JP5683581B2 - 免疫グロブリンＦｃポリペプチド - Google Patents

Description

発明の背景
本願は、２００９年６月３０日に出願した米国出願第６１／２２１，９９９号に対する優先権を主張する。米国出願第６１／２２１，９９９号の開示全体は、権利を放棄することなくその全体が具体的に本明細書中に援用される。

１．発明の分野
本発明は一般的に、タンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細菌の中で発現されたコンビナトリアル抗体Ｆｃライブラリーをスクリーニングするための改良された方法と組成物に関係する。

２．関連技術についての記載
現在、組み換え体である治療用抗体は、１００億ドル／年を優に上回る売り上げがあり、２０．９％の年間成長率が見込まれており、２０１０年には２５０億ドル／年にまで拡大すると予測される。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）には、現在病院にある組み換え体タンパク質の大部分が含まれ、世界中にある企業により資金提供を受けた研究において１５０を超える製品がある（Ｐａｖｌｏｕ ａｎｄ Ｂｅｌｓｅｙ，２００５）。治療の目的に関して、ｍＡｂ市場は、腫瘍学および関節炎、免疫疾患および炎症性疾患について大変に注目を集めており、製品は、これらの治療領域内で、予測期間にわたり重要な増殖ドライバー（ｇｒｏｗｔｈ ｄｒｉｖｅｒ）であり続けるように設計される。１つのグループとして、遺伝子操作されたｍＡｂは、一般的には、低分子薬物よりもＦＤＡによる認可が得られる可能性が高い。少なくとも５０のバイオテクノロジー企業と、あらゆる主要な製薬会社が、環境が整った活性のある抗体発見プログラムを有している。

ｍＡｂの単離および産生のための最初の方法は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）によって１９７５年に最初に報告され、これには、マウスのリンパ球と骨髄細胞を融合させ、それによりマウスハイブリドーマを得る工程が含まれる。治療用のマウスｍＡｂは１９８０年代の初期に臨床試験に入った。しかし、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を患者が産生することが原因で、効率的かつ迅速なクリアランスが行われないという問題が明らかになった。これらの問題、ならびにこの技術に関して時間とコストがかかることが、ｍＡｂ生産技術の進展への推進力となった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、免疫化された動物のリンパ球からのモノクローナル抗体遺伝子の直接のクローニング、および断片抗体のコンビナトリアルライブラリーの細菌の中での発現を容易にした（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）。後に、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が再配置された自然なままの遺伝子を使用したインビトロでのクローニング技術により、ライブラリー全体が作製された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｄｕｎｃａｎ，１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９８）。結果として、所望される特異性を持つ抗体断片の単離は、もはや対応する抗原の免疫原性には依存しない。さらに、合成のコンビナトリアルライブラリーにおける抗原特異性の範囲は、免疫化されたマウスから作製されたハイブリドーマのパネルにおいて見られる抗原特異性の範囲よりも大きかった。これらの利点が、低分子化合物（ハプテン）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２）、分子複合体（Ｃｈａｍｅｓら、２０００）、不安定な化合物（Ｋｊａｅｒら、１９９８）、および細胞表面タンパク質（Ｄｅｓａｉら、１９９８）を含む複数の特有の抗原に対する抗体断片の開発を容易にした。

微生物の細胞の中では、フローサイトメトリーによるディスプレイスクリーニングを行うことができる。具体的には、Ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＡＰＥｘ）は、Ｅ．ｃｏｌｉの内膜のペリプラズム側の表面上に抗体断片を固定すること、その後の、外膜の崩壊、蛍光標識された標的とのインキュベーション、およびスフェロプラストの選別に基づく（米国特許第７，０９４，５７１号）。ＡＰＥｘは、抗体断片の親和性成熟に使用された（Ｈａｒｖｅｙら、２００４；Ｈａｒｖｅｙら、２００６）。１つの研究では、わずか２回のスクリーニングの後に、２００倍を上回る親和性の改善が得られた。

抗体治療薬の効力の根底にある１つの重要な機構は、標的抗原（または細胞）に対して免疫細胞を動員する抗体の能力である。したがって、抗体のＦｃ領域が、免疫学的細胞の動員および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に重要である。具体的には、抗体により誘発されるＡＤＣＣ応答の性質は、Ｆｃ領域と多くの細胞のタイプの表面上にある受容体（ＦｃＲ）との相互作用に依存する。ヒトは、５つの異なるクラスのＦｃ受容体を含む。加えて、特定のクラスに属している様々なＦｃＲのハプロタイプまたは遺伝的バリアントが知られている。ＦｃＲに対する抗体の結合が、他の免疫学的細胞を動員するその能力と動員される細胞のタイプを決定する。したがって、特定の種類の細胞だけを動員することができるように抗体を操作する能力が治療に極めて重要であり得る。

しかし、本発明者が知る限りは、Ｆｃドメインを操作するこれまでの試みは、哺乳動物により発現されたＩｇＧ分子を使用して行われてきた。哺乳動物の抗体はグリコシル化される。炭水化物鎖がＦｃ領域に結合させられ、タンパク質の立体構造を変化させて、その抗体がＦｃＲに結合できるようにする。対照的に、細菌の中で産生されたグリコシル化されていない抗体はＦｃＲに結合することができず、したがって、ＡＤＣＣを誘発することができない。ＡＤＣＣを誘発することができるようにグリコシル化されていない抗体を操作し、それにより、細菌による発現により得られる低い生産コストの利益を得ることが所望される。

第２に、そして最も重要であるのは、操作されたＦｃ領域を持つ哺乳動物の抗体が、目的の特定のＦｃＲに対する結合の増大を示し、加えて、これらはなおも通常の親和性で他のＦｃＲに結合できることである。したがって、そのような抗体は、免疫系により自然に産生された分子よりも選択性が高いにも関わらず、それでもなおこれらは、望ましくない免疫学的応答を媒介する可能性がある。

それにも関らず、今日利用できる全てのハイスループット抗体スクリーニング技術は、抗体断片の微生物による発現に頼る。ライブラリーの構築およびスクリーニングにおけるインタクトなＩｇＧまたは全長のＩｇＧではなく抗体断片の使用は、はるかに大きなＩｇＧの微生物の中での発現に関連する限界により決定されている。ＩｇＧライブラリーは、これまでは、細菌または酵母のような微生物を使用して発現またはスクリーニングされることはなかった。結果として、抗原結合タンパク質の単離は、もっぱら、より小さく、生産がはるかに容易である抗体断片を使用して行われている。一旦単離されれば、そのような抗体断片は、全長の免疫グロブリンを発現するベクターに融合させられ、これがその後、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の中で優先的に発現させられる。

Ｅ．ｃｏｌｉは、ジスルフィド結合を持つタンパク質の折り畳みには適さない還元性の細胞質を持つ。これは、折り畳まれていない状態または不正確に折り畳まれた状態で蓄積する（Ｂａｎｅｙｘ ａｎｄ Ｍｕｊａｃｉｃ，２００４）。細胞質とは対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムは酸化された状態で維持され、これがタンパク質のジスルフィド結合の形成を可能にする。特に、ペリプラズムでの発現は、抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ，１９９９）の発現のための使用に成功している。これらの断片は、抗原結合活性を保持したまま、大量に、比較的迅速に作製することができる。しかし、抗体断片はＦｃドメインを欠くので、これらはＦｃＲｎ受容体には結合せず、迅速に除去される。したがって、これらが治療用タンパク質として適していることはわずかしかない（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９５）。最近までは、全長の抗体は不溶性凝集物としてＥ．ｃｏｌｉの中で発現させ、その後、インビトロで再度折り畳むことしかできなかった（Ｂｏｓｓら、１９８４；Ｃａｂｉｌｌｙら、１９８４）。現在の技術を用いても、何百万または何千万もの抗体を個々に折り畳むことができないので、このアプローチは明らかに、抗体ライブラリーのハイスループットスクリーニングには適さない。さらなる問題は、Ｅ．ｃｏｌｉにより発現された抗体はグリコシル化されないので、これらは、補体因子１ｑ（Ｃ１ｑ）またはＦｃ、および多くの他のＦｃ受容体に結合することができないことである。しかし、グリコシル化されていないＦｃドメインは、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に効率よく結合することができる。結果として、細菌により発現されたグリコシル化されていない抗体は、ヒト細胞の中で産生された完全にグリコシル化されたＩｇＧのものと類似する血清持続および薬物動態を示す。それにも関らず、グリコシル化されていない抗体は補体活性を誘発することができず、マクロファージのような免疫細胞の動員も媒介できないので、これまでのところは多くの治療的用途については有効ではない。

さらに、いくつかの研究は、ＦｃドメインによるいくつかのＦｃ受容体の結合が活性化効果を有している可能性があり、阻害効果を有しているものもあることを報告した（Ｂｏｒｕｃｈｏｖら、２００５；Ｋａｌｅｒｇｉｓら、２００２）。様々なＦｃγＲエフェクター機能として、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、サイトカインの放出、食作用、および成熟が挙げられる。選択的エフェクター機能を有するように操作されたＦｃドメインは、生理学的利点をもたらす可能性がある。

発明の要旨
本開示は、Ｆｃ受容体に結合するグリコシル化されていない抗体Ｆｃドメインを含む化合物および方法を提供する。

いくつかの実施形態においては、抗体に由来するグリコシル化されていないＦｃドメイン（「抗体Ｆｃドメイン」）を有するポリペプチドを含む組成物が存在する。さらなる実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインは野生型Ｆｃドメインのバリアントであり、その結果、そのようなバリエーションが、Ｆｃドメインが１つ以上のＦｃ受容体に特異的に結合することを可能にする。いくつかの実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインバリアントを持つポリペプチドは、野生型Ｆｃドメインのグリコシル化されたバージョン（「グリコシル化された野生型Ｆｃドメイン」）を持つポリペプチドが結合できるＦｃ受容体のサブセットだけに結合することができる。特異的な実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインバリアントを持つポリペプチドはＦｃγＲＩに特異的に結合することができる。いくつかの場合には、これは、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有しているポリペプチドの２倍以内の親和性または結合能力を有する。他の実施形態においては、さらに、またはあるいは、グリコシル化されていないＦｃドメインバリアントを持つポリペプチドは、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有しているポリペプチドと比較して、有意に低下した親和性または結合能力（５０倍以上の低下）を有する。特定の実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインバリアントを持つポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩｂに結合することについて有意に低下した親和性または能力を有する。ポリペプチドが、（いずれも、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有しているポリペプチドと比較して）匹敵する（２倍以内）のＦｃγＲＩに対する親和性または結合能力を有し得ること、ならびに、ＦｃγＲＩＩＢに対する有意に低下した親和性または結合能力を有し得ることが想定される。

本明細書中で使用される場合は、用語「親和性」は、２つの物質の可逆的結合についての平衡定数をいい、これはＫｄとして表わされる。結合ドメインのその標的に対する親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）〜約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭ〜約１フェムトモル（ｆＭ）であり得る。あるいはこれは、１００ｎＭ〜１ｎＭの間、または０．１ｎＭ〜１０ｎＭの間であり得る。さらに、２つの物質間の親和性が上記で議論した親和性範囲内にある場合は、上記物質は特異的に結合すると想定される。

抗体Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ抗体のＦｃドメイン、あるいはそれらのバリアントであり得る。特定の実施形態においては、上記ドメインはＩｇＧ抗体のＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体のＦｃドメインである。さらに、上記抗体Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインと定義され得る。この場合、ヒトＦｃドメインは１つ以上のヒトＦｃ受容体に特異的に結合する。特定の態様においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（例えば、抗ＨＥＲ２抗体のＦｃドメイン、より具体的には、トラツズマブのＦｃドメイン）であり得る。いくつかの実施形態においては、ポリペプチド全体がグリコシル化されていないか、または他の実施形態においては、ポリペプチドの一部（例えば、Ｆｃドメイン）だけがグリコシル化されないことが想定される。ポリペプチドに、Ｆｃドメインに加えて抗体に由来する１つ以上の領域が含まれる場合があることもまた想定される。ポリペプチドには、抗体由来の抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｅ）が含まれ得る。さらに、複数のポリペプチドが抗体または抗体様タンパク質を形成し得る。

いくつかの実施形態においては、ヒトＦｃＲポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていない抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチドが存在する。ここでは、上記Ｆｃドメインに、特定のアミノ酸置換が含まれる。いくつかの実施形態においては、複数のアミノ酸置換が存在する。さらなる実施形態においては、野生型Ｆｃドメイン配列と比較して８個までのアミノ酸置換が存在する。ヒトＦｃドメインの中に置換を持つ実施形態には、３８２位および４２８位のアミノ酸でのアミノ酸置換、ならびに以下のアミノ酸：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３８位、３４０位、３４１位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位のうちのいずれかの少なくとも１つのさらなる置換を有しているヒトＦｃドメインを持つポリペプチドが含まれる。いくつかの場合には、ヒトＦｃドメインの３２９位のアミノ酸が野生型配列、すなわち、プロリンであることが具体的に想定される。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、グルタミン酸（Ｅ）の代わりにバリン（Ｖ）である３８２位のアミノ酸でのヒトＦｃドメイン置換（Ｅ３８２Ｖ）を有する。アミノ酸についての従来の一文字の省略形を本明細書中で使用する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、イソロイシンである４２８位のアミノ酸に、ヒトＦｃドメイン置換（Ｍ４２８Ｉ）を有する。いくつかの場合には、ポリペプチドは、３８２位のアミノ酸でのバリンによる置換（Ｅ３８２Ｖ）と４２８位のアミノ酸でのイソロイシンによる置換（Ｍ４２８Ｉ）の両方をヒトＦｃドメインの中に有する。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、３２８位のアミノ酸でのトリプトファンによる置換（Ｌ３２８Ｗ）をヒトＦｃドメインの中に有する。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、３３２位のアミノ酸でのチロシンでのヒトＦｃドメイン置換（Ｉ３３２Ｙ）を有する。他のポリペプチドとしては、少なくとも３２８位および３３２位のアミノ酸にヒトＦｃドメイン置換を有しているポリペプチドが挙げられる。３２８位のアミノ酸の置換はトリプトファン（Ｌ３２８Ｗ）であり得、３３２位のアミノ酸での置換はチロシン（Ｉ３３２Ｙ）であり得る。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、３４１位のアミノ酸にヒトＦｃドメイン置換を有し、さらなる実施形態においては、これはバリン（Ｇ３４１Ｖ）である。さらなる実施形態には、３８２位と４２８位にヒトＦｃドメイン置換を持ち、以下の群のうちの少なくとも１つのさらなるドメイン置換を持つポリペプチドが含まれる：Ｈ２２４Ｒ／Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｋ２５１Ｆ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｖ２７９Ｍ、Ｎ２８６Ｄ、Ｑ２９５Ｒ、Ｎ２９７Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３１５Ｄ、Ｎ３２５Ｓ、Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｖ／Ｅ／Ｉ、Ｐ３３１Ａ／Ｓ／Ｅ、Ｉ３３２Ｙ、Ｋ３３８Ｉ／Ｒ、Ｋ３４０Ｎ／Ｑ、Ｇ３４１Ｖ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ａ３７８Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、Ｓ４２６Ｉ、またはＮ４３４Ｓ／Ｄ。いくつかの実施形態においては、複数のさらなる置換が想定される。

いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、３８２位と４２８位のアミノ酸に置換を持つグリコシル化されていないヒトＦｃドメインを有し、上方ＣＨ２領域に少なくとも１つのさらなる置換をもまた有する。いくつかの実施形態には、上方ＣＨ２領域の以下の部分のアミノ酸に少なくとも１つのさらなるヒトＦｃドメイン置換を有しているポリペプチドが含まれる：２３４Ｌ〜２３９Ｓ；２６４Ｖ〜２６８Ｈ；２９７Ｎ〜２９９Ｔ；または３２８Ｌ〜３３２Ｉ。

さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、ヒトＦｃドメインの中にＧ３４１Ｖおよび／またはＫ３３８Ｒのさらなる置換を有さない。しかし、他の場合には、Ｆｃドメインは、Ｇ３４１Ｖの置換と、以下からなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有し得る：Ｈ２２４Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２８６Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３２５Ｓ、Ｋ３３８Ｒ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ／Ｓ。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは上記群から選択される複数の他の置換を有する。ポリペプチドは、Ｋ３３８Ｒ置換を含むＦｃドメイン置換を有する場合がある。

いくつかの実施形態においては、以下からなる群より選択される置換の１つのセットを有するヒトＦｃドメインを持つポリペプチドが存在する：ａ）Ｋ３３８ＲとＧ３４１Ｖ；ｂ）Ｎ２９７Ｄ、Ｎ３１５Ｄ、およびＫ３４０Ｎ、ｃ）Ｋ３４０Ｎ、ｄ）Ｋ３３８ＩとＫ３４０Ｎ、ｅ）Ｋ３４０ＱとＡ３７８Ｄ；ｆ）Ｎ３２５ＳとＫ３４０Ｎ、ｇ）Ｈ２２４Ｙ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ３２５Ｓ、およびＧ３４１Ｖ、ｈ）Ｇ３４１ＶとＫ３９２Ｅ、ｉ）Ｋ３３８Ｒ、Ｇ３４１Ｖ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ、ｊ）Ｆ２４１ＬとＧ３４１Ｖ、ｋ）Ｇ３４１Ｖ、１）Ｎ２７６ＤとＧ３４１Ｖ、ｍ）Ｇ３４１ＶとＶ３６９Ａ、ｎ）Ｎ２８６Ｄ、Ｇ３４１Ｖ、およびＮ４３４Ｓ、ｏ）Ｎ３２５ＳとＧ３４１Ｖ、ｐ）Ｙ３００ＣとＧ３４１Ｖ、ｑ）Ｇ３４１ＶとＶ３４８Ｍ、ｒ）Ｅ３８２ＶとＭ４２８Ｉ、ｓ）Ｖ２６６Ｍ；ｔ）Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ａ、およびＱ２９５Ｒ、ｕ）Ａ３３０Ｅ、Ｐ３３１Ｅ、およびＶ２７９Ｍ、ｖ）Ａ３３０ＥとＰ３３１Ｅ、ｗ）Ａ３３０Ｅ、Ｐ３３１Ｖ、およびＳ４２６Ｔ、ｘ）Ａ３３０ＥとＰ３３１Ｖ、ｙ）Ａ３３０ＩとＰ３３１Ｅ、ｚ）Ａ３３０Ｅ、ａａ）Ｐ３３１Ｓ、ならびにｂｂ）Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２２４Ｒ、およびＬ２５１Ｆ。いくつかの実施形態においては、さらなるポリペプチドが存在し、これにヒト以外に由来するＦｃドメインが含まれる場合があることが想定される。この場合、列挙する置換は対応するアミノ酸において実施され得る。

１つ以上の特定のヒトＦｃＲポリペプチドに特異的に結合することができるグリコシル化されていないＦｃドメインを有しているポリペプチドが、複数の実施形態に含まれる。いくつかの実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインは、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃαＲＩのうちの１つ以上に結合できるように変異させられている。これらの特定のヒトＦｃＲポリペプチドの１つ以上に対する結合が、グリコシル化されたＦｃ領域を持つ場合に見られる結合の１０％以内、２０％以内、３０％以内、４０％以内、５０％以内、６０％以内、７０％以内、８０％以内、９０％以内、または１００％以内（または、これらの中で導くことができる任意の範囲）であること、あるいは、結合が、野生型のグリコシル化されたＦｃドメインと比較して少なくともまたは多くても５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（または、これらの中で導くことができる任意の範囲）変化する（増加するまたは減少する）ことが想定される。あるいは、変異したグリコシル化されていないＦｃドメインを有しているポリペプチドとグリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有しているポリペプチドとの間での相対的な結合能力は、Ｘ倍の差（増加または減少）として表わすことができる。例えば、少なくとも、または多くとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍の差、あるいはこれらから導くことができる任意の範囲であり得る。

いくつかの実施形態においては、変異したグリコシル化されていないＦｃドメインを持つポリペプチドは、ＦｃγＲＩポリペプチドに特異的に結合することができる。いくつかの場合には、これは、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有しているポリペプチドによる結合レベルの２倍以内のレベルで結合する。他の実施形態においては、結合レベルは、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍以内である。例えば、特定のＦｃ受容体と、グリコシル化されていないＦｃドメインバリアントを持つポリペプチドまたはグリコシル化された野生型Ｆｃドメインを持つポリペプチドのいずれかについてのＫ_Ｄ値は、本明細書中に記載される実施形態においては、少なくとも２倍または３倍以内である。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、グリコシル化されていない野生型抗体Ｆｃドメインを持つポリペプチドと比較して、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合において少なくとも２倍の減少を有する。さらなる実施形態においては、
いくつかの実施形態においては、本明細書中に記載されるポリペプチドにはリンカーが含まれ得る。さらなる実施形態においては、上記リンカーは結合可能なリンカーである。いくつかの実施形態においては、上記ポリペプチドに、抗体に由来するＦｃドメインが含まれる。これには、抗体に由来する他の領域（例えば、別の結合ドメイン）が含まれる場合がある。特定の実施形態においては、このさらなる結合ドメインはＦｃＲ結合ドメインではない。いくつかの実施形態においては、これに、抗体に由来する抗原結合部位またはドメインが含まれ得る。これには、抗体に由来する可変領域全体またはその一部が含まれるであろう。他の実施形態においては、ポリペプチドには、抗体に由来するＦｃドメインが含まれるが、別の結合ドメインは非ＦｃＲ結合ドメインである。いくつかの実施形態においては、非Ｆｃ結合領域は抗体の抗原結合部位ではないが、細胞表面タンパク質に特異的に結合する。いくつかの場合には、非Ｆｃ結合領域が認識する細胞表面タンパク質は受容体である。いくつかの実施形態においては、細胞表面受容体はチロシンキナーゼである。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは複数のチロシンキナーゼ受容体に結合できる非Ｆｃ結合領域を有する。いくつかの実施形態においては、そのような非Ｆｃ結合領域は、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦＲ受容体、ＥｒｂＢ−２受容体、ＥＧＦ受容体、ＨＧＦ受容体、および他のＳｒｃ様チロシンキナーゼ受容体、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上に結合することができる。ポリペプチドが、これらの受容体チロシンキナーゼの１つ以上を認識する抗原結合領域を有することもまた具体的に想定される。

他のポリペプチドとしては、ＦｃＲγＩポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていないＦｃドメインと第２の結合ドメインを有しているポリペプチドが挙げられる。ここでは、第２の結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態においては、第２の結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン（「抗体抗原結合ドメイン」）である。いくつかの場合には、第２の結合ドメインは抗体抗原結合ドメインではない。いくつかの実施形態においては、第２の結合ドメインは、タンパク質様分子である細胞表面分子に特異的に結合することができる。第２の結合ドメインは細胞表面受容体のリガンドである場合があり、またこれは、細胞表面リガンドの受容体である場合もある。

複数の実施形態は、本明細書中に開示されるポリペプチドのいずれかをコードする核酸にも関係する。この核酸は単離することができる場合があり、および／または組み換え体である場合もある。これは、単離されたおよび／または組み換え体である核酸セグメントであり得る。いくつかの実施形態においては、核酸はＤＮＡであり、他の実施形態においては、核酸はＲＮＡである。特定の実施形態においては、核酸はＤＮＡセグメントである。他の実施形態においては、核酸は、ヒトＦｃＲポリペプチドに特異的に結合する、１つ以上の置換を持つＦｃ結合ドメインを有しているポリペプチドのうちのいずれかを発現することができる発現ベクターである。核酸は、ポリペプチドが生産される方法に応じてグリコシル化される場合も、またグリコシル化されない場合もある、１つ以上の上記で議論されたポリペプチドをコードし得る。

いくつかの実施形態においては、ヒトＦｃＲポリペプチドに特異的に結合することができるＦｃドメインを持つポリペプチドをコードする核酸が存在する。上記核酸は、ポリペプチド（特に、ポリペプチドのグリコシル化されていないバージョン）を発現することができる宿主細胞中に配置され得る。宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。あるいは、宿主細胞は真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）であり得る。いくつかの実施形態においては、宿主細胞に第１の発現ベクターが含まれ、それにもかかわらずさらに、これには、第２の発現ベクターも含まれる場合がある。いくつかの抗体は複数のポリペプチドからなるので、いくつかの実施形態においては、これらのポリペプチドを発現する宿主細胞が想定される。例えば、いくつかの実施形態においては、免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードする第２の発現ベクターを含む宿主細胞が存在する。

