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ES2537226T3 - Anticuerpos contra IL-25 - Google Patents

Anticuerpos contra IL-25 Download PDF

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ES2537226T3
ES2537226T3 ES09795802.9T ES09795802T ES2537226T3 ES 2537226 T3 ES2537226 T3 ES 2537226T3 ES 09795802 T ES09795802 T ES 09795802T ES 2537226 T3 ES2537226 T3 ES 2537226T3
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Spain
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tyr
val
thr
ser
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ES09795802.9T
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David John Matthews
Jillian Barlow
Andrew Neil James Mckenzie
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Original Assignee
Medical Research Council
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Abstract

Un miembro de unión a diana que se une a IL-25, que comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende las CDR 1-3 de Kabat como se expone como los restos 24-34 (SEC ID Nº: 29); 50-56 (SEC ID Nº: 30) y 89-97 (SEC ID Nº: 31), respectivamente, de SEC ID Nº: 15 y un dominio VH de anticuerpo que comprende SEC ID Nº: 1: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser en donde: Xa1 es Ser o Thr; Xa2 es Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr o Met; Xa3 es Met o Ile; Xa4 es Val o Arg; y Xa5 es Asp, Asn o Gly.

Description

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La pluralidad de dominios VL puede ser cualquiera de 104 dominios individuales hacia arriba, por ejemplo, de 106 a 108 ó 1010 dominios.
Las moléculas de anticuerpo, y ácido nucleico que codifica dichas moléculas, pueden formar una parte adicional de 5 la presente invención.
IL-25
IL-25, también denominado en la técnica IL-17E, está disponible de fuentes comerciales (por ejemplo R&D Systems, MN, EEUU) o puede clonarse o sintetizarse por referencia a las secuencias de IL-25 disponibles en la técnica. La IL25 murina (proteína NCBI NP_542767) se describe por Hurst et al, 2002 (Ref. 7 más adelante). La IL-25 humana (proteína NCBI Q9H293) se describe por Fort et al. (Ref. 4 más adelante). Para la producción de anticuerpos o uso en inmunoensayos, pueden usarse fragmentos de IL-25 recombinante, particularmente los truncados en el extremo
N. Por ejemplo, la IL-25 humana recombinante comercialmente disponible (IL-17E) comprende la secuencia de
15 proteína madura de Tyr 33 -Gly 177 de nº de acceso Q9H293) y la IL-25 murina comercialmente disponible comprende los restos Val 17 -Ala 169 de IL-17E de ratón (nº de Acceso NP_542767).
Ácidos nucleicos y vectores
En aspectos adicionales, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de unión a diana, un dominio VH o un dominio VL según la presente invención, y métodos para preparar un miembro de unión a diana, un dominio VH o un dominio VL de la invención, que comprende expresar dicho ácido nucleico en condiciones para provocar la producción de dicho miembro de unión a diana, dominio VH o dominio VL y recuperarlo.
25 Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender las secuencias o porciones relevantes de las mismas (por ejemplo, regiones que codifican CDR) de SEC ID Nº: 40 (para cadenas pesadas) o SEC ID Nº: 26 (para cadenas ligeras), o variantes de estas secuencias modificadas mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio para codificar otros dominios VH y VL de la invención. Adicionalmente, puede variarse el uso de codón, por ejemplo, para optimizar la expresión de la secuencia en una célula huésped deseada.
La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión a diana de la presente invención. El ácido nucleico incluye ADN y ARN.
35 El ácido nucleico según la presente invención puede comprender ADN o ARN y puede ser completa o parcialmente sintético. Referencia a una secuencia de nucleótidos, como se expone en el presente documento, incluye una molécula de ADN con la secuencia especificada y engloba una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera otra cosa.
La presente invención también proporciona vectores, por ejemplo, en forma de plásmidos, virus, por ejemplo, fago o fagémido, cósmidos, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un ácido nucleico como antes.
Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes
45 marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Los vectores de la invención también incluyen vectores virales que pueden infectar células humanas in vivo, por ejemplo, vectores adenovirales, retrovirales o de virus adeno-asociados. Tales vectores pueden ser útiles para la expresión de un miembro de unión a diana de la invención en las células de un sujeto humano o animal, para proporcionar la producción y administración del miembro de unión a diana a dicho sujeto.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica un miembro de unión a diana de la invención, en un aspecto, estará operativamente ligada a un promotor para efectuar la expresión del miembro de unión a diana en una célula
