JP5692867B2 - 脂質障害およびコレステロール障害を治療するための抗ｐｃｓｋ９および方法 - Google Patents

Description

本願は、２００７年１０月２６日出願の米国特許出願第６０／９８２，９２２号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／９８２，９２２号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明の分野は、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することによってコレステロール恒常性の障害を治療するための方法および組成物に関する。

（発明の背景）
アテローム硬化性冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）は、西欧諸国における死亡および心臓血管の病的状態の主要な原因である。アテローム硬化性冠状動脈心疾患についての危険因子は、高血圧、糖尿病、家族歴、男性であること、喫煙、高い血清コレステロールレベル、高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルおよび低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルを含む。一般に、約２２５−２５０ｍｇ／ｄｌを超える総コレステロールレベルはＣＨＤの危険度の重大な上昇に結びつく。

様々な臨床試験で、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールのレベル上昇はヒトのアテローム性動脈硬化症を促進することが明らかにされた。疫学的調査は、心臓血管罹病率および死亡率が総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールのレベルによって直接変化することを確認した。

ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるための１つの方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬を投与することによる。これらの薬剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよび肝臓におけるコレステロール合成に拮抗し、細胞表面の肝ＬＤＬ受容体の数を増加させてＬＤＬの取込みと異化を促進する。そのようなアプローチの欠点は、これらの薬剤が共通して、例えば、肝毒性を含む、不都合な副作用プロフィールを有することである。選択的なアプローチは、ＬＤＬ受容体経路を直接調節することである。

ＰＣＳＫ９（プロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケキシン９型）は、細胞の表面上のＬＤＬ受容体に結合し、その発現を調節するセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。ＬＤＬ受容体−ＰＣＳＫ９相互作用の阻害はコレステロール障害の治療への魅力的なアプローチである。抗体または低分子阻害剤の使用による大型タンパク質間の相互作用（すなわちタンパク質間相互作用またはＰＰＩ）の阻害は、しかし、一般に極めて難しく、厳しい課題であるとみなされている。約７４ＫＤａの分子量を有する、ＰＣＳＫ９のような大型タンパク質と、約１６０ＫＤａの分子量を有する（細胞表面でグリコシル化される；未熟形態では１１５ＫＤａ）ＬＤＬＲは、大きな範囲にわたって広範囲の分子間接触を示す可能性が高い。広範囲の接触の存在により、所与の抗体または低分子阻害剤がそれらの結合を成功裏にブロックすることは起こりそうにない。

（発明の要旨）
本発明は、驚くべきことに、大型タンパク質の間の分子間相互作用の遮断に関連する技術的な問題を克服し、抗体またはペプチドによるＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用の遮断が可能であることを明らかにした。本明細書で詳細に論じるように、これは、次に、コレステロール障害を治療する新規方法を提供する。

本発明は、一部には、被験者（例えば、ヒト）において総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率または低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させるための方法であって、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の結合を阻害する、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体）または1ＥＧＦ−Ａポリペプ
チドの治療有効量を、場合によりさらなる化学療法剤（例えば、エゼチミブおよび／またはシンバスタチン）と組み合わせて、前記被験者に投与することを含む方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、前記抗体またはフラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドは、ＰＣＳＫ９触媒ドメインまたはＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインと相互作用するＰＣＳＫ９のドメインに特異的に結合する。

本発明はさらに、一部には、被験者において高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、血管炎症または黄色腫を治療するまたは予防するための方法であって、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の結合を阻害する、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体）またはＥＧＦ−Ａポリペプチドの治療有効量を、場合によりさらなる治療薬（例えば、エゼチミブおよび／またはシンバスタチン）と組み合わせて、前記被験者に投与することを含む方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、前記抗体またはフラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドは、ＰＣＳＫ９触媒ドメインまたはＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインと相互作用するＰＣＳＫ９のドメインに特異的に結合する。

本発明はまた、一部には、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の結合を阻害する、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または組換え抗体）またはＥＧＦ−Ａポリペプチド、および医薬的に許容される担体を、場合によりさらなる化学療法剤（例えば、エゼチミブおよび／またはシンバスタチン）と共に含有する医薬組成物を提供する。

本発明はまた、ヒトＬＤＬ受容体のおよそアミノ酸位置３１４から始まり、およそアミノ酸位置３５５で終わるアミノ酸から成る、ヒトＬＤＬ受容体フラグメントに対して約９０％またはそれより高いアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、場合により、（ｉ）ＰＣＳＫ９に結合する；（ｉｉ）ＰＣＳＫ９への結合に関してＬＤＬ受容体または抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメントと競合する；（ｉｉｉ）動物に投与した場合、総コレステロールレベルを低下させる；（ｉｖ）動物に投与した場合、低密度リポタンパク質コレステロールレベルを低下させる；（ｖ）動物に投与した場合、アポリポタンパク質Ｂレベルを低下させる；（ｖｉ）動物に投与した場合、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率を低下させる；および（ｖｉｉ）動物に投与した場合、低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させることから成る群より選択される１つまたはそれより多くの性質を含む単離ポリペプチド、または医薬的に許容される担体を含有するその医薬組成物を提供する。本発明の１つの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、または医薬的に許容される担体を含有するその医薬組成物から成る。

本発明は、
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む１１Ｂ５重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む７５Ｂ９重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む７７Ｄ１０重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２９Ｃ１０重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む２２Ｄ１１重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む１Ｆ１１／１Ｇ１１重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む１１Ｂ５軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む７５Ｂ９軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｘ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む７７Ｄ１０軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｘ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む２９Ｃ１０軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｘｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む２２Ｄ１１軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｘｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む１Ｆ１１／１Ｇ１１軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３
から成る群より選択される１つまたはそれより多くのメンバーを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明はまた、
（ｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｍ Ｈ（配列番号１１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ Ｔ Ｅ Ｙ Ｄ Ｐ Ｋ Ｆ Ｑ Ｄ（配列番号１２）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｓ Ｙ Ｆ Ｇ
Ｓ Ｉ Ｆ Ａ Ｙ（配列番号１３）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ Ｔ Ｅ Ｙ Ｄ Ｐ
Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｓ Ｙ Ｙ Ｇ Ｓ Ｉ Ｆ Ａ Ｙ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｙ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｗ Ｉ Ｄ Ｐ Ｅ Ｎ Ｇ Ｄ Ｔ Ｅ Ｙ Ａ Ｐ Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｙ Ｙ Ｒ
Ｙ Ｄ Ｄ Ｇ Ｔ Ｗ Ｆ Ｐ Ｙ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号３５）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｗ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｙ Ｔ Ｋ Ｙ Ａ Ｐ
Ｎ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号３６）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｇ Ｙ Ｙ Ｒ Ｙ Ｙ Ｓ Ｌ Ｄ Ｙ（配列番号３７）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｓ Ｎ Ｈ Ｄ Ｍ Ａ（配列番号４３）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｓ Ｉ Ｔ Ｐ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｙ Ｙ Ｒ Ｄ Ｓ Ｖ Ｅ Ｇ（配列番号４４）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｎ Ｙ Ｙ
Ｄ Ｇ Ｓ Ｙ Ｙ Ｙ Ｇ Ｌ Ｙ Ｙ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号４５）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｙ Ｍ Ｎ（配列番号５１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｄ Ｉ Ｎ Ｐ Ｎ Ｎ Ｇ Ｇ Ａ Ｉ Ｙ Ｎ Ｑ
Ｋ Ｆ Ｋ Ｇ（配列番号５２）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｇ Ｉ Ｉ Ｔ Ｅ Ｉ Ａ Ｅ Ｄ Ｆ（配列番号５３）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｓ Ｓ Ｖ Ｓ Ｙ Ｌ Ｙ（配列番号１５）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｓ Ｓ Ｈ Ｒ Ａ Ｓ（配列番号：１６）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｈ Ｑ Ｙ Ｑ Ｓ Ｙ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号１７）を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｓ Ｓ Ｖ Ｓ Ｙ Ｌ Ｆ（配列番号２３）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｔ Ｓ Ｙ Ｌ Ａ Ｓ（配列番号２４）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｈ Ｑ Ｙ Ｈ Ｔ Ｙ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号２５）を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｘ）アミノ酸配列：Ｒ Ａ Ｓ Ｇ Ｎ Ｉ Ｈ Ｓ Ｙ Ｌ Ａ（配列番号３１）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｎ Ａ Ｋ Ｔ Ｌ Ｐ Ｄ（配列番号３２）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｈ Ｆ Ｗ Ｎ Ｔ Ｐ Ｗ Ｔ（配列番号３３）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘ）アミノ酸配列：Ｒ Ａ Ｓ Ｑ Ｄ Ｉ Ｓ Ｎ Ｙ Ｌ Ｎ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｙ Ｓ Ｓ Ｒ Ｌ Ｈ Ｓ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｑ Ｇ Ｋ Ｔ Ｌ Ｐ Ｌ Ｔ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉ）アミノ酸配列：Ｒ Ｓ Ｓ Ｑ Ｓ Ｌ Ｖ Ｙ Ｓ Ｄ Ｇ Ｎ Ｔ Ｙ Ｌ Ｈ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｖ Ｓ Ｎ Ｒ Ｆ Ｓ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｌ Ｑ Ｓ Ｔ Ｈ Ｆ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｉ）アミノ酸配列：Ｋ Ａ Ｓ Ｑ Ｎ Ｖ Ｇ Ｔ Ｎ Ｖ Ｖ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｙ Ｒ Ｙ Ｓ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｑ Ｙ Ｋ Ｔ Ｙ Ｐ Ｙ Ｔ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ３
から成る群より選択される１つまたはそれより多くのメンバーを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらに、本発明は、（ａ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；（ｂ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；（ｃ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；（ｄ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；（ｅ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；（ｆ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；（ｇ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｈ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；（ｉ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；（ｊ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；（ｋ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；および（ｌ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖
から成る群より選択される１つまたはそれより多くのメンバーを含む、請求項ｘｘｘに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の実施形態は、例えば、さらなる化学療法剤、例えば、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬と共に本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかを含有する組成物を含む。本発明の１つの実施形態では、さらなる化学療法剤は、エゼチミブ、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、アゼチジノン、塩酸ブノロール、アセブトロール、塩酸アルプレノロール、アテノロール、塩酸カルテオロール、塩酸セリプロロール、塩酸セタモロール、塩酸ラベタロール、塩酸エスモロール、塩酸レボベタキソロール、塩酸レボブノロール、ナドロール、プラクトロール、塩酸プロプラノロール、塩酸ソタロール、チモロール、マレイン酸チモロール、ビソプロロール、フマル酸ビソプロロール、ネビボロール（ｎｅｂｉｖａｌｏｌ）、塩酸シクロプロロール、塩酸デキスプロプラノロール、塩酸ジアセトロール、塩酸ジレバロール、塩酸エキサプロロール、硫酸フレストロール、塩酸メタロール、メトプロロール２−プロパノール、酒石酸メトプロロール、硫酸パマトロール、硫酸ペンブトロール、プラクトロール、塩酸チプレノロールまたはトラモロールである。本発明の実施形態はまた、抗体またはフラグメントが、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃｆｖ、ｓｃｆｖ二量体、ｄｓｆｖ、（ｄｓｆｖ）_２、ｄｓＦｖ−ｄｓｆｖ’、二重特異性ｄｓダイアボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはドメイン抗体であるものを含む。本発明の１つの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン定常領域、例えば、κ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖またはγ４重鎖に連結されている。本発明はまた、医薬的に許容される担体と共に本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を提供する。

本発明はまた、被験者において、総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率もしくは低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させるため；または高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、血管炎症もしくは黄色腫を治療するための方法であって、本明細書で述べるように治療有効量の本発明の任意のポリペプチドまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または、その医薬組成物を、場合により、例えば、本明細書で述べるような、さらなる化学療法剤と組み合わせて前記被験者に投与することを含む方法を提供する。

本発明はまた、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを作製するための方法であって、前記重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコードし、その発現を指令する１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを１つまたはそれより多くの宿主細胞に導入すること；ならびに前記宿主細胞を、前記重鎖および軽鎖免疫グロブリンが発現される条件下で増殖させることを含む方法を提供し、その方法では、例えば、前記軽鎖をコードし、その発現を指令する前記ポリヌクレオチドと、前記重鎖をコードし、その発現を指令する前記ポリヌクレオチドとは、別々の宿主細胞中に存在する。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下の単離抗体またはその抗原結合フラグメントなどが提供される：
（項目１） （ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む１１Ｂ５重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む７５Ｂ９重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む７７Ｄ１０重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｉｖ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む２９Ｃ１０重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む２２Ｄ１１重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む１Ｆ１１／１Ｇ１１重鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；
（ｖｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む１１Ｂ５軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む７５Ｂ９軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；
（ｉｘ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む７７Ｄ１０軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；
（ｘ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む２９Ｃ１０軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；
（ｘｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む２２Ｄ１１軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；および
（ｘｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む１Ｆ１１／１Ｇ１１軽鎖免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３
から成る群より選択される１つまたはそれより多くのメンバーを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２） さらなる化学療法剤と組み合わせての項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する組成物。
（項目３） 前記さらなる化学療法剤が、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬である、項目２に記載の組成物。
（項目４） 前記さらなる化学療法剤が、エゼチミブ、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、アゼチジノン、塩酸ブノロール、アセブトロール、塩酸アルプレノロール、アテノロール、塩酸カルテオロール、塩酸セリプロロール、塩酸セタモロール、塩酸ラベタロール、塩酸エスモロール、塩酸レボベタキソロール、塩酸レボブノロール、ナドロール、プラクトロール、塩酸プロプラノロール、塩酸ソタロール、チモロール、マレイン酸チモロール、ビソプロロール、フマル酸ビソプロロール、ネビボロール（ｎｅｂｉｖａｌｏｌ）、塩酸シクロプロロール、塩酸デキスプロプラノロール、塩酸ジアセトロール、塩酸ジレバロール、塩酸エキサプロロール、硫酸フレストロール、塩酸メタロール、メトプロロール２−プロパノール、酒石酸メトプロロール、硫酸パマトロール、硫酸ペンブトロール、プラクトロール、塩酸チプレノロールまたはトラモロールである、項目２に記載の組成物。
（項目５） さらなる化学療法剤が、場合によりシンバスタチンと組み合わせたエゼチミブである、項目４に記載の組成物。
（項目６） ヒト化抗体である、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。（項目７） モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である抗体である、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目８） ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃｆｖ、ｓｃｆｖ二量体、ｄｓｆｖ、（ｄｓｆｖ）_２、ｄｓＦｖ−ｄｓｆｖ’、二重特異性ｄｓダイアボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはドメイン抗体である抗原結合フラグメントである、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目９） 免疫グロブリンの定常領域に連結されている、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１０） 前記定常領域がκ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖またはγ４重鎖である、項目９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１１） 医薬的に許容される担体と組み合わせて項目１に記載の抗体またはフラグメントを含有する医薬組成物。
（項目１２） （ｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｍ Ｈ（配列番号１１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ Ｔ Ｅ Ｙ Ｄ Ｐ Ｋ Ｆ Ｑ Ｄ（配列番号１２）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｓ
Ｙ Ｆ Ｇ Ｓ Ｉ Ｆ Ａ Ｙ（配列番号１３）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ Ｔ Ｅ Ｙ Ｄ Ｐ
Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｓ Ｙ Ｙ Ｇ Ｓ Ｉ Ｆ Ａ Ｙ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｙ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｗ Ｉ Ｄ Ｐ Ｅ Ｎ Ｇ Ｄ Ｔ Ｅ Ｙ Ａ Ｐ Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｙ Ｙ Ｒ
Ｙ Ｄ Ｄ Ｇ Ｔ Ｗ Ｆ Ｐ Ｙ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号３５）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｗ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｙ Ｔ Ｋ Ｙ Ａ Ｐ
Ｎ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号３６）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｇ Ｙ Ｙ Ｒ Ｙ Ｙ Ｓ Ｌ Ｄ Ｙ（配列番号３７）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｓ Ｎ Ｈ Ｄ Ｍ Ａ（配列番号４３）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｓ Ｉ Ｔ Ｐ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｙ Ｙ Ｒ Ｄ Ｓ Ｖ Ｅ Ｇ（配列番号４４）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｎ Ｙ Ｙ
Ｄ Ｇ Ｓ Ｙ Ｙ Ｙ Ｇ Ｌ Ｙ Ｙ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号４５）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｙ Ｍ Ｎ（配列番号５１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｄ Ｉ Ｎ Ｐ Ｎ Ｎ Ｇ Ｇ Ａ Ｉ Ｙ Ｎ Ｑ
Ｋ Ｆ Ｋ Ｇ（配列番号５２）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｇ Ｉ Ｉ Ｔ Ｅ Ｉ Ａ Ｅ Ｄ Ｆ（配列番号５３）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｓ Ｓ Ｖ Ｓ Ｙ Ｌ Ｙ（配列番号１５）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｓ Ｓ Ｈ Ｒ Ａ Ｓ（配列番号：１６）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｈ Ｑ Ｙ Ｑ Ｓ Ｙ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号１７）を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｓ Ｓ Ｖ Ｓ Ｙ Ｌ Ｆ（配列番号２３）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｔ Ｓ Ｙ Ｌ Ａ Ｓ（配列番号２４）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｈ Ｑ Ｙ Ｈ Ｔ Ｙ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号２５）を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｘ）アミノ酸配列：Ｒ Ａ Ｓ Ｇ Ｎ Ｉ Ｈ Ｓ Ｙ Ｌ Ａ（配列番号３１）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｎ Ａ Ｋ Ｔ Ｌ Ｐ Ｄ（配列番号３２）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｈ Ｆ Ｗ Ｎ Ｔ Ｐ Ｗ Ｔ（配列番号３３）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘ）アミノ酸配列：Ｒ Ａ Ｓ Ｑ Ｄ Ｉ Ｓ Ｎ Ｙ Ｌ Ｎ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｙ Ｓ Ｓ Ｒ Ｌ Ｈ Ｓ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｑ Ｇ Ｋ Ｔ Ｌ Ｐ Ｌ Ｔ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉ）アミノ酸配列：Ｒ Ｓ Ｓ Ｑ Ｓ Ｌ Ｖ Ｙ Ｓ Ｄ Ｇ Ｎ Ｔ Ｙ Ｌ Ｈ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｖ Ｓ Ｎ Ｒ Ｆ Ｓ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｌ Ｑ Ｓ Ｔ Ｈ Ｆ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ３；および
（ｘｉｉ）アミノ酸配列：Ｋ Ａ Ｓ Ｑ Ｎ Ｖ Ｇ Ｔ Ｎ Ｖ Ｖ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｙ Ｒ Ｙ Ｓ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｑ Ｙ Ｋ Ｔ Ｙ Ｐ Ｙ Ｔ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ３
から成る群より選択される１つまたはそれより多くのメンバーを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１３） さらなる化学療法剤と組み合わせて項目１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する組成物。
（項目１４） 前記さらなる化学療法剤が、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５） さらなる化学療法剤が、エゼチミブ、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、アゼチジノン、塩酸ブノロール、アセブトロール、塩酸アルプレノロール、アテノロール、塩酸カルテオロール、塩酸セリプロロール、塩酸セタモロール、塩酸ラベタロール、塩酸エスモロール、塩酸レボベタキソロール、塩酸レボブノロール、ナドロール、プラクトロール、塩酸プロプラノロール、塩酸ソタロール、チモロール、マレイン酸チモロール、ビソプロロール、フマル酸ビソプロロール、ネビボロール、塩酸シクロプロロール、塩酸デキスプロプラノロール、塩酸ジアセトロール、塩酸ジレバロール、塩酸エキサプロロール、硫酸フレストロール、塩酸メタロール、メトプロロール２−プロパノール、酒石酸メトプロロール、硫酸パマトロール、硫酸ペンブトロール、プラクトロール、塩酸チプレノロール、トラモロール、塩酸フェンスピリド、プロロキサン、塩酸アルフゾシン、塩酸ラベタロール、ブレチリウムトシレート、ジヒドロエルゴタミンメシレート、カルベジロール、ラベタロール、ブレチリウムトシレート、フェントラミンメシレート、酒石酸ソリペルチン、塩酸ゾレルチン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、ロサルタンカリウム、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、フォシノプリル、塩酸モエキシプリル、ペリンドプリルエルブミン、キナプリル、ラミプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、デラプリル、スピラプリル、塩酸デラプリル、リベンザプリル、ペントプリル、ペリンドプリル１Ｈ−インドール−２−カルボン酸、キナプリラート、塩酸スピラプリル、スピラプリラート、テプロチド、ゾフェノプリル、アムロジピンベシレート、マレイン酸クレンチアゼム、イスラジピン、ニモジピン、フェロジピン、ニルバジピン、塩酸ジルチアゼム、塩酸ベラパミル、塩酸テルジピン、ベルホスジル、ホステジル、ラノラジン、塩酸ブトプロジン、トシフェン、モルシドミン、塩酸ラノラジン、トシフェン、塩酸ジルチアゼム、二硝酸イソソルビド、一硝酸ソソルビド、ニトログリセリン、塩酸ベラパミル、クロモナール、クロニテート、ドロプレニラミン、リドフラジン、プレニラミン、硝酸プロパチル、塩酸ミオフラジン、ミキシジン、モルシドミン、一硝酸イソソルビド、四硝酸エリトリチル、クロニトレート、ジピリダモール、ニコランジル、ピリジンカルボキサミド、ニフェジピン、マレイン酸ペルヘキシリン、オクスプレノロール、ペントリニトロール、ベラパミル、アルチアジド、ベンズチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、スピロノラクトン、トリアムテレン、塩酸グアンファシン、ヒドロクロロチアジドと組み合わせたメチルドパ−ヒドロクロロチアジド、メチルドパ−クロロチアジド、塩酸クロニジン、クロルタリドン、塩酸クロニジン、クロニジン、アルチアジド、ベンズチアジド、カプトプリル、カルベジロール、クロロチアジド、塩酸クロニジン、シクロチアジド、塩酸デラプリル、塩酸ジレバロール、塩酸デラプリル、ドキサゾシンメシレート、フォシノプリルナトリウム、塩酸モエキシプリル、マレイン酸モナテピル、コハク酸メトプロロール、塩酸グアンファシン、メチルドパ、キナプリラート、塩酸キナプリル、プリミドロール、塩酸プラゾシン、塩酸ペランセリン、塩酸フェノキシベンズアミン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、マレイン酸アムロジピン、塩酸テラゾシン、塩酸ベバントロールまたはラミプリルである、項目１３に記載の組成物。
（項目１６） 前記さらなる化学療法剤が、場合によりシンバスタチンと組み合わせたエゼチミブである、項目１５に記載の組成物。
（項目１７） ヒト化抗体である、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１８） ヒト化抗体である、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１９） モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である抗体である、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２０） ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃｆｖ、ｓｃｆｖ二量体、ｄｓｆｖ、（ｄｓｆｖ）_２、ｄｓＦｖ−ｄｓｆｖ’、二重特異性ｄｓダイアボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはドメイン抗体である抗原結合フラグメントである、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２１） 免疫グロブリンの定常領域に連結されている、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２２） 前記定常領域がκ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖またはγ４重鎖である、項目２１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２３） 医薬的に許容される担体と組み合わせて項目１２に記載の抗体またはフラグメントを含有する医薬組成物。
（項目２４） （ａ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｂ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｄ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｅ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｆ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｇ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｈ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｉ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；
（ｊ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｋ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン重鎖；および
（ｌ）アミノ酸配列：