いくつかの実施形態においては、宿主細胞の集団が存在する。この場合、上記集団には、異なるＦｃドメインを有しているポリペプチドを発現する複数の宿主細胞が含まれる。任意の２つの異なるＦｃドメインのアミノ酸配列は、同一性において２０％未満、１５％、１０％、５％、またはそれ未満異なることが想定される。

いくつかの実施形態においては、本明細書中で記載されるポリペプチド（グリコシル化されていないＦｃ領域を有しているポリペプチド）を作製する方法、およびこれらのポリペプチドを使用する方法が存在する。これらの方法のうちのいずれかが、本明細書中に記載される任意のポリペプチドに関して実施され得る。

いくつかの実施形態においては、以下の工程を含む、グリコシル化されていないポリペプチドを調製するための方法が存在する：ａ）ＦｃＲポリペプチドに結合することができるＦｃドメインを含むグリコシル化されていない抗体を発現することができる宿主細胞を得る工程（ここでは、Ｆｃドメインには、３８２位と４２８位のアミノ酸での置換と、以下のアミノ酸：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３８位、３４０位、３４１位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位のうちのいずれかの少なくとも１つのさらなる置換が含まれる）；ｂ）上記宿主細胞を、グリコシル化されていない抗体の発現を促進する条件下にて培養物中でインキュベーションする工程；ならびに、ｃ）上記宿主細胞から発現された抗体を精製する工程。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）である。他の実施形態においては、宿主細胞は真核生物細胞であり、ポリペプチドにはＮ２９７Ｄ置換が含まれる。さらなる実施形態においては、複数の方法に、上清から発現された抗体を回収する工程が含まれ、これは、精製の前に行われる場合がある。

いくつかの実施形態においては、複数の方法に、上清から抗体を精製する工程が含まれる。これには、上清に由来する抗体について、濾過、ＨＰＬＣ、陰イオン交換または陽イオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを行うことが含まれ得る。いくつかの実施形態においては、複数の方法に、ＩｇＧ Ｆｃ領域に結合するブドウ球菌プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。他の精製方法は当業者に周知である。

他の実施形態には、被験体において免疫応答を誘導するための方法が含まれる。ＦｃＲポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていないＦｃドメインを有しているポリペプチドがそのような方法において実施され得る。特定の実施形態においては、グリコシル化されていない、ＦｃγＲＩポリペプチドに結合することができるＦｃドメインを有する抗体が使用されるか、または被験体に投与される。あるいは、複数の方法に、そのような抗体で被験体を処置する工程が含まれ得る。本明細書中に記載されるポリペプチドのいずれかが使用され得る。特定の実施形態には、３８２位と４２８位のアミノ酸でのアミノ酸置換と、以下のアミノ酸：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３８位、３４０位、３４１位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位のうちのいずれかの少なくとも１つのさらなる置換を含む、グリコシル化されていないヒトＦｃドメインを有しているポリペプチドが含まれる。

いくつかの実施形態においては、グリコシル化されていないポリペプチドまたは抗体は、活性化ＦｃＲポリペプチドに特異的に結合することができる。活性化ＦｃＲポリペプチドは、１つ以上の免疫細胞を活性化するＦｃＲポリペプチドをいう。活性化ポリペプチドには、ＦｃγＲＩ、ＩＩａ、ＩＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｃが含まれる。ＦｃγＲＩＩｂは阻害性ＦｃＲポリペプチドである。さらなる実施形態においては、グリコシル化されていないポリペプチドまたは抗体は、もはや、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインに匹敵するレベルでは阻害性ＦｃＲポリペプチドには結合しない。特異的な実施形態においては、グリコシル化されていないポリペプチドまたは抗体は、ＦｃγＲＩポリペプチドに特異的に結合する。さらなる実施形態においては、グリコシル化されていないポリペプチドまたは抗体はＦｃγＲＩＩｂポリペプチドに結合する能力が低下しており、この場合、その親和性は、ポリペプチドまたは抗体のグリコシル化された野生型バージョンよりも少なくとも５０倍小さい。特定の実施形態においては、グリコシル化されていない抗体は治療用抗体のグリコシル化されていないバージョンであり、これは、疾患または症状の治療あるいは処置に使用される抗体をいう。上記で議論されたものを含む本明細書中で議論される抗体またはポリペプチドのいずれかが、免疫応答を誘導するための方法の実施において使用され得る。治療用抗体の一例はトラスツズマブである。

いくつかの実施形態においては、以下の工程を含む、標的化された細胞表面ポリペプチドを発現する標的細胞に対する樹状細胞（ＤＣ）媒介性の細胞殺傷を誘導する方法が存在する：ａ）標的細胞を、ｉ）少なくとも１つの樹状細胞活性化ＦｃＲに特異的に結合することができる変異させられたグリコシル化されていないＦｃドメインと、ｉｉ）標的化された細胞表面ポリペプチドに結合する第２の結合ドメインを含むポリペプチドと接触させる工程；およびｂ）標的細胞の殺傷を促進する条件下で標的細胞を樹状細胞に曝す工程。いくつかの実施形態においては、活性化ＦｃＲはＦｃγＲＩポリペプチドである。さらなる実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインを持つポリペプチドは、グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを有しているポリペプチドと比較して低いレベルで、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに対して特異的に結合する。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、以下のアミノ酸に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃドメインを有する：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３４０位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位。さらなるポリペプチドは、上記、および本出願を通じて議論される。いくつかの実施形態においては、標的細胞は癌細胞である。結果として、抗体療法においてグリコシル化された野生型Ｆｃドメインの代わりにグリコシル化されていない変異させたＦｃドメインを使用して癌を処置する方法が想定される。グリコシル化された野生型Ｆｃドメインを使用する、他の疾患または症状の抗体を含む処置を、本明細書中に記載されるグリコシル化されていないＦｃバリアントポリペプチドを用いる場合にも同様に実施することができる。

他の実施形態は、以下の工程を含む１つ以上の特異的ＦｃＲポリペプチドに結合するＦｃドメインを有しているグリコシル化されていないポリペプチドをスクリーニングするための方法に関係する：ａ）グラム陰性細菌細胞の集団を得る工程であって、この集団の細胞が、それらのペリプラズムの中でＦｃドメインを含むグリコシル化されていないポリペプチドを発現する工程（ここでは、上記集団は複数の異なるＦｃドメインを発現する）；ｂ）上記細菌細胞を第１のＦｃＲポリペプチドと、ＦｃＲポリペプチドとグリコシル化されていないＦｃドメインとの間での接触を可能にする条件下で接触させる工程（ここでは、上記ＦｃＲポリペプチドは、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃαＲＩである）；およびｃ）グリコシル化されていないＦｃドメインの第１のＦｃＲポリペプチドに対する結合に基づいて少なくとも１つの細菌細胞を選択する工程。複数の方法にはさらに、選択された細菌細胞からグリコシル化されていないポリペプチドを同定または単離する工程が含まれ得る。また、複数の方法には、選択された細菌細胞の中のグリコシル化されていないポリペプチドが他のＦｃＲポリペプチドに結合できるかどうかを決定する工程が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、選択された細菌細胞の中のグリコシル化されていないポリペプチドが他のＦｃＲポリペプチドに結合できるかどうかを決定する工程には、グリコシル化されていないポリペプチドもまた第２のＦｃＲポリペプチドに結合するかどうかを決定するために、第２のＦｃＲポリペプチドを用いて工程ａ）〜ｃ）を繰り返し行う工程が含まれる。工程ａ）〜ｃ）を、３つ以上の異なるＦｃＲポリペプチドを用いて繰り返すことができることが想定される。いくつかの実施形態においては、グリコシル化されていないポリペプチドは複数のＦｃＲポリペプチドに結合する。

いくつかの実施形態においては、複数の方法に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である細菌細胞が含まれる。さらなる実施形態においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ Ｆｃドメインである。さらなる実施形態においては、グラム陰性細菌細胞の集団に、複数のグリコシル化されていないＦｃドメインをコードする複数の核酸が含まれる。いくつかの場合には、複数の核酸はさらに、複数のグリコシル化されていないＦｃドメインに融合させられた膜分泌シグナルをコードする。膜分泌シグナルはＰｅｌＢまたはＤｓｂＡであり得る。さらに、グリコシル化されていないＦｃドメインには、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれ得る。特定の実施形態においては、グリコシル化されていないポリペプチドに、真核生物のＦｃＲドメインが含まれる。いくつかの実施形態においては、表１のポリペプチドのうちの１つに特異的に結合するＦｃドメインを持つポリペプチドが存在する。特定の実施形態においては、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩ、またはＣ１ｑに結合する。他の実施形態においては、これは、Ｆｃドメインのグリコシル化された野生型バージョンと比較して、ＦｃγＲＩＩｂに対して低い結合親和性を有する。特異的な方法が、引用により本明細書中に組み入れられるＷＯ２００８／１３７４７５に開示されている。

他の実施形態には、以下の工程を含む、Ｆｃドメインを有しているグリコシル化されていないポリペプチドの１つ以上の特異的ＦｃＲポリペプチドに対するＦｃの結合を最適化するための方法が含まれる：ａ）グラム陰性細菌細胞の集団を得る工程であって、この集団の細胞が、それらのペリプラズムの中でＦｃドメインを含むグリコシル化されていないポリペプチドを発現する工程（ここでは、上記集団は、様々な変異したＦｃドメインを発現する複数の異なるポリペプチドを発現する）；ｂ）上記細菌細胞を第１のＦｃＲポリペプチドと、ＦｃＲポリペプチドとグリコシル化されていないＦｃドメインとの間での接触を可能にする条件下で接触させる工程（ここでは、ＦｃＲポリペプチドは、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃαＲＩである）；およびｃ）グリコシル化されていないＦｃドメインの第１のＦｃＲポリペプチドに対する結合に基づいて少なくとも１つの細菌細胞を選択する工程。上記の実施形態の議論のいずれかをこれらの方法の実施のために適用することができる。

本発明の方法および／または組成物の状況において議論される実施形態は、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して利用され得る。したがって、１つの方法または組成物に関する実施形態は、本発明の他の方法および組成物にも同様に適用することができる。

本明細書中で使用される場合は、用語「コードする」または「コーディング」は、核酸に関して、当業者が本発明を容易に理解できるようにするために使用される。しかし、これらの用語は、それぞれ「含む」または「含んでいる」と互換的に使用され得る。

明細書において本明細書中で使用される場合は、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味する場合がある。特許請求の範囲（単数または複数）において本明細書中で使用される場合は、語句「含んでいる」と組み合わせて使用されていれば、語句「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替えのものだけを言うように明白に示されているか、または代替えのものが相互に排他的でない限りは、「および／または」を意味するように使用されるが、上記開示は、代替えのものだけ、および「および／または」をいう定義をサポートする。本明細書中で使用される場合は、「別」は、少なくとも第２のものまたはそれ以上を意味し得る。

本明細書全体を通じて、用語「約」は、値が、デバイスの固有の偏差、値を決定するために利用される方法、または実験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な記述から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内での様々な変更と改変が、この詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうとの理由から、説明のために提供されるにすぎないことが理解されるものとする。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトＦｃＲポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていない抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、該Ｆｃドメインは、３８２位と４２８位のアミノ酸でのアミノ酸置換、ならびに以下のアミノ酸：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３８位、３４０位、３４１位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位
のうちのいずれかの少なくとも１つのさらなる置換
を含む、ポリペプチド。
（項目２）
前記ＦｃドメインがヒトＦｃγＲＩポリペプチドに結合することができる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
少なくとも１つのさらなる置換が、上方ＣＨ２領域中のアミノ酸の置換である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４）
少なくとも１つのさらなる置換が、上方ＣＨ２領域の以下の部分：２３４Ｌ〜２３９Ｓ；２６４Ｖ〜２６８Ｈ；２９７Ｎ〜２９９Ｔ；または、３２８Ｌ〜３３２Ｉ
の中のアミノ酸の置換である、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記３８２位のアミノ酸の置換がバリン（Ｅ３８２Ｖ）である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記４２８位のアミノ酸の置換がイソロイシン（Ｍ４２８Ｉ）である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記３８２位のアミノ酸の置換がバリン（Ｅ３８２Ｖ）であり、前記４２８位のアミノ酸の置換がイソロイシン（Ｍ４２８Ｉ）である、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記３２８位のアミノ酸の置換がトリプトファン（Ｌ３２８Ｗ）である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記３３２位のアミノ酸の置換がチロシンである（Ｉ３３２Ｙ）、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１０）
少なくとも３２８位および３３２位のアミノ酸に別の置換を有している、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記３２８位のアミノ酸の置換がトリプトファン（Ｌ３２８Ｗ）であり、３３２位のアミノ酸の置換がチロシン（Ｉ３３２Ｙ）である、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
３４１位のアミノ酸に別の置換を有している、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記３４１位のアミノ酸の置換がバリン（Ｇ３４１Ｖ）である、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記少なくとも１つのさらなる置換が：
Ｈ２２４Ｒ／Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｋ２５１Ｆ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｖ２７９Ｍ、Ｎ２８６Ｄ、Ｑ２９５Ｒ、Ｎ２９７Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３１５Ｄ、Ｎ３２５Ｓ、Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｖ／Ｅ／Ｉ、Ｐ３３１Ａ／Ｓ／Ｅ、Ｉ３３２Ｙ、Ｋ３３８Ｉ／Ｒ、Ｋ３４０Ｎ／Ｑ、Ｇ３４１Ｖ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ａ３７８Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、Ｓ４２６Ｉ、またはＮ４３４Ｓ／Ｄ
である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ポリペプチドが、グリコシル化されていない野生型抗体Ｆｃドメインを持つポリペプチドと比較して、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合において少なくとも２倍の減少を有する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ポリペプチドが、Ｇ３４１Ｖのさらなる置換を有さない、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ポリペプチドが、Ｋ３３８Ｒのさらなる置換を有さない、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ポリペプチドが、Ｋ３３８ＲおよびＧ３４１Ｖのさらなる置換を有さない、項目１７に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記ＦｃドメインがＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉの置換を有し、Ｇ３４１Ｖおよび／またはＫ３４０Ｎ／Ｑのさらなる置換を有する、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２０）
前記ＦｃドメインがＧ３４１Ｖのさらなる置換を有する、項目１９に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記Ｆｃドメインが、Ｈ２２４Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２８６Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３２５Ｓ、Ｋ３３８Ｒ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ／Ｓからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有する、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記Ｆｃドメインが前記群より選択される複数の他の置換を有する、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記ＦｃドメインがＫ３３８Ｒ置換を含む、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記Ｆｃドメインが、
ａ）Ｋ３３８ＲおよびＧ３４１Ｖ；ｂ）Ｎ２９７Ｄ、Ｎ３１５Ｄ、およびＫ３４０Ｎ、ｃ）Ｋ３４０Ｎ、ｄ）Ｋ３３８ＩおよびＫ３４０Ｎ、ｅ）Ｋ３４０ＱおよびＡ３７８Ｄ；ｆ）Ｎ３２５ＳおよびＫ３４０Ｎ、ｇ）Ｈ２２４Ｙ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ３２５Ｓ、およびＧ３４１Ｖ、ｈ）Ｇ３４１ＶおよびＫ３９２Ｅ、ｉ）Ｋ３３８Ｒ、Ｇ３４１Ｖ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ、ｊ）Ｆ２４１ＬおよびＧ３４１Ｖ、ｋ）Ｇ３４１Ｖ、ｌ）Ｎ２７６ＤおよびＧ３４１Ｖ、ｍ）Ｇ３４１ＶおよびＶ３６９Ａ、ｎ）Ｎ２８６Ｄ、Ｇ３４１Ｖ、およびＮ４３４Ｓ、ｏ）Ｎ３２５ＳおよびＧ３４１Ｖ、ｐ）Ｙ３００ＣおよびＧ３４１Ｖ、ｑ）Ｇ３４１ＶおよびＶ３４８Ｍ、ｒ）Ｅ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ、ｓ）Ｖ２６６Ｍ；ｔ）Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ａ、およびＱ２９５Ｒ、ｕ）Ａ３３０Ｅ、Ｐ３３１Ｅ、およびＶ２７９Ｍ、ｖ）Ａ３３０ＥおよびＰ３３１Ｅ、ｗ）Ａ３３０Ｅ、Ｐ３３１Ｖ、およびＳ４２６Ｔ、ｘ）Ａ３３０ＥおよびＰ３３１Ｖ、ｙ）Ａ３３０ＩおよびＰ３３１Ｅ、ｚ）Ａ３３０Ｅ、ａａ）Ｐ３３１Ｓ、ならびに、ｂｂ）Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２２４Ｒ、およびＬ２５１Ｆ
からなる群より選択される置換のセットを含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２５）
結合可能なリンカーをさらに含む、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２６）
非ＦｃＲ結合ドメインをさらに含む、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記非ＦｃＲ結合ドメインが抗体の抗原結合部位である、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記非Ｆｃ結合領域が抗体の抗原結合部位ではない、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記非Ｆｃ結合領域が細胞表面タンパク質に結合する、項目２８に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記細胞表面タンパク質が受容体である、項目２８に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記受容体がチロシンキナーゼである、項目３０に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記非Ｆｃ結合領域が複数のチロシンキナーゼ受容体に結合する、項目３１に記載のポリペプチド。
（項目３３）
項目１〜３２に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
（項目３４）
前記核酸がＤＮＡセグメントである、項目３３に記載の核酸。
（項目３５）
前記核酸が発現ベクターである、項目３３に記載の核酸。
（項目３６）
項目３３に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目３７）
前記核酸が第１の発現ベクター中に存在する、項目３６に記載の宿主細胞。
（項目３８）
第２の発現ベクターをさらに含む、項目３７に記載の宿主細胞。
（項目３９）
前記第２の発現ベクターが免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードする、項目３８に記載の宿主細胞。
（項目４０）
項目３９に記載の宿主細胞の集団であって、異なるＦｃドメインを発現する複数の宿主細胞を含む集団。
（項目４１）
いずれか２つの異なるＦｃドメインのアミノ酸配列が、同一性に関して、２０％未満異なる、項目４０に記載の宿主細胞の集団。
（項目４２）
ＦｃＲγＩポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていないＦｃドメインと第２の結合ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、該第２の結合ドメインは細胞表面分子に結合することができる、ポリペプチド。
（項目４３）
前記第２の結合ドメインが抗体抗原結合ドメインである、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４４）
前記第２の結合ドメインが抗体抗原結合ドメインではない、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４５）
前記細胞表面分子がタンパク質様分子である、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４６）
前記第２の結合ドメインが細胞表面受容体のリガンドである、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４７）
前記第２の結合ドメインが細胞表面リガンドの受容体である、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４８）
項目４２〜４７に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
（項目４９）
前記核酸がＤＮＡセグメントである、項目４８に記載の核酸。
（項目５０）
前記核酸が発現ベクターである、項目４８に記載の核酸。
（項目５１）
項目４８に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目５２）
前記核酸が第１の発現ベクター中に存在する、項目５１に記載の宿主細胞。
（項目５３）
第２の発現ベクターをさらに含む、項目５２に記載の宿主細胞。
（項目５４）
前記第２の発現ベクターが免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードする、項目５３に記載の宿主細胞。
（項目５５）
グリコシル化されていないポリペプチドを調製するためのインビトロでの方法であって、ａ）ＦｃＲポリペプチドに結合することができるＦｃドメインを含むグリコシル化されていない抗体を発現することができる宿主細胞を得る工程であって、ここで、該Ｆｃドメインは３８２位および４２８位のアミノ酸でのアミノ酸置換と、以下のアミノ酸：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３８位、３４０位、３４１位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位のうちのいずれかの少なくとも１つのさらなる置換を含む、工程；
ｂ）該グリコシル化されていない抗体の発現を促進する条件下で、培養物中で該宿主細胞をインキュベーションする工程；ならびに
ｃ）該宿主細胞から、発現された抗体を精製する工程
を包含する、方法。
（項目５６）
前記宿主細胞が原核生物細胞である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記宿主細胞が真核生物細胞であり、前記ポリペプチドはＮ２９７Ｄの置換を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
発現された抗体を上清から回収する工程をさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記抗体を上清から精製する工程が、上清に由来する抗体を、濾過、ＨＰＬＣ、陰イオン交換または陽イオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、あるいはそれらの組み合わせに供することを包含する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
アフィニティークロマトグラフィーにプロテインＡが含まれる、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
被験体において免疫応答を誘導するための、項目１〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目６２）
前記グリコシル化されていない抗体が、ＦｃγＲＩポリペプチドに特異的に結合することができる、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記グリコシル化されていない抗体が、前記抗体のグリコシル化された野生型バージョンよりも少なくとも５０倍低いレベルでＦｃγＲＩＩｂポリペプチドに特異的に結合することができる、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記抗体が治療用抗体のグリコシル化されていないバージョンである、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
標的化された細胞表面ポリペプチドを発現する標的細胞に対して樹状細胞（ＤＣ）媒介性の細胞の殺傷を誘導する方法であって、
ａ）該標的細胞を、少なくともＦｃγＲＩポリペプチドと、該標的化された細胞表面ポリペプチドに結合する第２の結合ドメインとに特異的に結合することができる変異させたグリコシル化されていないＦｃドメインを含むポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、該グリコシル化されていないＦｃドメインが、グリコシル化されたＦｃドメインよりも少なくとも５０倍低いレベルでＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合する、工程；および
ｂ）該標的細胞を、該標的細胞の殺傷を促進する条件下で樹状細胞に曝す工程
を包含する、方法。
（項目６６）
前記Ｆｃドメインが、以下のアミノ酸の中の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、項目６５に記載の方法：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３４０位、３４８位、３６９位、３７８位、３８２位、３９２位、４２４位、４２６位、４２８位、および／または４３４位。
（項目６７）
前記ＦｃドメインにＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉの置換が含まれる、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
特異的なＦｃγＲポリペプチドに結合するＦｃドメインを有しているグリコシル化されていないポリペプチドをスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、
ａ）グラム陰性細菌細胞の集団を得る工程であって、この集団の細胞が、それらのペリプラズムの中でＦｃドメインを含むグリコシル化されていないポリペプチドを発現し、前記集団が、複数の異なるＦｃドメインを発現する、工程；
ｂ）該細菌細胞を第１のＦｃＲポリペプチドと、該ＦｃγＲポリペプチドと該グリコシル化されていないＦｃドメインとの間での接触を可能にする条件下で接触させる工程であって、ここで、該ＦｃγＲポリペプチドが、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃαＲＩである、工程；
ｃ）該グリコシル化されていないＦｃドメインの、該第１のＦｃＲポリペプチドに対する結合に基づいて少なくとも１つの細菌細胞を選択する工程
を包含する、方法。
（項目６９）
前記選択された細菌細胞から前記グリコシル化されていないポリペプチドを同定または単離する工程をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
選択された細菌細胞中のグリコシル化されていないポリペプチドが他のＦｃＲポリペプチドに結合できるかどうかを決定する工程をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目７１）
選択された細菌細胞中のグリコシル化されていないポリペプチドが他のＦｃＲポリペプチドに結合できるかどうかを決定する工程が、第２のＦｃＲポリペプチドを用いて工程ａ）〜ｃ）を繰り返し行って該グリコシル化されていないポリペプチドが該第２のＦｃＲポリペプチドにも結合するかどうかを決定することを含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記工程ａ）〜ｃ）が、２つより多くの異なるＦｃＲポリペプチドを用いて繰り返し行われる、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記グリコシル化されていないポリペプチドが複数のＦｃＲポリペプチドに結合する、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、項目６８に記載の方法。
（項目７５）
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのＦｃドメインである、項目６８に記載の方法。
（項目７６）
前記ＩｇＧ ＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが抗ＨＥＲ２抗体のＦｃドメインである、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記ＩｇＧ１ ＦｃドメインがトラスツズマブのＦｃドメインのＦｃドメインである、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記グラム陰性細菌細胞の集団が、前記複数のグリコシル化されていないＦｃドメインをコードする複数の核酸を含む、項目６８に記載の方法。
（項目８０）
前記複数の核酸が、前記複数のグリコシル化されていないＦｃドメインに融合させられた膜分泌シグナルをさらにコードする、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記膜分泌シグナルがＰｅｌＢである、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記膜分泌シグナルがＤｓｂＡである、項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記グリコシル化されていないＦｃドメインが、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含む、項目６８に記載の方法。
（項目８４）
前記グリコシル化されていないポリペプチドが真核生物のＦｃドメインを含む、項目６８に記載の方法。
（項目８５）
前記グリコシル化されていないポリペプチドが合成Ｆｃドメインを含む、項目６８に記載の方法。
（項目８６）
前記ＦｃＲポリペプチドが、表１のうちのポリペプチドの１つに由来する抗体結合ドメインを含む、項目８４に記載の方法。
（項目８７）
前記ＦｃＲポリペプチドが、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩ、またはＣ１ｑに由来する抗体結合ドメインを含む、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記ＦｃＲポリペプチドが、ヒトＦｃγＲＩａに由来する抗体結合ドメインを含む、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記ＦｃＲポリペプチドが標識されている、項目６８に記載の方法。
（項目９０）
前記ＦｃＲポリペプチドが、発蛍光団、放射性同位体、または酵素で標識されている、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ＦｃＲポリペプチドが発蛍光団で標識されている、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記ＦｃＲポリペプチドが蛍光タンパク質または酵素に融合している、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
前記ＦｃＲポリペプチドが緑色蛍光タンパク質ＧＦＰに融合している、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記ＦｃＲポリペプチドが固定化されている、項目６８に記載の方法。
（項目９５）
前記工程（ｃ）の選択が、少なくとも２回の選択を含むとさらに定義され、ここでは、第１回目の選択において得られた細菌細胞のサブ集団が、ＦｃＲポリペプチドに対するＦｃポリペプチドの結合に基づく少なくとも第２回目の選択に供される、項目６８に記載の方法。
（項目９６）
２回〜１０回の選択を含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記選択が、ＦＡＣＳまたは磁気分離により行われる、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記細菌細胞を少なくとも２つのＦｃＲポリペプチドと接触させる工程をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目９９）
前記少なくとも２つのＦｃＲポリペプチドが異なる標識を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記少なくとも２つのＦｃＲポリペプチドに対するグリコシル化されていないＦｃドメインの結合に基づいて細菌細胞を選択する工程をさらに含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
少なくとも１つのＦｃＲポリペプチドに対するグリコシル化されていないＦｃドメインの結合に基づいて、そして、少なくとも１つの他のＦｃＲポリペプチドに対しては該グリコシル化されていないＦｃドメインが結合しないことに基づいて細菌細胞を選択する工程をさらに含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
前記細菌細胞をＦｃＲポリペプチドと接触させる前に、前記細菌細胞の外膜を破壊する工程をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目１０３）
前記細菌細胞の外膜を破壊する工程に、高浸透圧条件での処理、物理的ストレスでの処理、細菌のファージ感染、リゾチームでの処理、ＥＤＴＡでの処理、消化酵素での処理、または外膜を破壊する化学物質での処理が含まれる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記細菌細胞の外膜を破壊する工程に、前記方法の組み合わせが含まれる、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記細菌細胞の外膜を破壊する工程に、外膜の物理的、化学的、および酵素的破壊の組み合わせとともに細菌細胞を加熱することが含まれる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０６）
前記細菌細胞の外膜を破壊する工程に、前記細菌の外膜を除去することがさらに含まれる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０７）
グリコシル化されていないＦｃドメインに結合していないＦｃＲポリペプチドを除去する工程がさらに含まれる、項目６８に記載の方法。
（項目１０８）
前記細菌が、スクロース、ソルビトール、マンニトール、またはトレハロースを含む培地中で増殖させられる、項目６８に記載の方法。
（項目１０９）
前記細菌が、トレハロースを含む培地中で増殖させられる、項目６８に記載の方法。
（項目１１０）
ＦｃＲポリペプチドに対して特異的親和性を有している抗体Ｆｃポリペプチドをコードする核酸配列を産生する方法としてさらに定義される、前記細菌細胞からＦｃポリペプチドをコードする核酸配列をクローニングして、ＦｃＲポリペプチドに対して特異的親和性を有している抗体Ｆｃポリペプチドをコードする核酸配列を産生する工程をさらに含む、項目６８に記載の方法。
（項目１１１）
前記クローニング工程が前記核酸配列の増幅を含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
ＦｃＲポリペプチドに対して特異的親和性を有している抗体Ｆｃポリペプチドを産生する方法としてさらに定義される、前記抗体Ｆｃポリペプチドをコードする核酸配列を発現させて、ＦｃＲポリペプチドに対して特異的親和性を有している抗体Ｆｃポリペプチドを産生する工程をさらに含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＦｃＲポリペプチドがＦｃγＲＩポリペプチドである、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記複数の異なるＦｃドメインが１つのＦｃドメインの変異体バリエーションである、項目６８に記載の方法。
（項目１１５）
前記変異体バリエーションが無作為に作製されたものである、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
Ｆｃドメインを有しているグリコシル化されていないポリペプチドの１つ以上の特異的ＦｃＲポリペプチドに対するＦｃの結合を最適化するためのインビトロでの方法であって：ａ）グラム陰性細菌細胞の集団を得る工程であって、該集団の細胞が、それらのペリプラズムの中でＦｃドメインを含むグリコシル化されていないポリペプチドを発現し、ここでは、該集団が様々な変異したＦｃドメインを発現する複数の様々なポリペプチドを発現する、工程；
ｂ）該細菌細胞を第１のＦｃＲポリペプチドと、該ＦｃＲポリペプチドと該グリコシル化されていないＦｃドメインとの間での接触を可能にする条件下で接触させる工程であって、ここで、該ＦｃＲポリペプチドは、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃαＲＩである、工程；
ｃ）該グリコシル化されていないＦｃドメインの、該第１のＦｃＲポリペプチドに対する結合に基づいて少なくとも１つの細菌細胞を選択する工程
を包含する、方法。

