Ｐ６」と記載する場合がある；配列番号１）等であり、従来知られているプロサイモシンα全長やプロサイモシンα由来のペプチドに比べて、製造・加工が容易であって、かつ同等以上の虚血改善効果を有している。したがって当該ペプチドは、血液臓器関門障害の改善剤や、血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤、また虚血性疾患の治療剤等の有効成分として、より有用である。

図１Ａはヒト、ラット、及びマウス由来のプロサイモシンαのアミノ酸配列を示す図である。図１Ｂは，本発明と関連するペプチドを示す図である。図２はペプチド９の配列を、ラットプロサイモシンαの配列上で移動あるいは欠損させたペプチドの網膜虚血一週間後の機能障害に対する効果をERGにて評価したものである。図３は網膜虚血による機能障害に対するＰ３０、P９、Ｐ６及びｍＰ６（N-acetyl-P6-amide又はＦペプチド）の効果を示す図である。左図及び右図はそれぞれ、示したペプチド濃度におけるa-wave及びb-waveを示す。図４は網膜虚血モデルにおける虚血１２時間後のMMP活性上昇に対するP６およびP６誘導体の効果を示す図である。図中、*はstudent’s t検定におけるP<0.05 vs control、#はP<0.05 vs Vehicleを示す。図５は、tMCAO虚血モデルにおける臨床スコアに対するＰｒｏＴαペプチド（Ｐ３０及びＰ６）の効果を示す図である。図中、*及び**はそれぞれ、RepeatedMeasure ANOVA検定におけるP<0.05及びP<0.01を示す。図６の上段は、図５の虚血後７日目の結果を棒グラフで示しており、下段左は、１４日間の臨床スコアの累積をＡＵＣで示すグラフである。下段右は、tMCAO後のP6の投与タイミングを変えたときの、１４日間の臨床スコアの累積を示すグラフである。図中、統計にはShirley-Williams検定を用い、*と**はそれぞれP<0.05とP<0.01を示す。図７は、P6ペプチドの血液脳関門障害抑制効果を示すトマトレクチン染色図である。contraは動脈非梗塞側を、ipsiは動脈梗塞側を示す。下段の番号１〜３は、上段の左図中の１〜３に対応し、それぞれ、大脳皮質（虚血中心部：コア）、大脳皮質（虚血周囲：ペナンブラ）及び線条体を指す。図８の左図は、4時間のMCAOを行い1日後の臨床スコアに対するP6のtPAとの併用効果を示した図である。Vehicle、tPA 10 mg/kg、tPA+P6 1 mg/kgは再灌流直前に尾静脈投与した。図中、*はstudent’s t検定におけるP<0.05を示す。図８の右図は、4時間のMCAOを行い1日後の死亡率に対するP6のtPAとの併用効果を示した図である。図９は，基本ペプチドＰ６の網膜虚血障害保護効果を示すための染色された網膜を示す図面に替わる写真である。図１０は，対照，ＤＭＳＯ投与，Ｐ６を１眼当たり１ｐｍｏｌ，３ｐｍｏｌ，及び１０ｐｍｏｌ投与した場合の網膜の厚さ及び網膜電位図である。図１０Ａは，網膜の厚さを示すグラフである。図１０Ｂは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１０Ｃは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１１は，様々なペプチドの網膜電位の値を示すグラフである。図１１Ａは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１１Ｂは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１２は，様々なペプチドの網膜電位の値を示すグラフである。図１２Ａは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１２Ｂは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１３Ａは，tMCAOモデルにおける評価工程を示す。図１３Ｂは，評価スコアを示す。図１３Ｃは，６０分のtMCAOを行った後の評価スコアの変遷を示す。図１３Ｄは，対照，1時間のｔＭＣＡＯ後、それぞれさらに１，２，３時間後に１ｍｇ／ｋｇのP６を投与し、１‐１４日後の間の運動障害を評価したスコアを示す。図１４Ａは，tMCAOモデルにおける評価工程を示す。図１４Ｂは，Ａペプチドを静脈内投与した場合のtMCAOモデルでの運動障害評価スコアの変遷を示す。図１４Ｃは，Ｂペプチドを静脈内投与した場合のtMCAOモデルでの運動障害評価スコアの変遷を示す。図１５は，ＥＲＧ機能解析の結果を示すグラフである。図１５Ａは，Ａペプチド又はＢペプチドを網膜虚血後２４時間に１０ｍｇ/ｋｇ静脈内したときのａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１５Ｂは，Ａペプチド又はＢペプチドを網膜虚血後２４時間に１０ｍｇ/ｋｇ静脈内したときのｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１６Ａは，ｔＭＣＡＯ虚血4時間後にP６単独あるいはP６とｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図１６Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＰ６単独あるいはＰ６とｔＰＡの併用時の虚血後24時間での運動障害評価スコア（ＣｌｉｎｉｃａｌＳｃｏｒｅ）を定量的解析したものである。図１６Ｂは対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、Ｐ６を、１，３，１０ｍｇ／ｋｇ投与、ｔＰＡ単独対照、ｔＰＡとＰ６を１，３，１０ｍｇ／ｋｇ同時投与した際のスコアを示す。図１６Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＰ６単独あるいはＰ６とｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を定量的解析したものである。図１６Ｃは対照、Ｐ６を、１，３，１０ｍｇ／ｋｇ投与、ｔＰＡ単独対照、ｔＰＡとＰ６を１，３，１０ｍｇ／ｋｇ同時投与した際のスコアを示す。図１７Ａは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図１７Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥペプチドとｔＰＡの併用時の虚血後２４時間後の運動障害評価スコアを定量的解析したものである。図１７Ｂは対照、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅペプチドを１０ｍｇ／ｋｇとｔＰＡと静脈内同時投与した際のスコアを示す。図１７Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を定量的解析したものである。図１７Ｃは対照、ｔＰＡ単独対照、ｔＰＡとＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅペプチドを１０ｍｇ／ｋｇ同時投与した際のスコアを示す。図１８Ａは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後に１，３，１０ｍｇ／ｋｇのＡペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図１８Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後に１，３，１０ｍｇ／ｋｇのＡペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの静脈内併用投与時の虚血後24時間での運動障害評価スコア (Clinical Score)を定量的解析したものである。図１８Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後に１，３，１０ｍｇ／ｋｇのＡペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を定量的解析したものである。図１９は，ＰＩＴモデルにおけるＡペプチド及びｔＰＡの投与計画を示す。図２０Ａは，ローズベンガル投与後すぐに光照射し、中大脳動脈に血栓を生じさせ、その後５時間に対照あるいはＡペプチド１０,３０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与、さらにその後１時間にｔＰＡを投与し、最終的に光化学的血栓形成後２４時間に認められる大脳皮質と線条体領域の脳梗塞を示した写真を示す。図２０Ａでは対照、ｔＰＡ単独対照、１０, ３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド併用、３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド単独による結果を示す。図２０Ｂは，図２０Ａの梗塞領域を定量化したものである。図２０Ｃは，ローズベンガル投与後すぐに光照射し、中大脳動脈に血栓を生じさせ、その後５時間に対照あるいはＡペプチド１０,３０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与、さらにその後1時間にｔＰＡを投与し、最終的に光化学的血栓形成後２４時間に認められる運動障害評価スコアをもとめたものである。図２０Ｃでは対照、ｔＰＡ単独対照、1１０,３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド併用、３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド単独による結果を示す。図２１は，アクセレイテッドロータロッドテスト（Accelerated Rota rod test）の結果を示す，走行不可能となるまでの時間を示す折れ線グラフである。図２２は，トレイニング期間の平均値及び７日後の平均値を示す棒グラフである。図２３は，Ｐ６，Ａペプチド〜Ｅペプチドの配列を示す参考図であり，内容は表１のものと同様である。図２４は，Ｐ６，Ａペプチド〜Ｕペプチドの配列を示す参考図である。図２５は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体を示す図面に替わる写真である。図２６Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図２６Ｂは，評価スコアを示すグラフである。図２７は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体を示す図面に替わる写真である。図２８Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図２８Ｂは，評価スコアを示すグラフである。図２９は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体を示す図面に替わる写真である。図３０Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図３０Ｂは，評価スコアを示すグラフである。図３１は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体を示す図面に替わる写真である。図３２Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図３２Ｂは，評価スコアを示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。
プロサイモシンα（以下、「ＰｒｏＴα」と記載する場合がある）とは、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能を有し、また「脳虚血性の血液脳関門脆弱化を顕著に抑制し、血液脳関門障害を改善する機能」をも有することが知られている公知のタンパク質である。

P7ペプチド NEVDEEE（配列番号３２）

本発明のペプチドまたはその塩（単に本発明のペプチドとよぶ場合がある）は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩であり，配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと同様又はそれ以上の活性を有するものである。配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドの活性は，後述する実施例で評価された活性のうちいずれか１つであればよい。また，このように本発明のペプチドまたはその塩は，単離されたペプチドであるか，又は単離及び精製されたペプチドである。

本発明のペプチドは，ヒトや哺乳動物（例えば，モルモット，ラット，マウス，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ又はサル）の細胞に由来するペプチドであってもよい。また，本発明のペプチドは，プロサイモシンα又はそれに由来するペプチドの部分ペプチドであってもよい。さらに，本発明のペプチドは，合成ペプチドであってもよい。

本発明のペプチドの例は，配列番号１で表わされるアミノ酸配列であるか，又は配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個又は２個のアミノ酸が欠失，付加，置換，又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。本発明のペプチドは，たとえば，１個のアミノ酸が欠失し，１個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩のように，欠失，付加，置換，及び挿入が２種以上存在してもよい。

なお，置換には，たとえばアミノ酸残基や，末端が修飾されているものとするものも含まれる。そのような置換の例は，アミノ酸残基又はペプチド末端が，アセチル化又はアミド化されているものである。

本発明のペプチドの好ましい例は，配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，又は配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。これらの中でも，本発明のペプチドの好ましい例は配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩である。

本明細書におけるペプチドは，ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）であり，右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のペプチドは，Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ），カルボキシレート(−ＣＯＯ⁻），アミド（−ＣＯＮＨ_２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲの例は，Ｃ_１−６アルキル基，Ｃ_３−８シクロアルキル基，Ｃ_６−１２アリール基，Ｃ_７−１４アラルキル基，及びピバロイルオキシメチル基である。Ｃ_１−６アルキル基の例は，メチル基，エチル基，ｎ−プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓ−ブチル基及びｔ−ブチル基である。Ｃ_３−８シクロアルキル基の例は，シクロペンチル基及びシクロヘキシル基である。Ｃ_６−１２アリール基の例は，フェニル基及びα−ナフチル基である。Ｃ_７−１４アラルキル基の例は,ベンジル基及びフェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基；及びα−ナフチルメチル基などのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基である。

本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合，カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルの例は，上記したＣ末端のエステルである。

本発明のペプチドには，上記したペプチドにおいて，Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの，Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの，分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの，あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド・糖タンパク質などの複合ペプチド・複合タンパク質なども含まれる。Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基の保護基の例は，Ｃ_１−６アシル基であり，Ｃ_１−６アシル基の例は，ホルミル基，アセチル基などのＣ_２−６アルカノイル基である。分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基の例は，−ＯＨ，−ＳＨ，アミノ基，イミダゾール基，インドール基，及びグアニジノ基である。分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基の保護基の例は，Ｃ_１−６アシル基であり，Ｃ_１−６アシル基の例は，ホルミル基，アセチル基などのＣ_２−６アルカノイル基である。

本発明のペプチドの塩は，生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩の例は，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，及び硫酸）との塩及び有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，及びベンゼンスルホン酸）との塩である。