を含む免疫グロブリン軽鎖
から成る群より選択される１つまたはそれより多くのメンバーを含む、項目１２に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２５） さらなる化学療法剤と組み合わせて項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する組成物。
（項目２６） 前記さらなる化学療法剤が、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７） 前記さらなる化学療法剤が、エゼチミブ、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、アゼチジノン、塩酸ブノロール、アセブトロール、塩酸アルプレノロール、アテノロール、塩酸カルテオロール、塩酸セリプロロール、塩酸セタモロール、塩酸ラベタロール、塩酸エスモロール、塩酸レボベタキソロール、塩酸レボブノロール、ナドロール、プラクトロール、塩酸プロプラノロール、塩酸ソタロール、チモロール、マレイン酸チモロール、ビソプロロール、フマル酸ビソプロロール、ネビボロール、塩酸シクロプロロール、塩酸デキスプロプラノロール、塩酸ジアセトロール、塩酸ジレバロール、塩酸エキサプロロール、硫酸フレストロール、塩酸メタロール、メトプロロール２−プロパノール、酒石酸メトプロロール、硫酸パマトロール、硫酸ペンブトロール、プラクトロール、塩酸チプレノロール、トラモロール、塩酸フェンスピリド、プロロキサン、塩酸アルフゾシン、塩酸ラベタロール、ブレチリウムトシレート、ジヒドロエルゴタミンメシレート、カルベジロール、ラベタロール、ブレチリウムトシレート、フェントラミンメシレート、酒石酸ソリペルチン、塩酸ゾレルチン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、ロサルタンカリウム、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、フォシノプリル、塩酸モエキシプリル、ペリンドプリルエルブミン、キナプリル、ラミプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、デラプリル、スピラプリル、塩酸デラプリル、リベンザプリル、ペントプリル、ペリンドプリル１Ｈ−インドール−２−カルボン酸、キナプリラート、塩酸スピラプリル、スピラプリラート、テプロチド、ゾフェノプリル、アムロジピンベシレート、マレイン酸クレンチアゼム、イスラジピン、ニモジピン、フェロジピン、ニルバジピン、塩酸ジルチアゼム、塩酸ベラパミル、塩酸テルジピン、ベルホスジル、ホステジル、ラノラジン、塩酸ブトプロジン、トシフェン、モルシドミン、塩酸ラノラジン、トシフェン、塩酸ジルチアゼム、二硝酸イソソルビド、一硝酸ソソルビド、ニトログリセリン、塩酸ベラパミル、クロモナール、クロニテート、ドロプレニラミン、リドフラジン、プレニラミン、硝酸プロパチル、塩酸ミオフラジン、ミキシジン、モルシドミン、一硝酸イソソルビド、四硝酸エリトリチル、クロニトレート、ジピリダモール、ニコランジル、ピリジンカルボキサミド、ニフェジピン、マレイン酸ペルヘキシリン、オクスプレノロール、ペントリニトロール、ベラパミル、アルチアジド、ベンズチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、スピロノラクトン、トリアムテレン、塩酸グアンファシン、ヒドロクロロチアジドと組み合わせたメチルドパ−ヒドロクロロチアジド、メチルドパ−クロロチアジド、塩酸クロニジン、クロルタリドン、塩酸クロニジン、クロニジン、アルチアジド、ベンズチアジド、カプトプリル、カルベジロール、クロロチアジド、塩酸クロニジン、シクロチアジド、塩酸デラプリル、塩酸ジレバロール、塩酸デラプリル、ドキサゾシンメシレート、フォシノプリルナトリウム、塩酸モエキシプリル、マレイン酸モナテピル、コハク酸メトプロロール、塩酸グアンファシン、メチルドパ、キナプリラート、塩酸キナプリル、プリミドロール、塩酸プラゾシン、塩酸ペランセリン、塩酸フェノキシベンズアミン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、マレイン酸アムロジピン、塩酸テラゾシン、塩酸ベバントロールまたはラミプリルである、項目２５に記載の組成物。
（項目２８） 前記さらなる化学療法剤が、場合によりシンバスタチンと組み合わせたエゼチミブである、項目２７に記載の組成物。
（項目２９） ヒト化抗体である、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３０） ヒト化抗体である、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３１） モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体または二重特異性抗体である抗体である、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３２） ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃｆｖ、ｓｃｆｖ二量体、ｄｓｆｖ、（ｄｓｆｖ）_２、ｄｓＦｖ−ｄｓｆｖ’、二重特異性ｄｓダイアボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはドメイン抗体である抗原結合フラグメントである、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３３） 免疫グロブリンの定常領域に連結されている、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３４） 前記定常領域がκ軽鎖、γ１重鎖、γ２重鎖、γ３重鎖またはγ４重鎖である、項目３３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３５） 医薬的に許容される担体と組み合わせて項目２４に記載の抗体またはフラグメントを含有する医薬組成物。
（項目３６） ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の結合を阻害する、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する単離抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは単離ＥＧＦ−Ａポリペプチド、および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
（項目３７） 前記抗体がＰＣＳＫ９触媒ドメインまたはＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインと相互作用するＰＣＳＫ９のドメインに特異的に結合する、項目３６に記載の医薬組成物。
（項目３８） ヒトＬＤＬ受容体のおよそアミノ酸位置３１４から始まり、およそアミノ酸位置３５５で終わるアミノ酸から成る、ヒトＬＤＬ受容体フラグメントに対して約９０％またはそれより高いアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、場合により、
（ｉ）ＰＣＳＫ９に結合する；
（ｉｉ）ＰＣＳＫ９への結合に関してＬＤＬ受容体または抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメントと競合する；
（ｉｉｉ）動物に投与した場合、総コレステロールレベルを低下させる；
（ｉｖ）動物に投与した場合、低密度リポタンパク質コレステロールレベルを低下させる；
（ｖ）動物に投与した場合、アポリポタンパク質Ｂレベルを低下させる；
（ｖｉ）動物に投与した場合、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率を低下させる；および
（ｖｉｉ）動物に投与した場合、低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させる
ことから成る群より選択される１つまたはそれより多くの性質を含む単離ポリペプチド、または医薬的に許容される担体を含有するその医薬組成物。
（項目３９） 配列番号３のアミノ酸配列から成る項目３８に記載のポリペプチドまたは医薬的に許容される担体を含有するその医薬組成物。
（項目４０） 被験者において、
総コレステロールレベル；
低密度リポタンパク質コレステロールレベル；
アポリポタンパク質Ｂレベル；
総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率；または
低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率
を低下させるための方法であって、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する、ＰＣＳＫ９アンタゴニストであるＥＧＦ−Ａポリペプチドまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメントの治療有効量を、場合によりさらなる化学療法剤と組み合わせて前記被験者に投与する工程を含み、該抗体もしくはフラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の結合を阻害する、方法。
（項目４１） 前記抗体もしくはフラグメントが、ＰＣＳＫ９触媒ドメインまたはＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインと相互作用するＰＣＳＫ９のドメインに特異的に結合する、項目４０に記載の方法。
（項目４２） 被験者において高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、血管炎症または黄色腫を治療するまたは予防するための方法であって、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する、ＥＧＦ−Ａポリペプチドまたは抗体もしくはその抗原結合フラグメントの治療有効量を、場合によりさらなる化学療法剤と組み合わせて前記被験者に投与する工程を含み、該抗体もしくはフラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の結合を阻害する、方法。
（項目４３） 前記抗体が、ＰＣＳＫ９触媒ドメインまたはＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインと相互作用するＰＣＳＫ９のドメインに特異的に結合する、項目４２に記載の方法。（項目４４） 被験者において、
総コレステロールレベル；
低密度リポタンパク質コレステロールレベル；
アポリポタンパク質Ｂレベル；
総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率；もしくは
低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率
を低下させるため；または
高コレステロール血症；
高脂血症；
高トリグリセリド血症；
シトステロール血症；
アテローム性動脈硬化症；
動脈硬化症；
冠状動脈性心疾患；
血管炎症；もしくは
黄色腫
を治療するための方法であって、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を前記被験者に投与する工程を含む方法。
（項目４５） 項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをさらなる化学療法剤と組み合わせて投与する、項目４４に記載の方法。
（項目４６） 前記さらなる化学療法剤が、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬である、項目４５に記載の方法。
（項目４７） 前記さらなる化学療法剤が、エゼチミブ、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、アゼチジノン、塩酸ブノロール、アセブトロール、塩酸アルプレノロール、アテノロール、塩酸カルテオロール、塩酸セリプロロール、塩酸セタモロール、塩酸ラベタロール、塩酸エスモロール、塩酸レボベタキソロール、塩酸レボブノロール、ナドロール、プラクトロール、塩酸プロプラノロール、塩酸ソタロール、チモロール、マレイン酸チモロール、ビソプロロール、フマル酸ビソプロロール、ネビボロール、塩酸シクロプロロール、塩酸デキスプロプラノロール、塩酸ジアセトロール、塩酸ジレバロール、塩酸エキサプロロール、硫酸フレストロール、塩酸メタロール、メトプロロール２−プロパノール、酒石酸メトプロロール、硫酸パマトロール、硫酸ペンブトロール、プラクトロール、塩酸チプレノロール、トラモロール、塩酸フェンスピリド、プロロキサン、塩酸アルフゾシン、塩酸ラベタロール、ブレチリウムトシレート、ジヒドロエルゴタミンメシレート、カルベジロール、ラベタロール、ブレチリウムトシレート、フェントラミンメシレート、酒石酸ソリペルチン、塩酸ゾレルチン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、ロサルタンカリウム、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、フォシノプリル、塩酸モエキシプリル、ペリンドプリルエルブミン、キナプリル、ラミプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、デラプリル、スピラプリル、塩酸デラプリル、リベンザプリル、ペントプリル、ペリンドプリル１Ｈ−インドール−２−カルボン酸、キナプリラート、塩酸スピラプリル、スピラプリラート、テプロチド、ゾフェノプリル、アムロジピンベシレート、マレイン酸クレンチアゼム、イスラジピン、ニモジピン、フェロジピン、ニルバジピン、塩酸ジルチアゼム、塩酸ベラパミル、塩酸テルジピン、ベルホスジル、ホステジル、ラノラジン、塩酸ブトプロジン、トシフェン、モルシドミン、塩酸ラノラジン、トシフェン、塩酸ジルチアゼム、二硝酸イソソルビド、一硝酸ソソルビド、ニトログリセリン、塩酸ベラパミル、クロモナール、クロニテート、ドロプレニラミン、リドフラジン、プレニラミン、硝酸プロパチル、塩酸ミオフラジン、ミキシジン、モルシドミン、一硝酸イソソルビド、四硝酸エリトリチル、クロニトレート、ジピリダモール、ニコランジル、ピリジンカルボキサミド、ニフェジピン、マレイン酸ペルヘキシリン、オクスプレノロール、ペントリニトロール、ベラパミル、アルチアジド、ベンズチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、スピロノラクトン、トリアムテレン、塩酸グアンファシン、ヒドロクロロチアジドと組み合わせたメチルドパ−ヒドロクロロチアジド、メチルドパ−クロロチアジド、塩酸クロニジン、クロルタリドン、塩酸クロニジン、クロニジン、アルチアジド、ベンズチアジド、カプトプリル、カルベジロール、クロロチアジド、塩酸クロニジン、シクロチアジド、塩酸デラプリル、塩酸ジレバロール、塩酸デラプリル、ドキサゾシンメシレート、フォシノプリルナトリウム、塩酸モエキシプリル、マレイン酸モナテピル、コハク酸メトプロロール、塩酸グアンファシン、メチルドパ、キナプリラート、塩酸キナプリル、プリミドロール、塩酸プラゾシン、塩酸ペランセリン、塩酸フェノキシベンズアミン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、マレイン酸アムロジピン、塩酸テラゾシン、塩酸ベバントロールまたはラミプリルである、項目４６に記載の方法。（項目４８） 前記さらなる化学療法剤がエゼチミブおよび、場合により、シンバスタチンである、項目４７に記載の方法。
（項目４９） 前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化抗体である、項目４４に記載の方法。
（項目５０） 被験者において、
総コレステロールレベル；
低密度リポタンパク質コレステロールレベル；
アポリポタンパク質Ｂレベル；
総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率；もしくは
低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率
を低下させるため；または
高コレステロール血症；
高脂血症；
高トリグリセリド血症；
シトステロール血症；
アテローム性動脈硬化症；
動脈硬化症；
冠状動脈性心疾患；
血管炎症；もしくは
黄色腫
を治療するための方法であって、項目２４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を前記被験者に投与する工程を含む方法。
（項目５１） 項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをさらなる化学療法剤と組み合わせて投与する、項目５０に記載の方法。
（項目５２） 前記さらなる化学療法剤が、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬である、項目５１に記載の方法。
（項目５３） 前記さらなる化学療法剤が、エゼチミブ、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチン、シンバスタチン、アゼチジノン、塩酸ブノロール、アセブトロール、塩酸アルプレノロール、アテノロール、塩酸カルテオロール、塩酸セリプロロール、塩酸セタモロール、塩酸ラベタロール、塩酸エスモロール、塩酸レボベタキソロール、塩酸レボブノロール、ナドロール、プラクトロール、塩酸プロプラノロール、塩酸ソタロール、チモロール、マレイン酸チモロール、ビソプロロール、フマル酸ビソプロロール、ネビボロール、塩酸シクロプロロール、塩酸デキスプロプラノロール、塩酸ジアセトロール、塩酸ジレバロール、塩酸エキサプロロール、硫酸フレストロール、塩酸メタロール、メトプロロール２−プロパノール、酒石酸メトプロロール、硫酸パマトロール、硫酸ペンブトロール、プラクトロール、塩酸チプレノロール、トラモロール、塩酸フェンスピリド、プロロキサン、塩酸アルフゾシン、塩酸ラベタロール、ブレチリウムトシレート、ジヒドロエルゴタミンメシレート、カルベジロール、ラベタロール、ブレチリウムトシレート、フェントラミンメシレート、酒石酸ソリペルチン、塩酸ゾレルチン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、ロサルタンカリウム、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、フォシノプリル、塩酸モエキシプリル、ペリンドプリルエルブミン、キナプリル、ラミプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリル、デラプリル、スピラプリル、塩酸デラプリル、リベンザプリル、ペントプリル、ペリンドプリル１Ｈ−インドール−２−カルボン酸、キナプリラート、塩酸スピラプリル、スピラプリラート、テプロチド、ゾフェノプリル、アムロジピンベシレート、マレイン酸クレンチアゼム、イスラジピン、ニモジピン、フェロジピン、ニルバジピン、塩酸ジルチアゼム、塩酸ベラパミル、塩酸テルジピン、ベルホスジル、ホステジル、ラノラジン、塩酸ブトプロジン、トシフェン、モルシドミン、塩酸ラノラジン、トシフェン、塩酸ジルチアゼム、二硝酸イソソルビド、一硝酸ソソルビド、ニトログリセリン、塩酸ベラパミル、クロモナール、クロニテート、ドロプレニラミン、リドフラジン、プレニラミン、硝酸プロパチル、塩酸ミオフラジン、ミキシジン、モルシドミン、一硝酸イソソルビド、四硝酸エリトリチル、クロニトレート、ジピリダモール、ニコランジル、ピリジンカルボキサミド、ニフェジピン、マレイン酸ペルヘキシリン、オクスプレノロール、ペントリニトロール、ベラパミル、アルチアジド、ベンズチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、スピロノラクトン、トリアムテレン、塩酸グアンファシン、ヒドロクロロチアジドと組み合わせたメチルドパ−ヒドロクロロチアジド、メチルドパ−クロロチアジド、塩酸クロニジン、クロルタリドン、塩酸クロニジン、クロニジン、アルチアジド、ベンズチアジド、カプトプリル、カルベジロール、クロロチアジド、塩酸クロニジン、シクロチアジド、塩酸デラプリル、塩酸ジレバロール、塩酸デラプリル、ドキサゾシンメシレート、フォシノプリルナトリウム、塩酸モエキシプリル、マレイン酸モナテピル、コハク酸メトプロロール、塩酸グアンファシン、メチルドパ、キナプリラート、塩酸キナプリル、プリミドロール、塩酸プラゾシン、塩酸ペランセリン、塩酸フェノキシベンズアミン、カンデサルタンシレキセチル、テルミサルタン、カンデサルタン、マレイン酸アムロジピン、塩酸テラゾシン、塩酸ベバントロールまたはラミプリルである、項目５１に記載の方法。（項目５４） 前記さらなる化学療法剤がエゼチミブおよび、場合により、シンバスタチンである、項目５３に記載の方法。
（項目５５） 前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化抗体である、項目５０に記載の方法。
（項目５６） 項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを作製するための方法であって、前記重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコードし、その発現を指令する１つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを、１つまたはそれより多くの宿主細胞に導入する工程；ならびに該宿主細胞を前記重鎖および軽鎖の免疫グロブリンが発現される条件下で増殖させる工程を含む方法。
（項目５７） 前記軽鎖をコードし、その発現を指令する前記ポリヌクレオチドと、前記重鎖をコードし、その発現を指令する前記ポリヌクレオチドが別々の宿主細胞中に存在する、項目５６に記載の方法。

