JP5719771B2 - Ｉｌ−２５に対する抗体 - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２００８年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／１０１，２９３号明細書の利益を主張し、米国特許法第１１９条または第３６５条に基づき、２００８年９月３０日に出願された英国特許出願第０８１７８９１．５号明細書への優先権を主張している。上記出願の教示全体が、参照により本明細書に援用される。

発明の技術分野
本発明は、インターロイキン２５（ＩＬ−２５）に対する抗体（その結合フラグメントを包含する）に関する。

喘息
喘息は、一般的な気道の慢性炎症性障害である。この数十年の間に罹患者数は著しく増加し、世界保健機関は、世界中で約３億人が喘息に罹患していると推定している。アレルギー性喘息は、種々の誘発刺激によって誘発される制御困難な気道過敏性（ＡＨＲ）により特徴づけられ、肺への２型炎症性浸潤と関連する。

２型サイトカインは、寄生虫性蠕虫感染に対する防御免疫を媒介し、エフェクター機能（例えば、Ｂ細胞増殖およびＩｇＥ分泌）の調節、杯細胞過形成および関連する粘液生成、好酸球増加、肥満細胞症ならびに線維症の誘発に重要な役割を果たす（１）。これらのエフェクター機能の調節において、このサイトカインは中心的な役割を担っており、喘息における重要な治療標的となっている。実際、このサイトカインを過剰発現させたマウスモデルは、顕著な喘息の特徴を示す。そして驚くことに、特定の２型サイトカインを阻止することにより実験的喘息を改善しようとする取り組みは、ＩＬ−１３の阻害を除いて成功しないことが分かった。

ＩＬ−１３の阻害は、その機序は依然として不明ではあるが、ＡＨＲおよび気道炎症の両方を抑制する（２，３）。しかしながら、喘息の病態生理学が複雑であること、および病因が十分に理解されていないことを考慮すると、個々の経路を標的化することで、最終的に治療が成功するか否かは不確かである。

近年、構造的に関連するＩＬ−１７サイトカインファミリーのメンバーであるＩＬ−２５／ＩＬ−１７Ｅ（８）の過剰発現が、インビボで２型応答を誘発し（４〜６）、気道アゴニストへの応答性を増大させる（７）ことが示された。Ｉｌ２５^−／−マウスは、蠕虫寄生虫を効率よく駆逐することができず、これは効果的な２型応答がないことの重要な指標である（９，１０）。また、ＩＬ−２５が、喘息患者からの試料においてアップレギュレートされることも示された。

炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ＩＢＤ）は、大腸または結腸の粘膜層を冒す慢性炎症であり、典型的に、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ：ＵＣ）およびクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＤ）からなる群より選択される１種以上の疾患状態を含む。ＵＣはＴｈ２媒介性疾患と考えられており、代表的なマウスモデルは消化管炎症の発症への２型サイトカインの関与を示す（１６）。ＩＬ−２５産生が、慢性大腸炎のマウスモデルにおいてＴｈ１からＴｈ２型応答への転換に関連して観察され（１７）、ＩＬ−２５ｍＲＮＡの高発現が、マウスにおける胃腸管の全体にわたって報告された（１８）。さらに、ＩＬ−２５遺伝子は、そのクローン病との潜在的な関連は今後調査されなければならないが、染色体１４上のクローン病感受性領域内に位置している（１９）。また、ＩＢＤは、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性結腸炎、空置結腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、および分類不能大腸炎からなる群より選択される１種以上の疾患状態を含み得る。

ＩＢＤの処置のための従来の治療は、抗生物質またはステロイド由来薬物のいずれかを伴う；しかしながら、これらは現在のところ、患者における臨床的寛解の誘導または維持に成功していない（２０）。抗ＴＮＦ−α薬を伴う治療もまた、十分な効果を示さないが、現在利用可能である（２１，２２）。このことは、炎症性腸疾患の処置において、新規のより有効な治療への明確な必要性があることを示している。

抗体
抗体の基本構造は、当該技術分野において周知である。天然に存在する抗体は、通常、４本のポリペプチド鎖：ジスルフィド結合により連結された、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を有する。重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＬＨ）は、それぞれが定常領域および可変領域（またはドメイン）を有する。可変領域は、主として抗原結合を担っている。各可変領域内の、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる３つの部分領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）が、抗原と接触する。各可変ドメインのＣＤＲは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と番号が付けられている。ＣＤＲの間ならびにＮ末端およびＣ末端からＣＤＲまでは、抗原との接触がたとえあったとしてもわずかしかない、４つの所謂フレームワーク領域である。抗体の構造に関するさらに多くの詳細は、参照により本明細書に援用される以下に挙げられる文献の多くに説明されている。

標的抗原に対する抗体を生成し得る方法は数多くある。ハイブリドーマ技術を用いたモノクローナル抗体の生成は、そのような方法の１つである。抗体は、通常、マウスまたは他の齧歯動物において生成される。これは、高親和性の抗体を生成する有用な方法であり得る。しかしながら、そのような抗体がさらにヒト治療においても有用であるためには、通常、その抗体のＣＤＲをヒトフレームワークに移入する必要がある。これは、患者におけるヒト抗マウス抗体応答を回避しようとする試みである。

ＣＤＲ移植の一般原則については、ＪｏｎｅｓらおよびＲｉｅｃｈｍａｎら（１１，１２）により記載された。明確に言えば、マウス抗体のＣＤＲが、レシピエントヒト抗体のフレームワーク領域中に移植される。実際には、結果として生ずる抗体は、元のドナーマウス抗体と同じ標的抗原に結合することになるが、移植された抗体の親和性は、通常大きく減少する。

また、移植された抗体の熱安定性は、多くの場合、損なわれ得る。

元の抗体の特性を回復し最適化しようと試みる様々な方法が、当該技術分野において公知である。例えば、フレームワーク領域内には、特定の生殖細胞系ＣＤＲと関連する特定の「カノニカル構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」残基（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１３））がある。さらに、Ｆｏｏｔｅ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ（１４）は、抗原結合ループコンホメーションおよびそれらの相対的配置を支持し、したがって、抗原への抗体の適合の微調整に重要な役割を果たすことが示唆された「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）ゾーン」残基（そのうちのいくつかはカノニカル構造残基でもある）を同定した。また、フレームワーク内のさらなる残基が、ＶＨ／ＶＬインターフェースを安定化し、維持するものと考えられる。したがって、抗体をヒト化しようとする当業者は、多くの場合、バーニアゾーン、カノニカルおよびインターフェース（「ＶＣＩ」）残基が元のドナー抗体のものと可能な限り厳密に対応するヒトフレームワークを探す。

しかしながら、当業者にとって抗体は、その各々が唯一無二の課題であり、ＣＤＲ移植のためのどんな一般的に知られた方法論であっても各場合に直接適用し得るという確信は全くない。

本発明者らおよび同僚ら（Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅら（１５））は、ＩＬ−２５に結合し、インビボでアレルギー性喘息における気道過敏性を阻止し得る、マウスモノクローナル抗体２Ｃ３の作製を報告する。現在までのところ、この抗体の配列は、一般に公開されていない。

２００８年１０月３０日に国際公開第２００８／１２９２６３号パンフレットとして公開された国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００１３６５号明細書は、２Ｃ３抗体の配列および気道過敏性の阻止におけるその使用を報告している。

本発明は、その２Ｃ３配列に基づくヒト化（ＣＤＲ移植）抗体に関する。この抗体を作製する際に、数多くの課題を克服しなければならなかった。

本発明者らは、第一に、最大のＶＣＩ相同性（言い換えれば、２２個のＶＣＩ残基のうち２０個）を有するレシピエントヒト抗体ＶＨ鎖を選択した。しかしながら、結果として生ずる抗体（「ＲＨＡ」）は、２Ｃ３自体よりも顕著に少ない程度にＩＬ−２５と結合することが見出された。抗体に対する多くのさらなる改変（ＶＣＩと称されるアミノ酸および稀な体細胞変異の結果であると思われる残基に対する変更を含む）にもかかわらず、抗体結合への改善はほとんど達成されなかった。

抗体ヒト化へのＶＣＩ相同性アプローチの失敗を克服しようとして、ＶＣＩ残基適合性はより低い（１７／２２）が、全体の相同性はほんの僅かではあるがより高い、異なるヒトＶＨフレームワークが選択された。結果として生ずる抗体は「ＲＨＡ」抗体よりも高い結合性を提供したが、これは依然として親２Ｃ３抗体ほどには高くなかった。

結合を最大にし、抗体応答を惹起する恐れのある非ヒト残基を極力減らすために、さらなるフレームワークおよびＣＤＲの変更を行った。結果として生ずる抗体は、２Ｃ３と比較して向上した結合性を有することが見出され、気道過敏性のインビボ抑制試験において、２Ｃ３よりも有意に大きな効力があることが見出された。この抗体はまた、優れた熱安定性も示した。

本発明は、２Ｃ３に由来するヒト化ＶＨ鎖に関する。一部の態様において、本発明は、この鎖を含む抗体に関する。この抗体は、２Ｃ３ ＶＬ ＣＤＲを含むヒト化ＶＬ鎖を含み得る。

したがって、一態様において、本発明は、配列番号１：

を含む抗体ＶＨドメインを提供し、ここで：
Ｘａ１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａ２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり；
Ｘａ３は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘａ４は、ＶａｌまたはＡｒｇであり；そして
Ｘａ５は、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｙである。

一態様において、残基Ｘａ１〜Ｘａ５は、以下の組み合わせ：
Ｘａ１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａ２は、ＧｌｙまたはＡｓｐであり；
Ｘａ３は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘａ４は、ＶａｌまたはＡｒｇであり；そして
Ｘａ５は、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｙである
から選択され得る。

一部の実施形態において、Ｘａ２はＧｌｙであり、Ｘａ５はＡｓｐまたはＡｓｎ、好ましくはＡｓｐである。

一部の実施形態（Ｘａ２がＧｌｙであり、Ｘａ５がＡｓｐまたはＡｓｎ、好ましくはＡｓｐである実施形態を含む）において、Ｘａ１はＳｅｒである。

一部の実施形態（Ｘａ２がＧｌｙであり、Ｘａ５がＡｓｐまたはＡｓｎ、好ましくはＡｓｐである実施形態を含む）において、Ｘａ１はＴｈｒである。

一部の実施形態（Ｘａ２、Ｘａ５およびＸａ１の上記の組み合わせを全て含む）において、Ｘａ３はＭｅｔである。

一部の実施形態（Ｘａ２、Ｘａ５およびＸａ１の上記の組み合わせを全て含む）において、Ｘａ３はＩｌｅである。

上記の実施形態は全て、Ｘａ４の値のいずれか（すなわち、ＶａｌまたはＡｒｇ）と組み合わされ得る。

上記残基の特定の組み合わせを、以下の表に示す。当業者に好都合なように、そして付随する実施例との一貫性のために、表には、Ｋａｂａｔの残基番号付けが載せてある。場合により、これは、配列表の番号付けと異なる。

