JP5682976B2 - 抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法 - Google Patents

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本発明は、自家蛍光による影響を効果的に排除した高精度で定量的に解析可能な組織染色法を用いた、抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法に関する。

がんは、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに成人の死亡原因を二分する疾患である。例えば、乳がん罹患率は、日本人では欧米諸国に比べて低いが、近年では増加傾向にあり、１９９８年には胃がんの罹患率を抜いて女性罹患率の第１位となった。最近の報告である２００５年の厚生労働省統計によれば、乳がんの年間罹患数は５万人を超えている。世界でも同様にその数は年々増加しており、２００８年のＷＨＯの報告によれば、乳がんは男女合わせても罹患率第1位の疾患となっており、その年間罹患数は１３８万人を超え、女性のがん全体の約２３％を占めている。

がんの診断にはＸ線ＣＴやＭＲＩ等の画像診断のほか、特定のがんに特異的に発現するがんマーカーや、血液、組織中に漏出するがんマーカー等を検出する方法も汎用されている。乳がんの一般的なスクリーニング検査としては、問診、触診、軟Ｘ線乳房撮影（マンモグラフィー）、超音波検査等が実施され臨床的に疑いが生じると、細胞診や生検が実施され病理学的診断によりがんであるかどうか判別される。がん治療や予後の経過を判定するために、病理学診断は重要であり、この診断の中心となるのは「形態観察を行うためのＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色法」と「がんマーカー因子に対する抗体を用いた免疫組織化学法」である。特に近年の抗体医薬の登場により、免疫組織化学の重要性は非常に高まっている。

ヒトがん遺伝子ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）の遺伝子産物であるＨＥＲ２タンパク質は、ヒト上皮増殖因子受容体ファミリーに属する増殖因子受容体であり、その細胞質側にチロシンキナーゼ活性領域を有する分子量約１８５ｋＤａの膜貫通型タンパク質である。ヒト乳癌細胞において、ＨＥＲ２の高発現が認められているものもある。がんの増殖に関与する因子であるヒト上皮成長因子受容体２（human epidermal growth factor receptor 2；ＨＥＲ２）を標的とした抗ＨＥＲ２抗体からなる抗体医薬であるハーセプチン（Herceptin；登録商標）として市販されているトラスツズマブ（Trastuzumab；一般名）は、乳がんの代表的な抗がん剤であることが知られている。トラスツズマブは、ＨＥＲ２に特異的に結合した後、ＮＫ細胞、単球を作用細胞とした抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）により抗腫瘍効果を発揮する。この薬剤投与の有効性の判定方法として、ＨＥＲ２タンパク質等のタンパク質の発現を解析する免疫組織化学（Immunohistochemistry；ＩＨＣ）法と、ＨＥＲ２遺伝子等の遺伝子コピー数の増加を解析するＦＩＳＨ（Fluorescence in situ hybridization）法とが臨床の場で広く用いられている。ＩＨＣ法により、ＨＥＲ２抗原部位に結合した抗ＨＥＲ２抗体をＤＡＢ（Diaminobenzidine；ジアミノベンジジン）を用いて染色し、可視化することでＨＥＲ２の発現量を検出することができる。しかし、その判定基準は染色レベルをＳｃｏｒｅ０〜３とした４段階のみによる大雑把な判定基準であるため、定量性に欠けており、さらに病理医の熟練度により判定基準が左右されることから、臨床の現場において問題となっている。他方、ＦＩＳＨ法は、ＨＥＲ２遺伝子を検出するプローブと、１７番染色体セントロメアを検出するプローブを用いて行われ、このＦＩＳＨ法により解析された１７番染色体１本あたりのＨＥＲ２の遺伝子コピー数を基に、ゲノム上のＨＥＲ２遺伝子コピー数の増加の有無を判定することができる。ＦＩＳＨ法は定量的検査法ではあるが、ＨＥＲ２タンパク質量やＨＥＲ２タンパク質の細胞内局在を直接評価する方法ではない。がん治療において、局所における「がん遺伝子のコピー数」と「がん遺伝子産物の量」を定量的に解析し、相関関係を調べることが重要であると考えられており、かかる事情から、局所におけるがん遺伝子産物の量、すなわちＨＥＲ２タンパク質等のがん関連タンパク質量を定量的に検出することができる判定方法の開発が必要とされている。