マウス抗ヒトＰＣＳＫ９抗体の成熟可変領域アミノ酸配列。ＣＤＲに下線を付している。 マウス抗ヒトＰＣＳＫ９抗体の成熟可変領域アミノ酸配列。ＣＤＲに下線を付している。 マウス抗ヒトＰＣＳＫ９抗体の成熟可変領域アミノ酸配列。ＣＤＲに下線を付している。 マウス抗ヒトＰＣＳＫ９抗体の成熟可変領域アミノ酸配列。ＣＤＲに下線を付している。

（発明の詳細な説明）
本発明は、コレステロール障害を治療する革新的方法のための方法および組成物を含む。本発明の方法および組成物は、ＬＤＬ受容体経路を調節することによってコレステロール障害を治療するために有用である。具体的には、本発明の方法および組成物は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの相互作用に拮抗し、それにより血流からのＬＤＬのクリアランス上昇を導く。ＰＰＩをブロックすることに関連する非常な技術的困難さにもかかわらず、本発明は、この相互作用を標的化し、ブロックするための、それゆえ血中コレステロールレベルに関する有益な作用を導く方法を提供する。

低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）という用語は、任意のそのような受容体、例えば、ヒトＬＤＬＲとその任意の対立遺伝子変異体を包含する。本発明の１つの実施形態では、完全長ＬＤＬＲは以下のアミノ酸配列を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿０００５２７．２参照）：

本発明の１つの実施形態では、可溶性ＬＤＬＲフラグメントは以下のアミノ酸配列を含む（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ（１９８４）３９：２７−３８）：

本発明の１つの実施形態では、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａドメインは以下のアミノ酸配列を含む：

「被験者」という用語は、任意の動物、例えば、ヒトなどの哺乳動物を含む。

ＰＣＳＫ９
本発明は、ＰＣＳＫ９、例えば、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む組成物および方法を包含する。本発明の一部の実施形態では、以下で述べる様々な種からの特定ＰＣＳＫ９ポリペプチド配列またはその抗原性フラグメントは、抗原として使用され得る：
ＨＵＭＡＮ ｇｉ｜３１３１７３０７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７７７５９６．２｜プロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケキシン９型
プレプロタンパク質［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］

ＣＨＩＭＰ ｇｉ｜１１４５５６７９０｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１１５４１２６．１｜予測：プロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケキシン９型［チンパンジー（Ｐａｎ
ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）］

ＭＯＵＳＥ ｇｉ｜２３９５６３５２｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿７０５７９３．１｜プロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケキシン９型［ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］

ＲＡＴ ｇｉ｜７７０２０２５０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿９５４８６２．２｜プロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケキシン９型［ドブネズミ（ラット）（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）］

ＥＧＦ−Ａ
本発明はまた、場合によりさらなる化学療法剤（例えば、本明細書で述べるような）と共に、ＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインを含むポリペプチドまたは医薬的に許容される担体を含有するその医薬組成物を被験者に投与することにより、該被験者において総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率または低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させるための方法を提供する。ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−ＡドメインはＰＣＳＫ９に結合し、そして、特定の理論または機序に拘束されることなく、ＰＣＳＫ９への結合に関して完全な内因性ＬＤＬ受容体と競合することによってＰＣＳＫ９の活性を低下させ得る。

例えば、本発明の１つの実施形態では、ＥＧＦ−Ａドメインは以下のアミノ酸配列を含むまたは以下のアミノ酸配列から成る：

本発明の１つの実施形態では、ヒトＬＤＬ受容体は以下のアミノ酸配列を含む：

ＥＧＦ−Ａドメインに下線を付し、太字活字で示している。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００５１８、ＥＡＷ８４１７０、ＢＡＤ９２６４６．１またはＡＡＦ２４５１５．１も参照のこと。

本発明はまた、例えば、医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物中の、ＥＧＦ−Ａポリペプチドを含むまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドから成る単離ポリペプチドを包含する。本発明はまた、場合により、天然では他の直接隣接するＬＤＬ受容体配列に隣接していない任意の他の異種ポリペプチドに融合した、そのようなポリペプチド、ならびに、例えば、本明細書で論じるような、融合ポリペプチドの投与を含む治療の方法を提供する。そのようなポリペプチドを本明細書では「ＥＧＦ−Ａポリペプチド」と称することがあり、またＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを「ＥＧＦ−Ａポリヌクレオチド」と称することがある。

例えば、本発明の１つの実施形態では、ＥＧＦ−Ａポリヌクレオチドは以下のヌクレオチド配列を含む：

前記で論じたように、本発明はまた、本発明のＥＧＦ−Ａポリペプチドおよびポリヌクレオチドと、「タグ」と称され得る第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド部分を含む融合物を包含する。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを発現ベクターに挿入することにより、好都合に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易にするタグを含み得る。そのようなタグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグおよびｍｙｃタグを含む。^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１３ｍＩｎ、^７６Ｂｒ、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎおよび^６８Ｇａなどの検出可能なタグも、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用し得る。そのような融合物を構築し、使用するための方法は極めて慣例的であり、当技術分野において周知である。

本発明のそのようなＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする任意の単離ポリヌクレオチドも、そのようなポリヌクレオチドを含む任意のベクターおよびそのようなベクターを含む宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞または真核細胞）と共に、本発明の一部を形成する。発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されたそのようなポリヌクレオチドも本発明の一部を形成する。

一般に、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することができ（例えば、直接にまたは他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）、コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、一般に、転写開始部位によってその３’末端で結合され、任意のレベルで転写を開始させるために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸びる。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより、好都合に定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が認められ得る。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と、または本発明の核酸と作動可能に連結され得る。遺伝子発現を制御するために使用し得るプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８．０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）などの原核生物発現ベクター；“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”
ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４も参照のこと；ならびにＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターまたはアルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌からのプロモーターエレメントを含むが、これらに限定されない。

細胞または他の発現系における転写制御配列および翻訳制御配列が、ＲＮＡポリメラーゼを介したコード配列のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへの転写を指令し、次にそれがスプライシングされたＲＮＡとなり（それがイントロンを含む場合）、場合によりコード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳され得る場合、コード配列は転写制御配列および翻訳制御配列「の制御下にある」、「と機能的に連結されている」または「と作動可能に連結されている」。

「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列内の情報が明らかになることを可能にするまたは明らかになるようにすること、例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質などの「発現産物」を形成するように細胞においてまたは細胞によって発現される。発現産物自体も、細胞によって「発現される」と言われ得る。

「ベクター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が宿主を形質転換して、場合により、導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することができる媒体（例えば、プラスミド）を包含する。

本発明において使用できるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主のゲノムへの核酸の導入を促進し得る他の媒体を含む。プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を果たし、当技術分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが本明細書における使用に適する。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編集），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ参照。

「発現系」という用語は、例えば、適切な条件下で、そのベクターによって担持され、宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を発現することができる、宿主細胞および適合性ベクターを包含する。一般的な発現系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞とベクターを含む。

原核生物宿主−ベクター系は、多くの異なる種のための多種多様なベクターを含む。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその誘導体の多く（例えば、ｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９）である。ＥＧＦ−Ａポリペプチドを発現するために使用できるベクターは、ｌａｃプロモーターを含むもの（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含むもの（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；ｌｐｐプロモーターを含むもの（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰプロモーターもしくはλ−ｐＲプロモーターを含むもの（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃなどのハイブリッドプロモーターを含むもの（ｐＤＲ５４０）を包含するが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ ｌｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ”，ｉｎ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（編集）Ｖｅｃｔｏｒｓ；Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６参照。多くのポリペプチドは、米国特許第４，９５２，４９６号、同第５，６９３，４８９号および同第５，８６９，３２０号およびＤａｖａｎｌｏｏ，Ｐ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２０３５−２０３９；Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：１２５−１３５；およびＤｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ
６８：２５９に開示されているような大腸菌／Ｔ７発現系において高レベルで発現され得る。

本発明は、本発明のＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、プロモーターなどの発現制御配列に作動可能に連結された）を含むベクターを適切な宿主細胞に導入し、ベクター内のポリヌクレオチドからのポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を増殖させる（例えば、適切な液体増殖培地で増殖させる）ことを含む、本発明のＥＧＦ−Ａポリペプチドの発現の方法を含む。

また、配列番号３のアミノ酸配列と約９０％またはそれより高いアミノ酸配列類似性または同一性を有する任意の単離ポリペプチドも本発明の一部である。本発明の１つの実施形態では、そのようなポリペプチドは、ＰＣＳＫ９もしくはその機能的フラグメントに結合しなければならないか、またはＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体もしくはそのいずれかの機能的フラグメントの結合を阻害しなければならないか、または許容される動物モデル（例えば、イヌ、霊長類、ウサギ、マウスもしくはラットなどの哺乳動物）またはヒトなどの被験者において総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率または低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させる能力を示さなければならない。

本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学および当分野の技術内の組換えＤＮＡ手法が使用され得る。そのような手法は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書中以下では「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＩ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４））；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＪ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）参照。

「宿主細胞」という用語は、細胞による物質の生産、例えば、細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列またはタンパク質の発現または複製のために、任意の方法で選択される、改変される、トランスフェクトされる、形質転換される、増殖されるまたは使用されるまたは操作される任意の生物の任意の細胞を包含する。

「単離ポリヌクレオチド」または「単離ポリペプチド」という用語は、それぞれ、細胞においてまたは組換えＤＮＡ発現系において通常認められる他の成分から部分的にまたは完全に分離されている、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子、または混合ポリマー）またはポリペプチドを包含する。これらの成分は、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および外来性ゲノム配列を含むが、これらに限定されない。

単離ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本発明の１つの実施形態では、基本的に分子の均質な組成物であるが、多少の不均質性を含み得る。

本発明は、本発明のＥＧＦ−Ａポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列への表面的なまたはわずかな改変を企図する。特に、本発明は、本発明のＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする核酸の配列保存的変異体を企図する。ＥＧＦ−Ａポリヌクレオチド配列の「配列保存的変異体」は、所与のコドン内の１つまたはそれより多くのヌクレオチドの変化がその位置でコードされるアミノ酸の変化を生じさせないものである。本発明のＥＧＦ−Ａポリペプチドの機能保存的変異体も本発明によって企図される。「機能保存的変異体」は、ＥＧＦ−Ａポリペプチド内の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な高次構造および／または機能（例えば、ＰＣＳＫ９に結合する能力またはＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体もしくはそのフラグメントの結合を阻害する能力）を変化させることなく変更されたものであり、類似の性質を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含むが、決してこれに限定されない。類似の性質を有するアミノ酸は当技術分野において周知である。例えば、交換可能であり得る極性／親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；交換可能であり得る非極性／疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む；交換可能であり得る酸性アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、交換可能であり得る塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンを含む。

本発明は、ＥＧＦ−Ａをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号９）およびその機能的フラグメントならびに前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を含む。本発明の１つの実施形態では、核酸は、低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下でまたは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。一本鎖形態の核酸分子が温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングすることができる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。温度およびイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。典型的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％乳、および４２℃でホルムアミドなし；または４２℃で３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳである。典型的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが４０％ホルムアミド、５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ中４２℃で実施されることを除き、前記低ストリンジェンシー条件と同様である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション条件が５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣ中、場合により、より高い温度（例えば、４２℃より高い温度：５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）で実施されることを除き、低ストリンジェンシー条件と同様である。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の程度が大きいほど、その下で核酸がハイブリダイズし得るストリンジェンシーはより高い。１００ヌクレオチド長より大きいハイブリッドに関して、融解温度を計算するための方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。本発明の１つの実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９もしくはその機能的フラグメントに結合しなければならないが、またはＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体もしくはそのいずれかの任意の機能的フラグメントの結合を阻害しなければならないか、または許容される動物モデル（例えば、イヌ、霊長類、ウサギ、マウスもしくはラットなどの哺乳動物）またはヒトなどの被験者において総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率または低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させる能力を示さなければならないポリペプチドをコードする。

また、比較をＢＬＡＳＴアルゴリズムによって実施する場合（そこではアルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大のマッチを与えるように選択される）、参照ヌクレオチド配列（配列番号９）または参照アミノ酸配列（配列番号３）に少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一である、より好ましくは少なくとも約９０％同一である、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に包含される。比較をＢＬＡＳＴアルゴリズムによって実施する場合（そこではアルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大のマッチを与えるように選択される）、配列番号３の参照ＥＧＦ−Ａアミノ酸配列に少なくとも約７０％類似する、好ましくは少なくとも約８０％類似する、より好ましくは少なくとも約９０％類似する、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に包含される。

配列同一性は、比較する２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の間の正確なマッチを指す。配列類似性は、非同一で生化学的に関連するアミノ酸の間のマッチに加えて、比較する２つのポリペプチドのアミノ酸の間の正確なマッチの両方を指す。類似の性質を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸については前記で論じている。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する以下の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；アラインメントスコアリングシステム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編集），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら、“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編集），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ．Ｓ．Ｆ．ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；アラインメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編集）（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。