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに明らかにするために含められる。本発明は、本明細書中に提示される特異的な実施形態についての詳細な記載と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってさらに理解され得る。
図１は、グリコシル化されたＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＢＤ Ｃｏｄｅ：１ＦＣ１）の３Ｄ構造上に示される単離されたグリコシル化されていないＦｃ５の変異点（３８２Ｅおよび４２８Ｍ）を示す図面である。 図２は、グリコシル化されたＩｇＧ（ＰＢＤ Ｃｏｄｅ：１ＦＣ１）の結晶構造上に示されるＣＨ３ドメインのβシートＣ中に３８２ＥおよびβシートＣ中に４２８Ｍを含む２つのβシートを示す図面である。 図３は、グリコシル化されていないＦｃ５ドメインを操作するためのＥｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲライブラリーを示す図面である。 図４は、ＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣで標識された選別の異なる回に由来するスフェロプラストの蛍光ヒストグラムを示す図面である。 図５は、Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い親和性を示す単離されたＦｃ変異体クローンのＤＮＡ配列を示す図面である。ＦｃγＲＩａで標識されたそれぞれのクローンについての平均蛍光値を括弧内に示す。 図５は、Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い親和性を示す単離されたＦｃ変異体クローンのＤＮＡ配列を示す図面である。ＦｃγＲＩａで標識されたそれぞれのクローンについての平均蛍光値を括弧内に示す。 図６は、グリコシル化されたＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＢＤ Ｃｏｄｅ：１ＦＣ１）の３Ｄ構造上に示される単離されたグリコシル化されていないＦｃ６０１〜６１９の変異点を示す図面である。 図７は、３０ｎＭのＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣで標識した野生型Ｆｃ、Ｆｃ５、およびＦｃ６０１のスフェロプラストについての蛍光ヒストグラムを示す図面である。Ｍ：平均蛍光強度。 図８は、グリコシル化されたＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＢＤ Ｃｏｄｅ：１ＦＣ１）の３Ｄ構造上に示される単離されたグリコシル化されていないＦｃ６０１の変異点（Ｋ３３８Ｒ、Ｇ３４１Ｖ、Ｅ３８２Ｖ、Ｍ４２８Ｉ）を示す図面である。 図９は、プラスミドｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１のマップを示す図面である。 図１０は、ＦｃγＲＩａに対する結合についてＢＩＡＣｏｒｅ分析により決定した、グリコシル化されていないトラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、トラスツズマブ−Ｆｃ６０１、およびグリコシル化されたトラスツズマブの運動速度定数と平衡解離定数を示す図面である。 図１１は、ＦｃγＲＩＩａ−ＧＳＴに対するトラスツズマブ抗体の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す図面である。 図１２は、ＦｃγＲＩＩｂ−ＧＳＴに対するトラスツズマブ抗体の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す図面である。 図１３は、ＦｃγＲＩＩＩａに対するトラスツズマブ抗体の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す図面である。 図１４は、ｐＨ７．４およびｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対するｐＨ依存性の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す図面である。プレートを、グリコシル化されていないトラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、トラスツズマブ−Ｆｃ６０１、または市販されているグリコシル化されたトラスツズマブでコーティングし、ＦｃＲｎの結合を抗ＧＳＴ−ＨＲＰを使用して検出した。 図１５は、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合についてＦｃ５を上回るＦｃγＲＩａに対する高い親和性についてのライブラリーを示す図面である。 図１６は、上方ＣＨ２領域を無作為化した４つのサブライブラリーの構築のための遺伝子アセンブリＰＣＲを示す図面である。 図１７は、Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い親和性を示している単離されたＦｃ変異体クローンのＤＮＡ配列を示す図面である。ＦｃγＲＩａで標識されたそれぞれのクローンについての平均蛍光値を括弧内に示す。 図１８は、Ｆｃ７０１〜７０９の中の変異のまとめを示す図面である。 図１９は、１ｎＭのＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣで標識された野生型Ｆｃ、Ｆｃ５、Ｆｃ７０１、およびＦｃ７０２についてのスフェロプラスト化細胞の蛍光ヒストグラムを示す図面である。Ｍ：平均蛍光強度。 図２０は、１ｎＭのＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣで標識された野生型Ｆｃ、Ｆｃ５、Ｆｃ６０１、およびＦｃ７０１についてのスフェロプラスト化細胞の蛍光ヒストグラム。Ｍ：平均蛍光強度。 図２１は、グリコシル化されたＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＢＤ Ｃｏｄｅ：１ＦＣ１）の３Ｄ構造上に示される単離されたグリコシル化されていないＦｃ５の変異点（３８２Ｅおよび４２８Ｍ）を示す図面である。 図２２は、ＦｃγＲＩに対する結合についてのＢＩＡＣｏｒｅ分析により決定した、グリコシル化されていないトラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、トラスツズマブ−Ｆｃ６０１、トラスツズマブ−Ｆｃ７０１、およびグリコシル化されたトラスツズマブの運動速度定数と平衡解離定数を示す図面である。 図２３は、ＰＨ７．４およびｐＨ６．０でのＦｃＲｎに対するｐＨ依存性の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを示す図面である。プレートを、グリコシル化されていないトラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、トラスツズマブ−Ｆｃ６０１、トラスツズマブ−Ｆｃ７０１、または市販されているグリコシル化されたトラスツズマブでコーティングし、ＦｃＲｎの結合を抗ＧＳＴ−ＨＲＰを使用して検出した。 図２４は、共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステム。 図２５は、２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムと２シストロン性システムとの間でのＦＡＣＳシグナルの比較を示す図面である。トラスツズマブ全長ＩｇＧを、２つのプラスミドを固定した全長ＩｇＧディスプレイシステムまたは２シストロン性全長ＩｇＧディスプレイシステムのいずれかを使用して発現させた。Ｍ：平均蛍光強度。スフェロプラストを、検出のための３０ｎＭのＦｃγＲＩ−ＦＩＴＣプローブとともにインキュベーションした。 図２６は、２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムと２シストロン性システムとの間でのＦＡＣＳシグナルの比較を示す図面である。トラスツズマブ全長ＩｇＧを、２つのプラスミドを固定した全長ＩｇＧディスプレイシステムまたは２シストロン性全長ＩｇＧディスプレイシステムのいずれかを使用して発現させた。Ｍ：平均蛍光強度。スフェロプラストを３０ｎＭのＦｃγＲＩＩａ−ＧＳＴとともにインキュベーションし、検出のためのポリクローナル抗ＧＳＴ−ＦＩＴＣ（１：２００）プローブで標識した。 図２７は、２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムと２シストロン性システムを使用したトラスツズマブ全長ＩｇＧのＦＡＣＳ分析を示す図面である。トラスツズマブ全長ＩｇＧを発現するスフェロプラストを、検出のための３０ｎＭのＦｃγＲＩ−ＦＩＴＣプローブとともにインキュベーションした。Ｍ：平均蛍光強度。 図２８は、２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムと２シストロン性システムを使用したトラスツズマブ全長ＩｇＧのＦＡＣＳ分析を示す図面である。トラスツズマブ全長ＩｇＧを発現するスフェロプラストを、３０ｎＭのＦｃγＲＩＩａ−ＧＳＴとともにインキュベーションし、検出のためのポリクローナル抗ＧＳＴ−ＦＩＴＣ（１：２００）プローブで標識した。Ｍ：平均蛍光強度。 図２９は、上方ＣＨ２領域の無作為化のためのライブラリーを示す図面である。 図３０は、エフェクター細胞としてＰＢＭＣを、標的細胞としてＳｋＢｒ３を用いたＡＤＣＣアッセイを示す図面である。^＊、Ｐ＜０．０５。 図３１は、エフェクター細胞としてｍＤＣを、標的細胞ＳｋＢｒ３を用いたＡＤＣＣアッセイを示す図面である。^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１。

代表的実施形態の説明
本発明者らは、これまでに、Ｆｃ受容体ポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていない抗体Ｆｃドメインを提供することにおける、現在の免疫治療技術に伴ういくつかの重要な問題を克服してきた。操作された特性を持つさらなるＦｃドメインが開発されている。さらなる実施形態と利点が以下に記載されるが、Ｆｃライブラリーについての情報とスクリーニング方法が提供される。

Ｉ．ペリプラズム発現
いくつかの実施形態においては、抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチドを、グラム陰性細菌のペリプラズム空間内で発現させることができる。さらに、いくつかの態様においては、抗体Ｆｃドメインを、内膜のペリプラズム表面に固定することができる。例えば、Ｆｃドメインは、膜貫通ポリペプチドもしくは膜結合型ポリペプチドに直接融合させることができ、また、膜貫通ポリペプチドもしくは膜結合型ポリペプチドと相互作用する（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用を介して）場合もある。そのような技術は、「固定化ペリプラズム発現」または「ＡＰＥｘ」と呼ぶことができる。

ペリプラズム区画は、グラム陰性細胞の内膜と外膜との間に含まれる（例えば、Ｏｌｉｖｅｒ，１９９６を参照のこと）。ペリプラズム区画は、細胞内区画（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）であるので、細胞の増殖および分裂に伴って大きさ、形状、および内容物が変動する。ペプチドグリカンの枠組み内では、ヘテロポリマーはペリプラズムタンパク質およびわずかな水の高密度環境であり、この区画にゲル様の粘稠度をもたらす（Ｈｏｂｏｔら、１９８４；ｖａｎ Ｗｉｅｌｉｎｋ ａｎｄ Ｄｕｉｎｅ、１９９０）。ペプチドグリカンは、外膜への近さに依存して様々な程度に重合され、至近距離では、細胞の形状および浸透圧溶解に対する耐性を与えるムレイン細胞嚢を形成する。

外膜（Ｎｉｋａｉｄｏ、１９９６を参照のこと）は、リン脂質、ポーリンタンパク質、および、培地内へ伸長するリポ多糖（ＬＰＳ）から構成される。外膜の完全性の分子基盤は、２価の陽イオン（Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋）を結合し、互いを静電気的に連結して表面上に高次の規則正しい準結晶配向した「瓦屋根」を形成するＬＰＳの能力により備わっている（Ｌａｂｉｓｃｈｉｎｓｋｉら、１９８５）。この膜は、ポーリンを介して、約６５０Ｄａ以下の分子の通過を可能にする非常に厳密な透過性障壁を形成する（Ｂｕｒｍａｎら、１９７２；Ｄｅｃａｄ ａｎｄ Ｎｉｋａｉｄｏ、１９７６）。大量の水で満たされたポーリンチャネルは、単糖および二糖、イオン、ならびにアミノ酸のペリプラズム区画への自由な通過の許容を主に担う（Ｎｉｋａｉｄｏ ａｎｄ Ｎａｋａｅ、１９７９；Ｎｉｋａｉｄｏ ａｎｄ Ｖａａｒａ、１９８５）。分子のペリプラズムへの接近の、そのような厳密な生理的調節により、より大きなリガンド（すなわち、６５０Ｄａの排除限界より大きいもの）をスクリーニング方法において利用できることは、一見して不可解に見えるかもしれない。しかし、本発明者らは、２０００Ｄａよりも大きいリガンドがペリプラズム膜を破壊することなくペリプラズム内に拡散し得ることを示した。このような拡散は、細菌細胞の１つ以上の処理によって支援することができ、これにより、本明細書中において以下に記載されるように、外膜をより透過性にすることができる。

ペリプラズム空間内でポリペプチド、および特に、抗体を発現させるための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第７，０９４，５７１号、ならびに米国特許公開番号第２００３０１８０９３７号および同第２００３０２１９８７０号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。いくつかの場合には、本発明のグラム陰性細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞として定義され得る。さらに、いくつかの態様においては、グラム陰性細菌細胞は、遺伝子操作された細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＪｕｄｅ−１株）として定義され得る。

ＩＩ．外膜の透過処理
いくつかの実施形態においては、複数の方法に、当該分野で周知である細菌の外膜を破壊する、透過処理する、または除去する工程が含まれる。例えば、米国特許第７，０９４，５７１号を参照のこと。例えば、細菌細胞をＦｃＲポリペプチドと接触させる前に、細菌細胞の外膜を、高浸透圧条件、物理的ストレス、リゾチーム、ＥＤＴＡ、消化酵素、外膜を破壊する化学物質で、または細菌をファージに感染させることにより、あるいは上記方法の組み合わせにより処理することができる。このように、いくつかの場合には、外膜を、リゾチームとＥＤＴＡでの処理により破壊することができる。さらに、特定の実施形態においては、細菌の外膜を完全に取り除くことができる。

１つの実施形態においては、１つ以上の標識されたリガンドに対する外膜の透過性を増大させる方法が利用される。これにより、通常なら外膜を通過できない標識されたリガンドのスクリーニングアクセスを利用することが可能になる。しかし、特定のクラスの分子（例えば、６５０Ｄａの排除限界よりも大きい疎水性抗生物質）は、膜ポーリンとは無関係にそれ自体が細菌の外膜を通過して拡散することができる（Ｆａｒｍｅｒら、１９９９）。このプロセスは、そのように行うと膜を実際に透過処理することができる（Ｊｏｕｅｎｎｅ ａｎｄ Ｊｕｎｔｅｒ、１９９０）。このような機構は、ポリミキシンＢノナペプチドを用いてインビボで細胞質膜タンパク質のペリプラズムループを選択的に標識するために採用されている（Ｗａｄａら、１９９９）。また、特定の長鎖リン酸ポリマー（１００Ｐｉ）も、外膜の正常な分子ふるい活性をまとめて回避するとみられる（Ｒａｏ ａｎｄ Ｔｏｒｒｉａｎｉ、１９８８）。

生存性を喪失することなく、または発現されたタンパク質が細胞から放出されることなく、リガンドのペリプラズム内への透過をもたらす条件が同定されているが、本発明は外膜を維持せずに行うことが可能である。本明細書中で示されるように、Ｆｃドメインをペリプラズム空間の中で発現させ、ペリプラズム空間の中の候補の結合性ポリペプチドに対して固定することにより、結合した標識リガンドを検出するために（細胞からの結合性タンパク質（ｂｉｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の漏出を妨げる障壁としての）外膜を維持する必要がなくなる。結果として、細胞質膜の外（ペリプラズム）面に固定された結合性タンパク質を発現する細胞は、ある程度透過処理された膜を有する細胞またはほぼ完全に外膜が除去された細胞のいずれかにおいて、単に蛍光標識リガンドの溶液とともにインキュベーションすることにより、蛍光標識することができる。

異なる細菌宿主株の外膜の透過性は、大きく異なり得る。ＯｍｐＦの過剰発現が原因である透過性の増大が、ヒストン様タンパク質が存在しないことにより起こり、これにより、ＯｍｐＦの翻訳に関する負の調節性ｍＲＮＡの量の減少が生じることが以前に示されている（Ｐａｉｎｂｅｎｉら、１９９７）。また、ＤＮＡ複製および染色体分離も、レプリソームと内膜との密接した接触に依存することが公知であり、内膜自体は複数の箇所で外膜と接触している。ライブラリースクリーニングの用途に好ましい宿主は、プラスミドコピー数を減少させる変異をさらに有するＥ．ｃｏｌｉ ＡＢＬＥＣ株である。

高浸透圧ショックのような処理により標識を有意に改善することができる。カルシウムイオン（Ｂｕｋａｕら、１９８５）、およびさらにはＴｒｉｓ緩衝液（Ｉｒｖｉｎら、１９８１）を含む多くの物質が、外膜の透過性を変化させることは公知である。さらに、ファージ感染が標識化プロセスを刺激する。繊維状ファージの内膜タンパク質ｐＩＩＩおよび大きな多量体外膜タンパク質ｐＩＶの両方によって膜透過性は変わり得（Ｂｏｅｋｅら、１９８２）、ｐＩＶ中の変異が、通常は排除されるマルトデキストリンへの接近を改善することが知られている（Ｍａｒｃｉａｎｏら、１９９９）。株、塩、およびファージの賢明な組み合わせを含む本発明の技法を使用して、高度な透過性が達成され得る（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９９）。次に、フローサイトメトリーまたは他の関連する技術を使用して、蛍光標識リガンドに結合している固定されたポリペプチドまたはペリプラズムと関係があるポリペプチドを含む細胞を、標識リガンドに対する親和性を持たない結合性タンパク質を発現する細胞から容易に単離することができる。しかし、いくつかの場合には、細胞の生存性を維持するために、破壊的な技法の使用を控えることが望ましいと考えられる。ＥＤＴＡ処理およびリゾチーム処理もまた、これに関して有用であり得る。

ＩＩＩ．抗体結合性ポリペプチド
特定の態様においては、Ｆｃ受容体のような抗体結合性ポリペプチドに対して特異的親和性を持つ抗体Ｆｃドメインを同定するための方法が存在する。いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインは、１つ以上の特異的Ｆｃ受容体に結合するように操作される。さらに、またはあるいは、Ｆｃドメインは、それが１つ以上の特異的Ｆｃ受容体に特異的に結合しないように操作される場合もある。

特定の実施形態においては、天然のまたは野生型タンパク質と比較して修飾されたタンパク質様分子を含む組成物が存在する。

いくつかの実施形態においては、タンパク質様化合物は、アミノ酸残基が欠失している。他の実施形態においては、タンパク質様化合物のアミノ酸残基は置換されており、なおさらなる実施形態においては、タンパク質様化合物中のアミノ酸残基の欠失と置換の両方が作製されている。さらに、タンパク質様化合物には、アミノ酸分子を含有する２つ以上のポリペプチド物質が含まれ得る。本明細書中で使用される場合は、「タンパク質様分子」、「タンパク質様組成物」、「タンパク質様化合物」、「タンパク質様鎖」、または「タンパク質様物質」は、一般的には、１つの遺伝子から翻訳された約２００を超えるアミノ酸もしくは全長の内因性の配列のタンパク質；１００以上のアミノ酸のポリペプチド；および／または３〜１００アミノ酸のペプチドをいうが、これらに限定されない。上記全ての「タンパク質様」の用語は、本明細書中では互換的に使用され得る。しかし、特定のタイプのタンパク質様化合物（例えば、ポリペプチド）に限定される実施形態が存在し得ることが具体的に想定される。さらに、これらの用語は、融合タンパク質またはタンパク質結合体にも同様に適用され得る。タンパク質には、２つ以上のポリペプチドが含まれる場合がある。例えば、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドを有し、これらは、ジスルフィド結合を通じて互いに連結される。