55 huésped. La secuencia puede incluir en su extremo 5' una secuencia conductora para facilitar la expresión y/o secreción del miembro de unión a diana en y/o a partir de una célula huésped. Se conocen numerosas secuencias conductoras adecuadas como tales en la técnica y pueden seleccionarse por un experto en la materia teniendo en cuenta la célula huésped.
Secuencias conductoras adecuadas incluyen cualquier secuencia conductora de inmunoglobulina humana o de otro mamífero, aunque en su lugar podría usarse una secuencia conductora de mamífero de no inmunoglobulina o una secuencia conductora sintética. Preferentemente para la expresión de una cadena de VH se usa una secuencia conductora VH humana. Preferentemente para la expresión de una cadena de VL se usa una secuencia conductora VL humana.
65 Una secuencia conductora adecuada para la expresión de un dominio VH de la invención es:
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fuertemente mutados y anticuerpos de ratón. También se eliminaron aquellas secuencias con restos de cisteína o prolina en posiciones atípicas.
Análisis del aceptor de cadena pesada para 2c3
5 Se identificaron las 20 primeras secuencias para la cadena pesada de 2c3. En la Figura 3 se muestra la secuencia AY393094, con la puntuación de VCI superior (SEC ID Nº: 19), con únicamente 2 restos de VCI diferentes A67V y L691. Estos dos cambios son conservativos. El análisis del resto de la secuencia de la región estructural muestra que 59 de los 87 restos están conservados. Los restos de la superficie de separación encontrados en 2c3 y AY393094 se conservan en la cadena pesada relacionada (AY510106) para la cadena ligera propuesta por los presentes inventores, AY510106. En conjunto, el análisis hace que AY393094 (SEC ID Nº: 19) sea un buen candidato que puede requerir pocas retromutaciones de VCI.
Sin embargo, la longitud del bucle H3 de AY393094 es 17 en lugar de los 13 restos encontrados en 2c3, pero esta
15 diferencia en la longitud de H3 no es poco común durante las humanizaciones y se considera menos importante que conservar los restos de VCI.
Construcción humanizada de la cadena pesada de 2c3 (RHA)
En la Figura 4 se muestra la construcción de la cadena pesada humanizada y se denominó RHA (SEC ID Nº: 21). La secuencia conductora y la secuencia de la región estructural son de AY393094 y los bucles de H1-3, como se definen por Kabat son de 2c3. En el extremo 5' se ha añadido una secuencia consenso de Kozak y un sitio de restricción Hindlll mientras que en el extremo 3' se ha añadido un sitio de restricción Apal. Los sitios de restricción son para ayudar a los vectores de expresión y la secuencia consenso de Kozak tiene por objeto maximizar la
25 expresión de proteínas. Los sitios de glucosilación unidos a N tienen el motivo NX(S/T), no se encontró ninguno en la cadena pesada humanizada. La calidad del sitio de escisión peptídico se evaluó aplicando el programa Signal P a la secuencia de péptidos del extremo amino de RHA. Los resultados confirmaron que la secuencia conductora de VH5a se escindirá entre VCA (el extremo C del péptido señal) y EVR (el extremo N de FR1).
Análisis de la región estructural de la cadena ligera
Se identificaron varias regiones estructurales de la cadena ligera humana con las mejores puntuaciones de VCI y de región estructural. Sin embargo, después de considerar las tres secuencias de mayor puntuación, todas se descartaron. La primera porque esta cadena ligera era de un anticuerpo que se había mostrado que se asociaba con
35 la formación de fibrilla amiloide, las dos siguientes ya que las secuencias no tienen restos conservados en las posiciones 1 y 3. La experiencia de humanización previa de los inventores les condujo a creer que estos restos deberían estar conservados.
Las siguientes mejores secuencias solo se diferenciaron en dos restos de VCI V44P e Y71F, aunque en un análisis adicional se observó que los candidatos con las mayores puntuaciones de la región estructural fueron muy similares, pero tenían tanto desapareamientos L73F como I83F. La fenilalanina es un cambio relativamente grande y parece estar conservada en estos dos tipos de cadenas ligeras. El análisis adicional de regiones estructurales de la cadena ligera similares a 2c3 encontró un número significativo que tenía una valina en la posición 83 combinada con leucina en la posición 73 y así proporciona una alternativa a aquellas regiones estructurales con una Phe en la posición 83.
45 En vista de esto, los inventores seleccionaron una cadena ligera, AY510106, que es una cadena ligera de V83 con las mismas longitudes de bucle de CDR que 2c3. La secuencia para AY510106 (SEC ID Nº: 23) se muestra en la Figura 5.
Construcción humanizada de la cadena ligera de 2c3 (RKA)