抗体
本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントを含む方法および組成物を包含する。抗ＰＣＳＫ９抗体等の用語は、ＰＣＳＫ９（例えば、ヒトＰＣＳＫ９）に特異的に結合するいかなる抗体も包含する。本発明において使用される抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントは、全ＰＣＳＫ９タンパク質に対して惹起されるまたはそれに結合する抗体およびフラグメント、ならびにＰＣＳＫ９内の特定の短いエピトープ、例えば、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインもしくはその部分（例えば、ＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲエピトープ（配列番号８）に結合する部分）またはアミノ酸配列：ＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭＥＡ（配列番号４のアミノ酸４９０−５０２）を有する、ＰＣＳＫ９のＣ末端ドメイン（すなわちＰＣＳＫ９のｃａｔドメインに対するＣ末端）に対して惹起されるまたはそれに結合する抗体を包含する。本発明の１つの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａドメインと相互作用するＰＣＳＫ９のドメインに結合する。

本発明の具体的な単離マウス抗ヒトＰＣＳＫ９抗体免疫グロブリン配列を以下に示す。各々の免疫グロブリン鎖についてのＣＤＲ配列に下線を付している。

１１Ｂ５免疫グロブリン重鎖

１１Ｂ５免疫グロブリン軽鎖

７５Ｂ９免疫グロブリン重鎖

７５Ｂ９免疫グロブリン軽鎖

７７Ｄ１０免疫グロブリン重鎖

７７Ｄ１０免疫グロブリン軽鎖

２９Ｃ１０免疫グロブリン重鎖

２９Ｃ１０免疫グロブリン軽鎖

２２Ｄ１１免疫グロブリン重鎖

２２Ｄ１１免疫グロブリン軽鎖

１Ｆ１１／１Ｇ１１免疫グロブリン重鎖

１Ｆ１１／１Ｇ１１免疫グロブリン軽鎖

本発明は、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，，１９８７および１９９１）；またはＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８（１９８９）；およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８９）（ＫａｂａｔもしくはＣｈｏｔｈｉａ）またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）に述べられている慣例によって定義されるような前記に示す軽鎖および／または重鎖免疫グロブリンからの１つまたはそれより多くの（例えば、３つの）ＣＤＲを含む単離ポリペプチド（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を包含する。

ゆえに、本発明は、前記に示す軽鎖および／または重鎖免疫グロブリンＣＤＲの１つまたはそれを超えて含むいかなる抗体またはその抗原結合フラグメントも包含する。本発明の１つの実施形態では、抗体またはフラグメントは、３つの軽鎖ＣＤＲ全部および／または３つの重鎖ＣＤＲ全部を、例えば、前記で特定した順序で含む。本発明の実施形態は、例えば、抗体またはフラグメントがモノクローナル抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、一本鎖抗体、ジスルフィドＦｖ（ｄｓｆｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびドメイン抗体である、前記で述べたような、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ゆえに、抗体という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含するが、これらに限定されない。抗体の抗原結合フラグメントという用語は、典型的には、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する、親抗体の抗原結合領域または可変領域の少なくとも一部（例えば、１つまたはそれより多くのＣＤＲ）を含む、抗体のフラグメントまたは誘導体を包含する。抗体の抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント：ｄｓＦｖ；（ｄｓＦｖ）_２、ｄｓダイアボディ；ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）；二重特異性ダイアボディ；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、ＰＣＳＫ９、例えば、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。本発明の１つの実施形態では、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体またはフラグメントは、ラット、マウスまたはチンパンジーのＰＣＳＫ９に対するそれと比較してヒトＰＣＳＫ９に選択的に結合する。ヒトＰＣＳＫ９への選択的結合とは、ラット、マウスまたはチンパンジーのＰＣＳＫ９への結合の親和性よりも任意の程度大きい親和性（例えば、１％、１０％、５０％、１００％または１０倍高い親和性）での結合を意味する。本発明の１つの実施形態では、抗ヒトＰＣＳＫ９抗体は、いかなる他の種のＰＣＳＫ９への検出可能な結合も伴わずに（例えば、マウスまたはラットのＰＣＳＫ９への検出可能な結合を伴わずに）ヒトＰＣＳＫ９に結合する。特異的抗ＰＣＳＫ９結合とは、結合し得る他の任意のタンパク質のそれよりも少なくとも約１００倍高いＫｄおよび約５００ｎＭの最小Ｋｄでの、ＰＣＳＫ９またはその抗原性フラグメントへの抗体の結合を指す。

抗体を作製するためのいかなる適切な方法も使用し得る。例えば、受容者をＰＣＳＫ９またはその抗原性フラグメントで免疫し得る。免疫のいかなる適切な方法も使用できる。そのような方法は、アジュバント、他の免疫刺激薬、反復ブースター免疫、および１つまたはそれより多くの免疫化経路の使用を含み得る。ＰＣＳＫ９のいかなる適切なソースも、本明細書で開示する組成物および方法の抗体およびフラグメントの作製のための免疫原として使用できる。そのような形態は、当技術分野で公知の組換え、合成、化学的または酵素分解手段を介して作製される全タンパク質、ペプチドおよびエピトープを含むが、これらに限定されない。

いかなる形態の抗原も、生物学的に活性な抗体を生成するのに十分である抗体を作製するために使用できる。ゆえに、惹起した抗原は、単独のまたは当技術分野で公知の１つもしくはそれより多くの免疫原性増強剤と組み合わせた、単一エピトープ、複数のエピトープまたはタンパク質全体であり得る。惹起した抗原は、単離完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、少なくとも抗原の一部でトランスフェクトした細胞で免疫する）または可溶性タンパク質フラグメントであり得る。

いかなる適切な方法も、ＰＣＳＫ９を阻害するための所望生物学的特性を備えた抗体を惹起するために使用できる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ヒト、他の霊長類等のような様々な哺乳動物宿主から作製され得る。そのようなモノクローナル抗体を作製するための手法の説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編集）ＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡおよびその中で引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに見出される。ゆえに、モノクローナル抗体は、当技術分野の研究者が精通する様々な手法によって入手し得る。典型的には、所望抗原で免疫した動物からの脾細胞を、一般に骨髄腫細胞との融合によって不死化する。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９参照。不死化の選択的な方法は、エプスタイン‐バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当技術分野で公知の他の方法を含む。例えば、Ｄｏｙｌｅら（編集、１９９４および定期的補遺）ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照。単一不死化細胞から生じるコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体の産生に関してスクリーニングし、そのような細胞によって産生されたモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む、様々な手法によって増強し得る。あるいは、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を、例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１に概説されている一般的プロトコールに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。

他の適切な手法は、ファージまたは同様のベクター中の抗体のライブラリーの選択を含む。例えば、Ｈｕｓｅら、前出；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１ ：５４４−５４６参照。キメラ抗体またはヒト化抗体を含む、本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変を加えてまたは改変せずに使用し得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、共有結合によってまたは非共有結合的に、検出可能なシグナルを提供する物質と結合することによって標識される。多種多様な標識および結合手法が公知であり、学術文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適切な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子等を含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を含む。また、組換え免疫グロブリンは、Ｃａｂｉｌｌｙの米国特許第４，８１６，５６７号；Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３を参照して生成され得るか、またはＭｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６を参照して、トランスジェニックマウスにおいて作製され得る。

所与の抗原で免疫した場合にヒト免疫グロブリンを産生するマウスも当技術分野において使用可能である。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；
Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６）；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１およびＨａｒｄｉｎｇら（１９９５）Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６参照。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；同第５，７７０，４２９号および同第５，５４５，８０７号；ならびに国際特許出願公開公報第ＷＯ９８／２４８８４号；同第ＷＯ９４／２５５８５号；同第ＷＯ９３／１２２２７号；同第ＷＯ９２／２２６４５号および同第ＷＯ９２／０３９１８号も参照のこと。

「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖および１本の重鎖のＣ_Ｈ１領域と可変領域から成る。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは、２つまたはそれを超えるジスルフィド結合によっておよびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって結びつけられている。

「Ｆａｂ’」フラグメントは、１本の軽鎖ならびに、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成するために２つのＦａｂ’フラグメントの２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が結合され得るように、Ｖ_ＨドメインとＣ_Ｈ１ドメインおよびまたＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の領域を含む１本の重鎖の一部を含有する。

「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、２本の軽鎖および、２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、それゆえ、２本の重鎖の間のジスルフィド結合によって結びつけられた２つのＦａｂ’フラグメントから成る。

「ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント」および「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド架橋によって連結された可変重鎖（Ｖ_Ｈ）および／または可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）を有する分子を含む。

「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体という用語は、抗体のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインが一本のポリペプチド鎖に存在する抗体フラグメントを指す。一般に、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖が対合して結合部位を形成することを可能にする、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間のポリペプチドリンカー（例えば、５〜１２残基長）をさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５参照。また、国際特許出願公開公報第ＷＯ８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号も参照のこと。

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントである。一部の場合、２つまたはそれを超えるＶ_Ｈ領域がペプチドリンカーで共有結合連結されて、二価ドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じ抗原または異なる抗原を標的し得る。

「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。一部の場合、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異性であり得る。例えば、本発明は、ｓｃｆｖおよびｄｓｆｖ部分の各々が共通のまたは異なる抗原結合特異性を有し得る、ｓｃｆｖ二量体およびｄｓｆｖ二量体を包含する。

本発明の１つの実施形態では、（ｄｓｆｖ）_２は３本のペプチド鎖を含む：ペプチドリンカーで連結され、ジスルフィド架橋によって２つのＶ_Ｌ部分に対して結合された２つのＶ_Ｈ部分。本発明の１つの実施形態では、二重特異性ｄｓダイアボディは、ＶＨ_１とＶＬ_１の間のジスルフィド架橋によってＶＬ_１−ＶＨ_２部分（ペプチドリンカーによってテザー（鎖繋）された）に連結されたＶＨ_１−ＶＬ_２（同じくペプチドリンカーによってテザーされた）を含む。本発明の１つの実施形態では、二重特異性ｄｓｆｖ−ｄｓｆｖ’も３本のペプチド鎖を含む：重鎖がペプチドリンカー（例えば、長い柔軟なリンカー）によって連結され、それぞれジスルフィド架橋によってＶＬ_１およびＶＬ_２部分に結合されており、各々のジスルフィド対合した重鎖と軽鎖が異なる抗原特異性を有する、ＶＨ_１−ＶＨ_２部分。本発明の１つの実施形態では、ｓｃｆｖ二量体（二価ダイアボディ）は、重鎖と軽鎖がペプチドリンカーによって結合して、１本の鎖のＶ_Ｈが別の鎖のＶ_Ｌと調和的に働いて２つの同一結合部位を形成するように、別のそのような部分と二量体化している、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ部分を含む。本発明の１つの実施形態では、二重特異性ダイアボディは、ＶＨ_１とＶＬ_１が調和的に働いて、ＶＨ_２とＶＬ_２が調和的に働いて、各々の組み合わされたセットが多様な抗原特異性を有する、ＶＬ_１−ＶＨ_２（ペプチドリンカーによって連結された）と結合したＶＨ_１−ＶＬ_２部分（ペプチドリンカーによって連結された）を含む。

本明細書で使用される、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る天然に起こり得る突然変異を除いて同一である、集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原エピトープだけを対象とする。これに対し、従来の（ポリクローナル）抗体製剤は、典型的には種々のエピトープを対象とする（または種々のエピトープに特異的な）多数の抗体を含有する。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、組換えによってもしくはＫｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に述べられている手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離し得る。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照のこと。

モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来するまたは特定抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分が別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、それらが所望生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。例えば、可変ドメインはマウスなどの実験動物からの抗体（「親抗体」）より得られ、定常ドメイン配列は、生じるキメラ抗体が親マウス抗体よりもヒト被験者において有害な免疫応答を惹起する可能性がより低くなるように、ヒト抗体から得られる。

本発明の組換え抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の１つの実施形態では、組換えによって作製される、例えば、生物（例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌）または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に形質転換された抗体またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド）に導入されたポリヌクレオチドから発現され、その後生物から抗体またはフラグメントを単離して作製される抗体である。

本発明は、本発明の任意の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを発現するための方法を含む。例えば、本発明の１つの実施形態は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１またはＤＸＢ１１細胞）などの宿主細胞（例えば、単一宿主細胞）において、少なくとも免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の可変ドメインを含む免疫グロブリン分子または免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントを作製するための工程であって、（ｉ）前記宿主細胞を、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインをコードする第１ポリヌクレオチドおよび少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインをコードする第２ポリヌクレオチドで形質転換し、そして（ｉｉ）前記免疫グロブリン重鎖と軽鎖が前記形質転換宿主細胞において別々の分子として生成されるように、前記第１ポリヌクレオチドと前記第２ポリヌクレオチドを独立して発現させる段階を含む工程を包含する。本発明の１つの実施形態では、ポリヌクレオチドはＣＭＶプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結される。本発明はまた、免疫グロブリン分子または免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントを作製するための工程であって、第１ハプロイド酵母宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス（メタノール資化性酵母）（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属）を、少なくとも免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変ドメインをコードする第１ポリヌクレオチドで形質転換し、第２ハプロイド酵母宿主細胞（例えば、ピキア・パストリスなどのピキア属）を、その他の鎖をコードする第２ポリヌクレオチドで形質転換して、ハプロイド細胞に二倍体などの倍数体を形成するのを可能にし（例えば、接合を介して）、ハプロイドから倍数体を選択して、重鎖と軽鎖が倍数体において発現され、場合により培地に分泌される条件下で倍数体を増殖させる工程を含む工程を包含する。

本発明の１つの実施形態では、宿主細胞に導入されたポリヌクレオチドは異所性のままであるが、本発明のもう１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれる。

本発明の１つの実施形態では、抗体またはフラグメントを作製するための方法は、発現された鎖を宿主細胞および／または培地から単離する工程をさらに含む。

本発明はまた、ラクダ化単一ドメイン抗体を含む。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５；国際公開公報第ＷＯ９４／０４６７８号；同第ＷＯ９４／２５５９１号；米国特許第６，００５，０７９号参照。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）は、軽鎖を欠き、それゆえ「重鎖」ＩｇＧまたはＨＣＡｂ（重鎖抗体）と呼ばれるＩｇＧ抗体を含む。ＨＣＡｂは、重鎖可変ドメインだけから成るので、典型的には約９５ｋＤａの分子量を有する。ＨＣＡｂは軽鎖を欠くが、真正な抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３：４４６−４４８；Ｎｇｕｙｅｎら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）７９：２６１−２９６；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００２）５４：３９−４７）。１つの実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変が加えられた２つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。

本明細書で使用される、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、前記フラグメントは、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に連結された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）。同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いられ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第ＥＰ４０４，０９７号；国際公開公報第ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８においてより詳細に説明されている。設計された抗体変異体の総説については、一般にＨｏｌｌｉｇｅｒとＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６参照。

本明細書で使用される、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体と非ヒト（例えば、マウスまたはラット）抗体の両方からの配列を含む抗体の形態を指す。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループ（ＣＤＲ）の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。免疫グロブリン軽鎖可変領域または重鎖可変領域は、ＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域から成る。ヒトフレームワーク配列についてのいくつかの公的なソースが使用可能であり、例えば、Ｖ−ｂａｓｅ（ＭＲＣ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含む。ヒト化抗体は、場合によりヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。例えば、本発明の１つの実施形態は、本明細書で述べる、例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域に融合した、特定のマウス免疫グロブリンＣＤＲとヒト免疫グロブリンフレームワーク領域を含むヒト化抗ＰＣＳＫ９（例えば、抗ヒトＰＣＳＫ９）抗体を包含する。以下の米国特許は参照により本明細書に組み込まれる：第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号。例えば、本発明の実施形態は、以下の群のＣＤＲのいずれかが本発明のヒト化抗体内に含まれるものを包含する：
（ｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｍ Ｈ（配列番号１１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ Ｔ Ｅ Ｙ Ｄ Ｐ Ｋ Ｆ Ｑ Ｄ（配列番号１２）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｓ Ｙ Ｆ Ｇ
Ｓ Ｉ Ｆ Ａ Ｙ（配列番号１３）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号１９）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ Ｔ Ｅ Ｙ Ｄ Ｐ
Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号２０）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｓ Ｙ Ｙ Ｇ Ｓ Ｉ Ｆ Ａ Ｙ（配列番号２１）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｙ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号２７）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｗ Ｉ Ｄ Ｐ Ｅ Ｎ Ｇ Ｄ Ｔ Ｅ Ｙ Ａ Ｐ Ｋ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号２８）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｙ Ｙ Ｒ
Ｙ Ｄ Ｄ Ｇ Ｔ Ｗ Ｆ Ｐ Ｙ（配列番号２９）を含むＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｎ Ｉ Ｋ Ｄ Ｔ Ｙ Ｉ Ｈ（配列番号３５）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｗ Ｉ Ｄ Ｐ Ａ Ｎ Ｇ Ｙ Ｔ Ｋ Ｙ Ａ Ｐ
Ｎ Ｆ Ｑ Ｇ（配列番号３６）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｇ Ｙ Ｙ Ｒ Ｙ Ｙ Ｓ Ｌ Ｄ Ｙ（配列番号３７）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖ）アミノ酸配列：Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｓ Ｎ Ｈ Ｄ Ｍ Ａ（配列番号４３）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｓ Ｉ Ｔ Ｐ Ｓ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｙ Ｙ Ｒ Ｄ Ｓ Ｖ Ｅ Ｇ（配列番号４４）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｎ Ｙ Ｙ
Ｄ Ｇ Ｓ Ｙ Ｙ Ｙ Ｇ Ｌ Ｙ Ｙ Ｆ Ｄ Ｙ（配列番号４５）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）アミノ酸配列：Ｇ Ｙ Ｔ Ｆ Ｔ Ｄ Ｙ Ｙ Ｍ Ｎ（配列番号５１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｄ Ｉ Ｎ Ｐ Ｎ Ｎ Ｇ Ｇ Ａ Ｉ Ｙ Ｎ Ｑ
Ｋ Ｆ Ｋ Ｇ（配列番号５２）を含むＨＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｇ Ｉ Ｉ Ｔ Ｅ Ｉ Ａ Ｅ Ｄ Ｆ（配列番号５３）を含むＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｓ Ｓ Ｖ Ｓ Ｙ Ｌ Ｙ（配列番号１５）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｓ Ｓ Ｈ Ｒ Ａ Ｓ（配列番号：１６）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｈ Ｑ Ｙ Ｑ Ｓ Ｙ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号１７）を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｓ Ｓ Ｖ Ｓ Ｙ Ｌ Ｆ（配列番号２３）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｔ Ｓ Ｙ Ｌ Ａ Ｓ（配列番号２４）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｈ Ｑ Ｙ Ｈ Ｔ Ｙ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号２５）を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｘ）アミノ酸配列：Ｒ Ａ Ｓ Ｇ Ｎ Ｉ Ｈ Ｓ Ｙ Ｌ Ａ（配列番号３１）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｎ Ａ Ｋ Ｔ Ｌ Ｐ Ｄ（配列番号３２）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｈ Ｆ Ｗ Ｎ Ｔ Ｐ Ｗ Ｔ（配列番号３３）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘ）アミノ酸配列：Ｒ Ａ Ｓ Ｑ Ｄ Ｉ Ｓ Ｎ Ｙ Ｌ Ｎ（配列番号３９）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｙ Ｓ Ｓ Ｒ Ｌ Ｈ Ｓ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｑ Ｇ Ｋ Ｔ Ｌ Ｐ Ｌ Ｔ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉ）アミノ酸配列：Ｒ Ｓ Ｓ Ｑ Ｓ Ｌ Ｖ Ｙ Ｓ Ｄ Ｇ Ｎ Ｔ Ｙ Ｌ Ｈ（配列番号４７）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｒ Ｖ Ｓ Ｎ Ｒ Ｆ Ｓ（配列番号４８）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｌ Ｑ Ｓ Ｔ Ｈ Ｆ Ｐ Ｐ Ｔ（配列番号４９）を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｉ）アミノ酸配列：Ｋ Ａ Ｓ Ｑ Ｎ Ｖ Ｇ Ｔ Ｎ Ｖ Ｖ（配列番号５５）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列：Ｓ Ａ Ｓ Ｙ Ｒ Ｙ Ｓ（配列番号５６）を含むＬＣＤＲ２およびアミノ酸配列：Ｑ Ｑ Ｙ Ｋ Ｔ Ｙ Ｐ Ｙ Ｔ（配列番号５７）を含むＬＣＤＲ３。