近年、ＤＡＢによる酵素法に代わり、検出感度・定量性が優れた検出方法として量子ドット等の蛍光性粒子が注目されている。量子ドットは粒子数と蛍光輝度が比例関係にあるため、量子ドットと抗体とを結合させたプローブを免疫組織化学法に用いることによって、がんマーカータンパク質の量を高精度で定量的に解析することができる可能性がある。

また、乳がん患者におけるトラスツズマブ単剤投与での奏効率は１５〜３４％であり、抗体医薬としてはその効果が低いことも問題となっている。ＤＡＢ法を用いた免疫組織染色によりＨＥＲ２の過剰発現が確認されたにもかかわらず、トラスツズマブによる治療効果が低い患者においては、トラスツズマブが認識するＨＥＲ２の細胞外ドメインが欠失していることが報告されており（Nahta R et al, Breast Cancer Res. 2006;8:215-223、Scaltriti M et al, J. Natl. Cancer Inst. 2007;99:628-638）、乳がんの診断においてＨＥＲ２の検出に用いる抗ＨＥＲ２抗体が認識するＨＥＲ２の抗原部位と、乳がんの治療においてトラスツズマブが認識するＨＥＲ２の抗原部位が異なっていることが上記問題の原因のひとつとして考えられる。

Nahta R et al, Breast Cancer Res. 2006;8:215-223 Scaltriti M et al, J. Natl. Cancer Inst. 2007;99:628-638

量子ドット等の蛍光粒子は、自身が有する光安定性と定量的な解析に威力を発揮することから、蛍光免疫染色における新たなツールとして期待が高まっているが、現時点では定量的な解析としては培養細胞に限定されている。その理由として、培養細胞では細胞の自家蛍光が弱いため、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を十分高いＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比として算出できるのに対し、生体組織では培養細胞に比べ非常に強い自家蛍光を有するため、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を十分高いＳ／Ｎ比として算出できないことが大きな原因である。生体組織の長波長の自家蛍光は、短波長の自家蛍光と比べ量が少ないものの、観察において自家蛍光の影響を無視することはできず、定量的な解析は困難であった。さらに、乳がんの診断においてＨＥＲ２タンパク質の検出に用いる抗体とＨＥＲ２タンパク質を標的とした治療薬（抗体）の抗原決定基（エピトープ）が異なることから、現在の抗ＨＥＲ２抗体を用いたＩＨＣ法は、トラスツズマブの抗原決定基を含むＨＥＲ２が過剰発現したトラスツズマブ投与適応患者を選定する方法として不十分であると考えられた。本発明の課題は、生体組織の定量的な組織染色法により、トラスツズマブ等の抗体医薬の有効成分である抗体や、有効成分の標的部位へのターゲットのための抗体が認識するタンパク質を高精度に定量することにより、かかる抗体を成分として含む医薬品による治療有効性の判定方法を提供することにある。