このＶＨドメインは、軽鎖可変ドメインと組み合わされて、ＩＬ−２５と結合する特異的な標的結合メンバーを与え得る。

適切な軽鎖ドメインは、２Ｃ３抗体のＣＤＲ残基を含む軽鎖ドメインである。好ましくは、軽鎖は、ヒト化軽鎖であり、すなわち、ヒトフレームワーク配列および２Ｃ３のＣＤＲ領域を含む。２Ｃ３の軽鎖ドメインは、配列番号１５として示される。ＣＤＲ領域１〜３は、残基３０〜３４を含み得、例えば、それぞれ、残基２４〜３４（配列番号２９）；５０〜５６（配列番号３０）および８９〜９７（配列番号３１）を含み得る。

ＣＤＲ残基は、天然２Ｃ３抗体軽鎖中にある場合も、ヒト化軽鎖分子に移入されている場合もある。

残基３５〜３８は、ＣＤＲを構成しないが、マウスおよびヒトの軽鎖配列の間で高度に保存されており、これもまた移入され得る。

ヒト化ＶＬ鎖の一例は、配列番号２５の残基２１〜１２７を含む。しかしながら、配列番号１５の３つのＣＤＲ領域を含む他のヒトフレームワークもまた使用され得る。さらに、以下に指摘されるように、ＶＬ鎖の非天然抗体リーダー配列以外の抗体リーダー配列が使用され得る。したがって、一実施形態において、ＶＬ鎖は、配列番号２５を含む。別の実施形態において、ＶＬ鎖は、抗体リーダー配列（例えば、本明細書において以下に記載される、配列番号２５の残基２１〜１２７に融合された抗体リーダー配列）を含み得る。

本発明は、さらに、本発明の標的結合メンバーの、例えば、薬学的組成物の形態での、疾患（炎症状態（例えば、喘息（アレルギー性喘息を含む）、クローン病および潰瘍性大腸炎）を含む）の処置のための使用を提供する。

本発明のこれらの態様およびさらなる態様を、以下にさらに詳細に、付随する実施例を参照しながら説明する。

２ｃ３マウス抗体のκ軽鎖ヌクレオチド（配列番号１６）およびアミノ酸（配列番号１５）の配列を示している。陰影はＣＤＲであることを示している。 ２ｃ３マウス抗体の重鎖ヌクレオチド（配列番号１８）およびアミノ酸（配列番号１７）の配列を示している。陰影はＣＤＲであることを示している。 ＡＹ３９３０９４のＤＮＡ（配列番号２０）およびアミノ酸（配列番号１９）の配列を示している。 ヒト化２ｃ３ＲＨＡのＤＮＡ（配列番号２２）およびアミノ酸（配列番号２１）の配列を示している。 ＡＹ５１０１０６のＤＮＡ（配列番号２４）およびアミノ酸（配列番号２３）の配列を示している。 ヒト化κ軽鎖２ｃ３ＲＫＡのＤＮＡ（配列番号２６）およびアミノ酸（配列番号２５）の配列を示している。 図７Ａ〜Ｃは、ヒト化抗体２ｃ３ＲＨＡ／ＲＫＡおよび変異体とキメラ２ｃ３との結合活性の比較を示している。 ヒト化２ｃ３−ＲＨ２の設計において使用されたフレームワークＡＪ３９９８２３のＤＮＡ（配列番号２８）およびアミノ酸（配列番号２７）の配列を示している。 図９ＡおよびＢは、ＩＬ−２５に結合する２ｃ３ＲＨ２ｂｃｄｅｆへの特異的ＣＤＲ変異の効果を示している。 ＣＤＲ変異Ｄ３１ＧとＧ９６Ｄとを組み合わせることによるＩＬ−２５結合に対する効果を示している。 ＩＬ−２５に結合する２ｃ３ＲＨ２．５＿Ｓ３０Ｔと２ｃ３ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖとの比較を示している。 ＡＨＲのインビボマウスモデルのプロトコルである。 図１３ＡおよびＢは、メタコリンに応答する肺抵抗に対する２ｃ３ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ投与の効果を示している。 図１４ＡおよびＢは、大腸炎モデルにおけるマウスの結腸の長さおよび体重を示している。

標的結合メンバー
これは、互いに結合特異性を有する分子対のメンバーを記載している。特異的結合対のメンバーは、天然に由来するか、または全部もしくは一部が合成により作製され得る。分子対の一方のメンバーは、分子対の他方のメンバーの特定の空間的極性構造に対し、特異的に結合し、したがって、相補的である、表面上の領域すなわち空隙を有する。したがって、その対のメンバーは、互いに特異的に結合するという特性を有する。特異的結合対の種類の例には、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、および酵素−基質がある。

本願は、抗原−抗体型の反応に関するものである。したがって、本発明の標的結合メンバーは、抗体分子の少なくとも一部、より好ましくは、そのような分子の抗原結合ドメインの少なくとも一部を含む。

一般的に、抗体の重鎖可変領域（ＶＨドメイン）は、抗体の抗原への結合において重要な役割を果たす。したがって、本発明の標的結合メンバーは、配列番号１を含むＶＨドメインを含んだものを基礎として作製されている。

本発明のＶＨドメインを作製する際に、２Ｃ３抗体ＣＤＲ領域が、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３の配列を変更することによって改善されることが見出された。したがって、本明細書に記載される本発明の好ましい実施形態は、Ｘａ２がＧｌｙであり、Ｘａ５がＡｓｐである配列番号１のＶＨドメインを企図するが、本発明はまた、それぞれ配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６であるＣＤＲ１〜３領域を有したヒトフレームワーク領域を有するヒト化ＶＨドメインも企図する。

したがって、さらなる態様において、本発明は、Ｈ１重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号３４のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。別の態様において、本発明は、Ｈ２重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号３５のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。別の態様において、本発明は、Ｈ３重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号３６のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。

さらなる態様において、本発明は、Ｌ１軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号２９のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。別の態様において、本発明は、Ｌ２軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号３０のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。別の態様において、本発明は、Ｌ３軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。

さらなる態様において、本発明は、Ｈ１重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）が配列番号３４のアミノ酸配列を有し、Ｈ２重鎖ＣＤＲが配列番号３５のアミノ酸配列を有し、そしてＨ３重鎖ＣＤＲが配列番号３６のアミノ酸配列を有する、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバーを提供する。一実施形態において、そのような標的結合メンバーは、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＬ１軽鎖ＣＤＲ、配列番号３０のＬ２軽鎖ＣＤＲおよび配列番号３１のＬ３軽鎖ＣＤＲを有する。

そのような標的結合メンバーのフレームワークは、ヒトのみであるか、マウスのみであるか、または本発明によれば、主としてヒトであるが、結合親和性を向上させるために１個以上のマウス残基を保持するフレームワークであり得る。

したがって、前記ＣＤＲを含む標的結合メンバーは、本発明のさらなる態様を形成し、本明細書に記載されるように、配列番号１を含むＶＨドメインを有する標的結合メンバーに使用され得る。

一般的に、標的結合メンバーは、抗体抗原結合ドメインを提供するために、ＶＬドメインと対をなしたＶＨドメインを含む。一実施形態において、ＶＨドメインは、ＣＤＲと、必要に応じ、ヒトとマウスとの間で保存された任意のフレームワーク残基とが２Ｃ３抗体由来のものである、ＶＬドメインと対をなす。

しかしながら、軽鎖混雑（ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）が、本明細書でさらに検討されるように、当該技術分野において十分に確立されており、したがって、ＶＨは、２Ｃ３由来のＶＬ以外のＶＬドメインと対をなし得る。そのようなＶＬは、本明細書において以下に検討されるように選択され得る。

免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、およびその最新版を参照することにより決定され得る。数多くの学術的および商業的オンライン情報源が、このデータベースを検索するために利用され得る。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｋａｂａｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｂｙ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５（１９９６），１３０−１３３および現在ウェブアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｓｉｍｋａｂ．ｈｔｍｌ．にある関連するオンライン情報源を参照されたい。

本発明に従う標的結合メンバーは、下記のＲＨＡ２．５ Ｒ７１Ｖ抗体と実質的に類似した親和性（例えば、＋１０％）でＩＬ−２５と結合し得る。標的結合メンバーは、概してＩＬ−２５に対して特異的である。したがって、標的結合メンバーは、その１種または複数種の特異的結合パートナー以外の分子への有意な結合を何ら示さない。例えば、本発明の抗体が由来する２Ｃ３抗体は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３と交差反応せず、したがって、喘息および類似の過程に関与する他のサイトカインへのそうした交差反応性の回避が、本発明の標的結合メンバーの望ましい特徴であることが見出された。

典型的に、特異性は、抗原のパネルを用いた結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により決定され得る。本発明に従う標的結合メンバーはＩＬ−２５を認識し得て、ＩＬ−１７ファミリーの他のメンバー、特にＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＢおよびＩＬ−１７Ｃのいずれか１種、より好ましくはＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＢおよびＩＬ−１７Ｃの３種全てを認識し得ない。本発明に従う標的結合メンバーのＩＬ−２５への結合は、組換えＩＬ−２５との競合により無効にされ得る。

異なる標的結合メンバーの結合親和性および中和能力は、適切な条件下で比較され得る。

抗体分子
これは、天然であるかまたは一部もしくは全部が合成により作製されたかにかかわらず、免疫グロブリンを記載している。完全抗体のフラグメントが、抗原と結合する機能を果たし得ることが示された。したがって、抗体についての言及は、抗体結合フラグメントを含む任意のポリペプチドまたはタンパク質も対象として含む。

結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインがその２つのドメインを結合して抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結されている単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉ）双特異性単鎖Ｆｖダイマー（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号明細書）、ならびに（ｖｉｉｉ）遺伝子融合により構築される多価または多特異性フラグメントである「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８，１９９３）がある。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得る（Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインに繋がれたｓｃＦｖを含むミニボディもまた作製され得る（Ｓ．Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。