本発明はまた、本明細書で示す免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを、前記ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ポリヌクレオチドとベクターを含む単離宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、大腸菌のような細菌細胞ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリスなどのピキア属のような真菌細胞）と共に包含する。前記ポリペプチドを作製するための方法も包含され、その方法は、ポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞に導入し、ポリペプチドが発現され得、場合により分泌され得る条件下で宿主細胞を培養して、場合によりポリペプチドを単離する工程を含む。

治療方法、投与および医薬製剤
本発明は、コレステロールまたは脂質の恒常性の障害およびそれに関連する障害、例えば、高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、血管炎症および黄色腫を、治療有効量の抗ＰＣＳＫ９抗体（例えば、本明細書で述べるような）もしくはその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドを投与することによって治療するまたは予防するための方法を提供する。

高コレステロール血症という用語は、例えば、家族性および非家族性の高コレステロール血症を含む。家族性高コレステロール血症（ＦＨＣ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に結合した血清コレステロールの上昇によって特徴づけられる常染色体優性障害である。家族性高コレステロール血症は、ヘテロ接合ＦＨＣとホモ接合ＦＨＣの両方を含む。

高脂血症は血流中の脂質の増加である。これらの脂質は、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質およびトリグリセリドを含む。高脂血症は、例えば、Ｉ型、ＩＩａ型、ＩＩｂ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型を含む。

シトステロール血症は、まれな遺伝性植物ステロール蓄積疾患である。一般に、罹患患者における代謝欠損は、胃腸管からのシトステロールの過剰吸収、シトステロールの肝分泌低下とその後の排泄低下、およびコレステロール合成の変化を引き起こす。

アテローム性動脈硬化症は、動脈の内層における脂肪物質、コレステロール、細胞廃棄物、カルシウムおよびフィブリンの沈着に関連する動脈の硬化を含む。生じる集積物はプラークと呼ばれる。

動脈硬化症は、硬化を導く、動脈壁におけるカルシウムの散在性蓄積と沈着を含む。

本発明はまた、心疾患の危険度上昇に関連する血液コレステロールマーカーを改善するための方法を提供する。これらのマーカーは、高い総コレステロール、高いＬＤＬ、高い総コレステロール対ＨＤＬ比および高いＬＤＬ対ＨＤＬ比を含む。

一般に、２００ｍｇ／ｄＬ未満の総コレステロールが望ましいとみなされ、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬは高境界値とみなされ、そして２４０ｍｇ／ｄＬ以上は高いとみなされる。

一般に、１００ｍｇ／ｄＬ未満の血中ＬＤＬレベルが最適とみなされる；１００〜１２９ｍｇ／ｄＬは最適に近い／最適よりは高いとみなされ、１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬは高境界値とみなされ、１６０〜１８９ｍｇ／ｄＬは高いとみなされ、そして１９０ｍｇ／ｄＬ以上は非常に高いとみなされる。

一般に、正常とみなされるＨＤＬレベルは少なくとも３５〜４０ｍｇ／ｄＬである。

心疾患危険度のもう１つの指標は、総コレステロールのＨＤＬに対する比率である。一般に、心疾患の非常に低い危険度は、＜３．４（男性）または＜３．３（女性）の比率と相関する；低い危険度は４．０（男性）または３．８（女性）の比率に結びつき、平均的な危険度は５．０（男性）または４．５（女性）の比率に結びつき、中等度の危険度は９．５（男性）または７．０（女性）の比率に結びつき、そして高い危険度は＞２３（男性）または＞１１（女性）の比率に結びつく。

心疾患危険度のさらなる指標は、ＬＤＬのＨＤＬに対する比率である。一般に、非常に低い危険度は、１（男性）または１．５（女性）の比率に結びつき、平均的な危険度は３．６（男性）または３．２（女性）の比率に結びつき、中等度の危険度は６．３（男性）または５．０（女性）の比率に結びつき、そして高い危険度は８（男性）または６．１（女性）の比率に結びつく。

本発明の１つの実施形態では、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドは、医薬的に許容される担体を含有する医薬製剤に製剤化される。製剤に関する一般的な情報については、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編集）（１９９０），Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編集），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．；Ａｖｉｓら（編集）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編集）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編集）（１９９０），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｅｎｎｅｔｈ Ａ．Ｗａｌｔｅｒｓ（編集）（２００２）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｅｓｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ １１９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ参照。

本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドは、医薬的に有用な組成物を製造するための公知の方法に従って製剤化でき、それにより抗体またはフラグメントを医薬的に許容される担体と混合して組み合わせる。担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度で受容者に無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリン類を含む単糖類、二糖類および他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌ろ過膜を介したろ過によって容易に達成される。本明細書の治療もしくは医薬組成物または製剤は一般に、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを備えた静脈内溶液バッグまたはバイアル中に収められる。

本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントの投与の経路は、本発明の１つの実施形態では、非経口経路（例えば、静脈内、皮下、動脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内）によるものである。

本発明の医薬組成物の用量および所望の抗ＰＣＳＫ９濃度またはＥＧＦ−Ａポリペプチド濃度は、想定される特定用途に依存して異なり得る。適切な用量または投与経路の決定は十分に一般的な医師の技術範囲内である。動物実験は、ヒト治療用の有効用量の決定のために信頼し得る指針を提供する。有効用量の種間スケーリング（ｓｃａｌｉｎｇ）は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．とＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら編集、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２９６によって規定された原則に従って実施できる。

被験者（例えば、本明細書で論じるような）において障害を治療するために使用される場合、抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドの治療有効用量または治療有効量を被験者に投与する。本発明の１つの実施形態では、治療有効用量は、いかなる程度であれ総血清コレステロールを低下させる、血中ＬＤＬレベルを低下させる、または血中ＨＤＬレベルを上昇させるのに十分な用量である。本発明の１つの実施形態では、高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、血管炎症もしくは黄色腫の治療のため、または心疾患危険度の任意の血液マーカー（例えば、本明細書で論じるような）の治療のための抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、本明細書で述べるような）の治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）／週〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／週である。可溶性ＰＣＳＫ９ ＥＧＦ−Ａポリペプチドの治療有効用量は、本発明の１つの実施形態では、約０．２５ｍｇ／ｋｇ／週〜約２５ｍｇ／ｋｇ／週である。

可能な場合、作用物質（例えば、本明細書で論じるさらなる治療薬）の投与および投薬は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第５７版）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月）の中の、作用物質の製品情報シートに列挙されているスケジュール、ならびに当技術分野で周知の治療プロトコールに従って行われる。

医師および臨床家は、抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドで治療されているまたは治療される予定である被験者において血中コレステロールレベルを監視し、有益な医学的結果に達するために必要に応じて被験者の治療レジメンに調整を加え得る。

さらなる化学療法剤
本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドの投与によって脂質およびコレステロールの代謝の障害（例えば、本明細書で述べるような）を治療するための方法および組成物を提供する。抗体は、本発明の１つの実施形態では、任意の付加的なまたはさらなる化学療法剤と共に提供または投与され得る。本発明の１つの実施形態では、さらなる化学療法剤は、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬またはアドレナリン刺激薬である。本発明の１つの実施形態では、さらなる治療薬は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬のようなコレステロール低下薬である。

本発明に関連して使用し得る心臓血管薬は、脂質および／もしくはコレステロール障害または高血圧ならびに他の心臓血管障害および疾患の治療または予防のためのものを含む。脂質またはコレステロールの代謝の障害は、高血圧によって引き起こされ得るまたは悪化し得る。高血圧は、持続的に高い血圧と定義される。一般に、成人は、収縮期血圧が持続的に１４０ｍｍＨｇより高い場合または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇより高い場合に高血圧と分類される。心臓血管死亡率についての長期的な危険度は、持続的血圧と直接関係して上昇する。本発明において使用し得る抗高血圧薬の例としては、例えば、カルシウムチャネル遮断薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、利尿薬、βアドレナリン受容体遮断薬およびαアドレナリン受容体遮断薬を含むアドレナリン遮断薬、または利尿薬が挙げられる。

抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合フラグメントと共に提供され得る他の心臓薬としては、アドレナリン刺激薬または冠血管拡張薬などの抗狭心症薬およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬が挙げられる。

ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ酵素を阻害し、それゆえ、被験者の体内でのコレステロールの産生を減少させる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬は、例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、リバスタチンおよびシンバスタチン：

を含む。

アドレナリン遮断薬は、β受容体阻害薬および／またはα受容体阻害薬である化合物を含む。β受容体阻害薬であるアドレナリン遮断薬は、高血圧、狭心症および心不整脈におけるカテコールアミンの心臓血管作用に拮抗する薬剤のクラスを含む。βアドレナリン受容体遮断薬は、塩酸ブノロール（１（２Ｈ）−ナフタレノン，５−［３−（１，１−ジメチルエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジヒドロ−，塩酸塩、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓより入手できる、ＣＡＳ ＲＮ ３１９６９−０５−８）；アセブトロール（±Ｎ−［３−アセチル−４−［２−ヒドロキシ−３−［（１−メチルエチル）アミノ］プロポキシ］フェニル］−ブタンアミド、または（±）−３’−アセチル−４’−［２−ヒドロキシ−３−（イソプロピルアミノ）プロポキシ］ブチルアニリド）；塩酸アセブトロール（例えば、Ｎ−［３−アセチル−４−［２−ヒドロキシ−３−［（１−メチルエチル（ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅ））アミノ］プロポキシ］フェニル］−，一塩酸塩（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、（±）−３’−アセチル−４’−［２−ヒドロキシ−３−（イソプロピルアミノ）プロポキシ］ブチルアニリド一塩酸塩、例えば、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔより入手可能なＳＥＣＴＲＡＬ（登録商標）カプセル）；塩酸アルプレノロール（２−プロパノール，１−［（１−メチルエチル）アミノ］−３−［２−（２−プロペニル）フェノキシ］−，塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ １３７０７−８８−５、オランダ特許出願第６，６０５，６９２号参照）；アテノロール（例えば、ベンゼンアセトアミド４−［２’−ヒドロキシ−３’−［（１−メチルエチル）アミノ］プロポキシ］−、例えば、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａより入手可能なＴＥＮＯＲＭＩＮ（登録商標）Ｉ．Ｖ．注射剤）；塩酸カルテオロール（例えば、５−［３−［（１，１−ジメチルエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリノン一塩酸塩、例えば、Ａｂｂｏｔｔより入手可能なＣａｒｔｒｏｌ（登録商標）、Ｆｉｌｍｔａｂ（登録商標）錠剤）；塩酸セリプロロール（３−［３−アセチル−４−［３−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−ヒドロキシプロポキシル］フェニル］−１，１−ジエチル尿素一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ５７４７０−７８−７、米国特許第４，０３４，００９号も参照のこと）；塩酸セタモロール（アセトアミド，２−［２−［３−［（１，１−ジメチルエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロポキシ］−フェノキシ］−Ｎ−メチル−、一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ７７５９０−９５−５、米国特許第４，０５９，６２２号も参照のこと）；塩酸ラベタロール（例えば、５−［１−ヒドロキシ−２−［（１−メチル−３−フェニルプロピル）アミノ］エチル］サリチルアミド一塩酸塩、例えば、Ｓｃｈｅｒｉｎｇより入手可能なＮＯＲＭＯＤＹＮＥ（登録商標）錠剤）；塩酸エスモロール（（±）−メチルｐ−［２−ヒドロキシ−３−（イソプロピルアミノ）プロポキシ］ヒドロシンナメート塩酸塩、例えば、Ｂａｘｔｅｒより入手可能なＢＲＥＶＩＢＬＯＣ（登録商標）注射剤）；塩酸レボベタキソロール（例えば、（Ｓ）−１−［ｐ−［２−（シクロプロピルメトキシ）エチル］フェノキシ］−３−（イソプロピルアミノ）−２−プロパノール塩酸塩、例えば、Ａｌｃｏｎより入手可能なＢＥＴＡＸＯＮ（商標）眼科用懸濁剤）；塩酸レボブノロール（例えば、（−）−５−［３−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−ヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ナフタレノン塩酸塩、例えば、Ａｌｌｅｒｇａｎより入手可能なＣ ＣＡＰ（登録商標）コンプライアンスキャップを有するＢＥＴＡＧＡＮ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｆｉｌｍ（登録商標））；ナドロール（例えば、１−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−３−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−シス−６，７−ジヒドロキシ−１−ナフチル）オキシ］−２−プロパノール、例えば、Ｍｙｌａｎより入手可能なＮａｄｏｌｏｌ錠剤）；プラクトロール（アセトアミド，Ｎ−［４−［２−ヒドロキシ−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−プロポキシ］フェニル］−、ＣＡＳ
ＲＮ ６６７３−３５−４、米国特許第３，４０８，３８７号も参照のこと）；塩酸プロプラノロール（１−（イソプロピルアミノ）−３−（１−ナフチルオキシ）−２−プロパノール塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ３１８−９８−９）；塩酸ソタロール（例えば、ｄ，l
−Ｎ−［４−［１−ヒドロキシ−２−［（１−メチルエチル）アミノ］エチル］−フェニル］メタンスルホンアミド一塩酸塩、例えば、Ｂｅｒｌｅｘより入手可能なＢＥＴＡＰＡＣＥ ＡＦ（商標）錠剤）；チモロール（２−プロパノール，１−［（１，１−ジメチルエチル）アミノ］−３−［［４−４（４−モルホリニル）−１，２，５−チアジアゾール−３−イル］オキシ］−，半水和物、（Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ９１５２４−１６−２）；マレイン酸チモロール（（Ｓ）−１−［（１，１−ジメチルエチル）アミノ］−３−［［４−（４−モルホリニル）−１，２，５−チアジアゾール−３−イル］オキシ］−２−プロパノール（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）塩、ＣＡＳ ＲＮ ２６９２１−１７−５）；ビソプロロール（２−プロパノール，１−［４−［［２−（１−メチルエトキシ）エトキシ］−メチル］フェノキシル］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−、（±）、ＣＡＳ ＲＮ ６６７２２−４４−９）；フマル酸ビソプロロール（例えば、（±）−１−［４−［［２−（１−メチルエトキシ）エトキシ］メチル］フェノキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−２−プロパノール（Ｅ）−２−ブテンジオエート（２：１）（塩）、例えば、Ｌｅｄｅｒｉｅ Ｃｏｎｓｕｍｅｒより入手可能なＺＥＢＥＴＡ（商標）錠剤）；ネビボロール（ｎｅｂｉｖａｌｏｌ）（２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−メタノール，αα’−［イミノビス（メチレン）］ビス［６−フルオロ−３，４−ジヒドロ−、ＣＡＳ ＲＮ ９９２００−０９−６、米国特許第４，６５４，３６２号も参照のこと）；塩酸シクロプロロール、例えば、２−プロパノール，１−［４−［２−（シクロプロピルメトキシ）エトキシ］フェノキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−，塩酸塩、Ａ．Ａ．Ｓ．ＲＮ ６３６８６−７９−３）；および塩酸デキスプロプラノロール（２−プロパノール，１−［（１−メチルエチル）−アミノ］−３−（１−ナフタレニルオキシ）−塩酸塩（ＣＡＳ ＲＮ １３０７１−１１−９）；塩酸ジアセトロール（アセトアミド，Ｎ−［３−アセチル−４−［２−ヒドロキシ−３−［（１−メチル−エチル）アミノ］プロポキシ］［フェニル］−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ６９７９６−０４−９）；塩酸ジレバロール（ベンズアミド，２−ヒドロキシ−５−［１−ヒドロキシ−２−［１−メチル−３−フェニルプロピル）アミノ］エチル］−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ
７５６５９−０８−４）；塩酸エキサプロロール（２−プロパノール，１−（２−シクロヘキシルフェノキシ）−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−，塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ５９３３３−９０−３）；硫酸フレストロール（安息香酸，２−フルオロ（ｆｌｕｒｏ）−，３−［［２−［アミノカルボニル）アミノ］−１−ジメチルエチル］アミノ］−２−ヒドロキシプロピルエステル，（±）−硫酸塩（１：１）（塩）、ＣＡＳ ＲＮ ８８８４４−７３−９；塩酸メタロール（メタンスルホンアミド，Ｎ−［４−［１−ヒドロキシ−２−（メチルアミノ）プロピル］フェニル］−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ７７０１−６５−７）；メトプロロール２−プロパノール，１−［４−（２−メトキシエチル）フェノキシ］−３−［１−メチルエチル）アミノ］−、ＣＡＳ ＲＮ ３７３５０−５８−６）；酒石酸メトプロロール（例えば、２−プロパノール，１−［４−（２−メトキシエチル）フェノキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓより入手可能なＬＯＰＲＥＳＳＯＲ（登録商標））；硫酸パマトロール（カルバミン酸，［２−［４−［２−ヒドロキシ−３−［（１−メチルエチル）アミノ］プロポキシル］フェニル］−エチル］−，メチルエステル，（±）硫酸塩（塩）（２：１）、ＣＡＳ ＲＮ ５９９５４−０１−７）；硫酸ペンブトロール（２−プロパノール，１−（２−シクロペンチルフェノキシ）−３−［１，１−ジメチルエチル）アミノ］１，（Ｓ）−，硫酸塩（２：１）（塩）、ＣＡＳ ＲＮ ３８３６３−３２−５）；プラクトロール（アセトアミド，Ｎ−［４−［２−ヒドロキシ−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−プロポキシ］フェニル］−、ＣＡＳ ＲＮ ６６７３−３５−４）；塩酸チプレノロール（プロパノール，１−［（１−メチルエチル）アミノ］−３−［２−（メチルチオ）−フェノキシ］−，塩酸塩，（±）、ＣＡＳ ＲＮ ３９８３２−４３−４）；トラモロール（ベンズアミド，４−［２−［［２−ヒドロキシ−３−（２−メチルフェノキシ）−プロピル］アミノ］エトキシｌ］−、ＣＡＳ ＲＮ ３８１０３−６１−６）を含むが、これらに限定されない。