本明細書中で使用される場合は、「異なるＦｃドメイン」は、わずか１つのアミノ酸が別のＦｃとは異なるドメインと定義され得る。異なる抗体Ｆｃドメインまたは複数の抗体をコードする核酸のライブラリーを作製するための方法は当該分野で周知であり、本明細書中で例示される。例えば、いくつかの場合には、Ｆｃドメインを、本明細書中で例示されるｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲにより増幅させることができる。さらに、特定の場合には、複数の抗体Ｆｃドメインに、無作為化された（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の）アミノ酸の１つのストレッチが含まれ得る。特定の場合には、特異的な変異が、Ｆｃドメインの中に操作され得る。例えば、いくつかの態様においては、抗体Ｆｃドメインにおいて通常グリコシル化される残基を変異させることができる。さらに、特定の態様においては、通常グリコシル化される残基（または隣接する残基）を、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸の挿入のための部位として使用することができる。アミノ酸の挿入は、ＩｇＧ１ Ｆｃ（配列番号２）の３８４位のアミノ酸に対応している残基に、またはそれに隣接するように作製することができる。なおさらなる場合には、本発明のグラム陰性細菌の集団は、少なくとも約１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、またはそれ以上の異なる抗体Ｆｃドメインを含むと定義され得る。いくつかの特異的な場合には、グラム陰性細菌細胞の集団は、以下の工程を含む方法により産生され得る：（ａ）複数の異なる抗体Ｆｃドメインをコードする複数の核酸配列を調製する工程；および（ｂ）グラム陰性細菌の集団を上記核酸で形質転換する工程（ここでは、上記グラム陰性細菌には、ペリプラズムの中で発現された複数の抗体Ｆｃドメインが含まれる）。

様々な抗体結合ドメイン（例えば、ＦｃＲポリペプチド）が当該分野で公知であり、本発明の方法および組成物において使用され得る。例えば、いくつかの態様においては、ＦｃＲは、特定のタイプまたはサブタイプのＩｇ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）に対して特異性を有し得る。したがって、いくつかの実施形態においては、抗体結合ドメインは、ＩｇＧ結合ドメインとして定義され得る。ＦｃＲポリペプチドには、真核生物の、原核生物の、または合成のＦｃＲドメインが含まれ得る。例えば、抗体Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物の、細菌の、または合成の結合ドメインと定義され得る。本発明において使用されるいくつかのＦｃ結合ドメインとしては、表１のポリペプチドのうちの１つに由来する結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｆｃ結合ポリペプチドは、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＣＧＲ１Ａ、Ｆｃｇｒ１、ＦＣＧＲ２、ＦＣＧＲ２、Ｆｃｇｒ２、Ｆｃｇｒ２、ＦＣＧＲ３、ＦＣＧＲ３、Ｆｃｇｒ３、ＦＣＧＲ３、Ｆｃｇｒ３、ＦＣＧＲＴ、ｍｒｐ４、ｓｐａ、またはｓｐｇ遺伝子によりコードされ得る。好ましくは、本発明にしたがって使用されるＦｃＲポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩ、またはＣ１ｑ由来のＦｃ結合領域であり得る。

本発明のなおさらなる実施形態においては、Ｆｃポリペプチドがグラム陰性細菌の内膜に固定され得る。グラム陰性細菌の内膜へのポリペプチドの固定のための方法および組成物は、これまでに記載されている（米国特許第７，０９４，５７１号および米国特許公開番号２００５０２６０７３６）。したがって、いくつかの態様においては、Ｆｃドメインは、細菌の内膜と会合するかまたは細菌の内膜の中に組み込まれるポリペプチドに融合させることができる。そのような融合タンパク質には、ＦｃドメインとのＮ末端またはＣ末端融合が含まれ得、いくつかの場合には、膜固定性ポリペプチドとＦｃドメインとの間にさらに別のリンカーアミノ酸が含まれ得る。特定の特異的な場合には、膜固定性ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｌｐＡ遺伝子によりコードされる最初の６個のアミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ内膜タンパク質由来の１つ以上の膜貫通αへリックス、線維性ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質またはその断片、あるいは内膜リポタンパク質またはその断片であり得る。したがって、一例として、膜固定性ポリペプチドは、以下のような内膜リポタンパク質またはその断片であり得る：ＡｒａＨ、ＭｇｌＣ、ＭａｌＦ、ＭａｌＧ、ＭａｌＣ、ＭａｌＤ、ＲｂｓＣ、ＲｂｓＣ、ＡｒｔＭ、ＡｒｔＱ、ＧｌｎＰ、ＰｒｏＷ、ＨｉｓＭ、ＨｉｓＱ、ＬｉｖＨ、ＬｉｖＭ、ＬｉｖＡ、ＬｉｖＥ、ＤｐｐＢ、ＤｐｐＣ、ＯｐｐＢ、ＡｍｉＣ、ＡｍｉＤ、ＢｔｕＣ、ＴｈｕＤ、ＦｅｃＣ、ＦｅｃＤ、ＦｅｃＲ、ＦｅｐＤ、ＮｉｋＢ、ＮｉｋＣ、ＣｙｓＴ、ＣｙｓＷ、ＵｇｐＡ、ＵｇｐＥ、ＰｓｔＡ、ＰｓｔＣ、ＰｏｔＢ、ＰｏｔＣ、ＰｏｔＨ、Ｐｏｄ、ＭｏｄＢ、ＮｏｓＹ、ＰｈｎＭ、ＬａｃＹ、ＳｅｃＹ、ＴｏｌＣ、Ｄｓｂ、Ｂ、ＤｓｂＤ、ＴｏｕＢ、ＴａｔＣ、ＣｈｅＹ、ＴｒａＢ、ＥｘｂＤ、ＥｘｂＢ、またはＡａｓ。

当業者は、ＦｃＲとのそれらの相互作用（結合）に基づいて細胞を選択するための方法が当該分野で周知であることを理解するであろう。例えば、ＦｃＲが、カラムまたはビーズ（例えば、磁気ビーズ）上に固定化され得、ＦｃＲに対する細菌細胞の結合が、ビーズ（例えば、磁気による分離）またはカラムを繰り返し洗浄することにより分離される。さらに、いくつかの態様においては、標的リガンドが、例えば、発蛍光団、放射性同位体、または酵素で標識され得る。したがって、いくつかの場合には、細菌細胞は、結合したＦｃＲ上の標識を検出することにより選択され得る。例えば、発蛍光団が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して細胞を選択するために使用され得る。さらに、いくつかの態様においては、細菌細胞は、２つ以上のＦｃＲポリペプチドの結合、またはその結合が存在しないことに基づいて選択され得る。例えば、２つのＦｃＲポリペプチドに結合する抗体を提示する細菌が選択され得る。ここでは、各ＦｃＲは、細菌を連続して選択するため使用される。反対に、特定の態様においては、１つのＦｃＲ（例えば、第１の標識を含むＦｃＲ）に結合するが、第２のＦｃＲ（例えば、第２の標識を含むＦｃＲ）には結合しない抗体Ｆｃドメインを提示する細菌が選択され得る。上記方法は、例えば、特異的ＦｃＲに結合するが、第２の特異的ＦｃＲには結合しない抗体Ｆｃドメインを同定するために使用することができる。

特定の実施形態においては、少なくとも１つのタンパク質様分子の大きさとして、以下を挙げることができるが、これらに限定されない：約または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、もしくはそれより多いアミノ酸分子残基、あるいはその中から導くことができる任意の範囲。化合物には、配列番号２（ヒトＩｇＧ Ｆｃポリペプチド）または配列番号４〜３１に由来する、上記数の連続するアミノ酸が含まれ得、これらは、配列番号２または配列番号４〜３１のいずれかに対して同一性または相同性（％）を有しているとしてさらに条件をつけることができる（以下で議論される）。配列番号２に関する実施形態が、本明細書中に記載される任意の他のアミノ酸配列に関しても利用され得ること、および適切である場合にはその逆も想定される。

本明細書中で使用される場合は、「アミノ分子」は、任意のアミノ酸、当業者に公知である任意のアミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物をいう。特定の実施形態においては、タンパク質様分子の残基は連続しており、アミノ分子の残基の配列の間に割り込んでいる非アミノ分子は存在しない。他の実施形態においては、上記配列に、１つ以上の非アミノ分子部分が含まれ得る。特定の実施形態においては、タンパク質様分子の残基の配列の間に、１つ以上の非アミノ分子部分が割り込んでいる場合がある。

Ａ．修飾されたタンパク質およびポリペプチド
複数の実施形態は、修飾されたタンパク質およびポリペプチド、特に、修飾されていないバージョンに匹敵する少なくとも１つの機能的活性を示す修飾されたタンパク質またはポリペプチドに関係するが、上記修飾されたタンパク質またはポリペプチドは、なおも、修飾されていないバージョンを上回るさらなる利点（例えば、ＡＤＣＣを誘発すること、生産がより容易であり、より安価であること、誘発する副作用が少ないこと、および／またはより優れたもしくはより長い効力または生体利用性を有していること）を持つ。したがって、本出願が「修飾されたタンパク質」または「修飾されたポリペプチド」の機能あるいは活性について言及する場合には、当業者は、これに、例えば、１）未修飾のタンパク質もしくはポリペプチドと少なくとも１つの同じ活性を行うか、または少なくとも１つの同じ特異性を有するが、異なるレベルの別の活性または特異性を有し得る；そして、２）未修飾のタンパク質またはポリペプチドを上回るさらなる利点を持つタンパク質あるいはポリペプチドが含まれることを理解するであろう。活性の決定は、（特に、タンパク質の活性に関する）当業者が良く知っているアッセイを使用して達成され得、これには、比較目的のための、例えば、修飾されたもしくは未修飾のタンパク質またはポリペプチドのいずれかの未改変のならびに／あるいは組み換え体バージョンの使用が含まれ得る。「修飾されたタンパク質」と関係がある複数の実施形態は、「修飾されたポリペプチド」に関して実行することができる場合があり、そしてその逆もあり得ることが具体的に想定される。本明細書中で議論される修飾されたタンパク質およびポリペプチドに加えて、複数の実施形態には、ＷＯ２００８／１３７４７５（引用により本明細書中に具体的に組み入れられる）に記載されているドメイン、ポリペプチド、およびタンパク質が含まれ得る。

修飾されたタンパク質は、アミノ酸の欠失および／または置換を持つ場合がある。したがって、欠失を持つタンパク質、置換を持つタンパク質、および欠失と置換を持つタンパク質は、修飾されたタンパク質である。いくつかの実施形態においては、これらの修飾されたタンパク質にはさらに、例えば、融合タンパク質またはリンカーを持つタンパク質のように、アミノ酸の挿入または付加が含まれる場合がある。「修飾された欠失タンパク質」は、未改変のタンパク質の１つ以上の残基を欠くが、未改変のタンパク質の特異性および／または活性を持つ。「修飾された欠失タンパク質」はまた、低下した免疫原性または抗原性を有し得る。修飾された欠失タンパク質の一例は、少なくとも１つの抗原性領域（すなわち、特定の生物（例えば、修飾されたタンパク質が投与され得る生物のタイプ）において抗原性であると決定されたタンパク質の１つの領域）に由来するアミノ酸残基が欠失しているタンパク質である。

置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ）バリアントまたは置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）バリアントは、典型的にはタンパク質内の１つ以上の部位での、１つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含み、ポリペプチドの１つ以上の特性（特に、そのエフェクター機能および／または生体利用性）を調節するように設計され得る。置換は保存的である、すなわち１つのアミノ酸が類似する形状および電荷を持つもので置き換えられている場合も、またそうではない場合もある。保存的置換は当該分野で周知であり、これには例えば、以下の変化が含まれる：アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへ。

欠失または置換に加えて、修飾されたタンパク質は残基の挿入を持つ場合があり、これには典型的には、ポリペプチドの中の少なくとも１つの残基の付加が含まれる。これには、標的化ペプチドもしくはポリペプチド、または単に１つの残基の挿入が含まれ得る。融合タンパク質と呼ばれる末端付加は以下で議論される。

用語「生物学的に機能的に等価」は、当該分野で十分に理解されており、本明細書中でさらに詳細に定義される。したがって、天然のポリペプチドのアミノ酸に対して同一または機能的に等価であるアミノ酸の約７０％〜約８０％、または約８１％〜約９０％、さらには約９１％〜約９９％を有している配列が、そのタンパク質の生物学的活性が維持される限りにおいて含まれる。修飾されたタンパク質は、その天然の対応物と生物学的に機能的に等価であり得る。

アミノ酸配列および核酸配列に、さらなる残基（例えば、さらなるＮ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸、または５’配列もしくは３’配列）が含まれる場合があり、それでもなお、本質的には、その配列が、タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む上記に示された基準を満たす限りは、本明細書中で開示される配列のうちの１つの中に示されるものであることも、理解されるであろう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’部分もしくは３’部分のいずれかに隣接している様々な非コード配列を含み得るか、または、遺伝子内に存在することが知られている様々な内部配列（すなわち、イントロン）を含み得る核酸配列に適用される。

以下は、等価であるか、またはなおさらには改良された第２世代の分子を作製するための、タンパク質のアミノ酸の変化に基づく議論である。例えば、特定のアミノ酸を、構造（例えば、基質分子に対する結合部位）との相互作用による結合能力の感知できるほどの喪失を伴って、または伴わずに、タンパク質構造中の他のアミノ酸で置換することができる。そのタンパク質の生物学的機能的活性を定義するものが、タンパク質の相互作用能力および性質であるので、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列中、およびその根底にあるＤＮＡコード配列中に作製することができ、それでもなお、類似する特性を持つタンパク質が生じる。したがって、以下で議論されるように、それらの生物学的有用性または活性の感知できるほどの喪失を伴わない様々な変化を、遺伝子のＤＮＡ配列中に作製することができることが、本発明者らにより想定される。タンパク質様分子は、以下の「相同性の基準」が満たされる場合には、第２のタンパク質様分子に対して「相同性」を有するか、または「相同である」と考えられる：１）タンパク質様分子の少なくとも３０％が第２のタンパク質様分子と同じ位置に配列同一性を有する；２）第２のタンパク質様分子と同じ位置に、ある程度の配列同一性が存在し、同一ではない残基では、本明細書中に記載される場合には、それらのうちの少なくとも３０％が第２のタンパク質様分子と保存的に異なる；または、３）タンパク質様分子の少なくとも３０％が第２のタンパク質様分子と配列同一性を有するが、同一である残基の間に同一ではない残基のギャップが存在する可能性がある。本明細書中で使用される場合は、用語「相同」は、分子全体ではなくタンパク質様分子の１つの領域にも同様に適用することができる。用語「相同性」または「相同」は数により定性化され（例えば、「５０％の相同性」または「５０％相同」）、その後、１）、２）、および３）に関する相同性の基準が、「少なくとも３０％」から「少なくとも５０％」までで調節される。したがって、２つのタンパク質様分子またはタンパク質様分子の複数の部分の間に、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の相同性が存在し得ることが想定される。

あるいは、修飾されたポリペプチドは、未修飾のポリペプチドに対して、または配列番号２もしくは配列番号４〜３１のいずれかを含む本明細書中に開示される任意のポリペプチド配列に対して、特定の割合（％）の同一性を有するとして特性決定することができる。同一性の割合（％）は、２つのタンパク質様分子またはタンパク質様分子の複数の部分の間で、多くとも、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（あるいはそれらから導くことができる任意の範囲）であり得る。上記で議論される同一性の割合（％）が、ポリペプチドの未修飾の領域と比較したポリペプチドの特定の領域に関係し得ることが想定される。例えば、ポリペプチドには、修飾されたＦｃドメインまたは変異体Ｆｃドメインが含まれ得る。これらは、同じ種に由来する未修飾のＦｃドメインまたは変異体Ｆｃドメインに対する、修飾されたＦｃドメインまたは変異体Ｆｃドメインのアミノ酸配列の同一性に基づいて特性決定することができる。例えば、未修飾のＦｃドメインに対して９０％の同一性を有していると特性決定された修飾されたヒトＦｃドメインまたは変異体ヒトＦｃドメインは、そのドメイン中のアミノ酸の９０％が未修飾のヒトＦｃドメイン（配列番号２）中のアミノ酸と同一であることを意味する。

そのような変化を作製することにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指数が考慮される場合がある。タンパク質に対して相互作用性の生物学的機能を付与する疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は当該分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次いで、そのタンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を決定すると認められている。

類似するアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効となり得ることもまた当該分野で理解されている。引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第４，５５４，１０１号には、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の最大の局所平均親水性（ｌｏｃａｌ ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）がタンパク質の生物学的特性と関係していることが記載されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。

アミノ酸を類似する親水性値を有している別のアミノ酸で置換することができ、なおも生物学的に等価であり免疫学的に等価なタンパク質が生じることが理解される。このような変化においては、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内にあるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおさらに特に好ましい。

上記で概説されたように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。様々な上記特徴を考慮する例示的な置換は当業者に周知であり、これには、アルギニンおよびリジン；グルタミンおよびアスパルギン；セリンおよびスレオニン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；ならびに、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。

それに対してＦｃドメインが結合する様々なＦｃ受容体が当該分野で周知であり、受容体のいくつかの例が表１において以下に列挙される。

上記で議論されたように、ポリペプチドには、ＦｃＲポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていない抗体Ｆｃドメインが含まれる場合がある。いくつかの態様においては、上記グリコシル化されていないＦｃドメインは、生理学的条件下でＦｃＲポリペプチドに対して特異的親和性を有しているとしてさらに定義され得る。例えば、Ｆｃドメインは、生理学的条件下で約１０^−６Ｍ〜約１０^−９Ｍの間の平衡解離定数を有し得る。いくつかの態様においてはさらに、グリコシル化されていないＦｃドメインは、野生型配列（例えば、ヒトの野生型配列）と比較して１つ以上のアミノ酸置換または挿入を含むと定義することができる。

そのようなポリペプチドを調製する手段としては、引用により本明細書中に組み入れられるＷＯ２００８／１３７４７５において議論されているものが挙げられる。あるいは、例えば、既知のＦｃバックグラウンドの中に選択されたアミノ酸置換または挿入を導入することにより、遺伝子操作技術によって直接そのようなポリペプチドを調製することもできる。この場合、上記挿入または置換により、グリコシル化されていないＦｃ領域に対する改善されたＦｃＲ結合能力がもたらされる。本発明者らは、そのような改善されたＦｃＲ結合を得るために特に好ましい置換として、Ｆｃドメインの３３１位、３８２位、および／または４２８位の置換を同定し（例えば、Ｎａｇａｏｋａ ａｎｄ Ａｋａｉｋｅ ２００３を参照のこと；引用により本明細書中に組み入れられる米国特許公開番号ＵＳ２００６０１７３１７０に示されているような、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン配列のＰ３３１、Ｅ３８２、および／またはＭ４２８）、Ｐ３３１Ｌ、Ｅ３８２Ｖ、Ｍ４２８Ｉ、またはＭ４２８Ｌにより定義される１つ以上の置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）がなおさらに好ましい。

以下の表５および６に記載される置換に加えて、ポリペプチドは、以下のような、Ｆｃドメインの４２６位、２２９位、３２２位、３５０位、３６１位、３７２位、４４２位、４０２位、２２４位、４３０位、２３８位、４３６位、３１０位、３１３位、３８４位、３７２位、３８０位、または３３１位の１つ以上を含む置換を有し得る：ヒトＩｇＧ ＦｃドメインのＳ４２６、Ｃ２２９、Ｋ３２２、Ｔ３５０、Ｎ３６１、Ｆ３７２、Ｓ４４２、Ｇ４０２、Ｈ２２４、Ｅ４３０、Ｐ２３８、Ｙ４３６、Ｈ３１０、Ｗ３１３、Ｎ３８４、Ｆ３７２、Ｅ３８０、またはＰ３３１。特に好ましい例は以下である：ａ）Ｅ３８２およびＭ４２８；ｂ）Ｎ３６１、Ｅ３８２、およびＭ４２８；ｃ）Ｎ３６１、Ｆ３７２、Ｅ３８２、およびＭ４２８；ｄ）Ｈ３１０、Ｋ３２２、Ｔ３５０、Ｅ３８２、Ｓ４２６、およびＳ４４２；ｅ）Ｃ２２９Ｒ、Ｅ３８２、およびＭ４２８；ｆ）Ｗ３１３およびＭ４２８；ｇ）Ｅ３８２、Ｎ３８４、およびＭ４２８；ｈ）Ｅ３８０、Ｅ３８２、およびＮ３８４；ｉ）Ｎ３６１、Ｅ３８２、およびＭ４２８；ｊ）Ｅ３８２、Ｍ４２８、およびＹ４３６；ｋ）Ｐ２３８、Ｅ３８２、Ｓ４２６、Ｍ４２８、およびＥ４３０；１）Ｅ３８０、Ｅ３８２、Ｎ３８４、Ｓ４２６、Ｍ４２８、およびＥ４３０；ｍ）Ｅ３８２、Ｓ４２６、Ｍ４２８、およびＥ４３０；ｎ）Ｈ２２４、Ｅ３８２、Ｓ４２６、Ｍ４２８、およびＥ４３０；ｏ）Ｐ３３１；ｐ）Ｓ２３９、Ｉ２５３、Ｑ３４７、Ｅ３８２；ｑ）Ｅ３８２、Ｇ４０２、およびＭ４２８；ならびにｒ）Ｅ３８２、Ｐ３３１、およびＭ４２８。特定の置換としては以下が挙げられる：ａ）Ｅ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ；ｂ）Ｅ３８２Ｖ；ｃ）Ｎ３６１Ｄ、Ｅ３８２Ｖ、およびＭ４２８Ｉ；ｄ）Ｎ３６１Ｄ、Ｆ３７２Ｌ、Ｅ３８２Ｖ、およびＭ４２８Ｉ；ｅ）Ｈ３１０Ｙ、Ｋ３２２Ｒ、Ｔ３５０Ａ、Ｅ３８２Ｖ、Ｓ４２６Ｔ、およびＳ４４２Ｐ；ｆ）Ｃ２２９Ｒ、Ｅ３８２Ｖ、およびＭ４２８Ｉ；ｇ）Ｗ３１３Ｒ、およびＭ４２８Ｉ；ｈ）Ｅ３８２Ｔ、Ｎ３８４Ｄ、およびＭ４２８Ｉ；ｉ）Ｅ３８０Ｒ、Ｅ３８２Ｍ、およびＮ３８４Ｅ；ｊ）Ｎ３６１Ｓ、Ｅ３８２Ｖ、およびＭ４２８Ｉ；ｋ）Ｅ３８２Ｖ、Ｍ４２８Ｉ、およびＹ４３６Ａ；１）Ｐ２３８Ｓ、Ｅ３８２Ｖ、Ｓ４２６Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、およびＥ４３０Ｈ；ｍ）Ｅ３８０Ｄ、Ｅ３８２Ｖ、Ｎ３８４Ｒ、Ｓ４２６Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、およびＥ４３０Ｄ；ｎ）Ｅ３８２Ｖ、Ｓ４２６Ｉ、Ｍ４２８Ｌ、およびＥ４３０Ｓ；ｏ）Ｈ２２４Ｒ、Ｅ３８２Ｖ、Ｓ４２６Ｔ、Ｍ４２８Ｓ、およびＥ４３０Ｐ；ｐ）Ｐ３３１Ｌ；ｑ）Ｓ２３９Ｌ、Ｉ２５３Ｔ、Ｑ３４７Ｌ、Ｅ３８２Ｖ；ｒ）Ｅ３８２Ｖ、Ｇ４０２Ｄ、およびＭ４２８Ｉ；ならびにｓ）Ｅ３８２Ｖ、Ｐ３３１Ｌ、およびＭ４２８Ｉ。

さらなるアミノ酸が挿入されると改善されたＦｃＲ結合能力をもたらす、様々な挿入点がＦｃドメイン中に存在し得る。５〜１５アミノ酸の挿入が想定される。いくつかの実施形態においては、１０アミノ酸が、例えば、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン）のアミノ酸Ｎ２９７とＳ２９８との間に挿入される。この位置での具体的な挿入（ならびに置換）としては、以下が挙げられる：ａ）ＲＴＥＴＰＶＹＭＶＭ（配列番号７９）；ｂ）ＷＱＶＦＮＫＹＴＫＰ（配列番号８０）；ｃ）ＬＧＤＧＳＰＣＫＡＮ（配列番号８１）；ｄ）Ｆ２４１ＬおよびＫ３２６ＥとともにＥＶＰＬＶＷＭＷＶＳ（配列番号８２）；ならびにｅ）Ｖ２８２ＡとともにＥＱＷＧＳＱＦＧＣＧ（配列番号８３）。