双特異性抗体が使用されるべき場合には、これらは、種々の方法で製造され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））（例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製され得る）か、または上述の双特異性抗体フラグメントのいずれかであり得る、従来の双特異性抗体であり得る。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、Ｆｃ領域を含まずに可変ドメインのみを使用して構築され得、潜在的に抗イディオタイプ反応の影響を軽減し得る。

双特異性完全抗体とは対照的に、双特異性ダイアボディはまた、それらが容易に構築され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され得ることから特に有用であり得る。適切な結合特異性を有するダイアボディ（および多くの他のポリペプチド（例えば、抗体フラグメント））は、ファージディスプレイ法（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット）を用いてライブラリーから容易に選択され得る。ダイアボディの一方のアームが、例えば特異性がＩＬ−２５に対して向けられたまま、一定に保たれるべき場合は、他方のアームが様々に異なるライブラリーが作製され得、適切な特異性を有する抗体が選択され得る。双特異性完全抗体は、ノブズ・イントゥ・ホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術により作製され得る（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）。

モノクローナル抗体および他の抗体を使用し、組換えＤＮＡ技術の方法を用いて、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を作製することが可能である。そうした方法は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域とフレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−１８４１８７号明細書、英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号明細書、または欧州特許出願公開Ａ−２３９４００号明細書を参照されたい。

好ましくは、２Ｃ３のＶＬ鎖のＣＤＲ領域が、ヒトフレームワーク領域に移植される。ヒトフレームワーク領域は、多くの方法により（例えば、マウスフレームワーク領域またはマウスＶＬ領域の配列を公知のヒトフレームワークまたはＶＬ領域の配列と比較し、最高度のアミノ酸類似性もしくは同一性、または最高度のアミノ酸類似性もしくは同一性のうちの１つを有するヒトフレームワーク領域を選択することにより）選択され得る。結果として生ずるＣＤＲ移植抗体をさらに最適化するために、天然ヒト配列のフレームワーク領域に改変を加え得る。

本発明の好ましい態様においては１対のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体分子が好ましいが、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインが本発明のさらなる態様を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは、特異的な様式で標的抗原と結合し得ることが知られている。

単鎖結合ドメインのうちのいずれかである場合、本明細書において以下でさらに検討されるように、これらのドメインを使用して、ＩＬ−２５と結合し得る２ドメイン標的結合メンバーを形成する能力がある相補的ドメインをスクリーニングし得る。

本発明の抗体分子は、抗体定常領域またはその一部をさらに含み得る。例えば、ＶＬドメインが、そのＣ末端で、ヒトＣκまたはＣλ鎖、好ましくはＣκ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合され得る。同様に、ＶＨドメインに基づく標的結合メンバーは、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）およびアイソタイプサブクラスのいずれか（特に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４）に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合し得る。ＩｇＧ４が好ましい。国際公開第９９／５８５７２号パンフレットに開示されるようなＦｃ領域（例えば、ΔｎａｂおよびΔｎａｃ）が使用され得る。

したがって、別のポリペプチドに融合した標的結合ドメインまたは等価物を含むキメラ分子が包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現については、欧州特許出願公開第Ａ−０１２０６９４号明細書および欧州特許出願公開第Ａ０１２５０２３号明細書に記載されている。

本発明の抗体分子のフレームワーク領域はまた、１つ以上のグリコシル化部位を含むグリコシル化配列も含み得る。標的結合メンバーを発現させる宿主細胞によって、グリコシル化のパターンは異なり得る。したがって、グリコシル化部位をコードする核酸構築物を改変してその部位を除去する場合もあるし、あるいはそのような部位をタンパク質に導入する場合もある。例えば、真核生物タンパク質中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（ここで、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）により特徴づけられる。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合の防止となる。例えばＡｓｎが異なるアミノ酸で置換されるように選択される単一ヌクレオチドの変更は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための公知の手順としては、米国特許第５，０７１，９７２号明細書および欧州特許出願公開第２７６，８４６号明細書に記載されている手順が挙げられる。

抗原結合ドメイン
これは、抗原の一部または全部に対して特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体分子の部分を記載している。抗原が大きい場合、抗体は、エピトープと称される抗原の特定の部分にしか結合し得ない。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインからなる所謂Ｆｄ抗体フラグメント）により提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくとも実質的部分、および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくとも実質的部分を含む。

免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、その介在フレームワーク領域と一緒に含む。好ましくは、この部分はまた、少なくとも約５０％の第１および第４フレームワーク領域のいずれかまたは両方を含み、この５０％は、第１フレームワーク領域の場合はＣ末端の５０％であり、第４フレームワーク領域の場合はＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常は関連しない残基であり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術による本発明の標的結合メンバーの構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされるＮまたはＣ末端残基の導入をもたらし得る。他の操作工程としては、本発明の可変ドメインを、さらなるタンパク質配列（免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの作製において）または以下により詳細に検討されるタンパク質標識を含む）と繋げるためのリンカーの導入が挙げられる。

含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
これは、概して、含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味、すなわち、１つ以上の特徴または成分の存在を可能にする意味で使用される。

単離（された）
これは、本発明の標的結合メンバーであるＶＨドメイン、またはそのような結合メンバーをコードする核酸が、概して本発明に従っている状態をいう。メンバーおよび核酸は、それらが本来関連する物質（例えば、それらの天然環境、またはインビトロもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ技術により調製される時にそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）において一緒に見出される他のポリペプチドまたは核酸）を含まない、または実質的に含まない。

標的結合メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと共に配合され得るが、それでもやはり実用上は単離され得る（例えば、メンバーは、イムノアッセイにおける使用のためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合は、通常ゼラチンまたは他のキャリアと混合され、診断または治療において使用される場合は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と混合される）。標的結合メンバーは、天然に、または異種真核生物細胞（例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３）細胞）の系によってのいずれかでグリコシル化される場合もあるし、（例えば、原核生物細胞において発現により産生される場合は）グリコシル化されない場合もある。

標的結合メンバーのさらなる特徴
抗体配列に加え、本発明に従う標的結合メンバーは、他のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、折りたたまれたドメイン）を形成するアミノ酸、または当該分子に抗原と結合する能力に加えて別の機能特性を付与するためのアミノ酸）を含み得る。本発明の標的結合メンバーは、検出可能な標識を有し得るし、または毒素もしくは酵素と（例えば、ペプチジル結合またはリンカーを介して）結合され得る。

検出可能な標識としては、抗体イメージングの技術分野において公知の従来化学を用いて本発明の抗体に結合され得る放射能標識（例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃ）が挙げられる。標識はまた、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）も包含する。標識は、さらに、化学的部分（例えば、特異的な同系の検出可能部分（例えば、標識化アビジン）への結合により検出され得るビオチン）を包含する。

さらなる特徴がポリペプチドドメインまたは標識である場合は、標的結合メンバーは、組換え技術により、すなわち、標的結合メンバーとさらなるドメインとの融合体（ｆｕｓｉｏｎ）をコードする核酸の発現により作製され得る。

チェーンシャッフリング（Ｃｈａｉｎ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−２５に対する抗体抗原結合ドメインを得るための方法を提供し、この方法は、本発明の標的結合メンバーのＶＨドメインを提供する工程、そのＶＨドメインを１種以上のＶＬドメインと組み合わせる工程、およびそのＶＨ／ＶＬの１つまたは複数の組み合わせをＩＬ−２５に対する抗体−抗原結合ドメインについて試験する工程を包含する。

前記ＶＬドメインは、実質的に本明細書に示される通りであるアミノ酸配列を有し得る。

本明細書に開示されるＶＬドメインの１種以上の配列変異体が１種以上のＶＨドメインと組み合わされる、類似の方法が使用され得る。

これは、国際公開第９２／０１０４７号パンフレットに開示されている所謂階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング方法により達成され得る。この方法において、ＨまたはＬ鎖のクローンのいずれかを含有する個々のコロニーが、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させるのに使用され、結果として生ずる二本鎖の標的結合メンバーが、ファージディスプレイ技術（例えば、その参考文献に記載される技術）に従って選択される。

したがって、本発明は、ＩＬ−２５に対する抗体分子の選択方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＩＬ−２５と結合し、本発明の抗体ＶＨドメインを含む標的結合メンバーを含むＶＨドメインを提供する工程；
（ｂ）前記ＶＨドメインを複数の抗体ＶＬドメインと組み合わせて抗体分子を提供する工程；
（ｃ）前記抗体分子をＩＬ−２５への結合についてスクリーニングする工程；および
（ｄ）ＩＬ−２５と結合する抗体分子を選択する工程
を包含する。

そのような方法において、ＶＨおよびＶＬドメインは、組換えＤＮＡにより、特にファージまたはファージミドＤＮＡにより発現されたタンパク質の形態で提供され得る。

上記複数のＶＬドメインは、１０４個より多くの別個のドメイン、例えば、１０６個〜１０８個または１０１０個までのドメインのいずれかであり得る。

抗体分子およびそのような分子をコードする核酸が、本発明のさらなる部分を形成し得る。

ＩＬ−２５
Ｉｌ−２５は、当該技術分野においてＩＬ−１７Ｅとも称され、商業的供給源（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（ＭＮ，ＵＳＡ））から入手し得るか、当該技術分野において利用可能なＩＬ−２５の配列を参照することによりクローニングまたは合成され得る。マウスＩＬ−２５（ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＰ＿５４２７６７）は、Ｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００２（下記参考文献７）により記載されている。ヒトＩＬ−２５（ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑ９Ｈ２９３）は、Ｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（下記参考文献４）により記載されている。抗体の作製またはイムノアッセイにおける使用については、組換えＩＬ−２５のフラグメント、特にＮ−末端で切断されたフラグメントが使用され得る。例えば、市販の組換えヒトＩＬ−２５（ＩＬ−１７Ｅ）は、受託番号Ｑ９Ｈ２９３のＴｙｒ３３〜Ｇｌｙ１７７の成熟タンパク質配列を含み、市販のマウスＩＬ−２５は、マウスＩＬ−１７Ｅ（受託番号ＮＰ＿５４２７６７）の残基Ｖａｌ１７〜Ａｌａ１６９を含む。

核酸およびベクター
さらなる態様において、本発明は、本発明に従う標的結合メンバー、ＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする配列を含む単離核酸を提供し、そして本発明の標的結合メンバー、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを調製する方法であって、前記標的結合メンバー、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの産生をもたらす条件下で前記核酸を発現させる工程、およびそれを回収する工程を包含する方法を提供する。