α受容体阻害薬であるアドレナリン受容体は、内因性カテコールアミンによって誘導される血管収縮をブロックするように働く。生じる末梢抵抗の減少は平均血圧の低下を導く。この作用の大きさは、アンタゴニストが投与される時点での交感神経緊張の程度に依存する。

α受容体阻害薬である適切なアドレナリン受容体は、塩酸フェンスピリド（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，３９９，１９２号に開示されているように製造され得る）；プロロキサン（ＣＡＳ ＲＮ ３３７４３−９６−３）；塩酸アルフゾシン（ＣＡＳ ＲＮ ８１４０３−６８−１）；および前述した塩酸ラベタロールまたはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

本発明と共に使用し得るαおよびβ受容体阻害剤活性を有するアドレナリン遮断薬は、ブレチリウムトシレート（ＣＡＳ ＲＮ ６１−７５−６）；ジヒドロエルゴタミンメシレート（ｄｉｈｙｄｒｏｅｒｇｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（例えば、エルゴタマン−３’，６’，１８−トリオン，９−１０−ジヒドロ−１２’−ヒドロキシ−２’−メチル−５’−（フェニルメチル）−，（５’（α））−，モノメタンスルホン酸塩、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓより入手可能なＤＨＥ４５（登録商標）注射剤）；カルベジロール（例えば、（±）−１−（カルバゾール−４−イルオキシ）−３−［［２−（ｏ−メトキシフェノキシ）エチル］アミノ］−２−プロパノール、例えば、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍより入手可能なＣＯＲＥＧ（登録商標）錠剤）；ラベタロール（例えば、５−［１−ヒドロキシ−２−［（１−メチル−３−フェニルプロピル）アミノ］エチル］サリチルアミド一塩酸塩、例えば、Ｓｃｈｅｒｉｎｇより入手可能なＮＯＲＭＯＤＹＮＥ（登録商標）錠剤）；ブレチリウムトシレート（ベンゼンメタンアミニウム，２−ブロモ−Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル，４−メチルベンゼンスルホン酸との塩（１：１）、ＣＡＳ ＲＮ ６１−７５−６）；フェントラミンメシレート（フェノール，３−［［（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル］（４−メチルフェニル）アミノ］−，モノメタンスルホン酸塩（塩）ＣＡＳ ＲＮ ６５−２８−１）；酒石酸ソリペルチン（５Ｈ−１，３−ジオキソロ［４，５−ｆ］インドール，７−［２−［４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］エチル］−，（２Ｒ，３Ｒ）−２，３−ジヒドロキシブタンジオエート（１：１）、ＣＡＳ ＲＮ ５５９１−４３−５）；塩酸ゾレルチン（ピペラジン，１−フェニル−４−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−，一塩酸塩（８Ｃｌ，９Ｃｌ）、ＣＡＳ ＲＮ ７２４１−９４−３）を含むが、これらに限定されない。

アンギオテンシン系阻害薬は、アンギオテンシンＩＩの機能、合成または異化に干渉する作用物質である。本発明において使用し得るこれらの作用物質は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンギオテンシンＩＩアンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンギオテンシンＩＩの異化を活性化する作用物質、およびそこからアンギオテンシンＩＩが最終的に誘導されるアンギオテンシンＩの合成を妨げる作用物質を含むが、これらに限定されない。レニン−アンギオテンシン系は血行力学および水と電解質のバランスの調節に関与する。血液量、腎プロフュージョン（ｒｅｎａｌ ｐｒｏｆｕｓｉｏｎ）、または血漿中のＮａ^＋の濃度を低下させる因子はこの系を活性化する傾向があり、一方これらのパラメータを上昇させる因子はその機能を抑制する傾向がある。アンギオテンシンＩおよびアンギオテンシンＩＩは、酵素的レニン−アンギオテンシン経路によって合成される。合成プロセスは、レニン酵素が、血漿中の偽性グロブリンであるアンギオテンシノゲンに作用して、デカペプチド（ｃｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ） アンギオテンシンＩを生成するときに開始される。アンギオテンシンＩはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンギオテンシンＩＩに変換される。後者は、様々な哺乳動物種においていくつかの形態の高血圧の原因物質として関係づけられてきた活性昇圧物質である。

アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストは、アンギオテンシンＩＩ受容体に結合し、その活性を妨げることによってアンギオテンシンＩＩの活性に干渉する化合物である。本発明において使用し得るアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストは周知であり、ペプチド化合物および非ペプチド化合物を含む。アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストの非限定的な例としては、カンデサルタンシレキセチル（ｌＨ−ベンズイミダゾール−７−カルボン酸，２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−，１−［［（シクロヘキシルオキシ）カルボニル］オキシ］エチルエステル）、ＣＡＳ ＲＮ １４５０４０−３７−５）；テルミサルタン（［１，１’−ビフェニル］−２−カルボン酸，４’−［（１，４’−ジメチル−２’−プロピル［２，６’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール］−１’−イル）メチル］−、ＣＡＳ ＲＮ １４４７０１−４８−４）；カンデサルタン（ｌＨ−ベンズイミダゾール−７−カルボン酸，２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−、ＣＡＳ ＲＮ １３９４８１−５９−７）；ロサルタンカリウム（１Ｈ−イミダゾール−５−メタノール，２−ブチル−４−クロロ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］−メチル］−，一カリウム塩；イルベサルタン（１，３−ジアザスピロ［４．４］ノン−１−エン−４−オン，２−ブチル−３−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−、ＣＡＳ ＲＮ １３８４０２−１１−６）が挙げられる。

アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩへの変化を触媒する酵素である。本発明において使用し得るＡＣＥ阻害薬は、ＡＣＥの活性を阻害することによってレニン−アンギオテンシン系に干渉し、それにより昇圧物質アンギオテンシンＩＩの形成を低減するまたは排除する、アミノ酸およびその誘導体、ジペプチドおよびトリペプチドを含むペプチドならびにＡＣＥに対する抗体を含む。ＡＣＥ阻害薬は、高血圧、うっ血性心不全、心筋梗塞および腎疾患を治療するために医学的に使用されてきた。適切なＡＣＥ阻害薬としては、塩酸ベナゼプリル（例えば、３−［［１−（エトキシカルボニル）−３−フェニル−（１Ｓ）−プロピル］アミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−（３Ｓ）−ベンザゼピン−１−酢酸一塩酸塩、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓより入手可能なＬＯＴＲＥＬ（登録商標）カプセル）；カプトプリル（例えば、１−［（２Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｌ−プロリン、例えば、Ｍｙｌａｎより入手可能なＣＡＰＴＯＰＲＩＬ錠剤）；フォシノプリル（例えば、Ｌ−プロリン，４−シクロヘキシル−１−［［［２−メチル−１−（１−オキソプロポキシ）プロポキシ］（４−フェニルブチル）ホスフィニル］アセチル］−，ナトリウム塩、トランス−、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂより入手可能なＭＯＮＯＰＲＩＬ（登録商標）錠剤）；塩酸モエキシプリル（例えば、［３Ｓ−［２［Ｒ^＊（Ｒ^＊）］，３Ｒ^＊］］−２−［２−［［１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−６，７−ジメトキシ−３−イソキノリンカルボン酸，一塩酸塩，例えば、Ｓｃｈｗａｒｚより入手可能なＵＮＩＲＥＴＩＣ（登録商標）錠剤）；ペリンドプリルエルブミン（例えば、（２Ｓ，３ａＳ，７ａＳ）−１−［（Ｓ）−Ｎ−［（Ｓ）−１−カルボキシブチル］アラニル］ヘキサヒドロ−２−インドリンカルボン酸，１−エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルアミンとの化合物（１：１）、例えば、Ｓｏｌｖａｙより入手可能なＡＣＥＯＮ（登録商標）錠剤）；キナプリル（例えば、［３Ｓ−［２［Ｒ^＊（Ｒ^＊）］，３Ｒ^＊］］−２−［２−［［１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−イソキノリンカルボン酸，一塩酸塩、例えば、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓより入手可能なＡＣＣＵＲＥＴＩＣ（登録商標）錠剤）；ラミプリル（例えば、２−アザビシクロ［３．３．０］−オクタン−３−カルボン酸誘導体、例えば、Ｍｏｎａｒｃｈより入手可能なＡＬＴＡＣＥ（登録商標）カプセル）；マレイン酸エナラプリル（例えば、（Ｓ）−１−［Ｎ −［１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］−Ｌ−アラニル］−Ｌ−プロリン，（Ｚ）−２−ブタンジオエート塩（１：１）、例えば、Ｍｅｒｃｋより入手可能なＶＡＳＯＴＥＣ（登録商標）錠剤）；リシノプリル（例えば、（Ｓ）−１−［Ｎ２−（１−カルボキシ−３−フェニルプロピル）−Ｌ−リシル］−Ｌ−プロリン二水和物、例えば、Ｍｅｒｃｋより入手可能なＰＲＩＮＺＩＤＥ（登録商標）錠剤）；デラプリル（米国特許第４，３８５，０５１号に開示されているように製造され得る）；およびスピラプリル（米国特許第４．４７０，９７２号に開示されているように製造され得る）；ベナザプリラート（１Ｈ−１−ベンザゼピン−１−酢酸，３−［［（１Ｓ）−１−カルボキシ−３−フェニルプロピル］アミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ、（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８６５４１−７８−８）；塩酸デラプリル（グリシン，Ｎ−［（１Ｓ）−１ −（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］−Ｌ−アラニル−Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル）−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ８３４３５−６７−０）；フォシノプリルナトリウム（Ｌ−プロリン，４−シクロヘキシル−１−［［（Ｒ）−［（１Ｓ）−２−メチル−１−（１−オキソプロポキシ）プロポキシ］（４−フェニルブチル）ホスフィニル］アセチル］−，ナトリウム塩，（４Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８８８８９−１４−９）；リベンザプリル（１Ｈ−１−ベンザゼピン−１−酢酸，３−［［（１Ｓ）−５−アミノ−１−カルボキシペンチル］アミノ］−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−，（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ １０９２１４−５５−３）；ペントプリル（１Ｈ−インドール−１−ペンタン酸，２−カルボキシ−２，３−ジヒドロ−α，γ−ジメチル−δ−オキソ−，α−エチルエステル（αＲ，γＲ，２Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２９２４−０３−６）； ペリンドプリル（１Ｈ−インドール−２−カルボン酸，１−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１ −（エトキシカルボニル）ブチル］アミノ］−１−オキソプロピル］オクタヒドロ−，（２Ｓ，３ａＳ，７ａＳ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２８３４−１６−０）；塩酸キナプリル（３−イソキノリンカルボン酸，２−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−，一塩酸塩，（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２５８６−５５−）；キナプリラート（３−イソキノリンカルボン酸，２−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−カルボキシ−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−，（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２７６８−８５−２）；塩酸スピラプリル（１，４−ジチア−７−アザスピロ［４，４］ノナン−８−カルボン酸，７−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−，一塩酸塩，（８Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ９４８４１−１７−５）；スピラプリラート（１，４−ジチア−７−アザスピロ［４．４］ノナン−８−カルボン酸，７−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−カルボキシ−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−，（８Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８３６０２−０５−５）；テプロチド（ブラジキニン増強剤ＢＰＰ９ａ、ＣＡＳ ＲＮ ３５１１５−６０−７）；リシノプリル（Ｌ−プロリン，Ｎ２−［（１Ｓ）−１−カルボキシ−３−フェニルプロピル］−Ｌ−リシル−、ＣＡＳ ＲＮ ７６５４７−９８−３）；ゾフェノプリル（Ｌ−プロリン，１−［（２Ｓ）−３−（ベンゾイルチオ）−２−メチル−１−オキソプロピル］−４−（フェニルチオ）−，カルシウム塩（２：１），（４Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８１９３８−４３−４）が挙げられるが、これらに限定されない。

「カルシウムチャネル遮断薬」は、高血圧、狭心症および心不整脈などのいくつかの心臓血管障害を含む様々な疾患の管理において重要な治療的価値を有する化学的に多様なクラスの化合物である（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．Ｖ．５２（ｓｕｐｐｌ．１），ｐ．１３−１６（１９８３）；Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；ＭｃＣａｌｌ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒａｃｔ Ｃａｒｄｉｏｌ．ｖ．１０，ｐ．１−１１（１９８５））。カルシウムチャネル遮断薬は、細胞カルシウムチャネルを調節することによって細胞へのカルシウムの流入を防ぐまたは緩やかにする薬剤の不均一な群である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．９６３（１９９５））。本発明において有用なカルシウムチャネル遮断薬としては、アムロジピンのベシレート塩（例えば、３−エチル−５−メチル−２−（２−アミノエトキシメチル）−４−（２−クロロフェニル）−１，４−ジヒドロ−６−メチル−３，５−ピリジンジカルボキシレートベンゼンスルホン酸塩、例えば、Ｐｆｉｚｅｒより入手可能なＮＯＲＶＡＳＣ（登録商標））；マレイン酸クレンチアゼム（１，５−ベンゾチアゼピン−４（５Ｈ）−オン，３−（アセチルオキシ）−８−クロロ−５−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−（４−メトキシフェニル）−（２Ｓ−シス）−，（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）、米国特許第４，５６７，１９５号も参照のこと）；イスラジピン（３，５−ピリジンジカルボン酸，４−（４−ベンゾフラザニル）−１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−，メチル１−メチルエチルエステル，（±）−４（４−ベンゾフラザニル）−１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−３，５−ピリジンジカルボキシレート、米国特許第４，４６６，９７２号も参照のこと）；ニモジピン（例えば、イソプロピル（２−メトキシエチル）１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（３−ニトロフェニル）−３，５−ピリジン−ジカルボキシレート、例えば、Ｂａｙｅｒより入手可能なＮＩＭＯＴＯＰ（登録商標））；フェロジピン（例えば、エチルメチル４−（２，３−ジクロロフェニル）−１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−３，５−ピリジンジカルボキシレート、例えば、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＬＰより入手可能なＰＬＥＮＤＩＬ（登録商標）持続放出錠）；ニルバジピン（３，５−ピリジンジカルボン酸，２−シアノ−１，４−ジヒドロ−６−メチル−４−（３−ニトロフェニル）−，３−メチル５−（１−メチルエチル）エステル、米国特許第３，７９９，９３４号も参照のこと）；ニフェジピン（例えば、３，５−ピリジンジカルボン酸，１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−，ジメチルエステル，例えば、Ｐｆｉｚｅｒより入手可能なＰＲＯＣＡＲＤＩＡ ＸＬ（登録商標）持続放出錠）；塩酸ジルチアゼム（例えば、１，５−ベンゾチアゼピン−４（５Ｈ）−オン，３−（アセチルオキシ）−５［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，３−ジヒドロ−２（４−メトキシフェニル）−，一塩酸塩，（＋）−シス、例えば、Ｆｏｒｅｓｔより入手可能なＴＩＡＺＡＣ（登録商標）カプセル）；塩酸ベラパミル（例えば、ベンゼンアセトニトリル，（α）−［［３−［［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］メチルアミノ］プロピル］−３，４−ジメトキシ−（α）−（１−メチルエチル）塩酸塩，例えば、Ｋｎｏｌｌ Ｌａｂｓより入手可能なＩＳＯＰＴＩＮ（登録商標）ＳＲ錠剤）；塩酸テルジピン（３，５−ピリジンジカルボン酸，２−［（ジメチルアミノ）メチル］−４−［２−［（１Ｅ）−３−（１，１−ジメチルエトキシ）−３−オキソ−１−プロペニル］フェニル］−１，４−ジヒドロ−６−メチル−，ジエチルエステル，一塩酸塩）、ＣＡＳ ＲＮ １０８７００−０３−４）；ベルホスジル（ホスホン酸，［２−（２−フェノキシエチル）−１，３−プロパンジイル］ビス−，テトラブチルエステル、ＣＡＳ ＲＮ １０３４８６−７９−９）；ホステジル（ホスホン酸，［［４−（２−ベンゾチアゾリル）フェニル］メチル］−，ジエチルエステル、ＣＡＳ ＲＮ ７５８８９−６２−２）が挙げられるが、これらに限定されない。