本発明のペプチドの塩は，実質的に本発明のペプチドと同様の作用を有する。このため，本明細書の実施例においてもペプチドの塩が用いられている場合や，ペプチドの塩が含まれている場合が存在する。そのような場合であっても，簡便のためペプチドのみを用いたように表記する。

本発明のペプチドは，特許文献１又は２に開示されたプロサイモシンα又はプロサイモシンα由来のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。

本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療剤
本発明の血液脳関門障害改善剤は，本発明のペプチドを有効成分として含有する。このため本発明の血液脳関門障害改善剤は，脳虚血により生じる血液脳関門の脆弱性を保護し，血液脳関門障害を改善することができる。従って本発明の血液脳関門障害改善剤は，それが有する神経保護作用によって血液脳関門を保護すると共に，脳血管障害により脆弱化した血液脳関門をも改善することができるので，脳虚血性の疾患全般，特に血液脳関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。

本発明における「血液脳関門障害を伴う疾患」とは，血液脳関門に異常を生ずることが知られている疾患全般（例えば血液脳関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になる疾患，血液脳関門における物質輸送が異常を来す疾患など）や，血液脳関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患は，多くが脳虚血を伴う疾患であり，具体的には，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患などのほか，脳卒中，外傷性脳障害，緑内障，糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。なお，ここでいう「治療」には，疾患を完治させる場合のみならず，病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。

本発明の「血液脳関門障害改善剤」および「血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤」は，本発明のペプチドを，公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず公知の担体又は希釈剤を適用することが可能であるが，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。

本明細書中「血液臓器関門」とは、血管内の血液と臓器の組織液との間の物質交換を制御する機構のことをいう。血液臓器関門による物質交換の制御機構は、アミノ酸やグルコースをはじめとする神経活動のエネルギー源となる必須内因性物質を臓器内に取り込むメカニズムと、臓器内の毒物や不要な異物などを血中に排出するメカニズムに支えられている。これらのメカニズムは、各臓器の毛細血管内皮細胞に発現している多くのトランスポーター輸送系によってコントロールされ得る。
代表的な血液臓器関門である血液脳関門を解剖学的に見ると、血液脳関門を構成する脳毛細血管内皮細胞がタイトジャンクションを形成し、細胞間隙への物質透過性を制限していることが理解できる。つまり血液脳関門の存在により、脳組織をはじめとする中枢神経系へ血管内の成分が流れ込まなくなるため、中枢神経系の生化学的恒常性が高度に維持されている。血液脳関門に異常を生じた場合、脳血管内と脳内の選択的な物質透過性に異常が生じ、これらの異常が結果的に中枢神経系に影響を及ぼすこととなる。

血液臓器関門として具体的には、血液脳関門、血液網膜関門、血液脳脊髄液関門、血液胆汁関門、血液胸腺関門、血液精巣関門などが挙げられる。好ましくは、血液脳関門、血液網膜関門などの脳神経系の臓器における血液臓器関門である。

血管梗塞時には、梗塞部位だけでなく血液臓器関門にも虚血症状が生じる。虚血症状が生じた部分の血管は急激に弱くなるので、血流が再開された場合、血液臓器関門から出血する可能性が高い。特に脳梗塞などの脳虚血の場合は、血液脳関門の血管壁が急激に弱くなり、血流再開に伴い出血するリスクが非常に高い。
したがって血管梗塞治療に適用するか否か検討されるべきｔＰＡなどの血栓溶解剤は、例えば脳梗塞の場合、梗塞後６時間（好ましくは３時間）以内にその病態が確認できた場合でしか使用できないために、ほとんどが適用外となってしまう。
それに対しＰｒｏＴαは、脳梗塞のような血栓の排除に急を要する一方で必ず出血を避けなければならないような疾患に対する治療に用いることができる。すなわち、梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し、梗塞部位の障害を改善することが可能であるだけでなく、後述するように、ｔＰＡなどの血栓溶解剤を併用することができるよう、血液脳関門などの血液臓器関門の脆弱性を改善する目的でも用いることが可能なものである。

本発明における「血液臓器関門障害」とは、血液臓器関門に何らかの異常を生ずることをいう。このような異常としては、血液臓器関門における物質の選択的透過性の異常、毛細血管内皮細胞のタイトジャンクションの崩壊（細胞間隙の広がり）、毛細血管内皮細胞の減少が挙げられ、さらに血液臓器関門の機能低下に起因する障害、例えば浮腫や黄疸などが挙げられる。

本発明における「血液臓器関門障害」として具体的には、上記した血液臓器関門障害で一般的に生じる症状だけでなく、例えば血液脳関門障害に伴って生ずる、脳毛細血管内皮細胞の減少およびそれに伴う発熱、脳浮腫などの脳炎症状、記憶・学習、食欲、睡眠障害や情動性疼痛などのありとあらゆる高次脳機能障害、血圧、呼吸、消化器症状を伴う自律神経疾患、頭蓋内圧亢進症状に伴う頭痛、嘔吐、脳ヘルニアなども含まれる。また臓器が網膜の場合は、例えば中心性漿液性網脈絡膜症が挙げられる。
本発明の血液臓器関門障害改善剤は、このような血液臓器関門障害を改善し、血液臓器関門を保護するものである。

血液臓器関門の異常は、血液臓器関門周辺の毛細血管の数量や長さを確認することで発見することが可能である。
例えば血液脳関門の異常を確認する場合、大脳皮質知覚領域における毛細血管の数量や長さを通常の状態と比較する。すなわち大脳皮質知覚領域における毛細血管が少なければ、脳梗塞に伴い血液脳関門の異常が発生していると判断することができるし、大脳皮質知覚領域における毛細血管が適量であれば、血液脳関門の異常は無いものと判断することができる。毛細血管の長さや量は自体公知の方法によって判別することができるが、そのような方法としては、「生体の科学；５５（３）巻、２６６−２７２頁（森川俊一、江崎太一著）、２００４年」に記載のレクチン（例、トマトレクチン）による血管内皮細胞の染色が挙げられる。

配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＮＥＶＤＥＥ）からなるペプチドは、本発明の血液臓器関門障害改善剤、血液臓器関門障害を伴う疾患又は虚血性疾患の治療剤、神経細胞死抑制剤などの有効成分として利用することができる。

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ラットプロサイモシンαの５１番目から５６番目の６アミノ酸からなるペプチド（ＰｒｏＴα６と呼ぶ）である。当該ペプチドは、ラット由来のプロサイモシンα（配列番号８）だけでなく、ヒト由来のプロサイモシンα（配列番号６）における対応するペプチド、マウス由来のプロサイモシンα（配列番号７）における対応するペプチドなど、いずれの動物種のものも同じ配列である（図１）。

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、プロサイモシンαが有する機能、例えば血液臓器関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、神経細胞のネクローシス抑制機能、神経細胞のアポトーシス促進機能、神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）などを有するペプチドである。そして当該ペプチドは、創薬シーズへの適応をより容易にする目的で、その機能を維持しつつ、従来公知のプロサイモシンα由来のペプチドよりもさらに短小化されたペプチドである。

先に説明したとおり、本発明では、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの代わりに、配列番号１で表わされるアミノ酸配列であるか，又は配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個又は２個のアミノ酸が欠失，付加，置換，又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩であって配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと「実質的に同等の機能を有するペプチド」を使用することもできる。ここで「実質的に同等の機能を有するペプチド」とは、上記「配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」と同様の機能（ここでいう「同等の機能」とは、機能が質的に同等であることをいい、その活性/作用の強弱について述べているわけではない）、例えば血液臓器関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、神経細胞のネクローシス抑制機能、神経細胞のアポトーシス促進機能、神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）などを有し、かつ「配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列における１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換若しくは転位したペプチドが挙げられる。ここで、欠失、付加、置換若しくは転位するアミノ酸の個数は、プロサイモシンαと同様の機能を有する限り特に限定されないが、好ましくは２個以内であり、より好ましくは１個である。どのようなアミノ酸を欠失、付加、置換若しくは転位させることができるかについては、当業者であれば所望の機能や後述するペプチド修飾との兼ね合いにより適宜決定することが可能である。

ただし、本発明者は、ラットプロサイモシンαの５０番目〜５６番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチド及び５１番目〜５７番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチドも、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと同等の活性を有するが、５１番目〜５５番目のアミノ酸からなる５アミノ酸のペプチド及び４９番目〜５６番目のアミノ酸からなる８アミノ酸のペプチドでは、活性が低下することを見出している（データ示さず）。従って、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同等の機能を有するペプチドの好適な例として、１アミノ酸が付加したペプチド、具体的には、配列番号１２（５０番目〜５６番目）、配列番号１３（５１番目〜５７番目）が挙げられる。

これらのペプチドは、天然由来のペプチドでなくてもよく、自体公知のペプチド合成法によって製造することが可能である。またアミノ酸の欠失、付加、置換若しくは転位についても、自体公知の方法により行うことが可能である。

本発明のペプチドは、プロサイモシンαが有する機能、例えば血液臓器関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、ネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能など）などを有する限りにおいて、ペプチド修飾されていてもよい。

ペプチドの修飾としては、蛍光標識（例、ＦＩＴＣ化、Ｄｎｓ化、Ｎｍａ化など）、その他の標識（例、ビオチン標識など）、脂肪酸による修飾（例、ＤＨＡ修飾など）、リン酸化、スルホン化、水酸化、メチル化、アセチル化、プレニル化、パルミトイル化、カルボキシル化、アミノ基の修飾（例、アセチル化、ホルミル化、ピログルタミン酸化、アミド化、スクシニル化、ビオチニル化、Ｚ化、Ｄｎｐ化、Ｄｎｓ化、ミリストイル化など）、チオール基の修飾（例、ファルネシル化、ゲラニル化など）、糖による修飾（例、Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）含有ペプチドなど）、グリコシルホスファチジルイノシトール付加、ユビキチン化、ペプチド結合の修飾（例、還元型、スタチン型など）などが挙げられる。所望の機能を調整すべく、当業者であればこのましい修飾態様を適宜選択することが可能である。

本発明のペプチドが修飾される場合、ペプチドにおける修飾位置は特に限定されないが、ペプチド末端で修飾されることが好ましい。
ペプチド末端の修飾方法としては、上述した本発明のペプチドが有する機能を阻害しないものであれば特に限定されないが、当該機能を向上させる、あるいは本発明のペプチドの体内での分解を抑制するといった観点から、アセチル化またはアミド化であることが望ましい。本発明のペプチドをペプチド末端でアセチル化またはアミド化することによって、本発明のペプチドの機能を向上させ、あるいは体内での分解を抑制することができる。
ペプチド末端におけるアセチル化またはアミド化は、当業者であれば適切な手法を適宜選択して行うことが可能である。例えば、本発明のペプチドは、Ｎ末端がアセチル化され、かつ/又はＣ末端がアミド化されたペプチドである。最も好ましい本発明のポリペ
プチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されたペプチド（Ｎ−アセチル−Ｐ６−アミド；ｍＰ６やＦペプチドともいう）である。

本発明の「血液脳関門障害改善剤」は、本発明のペプチドを有効成分として含有してなるので、梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し、梗塞部位の障害を改善するだけでなく、さらに虚血により生じる血液臓器関門の脆弱化を改善し、血液臓器関門を保護することができる。
すなわち本発明の血液臓器関門障害改善剤は、本発明のペプチドが有する細胞保護作用によって、血液臓器関門周囲の神経組織を保護すると共に、血管障害により脆弱化した血液臓器関門をも改善し、血液臓器関門を保護することができる。したがって虚血性の疾患全般、血液臓器関門障害を伴う疾患、特に脳神経系組織における虚血性疾患、脳神経系臓器における血液臓器関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。