本発明の核酸は、配列番号４０（重鎖）もしくは配列番号２６（軽鎖）の配列、またはその関連部分（例えば、ＣＤＲコード領域）、または例えば本発明の他のＶＨおよびＶＬドメインをコードするように部位特異的変異誘発によって改変されたこれらの配列の変異体を含み得る。さらに、コドン利用が、例えば所望の宿主細胞における配列の発現を最適化するように、変更され得る。

本発明は、さらに、本発明の標的結合メンバーをコードする単離核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。

本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含し得、全部または一部が合成であり得る。本明細書に示されるヌクレオチド配列についての言及は、文脈上別段の要求のない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、かつＴがＵに置換された特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

本発明はまた、少なくとも１つの上記の核酸を含む、例えばプラスミド、ウイルス（例えば、ファージまたはファージミド）、コスミド、転写カセット、または発現カセットの形態の、ベクターを提供する。

適切な調節配列（適宜、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む）を含有する好適なベクターが選択されるか、または構築され得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

本発明のベクターはまた、インビボでヒト細胞に感染し得るウィルスベクター（例えば、アデノウィルス、レトロウィルスまたはアデノ随伴ウィルスベクター）を包含する。そのようなベクターは、ヒトまたは動物被験体の細胞において本発明の標的結合メンバーを発現させて、標的結合メンバーの産生および前記被験体への送達を提供するのに有用であり得る。

本発明の標的結合メンバーをコードする核酸配列は、一態様において、宿主細胞において標的結合メンバーの発現を生じさせるためのプロモーターに作動可能に連結される。この配列は、その５’末端に、宿主細胞におけるおよび／または宿主細胞からの標的結合メンバーの発現および／または分泌を促進するためのリーダー配列を含み得る。数多くの好適なリーダー配列がそのようなものとして当該技術分野において公知であり、宿主細胞を考慮して、当業者により選択され得る。

非免疫グロブリン哺乳動物リーダー配列または合成リーダー配列が代わりに使用され得るが、好適なリーダー配列としては、任意のヒトまたは他の哺乳動物の免疫グロブリンリーダー配列が挙げられる。ＶＨ鎖の発現には、好ましくは、ヒトＶＨリーダー配列が使用され得る。ＶＬ鎖の発現には、好ましくは、ヒトＶＬリーダー配列が使用される。

本発明のＶＨドメインの発現に適したリーダー配列は：
ＭＧＳＴＡＩＬＧＬＬＬＡＶＬＱＧＶＣＡ（配列番号３７）
である。

本発明のＶＬドメインの発現に適したリーダー配列は、ヒトまたはマウスＶＫリーダー配列である。そのような配列は、２Ｃ３リーダー配列：
ＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＤＴＲＣ（配列番号３８）またはヒトホモログ、例えば、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＤＴＲＣ（配列番号３９）
であり得る。

付随する実施例において、我々は、抗体リーダー配列で始まるコード配列の前に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣ、配列番号４１）を含む発現構築物を使用した。これは、哺乳動物宿主細胞における抗体ドメインの発現に好適である。しかしながら、実験者の嗜好および抗体ドメインを発現させることになる宿主細胞によっては、他の構築物が使用され得る。

例えば核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの公知の技術ならびにプロトコルが、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの開示は、参照により本明細書に援用される。

宿主細胞および標的結合メンバーの作製
さらなる態様は、本発明の核酸（例えば、ベクターの形態の核酸配列）で形質転換された宿主細胞を提供する。

一実施形態において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組み込みは、ゲノムとの組換えを促進する配列を標準的な技術に従って挿入することにより促進され得る。

なおさらなる態様は、本発明の標的結合メンバーの作製方法を提供し、この方法は、コード核酸から発現を生じさせる工程を包含する。そのような方法は、前記標的結合メンバーの産生条件下で宿主細胞を培養する工程を包含し得る。

発現による産生に続き、ＶＨもしくはＶＬドメインまたは標的結合メンバーは、任意の好適な技術を用いて単離および／または精製され得、次いで適宜使用され得る。作製方法は、生成物の単離および／または精製の工程を包含し得る。

生成物の精製に続き、標的結合メンバーは、物理的もしくは化学的手段により、例えば、タンパク質の安定性または生物学的半減期を変更（例えば、増大）する保護基を導入するように改変され得る。例えば、そうした効果を達成するためのタンパク質のＰＥＧ化が、そのようなものとして当該技術分野において公知であり、本発明の標的結合メンバーは、ＰＥＧ化された形態であり得る。

作製方法は、少なくとも１つの追加の成分（例えば、薬学的に受容可能な賦形剤）を含む組成物に生成物を配合する工程を包含し得る。

本発明はまた、１つもしくは複数の上記の核酸またはベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。規定されるとおりの任意のＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬドメインまたは標的結合メンバーをコードする核酸自体が、コード核酸から発現させる工程を包含することによるコード産物の作製方法と同様、本発明の一態様を形成する。

種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系が周知である。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウィルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、および多くの他の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

原核生物細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））における抗体および抗体フラグメントの発現は、当該技術分野において十分に確立されている。概観については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたい。培養下の真核生物細胞における発現もまた、標的結合メンバーの作製のための選択肢として当業者に利用可能である。最近の概観については、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３−５６０を参照されたい。

組成物
したがって、本発明に従う薬学的組成物および本発明に従う使用のための薬学的組成物は、有効成分に加え、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の効果を妨げるべきではない。キャリアまたは他の材料の厳密な性質は、投与経路によって決まり、その投与経路は、経口、または注射（例えば、静脈内注射）によるものであり得る。

標的結合メンバーの治療用配合物は、所望の純度を有する標的結合メンバーと、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ出版を参照）と混合することにより、凍結乾燥粉末または水溶液の形態で、保存用に調製され得る。受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤（例えば、ホスファート、シトラート、および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸を包含する）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を包含する。

インビボ投与に使用される標的結合メンバーについては、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後の、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に実現される。標的結合メンバーは、通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中に保存される。

経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤または液剤の形態であり得る。錠剤は、固体キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバント）を含み得る。液体薬学的組成物は、概して、液体キャリア（例えば、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油）を含む。生理的食塩水、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）が含まれ得る。

静脈内注射または疾病部位への注射のためには、有効成分は、発熱性物質を含まず、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に受容可能な水溶液の形態にある。当業者は、例えば等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液）を用いて好適な溶液を十分に調製し得る。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。

本発明の治療的使用
本発明は、ＩＬ−２５に対する抗体が、喘息の主要な症状である気道過敏性のインビボでの予防または軽減に有効であることの実証を初めて提供する。したがって、一態様において、本発明は、処置を必要としている被験体（例えば、ヒト）における気道過敏性を予防または軽減する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバー、特に抗体分子を被験体に投与する工程を包含する。別の態様において、本発明は、処置を必要としている被験体において喘息を予防、軽減または処置する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−２５と結合する標的結合メンバー、特に抗体分子を被験体に投与する工程を包含する。喘息は、アレルギー性喘息を包含する。

上記方法は、ＩＬ−２５への結合、および好ましくはＩＬ−２５の作用の中和において有用であり、ＩＬ−２５が役割を果たす種々の疾患および障害において治療的可能性を有する本発明に従う標的結合メンバー（その組成物を包含する）を用いて実施され得る。そうした疾患は、喘息に加え、炎症と関連する他の状態（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）を包含する。本方法はまた、以下に付随する実施例において記載されるようにして得られ得るＩＬ−２５と結合する他の標的結合メンバー（その組成物を包含する）を用いて実施され得る。

本発明に従う標的結合メンバー（その組成物を包含する）は、ヒトもしくは動物被験体における処置（予防的処置を包含する）または診断の方法において使用され得る。そのような処置または診断（予防的処置を包含し得る）の方法は、有効量の本発明の標的結合メンバーを前記被験体に投与する工程を包含し得る。例示的な疾患および障害が、以下でさらに検討される。

また、ヒトまたは動物被験体への投与のための医薬の製造における本発明の標的結合メンバー（その組成物を包含する）の使用も提供される。

治療的利益を提供するために抗ＩＬ−２５標的結合メンバーが使用され得る臨床適応症は、ＩＬ−２５が病理学的影響を有するあらゆる状態を包含する。したがって、概して、本発明の標的結合メンバーは、望ましくないＴｈ２応答または２型応答と関連する任意の状態の処置において使用され得る。例えば、本発明の標的結合メンバーは、アレルギーおよび喘息、特に喘息の処置のために使用され得る。

抗ＩＬ−２５処置は、注射により（例えば、静脈内に）または局所送達法により与えられ得る。抗ＩＬ−２５は、遺伝子媒介技術により送達され得る。別の配合方法により、経口または坐剤経路に適した製剤が提供され得る。投与経路は、疾患への特別な配慮をした上で、効果を最適化するように、または副作用を極力抑えるように、処置の物理化学的性質により決定され得る。

本発明によれば、提供される組成物は、個体に投与され得る。投与は、好ましくは「治療有効量」での投与であり、この治療有効量は、患者への利益を示すのに十分な量である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。実際の投与量ならびに投与の速度および時間経過は、処置対象の性質および重症度によって決まる。処置の処方（例えば、投与量などの決定）は、一般医および他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は、当該技術分野において周知である；Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ Ｋ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９１５−９２２を参照されたい。

正確な用量は、多くの要因（その抗体が診断のためのものであるのか、それとも処置のためのものであるのか、処置されることになる領域の大きさおよび場所、抗体の厳密な性質（例えば、完全抗体、フラグメントまたはダイアボディ）、ならびに抗体に結合させた任意の検出可能な標識または他の分子の性質を包含する）によって決まる。典型的な抗体用量は、０．５ｍｇ〜１．０ｇの範囲内にあり、これは、適宜、ボーラスとして、または数時間にわたる注入として、必要用量を達成するように、静脈内に投与され得る。投与の他の様式として、同様の総累積用量を達成するような、数時間にわたる静脈内注入が挙げられる。これは、成人患者の単一処置のための用量であり、小児および乳児に見合うように比例して調節され得、また、他の抗体形式に対しても分子量に比例して調節され得る。処置は、医者の判断で、１日１回、週２回、週１回または月１回の間隔で繰り返され得る。

さらなる投与様式は、体内留置デバイスへのプレコーティングかまたはさもなければ組み込みを利用するものであり、そのための抗体の最適量は、適切な実験により決定される。

本発明の一部の好ましい実施形態における抗体分子は、モノマーフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）またはｓｃＦｖ）である。そのような抗体フラグメントは、半減期が相対的に短いという利点を有し、レセプタークラスター化（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）により引き起こされ得る血小板活性化のリスクを低下させ得る。血小板活性化を生じさせるクラスター化は、例えば、ＩＬ−２５分子のものであるか、またはＩＬ−２５とＦｃγＲＩＩ分子のものであり得る。