Ｆｃドメインは、ＩｇＧ ＦｃドメインのＥ３８２に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ Ｆｃであり得る。さらに、グリコシル化されていないＦｃドメインには、ＩｇＧ ＦｃドメインのＥ３８２に対応するアミノ酸残基に隣接してアミノ酸配列の挿入（例えば、約１〜５アミノ酸）が含まれる場合がある。したがって、いくつかの特異的な態様においては、Ｆｃドメインには、ＥからＶへの置換のようなＥ３８２位での疎水性アミノ酸置換が含まれる場合がある。さらに、いくつかの態様においては、本発明のＦｃドメインには、ヒトＩｇＧ ＦｃのＭ４２８（例えば、Ｍ４２８からＩ）、Ｓ４２６、Ｃ２２９、Ｈ３１０、Ｋ３２２、Ｔ３５０、Ｎ３６１、Ｆ３７２、またはＳ４４２に対応する残基でのアミノ酸置換が含まれ得る。特定の特異的な実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインに、引用により本明細書中に組み入れられるＷＯ２００８／１３７４７５に記載されているように、Ｆｃｌ１の中で見られるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換が含まれ得る。したがって、極めて特異的な場合には、グリコシル化されていないＦｃドメインに配列番号２のアミノ酸配列が含まれ得る（Ｆｃ５）。

いくつかの実施形態においては、グリコシル化されていないＦｃドメインに、ＦｃＲ（例えば、ヒトＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃαＲＩ、またはＣ１ｑ）に対する特異的結合親和性が含まれる。したがって、いくつかの態様においては、本発明のグリコシル化されていないＦｃドメインは、ＦｃγＲＩａに対して特異的親和性を持つＦｃドメインと定義される。さらに、そのようなＦｃドメインは、生理学的条件下で約１０^−６Ｍ〜約１０^−９ＭのＦｃγＲＩａ結合に関する平衡解離定数を有していると定義され得る。

Ｂ．異種領域を持つ修飾された抗体およびタンパク質様化合物
複数の実施形態が、２つ以上の自然界に存在しているかまたは天然のポリペプチドあるいはタンパク質に由来するアミノ酸配列を含むことができるタンパク質様化合物に関係する。上記で議論された実施形態は、このセクションにも適用されると想定され、その逆も想定される。例えば、修飾された抗体は、抗原結合ドメインを持つ修飾されたＦｃドメインを含む抗体である。さらに、抗体は、２つの異なる抗原結合領域（例えば、２つの重鎖のそれぞれの上にある異なる領域）を有し得る。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態においては、複数の異種ペプチドおよび／またはポリペプチド（「異種」は、それらが同じポリペプチドには由来しないことを意味している）を含むポリペプチドが存在する。タンパク質様化合物または分子は、例えば、抗体由来ではないタンパク質結合領域を持つ修飾されたＦｃドメインを含み得る。いくつかの実施形態においては、細胞表面受容体に結合するタンパク質結合領域を持つ修飾されたＦｃドメインを含むポリペプチドが存在する。複数の機能的ドメインを含むこれらのタンパク質様分子は、互いに化学的に結合した２つ以上のドメインである場合があり、また、これは、同じ核酸分子によりコードされる２つ以上のポリペプチドの融合タンパク質である場合もある。タンパク質またはポリペプチドが、２つ以上の異種ポリペプチド全体あるいはそれらの一部を含み得ると想定される。

したがって、マルチポリペプチドタンパク質様化合物は、第１のポリペプチド全体またはその一部と、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、第４のポリペプチド、第５のポリペプチド、第６のポリペプチド、第７のポリペプチド、第８のポリペプチド、第９のポリペプチド、第１０のポリペプチド、またはさらなるポリペプチドの全体またはその一部から構成され得る。

抗体の抗原結合ドメインまたは領域とグリコシル化されていないＦｃドメインを有しているポリペプチドあるいはタンパク質（抗体を含む）は、以下の標的のリストに属しているタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフ、および／またはエピトープを含むがこれらに限定されない任意の抗原あるいはエピトープに対して使用することができる：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレッシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、α−１−抗トリプシン、α−Ｖ／β−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘ１、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３オステオゲニン、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰｓ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／ＺＩＰ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬｌ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲｌ、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、Ｄｎａｓｅ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、第ＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩｃ因子、第ＩＸ因子、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルキン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−α１、ＧＦＲ−α２、ＧＦＲ−α３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血成長因子（ＨＧＦ）、ＨｅｐＢ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量の黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＭ）、ＨＩＶ ｇｐｌ２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様成長因子１、インテグリンα２、インテグリンα３、インテグリンα４、インテグリンα４／β１、インテグリンα４／β７、インテグリンα５（αＶ）、インテグリンα５／β１、インテグリンα５／β３、インテグリンα６、インテグリンβ１、インテグリンβ２、インターフェロンγ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在型ＴＧＦ−１、潜在型ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、Ｌｅｆｔｙ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺表面活性物質、黄体形成ホルモン、リンホトキシンβ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＡＳＥＳ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−α、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制因子（Ｍｕｅｌｌｅｒｉａｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリリシン、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン−４、またはニュートロフィン−６、ニュールツリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−β、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰＩＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロリラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマチ因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体α／β）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣性ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ＰＬＡＰ−ｌｉｋｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β（Ｐａｎ特異的）、ＴＧＦ−β ＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−β ＲＩＩ、ＴＧＦ−β ＲＩＩｂ、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５、トロンビン、胸線Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αβ、ＴＮＦ−β２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ
（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンドＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、Ｌｅｗｉｓ Ｙ関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｉｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびに、ホルモンおよび成長因子の受容体。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドまたはタンパク質は、１つ以上の細胞表面腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する。複数の方法および組成物が、ＡＤＣＣのために腫瘍細胞を標的化するために利用され得る。

ＦｃドメインはＦｃＲに結合することができる。しかし、Ｆｃドメインを含むポリペプチド上の抗原結合ドメインを介してのみならず、いくつかの他のタンパク質結合ドメインを介しても、ＡＤＣＣに対して指向させることができると想定される。結果として、複数の実施形態は、Ｆｃドメインと異種非抗原結合ドメインとに関係する。特定の実施形態においては、非抗原結合ドメインは細胞表面に結合する。したがって、これらの物質には、特異的標的細胞に結合することができる物質／タンパク質に対する化学的結合、またはそれらとの融合のいずれかが必要である。複数の実施形態には、表２に列挙されるタンパク質のいずれかの全体またはその一部に対して、グリコシル化されていないＦｃドメイン全体またはその一部を連結させることがさらに含まれる。複数の実施形態に、表２および本明細書中の記載の中で提供される例が含まれるが、これらに限定されるわけではないことが想定される。

受容体のリガンドは、その表面上にリガンドの受容体を発現する細胞を標的化するために利用され得る。リガンドとしてはまた、例えば、ＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β）、成長因子（ＶＥＧＦおよびサイトカイン（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン、およびそれらのバリアント）のような上記で議論されたものを含む）が挙げられる。

ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）の第２の細胞外ドメインをＶＥＧＦ受容体２の第３のドメイン（ＫＤＲ／ＦＩＫ−１）とＩｇＧ Ｆｃ領域とともに含むＶＥＧＦ Ｔｒａｐ融合タンパク質のような、複数のドメインを持つ実施形態もまた想定される。

１．融合タンパク質および複合タンパク質
挿入バリアントの特別な種は融合タンパク質である。この分子は、一般的には、第２のポリペプチド全体またはその一部に対してＮ末端またはＣ末端で連結された天然の分子全体またはその実質的な部分を有する。

複数の実施形態はまた、修飾されたタンパク質またはポリペプチドが形成するように、少なくとも１つの物質に連結させられる、複合ポリペプチド（例えば、翻訳されたタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド）にも関係する。診断用物質または治療用物質としての分子の有効性を高めるためには、少なくとも１つの所望される分子または部分に連結させる、または共有結合させる、または複合体化させることが一般的である。そのような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であり得るが、これらに限定されるわけではない。エフェクター分子は、所望される活性（例えば、細胞傷害性活性）を有している分子を含む。抗体に結合させられているエフェクター分子の限定ではない例としては、毒素、抗腫瘍薬、治療用酵素、放射線標識核種、抗ウイルス薬、キレート化剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分と定義される。抗体に結合させられているレポーター分子の限定ではない例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色された粒子またはリガンド（例えば、ビオチン）が挙げられる。

十分な選択性、特異性、または親和性の任意の抗体を、抗体結合体の基礎として利用することができる。そのような特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング方法論を使用して評価することができる。標準的な抗原結合部位に加えて、抗体分子中の生物学的活性分子への結合のための部位として、病原体、Ｂ細胞スーパー抗原、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４、およびＨＩＶ−１エンベロープに結合することができる可変ドメイン中に存在する部位が挙げられる（Ｓａｓｓｏら、１９８９；Ｓｈｏｒｋｉら、１９９１；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎｎら、１９９５；Ｃｌｅａｒｙら、１９９４；Ｌｅｎｅｒｔら、１９９０；Ｂｅｒｂｅｒｉａｎら、１９９３；Ｋｒｅｉｅｒら、１９９１）。加えて、可変ドメインは抗体の自己結合にも関与しており（Ｋａｎｇら、１９８８）、これには抗抗体により認識されるエピトープ（イディオトープ）が含まれる（Ｋｏｈｌｅｒら、１９８９）。

抗体結合体の特定の例は、抗体が検出可能な標識に連結させられた結合体である。「検出可能な標識」は、それらの特異的機能的特性、および／または化学的特性から検出することができ、その使用により、それらを検出しようとする抗体に結合することができる、および／またはさらには、所望される場合には定量化することができる、化合物ならびに／あるいはエレメントである。別のそのような例は、細胞傷害性物質または抗細胞性物質（ａｎｔｉ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）に連結させられた、「免疫毒素」と呼ぶことができる、抗体を含む結合体の形成である。

アミノ酸（例えば、選択的に切断可能なリンカー、合成のリンカー、または他のアミノ酸配列）を、タンパク質様部分を分けるために使用することができる。

Ｃ．タンパク質精製
実施形態のいくつかには組み換え体タンパク質が含まれるが、複数の実施形態には、修飾されたタンパク質と組み換え体タンパク質を含む、タンパク質を精製するための方法ならびにプロセスが含まれ得る。一般的には、これらの技術には、１つのレベルでの、細胞環境からポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への粗分画が含まれる。他のタンパク質からポリペプチドが分離されると、目的のポリペプチドを、部分的または完全な精製（または均質にするための精製）を達成するためのクロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用してさらに精製することができる。調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動法；等電点電気泳動法である。ペプチドの精製に特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたはさらにはＨＰＬＣである。加えて、そのような技術を実行する条件は、精製される分子の特性（例えば、機能的活性）に影響を及ぼし得る。

特定の態様は精製に関係し、具体的な実施形態においては、コードされるタンパク質またはペプチドの実質的な精製に関係する。用語「精製されたタンパク質またはペプチド」は、本明細書中で使用される場合は、他の成分から単離することができる１つの組成をいうように意図される。ここでは、タンパク質またはペプチドは、その自然界で得られる状態と比較して任意の程度に精製される。したがって、精製されたタンパク質またはペプチドはまた、それが自然界に存在し得る環境から離れたタンパク質またはペプチドをいう。「実質的に精製された」タンパク質またはペプチド
一般的には、「精製された」は、様々な他の成分を除去するための分画が行われたタンパク質またはペプチド組成物でをいい、この組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持している。用語「実質的に精製された」が使用される場合は、この標記は、タンパク質またはペプチドが組成物の主な成分を形成する、例えば、組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．２％、約９９．４％、約９９．６％、約９９．８％、約９９．９％またはそれ以上をそのタンパク質が占める組成物をいう。

タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための様々な方法が、本発明の開示を考慮して当業者に既知である。これらには、例えば、活性画分の比活性を測定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、これを最初の抽出物の比活性に対する活性に対して比較すること、これにより本明細書において「精製倍率」により評価される純度の程度を計算することである。活性の量を示すために使用される実際の単位は、もちろん、精製後に選択される特定のアッセイ技術と、発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。

タンパク質精製での使用に適している様々な技術は当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などでの沈殿、または熱変性、その後の遠心分離；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法；ならびにそのような技術と他の技術の組み合わせが含まれる。当該分野で一般的に公知であるように、様々な精製工程を実施する順序を変えることができること、または特定の工程を省略できる場合があること、およびそれでもなお、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法が生じると考えられる。

タンパク質またはペプチドが常にそれらの最も精製された状態で提供されることは、一般的な要件ではない。実際に、特定の実施形態においては、実質的にはほとんど精製されていない産物が有用性を有することが想定される。部分的な精製は、数種類の精製工程を組み合わせて使用することにより、または様々な形態の同じ一般的な精製スキームを利用することにより、達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、一般的には、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術よりも大きな精製「倍率」を生じることが理解されている。低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質生成物の全体的な回収率、または発現されたタンパク質の活性の維持において利点を有し得る。

ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの様々な条件によっては時に有意に変動し得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。したがって、様々な電気泳動条件下で、精製されたかまたは部分的に精製された精製発現産物の見かけの分子量が異なる可能性があることが理解されるであろう。

複数の方法および組成物と組み合わせたペプチドタグの使用もまた想定される。タグは、２つのポリペプチド間での相互作用を利用する。相互作用に関与している一方のポリペプチドの部分がタグとして使用され得る。例えば、グルタチオンビーズをＧＳＴタグを含む化合物について富化させるために使用できるように、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の結合領域がタグとして使用され得る。抗体またはＴ細胞受容体によって認識されるアミノ酸領域であるエピトープタグが使用され得る。融合タンパク質が核酸分子によりコードされるように、タグは、修飾されたタンパク質をコードする核酸セグメントに作動可能であるように連結される核酸セグメントによりコードされ得る。他の適切な融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチン、ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）などを持つものである。

ＩＶ．抗体Ｆｃライブラリー
多様な抗体Ｆｃドメインおよび／またはそのようなドメインを含む抗体の作製のための実施形態と組み合わせて利用することができる技術の例は、米国特許第５，８２４，５２０号に記載されている免疫グロブリン重鎖ライブラリーの発現のための技術と類似する技術を利用することができる。これまでに利用されたＦｃライブラリーは、引用により具体的に本明細書中に組み入れられるＷＯ２００８／１３７４７５の中で議論されている。

Ｖ．抗体Ｆｃドメインのスクリーニング
特定のＦｃＲに結合することができる分子を同定するための方法を含む実施形態が存在する。これらは、本明細書中、ならびにその全体が引用により本明細書中に具体的に組み入れられる、ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／１３７４７５に記載されている。スクリーニングされた結合ポリペプチドには、多様な候補のＦｃドメインの大きなライブラリーが含まれる場合があり、また代わりに、それらが標的リガンドに結合する可能性をさらに高くすると考えられる目的とする構造的寄与を用いて選択された特定のクラスのＦｃドメイン（例えば、操作された点変異またはアミノ酸の挿入）が含まれる場合もある。１つの実施形態においては、候補の結合タンパク質は完全な抗体、またはＦｃドメインを含むその断片または一部である。

標的リガンドに結合することができる候補のＦｃドメインを同定するためには、以下の工程を行うことができる：異なる抗体Ｆｃドメインを発現するグラム陰性細菌細胞の集団を提供する工程；細菌またはファージと、抗体に接触することができる少なくとも１つの第１の標識または固定化された標的リガンド（ＦｃＲポリペプチド）を混合する工程、および標的リガンドに結合することができる分子を発現する少なくとも１つの第１の細菌を同定する工程。

上記方法のいくつかの態様においては、抗体Ｆｃドメインと標識されたＦｃＲポリペプチドとの間での結合は、細菌細胞の拡散を妨げるであろう。この方法で、標識されたリガンドの分子を、透過化された外膜を含む細菌のペリプラズムの中に保持することができる。あるいは、Ｆｃドメインは内膜と会合することが示されているので、ペリプラズムを除去し、それにより、Ｆｃドメインが結合した候補分子の保持を生じることができる。その後、標識を、ＦｃＲポリペプチドに結合できる結合ポリペプチドを発現する細胞、およびこの方法では、単離されたＦｃドメインポリペプチドをコードする遺伝子を単離するために使用することができる。次いで、標的リガンドに結合することができる分子が、インビボまたはエキソビボでの発現方法を使用して大量に産生され得、その後、任意の所望される用途（例えば、診断用途または治療用途）に使用され得る。さらに、同定された単離された抗体Ｆｃドメインが、抗原結合ドメインを含む抗体断片または全長抗体を構築するために使用され得ることが理解されるであろう。

さらなる実施形態においては、本発明の細菌の産生のための方法には、少なくとも２回の選択（工程ｃ）が含まれる。ここでは、第１回目の選択において得られた細菌細胞のサブ集団について、ＦｃＲに対する候補の抗体Ｆｃドメインの結合に基づく少なくとも第２回目の選択が行われる。さらに、いくつかの態様においては、第１回目の選択において得られた細菌細胞のサブ集団を、（細胞の総数を増加させるために）第２回目の選択の前に許容条件下で増殖させることができる。したがって、いくつかの態様においては、複数の方法に、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の回数の選択が含まれ得る。さらに、いくつかの態様においては、それぞれの回の選択により得られた細菌細胞のサブ集団が、続く回の選択の前に許容条件下で増殖させられるであろう。１回以上のそのような選択後に単離された細胞は、変異誘発のさらなる回に供され得る。いくつかの場合には、選択は、抗体に結合していないＦｃＲポリペプチドを除去した後に行われるであろう。さらに、いくつかの場合には、選択のストリンジェンシーは、抗体を提示する細菌を含む溶液のｐＨ、塩濃度、または温度を調節することにより変えることができる。したがって、いくつかの態様においては、本発明の細菌細胞を、約２５℃のような生理学的温度より低い温度（ｓｕｂ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で増殖させることが好ましい場合がある。

なおさらなる態様においては、本発明の細菌細胞を産生する方法はさらに、少なくとも第１のＦｃＲに結合するＦｃドメインをコードする核酸配列を産生する方法として定義することができる。したがって、本明細書中の方法により産生された細菌細胞は、ＦｃＲポリペプチドに対して特異的親和性を有しているＦｃドメインをコードする核酸配列をクローニングするために使用することができる。細胞からそのような核酸を単離し、増幅させるための方法（例えば、ＰＣＲによる）は当該分野で周知であり、以下にさらに記載される。したがって、上記方法により産生された核酸配列は、本発明の一部として含まれる。さらに、そのような配列は、ＦｃＲに対して特異的親和性を有しているＦｃドメインを産生させるために、細胞中で発現させることができる。したがって、いくつかの態様においては、本発明は、ＦｃＲに対して特異的親和性を有しているＦｃドメインを産生するための方法を提供する。さらに、本発明には、本発明の方法により産生された抗体Ｆｃドメインが含まれる。しかし、そのようなスクリーニングにより産生された抗体Ｆｃドメインを、特定の標的リガンドに対して親和性を有している抗体可変領域と組み合わせることができること、これらの抗体もまた本発明の一部として含まれることが理解されるであろう。

Ａ．Ｆｃドメインのコード配列のクローニング
抗体Ｆｃまたは他の結合タンパク質の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ＆ Ｐｏｌｌａｒｄ（１９８０）のスキャッチャード解析により決定することができる。あるいは、結合親和性は、表面プラズモン共鳴、またはタンパク質：タンパク質相互作用について速度論および平衡定数を決定するための任意の他の周知の方法により決定することができる。所望される特異性、親和性、および／または活性の分子を産生する細菌細胞が同定された後、対応するコード配列をクローニングすることができる。この方法では、上記分子をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、抗体または結合タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合することができる遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）単離し、配列決定することができる。

一旦単離されると、抗体ＦｃドメインＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、これをその後、細菌のような宿主細胞にトランスフェクトすることができる。上記ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインの配列の付加により、あるいは、免疫グロブリンではないポリペプチドのコード配列全体またはその一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、修飾することができる。そのような方法で、所望される結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」結合タンパク質が調製される。例えば、同定された抗体Ｆｃドメインは、治療用ポリペプチドまたは毒素に融合させられる場合があり、また、特定のＦｃＲを発現する標的細胞に対して（インビトロまたはインビボで）使用される場合もある。

キメラまたはハイブリッドＦｃドメインはまた、合成タンパク質化学反応（架橋剤を含む化学反応を含む）において公知の方法を使用してインビトロで調製することもできる。例えば、標的化された毒素を、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成させることにより構築することができる。この目的に適している試薬の例としては、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。

核酸を、生存細胞から、また非生存細胞からもクローニングできることは当業者に理解されるであろう。非生存細胞の場合には、例えば、（例えば、ＰＣＲを使用する）クローニングされたＤＮＡの増幅を使用することが所望され得る。これはまた、細胞のさらなる増殖を伴って生存細胞を使用して行われる場合があり、また、細胞のさらなる増殖を伴わずに生存細胞を使用して行われる場合のいずれもがある。

Ｂ．標識されたリガンド
１つの実施形態においては、標識されたＦｃＲポリペプチドに対して親和性を有するＦｃドメインが単離される。本発明のグラム陰性細菌のペリプラズム膜の透過化および／または除去により、あらゆる大きさである可能性がある標識されたリガンドをスクリーニングすることができる。ペリプラズム膜の除去を行わない場合には、リガンドが細菌のペリプラズム膜を通過して効率よく拡散できるようにするために、標識されたリガンドが５０，０００Ｄａ未満の大きさであることが通常は好ましいであろう。

上記で示されたように、１つ以上の検出可能な物質（単数または複数）で標識されたＦｃＲポリペプチドを提供することが通常は望ましいであろう。これは、結合体が形成するように、例えば、少なくとも１つの検出可能な物質に対してリガンドを連結させることにより行うことができる。例えば、少なくとも１つの検出可能な分子または部分に連結させる、共有結合させる、または複合体化させることが一般的である。「標識」または「検出可能な標識」は、その使用により、それが結合したリガンドを検出し、および／またはさらには所望される場合には定量化することが可能となる、特別な機能的特性および／または化学的特性により検出することができる化合物ならびに／あるいはエレメントである。使用することができる標識の例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発色分子、光親和性分子、着色された粒子、またはビオチンのようなリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の１つの実施形態においては、視覚的に検出可能なマーカーが使用される。その結果、その標識についての細胞の自動スクリーニングを行うことができる。具体的には、蛍光標識が、これらが所望される結合タンパク質または抗体を発現する細胞の単離にフローサイトメトリーを使用することを可能にするので、有用である。適切な機器を用いて視覚により検出することができる物質の例は、所望されるリガンドに対するそれらの結合についての方法と同様に、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；および同第４，４７２，５０９号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。そのような物質としては、常磁性イオン；放射性同位体；発蛍光団；ＮＭＲにより検出可能な物質、およびＸ線画像化法のための物質を挙げることができる。

別のタイプのＦｃＲ結合体は、リガンドが、色素形成性基質と接触すると着色された生成物を生じるであろう第２の結合分子に対しておよび／または酵素に対して（酵素タグ）連結される場合である。そのような酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。そのような例においては、選択された細胞が依然生存可能であることが所望されるであろう。好ましい第２の結合リガンドは、ビオチンおよび／またはアビジン、ならびにストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。

アジド基を含む分子もまた、弱い紫外線により発生する反応性ナイトレン中間体を通じてタンパク質に対して共有結合を形成させるために使用することができる（Ｐｏｔｔｅｒ ＆ Ｈａｌｅｙ，１９８３）。具体的には、プリンヌクレオチドの２−アジドアナログおよび８−アジドアナログが、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的フォトプローブ（ｐｈｏｔｏｐｒｏｂｅ）として使用されている（Ｏｗｅｎｓ ＆ Ｈａｌｅｙ、１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８５）。２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドはまた、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎら、１９８９；Ｋｉｎｇら、１９８９；およびＤｈｏｌａｋｉａら、１９８９）、そして、リガンド結合剤として使用することができる。

標識化は、当業者に周知である任意の技術によって行うことができる。例えば、ＦｃＲポリペプチドは、リガンドを、所望される標識および化学酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）または酵素的酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ）と接触させることによって標識することができる。同様に、リガンド交換プロセスが使用され得る。あるいは、直接標識化技術は、例えば、標識、還元剤（例えば、ＳＮＣｌ_２）、緩衝溶液（例えば、ナトリウム−カリウムフタレート溶液）、およびリガンドをインキュベーションすることによって使用され得る。リガンド上の中間官能基（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）もまた、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の存在下でリガンドに標識を結合させるために使用することができる。