本発明における「血液臓器関門障害を伴う疾患」とは、血液臓器関門に異常を生ずることが知られている疾患全般や、血液臓器関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患としては、血液臓器関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になることに起因する疾患や、血液臓器関門における物質輸送が異常を来すことに起因する疾患などが挙げられる。
臓器としては、脳神経系の臓器であることが好ましい。本発明の「血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤」に含まれる「本発明のペプチド」は、特に脳神経系の血液臓器関門の障害に対し有効に機能するので、当該剤は、脳神経系の血液臓器関門障害を伴う疾患の治療に有用である。

血液臓器関門障害が、血液脳関門障害である場合、血液脳関門障害を伴う疾患の多くは脳虚血を伴う疾患であって、このような疾患として具体的には、アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害、一過性血流障害、高血圧性脳障害、頭蓋内外の動脈の塞栓症、血栓症に起因する梗塞、動脈瘤、動静脈奇形、脳動脈狭窄性病変、硬膜動静脈瘻、血管外傷、血管性腫瘍、ウィルス感染性脳炎、あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫、黄疸または出血性疾患などのほか、脳卒中、外傷性脳障害などが挙げられる。
また血液臓器関門障害が、血液網膜関門障害である場合、血液網膜関門障害を伴う疾患として具体的には、緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。
なおここでいう疾患の「治療」には、疾患を完治させる場合のみならず、病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。

本発明における「虚血性疾患」とは、虚血によって生じる様々な疾患のことをいう。虚血は血栓による動脈の梗塞や、動脈自体の狭窄など様々な原因によって生ずる。
虚血性疾患としては、脳神経系組織の虚血により生じる虚血性疾患（脳卒中、脳梗塞、脳血栓、一過性脳虚血発作など）、心臓組織の虚血により生じる虚血性疾患（虚血性心疾患；例えば心筋梗塞、狭心症など）、腸組織の虚血により生じる虚血性腸疾患（虚血性腸疾患；例えば急性腸間膜動脈閉塞症、虚血性大腸炎、腹部アンギナなど）が挙げられるが、好ましくは、脳神経系組織の虚血により生じる虚血性疾患である。

一方、本発明の「虚血性疾患の治療剤」は、血栓溶解剤と併用することで、血栓溶解剤の適用範囲を広げることができる。特に本発明の「虚血性疾患の治療剤」を血栓溶解剤と併用することで、血管梗塞に起因する虚血性疾患をより効果的に治療することが可能である。

一般に血栓溶解剤は、血管梗塞急性期であって、従来の血管構造が保たれている期間内（例えば脳梗塞の場合は、発症後３時間以内）の患者にしか使用することができず、そのため、ＣＴやＭＲＩなどで出血がない事を確認した上で用いることが求められている。これは、血液臓器関門が虚血により脆弱化するので、発症初期の血液臓器関門の構造が比較的維持されている状態でないと血栓溶解剤の効果により出血などの副作用が生じる危険性が高まるためである。したがって特に脳梗塞を始めとする脳血管障害の場合は、頭蓋内から出血がない、あるいは出血する危険性が無い状態で使用することが望まれるため、多くの脳血管障害に直面した医師は、出血の危険性を恐れて、本来使用したい血栓溶解剤を使用しない場合が多い。
しかしながら、本発明の「虚血性疾患の治療剤」に含まれる本発明のペプチドは、梗塞部位周囲の神経細胞死を抑制して臓器の恒常性を維持し、梗塞部位の障害を改善するだけでなく、さらに虚血により生じる血液臓器関門の脆弱化を改善し、血液臓器関門を保護することができる。本発明のペプチドは出血を引き起こさないので、虚血性疾患等の治療において、出血の有無を確認することなく早期に投与することが可能である。したがって、本発明のペプチド、あるいは本発明の「虚血性疾患の治療剤」を用いることにより、血液臓器関門の構造が維持され、血栓溶解剤の副作用として考えられる脆弱血管から出血するリスクが極めて低くなる。

したがって、血栓溶解剤の使用に際し本発明の「虚血性疾患の治療剤」を併用することにより、血管梗塞の発症時期に左右されること無く血栓溶解剤を用いることができる。これにより効果的に種々の虚血性疾患を治療できるようになる。特に脳虚血性疾患（例えば、脳梗塞、脳卒中など）では発症後３時間しか血栓溶解剤を用いることができなかったが、本発明の虚血性疾患治療剤との併用により、３時間が経過したとしても血栓溶解剤を使用することが可能になり、急性期における脳虚血性疾患の治療ルートの選択範囲が飛躍的に拡大する。

従って、本発明は本発明のペプチドを有効成分として含有する、虚血性疾患治療剤を提供すると共に、該虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分との組み合わせも提供する。なお、当該血栓溶解成分は、本発明の虚血性疾患治療剤の中に含まれていてもよいし、虚血性疾患治療剤とは別の血栓溶解剤として用いてもよい。

本発明の虚血性疾患治療剤と併用され得る血栓溶解剤（血栓溶解成分）としては、具体的にはｔＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ナットウキナーゼ、プロウロキナーゼ、スタフィロキナーゼ、デスモテプラーゼ、ＡＰＳＡＣなど、あるいはこれらの血栓溶解成分に由来するペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはｔＰＡである。ここで「これらの血栓溶解成分に由来するペプチド」とは、上記血栓溶解成分が有する活性をそれぞれ有し、かつ各血栓由来成分（蛋白質）全長のアミノ酸配列の一部または全部と同一のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
ｔＰＡは、市販されているものを用いてもよいし、また公知の方法で合成したものを用いてもよい。

さらに本発明の虚血性疾患治療剤は、他の公知の血管障害治療剤（血管障害治療成分）と併用して用いることができる。他の公知の血管障害治療剤としては特に限定されないが、上記血栓溶解剤の他に、例えばラジカルスカベンジャー（エダラボン）が挙げられる。

本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解剤（血栓溶解成分）との組み合わせは、（１）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを一緒に製剤化し、単剤（配合剤）として投与する方法、（２）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを別々に製剤化し、同時に投与する方法、（３）本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分とを別々に製剤化し、時間差で投与する方法（例、本発明の虚血性疾患治療剤を先に投与し、次いで血栓溶解成分を投与する）、などが挙げられるがこれらに限定されない投与方法によって、投与することができる。
併用される他の公知の血管障害治療剤の投与量は、用途や投与対象の年齢、体重、性別、疾患の程度等の要件によって適宜変更可能であるが、例えば、ｔＰＡの場合、虚血性疾患の治療に一般に使用される量を用いることができ、通常げっ歯類では約１０ｍｇ／ｋｇ、ヒトでは約０．６ｍｇ／ｋｇである。

本発明の虚血性疾患治療剤と血栓溶解成分との組み合わせでは、血栓溶解成分を使用できる期間を延長することが可能となる。かかる効果を奏するには、ヒトの場合、ｔＰＡ約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約０．９ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．６ｍｇ／ｋｇに対し、本発明のペプチドを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇの量で投与できる。マウスでは、ｔＰＡ約１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇに対し、本発明のペプチドを約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇの量で投与できる。

前述のとおり本発明のペプチドは、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、神経細胞のネクローシス抑制機能、神経細胞のアポトーシス促進機能、神経細胞の間接的アポトーシス抑制機能など）を有するペプチドであるため、本発明のペプチドを含む剤は、神経細胞死抑制剤として用いることが可能である。
よって本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する、神経細胞死抑制剤を提供する。

本発明の「血液臓器関門障害改善剤」、「血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤」、「虚血性疾患の治療剤」および「神経細胞死抑制剤」（以下、これらをまとめて「本発明の剤」と記載する場合がある）は、本発明のペプチドを公知の方法に従って薬学的に許容される担体あるいは希釈剤、さらに必要に応じて上記併用成分と混合することにより、製剤化される。
適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず、自体公知の担体あるいは希釈剤を適用することが可能であるが、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。

本発明の剤の剤型は特に限定されることなく、自体公知の投与剤型を適用可能である。しかしながら公知の臓器血管障害の治療用医薬と同様に、血管投与用の注射剤として調製されることが好ましく、特に血液脳関門障害に対する剤の場合は、脳室内投与用の注射剤として調製されることが好ましい。
より具体的には、本発明のペプチドを、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護剤として添加して調製することが可能である。また、リボソーム等の封入体にペプチドを包埋させて投与することも可能である。

本発明のペプチドを上述した疾患の治療に用いるとき、有効成分としての本発明のペプチドの用量は特に限定されず、対象の年齢、体重、病状、および投与経路、その他の要素により異なるが、投薬する医師などが容易に適宜決定することができる。

本発明のペプチド、あるいは本発明の剤の投与方法は特に限定されず、現在実際に行われている様々な投与方法を採用することができる。このような投与方法の一例として、大槽内投与を挙げることができる。大槽内投与は、脳実質を傷つけないという点で有利である。また非経口投与（例えば、血管内投与（例、静脈内投与）、脳室内投与など）、経口投与などにより投与してもよい。

本発明のペプチドを全身投与、例えば静脈内投与する場合、１日の投与量は、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇである。また、本発明のペプチドを局所投与、例えば硝子体内投与する場合、１回の投与量が約０．１ｐｍｏｌ〜２０ｐｍｏｌ、好ましくは約１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌとなるように投与する。

本発明の治療剤の好ましい態様は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤である。実施例により実証されたとおり，本発明のペプチド又はその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害や脳出血を防止できる。このため，たとえば，本発明のペプチドまたはその塩と，血栓溶解剤とを併用することで，血栓溶解剤により惹起される運動障害や脳出血を防止できる。

本発明の治療剤の好ましい態様は，本発明のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，脳虚血性疾患用治療剤である。本発明のペプチドまたはその塩は，血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血を治療又は予防できるので，血栓溶解剤との併用が有効である。この側面において，好ましい血栓溶解剤は，プラスミノーゲンアクチベータである。さらに，この側面において，好ましい適応症は脳梗塞である。この側面において，本発明のペプチドまたはその塩と血栓溶解剤とは，対象となる患者に同時に投与されても良い。また，本発明のペプチドまたはその塩が対象に投与された後，３０分から５時間以内（又は１時間から３時間以内）に血栓溶解剤が投与されるものであってもよい。血栓溶解剤は，様々な副作用を惹起する場合がある。例えば，脳梗塞の疑いがある患者に対し，本発明のペプチドまたはその塩を投与することで，血栓溶解剤を投与する時間的余裕を多くすることができる。このため，精密検査を行って脳梗塞であると判明した後に，血栓溶解剤を投与できることとなる。

本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチド（配列番号１で表わされるアミノ酸配列，又は配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個又は２個のアミノ酸が欠失，付加，置換，又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩）を，血液脳関門障害を伴う疾患を治療するために有効な量投与する工程を含む，血液脳関門障害を伴う疾患の治療方法をも提供する。

血液脳関門障害を伴う疾患の例は，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，及び脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患である。

本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチドを脳梗塞の治療に有効な量投与する工程を含む，脳梗塞の治療方法をも提供する。

本発明は，対象（例えばヒト）に，本発明のペプチド及び血栓溶解剤を脳虚血性疾患の治療に有効な量投与する工程を含む，脳虚血性疾患の治療方法をも提供する。血栓溶解剤の例は，プラスミノーゲンアクチベータである。この方法は，特に脳梗塞の治療に有効である。すなわち，血栓溶解剤と本発明のペプチドを併用することで，血栓溶解剤の治療可能時間を延長することができ，さらに血栓溶解剤による運動機能低下を防止できる。本発明のペプチド及び血栓溶解剤は，対象に同時に投与されてもよい。一方，たとえば，脳卒中の疑いがある場合に，本発明のペプチドを取り急ぎ投与し，その後３０分から５時間以内（又は１時間から３時間以内）に，検査結果に基づいて血栓溶解剤を対象に投与してもよい。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