完全抗体が使用される場合、その抗体は、好ましくは、血小板を活性化および／または破壊し得ない形態にある。ＩｇＧ４アイソタイプあるいはＩｇＧ１主鎖由来の「デザイナー」アイソタイプ（新規Ｆｃ遺伝子構築物、国際公開第９９／５８５７２号パンフレット、Ｃｌａｒｋ，Ａｒｍｏｕｒ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）が好ましい選択肢である。より小さい抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）が使用され得る。また、二重エピトープ特異性（例えば、ｓｃＦｖ ２Ｃ３により認識されるエピトープに対する特異性）を有する完全抗体またはフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２またはダイアボディ）が使用され得る。そのような実施形態はレセプタークラスター化を促進し得るが、個々のレセプターへの高い結合速度がこの問題の可能性を排除し得る。

本発明の標的結合メンバーは、通常、薬学的組成物の形態で投与され、この薬学的組成物は、標的結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含み得る。

本発明の標的結合メンバーは、単独でまたは他の処置と組み合わせて、処置されることになる状態によって同時にまたは逐次的に投与され得る。他の処置としては、適切な用量の鎮痛薬（例えば、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、またはケトプロフェン））もしくは麻酔薬（例えば、モルヒネ）の投与；鎮吐薬の投与；または喘息に対して活性を有する少なくとも１つの他の化合物、一般的には、気道弛緩を引き起こすかもしくは粘液クリアランスを向上させる気管支拡張薬（例えば、β−アゴニスト（例えば、サルブタモール、サルメテロール）、クロモグリク酸二ナトリウム、ステロイド、またはＰＤＥＩＶ阻害剤）の投与が挙げられ得る。

アッセイ方法
本発明は、本明細書において提供される標的結合メンバーのＩＬ−２５への結合を生じさせる、または可能にする工程を包含する方法を提供する。そうした結合は、インビボでも（例えば、標的結合メンバーまたは標的結合メンバーをコードする核酸の投与に続いて）起こり得るし、インビトロでも（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学、免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィーにおいて）起こり得ることに留意する。

ＩＬ−２５への標的結合メンバーの結合量が決定され得る。定量は、診断対象であり得る試験試料中の抗原の量と関連付けられ得る。

試料に対する抗体の反応性は、任意の適切な手段により決定され得る。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は１つの実行可能な手段である。放射性標識抗原が非標識抗原（試験試料）と混合され、抗体に結合させられる。結合抗原は、非結合抗原から物理的に分離され、抗体と結合した放射性抗原の量が決定される。試験試料中に存在する抗原が多いほど、より少ない放射性抗原が抗体に結合することになる。レポーター分子に連結された抗原またはアナログを用い、非放射性抗原との競合結合アッセイもまた使用され得る。レポーター分子は、スペクトル上区別される吸収または発光特性を有する蛍光色素、発光体またはレーザー色素であり得る。好適な蛍光色素としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。好適な色原体色素としては、ジアミノベンジジンが挙げられる。

他のレポーターとしては、高分子コロイド粒子または粒状材料（例えば、着色、磁性または常磁性のラテックスビーズ）、および直接的もしくは間接的に、検出可能シグナルを視覚的に観察させ得るか、電子的に検出させ得るか、またはさもなければ記録させ得る、生物学的もしくは化学的に活性な薬剤が挙げられる。これらの分子は、例えば発色もしくは変色する、または電気的性質に変化をもたらす、反応を触媒する酵素であり得る。それらは、エネルギー状態間の電子遷移が特徴的なスペクトル吸収または発光をもたらすように分子的に励起可能であり得る。それらは、バイオセンサーと共に使用される化学的実体を包含し得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンとアルカリホスファターゼとの検出系が使用され得る。

個々の抗体−レポーター複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）により生成されるシグナルは、試料（正常および試験）中の関連する抗体結合の定量化可能な絶対または相対データを得るために使用され得る。

本発明はまた、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための上記のような標的結合メンバーの使用、すなわち、本発明により提供されるような標的結合メンバーを競合アッセイにおいて使用することにより試料中の抗原レベルを測定する方法を提供する。これは、非結合抗原からの結合抗原の物理的分離が必要とされない場合であり得る。物理的または光学的変化が結合の際に起こるようにレポーター分子を標的結合メンバーに連結することは、１つの実行可能な手段である。レポーター分子は、検出可能な、かつ好ましくは測定可能なシグナルを、直接的または間接的に生成し得る。レポーター分子の連結は、直接的または間接的に、共有結合による（例えば、ペプチド結合による）か、または非共有結合により得る。ペプチド結合による連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果としてあり得る。

本発明はまた、本発明に従う標的結合メンバーを例えばバイオセンサー系において使用することによる、抗原レベルの直接的な測定を提供する。

結合の決定様式は本発明の特徴ではなく、当業者は当業者の嗜好および一般的知識に従って好適な様式を選択し得る。

次に、本発明の態様および実施形態について、以下の実験を参照しながら例として説明する。

比較実施例：
２ｃ３の一次配列
図１に、リーダー配列を除くκ軽鎖配列（配列番号１５）、ならびにＬ１（配列番号２９）、Ｌ２（配列番号３０）およびＬ３（配列番号３１）と称される、Ｋａｂａｔにより定義されるところのＣＤＲループのアミノ酸配列を示す。２ｃ３軽鎖のヒト化のためのドナー配列となったのは、Ｌ１、２および３の配列である。図２に重鎖の配列（配列番号１７）を示す。この場合もそのＣＤＲを、Ｈ１（配列番号３２）、Ｈ２（配列番号３５）およびＨ３（配列番号３３）として特定する。

２ｃ３重鎖および軽鎖の分析
ヒト抗体配列のデータベースを、２ｃ３のアクセプターフレームワーク配列を特定するために分析した。ヒト抗体配列のデータベースは、９５９７種の重鎖配列および２６９５種の軽鎖配列を含む。好適なアクセプター配列を、第１に最も高いＶＣＩスコア、第２にフレームワーク（ＦＲ）スコア、第３に同一性スコアに基づいて、事前に特定した。最後に、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１およびＬ２について保存されたループ長さを有していない配列をいずれも除いた。その後、上位２０種のヒト抗体配列を調べて、ヒト化抗体、重度に変異したｓｃＦｖ抗体およびマウス抗体を排除した。異常な位置にシステインまたはプロリン残基を有するそれらの配列も排除した。

２ｃ３の重鎖アクセプターの分析
２ｃ３重鎖のための上位２０種の配列を特定した。図３に、２つのＶＣＩ残基Ａ６７ＶおよびＬ６９Ｉしか異ならない最高ＶＣＩスコアを有する配列ＡＹ３９３０９４（配列番号１９）を示す。これらは両方とも、保存的変化である。残りのフレームワーク配列を分析すると、８７残基のうち５９残基が保存されていることが認められる。２ｃ３およびＡＹ３９３０９４に見られるインターフェース残基は、我々が提案する軽鎖ＡＹ５１０１０６に対する同種の重鎖（ＡＹ５１０１０６）に保存されている。全体的にみて、この分析により、ＡＹ３９３０９４（配列番号１９）が、ＶＣＩ復帰変異をほとんど必要とし得ない優れた候補となる。

しかしながら、ＡＹ３９３０９４のＨ３ループ長さは、２ｃ３において見られる１３残基ではなく１７残基であるが、このＨ３の長さの違いは、ヒト化の際には珍しいことではなく、ＶＣＩ残基を保存することほど重要ではないと思われる。

２ｃ３の重鎖のヒト化構築物（ＲＨＡ）
図４にヒト化重鎖構築物を示す。これをＲＨＡ（配列番号２１）と命名した。リーダー配列およびフレームワーク配列はＡＹ３９３０９４に由来し、Ｋａｂａｔにより定義されるところのＨ１〜３ループは２ｃ３に由来する。５’末端にはコンセンサスコザック配列およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加し、３’末端にはＡｐａＩ制限部位を付加した。制限部位は、発現ベクターを補助するものであり、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、タンパク質発現を最大化することが意図される。Ｎ結合グリコシル化部位はモチーフＮＸ（Ｓ／Ｔ）を有するが、ヒト化重鎖においては一つも認められなかった。ペプチド切断部位の性質は、Ｓｉｇｎａｌ ＰプログラムをＲＨＡのアミノ末端ペプチド配列に適用することにより評価した。その結果から、ＶＨ５ａリーダー配列がＶＣＡ（シグナルペプチドのＣ末端）とＥＶＲ（ＦＲ１のＮ末端）との間で切断されることが確認された。

軽鎖フレームワーク分析
最良のＶＣＩおよびフレームワークスコアを有する多数のヒト軽鎖フレームワークを特定した。しかしながら、高スコアを得た上位３種の配列を検討後、全てを無視した。第１位のものについては、この軽鎖がアミロイド原繊維形成と関連することが示された抗体に由来したためであり、次の２つについては、それらの配列が１位および３位に非保存残基を有するためである。本発明者らの以前のヒト化の経験から、これらの残基は保存されるべきであると考えるに至った。

次の最良の配列は、２つのＶＣＩ残基Ｖ４４ＰおよびＹ７１Ｆが異なるだけであったが、さらなる分析により、最高フレームワークスコアを有する候補は非常に類似してはいるが、Ｌ７３ＦまたはＩ８３Ｆミスマッチのいずれかを有することが示された。フェニルアラニンは比較的大きな変化であり、これらの２種類の軽鎖において保存されているようである。２ｃ３様軽鎖フレームワークのさらなる分析により、７３位のロイシンと合わせて８３位にバリンを有し、したがって、８３位にＰｈｅを有するそれらのフレームワークの代替物を提供するかなりの数のものを見出した。このことを考慮して、本発明者らは、２ｃ３と同じＣＤＲループ長さを有するＶ８３軽鎖である軽鎖ＡＹ５１０１０６を選択した。図５にＡＹ５１０１０６の配列（配列番号２３）を示す。