En la Figura 6 se muestra la construcción de la cadena ligera kappa humanizada y se denominó RKA (SEC ID Nº: 25). La secuencia conductora y la secuencia de región estructural son de AY510106 y L1-3 es de 2c3. En el extremo 5' se ha añadido una secuencia de Kozak consenso y un sitio de restricción Hindlll mientras que en el extremo 3' se ha añadido un sitio de restricción de BamHI y un sitio de corte y empalme. Los sitios de restricción y los sitios de
55 corte y empalme son necesarios para clonar y expresar la construcción en el vector de expresión pKN100 y la secuencia consenso de Kozak tiene por objeto maximizar la expresión de proteínas. Los sitios de glucosilación unidos a N tienen el motivo NX(S/T), ninguno se encontró en la cadena ligera humanizada. La calidad del sitio de escisión peptídico se evaluó aplicando el programa Signal P a la secuencia de péptidos del extremo amino de RKA de 2c3. Los resultados confirmaron que la secuencia conductora VK1-A20 se escindió entre los restos TRC (en el extremo C del péptido de señal) y DI (en el extremo N de FR1). Comparación de RHA y RKA con 2c3 quimérico
Se sintetizaron los ADNc de RHA de la cadena pesada y RKA de la cadena ligera kappa de 2c3 humanizados (GeneArt AG) y se clonaron en el vector de expresión de cadena pesada de lgG1 pG1D200 y el vector de expresión
65 de cadena ligera pKN100, respectivamente. Inicialmente, se combinaron las construcciones de ADNc de la cadena pesada y ligera de 2c3 quimérico y el anticuerpo humanizado y se usaron para transfectar transitoriamente células
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Artículo
Proveedor en RU Número de catálogo Números de lote
Células de E. coli competentes 10β
NEB C3019H
Agarosa (UltraPure™)
Invitrogen 15510-027 3048948
Albúmina bovina (BSA)
Sigma A7030 086K1230
Ampicilina
Sigma A-9518 63H0992
Fosfatasa Antártica
NEB M0289S 13
Apa I
Promega R636 20381008
Bam HI
Promega R602 21936309
Tampón carbonatobicarbonato
Sigma C3041 076k82206
Reactivo de transfección FuGENE® 6
Roche 11814443001 14069500
Polimerasa verde Go -Taq
Promega
Anticuerpo anti-lgG humana de cabra (específico del fragmento Fc)
Stratech Scientific 109-005-098 76111
Conjugado de anti-cadena kappa humana de cabra con peroxidasa de rábano picante
Sigma A7164 116K6101
Hind III
Promega R604 19453528
Anticuerpo lgG1 humana/kappa
The Binding Site BP078 247317
IL-25 (murina)
R&D Systems
IL-25 (humana)
R&D Systems
Sustrato HRP K-Blue
SkyBio 308176 080129
Kit de extracción en gel MiniElute
Qiagen 28606 124105586
Oligonucleótidos
Sigma n.a.
Comprimidos de PBS
Sigma P4417 017K8212
Kit de mutagénesis dirigida al sitio Phusion™
NEB (Finnzymes) F-541 S
Kit QIAGEN Plasmid Maxi (25)
Qiagen 12163 127142067
Kit QIAprep Spin Miniprep
Qiagen 27106 127150290
Kit de ELISA de IL-13 murina Quantikine
R&D Systems M1300CB
Kit Quick Ligation
NEB M2200s
Kit de mutagénesis dirigida QuikChange® II XL
Stratagene 200522-5 0870486
Solución Red Stop (para K-Blue)
SkyBio Ltd 301475 071114
Perlas Dyna marcadas con estreptavidina
Invitrogen
Tinción en gel SYBR Safe DNA
Invitrogen 33102 55081A
Kit TOPO-TA Cloning®
Invitrogen 45-0641 1311906
X-Gal
Promega V394A 20965701
Clonación de genes variables de anticuerpos quiméricos y humanizados
Se sintetizaron los ADNc de la región variable de la cadena pesada y ligera del 2c3 y los ADNc de la región variable
5 de los anticuerpos humanizados (GeneArt AG). Las regiones V de la cadena pesada se clonaron en pG1D200 mediante los sitios de restricción enzimáticos Hindlll y Apal. Similarmente, las regiones V de la cadena ligera se clonaron en pKN100 mediante los sitios Hindlll y BamHI. Se preparó el vector pG1D200 para ligamiento digiriendo 5 µg de ADN con 20 unidades de Hindlll y Apal en tampón de digestión de restricción multicore (Promega) durante 2 h a 37 ºC. Posteriormente, se añadió 1 unidad de fosfatasa alcalina antártica (NEB) al ADN y se incubó entre 15 y 30
10 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, la preparación del vector se purificó en una columna Qiaquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El vector se eluyó en 50 µl. Similarmente, se preparó el vector pKN100 digiriendo 5 µg de ADN con 20 unidades de Hindlll y BamHI en tampón E (Promega) durante 1 hora a 37 ºC. El ADN se trató con fosfatasa alcalina antártica y se purificó como se ha descrito anteriormente. Los ADN de inserto de región V (aproximadamente 4 µg) se digirieron como se ha descrito
15 anteriormente y los fragmentos de cadena pesada y ligera se purificaron del vector mediante electroforesis en gel. La banda apropiada se escindió del gel y se purificó en una columna Qiaquick (Qiagen) y se eluyó en 50 µl siguiendo
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Claims (1)

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GBGB0817891.5A GB0817891D0 (en) 2008-09-30 2008-09-30 Antibodies against il-25
US101293P 2008-09-30
PCT/IB2009/007302 WO2010038155A2 (en) 2008-09-30 2009-09-30 Antibodies against il-25

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