［実施例１］Ｐ６の探索
特許文献２で既に特定したペプチド9（＝ProTα9）の誘導化を目指し、アミノ酸配列を前後させる、あるいはN末端およびC末端を欠損するなどした11種類のペプチドの効果を評価した。活性評価は網膜虚血モデルにおける一週間後のERGを指標とした。結果を図２に示す。図中のP1-9はペプチド9を示し、+1N/-1Cはペプチド9の配列のN末端側に1アミノ酸付加、C末端側を1アミノ酸削除したことを示す。
ラットプロサイモシンαの５０番目〜５８番目のアミノ酸からなる９アミノ酸のペプチド(P+2N/-2C)及び５１番目〜５７番目のアミノ酸からなる７アミノ酸のペプチド（P+1N/-3C）も、５１番目〜５６番目のアミノ酸からなるペプチド（P+1N/-4C）と同等の活性を有するが、５１番目〜５５番目のアミノ酸からなる５アミノ酸のペプチド（P+1N/-5C）及び４９番目〜５７番目のアミノ酸からなる９アミノ酸のペプチド（P+3N/-3C）では活性が低下した。従って、最短でかつ活性を維持しているペプチド配列として配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドP6（P+1N/-4C；即ちProTα6）を見出した。

図１Ｂは，本発明と関連するペプチドを示す図である。図１Ｂに記載されるラットプロサイモシンα（１−１１２）は，配列番号９で示される配列を有する全長ラットプロサイモンシンαである。Ｃ−端ラットプロサイモンシンαは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて１０２番目から１１２番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ３０は，配列番号１０で示されるＰｒｏＴα３０（配列番号９で示される配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて４９番目から７８番目のアミノ酸配列を有するペプチド）である。Ｐ１−９は，配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（Ｐ９ペプチド，ＰｒｏＴα９）である。ＰｒｏＴα９は，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて５２番目から６０番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ２−９は，ＰｒｏＴα９の２番目から９番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ３−９は，ＰｒｏＴα９の３番目から９番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ３−９は，ＰｒｏＴα９の３番目から９番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ１−８は，ＰｒｏＴα９の１番目から８番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ１−７は，ＰｒｏＴα９の１番目から７番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ１−６は，ＰｒｏＴα９の１番目から６番目のアミノ酸配列を有するペプチドである。Ｐ＋１Ｎ／−１Ｃは，ＰｒｏＴα９に比べてＮ末端の方に１つ戻るとともにＣ末端の方も１つ戻った配列（配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて５１番目から５９番目のアミノ酸配列）を有するペプチド（配列番号３０で示されるペプチド）である。
Ｐ＋２Ｎ／−２Ｃは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて５０番目から５８番目のアミノ酸配列）を有するペプチド（配列番号３１で示されるペプチド）である。Ｐ＋３Ｎ／−３Ｃは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて４９番目から５７番目のアミノ酸配列）を有するペプチド（配列番号１３で示されるペプチド）である。Ｐ＋１Ｎ／−３Ｃは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて５１番目から５７番目のアミノ酸配列）を有するペプチド（配列番号３２で示されるＰ７ペプチド）である。Ｐ＋１Ｎ／−４Ｃは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて５１番目から５６番目のアミノ酸配列）を有するペプチド（Ｐ６ペプチド：配列番号１で示されるペプチド）である。Ｐ＋１Ｎ／−５Ｃは，配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する全長ラットプロサイモンシンαにおいて５１番目から５５番目のアミノ酸配列）を有するペプチドである。

これらの中で，Ｐ＋１Ｎ／−１Ｃ（配列番号３０），Ｐ＋２Ｎ／−２Ｃ（配列番号３１），Ｐ＋１Ｎ／−３Ｃ（配列番号３２），及びＰ＋１Ｎ／−４Ｃ（配列番号１）が高い網膜虚血障害保護作用を有していた。

［実施例２］網膜虚血誘発網膜機能障害に対するプロサイモシンα由来ペプチドの抑制効果
ＥＲＧでは、光照射から視神経（神経節細胞）に至る活動を評価することができる。角膜の後極に対する電位差は＋２〜１７ｍＶであるが（網膜の静止電位）、光刺激後、１５ｍｓｅｃの潜時で内向きの電圧変化ａ−ｗａｖｅ（ａ波）が生じ、その後外向きの電圧変化ｂ−ｗａｖｅ（ｂ波）が生じる。ａ波は外顆粒層（視細胞）の働きを反映し、ｂ波は内顆粒層から神経節細胞層までの機能を反映している。ａ波及びｂ波は、虚血処理の１週間後の時点ではほぼ完全に消失し、電位は平坦なものになる。ａ波及びｂ波の消失は、網膜虚血障害により網膜機能が低下したことを示す。神経保護タンパク質であるプロサイモシンα １ｐｍｏｌ（ＰＢＳ溶液中）を虚血の２４時間後に硝子体内に注入すると、その内向き、外向きの電流がほぼ完全に回復することが知られている（非特許文献４（Ｆｕｊｉｔａｅｔａｌ．、ＣｅｌｌＤｅａｔｈａｎｄＤｉｆｆｅｒ，２００９））。
ＥＲＧ（Ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ；網膜電位図）を用いて、虚血処理後の網膜虚血障害に対する各プロサイモシンα由来ペプチド（即ち、ＰｒｏＴα３０（ラットプロサイモシンαの４９番目〜７８番目のアミノ酸からなるペプチド；配列番号１０）、ＰｒｏＴα９（ラットプロサイモシンαの５２番目〜６０番目のアミノ酸からなるペプチド；配列番号１１）、ＰｒｏＴα６、及びＰｒｏＴα６のN末端をアセチル化しC末端をアミド化したペプチド（それぞれ、Ｐ３０、Ｐ９、Ｐ６およびmP6と略記する）の効果を測定した。虚血処理は、マウス前眼房に１３０ｍｍＨｇの水圧を４５分間適用することにより行った。網膜電位の測定は、虚血処理の１週間後に行った。虚血処理の１週間後、マウスを３時間暗順応させた。その後光を短時間照射し、角膜に装置した電極を用いて静止電位の変化を測定した。
本実施例では、プロサイモシンαの部分ペプチドＰ３０及びＰ９（特許文献２）、並びにＰ６及びＰ６の誘導体であるｍＰ６（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｐ６−ａｍｉｄｅ）を、虚血の２４時間後に硝子体内に投与した。
結果を図３に示す（左図：ａ波；右図：ｂ波）。縦軸は電圧の変化分を示し、横軸は各ペプチドの投与量（ｐｍｏｌ）を示す。図３から明らかなように、Ｐ３０とＰ６は、１〜１０ｐｍｏｌの濃度範囲ではほぼ同等の優れた網膜虚血障害抑制効果を示した。Ｐ９の活性はＰ３０及びＰ６よりむしろ弱く、同等の効果を得るのに６倍程度高い濃度が必要であった。さらに、Ｐ６ペプチドの末端修飾誘導体ｍＰ６は、Ｐ３０やＰ６よりも高い効果を有しており、Ｐ６よりも４倍低い濃度でも同等の網膜虚血障害抑制効果を示した。

［実施例３］網膜虚血誘発MMP活性上昇に対するP6およびP6誘導体の抑制効果
タイトジャンクションタンパク質オクルディンは、虚血により発現が上昇するメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって分解されることが知られている（J Cereb Blood Flow Metab, 2007. 27(4): p. 697-709）。特にＭＭＰ−９は、虚血による血液臓器関門破綻において中心的な役割を担うと考えられている（J Cereb Blood Flow Metab, 2000. 20(12): p. 1681-9）。
MMP-9の発現レベルは通常低いが、虚血による様々な刺激により発現が誘導される。MMP-9の活性をゼラチンザイモグラフィーで評価したところ、網膜虚血により12時間後のproMMP-9の活性は著しく上昇するが、網膜虚血3時間後にP6 10 pmolを硝子体内投与した場合、虚血によるproMMP-9活性上昇を半分程度抑制した。
P6のC末端をアミド化したP6-NH₂も同様に10 pmolでproMMP-9活性を半分以下に抑制した。また、P6のN末端をアセチル化、C末端をアミド化したmP6は1 pmolでP6と同等の効果を示した。
MMP-2は恒常的に発現しているが、網膜虚血により著しく活性が上昇した。MMP-2に関してもproMMP-9と同様にP6誘導体ペプチドを投与した場合、活性は抑制された（図４）。

［実施例４］ｔＭＣＡＯ（一過性中大脳動脈閉塞）虚血モデルマウスにおけるＰ３０及びＰ６の効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの左中大脳動脈を梗塞して作成した脳虚血モデルマウスを１時間維持し、次いで再灌流した。再灌流の１時間後にＰ３０（１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ）又はＰ６（１ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内投与し、その後２４時間毎にマウスの経過を観察して運動機能及び生存を評価した。運動障害を表す臨床スコアは以下の５段階で評価した：１：右前肢を完全に伸長することができない、２：右方向への旋回行動、３：体勢を保てず右方向に傾く、４：自発運動の消失、５：死。

図５中、白の四角で示したデータは、１ｈｔＭＣＡＯの１ｈ後に、ＰＢＳ中０．１％のＤＭＳＯ（ビヒクル）を尾静脈に１００μＬ／１０ｇ投与した時の値を示す。マウスを１４日間毎日評価したところ、平均して６日後にほぼ最大の臨床スコアの悪化を示し、ほぼ全てのマウスが死亡した（ｎ＝９）。上のグラフの黒丸及び黒の菱形は、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇのＰ３０の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の結果を示し、下のグラフの黒丸は、１ｍｇ／ｋｇのＰ６の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の結果を示す。
図５から明らかなように、３ｍｇ／ｋｇのＰ３０投与では、有意な保護効果が観察され、臨床スコアは平均２程度に低下したが、１ｍｇ／ｋｇでは保護効果が低く、８日目以降にはスコアが平均して４程度であった。これに対し、Ｐ６は１ｍｇ／ｋｇでも臨床スコアが平均２程度に低下し、有意な保護効果を有することがわかる。１ｍｇ／ｋｇのＰ６は、３ｍｇ／ｋｇのＰ３０とほぼ同等の有効性であった。

図６の上段は、図５の虚血後７日目の結果を棒グラフで示したものであり、下段左は１４日間の臨床スコアの累積をＡＵＣ（ＡｒｅａＵｎｄｅｒＣｕｒｖｅ）として表したグラフである。

図６の下段右は、Ｐ６（１ｍｇ／ｋｇ）の投与タイミングを変えたときの（１ｈのｔＭＣＡＯの１時間後、２時間後、３時間後）、１４日間の臨床スコアの累積をＡＵＣとして示すグラフである。Ｐ６を２時間後に投与した場合には１時間後に投与した場合よりも保護効果が若干低くなったものの、同濃度のＰ３０とほぼ同等の保護効果を示していた（下段左と比較されたい）。
1時間のｔＭＣＡＯ、再灌流の２時間後は、実際の脳卒中発生の３時間後に相当する。つまりＰ６は、脳卒中で倒れてから３時間後に投与しても、脳卒中に対する十分な保護効果を奏すると言える。