リガンドのその結合体部分への結合または結合体化のための他の方法もまた、当該分野で公知である。いくつかの結合方法は、リガンドに結合させられた有機キレート剤（例えば、無水ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−３α−６α−ｄｉｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｏｕｒｉｌ−３）の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号、それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）。ＦｃＲポリペプチドはまた、カップリング剤（例えば、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩）の存在下で、酵素と反応させることができる。蛍光マーカーとの結合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製することができる。米国特許第４，９３８，９４８号において、乳癌の画像化はモノクローナル抗体を使用して達成され、そして、検出可能な画像化部分は、リンカー（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート）を使用して抗体に結合させられる。なおさらなる態様においては、ＦｃＲポリペプチドを、レポータータンパク質（例えば、上記のような酵素）または蛍光タンパク質に融合させることができる。

適切な蛍光リガンドを用いて、ペリプラズムで発現されるタンパク質を特異的に標識化する能力はまた、ライブラリースクリーニング以外の用途を有する。蛍光リガンドでの特異的標識化およびフローサイトメトリーは、タンパク質の製造の際のＦｃドメインの産生をモニタリングするために使用することができる。

一旦、Ｆｃドメインが単離されると、結合体を形成させるために、分子を少なくとも１つの物質に連結して、この分子の有用性を高めることが所望され得る。例えば、診断薬または治療薬としてのＦｃドメインあるいは抗体分子の有効性を高めるためには、少なくとも１つの所望される分子または部分に連結させる、または共有結合させる、または複合体化させることが一般的である。このような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクター分子またはレポーター分子であり得るが、これらに限定されない。エフェクター分子には、所望される活性（例えば、細胞傷害活性）を有している分子が含まれる。抗体へ結合させられるエフェクター分子の限定ではない例として、以下が挙げられる：毒素、抗腫瘍薬、治療用酵素、放射性標識ヌクレオチド、抗ウイルス薬、キレート剤、サイトカイン、成長因子、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる任意の部分として定義される。そのような分子を標識化するための技術は当業者に公知であり、そして、本明細書中で上記に記載されている。

次いで、本発明に従って調製された標識化された結合タンパク質（例えば、Ｆｃドメイン）はまた、例えば、生物学的成分（例えば、タンパク質（単数または複数）、ポリペプチド（単数または複数）、またはペプチド（単数または複数））の結合、精製、除去、定量、および／または、別の一般的な検出のための免疫検出方法において利用され得る。いくつかを挙げると、いくつかの免疫検出法として、少し言及すると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウェスタンブロット法が挙げられる。様々な有用な免疫検出法の工程は、以下のような科学技術文献に記載されている：例えば、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ａｎｄ Ｂｅｎ−Ｚｅｅｖ，１９９９；Ｇｕｌｂｉｓ ａｎｄ Ｇａｌａｎｄ Ｐ、１９９３；およびＤｅ Ｊａｇｅｒ Ｒら、１９９３（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）。このような技術として、結合アッセイ（例えば、当該分野で公知である、様々なタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および／または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が、挙げられる。

Ｆｃドメイン分子（抗体を含む）はまた、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、研究のために調製された新鮮凍結された、および／またはホルマリン固定され、パラフィンに包埋された組織ブロックと組み合わせて利用され得る。これらの粒子検体から組織ブロックを調製する方法は、種々の予後因子に関するこれまでのＩＨＣ研究においてうまく使用されており、そして／または当業者に周知である（Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら、１９９０）。

ＶＩ．フローサイトメトリーを用いる自動スクリーニング
本発明の１つの実施形態においては、蛍光活性化細胞選別（（ＦＡＣＳ）スクリーニング、または他の自動フローサイトメトリー技術を、Ｆｃドメインに結合した標識されたリガンドを含む細菌細胞の効率的な単離のために使用することができる。フローサイトメトリーを実施するための機器は当業者に公知であり、そして市販されている。そのような機器の例として、以下が挙げられる：ＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から）、Ｅｐｉｃｓ Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｈｉａｌｅａｈ、Ｆｌａ．）から）ならびにＭＯＦＬＯ（商標）（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏ）から）。

一般的に、フローサイトメトリー技術には、液体試料中の細胞または他の粒子の分離が含まれる。典型的には、フローサイトメトリーの目的は、分離された粒子を、それらの１つ以上の特性（例えば、標識されたリガンドまたは他の分子の存在）について分析することである。フローサイトメトリーの基本的な工程は、装置を通る液体試料の方向に関係し、その結果、液体の流れが検出領域を通り抜ける。粒子は、センサーによって１度に１つずつ通過するものとし、そして、大きさ、屈折、光散乱、不透明度、粗度、形状、蛍光などに基づいて分類される。

細胞の迅速な定量分析が生物医学的研究および医療において有用であることを証明する。装置は、１秒あたり数千個の細胞の速度で、細胞特性の定量的多パラメーター分析をすることができる。これらの機器は、細胞型間を区別する能力を提供する。多くの場合、データは、測定された変数の１次元度数分布（ヒストグラム）または２次元度数分布（輪郭プロット、散布図）で表示される。多パラメーターデータファイルの分配には、対話型（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）の１次元図表プログラムまたは２次元図表プログラムの継続的使用が含まれる。

迅速な細胞検出のための多パラメーターフローサイトメトリーデータの定量分析は、以下の２つの段階からなる：細胞のクラスの特性決定と試料の処理。一般に、細胞のクラスの特性決定のプロセスは、細胞の特徴を、目的の細胞と目的ではない細胞とに分配する。その後、試料の処理において、各細胞が、それらが分類される領域に従って、２つのカテゴリーのうちの一方に分類される。細胞のクラスの分析は、非常に重要である。なぜなら、高い検出性能は、細胞の適切な特性が取得される場合にしか期待できないからである。

フローサイトメトリーによっては、細胞分析が実施されるだけでなく、細胞の分別も行われる。米国特許第３，８２６，３６４号には、粒子（例えば、機能的に異なる細胞のタイプ）を物理的に分離する装置が開示されている。この機械では、レーザーは、適切なレンズまたはレンズシステムによって粒子の流れに集められた照明を提供し、その結果、その中に、粒子からの高度に限局化させられた散乱が存在する。加えて、強度照明光源は、流れの中での蛍光粒子の励起のために、粒子の流れに向けられる。この流れの中の特定の粒子を選択的に帯電させ、次いで、これら粒子を指定されるレセプタクルへ偏向させることによって分離することができる。この分離の古典的な形態は蛍光タグ化抗体を介するものであり、この蛍光タグ化抗体は、分離のために、１つ以上の細胞のタイプに印を付けるために使用される。

フローサイトメトリーの他の方法として、以下に記載されている方法を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない：米国特許第４，２８４，４１２号、同第４，９８９，９７７号、同第４，４９８，７６６号、同第５，４７８，７２２号、同第４，８５７，４５１号、同第４，７７４，１８９号、同第４，７６７，２０６号、同第４，７１４，６８２号、同第５，１６０，９７４号および同第４，６６１，９１３号（これらの開示のそれぞれが、引用により本明細書中に組み入れられる）。

本発明についてのフローサイトメトリーの重要な局面は、複数回のスクリーニングを連続して行うことができることである。細胞は、最初の回の選別により単離することができ、すぐにフローサイトメーターに再度導入され、スクリーンのストリンジェンシーを改善するために再びスクリーニングされ得る。当業者に公知である別の利点は、非生存細胞をフローサイトメトリーを使用して回収できることである。フローサイトメトリーは本質的には粒子選別技術であるので、増殖または繁殖する細胞の能力は必要ない。そのような非生存細胞からの核酸の回収のための技術は当該分野で周知であり、これには例えば、ＰＣＲを含む鋳型依存性増幅技術の使用が含まれ得る。

ＶＩＩ．フローサイトメトリーを用いる自動スクリーニング
核酸に基づく発現システムは、組み換え体タンパク質の発現のための本発明の特定の実施形態において用途が見出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態には、抗体Ｆｃドメイン、または好ましくは、複数の異なるＦｃドメインのコード配列でのグラム陰性細菌の形質転換が含まれる。

ＶＩＩＩ．核酸に基づく発現システム
核酸に基づく発現システムは、組換えタンパク質の発現のための本発明の特定の実施形態において用途が見出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態は、抗体Ｆｃドメイン、または好ましくは、複数の異なるＦｃドメインのコード配列でのグラム陰性細菌の形質転換が含まれる。

Ａ．核酸送達の方法
本発明の特定の態様は、標的細胞（例えば、グラム陰性細菌）への核酸の送達を含み得る。例えば、細菌宿主細胞は、ＦｃＲに結合する可能性がある候補Ｆｃドメインをコードする核酸で形質転換され得る。本発明の特定の実施形態においては、発現を細菌のペリプラズムに標的化することが所望され得る。真核生物宿主細胞の形質転換は同様に、標的リガンドに結合できるとして同定される様々な候補分子の発現において用途が見出され得る。

細胞の形質転換のための核酸送達に関する適切な方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を、そのような細胞に、またはさらにはその細胞小器官にさえも導入できる、実質的に任意の方法を含むと考えられる。このような方法としては以下のようなＤＮＡの直接送達が挙げられるが、これらに限定されない：注入（米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号、それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）（マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号、引用により本明細書中に組み入れられる）を含む）；エレクトロポレーション（米国特許第５、３８４、２５３号、引用により本明細書中に組み入れられる）；リン酸カルシウム沈澱（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストランと、それに続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；直接の音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｎｉｃ ｌｏａｄｉｎｇ）（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）；リポソーム媒介性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０９６９９号および同ＷＯ９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号、および同第５，５３８，８８０号、それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）；あるいは、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号、それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）；乾燥／阻害媒介性のＤＮＡの取り込み（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ）（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）。これらのような技術の適用により、細胞を安定に、または一時的に形質転換することができる。

Ｂ．ベクター
ベクターは、例えば、標的ＦｃＲに結合する能力についてスクリーニングすることが望まれる候補Ｆｃドメインをコードする核酸配列でのグラム陰性細菌の形質転換において、本発明での用途が見出され得る。本発明の１つの実施形態において、標的ポリペプチドをコードする核酸配列の不均質な「ライブラリー」全体が細菌集団に導入され得、それにより、全ライブラリーのスクリーニングが可能となる。用語「ベクター」は、核酸配列を複製することができる細胞への導入のために核酸配列を挿入することができるキャリア核酸分子をいうために使用される。核酸配列は「外来性」または「異種」であり得、この「外来性」または「異種」は、ベクターがその中に導入される細胞にとって外来のものであること、または、この配列がその細胞中の配列に対して相同であるが、通常その配列が見られない宿主細胞核酸内の位置にあるということを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、およびウイルス（例えば、バクテリオファージ）が挙げられる。当業者は、標準的な組換え技術によりベクターを構築することができる。この技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４（これらはいずれも、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。

用語「発現ベクター」は、転写される能力がある遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターをいう。いくつかの場合には、その後、ＲＮＡ分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な「制御配列」を含めることができる。「制御配列」は、特定の宿主生物体において作動可能であるように連結されたコード配列の転写と、おそらくは翻訳に不可欠な核酸配列をいう。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターには、さらに他の機能も供与する核酸配列を含めることができ、これらを以下に記載する。

１．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および転写の速度が制御される核酸配列の領域である、制御配列である。プロモーターは、調節タンパク質および調節分子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子）がそれに結合し得る遺伝子エレメントを含み得る。表現「作動可能であるように配置された」、「作動可能であるように連結された」、「制御下」、および「転写制御下」は、配列の転写開始および／または発現を制御するために、プロモーターが、核酸配列に関連して正しい機能的位置および／または方向にあることをいう。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて使用することができ、またそうでない場合もあり、この「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列をいう。

プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得ることができるように、遺伝子または配列に生来付随しているものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」として呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置し、核酸配列に生来付随しているものであり得る。あるいは、特定の利点は、組換え体プロモーターまたは異種プロモーター（その自然環境における核酸配列に通常は付随しないプロモーターをいう）の制御下にコード核酸セグメントを配置することにより得られるであろう。組換え体エンハンサーまたは異種エンハンサーはまた、その自然環境において核酸配列に通常は付随しないエンハンサーをいう。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他の原核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「自然界には存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または発現を変化させる変異を含む）を挙げることができる。合成によりプロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を作製することに加えて、配列は、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して作製され得、この技術としては、本明細書に開示される組成物と組み合わせたＰＣＲ（商標）が挙げられる（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照のこと）。

当然のことながら、発現のために選択される細胞のタイプにおいてＤＮＡセグメントの発現を効率的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することが重要である。本発明とともに使用することができるそのようなプロモーターの１つの例は、Ｅ．ｃｏｌｉアラビノースプロモーターまたはＴ７プロモーターである。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞のタイプの組み合わせの使用に精通している。例えば、引用により本明細書中に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。利用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性、ならびに／あるいは、組換え体であるタンパク質および／またはペプチドの大量生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高いレベルの発現を指示するための適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは、異種である場合も、また内因性である場合もある。

２．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特別な開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要である場合がある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを、提供することが必要な場合がある。当業者は、容易にこの配列を決定することができ、そして必要なシグナルを提供することができる。挿入物全体の翻訳を確実にするためは、開始コドンが、所望されるコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものであっても、また、合成のものであってもいずれであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることにより増強され得る。

３．マルチクローニング部位
ベクターには、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含めることができる。これは、ベクターを消化するための標準的な組換え技術と組み合わせて使用することができる任意の複数の制限酵素部位を含む核酸領域である（引用により本明細書中に組み入れられる、Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８、およびＣｏｃｅａ、１９９７を参照のこと）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素での核酸分子の触媒的切断をいう。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者に理解されている。多くの場合、ベクターは、外因性の配列をベクターに連結できるようにするために、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して直鎖化または断片化される。「ライゲーション」は、２つの核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう。これらの断片は互いに連続している場合があり、また連続していない場合もある。制限酵素およびライゲーション反応を含む技術は組換え技術の当業者に周知である。

４．終結シグナル
本発明にしたがって調製されたベクターまたは構築物には、一般的に、少なくとも１つの終結シグナルが含まれるであろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。したがって、特定の実施形態において、ＲＮＡ転写産物の産生を終わらせる終結シグナルが想定される。ターミネーターは、所望されるメッセージレベルを得るためにインビボで不可欠であり得る。

本発明での使用が想定されるターミネーターとしては、本明細書中に記載されるか、または当業者に公知の転写の任意の公知のターミネーターが挙げられる。これには、例えば、ｒｈｐ依存性ターミネーターまたはｒｈｏ非依存性ターミネーターが含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、終結シグナルは、配列の短縮が原因であるような、転写可能な配列または翻訳可能な配列の欠損であり得る。

５．複製起点
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、複製が開始される特定の核酸配列である１つ以上の複製起点部位（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含めることができる。

６．選択マーカーおよびスクリーニングマーカー
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。このようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする同定可能な変化を細胞に付与する。一般的には、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。ポジティブな選択マーカーは、そのマーカーの存在がその選択を可能にする選択マーカーであり、一方、ネガティブな選択マーカーは、その存在がその選択を妨げる選択マーカーである。ポジティブな選択マーカーの例は薬物耐性マーカーである。

通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニングおよび同定を補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が有用な選択マーカーである。実施の条件に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その根拠が比色分析であるＧＦＰのようなスクリーニングマーカーを含む他のタイプのマーカーもまた想定される。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者はまた、おそらくは、ＦＡＣＳ分析と組み合わせて免疫学的マーカーを利用する方法を理解するであろう。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることが可能である限りは、使用されるマーカーは重要ではないと考えられる。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。

Ｃ．宿主細胞
異種の核酸配列を発現する状況においては、「宿主細胞」は原核生物細胞をいい、そしてこれには、ベクターを複製することができる、および／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することができる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターのためのレシピエントとして使用することができ、そして使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」されるかまたは「形質転換」され得る。これは、外因性の核酸が、宿主細胞内に形質導入されるかまたは導入されるプロセスをいう。形質転換された細胞には、最初の被験細胞とその子孫が含まれる。

本発明の特定の実施形態においては、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。これらの細菌は、これらが内膜と外膜との間にペリプラズム空間を、特に、ペリプラズムと細胞質との間の上記内膜を（これは、細胞質膜としても知られている）持つ点で、本発明での使用について適している。このように、そのようなペリプラズム空間を持つ任意の他の細胞を、本発明に従って使用することができる。本発明を用いた用途が見出され得るグラム陰性細菌の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｂｏｒｄｏｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．を挙げることができるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌細胞は、なおさらに、選択されたリガンドに結合することができる候補の結合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドのコード配列で形質転換された細菌細胞として定義され得る。ポリペプチドは、ペリプラズム空間に面している細胞質膜の外表面に固定され、そしてこれには抗体のコード配列または別の配列が含まれ得る。ポリペプチドの発現のための１つの手段は、このような指示を生じ得るポリペプチドにリーダー配列を結合させることによる。

複数の原核生物細胞株および原核生物細胞培養物が、宿主細胞としての使用に利用可能であり、そして、これらはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を介して入手することができる。ＡＴＣＣは、生きた培養物および遺伝物質のための保管所としての役割を果たす機関である（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）。適切な宿主は、ベクター骨格および所望される結果に基づいて当業者によって決定され得る。プラスミドまたはコスミドは、例えば、多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞中に導入することができる。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、およびＫＣ８、ならびに複数の市販されている細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）Ｇｏｌｄ Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ））が挙げられる。あるいは、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＬＥ３９２のような細菌細胞をバクテリオファージのための宿主細胞として使用することができる。

様々な細胞のタイプおよび生物由来の多くの宿主細胞が入手可能であり、そして当業者に公知である。同様に、ウイルスベクターは、原核生物宿主細胞、特にベクターの複製または発現について許容性のものと組み合わせて使用され得る。いくつかのベクターは、ベクターが原核生物細胞および真核生物細胞の両方において複製および／または発現できるようにする制御配列を利用することができる。当業者は、さらに、上記に記載された宿主細胞の全てがこれらを維持し、そしてベクターの複製を可能にするための、インキュベーションするための条件を理解する。ベクターの大量生産、ならびにベクターによってコードされる核酸およびこれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの産生を可能にする技術ならびに条件もまた理解され、そして公知である。

Ｄ．発現システム
上記で議論した組成物の少なくとも一部または全てを含む複数の発現システムが存在する。そのようなシステムは、例えば、特定のリガンドに結合できるとして本発明に従って同定されたポリペプチド産物の産生のために使用することができる。原核生物をベースとするシステムは、核酸配列、またはそれらの同族のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生するために、本発明を用いる用途に利用することができる。複数のこのようなシステムは、商業的に広範に利用することができる。発現システムの他の例として、強力な原核生物のプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、ＢＡＤ、λｐＬ、テトラサイクリン、またはＬａｃプロモーター）、ｐＥＴ発現システム、およびＥ．ｃｏｌｉ発現システムが挙げられる。

Ｅ．候補の結合タンパク質および抗体
特定の実施形態においては、抗体Ｆｃドメインは、宿主細菌細胞の細胞質上、またはペリプラズム空間膜中で発現される。そのようなＦｃドメインの不均質な集団の発現によって、標的リガンド（ＦｃＲ）に対して高い親和性を有しているこれらのポリペプチドが同定され得る。その後、同定されたＦｃドメインは、本明細書中に記載されるように、様々な診断的適用または治療的適用に使用され得る。

本明細書中で使用される場合は、用語「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ Ｆｃのような任意の免疫グロブリンＦｃ領域を広くいうように意図される。種々な抗体をベースとする構築物および断片を調製し、使用するための技術は、当該分野で周知である。抗体を調製および特性決定するための方法もまた、当該分野で周知である（例えば、引用により本明細書中に組み入れられる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと）。

一旦、標的リガンドに対して親和性を有している抗体が同定されると、Ｆｃドメインを、必要に応じて、濾過、遠心分離、および様々なクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を使用して精製することができる。あるいは、より一般的にはＦｃドメイン、またはポリペプチドおよびペプチドを、自動ペプチド合成機を使用して合成することができる。

ＩＸ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本発明者によって発見された技術が本発明の実施において良好に機能することを示し、従って、本実施例において開示された技術が、その実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが当業者によって理解されるものとする。しかし、本開示を考慮して、当業者は、開示される特定の実施形態の中で多くの変更を行うことができ、そしてなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様もしくは類似する結果が得られることを理解するものとする。

実施例１
Ｆｃ５を操作するためのコンビナトリアルライブラリーの構築
本研究で使用した全てのプラスミドとプライマーを、表３および表４に記載する。これまでに単離されたＦｃ断片よりもＦｃγＲＩに対して高い結合親和性を示すＩｇＧ１ Ｆｃ断片（アミノ酸置換Ｅ３２８Ｖ／Ｍ４２８Ｉを含むＦｃ５）（図１および２）のスクリーニングのために、Ｆｃ５遺伝子について、ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲによる無作為な変異誘発を行った。標準的なｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法（Ｆｒｏｍａｎｔら、１９９５）を、ｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃ５の鋳型と、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ技術（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成した２つのプライマー（ＳＴＪ＃１９６およびＳＴＪ＃１９７）とともに利用した。増幅したＰＣＲ断片を、ＳｆｉＩで消化したｐＰｅｌＢＦＬＡＧに連結した。得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^ｒ） ｐｒｏＡＢ^＋ ｌａｃＩ^ｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）（Ｋａｗａｒａｓａｋｉら、２００３）に形質転換した。無作為に選択した２０個のライブラリークローンの配列に基づくと、ライブラリーは、遺伝子１つあたり０．２６４％のエラー率を有している７×１０８の個々の形質転換体であった（図３）。

実施例２
Ｆｃ５の親和性成熟のためのスフェロプラスト化とハイスループットフローサイトメトリースクリーニング
クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を補充した２％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｆｃｏ（商標）、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）中で２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩培養したライブラリー細胞を、０．５Ｍのトレハロース（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）とクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍｌ）を含む新しいＴＢ培地中で１：５０に希釈した。２５０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で３時間のインキュベーション、その後の２０分の２５℃での冷却の後、Ｆｃ断片の発現を、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。２５℃での５時間の培養後、４．５ｍｌの培養液を遠心分離により回収し、１ｍｌの冷却した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で２回洗浄した。１ｍｌの冷却したＳＴＥ溶液（０．５Ｍのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中への再懸濁の後、細胞を、３７℃で３０分間、回転混合しながらインキュベーションし、１２，０００×ｇで１分間の遠心分離によりペレット化し、１ｍｌの冷却したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（０．５Ｍのスクロース、２０ｍＭのＭｇＣ１２、１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．８）中で洗浄した。洗浄した細胞を、１ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵のリゾチームを含む１ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａの中で、３７℃で１５分間インキュベーションした。１２，０００×ｇで１分間の遠心分離の後、得られたスフェロプラストのペレットを１ｍｌの冷却したＰＢＳ中に再懸濁した。

ライブラリーのスクリーニングのために、組み換え体であるグリコシル化されたＦｃγＲＩａ／ＣＤ６４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の細胞外ドメインを、ＦＩＴＣタンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＦＩＴＣで標識した。標識化反応の後、ＦＩＴＣで標識したＦｃγＲＩのヒトＩｇＧ Ｆｃに対する親和性を、Ｆｃでグリコシル化したヒトＩｇＧ−Ｆｃをコーティングしたウェルにおいて、ＢＳＡをコーティングしたウェルと比較して高い蛍光を示す蛍光ＥＬＩＳＡにより確認した。スフェロプラストを３０ｎＭのＦｃγＲＩ−ＦＩＴＣで標識した。次の回の選別においては、低濃度のＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣ（２回目、３回目、および４回目の選別についてそれぞれ、１０ｎＭ、３ｎＭ、および１ｎＭ）を、スフェロプラストの標識に使用した。４×１０^８より多いスフェロプラストを、励起のための４８８ｎｍのアルゴンレーザーを搭載したＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）により選別した。それぞれの回において、ＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣの結合が原因で最も高い蛍光を示した集団の上部の３％を、最初の選別の直後の選別と再選別により単離した。