本発明者らは、量子ドット蛍光粒子で直接標識したトラスツズマブを用いた生体組織染色法を行うことにより、トラスツズマブ投与適応患者をより正確に選定することができると考えた。そして、生体組織染色法における自家蛍光の影響を除く方法を鋭意検討する中で、量子ドット蛍光粒子（Ｑｄｏｔ７０５）で標識されたトラスツズマブの有効成分である抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ＋ＱＤ７０５）で免疫染色した乳がん組織試料を波長が４８８ｎｍの励起光で照射し、量子ドット蛍光粒子の蛍光画像（量子ドット蛍光粒子の蛍光＋自家蛍光）を、蛍光波長の取得領域が６９５〜７４０ｎｍのバンドパスフィルタを通して取得した後、かかる蛍光画像と全く同じ焦点面及び同じ視野で自家蛍光のみの自家蛍光画像を、蛍光波長の取得領域が６４０〜６９０ｎｍのバンドパスフィルタを通して取得し、蛍光静止画像の各ピクセルの蛍光輝度から、自家蛍光画像において相当する各ピクセルの蛍光輝度を引くことによって、蛍光静止画像から自家蛍光画像（自家蛍光）を引いた量子ドット蛍光粒子の蛍光のみの画像（補正蛍光画像）を取得できることを見いだした。また、補正蛍光画像に含まれる量子ドット蛍光粒子の粒子数を特定するために、量子ドット特有の「ブリンキング（明滅）性」を利用した。すなわち、１粒子の量子ドット蛍光粒子であれば、２０秒間の励起光照射時間においてoff−state（滅状態）は約４秒になるため、約４秒間のoff−state（滅状態）を持つ粒子の平均輝度を量子ドット蛍光粒子１粒子の蛍光輝度として算出したところ、補正蛍光画像において１細胞あたりの量子ドット蛍光粒子の粒子数を算出できることが確認された。また、乳がん患者の乳腺組織において、トラスツズマブ＋ＱＤ７０５で検出される量子ドット蛍光粒子数を算出することにより、ＩＨＣ−ＤＡＢ法よりも広いレンジでＨＥＲ２タンパク質の発現量を定量できることが確認された。さらに、トラスツズマブ＋ＱＤ７０５で検出される量子ドット蛍光粒子数とトラスツズマブによる治療効果との相関が認められた。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、（１）（ａ）抗体を成分として含む医薬品における抗体を蛍光物質で標識し、該蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる工程；（ｂ）前記抗体が接触した組織部位に励起光を照射し、蛍光画像を取得する工程；（ｃ）前記蛍光画像と同一視野及び同一焦点における、前記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域よりも短波長側又は長波長側の近傍領域の自家蛍光画像を取得する工程；（ｄ）前記蛍光画像の蛍光輝度から、前記自家蛍光画像の蛍光輝度を除く画像処理をし、補正蛍光画像を取得する工程；を備えた組織染色方法を用いることを特徴とする抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法や、（２）抗体を成分として含む医薬品における抗体が、がんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体であることを特徴とする上記（１）記載の判定方法や、（３）がんの増殖制御因子又は転移制御因子がＨＥＲ２（human epidermal growth factor receptor 2）であることを特徴とする上記（２）記載の判定方法や、（４）がんが、乳がんであることを特徴とする上記（２）又は（３）記載の判定方法や、（５）蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域とその近傍領域の波長の差が１００ｎｍ以内であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の判定方法や、（６）蛍光物質が、蛍光粒子であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の判定方法や、（７）蛍光粒子が、量子ドット蛍光粒子であることを特徴とする上記（６）記載の判定方法や、（８）さらに（ｅ）抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする工程；（ｆ）蛍光画像を基に、蛍光粒子１粒子を特定し、該蛍光粒子１粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光粒子１粒子の平均蛍光輝度を計測する工程；（ｇ）補正蛍光画像内の全蛍光輝度を、前記蛍光粒子１粒子の平均蛍光輝度で除して蛍光粒子数を求め、該蛍光粒子数を工程（ｅ）でカウントした細胞数で除し、１細胞あたりの蛍光粒子数を算出する工程；を備えたことを特徴とする上記（６）又は（７）記載の判定方法や、（９）蛍光粒子が有する明滅性を利用して、蛍光粒子１粒子を特定することを特徴とする上記（８）記載の判定方法に関する。

本発明によると、例えば、自家蛍光の影響を除き、量子ドット蛍光粒子で標識したトラスツズマブを用いた組織染色法により、従来の乳がんの診断方法の一つとして用いられている組織染色法（ＩＨＣ−ＤＡＢ法）よりも広いレンジでＨＥＲ２タンパク質の発現量を定量することが可能となり、ＩＨＣ−ＤＡＢ法に代わる高感度で定量的な新たな乳がんの病理診断を行うことができる。さらに、量子ドット蛍光粒子で標識したトラスツズマブの有効成分である抗ＨＥＲ２抗体によるＨＥＲ２タンパク質の検出レベルと、トラスツズマブによる治療効果との相関が認められたことから、本発明によりトラスツズマブの治療効果を予測することが可能となることが期待される。このように本発明によると、トラスツズマブに限らず、抗体を成分として含む医薬品全般の有効性をも判定できる。また、本発明の抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法と従来技術のＦＩＳＨ法等とを組み合わせることで、乳がんにおけるＨＥＲ２の遺伝子コピー数とＨＥＲ２タンパク質量を共に定量的に評価することが可能となり、乳がんにおけるがん治療を進める上で有効である。