［実施例５］Ｐ６ペプチドの血液脳関門障害改善効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（雄性、体重２１〜２６ｇ）の左中大脳動脈を梗塞による脳虚血を１時間維持し、次いで再灌流した。再灌流の０．５時間後及び３時間後の２回、ｖｅｈｉｃｌｅまたはＰ６（０．１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、さらに再灌流２４時間後にペントバルビタール５０
ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することにより全身麻酔を施し、処置マウスを３７℃に保温したベッドの上に静置し、ＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍＬのビオチン化トマトレクチン（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ番号０４８Ｋ３７８６）１００μＬを２〜３分かけてゆっくりと静脈内投与した。５分後パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により全身を灌流固定し、脳を取り出し、室温にてさらに３時間４％ＰＦＡ処置した。その後２５％蔗糖液に入れ４℃で一晩なじませた。脳はＯＣＴコンパウンドにより凍結包埋し、大脳皮質知覚領Ｓ１（ＣＳ１）やＳ２（ＣＳ２）を含む面で５０μｍの厚さの切片を作製し、シランコーティングされたスライドガラス上で貼付し、一晩ヒーター上で乾燥させた。その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８でラベルされたストレプトアビジン（２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ液にて３００倍希釈）を用いてトマトレクチンの蛍光染色を行い、その後蛍光退色防止剤であるＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（日本ターナー株式会社）で固定し、一晩暗所静置し、後に共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ５ＰＡＳＣＡＬ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で観察した。蛍光シグナルはデコンボリューション法により、およそ３０μｍの範囲の蛍光全量を積算解析した。

切片全体を観察したとき、Ｐ６投与群は対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較して組織損傷は軽微であった（図７の上段左右）。上段の写真中、ｃｏｎｔｒａ側（ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ）（即ち動脈非梗塞側）の番号１〜３で示した部分とそれに対応するｉｐｓｉ側（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ）（即ち動脈梗塞側）の部分１〜３について、それぞれの拡大図をその下に示している。
対照群マウスでは、大脳皮質の虚血中心部コア（ｃｏｒｅ）と線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）の領域では、ｃｏｎｔｒａに比べｉｐｓｉで血管密度が減少していたが、Ｐ６投与群では、ｃｏｒｅ及びｓｔｒｉａｔｕｍで血管密度の改善が見られ、ｉｐｓｉでもｃｏｎｔｒａと同程度の染色結果が得られた。ｓｔｒｉａｔｕｍでの血管保護作用が特に顕著であった。

［実施例６］Ｐ６のtPA誘発性運動障害抑制効果
４時間のtMCAOを行い、１日後の臨床スコアと死亡率を評価した（図８）。Vehicle、tPA 10 mg/kg、tPA+P6 1 mg/kgは再灌流直前に尾静脈投与した。４時間のｔMCAOは、虚血性疾患の発症後３時間以降に相当する。tPA処置によりVehicle群と比較して運動障害は悪化したが、tPAとP6を併用すると有意に抑制された（左図）。
また、虚血1日後の死亡率を評価した結果、Vehicle投与群では8.3%しか死亡しないのに対し、tPA投与群では35.7%のマウスが死亡した。しかしながら、tPAとP6を併用すると全てのマウスが生存した。

［実施例７］
脳梗塞治療薬
配列番号１で表わされるアミノ酸配列，又は配列番号１で表わされるアミノ酸配列から１個又は２個のアミノ酸が欠失，付加，置換，又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩を公知の方法により合成した。得られたペプチドは，２２種類であった。２２種類のペプチドには，配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩が含まれていた。tPAは，協和発酵キリン株式会社（東京，日本）より購入した。配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド及びその塩を，それぞれＰ６，Ａペプチド，Ｂペプチド，Ｃペプチド，Ｄペプチド及びＥペプチドとした。

実験動物
本実験で使用したＣ５７／ＢＬ６Ｊ系雄性マウス６〜９週齢（１９〜２８ｇ）は，恒温（２２±２℃）の部屋で１２時間毎の昼夜自然管理下において飼育し，水道水及び一般動物用固形飼料（MF, オリエンタル酵母，東京，日本）を自由に摂取させた。以下に示す全ての実験は，長崎大学動物実験指針で定める方法に準じて行った。

網膜虚血モデル
ペントバルビタール７５ｍｇ／ｋｇをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。３７℃Cの恒温台の上にマウスを置き，体温を維持する。硝子体を1%の硫酸アトロピンで散瞳させ，無菌眼内潅流溶液（BSS PLUS dilution buffer; Alcon, Fort Worth, TX, USA）の容器を予め水面がマウスの眼より135.5 cm（100 mmHg）の高さになるようにつり上げておき，灌流溶液を小児用輸液セットに接続した33Gの注射針を針先から少し垂らしながら前眼房に刺入し固定した。前房に針を刺入した後，灌流系を解放することにより前眼房内に圧力（100 mmHg）を45分間負荷した（マウス正常眼圧は15 mmHg程度）。これらの操作は実体顕微鏡下で行い，眼圧の上昇により網膜虚血が惹起されていることを網膜内血流の遮断を指標に目視にて確認した。虚血負荷終了後に注射針を抜き，眼圧を低下させることにより網膜を再灌流させた。モデルは虚血-再灌流法を用いた一般的緑内障モデルであり，既存の緑内障治療薬であるアンジオテンシン変換酵素阻害薬の全身投与により神経保護効果を示すこと等が知られている。

ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色による組織障害評価
標本作製：ペントバルビタール50 mg/kgをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。心臓からK+ free PBS 40 mlを灌流して脱血し，4% PFA 30 mlを灌流して固定した。マウスから眼球を取り出し，室温で3時間，4% PFAで浸漬固定した。25%
スクロースに置換し，8時間以上組織が沈むまで４度Ｃでインキュベーションした。その後，組織表面の水分を拭き取った後，OCTコンパウンドで包埋した。凍結ミクロトームCM1900で10μM厚切り切片を作成し，シランコーティングしたスライドガラスに張り付けた。ヒーターの中で一晩乾燥させた。

HE染色：検体の細胞核をギルヘマトキシリン液にて染色し，洗浄後0.2% 塩酸・70%エタノールにて分別を行う。分別液を洗浄し，95%エタノールにて検体を親和させる。組織をエオジン・フロキシン液にて対比染色する。エタノールにて分別・脱水を行った後，キシレンにて透徹した。検体は封入した後，BIOZERO顕微鏡（KEYENCE，大阪，日本）にて観察を行った。

網膜電位図（Electroretinogram: ERG）による網膜機能の評価
マウスを暗室にて3時間暗順応させた後，ペントバルビタール50 mg/kgをマウス腹腔内に投与し麻酔をかけた。1% アトロピン点眼にて瞳孔を開かせた後，コンタクト電極（KE-S; Kyoto contact lenses，京都，日本）を角膜先端に設置し，鉄電極を眼近傍に設置した。皮下プラチナ針電極は，腹部に設置した。ERGはSLS-3100 (日本光電，東京，日本)にて20Jの閃光にて誘発させ，MEB-9104
(日本光電) にて2分ごとに30分間計測した。バックグラウンド補正は，通常時の明時における反応を2分ごとに20分間計測したものを使用した。計測されるa波，b波の増幅は，Neuropack（日本光電）にて定量した。

一過性中大脳動脈閉塞（tMCAO）モデル
マウスを3% イソフルラン（エスカイン（登録商標），マイラン製薬株式会社，東京，日本）で麻酔をかけた（Small animal anesthetizer MK-A100，室町機械株式会社，東京，日本）。摂氏３７度の恒温台（池本理化学株式会社，東京，日本）の上で咽頭部位の皮膚を鋏で2 cmほど縦に切る。硬質絹糸（硬質8号，夏目製作所）で皮を右側に引っ張り，視野を確保した。実体顕微鏡を使い，結合組織，神経などを剥離しながら気管左に位置する左総頸動脈を硬質絹糸で確保する。総頸動脈を上方へ辿ると内頸動脈と外頸動脈に分かれるので，左手前側の外頸動脈を二か所，軟質絹糸で硬く結び，間を切る。内頸動脈から上部に伸びる細い血管を軟質絹糸で確保する。軟質絹糸と硬質絹糸を強く引っ張り血流を止めて，内頸動脈に鋏で切りこみを入れる。そこから塞栓子を1から1.5 cm挿入し，中大脳動脈を閉塞する。内頸動脈を塞栓子ごと軟質絹糸で結び，塞栓子を固定した。引っ張っている硬質絹糸の下に軟質絹糸を通し，硬質絹糸の手前で総頸動脈を結んでから硬質絹糸を外す。軟質絹糸で胸を2か所縫合する。本課題の一過性中大脳動脈閉塞モデル（tMCAO）の場合，1時間，または4時間後に再び摂氏37度の恒温台の上でマウスに3% イソフルランで麻酔をかけ，胸を縫合した軟質絹糸をほどき，胸を開ける。内頸動脈を結んでいた軟質絹糸を緩め，塞栓子を抜去し，すぐに再び内頸動脈を結んだ。

血栓性脳梗塞（Photochemically-induced thrombosis:
PIT）モデル
マウスを3% イソフルラン（エスカイン（登録商標），マイラン製薬株式会社，東京，日本）で麻酔をかけた（Small animal anesthetizer MK-A100，室町機械株式会社，東京，日本）。術中は、2.5% イソフルランで麻酔効果の維持を行った。摂氏37度の恒温台（池本理化学株式会社，東京，日本）の上で左耳と左眼の間の皮膚を5-6 mm切開した。側頭筋縁に沿って眼科用ハサミを入れ、頭蓋骨と側頭筋の付着部を切開し、側頭筋下の中大脳動脈領域の頭蓋骨を露出した。軟質絹糸で四方向に皮膚および側頭筋を引っ張ることで視野を確保した後，実体顕微鏡下にて中大脳動脈領域の頭蓋骨にドリルで約1.5 mm径の小孔を開けた。ローズベンガル（Wako）30 mg/kgを尾静脈内投与し，直後にUVスポット光源（L-4887-13；浜松ホトニクス，静岡，日本）に接続したライトガイド（A4888；浜松ホトニクス，静岡，日本）の先端部を，硬膜下に確認される遠位中大脳動脈に垂直に充て緑色光を10分間照射した。その後，中大脳動脈が変化（細くなる or 血赤色が薄くなる）していることを確認した後，側頭筋を戻し，皮膚を軟質絹糸にて縫合した。

神経学的スコアリング
脳虚血に伴う運動機能障害の程度を評価するため，以下の定義による神経学的スコア（Clinical
Scores）を用いた。また，1〜4の各数値は2段階評価とした（スコア1と2を示すなら，1.5とした）。
1：右前肢の運動機能障害，2：一方向性の行動をとる，3：体勢を保てず傾く，4：自発運動の消失，5：死亡

TTC染色による脳梗塞領域評価
PBS（phosphate-bufferd saline）をビーカーに全脳が浸かる程度，また24穴プレートに500 μLずつ分注し氷冷する。2% TTC（2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride）溶液を作成する。脳組織を摘出し，ビーカー内で氷冷しておいたPBSで洗浄する。予め氷冷しておいたブレインスライサー（室町機械株式会社，東京，日本）上に脳組織を設置し，剃刀を用いて厚さ1mmの冠状断面の脳切片を6枚作成する。作成した脳切片の範囲はBregmaから前方に2mmから後方に3mmの位置までとする。脳切片は速やかに24穴プレートに氷冷したPBS内に1枚ずつ浸し，2% TTC溶液に置換する。その後遮光して室温で15〜20分間インキュベートした後，4% PFAで固定し観察を行った。

統計処理
独立した2群間については，F-testによる分散分析後にStudent’s t-testを用いて有意差検定を行った。多群間解析については，One-factor ANOVA，repeated measure ANOVAによる分散分析後にDunnett’s testを用いて有意差検定を行った。

網膜虚血モデルにおける評価と活性ペプチドスクリーニング
網膜虚血モデルにおける硝子体内投与処置における評価は，眼内という閉鎖系であることから網膜の厚みを測定する組織化学的解析，網膜電位図 (ERG)による機能解析は，高い再現性と高感度性を有する。このことから，研究責任者らは，実際in vivo解析である本モデルをin vitro類似解析と位置づけ，プロサイモシンαアミノ酸配列を基に活性ドメインの探索を行い，6アミノ酸（基本ペプチドP6）までの絞り込みに成功した。