スフェロプラスト中のＦｃ遺伝子を、２つの特異的プライマー（ＳＴＪ＃１６およびＳＴＪ＃２２０）を使用してＰＣＲ増幅によりレスキューし、ＳｆｉＩ制限酵素部位を使用してｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃに連結し、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１細胞に形質転換した。得られた形質転換体を、クロラムフェニコール含有培地上で選択し、その後、増殖させ、次の回の選別のための準備において上記のようにスフェロプラスト化した。高蛍光クローンを、続けて行う選別の回と同様に富化させた（図４）。５回目の選別の後、Ｆｃ５より高い蛍光を示す１９個の個々のクローンを単離した（図５）。不必要な変異を除き、全ての変異は、ＦｃγＲＩａと直接接触し得る上方ＣＨ２部分、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの界面にあるリンカー領域、およびＦｃγＲＩａに対する結合のためのＦｃ断片の立体構造変化に寄与し得るＣＨ３領域を含む、３つの異なる領域の中に存在していた（図６）。最も高い蛍光を示すクローンはＦｃ６０１であり、これは、Ｆｃ５（Ｅ３８２Ｖ／Ｍ４２８Ｉ）中に２つのさらなる変異（Ｋ３３８Ｒ、Ｇ３４１Ｖ）を有する（図７および図８）。

実施例３
Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い結合親和性を示す選択したクローンの配列
Ｆｃ５（ヌクレオチド配列＃２およびタンパク質配列＃２）は、野生型ＩｇＧ１−Ｆｃの配列（ヌクレオチド配列＃１およびタンパク質配列＃１）中に２つの変異（Ｅ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ）を有する。Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い親和性を示す操作されたＦｃ変異体は、Ｆｃ５の配列中に置換変異を有する。単離したＦｃ変異体Ｆｃ６０１−Ｆｃ６１９（タンパク質配列＃３〜＃２１）は、Ｆｃ５配列中に置換変異を有する。単離した変異体を表５にまとめる。

実施例４
全長のＩｇＧ１−Ｆｃ６０１の作製と精製
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｅｒｂ２）を過剰発現する転移性乳癌の処置に臨床的に使用されている（Ｓｅｒｇｉｎａ ａｎｄ Ｍｏａｓｓｅｒ，２００７）。転移性の癌腫の排除のために、トラスツズマブ抗体はＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｅｒｂ２）を認識し、免疫細胞の表面ＦｃγＲと相互作用して、治療的作用に不可欠なエフェクター機能の機構である抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらす（Ｌａｚａｒら、２００６；Ｓｅｒｇｉｎａ ａｎｄ Ｍｏａｓｓｅｒ，２００７）。高いＦｃγＲ親和性のために操作したＦｃ断片遺伝子を、全長のトラスツズマブ抗体に取り込ませた。ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１の構築のために、ヒト化４Ｄ５（抗ｐ１８５ＨＥＲ２）のＥ．ｃｏｌｉコドンに最適化した（Ｈｏｏｖｅｒ ａｎｄ Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ，２００２）Ｖ_ＬドメインとＶ_Ｈドメインを、それぞれ、Ｖ_Ｌについての２つの外部プライマー（ＳＴＪ＃３０２およびＳＴＪ＃３１３）と１０個の内部プライマー（ＳＴＪ＃３０３〜３１２）、ならびにＶ_Ｈについての全部で１４個のプライマー（２つの外部プライマー（ＳＴＪ＃３１４およびＳＴＪ＃３２７）と１２個の内部プライマー（ＳＴＪ＃３１５〜３２６）を含む１２のオリゴヌクレオチドを使用した重複伸長ＰＣＲを用いた全遺伝子合成により合成した。Ｖ_ＬについてはＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を、そしてＶ_ＨについてはＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用した、増幅したＶ_ＬおよびＶ_ＨのｐＭＡＺ３６０−Ｍ１８．１−Ｈｕｍ−ＩｇＧ１への連結により、ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１を作製した。ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−Ｆｃ２ａ−ＩｇＧ１およびｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−Ｆｃ５−ＩｇＧ１については、Ｆｃ５およびＦｃ２ａ変異遺伝子を、プライマー（ＳＴＪ＃２９０およびＳＴＪ＃２９１）と鋳型であるｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃ５またはｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃ６０１を使用して増幅し、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＶを使用して消化したｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１に連結した。グリコシル化されていないトラスツズマブ、およびトラスツズマブ−Ｆｃ５、およびトラスツズマブ−Ｆｃ６０１のＥ．ｃｏｌｉの中での準備としての産生のために、２シストロン性プラスミドであるｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＩｇＧ１、ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−Ｆｃ５−ＩｇＧ１、およびｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−Ｆｃ６０１−ＩｇＧ１を構築した。これらのプラスミドは、重鎖および軽鎖の両方に対するＰｅｌＢリーダーペプチド融合を持つ２シストロン性オペロン中のｌａｃプロモーターの制御下にある（図９）。

これらのプラスミドのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）への形質転換後、細胞を、ＬＢ複合培地中で一晩増殖させ、その後、２ｇの（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、６．７５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．９３ｇのクエン酸Ｈ_２Ｏ、０．３４ｇのＭｇＳＯ_４、２０ｇのグルコース、０．０５ｇのアンピシリン、および５ｍｌの、２ＮのＨＣｌ中に溶解させた微量金属の溶液（１Ｌあたり１０ｇのＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、２．２５ｇのＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、１ｇのＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ、０．３５ｇのＭｎＳＯ_４−Ｈ_２Ｏ、０．２３ｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７−１０Ｈ_２Ｏ、１．５ｇのＣａＣｌ_２、および０．１ｇの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４）からなるＲ／２培地（Ｊｅｏｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ，２００３）中での順応のために２回、一晩の培養を行った。ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＩｇＧ１、ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＩｇＧ１−Ｆｃ５、またはｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＩｇＧ１−Ｆｃ６０１を持つＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、３０℃、２５０ｒｐｍで８時間、１２０ｍｌのＲ／２培地を含む５００ｍＬのバッフル底フラスコの中で培養し、その後、１．２ＬのＲ／２培地を含む３．３ＬのＢｉｏＦｌｏ ３１０発酵装置（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）に接種した。流加発酵を、ｐＨスタットグルコース供給ストラテジー（ｐＨ−ｓｔａｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して３０℃で行った。溶存酸素（ＤＯ）濃度は、撹拌速度を１００ｒｐｍから１０００ｒｐｍまで、空気の循環速度を１ ＳＬＰＭ（１分あたりの標準的な液体（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｌｉｑｕｉｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ））から３ ＳＬＰＭまで、そして必要に応じて、純粋な酸素の流速を０ ＳＬＰＭから１．５ＳＬＰＭまで増大させることにより、自動カスケード制御を使用して、４０％の空気飽和度で維持した。最初のｐＨは６．８に調整し、６．７５未満にまで低下した場合には、３０％（ｖ／ｖ）の水酸化アンモニウムの添加により、そして６．９より上に上昇した場合には、栄養溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（７００ｇ／Ｌのグルコースおよび１０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ；導入前）と（５００ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、および１００ｇ／Ｌの酵母抽出物；誘導後）の供給により、制御した。ＯＤ６００が１００に達したら、培養温度を２５℃に下げ、３０分後、タンパク質の発現を１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。培養液を、約１３０〜１４０のＯＤ_６００で７時間後に回収した。グリコシル化されていない四量体ＩｇＧの収量は約４０ｇ／Ｌであった。

細胞を、１１，０００×ｇで３０分間の遠心分離により回収し、４ｍｇのリゾチーム（１ｇの乾燥細胞重量あたり）と１ｍＭのＰＭＳＦを補充した、１００ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む１．２Ｌの溶液中に懸濁した。ペリプラズムタンパク質を、２５０ｒｐｍ、３０℃で１６時間、振盪させながら懸濁溶液をインキュベーションすることにより、放出させた。１４，０００×ｇで３０分間の遠心分離の後、０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように上清をポリエチレンイミン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）と混合し、１４，０００×ｇで３０分間、再度遠心分離し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。透明な濾液を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に予め平衡化させた固定化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａアガロース樹脂と混合し、４℃で１６時間インキュベーションした。２００ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および２００ｍｌの４０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）での洗浄後、野生型のグリコシル化されていないトラスツズマブ、グリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ５、およびグリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ６０１を、１５ｍｌの０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．０）を使用して樹脂から溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）溶液ですぐに中和した。溶離させた試料を、１０ｋＤａのＭＷカットオフメンブレンを通した限外濾過により濃縮し、濃縮液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で展開させたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラムにアプライした。

実施例５
Ｆｃ受容体に対するグリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ６０１の親和性
完全にアセンブリされたグリコシル化されていないトラスツズマブ抗体のＦｃγＲＩａに対する親和性を、グリコシル化されたトラスツズマブ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ，Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、グリコシル化されていないトラスツズマブ、およびグリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ５、グリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ６０１を個々にＣＭ−５センサーチップ上に固定化することにより測定した。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．００５％のＰ２０界面活性剤）緩衝液中の可溶性の単量体ＦｃγＲＩａを、解離時間３００秒で、６０秒間、３０μｌ／分の流速で注入した。リガンドの再生を、１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）の１回の注入により行った。グリコシル化されたトラスツズマブ、グリコシル化されていないトラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、およびトラスツズマブ−Ｆｃ６０１との可溶性の単量体ＦｃγＲＩａの親和性を、固定化したグリコシル化されたトラスツズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、およびトラスツズマブＦｃ６０１上を３０μｌ／分の流速で６０秒間かけた、０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭの濃度で２連での可溶性ＦｃγＲＩａの注入により得た。野生型のグリコシル化されていないトラスツズマブに対するＦｃγＲＩａの親和性は、固定化したグリコシル化されていないトラスツズマブ上を３０μｌ／分の流速で６０秒間かけた、０ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、および６００ｎＭの濃度で２連でのＦｃγＲＩａの注入により得た。ゼロ濃度での結合曲線をブランクとして引き算した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアにより提供される定常状態の親和性モデルに対して平衡応答をフィットさせることにより決定した。図１０に示すように、トラスツズマブ−Ｆｃ６０１は、ＣＨＯ細胞由来の市販されている等級のグリコシル化されたトラスツズマブと類似する親和性でＦｃγＲＩａに結合し、野生型のグリコシル化されていないトラスツズマブと比較して、１３０倍を上回るほどに親和性が増大した。

ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外ドメインに対する精製したＩｇＧの親和性を、ＥＬＩＳＡによって分析した。５０μｌの４μｇ／ｍｌのグリコシル化されていないトラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、またはＥ．ｃｏｌｉから精製したトラスツズマブ−Ｆｃ６０１、グリコシル化されたＩｇＧトラスツズマブを、０．０５ＭのＮａ_２ＣＯ_３（ｐＨ９．６）緩衝液中に希釈し、４℃で１６時間、９６ウェルのポリスチレンＥＬＩＳＡウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）をコーティングするために使用した。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％のＢＳＡでの室温で２時間のブロッキング後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、段階希釈したＦｃγＲＩＩａ、ＧＳＴに対してＣ末端融合させたＦｃγＲＩＩｂ（Ｂｅｒｎｔｚｅｎら、２００５）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とともに室温で１時間インキュベーションした。同じ緩衝液での４回の洗浄後、ＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩｂについては１：５，０００に希釈した抗ＧＳＴ抗体ＨＲＰ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、またはＦｃγＲＩＩＩａについては１：１０，０００に希釈した抗ポリヒスチジン抗体ＨＲＰ結合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、プレートを洗浄し、以前に記載されたとおりに現像した（Ｍａｚｏｒら、２００７）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＩｇＧの結合を決定するために、以前に記載されたとおりに（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２００６）、室温で１時間、１：５，０００に希釈した抗ＧＳＴ−ＨＲＰを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でプレインキュベーションした２μｇ／ｍｌのＦｃＲｎを、トラスツズマブ抗体をコーティングしたプレートに添加した。ｐＨ６．０で結合を評価するために、ＥＬＩＳＡを、２０ｍＭのＭＥＳを洗浄緩衝液と試料希釈緩衝液に添加し、ｐＨを６．０に調整したことを除き、上記と同様に行った。予想したとおり、グリコシル化されていないトラスツズマブは、ＦｃγＲＩＩａまたはＦｃγＲＩＩｂ（ＧＳＴを融合させたＦｃγＲＩＩａおよびＧＳＴを融合させたＦｃγＲＩＩｂについてそれぞれ、ＥＣ_５０≧１０００倍および１００倍以上、図３ＣおよびＤ）（図１１および図１２）、またはＦｃγＲＩＩＩａ（図１３）に対して低い親和性を示した。トラスツズマブ−Ｆｃ６０１抗体は、ＦｃγＲＩＩｂに対してのみわずかに高い親和性を示した。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの界面に対する新生児のＦｃＲｎ受容体の結合は、血漿中のＩｇＧのエンドソームリサイクリングの原因である（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２０００）。トラスツズマブ−Ｆｃ５は、新生児のＦｃＲｎに対してそのｐＨ依存性結合（ｐＨ６．０での高い親和性での結合と、ｐＨ７．４でのその低い結合）を示した。しかし、トラスツズマブ−Ｆｃ６０１は、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対してはるかに低い結合親和性を示した（図１４）。

実施例６
Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対する高い親和性およびｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合のためのライブラリーの構築
ヒトＦｃＲｎは、わずかに酸性のｐＨ条件下でヒトＩｇＧに対して高い親和性を有し、中性または塩基性ｐＨでは低い親和性を有する（Ｏｂｅｒら、２００４ａ；Ｏｂｅｒら、２００４ｂ；Ｒａｇｈａｖａｎ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｍａｎ，１９９６；Ｒｏｄｅｗａｌｄ，１９７６）。ＦｃＲｎ結合部位は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの界面に位置しており、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の結合ドメインに類似している（Ｋｉｍら、１９９４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１）。Ｆｃ６０１は、Ｆｃ５よりも改善されたＦｃγＲＩａ結合親和性を示した。しかし、ＩｇＧ１の下の方のＣＨ２領域中のＦｃ６０１の２つのさらなる変異（Ｋ３３８Ｒ、Ｇ３４１Ｖ）は、リソソーム中での分解の代わりに血管内皮細胞膜を通過して血液に再循環するために、飲作用されたＩｇＧを、酸性化されたエンドソーム中で強いＩｇＧ−ＦｃＲｎ複合体にすることを可能にすることにより、血清ＩｇＧ濃度の調節に重要であるｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を弱めた（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２０００）。

Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い親和性を示し、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を保持している操作されたＦｃ断片を単離するために、上方ＣＨ２領域中の無作為なアミノ酸からなる新しいコンビナトリアルライブラリーを構築した。このライブラリーは、４つのサブライブラリーからなる。上方ＣＨ２領域の４つの部分（２３４Ｌ〜２３９Ｓ、２６４Ｖ〜２６８Ｈ、２９７Ｎ〜２９９Ｔ、３２８Ｌ〜３３２Ｉ）（Ｋａｂａｔら、１９９１）を、ＮＮＳ縮重コドンを使用して無作為のアミノ酸により置換した（図１５および１６）。第１のサブライブラリーについて、ＤＮＡ断片を、プライマー（ＳＴＪ＃４６５およびＳＴＪ＃２２０）と鋳型ｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃ５を使用して増幅した。プライマーＳＴＪ＃４７３を使用してＰＣＲ増幅した断片のＮ末端配列伸長により、無作為なアミノ酸で領域２３４Ｌ〜２３９Ｓ中の５個のアミノ酸を置き換えたサブライブラリーを作製した。プライマー（ＳＴＪ＃４６７およびＳＴＪ＃２２０）により増幅したＤＮＡ断片とプライマー（ＳＴＪ＃４７３およびＳＴＪ＃４６８）により増幅したＤＮＡ断片を使用した遺伝子アセンブリＰＣＲ産物は、２６４Ｖ〜２６８Ｈについて５つのアミノ酸残基が無作為化された第２のサブライブラリーを生じた。２９７Ｎ〜２９９Ｔが無作為化された第３のサブライブラリーは、プライマー対（ＳＴＪ＃４７３／ＳＴＪ＃４７０およびＳＴＪ＃４６９／ＳＴＪ＃２２０）を使用して作製し、そして第４のサブライブラリー（３２８Ｌ〜３３２Ｉ）は、プライマー対（ＳＴＪ＃４７３／ＳＴＪ＃４７０およびＳＴＪ＃４６９／ＳＴＪ＃２２０）を使用し、同じＰＣＲ鋳型プラスミドｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃ５を使用して作製した。可能な変異の数に基づいて、５個のアミノ酸残基を無作為化した３つのサブライブラリー（２３４Ｌ〜２３９Ｓ；２６４Ｖ〜２６８Ｈ；３２８Ｌ〜３３２Ｉ）に由来する同じ量のＤＮＡを、３つのアミノ酸残基を無作為化した第３のサブライブラリー（２９７Ｎ〜２９９Ｔ）に由来する２０^３／２０^５倍量のＤＮＡと混合した。３つのサブライブラリーのそれぞれを、ＳｆｉＩで消化したｐＰｅｌＢＦＬＡＧにサブクローニングした。得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^ｒ） ｐｒｏＡＢ^＋ ｌａｃＩ^ｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）（Ｋａｗａｒａｓａｋｉら、２００３）に形質転換した。

実施例７
Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩａに対して高い親和性を示すＦｃ変異体のｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合についてのスクリーニング
４つのサブライブラリーからなるライブラリー細胞を、実施例２に記載した方法によりスフェロプラストに転換させた。４×１０^８個を超えるスフェロプラストを、アルゴンレーザーを搭載したＭｏＦｌｏフローサイトメトリー（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）によって選別した。室温で１時間の１０ｎＭ（２回目については３ｎＭ、３回目については１ｎＭ、４回目については０．３ｎＭ）のＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣの標識後、スフェロプラストを選別し、ＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣ結合が原因で最も高い蛍光を示す集団の上位３％を選択的にゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）した。最初の選別の後、収集したスフェロプラストをすぐに再度選別した。Ｆｃをコードする遺伝子を、２つの特異的プライマー（ＳＴＪ＃１６およびＳＴＪ＃２２０）を使用してＰＣＲによりレスキューし、ＳｆｉＩで消化したｐＰｅｌＢＦＬＡＧプラスミドに連結した。連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１に形質転換した。クロラムフェニコール含有培地上で選択した形質転換体を増殖させ、上記のようにスフェロプラスト化し、選別した。４回目の選別の後、Ｆｃ５よりも高い蛍光を示す８個の個々のクローンを単離した（図１７）。これらのクローンの全てが、Ｌ３２８ＷおよびＩ３３２Ｙの変異においてコンセンサス変異を有している。また、アミノ酸残基３２９Ｐは十分に保存されており、これは、ＦｃγＲＩａの結合における特定のアミノ酸残基の重要な役割を示唆している（図１８）。最も高い蛍光のクローンはＦｃ７０１であり、これは、３２８Ｌ〜３３２Ｉ領域にＬ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ａ、Ｉ３３２Ｙ変異と、１つのさらなるＱ２９５Ｒ変異を有している（図１９〜２１）。

実施例８
上方ＣＨ２無作為化ライブラリーからスクリーニングした、ＦｃγＲＩａに対して高い結合親和性を示す選択したクローンの配列
Ｆｃ５よりもＦＣγＲＩａに対して高い親和性を示す操作したＦｃ変異体は、Ｆｃ５の配列中に置換変異を有する。単離したＦｃ変異体Ｆｃ７０１〜Ｆｃ７０８（タンパク質配列＃２２〜＃２９）は、Ｆｃ５の配列中に変異を有する。Ｆｃ５よりもＦｃγＲＩに対して高い親和性を示す単離した変異体を表６にまとめる。

実施例９
全長のトラスツズマブ−Ｆｃ７０１ ＩｇＧ１の特性決定
全長のトラスツズマブ−Ｆｃ７０１ ＩｇＧ１を流加発酵を使用して産生させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー、その後のゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、実施例４に記載したように精製した。全長のトラスツズマブ−Ｆｃ７０１のＦｃγＲＩａに対する結合についての反応速度定数を得るために、精製したトラスツズマブ−Ｆｃ７０１を、アミンカップリング方法を使用してＣＭ５センサーチップ上に固定化した。トラスツズマブ−Ｆｃ７０１とＦｃγＲＩａとの間での相互作用を、実施例５に記載した条件を使用して分析した。トラスツズマブ−Ｆｃ７０１は、トラスツズマブＦｃ６０１と同様の親和性でＦｃγＲＩａに結合した（図２２）。ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を、実施例５に記載したように、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４で、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。予想したとおり、トラスツズマブ−Ｆｃ７０１を含む全てのトラスツズマブ抗体が、中性のｐＨ７．４ではＦｃＲｎに対して有意な結合親和性を示さなかった。一方、トラスツズマブＦｃ７０１は、ｐＨ６．０で、野生型のグリコシル化されていないトラスツズマブ抗体またはグリコシル化されたトラスツズマブ抗体よりも、ＦｃＲｎに対して高い結合親和性を示した（図２３）。

実施例１０
共有結合させた全長ＩｇＧディスプレイシステムのためのプラスミドの構築の詳細
ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ断片をコードする、ＰＣＲ増幅し、ＳｆｉＩで消化したＦｃ遺伝子、ヒトＩｇＧ１重鎖（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３７５８３）のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の、ＳｆｉＩで消化したｐＰｅｌＢＦＬＡＧへのサブクローニングにより、ｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃを作製した。ｐＢＡＤＮｌｐＡＨｉｓ−Ｍ１８は、ｐＭｏＰａｃ１−ＦＬＡＧ−Ｍ１８由来のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＮｌｐＡを融合したＭ１８ ｓｃＦｖ遺伝子を、同じ制限エンドヌクレアーゼで消化したｐＢＡＤ３０−ＫｍＲに連結することにより行った。プライマー（ＳＴＪ＃４７５およびＳＴＪ＃４７６）と鋳型ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１を使用して増幅したＳｆｉＩで消化したトラスツズマブＶＬ−Ｃｋの、ＳｆｉＩで消化したｐＢＡＤＮｌｐＡＨｉｓ−Ｍ１８への連結により、ｐＢＡＤＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓを作製した。ＰｅｌＢリーダーペプチドを融合したトラスツズマブＶＬ−Ｃｋを、プライマー（ＳＴＪ＃１６およびＳＴＪ＃３４０）と鋳型（ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１）を使用して増幅し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩエンドヌクレアーゼにより消化し、同じエンドヌクレアーゼで消化したｐＢＡＤ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ηｉｓに連結して、ｐＢＡＤＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋを作製した。ｐＢＡＤＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ηｉｓは、プライマー（ＳＴＪ＃７０およびＳＴＪ＃３３２）と鋳型（ｐＢＡＤＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ）を使用して増幅したＸｂａＩで消化したＰＣＲ断片を、同じエンドヌクレアーゼを使用して消化したｐＢＡＤＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ηｉｓに連結することにより構築した。トラスツズマブ重鎖を、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−ＦＬＡＧ、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−Ｆｃ５−ＦＬＡＧ、およびｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−Ｆｃ２ａ−ＦＬＡＧについてそれぞれ、プライマー（ＳＴＪ＃４７４およびＳＴＪ＃６７）と鋳型ｐＳＴＪ４−Ηｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ１を使用して増幅した。Ｆｃ２ａは、上方ＣＨ２領域中の２つの変異（Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ）によりＦｃγＲＩＩ結合について最適化されたグリコシル化されていない抗体バリアントである。これは、Ｆｃ２ａを含むＩｇＧが、グリコシル化された抗体のものと匹敵するＦｃγＲＩＩａ結合とエフェクター機能を示すことが報告されている（Ｓａｚｉｎｓｋｙら、２００８）。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間の中での正確にアセンブリされたホモ二量体野生型ＦｃおよびＦｃ２ａの発現のために、プラスミドｐＤｓｂＡ−Ｆｃ−ＦＬＡＧとｐＤｓｂＡ−Ｆｃ２ａ−ＦＬＡＧを、ＤｓｂＡシグナルペプチドを介するＦｃの輸送のために構築した。ＰＣＲ増幅した断片をＳｆｉＩで消化し、同じエンドヌクレアーゼで消化したｐＰｅｌＢＦＬＡＧに連結して、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−ＦＬＡＧ、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−Ｆｃ５−ＦＬＡＧと、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−Ｆｃ２ａ−ＦＬＡＧを作製した。