「抗狭心症薬」としての役割も果たす本発明の心臓血管薬は本発明において有用である。狭心症は、心筋酸素アベイラビリティーが心筋酸素需要を満たすのに不十分であるときに起こる症状を含む。これらの薬剤の非限定的な例としては、ラノラジン（塩酸塩１−ピペラジンアセトアミド，Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−４−［２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシフェノキシ）プロピル］−，二塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ９５６３５−５６−６）；塩酸ベタキソロール（２−プロパノール，１−［４−［２（シクロプロピルメトキシ）エチル］フェノキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−，塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ６３６５９−１９−８）；塩酸ブトプロジン（メタノン，［４−［３（ジブチルアミノ）プロポキシ］フェニル］（２−エチル−３−インドリジニル）−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ６２１３４−３４−３）；マレイン酸シネパゼト（１−ピペラジン酢酸，４−［１−オキソ−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−２−プロペニル］−，エチルエステル，（２Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）、ＣＡＳ ＲＮ ５０６７９−０７−７）；トシフェン（ベンゼンスルホンアミド，４−メチル−Ｎ−［［［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］アミノ］カルボニル］−、ＣＡＳ ＲＮ ３２２９５−１８−４）；塩酸ベラパミル（ベンゼンアセトニトリル，α−［３−［［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］メチルアミノ］プロピル］−３，４−ジメトキシ−α−（１−メチルエチル）−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ １５２−１１−４）；モルシドミン（１，２，３−オキサジアゾリウム，５−［（エトキシカルボニル）アミノ］−３−（４−モルホリニル）−，分子内塩、ＣＡＳ ＲＮ ２５７１７−８０−０）；塩酸ラノラジン（１−ピペラジンアセトアミド，Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−４−［２−ヒドロキシ−３−（２−メトキシフェノキシ）プロピル］−，二塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ９５６３５−５６−６）；トシフェン（ベンゼンスルホンアミド，４−メチル−Ｎ−［［［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエチル］アミノ］カルボニル］−、ＣＡＳ ＲＮ
３２２９５−１８−４）が挙げられる。

「冠血管拡張薬」は、心臓への酸素供給を増大することによって狭心症のシステムを軽減するように作用し得る。本発明において有用な冠血管拡張薬としては、塩酸ジルチアゼム（例えば、１，５−ベンゾチアゼピン−４（５Ｈ）−オン，３−（アセチルオキシ）−５［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，−３−ジヒドロ−２（４−メトキシフェニル）−，一塩酸塩，（＋）−シス、例えば、Ｆｏｒｅｓｔより入手可能なＴＩＡＺＡＣ（登録商標）カプセル）；二硝酸イソソルビド（例えば、１，４：３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−グルシトール２，５−ジニトレート、例えば、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔより入手可能なＩＳＯＲＤＩＬ（登録商標）ＴＩＴＲＡＤＯＳＥ（登録商標）錠剤）；一硝酸ソソルビド（例えば、１，４：３，６−ジアンヒドロ−Ｄ−グルシトール，５−ニトレート，有機硝酸塩、例えば、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔより入手可能なＩｓｍｏ（登録商標）錠剤）；ニトログリセリン（例えば、２，３プロパントリオールトリニトレート、例えば、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓより入手可能なＮＩＴＲＯＳＴＡＴ（登録商標）錠剤）；塩酸ベラパミル（例えば、ベンゼンアセトニトリル，（±）−（α）［３−［［２−（３，４ジメトキシフェニル）エチル］メチルアミノ］プロピル］−３，４−ジメトキシ−（α）−（１−メチルエチル）塩酸塩、例えば、Ｓｅａｒｌｅより入手可能なＣＯＶＥＲＡ ＨＳ（登録商標）持続放出錠）；クロモナール（米国特許第３，２８２，９３８号に開示されているように製造され得る）；クロニテート（Ａｎｎａｌｅｎ １８７０ １５５）；ドロプレニラミン（ドイツ特許第２，５２１，１１３号に開示されているように製造され得る）；リドフラジン（米国特許第３，２６７，１０４号に開示されているように製造され得る）；プレニラミン（米国特許第３，１５２，１７３号に開示されているように製造され得る）；硝酸プロパチル（フランス特許第１，１０３，１１３に開示されているように製造され得る）；塩酸ミオフラジン（１−ピペラジンアセトアミド，３−（アミノカルボニル）−４−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチル］−Ｎ−（２，６−ジクロロフェニル）−，二塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ８３８９８−６７−３）；ミキシジン（ベンゼンエタンアミン，３，４−ジメトキシ−Ｎ−（１−メチル−２−ピロリジニリデン）−ピロリジン，２−［（３，４−ジメトキシフェネチル）イミノ］−１−メチル−１−メチル−２−［（３，４−ジメトキシフェネチル）イミノ］ピロリジン、ＣＡＳ ＲＮ ２７７３７−３８−８）；モルシドミン（１，２，３−オキサジアゾリウム，５−［（エトキシカルボニル）アミノ］−３−（４−モルホリニル）−，分子内塩、ＣＡＳ ＲＮ ２５７１７−８０−０）；一硝酸イソソルビド（Ｄ−グルシトール，１，４：３，６−ジアンヒドロ−，５−ニトレート、ＣＡＳ ＲＮ １６０５１−７７−７）；四硝酸エリトリチル（１，２，３，４−ブタンテトロール，四硝酸塩，（２Ｒ，３Ｓ）−レル− 、ＣＡＳ ＲＮ ７２９７−２５−８）；クロニトレート（１，２−プロパンジオール，３−クロロ−，ジニトレート（７Ｃｌ，８Ｃｌ，９Ｃｌ）、ＣＡＳ ＲＮ ２６１２−３３−１）；ジピリダモール（エタノール，２，２’，２’’，２’’’−［（４，８−ジ−１−ピペリジニルピリミド［５，４−ｄ］ピリミジン−２，６−ジイル）ジニトリロ］テトラキス−、ＣＡＳ ＲＮ ５８−３２−２）；ニコランジル（ＣＡＳ ＲＮ ６５１４１−４６−０３）；ピリジンカルボキサミド（Ｎ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−ニソルジピン３，５−ピリジンジカルボン酸，１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−，メチル２−メチルプロピルエステル、ＣＡＳ ＲＮ ６３６７５−７２−９）；ニフェジピン（３，５−ピリジンジカルボン酸，１，４−ジヒドロ−２，６−ジメチル−４−（２−ニトロフェニル）−，ジメチルエステル、ＣＡＳ ＲＮ ２１８２９−２５−４）；マレイン酸ペルヘキシリン（ピペリジン，２−（２，２−ジシクロヘキシルエチル）−，（２Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）、ＣＡＳ ＲＮ ６７２４−５３−４）；塩酸オクスプレノロール（２−プロパノール，１−［（１−メチルエチル）アミノ］−３−［２−（２−プロペニルオキシ）フェノキシ］−，塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ
６４５２−７３−９）；ペントリニトロール（１，３−プロパンジオール，２，２−ビス［（ニトロオキシ）メチル］−，一硝酸塩（エステル）、ＣＡＳ ＲＮ １６０７−１７−６）；ベラパミル（ベンゼンアセトニトリル，α−［３−［［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］メチルアミノ］プロピル］−３，４−ジメトキシ−α−（１−メチルエチル）−、ＣＡＳ ＲＮ ５２−５３−９）が挙げられるが、これらに限定されない。

「利尿薬」という用語は、溶質（主としてＮａＣｌ）と水の排泄を高める化合物である。一般に、利尿薬治療の主要な目的は、血圧を低下させるまたは過剰の間質液（水腫）を身体から除去するために細胞外液量を減少させることである。本発明の範囲内で使用し得る利尿薬の非限定的な例としては、アルチアジド（英国特許第９０２，６５８号に開示されているように製造され得る）；ベンズチアジド（米国特許第３，１０８，０９７号に開示されているように製造され得る）；ブチアジド（英国特許第８６１，３６７号に開示されているように製造され得る）；クロロチアジド（米国特許第２，８０９，１９４号に開示されているように製造され得る）；スピロノラクトン（ＣＡＳ番号５２−０１−７）；およびトリアムテレン（ＣＡＳ番号３９６−０１−０）が挙げられる。

本発明における心臓血管薬として有用な「アドレナリン刺激薬」としては、塩酸グアンファシン（例えば、Ｎ−アミジノ−２−（２，６−ジクロロフェニル）アセトアミド塩酸塩、例えば、Ｒｏｂｉｎｓより入手可能なＴＥＮＥＸ（登録商標）錠剤）；ヒドロクロロチアジド（例えば、６−クロロ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド１，１−ジオキシド）と組み合わせたメチルドパ−ヒドロクロロチアジド（例えば、レボ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−メチルアラニン、例えば、Ｍｅｒｃｋより入手可能なＡＬＤＯＲＩＬ（登録商標）錠剤のような組合せ）；メチルドパ−クロロチアジド（例えば、６−クロロ−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド１，１−ジオキシドと前述したようなメチルドパ、例えば、Ｍｅｒｃｋより入手可能なＡＬＤＯＣＬＯＲｒ（登録商標）錠剤）；塩酸クロニジン（例えば、２−（２，６−ジクロロフェニルアミノ）−２−イミダゾリン塩酸塩とクロルタリドン（例えば、２−クロロ−５−（１−ヒドロキシ−３−オキソ−１−イソインドリニル）ベンゼンスルホンアミド）、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍより入手可能なＣＯＭＢＩＰＲＥＳ（登録商標）錠剤）；塩酸クロニジン（例えば、２−（２，６−ジクロロフェニルアミノ）−２−イミダゾリン塩酸塩、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍより入手可能なＣＡＴＡＰＲＥＳ（登録商標）錠剤）；クロニジン（１Ｈ−イミダゾール−２−アミン，Ｎ−（２，６−ジクロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−、ＣＡＳ ＲＮ ４２０５−９０−７）が挙げられるが、これらに限定されない。

抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合フラグメントならびにＥＧＦ−Ａポリペプチドはまた、腸のコレステロール吸収を阻害する任意のアゼチジノンと共に投与し得る。そのようなアゼチジノンは、エゼチミブ：

を含む。

抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはＥＧＦ−Ａポリペプチドと共に投与し得るさらなる化学療法剤としては、魚油、エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｅｐｅｎａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサン酸、リノール酸、ナイアシン、フェノフィブラートなどのフィブラート、ゲムフィブロジル、ならびにコレスチラミン、コレスチポールおよびコレセベラムなどの胆汁酸吸着剤が挙げられる。

他の化学療法剤としては、アルチアジド（２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド，６−クロロ−３，４−ジヒドロ−３−［（２−プロペニルチオ）メチル］−，１，１−ジオキシド、ＣＡＳ ＲＮ ５５８８−１６−９）；ベンズチアジド（２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド，６−クロロ−３−［［（フェニルメチル）チオ］メチル］−，１，１−ジオキシド、ＣＡＳ ＲＮ ９１−３３−８）；カプトプリル（Ｌ−プロリン，１−［（２Ｓ）−３−メルカプト−２−メチル−１−オキソプロピル］−、ＣＡＳ ＲＮ ６２５７１−８６−２）；カルベジロール（２−プロパノール，１−（９Ｈ−カルバゾール−４−イルオキシ）−３−［［２−（２−メトキシフェノキシ）エチル］アミノ］−、ＣＡＳ ＲＮ ７２９５６−０９−３）；クロロチアジド（２−プロパノールナトリウム，１−（９Ｈ−カルバゾール−４−イルオキシ）−３−［［２−（２−メトキシフェノキシ）エチル］アミノ］−、ＣＡＳ ＲＮ ７２９５６−０９−３）；塩酸クロニジン（１Ｈ−イミダゾール−２−アミン、Ｎ−（２，６−ジクロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ４２０５−９１−８）；シクロチアジド（２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド，３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−イル−６−クロロ−３，４−ジヒドロ−，１，１−ジオキシド、ＣＡＳ ＲＮ ２２５９−９６−３）；塩酸デラプリル（２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド，３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−イル−６−クロロ−３，４−ジヒドロ−，１，１−ジオキシド、ＣＡＳ ＲＮ ２２５９−９６−３）；塩酸ジレバロール（２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−７−スルホンアミド，３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−イル−６−クロロ−３，４−ジヒドロ−，１，１−ジオキシド、ＣＡＳ ＲＮ ２２５９−９６−３）；塩酸デラプリル（グリシン，Ｎ−［（１Ｓ）−１−（エトキシカルボニル）− ３−フェニルプロピル］−Ｌ−アラニル−Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−２−イル）−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ８３４３５−６７−０）；ドキサゾシンメシレート（ピペラジン，１−（４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−キナゾリニル）−４−［（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−イル）カルボニル］−，モノメタンスルホン酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ７７８８３−４３−３）；フォシノプリルナトリウム（Ｌ−プロリン，４−シクロヘキシル−１−［［（Ｒ）−［（１Ｓ）−２−メチル−１−（１−オキソプロポキシ）プロポクス（ｐｒｏｐｏｘ））；塩酸モエキシプリル（３−イソキノリンカルボン酸，２−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−６，７−ジメトキシ−，一塩酸塩，（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２５８６−５２−５）；マレイン酸モナテピル（１−ピペラジンブタンアミド，Ｎ−（６，１１−ジヒドロジベンゾ（ｂ，ｅ）チエピン−１１−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−，（±）−，（Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）（±）−Ｎ−（６，１１−ジヒドロジベンゾ（ｂ，ｅ）チエピン−１１−イル）−４−（ｐ−フルオロフェニル）−１−ピペラジンブチルアミドマレエート（ｐｉｐｅｒａｄｉｎｅｂｕｔｙｒａｍｉｄｅ ｍａｌｅａｔｅ）（１：１）、ＣＡＳ ＲＮ １３２０４６−０６−１）；コハク酸メトプロロール（ブタン二酸，１−［４−（２−メトキシエチル）フェノキシ］−３−［（１−メチルエチル）アミノ］−２−プロパノールとの化合物（１：２）、ＣＡＳ ＲＮ ９８４１８−４７−４）；塩酸グアンファシン（ベンゼンアセトアミド，Ｎ−（アミノイミノメチル）−２，６−ジクロロ−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ２９１１０−４８−３）；メチルドパ（Ｌ−チロシン，３−ヒドロキシ−α−メチル−、ＣＡＳ ＲＮ ５５５−３０−６）；キナプリラート（３−イソキノリンカルボン酸，２−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−カルボキシ−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−，（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２７６８−８５−２）；塩酸キナプリル（３−イソキノリンカルボン酸，２−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−，一塩酸塩，（３Ｓ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８２５８６−５５−８）；プリミドロール（２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン，１−［２−［［２−ヒドロキシ−３−（２−メチルフェノキシ）プロピル］アミノ］エチル］−５−メチル−、ＣＡＳ ＲＮ ６７２２７−５５−８）；塩酸プラゾシン（ピペラジン，１−（４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−キナゾリニル）−４−（２−フラニルカルボニル）−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ １９２３７−８４−４）；塩酸ペランセリン（２，４（１Ｈ，３Ｈ）−キナゾリンジオン，３−［３−（４−フェニル−１−ピペラジニル）プロピル］−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ４２８７７−１８−９）；塩酸フェノキシベンズアミン（ベンゼンメタンアミン，Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−（１−メチル−２−フェノキシエチル）−，塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ６３−９２−３）；カンデサルタンシレキセチル（１Ｈ−ベンズイミダゾール−７−カルボン酸，２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−，１−［［（シクロヘキシルオキシ）カルボニル］オキシ］エチルエステル、ＣＡＳ ＲＮ １４５０４０−３７−５）；テルミサルタン（［１，１’−ビフェニル］−２−カルボン酸，４’−［（１，４’−ジメチル−２’−プロピル［２，６’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール］−１’−イル）メチル］−、ＣＡＳ ＲＮ １４４７０１−４８−４）；カンデサルタン（１Ｈ−ベンズイミダゾール−７−カルボン酸，２−エトキシ−１−［［２’−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−、ＣＡＳ ＲＮ １３９４８１−５９−７）；アムロジピンベシレート（３，５−ジピリジンカルボン酸，２−［（２−アミノエトキシ）メチル］−４−（２−クロロフェニル）−１，４−ジヒドロ−６−メチル−，３−エチル５−メチルエステル，モノベンゼンスルホン酸塩、ＣＡＳ ＲＮ １１１４７０−９９−６）；マレイン酸アムロジピン（３，５−ピリジンジカルボン酸，２−［（２−アミノエトキシ）メチル］−４−（２−クロロフェニル）−１，４−ジヒドロ−６−メチル−，３−エチル５−メチルエステル，（２Ｚ）−２−ブテンジオエート（１：１）、ＣＡＳ ＲＮ ８８１５０−４７−４）；塩酸テラゾシン（ピペラジン，１−（４−アミノ−６，７−ジメトキシ−２−キナゾリニル）−４−［（テトラヒドロ−２−フラニル）カルボニル］−，一塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ６３０７４−０８−８）； 塩酸ベバントロール（２−プロパノール，１−［［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル］アミノ］−３−（３−メチルフェノキシ）−，塩酸塩、ＣＡＳ ＲＮ ４２８６４−７８−８）；ラミプリル（シクロペンタ［ｂ］ピロール−２−カルボン酸，１−［（２Ｓ）−２−［［（１Ｓ）−１−（エトキシカルボニル）−３−フェニルプロピル］アミノ］−１−オキソプロピル］オクタヒドロ−，（２Ｓ，３ａＳ，６ａＳ）−、ＣＡＳ ＲＮ ８７３３３−１９−５）が挙げられる。