基本ペプチドＰ６の保護効果
図９は，基本ペプチドＰ６の網膜虚血障害保護効果を示すための染色された網膜を示す図面に替わる写真である。図１０は，対照，ＤＭＳＯ投与，Ｐ６を１眼当たり１ｐｍｏｌ，３ｐｍｏｌ，及び１０ｐｍｏｌ投与した場合の網膜の厚さ及び網膜電位図である。図１０Ａは，網膜の厚さを示すグラフである。図１０Ｂは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１０Ｃは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図９から，例えば，Ｐ６を３ｐｍｏｌ／目以上投与した場合網膜虚血モデルにおいて組織障害を抑制し，Ｐ６に組織保護作用があることがわかる。なお，網膜虚血モデルにおいて，基本ペプチドＰ６(NEVDEE)は，10 pmol/eyeの硝子体内投与でほぼ完全な組織障害を抑制したERGによる機能解析においては3 pmol/eyeから用量依存的な保護効果を示すことが明らかとなった（図９，図１０）。

活性ペプチドスクリーニング
P6のアミノ酸配列を基に，アミノ酸改変体，N末端のアセチル化，C末端のアミド化等の修飾体スクリーニングペプチドを21サンプル作製し，網膜虚血モデルにおけるERG解析にて評価を行った。P6の10倍活性の高い1
pmol/eyeを目標値と設定しており，本用量でスクリーニングを行ったところ，14サンプルがP6と比較して高活性を示しポジティブとした（図１１）。図１１は，様々なペプチドの網膜電位の値を示すグラフである。図１１Ａは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図中のアンダーラインを付けたペプチドは左からそれぞれ、基本ペプチドP6誘導体F,H,I, J, L, K, C, M, A, N, O, D, B, P,
Q, R, S, T, U, E, Gペプチドである。図１１Ｂは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。

高活性ペプチドセレクション
ポジティブペプチドから，より高活性のペプチドを抽出するため，用量0.1
pmol/eyeにおける保護効果をERG機能解析にて評価した（図１２）。図１２は，様々なペプチドの網膜電位の値を示すグラフである。図中１−１４はそれぞれ基本ペプチドP6誘導体（C, M, A, N, O, B, P, Q, E, G, U, D, T,
S)ペプチドに相当する。図１２Ａは，ａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１２Ｂは，ｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。

図１２から，１眼当たり０．１ｐｍｏｌ投与において，14サンプル中5サンプルがほぼ完全な保護活性を有することがわかる。この投与量での保護効果はプロサイモシンαに比べ著しく高い。

これら５種の高活性ペプチドを以降の脳虚血モデル解析における最優先ペプチドとして位置づけた。

図１２におけるA-Dのペプチドの配列と修飾は，P6と比較しても単純なものである。これらの配列を表１に示す。Ｂペプチド及びＤペプチドは，Ｎ末端がリン酸化されており，ＥペプチドはＣ末端がアミド化されている。

［実施例８］
tMCAOモデルにおける評価
基本ペプチドＰ６活性の運動障害保護効果
P6はtMCAOモデル（60 min虚血）において長急性期に相当する虚血1時間後静脈内投与で運動障害に対し保護効果を有することを評価した。図１３Ａは，tMCAOモデルにおける評価工程を示す。図１３Ｂは，評価スコアを示す。図１３Ｃは，６０分のtMCAOを行った後の評価スコアの変遷を示す。図１３Ｄは，対照，1時間のｔＭＣＡＯ後、それぞれさらに１，２，３時間後に１ｍｇ／ｋｇのP６を投与し、１‐１４日後の間の運動障害を評価したスコアを示す。虚血1時間後静脈内投与で運動障害に対し保護効果を有することは，例えばＰ６を1mg/kgで投与した場合について確認できた（図１３）。

その結果，Ｐ６は，１時間虚血，１時間後１ｍｇ／ｋｇ投与において顕著な運動障害に対する改善作用が確認できた。

活性ペプチドの運動障害保護効果
高活性プロトタイプペプチドの評価については，有効用量の低下，もしくは有効濃度域の拡大（用量依存性）について評価を行った。図１４Ａは，tMCAOモデルにおける評価工程を示す。図１４Ｂは，Ａペプチドを静脈内投与した場合のtMCAOモデルでの運動障害評価スコアの変遷を示す。図１４Ｃは，Ｂペプチドを静脈内投与した場合のtMCAOモデルでの運動障害評価スコアの変遷を示す。Ａペプチド及びＢペプチドは，虚血後1時間後処置にて，濃度依存的な運動障害保護効果を示した（1-10 mg/kg）。

図１４Ｂから，Ａペプチドは，３mg/kgで最大保護効果を示すことがわかった。一方，図１４Ｃから，Ｂペプチドは，１０ mg/kgで最大保護効果を有することをがわかった。Ｃペプチド，Ｄペプチド及びＥペプチドも同様に運動障害保護作用を検討した。その結果，これらのペプチドは，Ａペプチド及びＢペプチドほどの運動障害保護作用を示さないことがわかった。

網膜虚血において高活性を有していたＡペプチド〜Ｅペプチドが，脳虚血においては保護活性が高いＡ及びＢペプチドと保護活性の高くないＣ〜Ｅペプチドに大別された。更に，ＡペプチドとＢペプチドにも活性差が認められたこのため，この差異が硝子体内投与と静脈内投与という投与方式の差であると予想し，網膜虚血においてＡペプチドとＢペプチドの静脈内投与による保護効果を検討した（図１５）。図１５は，ＥＲＧ機能解析の結果を示すグラフである。
図１５Ａは，Ａペプチド又はＢペプチドを網膜虚血後２４時間に１０ｍｇ/ｋｇ静脈内したときのａ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。
図１５Ｂは，Ａペプチド又はＢペプチドを網膜虚血後２４時間に１０ｍｇ/ｋｇ静脈内したときのｂ−波を用いた網膜電位の値を示すグラフである。図１５Ａ及び図１５Ｂから，ERG機能解析にて評価したところ，予想通りＡペプチドが高活性を有することが明らかとなった。

［実施例９］
tPA副作用：脳出血に対する活性ペプチドの抑制効果
次に，P6の血管系に対する効果について着目した。脳梗塞治療薬として使用される血栓溶解剤tPAは，急性期における処置では梗塞自体を消失させることから有用である。しかし，副作用として脳出血を惹起することから，ｔＰＡを投与する際に画像診断が必要であり，更に虚血後3時間以内に投与する必要がある。そこで，P6，及びペプチド5サンプル（A-E）のtPA誘発性の副作用抑制効果の有無について解析を行った。tPAによる脳出血を有意に誘発させることを目的として，虚血4時間処置後に10 mg/kg tPAを処置し，再還流を行う系を用いた。

図１６Ａは，ＭＣＡＯ虚血4時間後にP６単独あるいはP６とｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図１６Ａには，対照，Ｐ６を１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与，ｔＰＡのみ（対照），ｔＰＡとＰ６を１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与した際の写真が示されている。図１６Ｂ，１６ｃは，ｔＰＡ併用によるプロトタイプペプチド5サンプルの多様な活性を示すグラフである。図１６Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＰ６単独あるいはＰ６とｔＰＡの併用時の虚血後24時間での運動障害評価スコア（ＣｌｉｎｉｃａｌＳｃｏｒｅ）を定量的解析したものである。図１６Ｂは対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、Ｐ６を、１，３，１０ｍｇ／ｋｇ投与、ｔＰＡ単独対照、ｔＰＡとＰ６を１，３，１０ｍｇ／ｋｇ同時投与した際のスコアを示す。図１６Ｃは，１６Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＰ６単独あるいはＰ６とｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を定量的解析したものである。図１６Ｃは対照、Ｐ６を、１，３，１０ｍｇ／ｋｇ投与、ｔＰＡ単独対照、ｔＰＡとＰ６を１，３，１０ｍｇ／ｋｇ同時投与した際のスコアを示す。図１６Ｃから，ｔＰＡ誘発性の運動障害の増悪と脳出血については，１ｍｇ／ｋｇのＰ６の併用により抑制するが，用量を増加するとその抑制効果は濃度依存的に減少した。

［実施例１０］
Ｐ６の結果を基に１０ｍｇ／ｋｇ投与において，ｔＰＡの副作用を抑制するか否かをプロトタイプペプチド5サンプル（Ａ〜Ｅペプチド）について解析を行った。図１７Ａは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。Ｄペプチド及びＥペプチドを投与した場合はマウスが死亡した。これは，Ｄペプチド及びＥペプチドの適正量が１０ｍｇ／ｋｇより小さな値であったことによると考えられる。

図１７Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥペプチドとｔＰＡの併用時の虚血後２４時間後の運動障害評価スコアを定量的解析したものである。図１７Ｂは対照、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅペプチドを１０ｍｇ／ｋｇとｔＰＡと静脈内同時投与した際のスコアを示す。図１７Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後にＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥペプチドとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を定量的解析したものである。図１７Ｃは対照、ｔＰＡ単独対照、ｔＰＡとＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅペプチドを１０ｍｇ／ｋｇ同時投与した際のスコアを示す。。Ａペプチドは，ｔＰＡ誘発性の副作用である運動障害増悪と脳出血のいずれも有意に抑制した。Ｂペプチドは，運動障害を抑制する傾向にあったが，脳出血については無影響であった。Ｃペプチドは，いずれの副作用にも効果を示さなかった。Ｄペプチド及びＥペプチドは，体全てのマウスが死亡した。Ｐ６が血管系に作用を有することから，Ｄペプチド及びＥペプチドは，血管系への何らかの作用が増強している可能性が示された。

［実施例１１］
ｔＰＡのいずれの副作用も抑制したＡペプチドについて，本抑制効果の用量依存性について検討を行った。４時間の中大脳動脈閉塞によるｔＭＣＡＯモデルを作成し，再灌流直後にｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｐ6: Ａ（Ａペプチド）の溶媒であるＰＢＳをｉ.ｖ.投与したＶｅｈｉｃｌｅ投与群、Ａペプチドを１，３，１０ｍｇ/ｋｇ (i.v.)投与したＡペプチド単独投与群、10 mg/kgのtPAをi.v.投与したｔＰＡ単独投与群、１０ｍｇ/ｋｇのｔＰＡとともにＡペプチドを1, 3, 10 mg/kg (i.v.)投与した併用投与群の計８群におけるｔＭＣＡＯ処置２４時間後の運動障害、ならびに虚血処置２４時間後に凍り非やＰＢＳを用いた還流により血液を序去し、灌流により除去できなかった脳組織内の血液を脳血管の破綻による出血とし、脳出血評価を実施した。

図１８Ａは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後に１，３，１０ｍｇ／ｋｇのＡペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を示す写真である。図１８Ａには，対照，Ａペプチドを１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与，ｔＰＡのみ（対照），ｔＰＡとＡペプチドを１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与した際の写真が示されている。