（ａ）量子ドット蛍光粒子を用いた免疫染色（ＩＨＣ−ＱＤｓ）法を行った組織試料の作製を示す図である。（ｂ）抗体（トラスツズマブ）のチオール基と量子ドット蛍光粒子のマレイミド基とのカップリング反応を示す図である。 取得した蛍光画像の代表的な図である。 自家蛍光の影響を除く従来方法を説明する図である。（ａ）は励起光照射による自家蛍光褪色法（Hikage et al. Nanotechnology （2010）参照）の結果を示す図であり、（ｂ）はコントラスト調整法の説明図である。（ｂ）中に示すグレー領域は、ヒトの目で黒く見える範囲を表している。 （ａ）引き算法による画像処理における画像変換を示す図である。（ｂ）量子ドット蛍光粒子の蛍光波長特性と自家蛍光の蛍光波長特性を示す図である。実線は量子ドット蛍光粒子（ＱＤ７０５）の蛍光波長特性を示す。またエラーバー付きプロットは、蛍光波長の取得領域が５０５〜５４５ｎｍ、５６５〜５９５ｎｍ、５８５〜６３０ｎｍ、６４０〜６９０ｎｍ、６９５〜７４０ｎｍ、及び７６０〜８００ｎｍの計６種類のバンドパスフィルタそれぞれで取得した、組織試料切片上の自家蛍光の蛍光輝度の実測値を示す。かかる実測値の平均値プロットを点線でつなぎ、自家蛍光の蛍光波長特性として示す。また、バンドパスフィルタの波長幅はバーで示す。 自家蛍光を除いた補正蛍光画像の作成法を示す図である。 ＩＨＣ−ＤＡＢ法により病理診断を行った組織試料において、ＩＨＣ−ＤＡＢ法の染色結果とＩＨＣ−ＱＤｓ法による染色結果を示す図である。 量子ドット蛍光粒子が有するブリンキング（明滅）性を示す図である。縦軸に量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を、横軸に量子ドット蛍光粒子の励起光による照射時間（秒）を示す。矢頭は、量子ドット蛍光粒子の最大蛍光輝度の１０％を蛍光輝度の閾値として設定していることを示す。 （ａ）ＦＩＳＨ法により算出したＨＥＲ２遺伝子コピー数とＩＨＣ−ＤＡＢ法により算出したＨＥＲ２タンパク質量との関係を示す図である。図中ＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅ２．２は、病理判断するためのＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅの閾値を示す。（ｂ）ＦＩＳＨ法により算出したＨＥＲ２遺伝子コピー数とＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出したＨＥＲ２タンパク質量との関係を示す図である。図中ＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅ２．２及びＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅ５．５は、それぞれ病理判断するためのＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅ及びＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅの閾値を示す。 ＩＨＣ−ＤＡＢ法の操作手順とＩＨＣ−ＱＤｓ法の操作手順とを示す図である。 ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出したＨＥＲ２タンパク質量とＩＨＣ−ＤＡＢ法により算出したＨＥＲ２タンパク質量との関係を示す図である。 （ａ）ＦＩＳＨ法により算出したＨＥＲ２遺伝子コピー数とトラスツズマブによる治療効果（ＴＴＰ［Time To Progression；薬剤投与により腫瘍増殖が制御されている期間］）との関係を示す図である。（ｂ）ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出したＨＥＲ２タンパク質量とトラスツズマブによる治療効果（ＴＴＰ［Time To Progression；薬剤投与により腫瘍増殖が制御されている期間］）との関係を示す図である。