スクリーニングアッセイ
本発明は、ＰＣＳＫ９阻害剤もしくはＰＣＳＫ９／ＬＤＬ受容体結合の阻害剤もしくはＰＣＳＫ９／ＥＧＦ−Ａドメイン結合の阻害剤である物質；または総コレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、総コレステロール／高密度リポタンパク質の比率もしくは低密度リポタンパク質／高密度リポタンパク質の比率を低下させる物質；または被験者において高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、血管炎症または黄色腫を治療するまたは予防する物質を同定するための方法であって、ＰＣＳＫ９ポリペプチドまたはその機能的フラグメントおよびＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメイン（例えば、配列番号３）を含むポリペプチドと、前記物質の存在に関して試験する試料を接触させ、試料の非存在下よりも試料の存在下の方がＰＣＳＫ９およびＬＤＬ受容体ＥＧＦ−Ａドメインを含むポリペプチドのより少ない結合が認められる場合に前記物質が同定される方法をさらに提供する。そのようなアッセイにおいて同定されるいかなるそのような物質も本発明の一部を形成する。

本発明の実施形態は、前記ＰＣＳＫ９およびＥＧＦ−Ａポリペプチドを、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ受容体またはそのＥＧＦ−Ａドメインの結合を阻害しないことが公知の物質と接触させ、前記結合の阻害剤の存在下よりも多いＰＣＳＫ９およびＬＤＬ受容体またはそのＥＧＦ−Ａドメインの結合が認められる場合、アッセイは適切に機能していると決定される、陰性対照アッセイをさらに含む。

本発明の１つの実施形態は、前記ＰＣＳＫ９およびＥＧＦ−Ａポリペプチドを、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ受容体またはそのＥＧＦ−Ａドメインの結合を阻害することが公知の物質と接触させ、前記結合の阻害剤の存在下よりも少ないＰＣＳＫ９およびＬＤＬ受容体またはそのＥＧＦ−Ａドメインの結合が認められる場合、アッセイは適切に機能していると決定される、陽性対照アッセイをさらに含む。

物質の結合は、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかを使用して測定できる。

以下の情報は本発明をより明瞭に説明するために提供されるものであり、本発明を限定すると解釈されるべきではない。以下で述べるありとあらゆる組成物および方法が本発明の範囲内に含まれる。

（実施例１）
ＬＤＬ受容体の可溶性ＥＧＦ−Ａドメインまたは抗ＰＣＳＫ９抗体はＬＤＬＲ−ＰＣＳＫ９の相互作用をブロックする。

この実施例では、ヒトＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａドメインをコードする可溶性ペプチドならびに様々な抗ＰＣＳＫ９抗体がＰＣＳＫ９と受容体の間の相互作用をブロックすることが示される。

以下は、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用に対する抗体およびＥＧＦ−Ａ阻害実験のためのアルファスクリーン法と材料である。

Ｃ末端ＦＬＡＧタグを担持する精製ＰＣＳＫ９を、ＰＣＳＫ９を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞から精製した。純度は、銀染色法により、＞９０％と推定された。抗ＰＣＳＫ９触媒ドメイン抗体は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ウサギ抗マウスＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ；カタログ番号１０００８８１１）より購入した。このウサギ抗マウス／ヒトＰＣＳＫ９触媒ドメイン抗体は、以下のアミノ酸配列：ＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲ（配列番号８）を有するエピトープを認識する。ウサギ抗ヒトＰＣＳＫ９ Ｃ末端ドメイン抗体（ＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭＥＡ（配列番号４のアミノ酸４９０〜５０２）に特異的に結合する）およびウサギ抗ヒトＰＣＳＫ９全長タンパク質抗体も使用した。

可溶性ＥＧＦ−Ａドメインペプチドは、標準的な方法を用いて合成によって作製した。緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５）２．５μｌ中の精製Ｃ末端ＦＬＡＧ標識ＰＣＳＫ９ ２．５ｎｇ（２．５ｎｇ／２．５μｌ／ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ−３８４ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）のウエル）を、指示されている濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体またはＥＧＦ−Ａドメインペプチドのいずれか２．５μｌと共に室温で３０分間プレインキュベートした。次に、精製ＨＩＳ標識可溶性ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２１４８−ＬＤ／ＣＦ；配列番号２）２．５ｎｇとビオチニル化抗ＦＬＡＧ抗体（ＢｉｏＭ２モノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；カタログ番号Ｆ９２９１）５ｎｇを含む緩衝液５μｌおよび前記混合物を室温でさらに３０分間インキュベートした。最後に、弱光条件下で、ドナー／アクセプタービーズ混合物（アルファスクリーンヒスチジン検出キット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｒｎ，Ｍａｓｓ．；カタログ番号６７６０６１９Ｃ）５μｌを添加し、２１０３ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用してアルファスクリーンシグナルを検出した。ドナー／アクセプタービーズ混合物は、１つの３８４ウェルプレートについてニッケル−アクセプタービーズ１０μｌおよびＳＡ−ドナービーズ１０μｌを緩衝液２．２ｍｌに添加することによって暗条件下で調製し、室温で少なくとも２時間、暗所にてインキュベートした。

これらの実験で生成されたデータを以下の表１〜３に示す。

これらのデータは、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用がカルシウムの存在下または非存在下で可溶性ＥＧＦ−Ａドメインによって阻害されることを示す。カルシウムの非存在下よりもカルシウムの存在下でわずかに高いレベルの阻害が認められた。カルシウムの存在下では、ＩＣ５０は約３μモルであり、カルシウムの非存在下ではＩＣ５０は約１２μモルであった。

これらのデータは、抗ＰＣＳＫ９触媒ドメイン抗体および抗ＰＣＳＫ９ Ｃ末端ドメイン抗体がＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体の間の相互作用を阻害することを明らかにする。Ｃ末端ドメインに対して惹起した抗ＰＣＳＫ９は、相互作用を阻害するうえで効果がより低かった。非特異的ＩｇＧ対照は相互作用を阻害するうえで無効であり、比較のために示している。この表の数値は３回の反復実験の平均値である。

これらのデータは、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用が、ＰＣＳＫ９触媒ドメインペプチドに結合する抗体および全長ＰＣＳＫ９タンパク質に対して惹起した抗体によって阻害されることを明らかにする。非特異的ＩｇＧ対照は相互作用を阻害するうえで無効であり、比較のために示している。これらの数値は３回の反復実験の平均値である。

（実施例２）
細胞の抗ＰＣＳＫ９抗体処理はＬＤＬ取込みの増強を導く。

可溶性ＰＣＳＫ９との細胞のインキュベーションは、細胞が培地から低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を吸収し、清掃する能力の低下を導く。この実施例は、抗ＰＣＳＫ９抗体によるＰＣＳＫ９の阻害がＰＣＳＫ９のこの作用に拮抗し、ＬＤＬの取込みとクリアランスのレベル上昇を導くことを明らかにする。

取込みアッセイを以下のように実施した：３８４穴のＩ型コラーゲンを被覆したプレートにおいて１０，０００細胞／ウエルのＨｅｐＧ２細胞を接種し、一晩増殖させた。その翌日、ＭＥＭ−１％ＢＳＡ中のｂａｃｕ−ＰＣＳＫ９−ＷＴの段階希釈溶液を作製し、固定濃度の抗マウスｃａｔドメインＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ；カタログ番号１０００８８１１；マウスＰＣＳＫ９抗原ＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲ（配列番号８）に対して惹起され、ヒトＰＣＳＫ９と交差反応する）と、または抗ヒトＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号ＡＦ３８８８）と、１００μｇ／ｍｌの最終濃度で、それぞれ混合した。これらの混合物を４℃で１時間インキュベートし、次に培地をＨｅｐＧ２細胞から吸引して除き、混合物２５μｌ／ウエルを３８４穴プレート中のＨｅｐＧ２細胞に添加し、それぞれ６時間および１８時間インキュベートした。指示されたインキュベーション時間後、混合物をＨｅｐＧ２細胞から取り出し、ＰＢＳで１回洗浄して、次にＤｉｌ−ＬＤＬ（Ｄｉｌ標識は、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩である）をＭＥＭ−１％ＢＳＡ中１０μｇ／ｍｌで細胞に添加し、続いて室温で９０分間インキュベートした。その後Ｄｉｌ−ＬＤＬを除去し、細胞をＰｒｅｆｅｒ固定液（グリオキサール、エタノール、緩衝液；Ａｎａｔｅｃｈ ＬＴＤ．；Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ；カタログ番号４１４）で２０分間固定して、次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光強度リーダーＡｎａｌｙｓｔを使用して細胞へのＤｉｌ−ＬＤＬ取込みを読み取った。これらのアッセイで生成されたデータを以下の表４に示す。

表４は、指示されている量の精製組換えＰＣＳＫ９（対照）で処理した、または触媒ドメインペプチドに対して惹起したポリクローナル抗体（抗ＣＡＴ）で処理した、もしくは全長タンパク質に対して惹起した抗体（抗全長）の存在下でのＰＣＳＫ９で処理したヒトＨｅｐＧ２肝細胞によるｄｉｌ標識ＬＤＬの取込みを示す。細胞によるＬＤＬのＰＣＳＫ９依存性取込みは、混合物中の抗ＰＣＳＫ９抗体の存在に依存する様式で増加した。より大きな数は、ＰＣＳＫ９の存在にもかかわらず、より大きなＬＤＬ取込みとＬＤＬＲの保存を示した。

（実施例３）
抗ＰＣＳＫ９抗体の特徴づけ。

７５Ｂ９、７７Ｄ１０、１１Ｂ５、２２Ｄ１１、１Ｆ１１／１Ｇ１１および２９Ｃ１０の抗ＰＣＳＫ９抗体を特徴づけた。抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体の間の相互作用を有効に阻害し、ならびにＰＣＳＫ９を介したＬＤＬ受容体分解を阻害することが認められた。インビボで、抗体はＰＣＳＫ９を阻害し、それによって存在するＬＤＬ受容体のレベルを上昇させることが認められた。さらに、抗体は、外因性ＰＣＳＫ９を添加したときに認められるインビボでのコレステロール上昇を中和した。

抗ＰＣＳＫ９抗体によるＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲ分解の阻害。

７５Ｂ９、７７Ｄ１０、１１Ｂ５、２２Ｄ１１、１Ｆ１１／１Ｇ１１および２９Ｃ１０抗体を、細胞内ウエスタンアッセイにおいてＨｅｐＧ２細胞でのＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解を阻害するそれらの能力に関して評価した。

細胞内ウエスタン法は、ＰＣＳＫ９を介したＬＤＬＲ分解の抗ＰＣＳＫ９抗体による阻害を定量するために実施した。ＨｅｐＧ２細胞を３８４ウェルのＩ型コラーゲンを被覆したプレートに接種し、抗ＰＣＳＫ９抗体および／またはＰＣＳＫ９（１００ｎＭ）で１８時間処理した。ＬＤＬＲおよびβアクチンの検出を、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ウサギ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）およびＩＲＤｙｅ ６８０ヤギ抗マウス（Ｌｉ−Ｃｏｒ）と共に上記の抗体を使用して、製造者のプロトコール（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）に従って実施した。アッセイをＯｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ）で読み取り、各々のウエル中のＬＤＬＲタンパク質についてのシグナルをβアクチン含量に対して基準化した。これらの実験からのデータを以下の表５に示す。

「＋ＰＣＳＫ９／抗体なし」対照と比較して、試験した抗体はＨｅｐＧ２細胞において様々な効力でＰＣＳＫ９を介したＬＤＬ受容体の分解を阻害した。

アルファスクリーン結合アッセイ
ＰＣＳＫ９−ＦＬＡＧと推定上の結合パートナーとの間の相互作用を直接測定することができる増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）（ＡＬＰＨＡ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、この相互作用への抗ＰＣＳＫ９抗体の作用を測定した。この手法は、「ドナー」ビーズと「アクセプター」ビーズをタンパク質間相互作用によって近接させ、ルミネセンス上昇を生じさせることを必要とした（Ｕｌｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：５４２６−５４３０）。基本アッセイでは、ＰＣＳＫ９へのＬＤＬ受容体結合を以下のように測定した：適切な濃度の組換え受容体５μｌをＰＣＳＫ９−ＦＬＡＧ（１．４μｇ／ｍｌ）２．５μｌと共に３０分間インキュベートした。ビオチニル化抗Ｆｌａｇ−Ｍ２抗体（１．８μｇ／ｍｌ）約２．５μｌを添加し、その混合物を１時間インキュベートした。その後ストレプトアビジンドナービーズとニッケルキレートアクセプタービーズ（１：１混合物）５μｌを添加し、その検定物を一晩インキュベートした。アルファスクリーンシグナル（計数／秒）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＳｍｅｒ）を用いて分析した。すべてのデータポイントを３回ずつ測定した。アッセイは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡを含む緩衝液中２３℃で実施した。阻害アッセイは、アッセイ容量とタンパク質濃度にわずかな調整を加えて同様に測定した。簡単に述べると、１．２５μｇ／ｍｌのＰＣＳＫ９−Ｆｌａｇおよび１．２５μｇ／ｍｌのＨｉｓ標識ＬＤＬ受容体５μｌを適切な濃度の抗体２．５μｌと共に３０分間インキュベートし、その後抗Ｆｌａｇ−ＢｉｏＭ２（１．８μｇ／ｍｌ）２．５μｌを添加して、１時間インキュベートした。これらのアッセイからのデータを以下の表６に示す。

試験した抗体は様々な効力でＰＣＳＫ９／ＬＤＬ受容体相互作用を阻害した（ＩＣ_５０および抗体を添加せずに実施したアッセイと比較した阻害％として表している）。

ＬＤＬＲ分解のインビボ阻害および血漿コレステロールへの抗ＰＣＳＫ９の作用
マウスにおいてＬＤＬ受容体分解を阻害する抗ＰＣＳＫ９抗体（１Ｆ１１／１Ｇ１１）の能力を、コレステロールレベルを調節する抗体の能力と共にこれらのアッセイにおいて評価した。

インビボ手順：
０時点：雄性Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスに抗ヒトＰＣＳＫ９抗体、１Ｆ１１／１Ｇ１１ ４００μｇを腹腔内注射した。

２時間目の時点：次にヒトＰＣＳＫ９タンパク質１０μｇをマウスに静脈内注射した。

４時間目の時点：マウスを犠死させ、血漿および肝臓試料を採取した。

分析：
個々のマウスの血漿リポタンパク質プロフィール（血漿０．１ｍＬ）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムによる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって測定した。ＦＰＬＣ画分のコレステロールレベルを、Ｗａｋｏコレステロール酵素比色法を用いて測定した。

肝ＬＤＬ受容体のタンパク質レベルをウエスタンブロット法によって測定した。各々の肝ホモジネート４０μｇをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、ヤギ抗マウスＬＤＬ受容体抗体と共にインキュベートした（ウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体を等しい負荷についての対照として使用した）。次に膜を対応するＨＲＰ結合抗体と共にインキュベートし、高性能化学発光フィルムで可視化を行った。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ５．２ソフトウエアを使用してバンドの強さを定量した。

ＬＤＬ受容体レベルをＬＤＬ受容体のバンド強度のＧＡＰＤＨのバンド強度に対する比率として任意単位（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔｓ）（ＡＵ）で表した。ＬＤＬ受容体測定の結果を以下の表７および８に示す。２つの別々の分析のデータを提示する。

１Ｆ１１／１Ｇ１１抗体は、試験したマウスにおいてＰＣＳＫ９を介したＬＤＬ受容体分解のレベルを低下させた。

１Ｆ１１／１Ｇ１１抗体は、試験したマウスにおいてＰＣＳＫ９を介したコレステロール上昇のレベルを低下させた。

本発明は、本明細書で述べる特定実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書で述べるものに加えて本発明の様々な改変が前記説明から当業者に明らかになる。そのような改変は付属の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

特許、特許出願、刊行物、製品説明書およびプロトコールが本出願全体を通じて引用され、それらの開示は、すべての目的に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (10)

1. 配列番号５０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列、並びに
   配列番号５４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含む、
   抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメント。
2. （ｉ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮ（配列番号５１）を含むＣＤＲ−Ｈ１、アミノ酸配列ＤＩＮＰＮＮＧＧＡＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５２）を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびアミノ酸配列ＧＩＩＴＥＩＡＥＤＦ（配列番号５３）を含むＣＤＲ−Ｈ３；並びに
   （ｉｉ）アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＶ（配列番号５５）を含むＣＤＲ−Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号５６）を含むＣＤＲ−Ｌ２およびアミノ酸配列ＱＱＹＫＴＹＰＹＴ（配列番号５７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
   単離された、請求項１に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメント。
3. ヒト化された、請求項１または２に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメント。
4. （ｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む、１Ｆ１１／１Ｇ１１の免疫グロブリン重鎖可変領域、および
   （ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む、１Ｆ１１／１Ｇ１１の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、
   抗ＰＣＳＫ９抗体もしくはその抗原結合フラグメント。
5. モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え抗体または抗イディオタイプ抗体である、請求項１、２または４に記載の抗体。
6. ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃｆｖ、ｓｃｆｖ二量体、ｄｓｆｖ、（ｄｓｆｖ） _２ 、ｄｓＦｖ−ｄｓｆｖ’、二重特異性ｄｓダイアボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） _２ 、またはドメイン抗体である、請求項１、２または４に記載の抗原結合フラグメント。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと、さらなる化学療法剤の組み合わせ。
8. 前記さらなる化学療法剤が、心臓血管薬、アドレナリン遮断薬、抗高血圧薬、アンギオテンシン系阻害薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、冠血管拡張薬、利尿薬、アドレナリン刺激薬またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬である、請求項７に記載の組み合わせ。
9. 前記さらなる化学療法剤が、エゼチミブである、請求項７に記載の組み合わせ。
10. さらに、シンバスタチンを含む、請求項９に記載の組み合わせ。

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