図１８Ｂは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後に１，３，１０ｍｇ／ｋｇのＡペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの静脈内併用投与時の虚血後24時間での運動障害評価スコア (Clinical Score)を定量的解析したものである。図１８Ｂは，対照，Ａペプチドを１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与，ｔＰＡのみ（対照），ｔＰＡとＡペプチドを１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与した際の評価スコアを示す。図１８Ｃは，ｔＭＣＡＯ虚血４時間後に１，３，１０ｍｇ／ｋｇのＡペプチド単独あるいはそれぞれとｔＰＡの併用時の大脳皮質および線条体における出血作用を定量的解析したものである。図１８Ｃは，対照，Ａペプチドを１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与，ｔＰＡのみ（対照），ｔＰＡとＡペプチドを１ｍｇ／ｋｇ投与，３ｍｇ／ｋｇ投与，１０ｍｇ／ｋｇ投与した際の出血面積を示す。図１８Ｂに示されるとおり，強度な処置である虚血4時間に対して，Ａペプチド単独投与では，いずれの用量（１〜１０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与）でも有意な保護効果を示すには至らなかった。しかしながら，図１８Ｃに示されるとおり，Ａペプチドは，ｔＰＡ処置より誘発される運動障害の増悪，脳出血を用量依存的に抑制することが確認された。

図１８Ｃから，4時間の中大脳動脈閉塞によるｔＭＣＡＯモデルに対し、ｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：Ａの溶媒であるＰＢＳをｉ．ｖ．投与したＶｅｈｉｃｌｅ投与群（0.1±0.1 mm²）およびｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：Ａを１，３，１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）投与したｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：Ａ単独投与群では、大脳皮質領域にわずかに出血が確認された（１ｍｇ／ｋｇ：０．０９±０．０１ｍｍ^２，３ｍｇ／ｋｇ：０．０６±０．０１ｍｍ^２，１０ｍｇ／ｋｇ：０．０８±０．０１ｍｍ^２）。しかしながら、ｔＰＡ単独投与群では、Ｃｌｉｎｉｃａｌｓｃｏｒｅの悪化傾向ならびに出血領域の有意な拡大が確認され（0.7±0.2 mm²）、さらにｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：ＡをｔＰＡと併用することにより用量依存的なＣｌｉｎｉｃａｌ
ｓｃｏｒｅの改善ならびに出血領域の縮小を示したことから（ｔＰＡ＋ｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：Ａ
１ｍｇ／ｋｇ：０．７±０．２ｍｍ^２，ｔＰＡ＋
ｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：Ａ３ｍｇ／ｋｇ：０．４±０．１ｍｍ^２, ｔＰＡ＋ｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：Ａ１０ｍｇ／ｋｇ：
０．２±０．１ｍｍ^２）、ｍｏｄｉｆｉｅｄＰ６：ＡがｔＰＡ誘発性の脳出血を抑制することが示唆された。

［実施例１２］
ＰＩＴモデルにおける評価
ｔＰＡ治療時間の遅延による保護効果の減弱
生体内での脳梗塞発症原理に近似した血栓性脳梗塞PITモデルにおける評価を行った。第一にPITモデルに対するｔＰＡの保護について検討したところ，血栓形成（梗塞）後，超急性期に相当する1時間後処置では，有意な梗塞領域の減少が確認された。この保護効果はｔＰＡ処置時間を遅延（２〜４時間）させることで減弱した。また，虚血６時間後にｔＰＡを投与したものについては，保護効果が認められなかった。しかしながら，虚血６時間後にｔＰＡを投与したものであっても，副作用といえる障害の増悪を認められなかったことから，より処置時間を遅延させた系で検討する必要もあると考えられる。運動障害を評価するクリニカルスコアについては，PITモデルは適さないことが明らかとなり，ローターロッド法等の行動学的手法で評価することとした。

ＡペプチドとtPAの併用によるtPA有効治療時間の拡大
tMCAOモデルにおいて，tPA副作用抑制効果を有したＡペプチドを虚血後４時間後にtPAのPITモデルにおけるtPAとの併用効果について解析を行った。図１９は，ＰＩＴモデルにおけるＡペプチド及びｔＰＡの投与計画を示す。図２０Ａは，ローズベンガル投与後すぐに光照射し、中大脳動脈に血栓を生じさせ、その後５時間に対照あるいはＡペプチド１０,３０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与、さらにその後１時間にｔＰＡを投与し、最終的に光化学的血栓形成後２４時間に認められる大脳皮質と線条体領域の脳梗塞を示した写真を示す。図２０Ａでは対照、ｔＰＡ単独対照、１０, ３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド併用、３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド単独による結果を示す。図２０Ｂは，図２０Ａの梗塞領域を定量化したものである。図２０Ｃは，ローズベンガル投与後すぐに光照射し、中大脳動脈に血栓を生じさせ、その後５時間に対照あるいはＡペプチド１０,３０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与、さらにその後1時間にｔＰＡを投与し、最終的に光化学的血栓形成後２４時間に認められる運動障害評価スコアをもとめたものである。図２０Ｃでは対照、ｔＰＡ単独対照、1１０,３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド併用、３０ｍｇ／ｋｇＡペプチド単独による結果を示す。図２０Ａ，図２０Ｂ及び図２０Ｃから，ＡペプチドをｔＰＡ投与の1時間前（虚血５ｈｒ後）に投与したところ，組織化学的解析において保護効果が認められた。また，そのＡペプチドの効果は用量依存的であった（１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ）。一方，Ａペプチドの単独投与では保護効果が認められなかった。本保護効果はｔＰＡとＡペプチドの相乗効果であると考えられる。

ＰＩＴ処置単独では，ＴＴＣ染色による障害脳領域は４２±２．５％で，ＰＩＴ処置6時間後にｔＰＡを単独投与した群で４０±１．８％を示し，両群に有意な変化は見られなかった。また，ＣｌｉｎｉｃａｌｓｃｏｒｅにおいてもＰＩＴ処置単独（１．３±０．２），ｔＰＡ単独投与群（１．５±０．２）に有意な変化は見られなかった。
以上の結果より，虚血後期でのｔＰＡ単独投与は運動機能障害の増悪，ならびに出血を誘導するものの脳障害領域の拡大には影響しないことが明らかになった。

さらに，Ａペプチド単独投与群では，TTC染色による障害脳領域は４０±４．８％で，Ｃｌｉｎｉｃａｌｓｃｏｒｅにおいても１．３±０．４であったことから，PIT処置単独と比較し変化は見られなかった。しかしながら，ＰＩＴ処置後にｔＰＡとＡペプチドの併用投与した群では，１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ投与群では用量依存的な脳障害領域の改善傾向を示し（１０ｍｇ／ｋｇ: ３７±２．７％, ３０ｍｇ／ｋｇ: ２９±２．１％），Ａペプチド 30 mg/kg投与群は有意に脳障害領域の減少を示すことが明らかになった。しかしながら，ＣｌｉｎｉｃａｌｓｃｏｒｅについてはtPAとＡペプチドの併用投与した群についても改善効果は認められなかった（１０ｍｇ／ｋｇg: １±０，３０ｍｇ／ｋｇ: １±０）。

先の実施例で基本ペプチドＰ６が１０ｐｍｏｌ／ｅｙｅの硝子体投与で最大保護効果を示した。このため，Ａペプチド〜Ｅペプチドを含むプロトタイプペプチドについては，この用量の１／１０である１ｐｍｏｌ／ｅｙｅを目標値とした。作製２１サンプル中１４サンプルがＰ６と比較して１ｐｍｏｌ／ｅｙｅで高活性であった。さらに，５サンプル（Ａペプチド〜Ｅペプチド）が０．１ｐｍｏｌ／ｅｙｅ，すなわちＰ６より１００倍高活性であることを見出した。

動物モデルでの２次評価
ｔＭＣＡＯモデル（６０分虚血-再還流）において，Ｐ６は虚血１時間後の１回１ｍｇ／ｋｇの尾静脈投与で運動障害を抑制した。しかしながら，本保護効果は３ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ投与といった高用量では，１回１ｍｇ／ｋｇの投与ほどの抑制効果が認められなかった。本実施例では，目標値として用量０．１ｍｇ／ｋｇと用量依存的な保護効果を示す活性ペプチドを見出すことを目的とした。高活性5ペプチドについて検討したところ，２種のペプチドがそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ(Ａペプチド) と１０ｍｇ／ｋｇ(Ｂペプチド) で保護効果を示すと共に，用量依存性を有していることを明らかとした。活性差とその他3種のペプチドにおいて活性が認められなかったのは，静脈内投与による生体内安定性と脳移行性の問題であると考えられる。

血栓溶解剤ｔＰＡの主たる副作用である脳出血に対する保護効果の検討を行った。tMCAOモデル（4時間虚血）に１０ｍｇ／ｋｇｔＰＡを処置した後に再還流を行うと，1日後の運動障害は悪化し（スコア2から3.5へ），脳出血を誘発した。本増悪効果に対し，ＡペプチドをｔＰＡと同時に処置することで保護されることを明らかとした。また，基本Ｐ６ペプチドについても検討したところ，Ｐ６は脳出血をより増悪化する傾向にあることを認めた。以上より，脳梗塞治療薬プロトタイプとしてＡペプチドを最優先サンプルとするに至った。

脳梗塞の急性期において血栓溶解剤であるtPA（組織プラスミノーゲンアクティベーター）が臨床において活用されているが，治療有効時間が脳梗塞発症後4.5時間以内と，tPAの使用には時間的制限がある。本実施例では，脳梗塞動物モデルであるtMCAOモデルを用いた検証により，脳虚血6時間後におけるtPA投与が脳出血を誘導し，また，PIT モデルにおいては，ミトコンドリアの活性を検討するTTC染色において，脳保護効果が見られないということを明らかにしている。さらに，運動行動学的にもRota rodを用いた運動協調性評価試験において，PIT虚血単独時よりも運動機能が増悪することを見出した。

［実施例１３］
プロトタイプペプチドの処置時間・濃度変更によるｔＰＡとの相乗的保護効果解析（運動機能解析については，ローターロッド試験適用）

アクセレイテッドロータロッドテスト（Accelerated Rota rod test）は，運動協調性（motor coordination）および運動学習機能の解析に特化した手法である。運動協調性は，主に線条体領域に存在する神経細胞の機能障害によって低下することが知られている。また，運動学習は主に小脳で制御されており，小脳神経細胞の機能障害によって運動学習機能は低下する。

脳梗塞動物モデルであるPITモデルは，尾静脈投与により光感受性色素であるローズベンガルを投与することで，緑色光を照射した場所特異的に活性酸素種を発生させることが可能な方法である。産生された活性酸素種は，血管内皮細胞を傷害し，血栓を形成させることで血管閉塞を引き起こす。中大脳動脈における緑色光の照射により，その血流支配下にある大脳皮質，線条体で虚血傷害を引き起こすことが可能である。そのため，PITモデルで見られる運動機能障害は，運動協調性を制御する線条体が主な病態責任領域であると考えられる。

神経保護ペプチドとして見出されたＡペプチドが，PITモデルにおけるtPAの治療有効時間延長に寄与することができるか，運動協調性の観点から検討することを目的とし，Accelerated Rota rod testを実施した。

アクセレイテッドロータロッドテスト（Accelerated Rota rod test）はROTA-ROD TREADMILL FOR RATS & MICE (MK-610A, 室町機械)を用いて行った。この実験では，ロッドの回転は5分間で4.5 rpmから45 rpmまで加速する条件とした。体重２０〜２５ｇの雄性マウス(C57BL/J6)をロッドに乗せ，ロッド上からマウスが落下するまでの時間（落下潜時）を測定することにより行った。本試行は1日4試行，1試行につき1時間の間隔をあけて3日連続で実施し「Training」（トレイニング）とした。

その後PIT手術を行い，1週間後に運動機能障害を4試行/日することで評価し，「Test」値とした。ただし，回転するRota rodからマウスが落下せず，ロッドにしがみついたまま一緒に回転する場合は，連続して2回回転した時点で歩行不可と判定し，測定を終了，落下時間として判定した。