２Ｃ３の軽鎖のヒト化構築物（ＲＫＡ）
図６にヒト化κ軽鎖構築物を示す。これをＲＫＡ（配列番号２５）と命名した。リーダー配列およびフレームワーク配列はＡＹ５１０１０６に由来し、Ｌ１〜３は２ｃ３に由来する。５’末端にはコンセンサスＫｏｚａｋ配列およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加し、３’末端にはＢａｍＨＩ制限部位およびスプライス部位を付加した。制限部位およびスプライス部位は、ｐＫＮ１００発現ベクター中の構築物のクローニングおよび発現に必要であり、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、タンパク質発現を最大化することが意図される。Ｎ結合グリコシル化部位はモチーフＮＸ（Ｓ／Ｔ）を有するが、ヒト化軽鎖においては一つも認められなかった。ペプチド切断部位の性質は、Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラムを２ｃ３ＲＫＡのアミノ末端ペプチド配列に適用することにより評価した。その結果から、ＶＫ１−Ａ２０リーダー配列が残基ＴＲＣ（シグナルペプチドのＣ末端にある）とＤＩ（ＦＲ１のＮ末端にある）との間で切断されることが確認された。

ＲＨＡおよびＲＫＡとキメラ２ｃ３との比較
ヒト化２ｃ３重鎖ＲＨＡおよびκ軽鎖ＲＫＡのｃＤＮＡを合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ）、それぞれＩｇＧ１重鎖発現ベクターｐＧ１Ｄ２００および軽鎖発現ベクターｐＫＮ１００にクローニングした。初めに、キメラ２ｃ３由来の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡ構築物とヒト化抗体とを合わせ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一時的にトランスフェクトするために使用した。トランスフェクトされた細胞からの上清をＥＬＩＳＡにおいて使用して、ＩＬ−２５への抗体結合を測定した。その結果（図７（Ａ））は、キメラ２ｃ３軽鎖をヒト化重鎖ＲＨＡと共に含むヒト化抗体は、キメラ２ｃ３の軽鎖および重鎖を含む抗体よりもＩＬ−２５への結合が顕著に少ないことを示した。それに対し、ＩＬ−２５への同等の結合が、キメラ２ｃ３重鎖と結合させたヒト化軽鎖ＲＫＡまたはキメラ２ｃ３軽鎖について認められた。

ヒト化重鎖の最大結合を回復しようとして、ＶＣＩ残基Ａ６７ＶおよびＩ６９Ｌを変異誘発により置換した。軽鎖ＲＫＡと合わせた二重変異体ＲＨＡ＿Ａ６７Ｖ＿Ｉ６９ＬおよびＲＨＡ＿Ｉ６９Ｌの抗原結合を、キメラ２ｃ３の抗原結合と比較した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、異なる変異誘発重鎖およびＲＫＡでコトランスフェクトし、上清をＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。図７（Ｂ）に示された結果は、ＩＬ−２５への最大抗体結合がＡ６７ＶおよびＩ６９Ｌの両残基の置換により部分的にしか回復されなかったことを示している。

さらなる変異誘発をＲＨＡに対して行った。アミノ酸置換Ｒ３Ｑ、Ｓ８２ａＬを行い、一次的にトランスフェクトさせたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清をＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。図７（Ｃ）中の結果は、これらの置換がＩＬ−２５へのヒト化抗体結合の改善に対しほとんどまたは全く効果がなかったことを示している。

したがって結論は、軽鎖のヒト化は成功し、さらなる改変を必要としないが、重鎖のさらなる操作をもってしても、明らかに十分に保存されているＶＣＩ残基を有する重鎖への、ＣＤＲの移入に基づくヒト化は成功しないということであった。

実施例１−高親和性ヒト化抗体の設計
フレームワークＡＹ３９３０９４は、ＶＣＩスコアよりも高配列同一性を優先した抗体フレームワーク領域を与えるバーニアまたはカノニカル残基の置換にもかかわらず、満足の行くヒト化抗体を提供することができなかった。この方法により、異なるクラスのヒトフレームワークが同定された。これらのうち、最高ＶＣＩスコアを有するフレームワークを選択した。そのリーダー配列は未知であったため、ＶＨ５ａリーダー配列のものを代わりとして使用した。図８に、選択されたヒトＶＨドメインＡＪ３９９８２３の配列（配列番号２７）を示す。

そのＣＤＲを２ｃ３のＣＤＲで置換し、第２のヒト化抗体をＲＨ２と名付けた。その配列を、配列番号４として示す。ＲＨ２は、５つの非保存ＶＣＩ残基：Ｓｅｒ３０；Ｍｅｔ４８；Ｖａｌ６７；Ａｒｇ７１およびＴｈｒ７３（Ｋａｂａｔ番号付け）を有する。これらの残基は、以下ではそれぞれｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆと呼ぶ。

そのＶＣＩ置換を全て含むヒト化重鎖をＲＨ２ｂｃｄｅｆと名付け、軽鎖ＲＫＡと結合させて試験した。一次的にトランスフェクトさせたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清を、ＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。ＲＨＡとＲＨ２ｂｃｄｅｆとの間の比較は、ＲＨＡと比較して改善されたＩＬ−２５への結合を示したが、キメラ２ｃ３により示される１００％の結合を回復することはできなかった。したがって結論は、２ｃ３の直接的なヒト化に対する代替的アプローチが必要とされるということであった。

実施例２−ＲＨ２ｂｃｄｅｆのＣＤＲの改変
２つのＣＤＲ残基がヒト化抗体の効力を改善することが見出された。変異Ｄ３１ＧおよびＧ９６ＤをＲＨ２ｂｃｄｅｆに導入し、一次的にトランスフェクトさせたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に使用した。上清をＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。図９（Ａ）中の結果は、Ｄ３１Ｇ変異がＲＨ２ｂｃｄｅｆの効力を２ｃ３のレベルに回復することを示している。しかしながら、Ｇ９６Ｄ変異（図９（Ｂ））は、２ｃ３の抗原結合効力を実質的に超えて抗原結合効力を増大させる。

これら２つの変異が相加的であるか否かを試験するために、両方をＲＨ２ｂｃｄｅｆに組み込んだ。一次的にトランスフェクトさせたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清を、ＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。図１０に示された結果は、両方のＣＤＲ変異を組み込むことによるヒト化において、わずかではあるが顕著な効力の増大があることを示唆している。

我々のデータはまた、抗体の類似した結合特性を維持するために、３１位が、ＧｌｙまたはＡｓｐに加えて、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＭｅｔからも選択され得ることを示す。

実施例３−残基９６（Ｋａｂａｔ）の改変
どのアミノ酸が残基９６にて許容され得るかをより良く理解するために、代表的なアミノ酸を選択して変異誘発によりグリシンを置換した。ＲＨ２ｂｃｄｅｆに対し、以下の変異：Ｇ９６Ｙ、Ｇ９６Ｎ、Ｇ９６Ｓ、Ｇ９６Ｌ、Ｇ９６ＫおよびＧ９６Ｅを作製した。これらの発現構築物をＲＫＡと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、上清をＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。その結果は、９６位のアスパルテートのアスパラギンによる置換のみが、同等の効力のものであり、この位置で試験された他の残基は全てＩＬ−２５への結合に悪影響を及ぼすことを示した。驚くことに、効力に対する悪影響は、アスパルテートと同様に負に荷電した残基であるグルタメートによる置換も包含した。効力増大へのアスパルテートの最も重要な貢献が、負電荷ではないと結論付け得る。

したがって、本発明のＶＨドメイン中の残基９６（Ｋａｂａｔ）は、アスパルテートまたはアスパラギンであり得る。

実施例４−ＲＨ２へのマウスＶＣＩ残基の最低必要要件の決定
ヒト化抗体に対する潜在的な免疫原の影響を極力小さくするために、マウスアミノ酸フレームワーク置換の数を極力少なくすることが望まれる。ヒト化重鎖ＲＨ２ｂｃｄｅｆ＿Ｇ９６Ｄは、ＲＨ２．１と命名され、２ｃ３からの５つのＶＣＩ置換を有した。最初に４つを除去して、どの残基が効力に貢献したかを特定した。

変異ｃ、ｄ、ｅ、およびｆを、単一変異として内因性ヒトフレームワーク残基で置換した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をＶＣＩ変異およびＲＫＡでコトランスフェクトし、上清をＩＬ−２５結合ＥＬＩＳＡにおいて試験した。驚くことに、ヒト残基Ｖ６７またはＴ７３を再導入すると、予期しないわずかな効力の向上があることが見出された。４８位のＭｅｔをマウスＩｌｅに戻すことに、何ら顕著な効果はなかった。

しかしながら、７１位におけるヒトアルギニン残基の存在は、ＩＬ−２５への結合に悪影響を及ぼすようであった。したがって結論は、マウスＶＣＩ残基Ｖａｌ７１のみがヒト化抗体において非常に望ましいということであった。その他の残基は、マウスまたはヒトのいずれかであり得る。

最適な最終ヒト化重鎖を特定するために、マウスＶＣＩ残基を全く含まない、ＲＨ２．５（配列番号４）と呼ばれる新しいバージョンの重鎖を合成した。さらに、ＲＨ２．５の２種の改変バージョンを、ＶＣＩ変異Ｓ３０Ｔ（配列番号３）またはＲ７１Ｖ（配列番号２）のいずれかを用いて作製した。これら３種の新規ヒト化抗体のＩＬ−２５への結合を、ＥＬＩＳＡにより分析した。その結果を図１１に示す。ＲＨ２．５との比較において、Ｓ３０ＴまたはＲ７１Ｖの追加は、ヒトＩＬ−２５への結合を同程度に向上させることが見出された。

したがって、本発明の一部の実施形態において、重鎖の３０位および７１位が、それぞれＳからＴおよびＲからＶに、別個にまたは組み合わせて改変され得る。

実施例５−抗体の熱安定性
ＲＨ２．５＿Ｓ３０Ｔ（配列番号３）およびＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ（配列番号２）の熱安定性を決定した。抗体を様々な温度で１０分間維持し、次いで室温まで急冷し、ＩＬ−２５と結合するそれらの能力をＥＬＩＳＡにより測定した。２ｃ３キメラ抗体（コントロール）はより大きな熱安定性を保持し、７５℃の温度まで活性であることが分かった。ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖは６５℃まで活性を維持し、ＲＨ２．５＿Ｓ３０Ｔは６０℃まで活性であった。