表７および表８は、実施例１０〜１４に使用したプラスミドとプライマーをまとめる。

実施例１１
ＩｇＧ重鎖を操作するための共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムのためのスフェロプラストの調製およびＦＡＣＳ分析
ライブラリースクリーニングのために細菌の全長ＩｇＧディスプレイシステムを使用するためには、４つの要素を考慮しなければならない。最初に、ＩｇＧ重鎖と軽鎖が十分に発現されなければならない。第２に、重鎖と軽鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で十分にアセンブリされなければならない。第３に、結合リガンドは、細菌細胞中で全長ＩｇＧに接近できなければならない。最後に、４番目は、提示される全量ＩｇＧの固定化は、ライブラリースクリーニングの間、耐えられなければならない。

２つのプラスミドの同時発現プラスミドを、全長ＩｇＧの安定な共有結合に使用した（図２４）。ｐＢＡＤＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓプラスミドは、ＮｌｐＡリーダーペプチドを融合したＩｇＧ軽鎖（ＶＬ−Ｃｋ）とＰｅｌＢリーダーペプチドを融合したＩｇＧ軽鎖（ＶＬ−Ｃｋ）を発現することができる。したがって、軽鎖の一部は、内膜のペリプラズム側に固定され、ここで、軽鎖の一部が重鎖と会合して、四量体の全長ＩｇＧを生じる。ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−ＦＬＡＧは、ｌａｃプロモーターの制御下にＩｇＧ重鎖をコードする高コピー数のプラスミドである。プラスミドｐＢＡＤＰｅｌＢ−ＶＬ−Ｃｋ−ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋ−Ｈｉｓを、野生型トラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、またはトラスツズマブ−Ｆｃ２ａのそれぞれについて、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−ＦＬＡＧ、ｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−Ｆｃ５−ＦＬＡＧ、またはｐＰｅｌＢ−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｈ）−Ｆｃ２ａ−ＦＬＡＧで、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^ｒ） ｐｒｏＡＢ^＋ ｌａｃＩ^ｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）（Ｋａｗａｒａｓａｋｉら、２００３）に形質転換した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０ｇ／ｍｌ）を補充した、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｆｃｏ（商標）、Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）中で２５０ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で一晩培養した。

一晩培養した細胞を、１２５ｍｌの三角フラスコ中のクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（５０ｇ／ｍｌ）を含む７ｍｌの新しいＴＢ培地中に１：１００に希釈した。３７℃で２時間のインキュベーションと、２５０ｒｐｍで振盪させながら２５℃で２０分間の冷却の後、タンパク質の発現を、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。ＩＰＴＧでの誘導の２０時間後、６ｍｌの培養液を遠心分離により回収し、１ｍｌの冷却した１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。１ｍｌの冷却したＳＴＥ溶液（０．５Ｍのスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中への再懸濁後、細胞を、３７℃で３０分間、回転混合しながらインキュベーションし、１２，０００×ｇで１分間の遠心分離によりペレット化し、１ｍｌの冷却したＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（０．５Ｍのスクロース、２０ｍＭのＭｇＣ１２、１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．８）中で洗浄した。洗浄した細胞を、１ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵のリゾチームを含む１ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ中で、３７℃で１５分間インキュベーションした。１２，０００×ｇで１分間の遠心分離の後、得られたスフェロプラストのペレットを１ｍｌの冷却したＰＢＳ中に再懸濁した。３００μｌのスフェロプラストを、７００μｌのＰＢＳ中に希釈し、ＦｃγＲＩａの結合を分析するために、３０ｎＭのＦｃγＲＩ−ＦＩＴＣで標識した。ＦｃγＲＩＩａ結合のＦＡＣＳ分析のために、スフェロプラストを、９０ｎＭの、ＧＳＴにＣ末端融合させたＦｃγＲＩＩａ（Ｂｅｒｎｔｚｅｎら、２００５）とともにインキュベーションし、１ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中に１：２００に希釈したポリクローナルヤギ抗ＧＳＴ−ＦＩＴＣ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で標識した。暗条件下、２５℃で激しく振盪させながらの１時間のインキュベーションの後、この混合物を、１２，０００×ｇで１分間の遠心分離によりペレット化し、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。蛍光標識したスフェロプラストを２．５ｍｌのＰＢＳ中に希釈し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析した。

実施例１２
ＦＡＣＳ分析
選択的蛍光および散乱領域のゲーティングに基づくＦＡＣＳ選別方法を使用した親和性成熟のためには、低い変動係数（ＣＶ＝［標準偏差／平均値］×１００）を持つネガティブ対照と比較して、識別できるほどに高いまたは低い蛍光シグナルを得ることが必要である。２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムについての蛍光を、２シストロン性プラスミドｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧ、ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＩｇＧ１−Ｆｃ５、またはｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＩｇＧ１−Ｆｃ２ａの蛍光と比較した。

内膜に固定化された（ＮｌｐＡ−ＶＬ−Ｃｋポリペプチドを介して）野生型の全長ＩｇＧトラスツズマブを発現するスフェロプラストと、２シストロン性ベクターシステムから可溶性ＩｇＧを発現するスフェロプラストの蛍光プロフィール（Ｍａｚｏｒら、２００７）を比較した。２つのプラスミドを固定化した全長ＩｇＧディスプレイシステムは、ＦｃγＲＩａ−ＦＩＴＣで標識すると、劇的に改善されたシグナル強度とＣＶ値を明らかに示した。固定化した全長ＩｇＧディスプレイシステムについての蛍光シグナルを、ＴＢ中で１２℃または２５℃で培養した細胞を用いて試験した。２５℃で培養した、２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムを使用してトラスツズマブ−Ｆｃ５を提示する細胞から作製したスフェロプラストは、野生型トラスツズマブを発現するスフェロプラストと比較して、ＦｃγＲＩ−ＦＩＴＣで標識すると、はるかに高い蛍光と改善されたＣＶを示した（図２５）。また、ＦｃγＲＩＩａ−ＧＳＴに対するスフェロプラストの親和性を測定するためのＦＡＣＳ分析においては（図２６）、ＴＢ中で２５℃で培養した２つのプラスミドを共有結合した全長ＩｇＧディスプレイシステムは、驚くほどに改善されたシグナル強度とＣＶを示し、全長のＩｇＧの実際の親和性成熟のための選択的ディスプレイシステムを提供する（図２７および図２８）。

実施例１３
ＩｇＧ Ｆｃの操作のためのｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲライブラリーの構築
固定化したＩｇＧ中のＣＨ２−ＣＨ３領域のｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲライブラリーを、野生型Ｆｃを鋳型として、そして２つのプライマー（ＳＴＪ＃１９６およびＳＴＪ＃１９７）を使用した標準的なｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ（Ｆｒｏｍａｎｔら、１９９５）により構築した。増幅したＰＣＲ断片を、ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲライブラリーのためのＳｆｉＩ制限酵素部位を持つｐＰｅｌＢＦＬＡＧに連結した。ライブラリーＦｃ断片を、プライマー（ＳＴＪ＃４７９およびＳＴＪ＃６７）を使用して増幅した。無作為化したＦｃ領域を持つトラスツズマブ重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ライブラリーのために、ＶＨ−ＣＨ１断片を、プライマー（ＳＴＪ＃４７４およびＳＴＪ＃４８０）を使用して、鋳型ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧから増幅した。プライマー（ＳＴＪ＃４７４およびＳＴＪ＃６７）を使用した２つの断片（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域およびＶＨ−ＣＨ１領域）からの遺伝子アセンブリＰＣＲにより、Ｆｃ領域を無作為化したトラスツズマブ重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）ライブラリーを作製した。遺伝子をアセンブリしたＰＣＲ断片を、ＳｆｉＩ制限酵素部位を用いてｐＰｅｌＢＦＬＡＧに連結した。得られたプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１（Ｆ’［Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^ｒ） ｐｒｏＡＢ^＋ ｌａｃＩ^ｑ Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５］ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ） ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）（Ｋａｗａｒａｓａｋｉら、２００３）に形質転換した。このライブラリーは、無作為に選択した２０個のライブラリークローンの配列決定に基づくと、遺伝子１つあたり０．４９％のエラー率を有している９．２×１０^８の個々の形質転換体から構成されていた。

実施例１４
ＩｇＧ Ｆｃの操作のための上方ＣＨ２領域無作為化ライブラリーの構築
これらのライブラリーは、４つのサブライブラリーからなる。上方ＣＨ２領域の４つの部分（２３４Ｌ〜２３９Ｓ、２６４Ｖ〜２６８Ｈ、２９７Ｎ〜２９９Ｔ、３２８Ｌ〜３３２Ｉ）（Ｋａｂａｔら、１９９１）を、ＮＮＳ縮重コドンを使用して無作為のアミノ酸により置換した（図２９）。第１のサブライブラリーについて、ＤＮＡ断片を、プライマー（ＳＴＪ＃４６５およびＳＴＪ＃２２０）と鋳型ｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃを使用して増幅した。プライマーＳＴＪ＃４７３を使用した５’配列の伸長を使用して、無作為なアミノ酸で領域２３４Ｌ〜２３９Ｓ中の５個のアミノ酸を置き換えたサブライブラリーを作製した。プライマー（ＳＴＪ＃４６７およびＳＴＪ＃２２０）を使用して増幅したＤＮＡ断片とプライマー（ＳＴＪ＃４７３およびＳＴＪ＃４６８）を使用して増幅したＤＮＡ断片を使用した遺伝子アセンブリＰＣＲ産物は、２６４Ｖ〜２６８Ｈについて５つのアミノ酸残基が無作為化された第２のサブライブラリーを生じた。第３のサブライブラリーにおいては、プライマー対（ＳＴＪ＃４７３／ＳＴＪ＃４７０およびＳＴＪ＃４６９／ＳＴＪ＃２２０）を使用して残基２９７Ｎ〜２９９Ｔを無作為化し、そして第４のサブライブラリー（３２８Ｌ〜３３２Ｉ）は、プライマー対（ＳＴＪ＃４７３／ＳＴＪ＃４７０およびＳＴＪ＃４６９／ＳＴＪ＃２２０）を使用し、同じＰＣＲ鋳型プラスミドｐＰｅｌＢＦＬＡＧ−Ｆｃ５を使用して作製した。可能な変異の数に基づいて、５個のアミノ酸残基を無作為化した３つのサブライブラリー（２３４Ｌ〜２３９Ｓ；２６４Ｖ〜２６８Ｈ；３２８Ｌ〜３３２Ｉ）に由来する同じ量のＤＮＡを、３つのアミノ酸残基を無作為化した第３のサブライブラリー（２９７Ｎ〜２９９Ｔ）に由来する２０^３／２０^５倍量のＤＮＡと混合した。３つのサブライブラリーのそれぞれを、ＳｆｉＩで消化したｐＰｅｌＢＦＬＡＧにサブクローニングした。上方ＣＨ２領域を無作為化したトラスツズマブ重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ライブラリーについては、ＶＨ１−ＣＨ１断片を、プライマー（ＳＴＪ＃４７４およびＳＴＪ＃４８０）を使用して、鋳型ｐＳＴＪ４−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＩｇＧから増幅した。２つの断片（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域およびＶＨ１−ＣＨ１領域）からの、プライマー（ＳＴＪ＃４７４およびＳＴＪ＃６７）を使用した遺伝子アセンブリＰＣＲにより、上方ＣＨ２領域を無作為化したトラスツズマブ重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ライブラリーを作製した。遺伝子をアセンブリしたＰＣＲ断片を、ＳｆｉＩ制限酵素部位を用いてｐＰｅｌＢＦＬＡＧに連結した。得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｊｕｄｅ−１に形質転換した。構築したライブラリーの大きさは、無作為に選択した２０個のライブラリークローンの配列に基づくと、３×１０^８の個々の形質転換体を上回る大きさであった。

実施例１５
抗体依存性細胞傷害性アッセイのためのヒト単球由来樹状細胞（ｍＤＣ）の単離および分化
Ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔｓ（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，ＴＸ）を、ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液（Ｓｉｇｍａ）に対して１：１の容量で添加して、内容物の混合を回避した。血液−ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液を、遠心分離のブレーキを行わずに、２３℃で３０分間、１６００ＲＰＭで遠心分離した。末梢血単核細胞層を、勾配遠心分離後に単離し、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、２．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））とともに遠心分離して２回洗浄した。その後、細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ、Ｃａｍｂｒｅｘ）中に再懸濁し、２４ウェルプレートに添加し、単球をプレートに接着させるために３７℃で２時間インキュベーションした。典型的には、５０ｍｌの容量の血液に由来するＰＢＭＣを２４ｍｌのＩＭＤＭ中に再懸濁し、１ｍｌ／ウェルでプレートした。その後、培地および接着しなかった細胞を吸引し、接着細胞を洗浄緩衝液で５回洗浄した。その後、細胞を、ＩＭＤＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ）、１０％のＦＢＳ、および２００ｎｇ／ｍｌの組み換え体サイトカインインターロイキン−４（ＩＬ−４、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、および２００ｎｇ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）からなる１ｍｌ／ウェルの増殖培地とともに再懸濁した。さらに、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦを、培地を交換せずに、それぞれ２日目および５日目に、２００ｎｇ／ｍｌで添加した。ＤＣの分化を、ＤＣ特異的表面マーカーＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する蛍光抗体での染色により、フローサイトメトリーによって測定した。

実施例１６
抗体依存性細胞傷害性（ＡＣＣＣ）アッセイ
Ｈｅｒ２を高レベルで発現する乳癌細胞株ＳｋＢｒ３を、ＡＤＣＣアッセイの標的として使用した。細胞を、１００ｕＣｉ／１０^６細胞の放射性同位体Ｎａ^５１ＣｒＯ_４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、３７℃で１時間標識した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ−１６４０ ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｍａｘ（ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。グリコシル化されていない野生型トラスツズマブ、トラスツズマブ−Ｆｃ５、およびトラスツズマブ−Ｆｃ６０１（実施例４に記載したように調製した）、ならびにグリコシル化されたトラスツズマブ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）と関連する対照を、３連のウェルで標的細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、プレートを、２０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。エフェクター細胞（完全に分化したｍＤＣ（７日目）または新しく単離したＰＢＭＣのいずれか）をＲＰＭＩ、２％の低ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５０ｎｇ／１０^６細胞のリポ多糖類（ＬＰＳ）中に再懸濁し、様々な割合でウェルに添加した。標的細胞とｍＤＣを３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、細胞培地中に存在する放射性同位体のレベルを、クロム５１についての液体シンチレーションカウンターの中で測定した。ＳＤＳとの標的細胞のインキュベーションを、最大溶解のポジティブ対照として使用し、エフェクター細胞を含めないインキュベーションをバックグラウンド溶解として使用した。ｍＤＣをエフェクター細胞として使用する場合は、グリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ５およびトラスツズマブ−６０１は、極めて高レベルのＡＤＣＣを示し、グリコシル化されたトラスツズマブは極めて低いＡＤＣＣを誘導する（図３１）。おそらく、これは、Ｆｃ−６０１およびＦｃ−５がＦｃγＲＩだけに結合し、これもまた単球由来ＤＣの表面上で発現される阻害剤受容体ＦｃγＲＩＩｂには結合しないことが原因である。一方、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ＦｃγＲＩＩｂを含む全てのＦｃγＲ受容体に対する結合と、標的細胞の活性化および殺傷をおそらく阻害する後者の受容体に対する結合を示す。エフェクター細胞としてＰＢＭＣを用いる場合は、Ｆｃ受容体の全てとかみ合うことができ、ＮＫ細胞を活性化することができるグリコシル化されたトラスツズマブは、高いＡＤＣＣを示す。対照的に、グリコシル化されていないトラスツズマブ−Ｆｃ５およびトラスツズマブ−６０１は低いＡＤＣＣを示す（図３０）。

本明細書中に開示され特許請求された方法の全ては、本開示を考慮して、過度の実験を伴わずに行うことができ、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法および本明細書に記載される方法、および工程に、または本明細書中に記載される方法の工程の順序に変更を適用することができることは、当業者に明らかである。さらに詳細には、化学的かつ生理学的の両方に関連する特定の物質を、本明細書中に記載される物質の代用とされる場合があり、それでも、同じまたは類似する結果が得られることは、明らかである。当業者に明らかであるこのような類似の代用品および改変はすべて、添付の特許請求の範囲により定義されるような、本発明の趣旨、範囲、および概念内にあるとみなされる。

参考文献
以下の参考文献は、本明細書中に示した手順または他の詳細を補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度まで、引用により本明細書中に組み入れられる。

Claims (28)

1. ヒトＦｃＲポリペプチドに結合することができるグリコシル化されていない抗体Ｆｃドメインを含むポリペプチドであって、
   ここで、該Ｆｃドメインは、３８２位と４２８位のアミノ酸でのアミノ酸置換、ならびに以下のアミノ酸：２２４位、２４１位、２５１位、２６６位、２６９位、２７６位、２７９位、２８６位、２９５位、２９７位、３００位、３１５位、３２５位、３２８位、３３０位、３３１位、３３２位、３３８位、３４０位、３４１位、３４８位、３６９位、３７８位、３９２位、４２４位、４２６位、および／または４３４位のうちのいずれかの少なくとも１つのさらなる置換
   を含み；
   ここで、該３８２位のアミノ酸の置換がバリン（Ｅ３８２Ｖ）であり、そして該４２８位のアミノ酸の置換がイソロイシン（Ｍ４２８Ｉ）であり；
   ここで、該少なくとも１つのさらなる置換が：
   Ｈ２２４Ｒ／Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｋ２５１Ｆ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｖ２７９Ｍ、Ｎ２８６Ｄ、Ｑ２９５Ｒ、Ｎ２９７Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３１５Ｄ、Ｎ３２５Ｓ、Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｖ／Ｅ／Ｉ、Ｐ３３１Ａ／Ｓ／Ｅ、Ｉ３３２Ｙ、Ｋ３３８Ｉ／Ｒ、Ｋ３４０Ｎ／Ｑ、Ｇ３４１Ｖ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ａ３７８Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、Ｓ４２６Ｉ、および／またはＮ４３４Ｓ／Ｄであり；
   そしてここで、該Ｆｃドメインが、
   ａ）Ｋ３３８ＲおよびＧ３４１Ｖ；ｂ）Ｎ２９７Ｄ、Ｎ３１５Ｄ、およびＫ３４０Ｎ、ｃ）Ｋ３４０Ｎ、ｄ）Ｋ３３８ＩおよびＫ３４０Ｎ、ｅ）Ｋ３４０ＱおよびＡ３７８Ｄ；ｆ）Ｎ３２５ＳおよびＫ３４０Ｎ、ｇ）Ｈ２２４Ｙ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ３２５Ｓ、およびＧ３４１Ｖ、ｈ）Ｇ３４１ＶおよびＫ３９２Ｅ、ｉ）Ｋ３３８Ｒ、Ｇ３４１Ｖ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ、ｊ）Ｆ２４１ＬおよびＧ３４１Ｖ、ｋ）Ｇ３４１Ｖ、ｌ）Ｎ２７６ＤおよびＧ３４１Ｖ、ｍ）Ｇ３４１ＶおよびＶ３６９Ａ、ｎ）Ｎ２８６Ｄ、Ｇ３４１Ｖ、およびＮ４３４Ｓ、ｏ）Ｎ３２５ＳおよびＧ３４１Ｖ、ｐ）Ｙ３００ＣおよびＧ３４１Ｖ、ｑ）Ｇ３４１ＶおよびＶ３４８Ｍ、ｒ）Ｅ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ、ｓ）Ｖ２６６Ｍ；ｔ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ａ、およびＱ２９５Ｒ、ｕ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｅ、Ｐ３３１Ｅ、およびＶ２７９Ｍ、ｖ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０ＥおよびＰ３３１Ｅ、ｗ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｅ、Ｐ３３１Ｖ、およびＳ４２６Ｔ、ｘ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０ＥおよびＰ３３１Ｖ、ｙ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０ＩおよびＰ３３１Ｅ、ｚ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｅ、ａａ）Ｌ３２８Ｗ、Ｐ３３１Ｓ、ならびに、ｂｂ）Ｌ３２８Ｗ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２２４Ｒ、およびＬ２５１Ｆ
   からなる群より選択される置換のセットを含む、ポリペプチド。
2. 前記ＦｃドメインがヒトＦｃγＲＩポリペプチドに結合することができる、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 少なくとも１つのさらなる置換が、上方ＣＨ２領域中のアミノ酸の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記少なくとも１つのさらなる置換が、上方ＣＨ２領域の以下の部分：２３４Ｌ〜２３９Ｓ；２６４Ｖ〜２６８Ｈ；２９７Ｎ〜２９９Ｔ；または、３２８Ｌ〜３３２Ｉの中のアミノ酸の置換である、請求項３に記載のポリペプチド。
5. 前記ポリペプチドが、３４１位のアミノ酸に別の置換を有している、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 前記３４１位のアミノ酸の置換がバリン（Ｇ３４１Ｖ）である、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドが、Ｇ３４１Ｖのさらなる置換を有さない、請求項１に記載のポリペプチド。
8. 前記ポリペプチドが、Ｋ３３８Ｒのさらなる置換を有さない、請求項１に記載のポリペプチド。
9. 前記ポリペプチドが、Ｋ３３８ＲおよびＧ３４１Ｖのさらなる置換を有さない、請求項８に記載のポリペプチド。
10. 前記ＦｃドメインがＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉの置換を有し、Ｇ３４１Ｖおよび／またはＫ３４０Ｎ／Ｑのさらなる置換を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、グリコシル化されていない野生型抗体Ｆｃドメインを持つポリペプチドと比較して、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合において少なくとも２倍の減少を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
12. 前記ＦｃドメインがＧ３４１Ｖのさらなる置換を有する、請求項１０に記載のポリペプチド。
13. 請求項１２に記載のポリペプチドであって、
    （ｉ）前記Ｆｃドメインが、Ｈ２２４Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２８６Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３２５Ｓ、Ｋ３３８Ｒ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ／Ｓからなる群より選択される少なくとも１つの他の置換を有するか；または
    （ｉｉ）前記ポリペプチドが、結合可能なリンカーをさらに含むか；または
    （ｉｉｉ）前記ポリペプチドが、非ＦｃＲ結合ドメインをさらに含む、
    ポリペプチド。
14. 前記Ｆｃドメインが、Ｈ２２４Ｙ、Ｆ２４１Ｌ、Ｅ２６９Ｋ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２８６Ｄ、Ｙ３００Ｃ、Ｎ３２５Ｓ、Ｋ３３８Ｒ、Ｖ３４８Ｍ、Ｖ３６９Ａ、Ｋ３９２Ｅ、Ｓ４２４Ｌ、およびＮ４３４Ｄ／Ｓからなる群より選択される複数の他の置換を有するか、または該ＦｃドメインがＫ３３８Ｒ置換を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
15. （ｉ）前記非ＦｃＲ結合ドメインが抗体の抗原結合部位であるか、または
    （ｉｉ）前記非Ｆｃ結合領域が抗体の抗原結合部位ではない、請求項１３または１４に記載のポリペプチド。
16. 前記非Ｆｃ結合領域が細胞表面タンパク質に結合する、請求項１５に記載のポリペプチド。
17. 前記細胞表面タンパク質が受容体である、請求項１６に記載のポリペプチド。
18. 前記受容体がチロシンキナーゼである、請求項１７に記載のポリペプチド。
19. 前記非Ｆｃ結合領域が複数のチロシンキナーゼ受容体に結合する、請求項１８に記載のポリペプチド。
20. 前記ポリペプチドが、配列番号５〜３１からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
21. 請求項１〜２０に記載のポリペプチドのいずれかをコードする核酸。
22. （ｉ）前記核酸がＤＮＡセグメントであるか、または
    （ｉｉ）前記核酸が発現ベクターである、
    請求項２１に記載の核酸。
23. 請求項２１または２２に記載の核酸を含む宿主細胞。
24. 前記核酸が第１の発現ベクター中に存在する、請求項２３に記載の宿主細胞。
25. 前記宿主細胞が第２の発現ベクターをさらに含む、請求項２４に記載の宿主細胞。
26. 前記第２の発現ベクターが免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の宿主細胞。
27. 請求項２６に記載の宿主細胞の集団であって、異なるＦｃドメインを発現する複数の宿主細胞を含む、宿主細胞の集団。
28. いずれか２つの異なるＦｃドメインのアミノ酸配列が、同一性に関して、２０％未満異なる、請求項２７に記載の宿主細胞の集団。

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