ＡペプチドによるｔＰＡ治療有効時間の延長効果の判定試験では，PIT虚血終了5時間後にAペプチドを3，10，30ｍｇ／ｋｇ尾静脈投与(ｉ.ｖ.)し，続いて虚血後6時間に10ｍｇ/ｋｇ (i.v.) ｔＰＡを投与した。効果検定は1週間後に行った。なお，ローズベンガルをi.v.投与し緑色光を照射しない群をSham群とし，ローズベンガルのｉ.ｖ.投与および緑色光照射を行い，5時間後に溶媒PBS(100μL/10g, i.v.)，6時間後に生理的食塩水(i.v. 100μL/10g)処置したものをVehicle群とした。5時間後に溶媒PBS(100L/10g, i.v.)，6時間後にtPA (10ｍｇ/kg,
i.v.)処置したものをtPA単独群とし，5時間後に溶媒Aペプチド (100 μL/10g,
i.v.)，6時間後にtPA (10 mg/kg, i.v.)処置したものをAペプチド+tPA処置群とした。

統計学的解析は，試行毎にsham群 (n=6), vehicle群 (n=8), tPA単独投与群 (n=10), Aペプチド+tPA処置群，Aペプチド (3
mg/kg) (n=6), Aペプチド (10 mg/kg) (n=6), Aペプチド (30 mg/kg) (n=6)の各群間をone-way ANOVA post hoc
Tukey-Kramer methodを用いて解析した。

参考文献：Jung-Kil Lee et al. Photochemically induced
cerebral ischemia in a mouse model．Surgical Neurology
67 (2007) 620〜625

図２１は，アクセレイテッドロータロッドテスト（Accelerated Rota rod test）の結果を示す，走行不可能となるまでの時間を示す折れ線グラフである。図２１中，ＡはＡペプチドを示す。図２２は，トレイニング期間の平均値及び７日後の平均値を示す棒グラフである。

図２１及び図２２から，ｔＰＡのみを投与した場合，運動能力の低下が見られる。一方，Ａペプチドを３ｍｇ／ｋｇ投与した径では，運動能力がわずかに回復し，Ａペプチドを１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇ投与した系では，運動能力が大きく回復することがわかる。

PIT処置前日までの3日連続で実施したTrainingでは，全ての群で変化は認められなかったが，PIT処置後それぞれの薬物を投与した7日後の運動機能は，Sham群と比較しPIT処置のみ実施したVehicle群で有意な運動機能の低下を示し（167±13秒），さらにtPA単独投与群でさらなる増悪傾向を示すことが明らかになった（127±15秒）。また，PIT処置後にtPAとmodified
P6: Aの併用投与した群では，modified P6: A 3 mg/kg投与では有意な改善傾向は認められなかったものの（132±15秒），10 mg/kgおよび30
mg/kg投与群では用量依存的な運動機能の改善効果を見出すことができた（10 mg/kg: 192±21秒, 30 mg/kg: 246±16秒）。以上の結果より，PIT処置6時間後にtPAを投与することで誘発される運動機能障害増悪が，modified P6: Aを前処置することで改善することから，modified P6:
AがtPA誘発性の運動障害抑制に有効であることが示唆された。

統計処理は，One-factor ANOVAによる分散分析後にDunnett’s testを用いて有意差検定を行った。また，sham群に対し有意であった各群間のp<0.05を*で，p<0.01を**で示し，tPA単独投与群に対し，有意であったmodified P6: Aの併用投与群間のp<0.05を#で，p<0.01を##で示した。

図２３は，Ｐ６，Ａペプチド〜Ｅペプチドの配列を示す参考図である。

その結果，Ａペプチドは，ｔＰＡによる副作用を抑制する作用があることが確認された。

図２４は，Ｐ６，Ａペプチド〜Ｕペプチドの配列を示す参考図である。図中，
PEは，ピログルタミン酸を示し，
Ac−Nは，アセチルアスパラギンを示し，
E-NH_２は，グルタミン酸アミド（イソグルタミン）を示し，
Nｖａは，ノルバリンを示し，
Nｌｅは，ノルロイシンを示す。

［実施例１３］
PITモデルにおけるＡペプチド以外のペプチド効果の検討（Clinical scoreとTTC染色による脳障害領域の評価）

用いたペプチドを変えた以外は，先に説明した実施例と同様にしてＡペプチド以外のペプチドＢ−Ｇを評価した。図２５は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体のＴＴＣ染色結果を示す図面に替わる写真である。図２６Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図２６Ｂは，評価スコアを示すグラフである。

PIT処置単独では、TTC染色による障害脳領域は48±2.5%で、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で44±2.6%を示し、modified P6: FをtPAと併用した場合に改善傾向が確認された（tPA + F: 37±3%）。また、modified P6: B, C, D, E, Gの併用は以下のとおりであった（tPA + B: 42±6.1%, tPA + C: 42±4.5%, tPA + D: 52±7.2%, tPA + E: 50±2.6%, tPA + G: 60±3%）。
また、Clinical scoreについては、PIT処置単独では1.5±0.1、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で1.4±0.1を示した。また、modified P6をtPAと併用した場合においても変化は見られなかった（tPA + B: 1±0, tPA + C: 1.5±0.4, tPA + D: 1±0, tPA + E: 1.2±0.2, tPA + F: 1.2±0.2, tPA + G: 1.2±0.2）。

用いたペプチドを変えた以外は，先に説明した実施例と同様にしてＡペプチド以外のペプチドＨ−Ｌを評価した。図２７は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体のＴＴＣ染色結果を示す図面に替わる写真である。図２８Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図２８Ｂは，評価スコアを示すグラフである。

PIT処置単独では、TTC染色による障害脳領域は48±2.5%で、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で44±2.6%を示した。また、ペプチド: H, I, J, K, Lを併用した場合は以下のとおりであった（tPA + H: 51±8.3%, tPA + I: 48±7.8%, tPA + J: 51±4.1%, tPA + K: 53±1.7%, tPA + L: 46±5.6%）。クリニカルスコアについては、PIT処置単独では1.5±0.1、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で1.4±0.1を示した。また、modified
P6をtPAと併用した場合においてもClinical
scoreの変化は見られなかった（tPA + H: 1.3±0.2,
tPA + I: 1.3±0.3, tPA + J: 1.3±0.3,
tPA + K: 1.1±0.2, tPA + L: 1.3±0.2）。

用いたペプチドを変えた以外は，先に説明した実施例と同様にしてＡペプチド以外のペプチドＭ−Ｑを評価した。図２９は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体のＴＴＣ染色結果を示す図面に替わる写真である。図３０Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図３０Ｂは，評価スコアを示すグラフである。

PIT処置単独では、TTC染色による障害脳領域は48±2.5%で、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で44±2.6%を示した。また、ペプチドM, N, O, P, Qを併用した場合は以下のとおりである（tPA + M: 50±5.9%, tPA + N: 43±4.9%, tPA + O: 54±5.8%, tPA + P: 47±5.1%, tPA + Q: 55±1.4%）。

また、Clinical scoreについては、PIT処置単独では1.5±0.1、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で1.4±0.1を示した。また、modified P6をtPAと併用した場合においてもclinical scoreの変化は見られなかった（tPA + M: 1.1±0.2, tPA + N: 1.1±0.1, tPA + O: 1±0, tPA + P: 1.1±0.1, tPA + Q: 1.7±0.5）。

用いたペプチドを変えた以外は，先に説明した実施例と同様にしてＡペプチド以外のペプチドＲ−Ｕを評価した。図３１は，虚血５時間後に適宜ペプチド及びｔＰＡを投与した際の線条体のＴＴＣ染色結果を示す図面に替わる写真である。図３２Ａは，梗塞体積（％）を示すグラフである。図３２Ｂは，評価スコアを示すグラフである。

PIT処置単独では、TTC染色による障害脳領域は48±2.5%で、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で44±2.6%を示した。また、modified P6: R, S, T, Uを併用した場合は以下のとおりである（tPA + R: 54±4.5%, tPA + S: 51±5.7%, tPA + T: 41±9.4%, tPA + U: 41±6.3%）。

また、Clinical scoreについては、PIT処置単独では1.5±0.1、PIT処置6時間後にtPAを単独投与した群で1.4±0.1を示した。また、modified P6をtPAと併用した場合においてもClinical scoreの変化は見られなかった（tPA + R: 1.1±0.1, tPA + S: 1.1±0.2, tPA + T: 1.4±0.4, tPA + U: 1.1±0.1）。

上記からＰ６誘導体の中では，ペプチドＡが最も優れており，次いでペプチドＦが優れていると考えられる。

本明細書中で述べられた全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

本発明の血液脳関門障害改善剤は、脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を改善することができる。従って、本発明の剤は血液脳関門障害に起因する疾患の治療薬となり得る。

配列番号１：ＰｒｏＴα６（Ｐ６）
配列番号２：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ａペプチド）
配列番号３：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｂペプチド）
配列番号４：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｃペプチド）
配列番号５：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｄペプチド）
配列番号６：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｅペプチド）
配列番号７：全長ヒトプロサイモシンα
配列番号８：全長マウスプロサイモシンα
配列番号９：全長ラットプロサイモシンα
配列番号１０：ＰｒｏＴα３０
配列番号１１：ＰｒｏＴα９
配列番号１２：ラット及びマウスプロサイモシンαの５０番目〜５６番目の７アミノ酸からなるペプチド
配列番号１３：ラット及びマウスプロサイモシンαの５１番目〜５７番目の７アミノ酸からなるペプチド
配列番号１４：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｆペプチド）
配列番号１５：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｇペプチド）
配列番号１６：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｈペプチド）
配列番号１７：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｉペプチド）
配列番号１８：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｊペプチド）
配列番号１９：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｋペプチド）
配列番号２０：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｌペプチド）
配列番号２１：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｍペプチド）
配列番号２２：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｎペプチド）
配列番号２３：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｏペプチド）
配列番号２４：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｐペプチド）
配列番号２５：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｑペプチド）
配列番号２６：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｒペプチド）
配列番号２７：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｓペプチド）
配列番号２８：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｔペプチド）
配列番号２９：Ｐ６の誘導体ペプチド（Ｕペプチド）
配列番号３０：P+1N/-1C
配列番号３１：P+2N/-2C
配列番号３２：ＰｒｏＴα７

Claims

配列番号１〜６及び配列番号１２〜配列番号３２のいずれかで表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩であって，
配列番号１，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号１２又は配列番号１３で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩であって，
配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる，ペプチドまたはその塩。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液臓器関門障害を伴う疾患の治療剤。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。
請求項５に記載の血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤であって，
前記血液脳関門障害を伴う疾患が，アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害，一過性血流障害，高血圧性脳障害，頭蓋内外の動脈の塞栓症，血栓症に起因する梗塞，動脈瘤，動静脈奇形，脳動脈狭窄性病変，硬膜動静脈瘻，血管外傷，血管性腫瘍，ウィルス感染性脳炎，脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫，又は脳梗塞後の脆弱性血管新生による出血疾患である，
血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む虚血性疾患の治療剤。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む脳梗塞の治療剤。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む，
血栓溶解剤により惹起される運動障害又は脳出血の治療剤又は予防剤。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩を有効成分として含む神経細胞死抑制剤。
請求項１に記載のペプチドまたはその塩，及び血栓溶解剤を有効成分として含む，
脳虚血性疾患用治療剤。
請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって，前記血栓溶解剤が，プラスミノーゲンアクチベータである，治療剤。
請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって，
脳虚血性疾患が脳梗塞である，治療剤。
請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって，
前記請求項１に記載のペプチドまたはその塩が対象に投与された後，３０分から５時間以内に前記血栓溶解剤が投与される，治療剤。
請求項１１に記載の脳虚血性疾患用治療剤であって，
前記請求項１に記載のペプチドまたはその塩が対象に投与された後，１時間から３時間以内に前記血栓溶解剤が投与される，治療剤。