実施例６−ヒト化抗体の非Ｂ／非Ｔ細胞バイオアッセイ
ＩＬ−２５活性を測定するために利用可能なインビトロバイオアッセイはごく少数しかない。１つの強力なアッセイは、マウスの腸間膜リンパ節から単離された非Ｂ／非Ｔ（ＮＢ／ＮＴ）細胞からのＩＬ−１３の放出を測定することである。このアッセイにおいて、細胞をＩＬ−２５および様々な濃度の抗体と共にインキュベートし、３日間の刺激後、ＩＬ−１３を測定した。その結果は、マウス２ｃ３抗体がＩＬ−１３産生を部分的にしか阻害しないことを示した。それに対し、ＲＨ２．５＿Ｒ７１ＶおよびＳ３０Ｔは、両方ともＩＬ−１３産生を除去（ａｂｌａｔｅ）し、ＲＨ２．５は、ＩＬ−１３産生を顕著に減少させた。興味深いことに、ＲＨ２．５＿Ｒ７１ＶおよびＲＨ２．５＿Ｓ３０Ｔは、両方とも０．２５μｇ／ｍＬもの低い濃度でなおＩＬ−１３産生の完全な阻害を示したが、ＲＨ２．５についてはいくらかの低レベルのサイトカイン産生をこの濃度で認め得た。これらのデータは、ヒト化抗体には２ｃ３キメラ抗体よりも大きな効力があり、変異Ｒ７１ＶおよびＳ３０Ｔが抗原結合効力を向上させたという見解と一致する。

実施例７−ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖによる気道過敏性の阻害
さらなる実験において、ヒト化抗体ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖを、急性気道過敏性（ＡＨＲ）のマウスモデルにおいて試験した。図１２に実験プロトコルを要約する。マウスを最初にオボアルブミンに感作させ、次いで抗ＩＬ−２５抗体の存在下でチャレンジした。図１３（Ａ）中の結果は、ＡＨＲ応答が、マウス１匹当たり５００μｇ用量の２ｃ３の添加によっては阻止されたが、この用量をマウス１匹当たり５０μｇ用量に低下させた場合には阻止されなかったことを示している。それに対し、図１３（Ｂ）に示されるように、わずか５０μｇ用量（２．５ｍｇ／Ｋｇ）のヒト化抗体ＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖを使用して、ＡＨＲが阻止された。これらのデータは、ヒト化抗体には２ｃ３抗体よりも顕著に大きな効力があるという見解にさらなる裏付けを与える。

実施例８−大腸炎の処置
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）を前感作するために、腹部皮膚の一領域を剃毛し、１００％エタノール中オキサゾロンの３％（ｗ／ｖ）溶液を１５０μＬ適用した。コントロールマウスを、１５０μＬの１００％エタノールの適用により前感作した。前感作の７日後、マウスを、イソフルランによる麻酔下で、１５０μＬの５０％エタノール中３％オキサゾロンまたは５０％エタノールのみ（コントロール）を用いて直腸内に再チャレンジした。結腸および盲腸内全体へのオキサゾロンの分布を確実にするために、注射後１分間、マウスを直立した姿勢で維持した。ヒトＩｇＧ１主鎖中のマウス２Ｃ３配列のキメラである抗体（１００μｇ／用量）を、前感作前日およびオキサゾロンの直腸内（ｉ．ｒ．）投与前日の両方に腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。コントロールマウスには、アイソタイプコントロールヒトＩｇＧ４（１００μｇ／用量）を与えた。ここで概説される全ての動物実験は、英国内務省（Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ）の許可を得て行われた。

結腸長さを、５０％エタノールとＩｇＧ４アイソタイプコントロールｉ．ｐ．（５０％ＥｔＯＨ ＩｇＧ４）；５０％エタノールｉ．ｒ．と抗ＩＬ−２５ｉ．ｐ．（５０％ＥｔＯＨ 抗ＩＬ−２５）；３％オキサゾロンを含む５０％エタノールｉ．ｒ．とＩｇＧ１アイソタイプコントロールｉ．ｐ．（３％オキサゾロン ＩｇＧ４）および３％オキサゾロンを含む５０％エタノールｉ．ｒ．と抗ＩＬ−２５ｉ．ｐ．（３％オキサゾロン 抗ＩＬ−２５）のいずれかの１日３回の投与後に、各マウス群において測定した。

動物の体重を、上記の処置後に毎日測定した。

図１４Ａは、オキサゾロンの投与が、大腸炎の指標として結腸長さの減少を引き起こすことを示している。オキサゾロンおよび２Ｃ３由来抗ＩＬ−２５抗体で処置された動物は、オキサゾロンおよびＩｇＧ４アイソタイプで処置された動物と比較してより長い結腸（改善された予後）を有する傾向を示す。オキサゾロンでの処置はまた、ビヒクルのみのコントロールと比較して体重減少を引き起こす（図１４Ｂ）。オキサゾロンおよび抗ＩＬ−２５で処置された動物も体重を減少させるが、３日目に、オキサゾロン ＩｇＧ４アイソタイプで処置された群よりも急速に体重を回復する傾向を示す。

材料および方法
略語
ＡＨＲ 気道過敏性
℃ 摂氏度
ｂｐ 塩基対
ＤＭＥＭ ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ａｄｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）
ＦＣＳ ウシ胎仔血清
ＦＲ フレームワーク
ｇ グラム
ＨＥＫ ２９３Ｔ ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞）
ｈｒ 時間
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩｇＧ 免疫グロブリン
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ｍｉｎ 分
ＮＢ／ＮＴ マウス腸間膜リンパ節から単離された非Ｂ／非Ｔ細胞
ＮＩＭＲ 国立医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（英国）
ｎｍ ナノメートル
ＯＤ 光学密度
ＰＢＳ リン酸緩衝化生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＨ 組換え重鎖
ＲＫ 組換えκ鎖
ＲＴ 室温
ｓｅｃ 秒
ＵＶ 紫外線
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＬ 免疫グロブリン軽鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンκ軽鎖可変領域

キメラおよびヒト化抗体可変遺伝子のクローニング
２ｃ３の重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡならびにヒト化抗体の可変領域ｃＤＮＡを合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ）。重鎖Ｖ領域を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ制限酵素部位を介してｐＧ１Ｄ２００にクローニングした。同様に、軽鎖Ｖ領域を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を介してｐＫＮ１００にクローニングした。ｐＧ１Ｄ２００ベクターは、５μｇのＤＮＡを、マルチコア（ｍｕｌｔｉｃｏｒｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）制限消化緩衝液中２０単位のＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩを用いて３７℃にて２時間消化することにより、ライゲーションのために調製された。続いて、１単位のＡｎｔａｒｃｔｉｃアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）をＤＮＡに加え、製造業者の指示書に従って、１５〜３０分の間インキュベートした。次いで、このベクター調製物を、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムで精製した。このベクターを５０μＬに溶出させた。同様に、ｐＫＮ１００ベクターは、５μｇのＤＮＡを、バッファーＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中２０単位のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃にて１時間消化することにより調製された。このＤＮＡをＡｎｔａｒｃｔｉｃアルカリホスファターゼで処理し、上記と同様に精製した。Ｖ領域インサートＤＮＡ（約４μｇ）を上記と同様に消化し、重鎖および軽鎖フラグメントを、ゲル電気泳動によりベクターから精製した。適切なバンドをゲルから切り出し、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、５０μＬに溶出させた。ライゲーションを、１μＬのベクターと１μＬまたは３μＬのインサートＤＮＡとを１×Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）および１μＬのＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ中で混合することにより実施し、室温（２０℃）にて１０分間インキュベートした。この反応物を、５０μＬの１０βコンピテント細胞（ＮＥＢ）を形質転換するために使用した。ベクター構築物は、ＤＮＡ配列決定により確認され、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）により完成された。

可変遺伝子合成および部位特異的変異誘発
可変遺伝子はＧｅｎｅＡｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。

部位特異的変異誘発を、ＲＨＡ変異Ｒ３ＱおよびＬ８２ａＳにおいてＰｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）法を製造業者の指示書に従って使用した以外は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の指示書に従って使用して行った。

ＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを０．４μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で被覆し、４℃にて１ヶ月間だけ保存した。使用前に、プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）中で３回洗浄し、次いでＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）／０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中でブロックした。プレートを前と同様に洗浄し、試料上清を、倍加希釈（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）を用いてある濃度範囲にわたって加え、３７℃にて１時間にわたりインキュベートした。プレートを前と同様に洗浄し、１：５０００希釈のヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。プレートを前と同様に洗浄し、次いで１５０μＬのＫ Ｂｌｕｅ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ基質（Ｎｅｏｇｅｎ）を加えた。１０分後、５０μＬのＲｅｄ Ｓｔｏｐ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ）を用いて反応を停止させ、光学密度を６５５ｎｍで測定した。

サイトカイン結合アッセイ
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中０．２５μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆し、４℃にて１ヶ月間だけ保存した。使用前に、プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）中で３回洗浄し、次いでＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）／０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中でブロックした。プレートを前と同様に洗浄し、試料上清を、倍加希釈を用いてある濃度範囲にわたって加え、３７℃にて１時間にわたりインキュベートした。プレートを前と同様に洗浄し、１：５０００希釈のヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。プレートを前と同様に洗浄し、次いで１５０μＬのＫ Ｂｌｕｅ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ基質（Ｎｅｏｇｅｎ）を加えた。１０分後、５０μＬのＲｅｄ Ｓｔｏｐ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ）を用いて反応を停止させ、光学密度を６５０ｎｍで測定した。

マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ ＵＫ（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，ＵＫ）から入手し、特定の病原体がいない環境下の施設であるＳｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｕｎｉｔ ａｎｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ＬＭＢ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅで維持した。本報告で概説される全ての動物実験は、英国内務省の許可を得て行われた。

非Ｂ非Ｔ細胞アッセイ
非Ｂ／非Ｔ（ＮＢＮＴ）細胞を腸間膜リンパ節から精製し、１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−２５と共にまたは無しに、かつマウスＩｇＧ１アイソタイプ（抗ｃ−ｍｙｃ）または抗ｍＩＬ−２５ ２ｃ３と共に、ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール（抗マラリア）、抗ｈＩＬ−２５ ＲＨ２．５ Ｒ７１Ｖ、抗ｈＩＬ−２５ ＲＨ２．５ Ｓ３０Ｔ、または抗ｈＩＬ−２５ ＲＨ２．５のいずれかの様々な濃度で、７２時間にわたりインキュベートした。ＩＬ−１３産生を、２つの複製ウェルから出し合った細胞上清からＥＬＩＳＡにより評価した。ＩＬ−１３ ＥＬＩＳＡは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｍｕｒｉｎｅ ＩＬ−１３ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。

気道過敏性（ＡＨＲ）の急性モデルの実験的設計
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１２週）を、０日目および１２日目に、ミョウバンとの複合体としたＰＢＳ中オボアルブミン（２０μｇ／注射）またはＰＢＳおよびミョウバンのみ（コントロール）の腹腔内投与により感作した。１％オボアルブミンのエアゾール投与を、１９日目、２０日目および２１日目に、１日２０分間行った。コントロール動物には、ＰＢＳを与えた。各肺チャレンジの２時間前に、２ｃ３、マウスＩｇＧ１コントロール、ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール（抗マラリア）、または抗ｈＩＬ−２５ ＲＨ２．５ Ｒ７１Ｖのいずれかの腹腔内投与もマウスに与えた。２２日目に、これらの動物を拘束プレチスモグラフィを用いて分析して、ＡＨＲを評価した。オボアルブミンおよび抗体を内毒素について試験し、１．２ＥＵ／ｍＬであったＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ以外は、０．１ＥＵ／ｍＬを下回ることが分かった。

ＡＨＲの測定
動物に麻酔をかけ、気管切開を施し、約１５０呼吸／分の速度で一回喚起量が０．１５ｍＬの人工呼吸器（Ｍｉｎｉｖｅｎｔ ８４５人工呼吸器，ＥＭＭＳ，ＵＫ）を装着した。マウスを拘束全身プレチスモグラフ（ＥＭＭＳ Ｈａｎｔｓ，ＵＫ）でモニタリングし、経肺圧をインライン変換器（ｉｎｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）により評価した。安定なベースライン肺抵抗を記録後、漸増濃度のアセチル−β−メチルコリンクロリド（メタコリン；Ｓｉｇｍａ，Ｄｏｒｓｅｔ，（Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））を、超音波ネブライザーを用いてエアゾールにより１０秒間投与し、肺抵抗を３分間にわたり記録した。ＥＤａｑソフトウェア（ＥＭＭＳ Ｈａｎｔｓ，ＵＫ）を使用して、気道抵抗、コンプライアンス、および標準的な肺パラメータを分析した。

参考文献
１．Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７，７（Ｊｕｌ，２００２）．
２．Ｇ．Ｇｒｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，２２６１（１９９８）．
３．Ｍ．Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，２２５８（１９９８）．
４．Ｍ．Ｍ．Ｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５，９８５（Ｄｅｃ，２００１）．
５．Ｍ．Ｒ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １００，２３３０（Ｏｃｔ １，２００２）．
６．Ｇ．Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７，６５５９（Ｄｅｃ １，２００１）．
７．Ｓ．Ｄ．Ｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，４４３（Ｊｕｌ １，２００２）．
８．Ｔ．Ａ．Ｍｏｓｅｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １４，１５５（Ａｐｒ，２００３）．
９．Ｐ．Ｇ．Ｆａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３，１１０５（Ａｐｒ １７，２００６）．
１０．Ａ．Ｍ．Ｏｗｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３，８４３（Ａｐｒ １７，２００６）．
１１．Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２２（１９８６）．
１２．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）．
１３．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．＆ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）．
１４．Ｆｏｏｔｅ Ｊ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２４：４８７（１９９２）．
１５．Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３２４（２００７）．
１６．Ｈｅｌｌｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７，６２９−６３８（２００２）
１７．Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ２４−７（２００８）
１８．Ｆｏｒｔ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５，９８５−９９５（２００１）
１９．Ｂｕｎｉｎｇ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ ３０，３２９−３３３（２００３）
２０．Ｈａｎａｕｅｒ，Ｓ．Ｂ．Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２７ Ｓｕｐｐｌ １，１５−２１（２００８）
２１．Ｐａｐａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １０４，１５７５−１５８６（２００９）
２２．Ｙｕｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｈａｎａｕｅｒ，Ｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ３，２３５−２４８（２００９）

配列：
配列番号１−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

ここで：
Ｘａ１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａ２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり；
Ｘａ３は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ｘａ４は、ＶａｌまたはＡｒｇであり；そして
Ｘａ５は、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｙである。

配列番号２−ヒト化ＶＨドメインＲＨ２．５＿Ｓ３０Ｔ（人工）

配列番号３−ヒト化ＶＨドメインＲＨ２．５＿Ｒ７１Ｖ（人工）

配列番号４−ヒト化ＶＨドメインＲＨ２（人工）

配列番号５−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号６−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号７−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号８−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号９−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号１０−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号１１−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号１２−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号１３−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号１４−ヒト化ＶＨドメイン（人工）

配列番号１５−２ｃ３のＶＫドメイン（マウス）

配列番号１６−２ｃ３のＶＫドメインをコードする核酸

配列番号１７−リーダー配列を含む２ｃ３のＶＨドメイン（マウス）

配列番号１８−２ｃ３のＶＨドメインをコードする核酸

配列番号１９−ＡＹ３９３０９４ ＶＨドメイン（ヒト）

配列番号２０−ＡＹ３９３０９４ ＶＨドメインをコードする核酸

配列番号２１−ＲＨＡ ＶＨドメイン（人工）

配列番号２２−ＲＨＡ ＶＨドメインをコードする核酸（人工）

配列番号２３−ＡＹ５１０１０６ ＶＫドメイン（ヒト）

配列番号２４−ＡＹ５１０１０６ ＶＫドメインをコードする核酸

配列番号２５−ヒト化２ｃ３ ＶＫドメイン ＲＫＡ（人工）

配列番号２６−ヒト化２ｃ３ ＶＫドメイン ＲＫＡをコードする核酸

配列番号２７−ＡＪ３９９８２３ ＶＨドメイン（ヒト）

配列番号２８−ＡＪ３９９８２３ ＶＨドメインをコードする核酸（ヒト）

配列番号２９−軽鎖ＣＤＲ１（マウス）
ＳＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮ

配列番号３０−軽鎖ＣＤＲ２（マウス）
ＹＴＳＳＬＨＳ

配列番号３１−軽鎖ＣＤＲ３（マウス）
ＱＱＹＳＫＬＰＹＴ

配列番号３２−重鎖ＣＤＲ１（マウス）
ＤＹＴＭＮ

配列番号３３−重鎖ＣＤＲ３（マウス）
ＥＧＹＤＧＹＬＹＦＡＭＤＹ

配列番号３４−重鎖ＣＤＲ１（人工）
ＧＹＴＭＮ

配列番号３５−重鎖ＣＤＲ２（マウス）
ＬＩＮＰＹＮＧＧＴＳＹＮＱＮＦＫＧ

配列番号３６−重鎖ＣＤＲ３（人工）
ＥＤＹＤＧＹＬＹＦＡＭＤＹ

配列番号３７−ＶＨドメインリーダー配列：
ＭＧＳＴＡＩＬＧＬＬＬＡＶＬＱＧＶＣＡ

配列番号３８−２Ｃ３ ＶＫドメインリーダー配列：
ＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＤＴＲＣ

配列番号３９−ヒトＶＬリーダー配列：
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＤＴＲＣ

配列番号４０−ＲＨ２．５ Ｒ７１Ｖをコードする核酸（人工）

配列番号４１−Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（人工）
ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣ

本明細書において引用された全ての特許、公開出願および参考文献の教示は、その全体が参照により援用される。

本発明を、その例示的実施形態を参照しながら詳細に示し説明してきたが、当業者には、形態および詳細の様々な変更を、添付される特許請求の範囲により包含される発明の範囲から逸脱することなく本発明に加え得ることが理解される。

Claims (14)

1. ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬドメインならびにＶＨドメインを含む、インターロイキン２５（ＩＬ−２５）に特異的に結合する抗体であって、
   前記ＶＬドメインのＫａｂａｔ ＣＤＲ１〜３が、それぞれ配列番号１５の、残基２４〜３４（配列番号：２９）；残基５０〜５６（配列番号：３０）および残基８９〜９７（配列番号：３１）として示され、
   前記ＶＨドメインは、配列番号：１：
   
   を含み、ここで：
   Ｘａ１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
   Ｘａ２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり；
   Ｘａ３は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
   Ｘａ４は、ＶａｌまたはＡｒｇであり；そして
   Ｘａ５は、ＡｓｐまたはＡｓｎである、
   抗体。
2. （ａ）Ｘａ２がＧｌｙである；
   （ｂ）Ｘａ２がＧｌｙであり、Ｘａ５がＡｓｐである；
   （ｃ）Ｘａ１がＳｅｒである；
   （ｄ）Ｘａ１がＴｈｒである；
   （ｅ）Ｘａ３がＭｅｔである；
   （ｆ）Ｘａ３がＩｌｅである；
   （ｇ）Ｘａ４がＶａｌである；または
   （ｈ）Ｘａ４がＡｒｇである、
   請求項１に記載の抗体。
3. 前記残基Ｘａ１〜Ｘａ５が、以下：
   
   の組み合わせとなっている、請求項１に記載の抗体。
4. （ａ）前記ＶＬドメインが、ＣＤＲ１（配列番号：２９）に隣接する配列番号：１５の残基３５〜３８をさらに含む；
   （ｂ）前記抗体が配列番号：１５を含む；
   （ｃ）前記ＶＬドメインがヒト化されている；または
   （ｄ）前記ＶＬドメインがヒト化されており、前記抗体の配列が、配列番号：２５のアミノ酸２１〜１２７を含む、
   請求項１に記載の抗体。
5. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖまたはＦｖである、請求項１に記載の抗体。
6. 抗体定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
7. （ａ）前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４定常領域である；または
   （ｂ）前記抗体が抗体全体を含む
   請求項６に記載の抗体。
8. 請求項１に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
9. プロモーターに作動可能に連結された請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
10. 請求項９に記載の発現ベクターを有する宿主細胞。
11. 前記抗体の産生条件下で請求項１０に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗体を製造する方法であって、該方法が任意に、前記抗体を単離する工程をさらに含み、任意に、少なくとも１つのさらなる成分を含む組成物に前記抗体を配合する工程をさらに含む、方法。
12. 請求項１に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含み、任意に凍結乾燥粉末の形態にある組成物。
13. （ａ）喘息；
    （ｂ）炎症性腸疾患
    （ｃ）潰瘍性大腸炎；または
    （ｄ）クローン病
    の治療または予防における使用のための、請求項１〜７いずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
14. ＩＬ−２５に対する抗体をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）配列番号：１：
    
    を含むＶＨドメインを提供する工程、ここで、
    Ｘａ１は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
    Ｘａ２は、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり；
    Ｘａ３は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
    Ｘａ４は、ＶａｌまたはＡｒｇであり；
    Ｘａ５は、ＡｓｐまたはＡｓｎである；
    （ｂ）前記ＶＨドメインを複数の抗体ＶＬドメインと組み合わせて抗体分子を提供する工程、ここで、各ＶＬドメインは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含む；
    （ｃ）前記抗体分子をＩＬ−２５への結合についてスクリーニングする工程；および
    （ｄ）ＩＬ−２５と結合する抗体分子を選択する工程
    を含む、方法。