本発明の抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法としては、抗体を成分として含む医薬品における抗体を蛍光物質で標識し、該蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる工程（ａ）；前記抗体が接触した組織部位に励起光を照射し、蛍光画像を取得する工程（ｂ）；前記蛍光画像と同一視野及び同一焦点における、前記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域よりも短波長側又は長波長側の近傍領域の自家蛍光画像を取得する工程（ｃ）；前記蛍光画像の蛍光輝度から、前記自家蛍光画像の蛍光輝度を除く画像処理をし、補正蛍光画像を取得する工程（ｄ）；を備えた組織染色方法を用いる方法（但し、医師による診断行為を除く。）であれば特に制限されないが、さらに、抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする工程（ｅ）；蛍光画像を基に、蛍光粒子１粒子を特定し、該蛍光粒子１粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光粒子１粒子の平均蛍光輝度を計測する工程（ｆ）；補正蛍光画像内の全蛍光輝度を、前記蛍光粒子１粒子の平均蛍光輝度で除して蛍光粒子数を求め、該蛍光粒子数を工程（ｅ）でカウントした細胞数で除し、１細胞あたりの蛍光粒子数を算出する工程（ｇ）；を備えることが好ましく、また、本発明の抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定システムとしては、（Ａ）蛍光物質で標識された抗体を成分として含む医薬品における抗体；（Ｂ）励起光照射手段；（Ｃ）蛍光画像取得手段；（Ｄ）蛍光画像取得用バンドパスフィルタ；を備えたシステムであれば特に制限されないが、さらに、（Ｅ）細胞核蛍光画像を取得するバンドパスフィルタ；を備えたシステムが好ましく、上記抗体を成分として含む医薬品が投与される対象としては、例えばがん患者、感染症患者、自己免疫疾患患者等を挙げることができ、これらの中でもがん患者を好適に例示することができる。

がん患者に投与される、抗体を成分として含む医薬品における抗体としては、がんの増殖制御因子又は転移制御因子等を標的抗原とし該標的抗原に結合する抗体を有効成分とし、該抗体ががん細胞に結合することによってがん細胞の増殖を抑える、又はがん細胞を死滅させる抗体を挙げることができる。また、抗体を成分として含む医薬品としては、前記抗体を有効成分とする医薬品の他、抗がん剤、抗ウィルス剤、抗生物質等を有効成分とし、がん細胞へのデリバリー手段として抗体が含まれる医薬品等を挙げることができる。上記抗体医薬品としては、例えばシナジス（Synagis）、レミケード（Remicade）、リツキサン（Rituxan）、トラスツズマブ（Trastuzumab）等を挙げることができ、これら中でもトラスツズマブを好適に例示することができる。上記がんとしては、大腸がん、直腸がん、腎がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、血液がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、肺がん、乳がん等を挙げることができる。また、がんの増殖制御因子又は転移制御因子のうち、がんの増殖制御因子としては、例えば表皮増殖因子（ＥＧＦ：epidermal growth factor）、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：platelet-derived growth factor）、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ：insulin-like growth factor）、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：fibroblast growth factor）、ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：vascular endotherial growth factor）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ：hepatocyte growth factor）、ＨＧＦ受容体（ＨＧＦＲ）、神経栄養因子（ＮＴ：neurotropin）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ：transforming growth factor-β）ファミリー、ヒト上皮成長因子受容体１、２、３若しくは４（ＨＥＲ１、２、３若しくは４：human epidermal growth factor receptor 1,2,3or4）、マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ１：macrophage colony- stimulating factor 1）、ＣＳＦ１受容体（ＣＳＦ1Ｒ）等の細胞増殖を調節する因子、並びに、サイクリン（cyclin）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ：cyclin-dependent kinase）、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ｐ１６ＩＮＫ、ｐ１５、ｐ２１、ｐ２７、ＲＢ（retinoblastoma）等の細胞周期を調節する因子を挙げることができ、がんの転移制御因子としては、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ１）、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）、ＰＡＲ１（protease activated receptor 1）、ＣＸＣＲ４（chemokine[Ｃ−Ｘ−Ｃ motif] receptor ４）、ＣＣＲ７（chemokine [Ｃ−Ｃ motif] receptor ７）等を挙げることができ、これらの中でもＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブが広く用いられているため、ＨＥＲ２を好適に例示することができる。

抗体を成分として含む医薬品の有効性を判定するために、例えば遺伝子診断法を併用することが好ましく、酵素と基質の発色反応を利用した免疫組織化学法等の従来の判定方法と比較検討することもできる。遺伝子診断法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ＦＩＳＨ法等を挙げることができ、酵素と基質の発色反応利用した免疫組織化学法としては、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とＨＲＰの基質であるＤＡＢ（3，3’-diaminobenzidine）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とＡＬＰの基質であるＢＣＩＰ/ＩＮＢＴ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/ nitro blue tetrazolium）、β−ガラクトシダーゼとβ−ガラクトシダーゼの基質であるＸ−ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-galactopyranoside）等を用いた方法を挙げることができる。これらの中でも乳がんにおけるトラスツズマブの有効性を判定する場合、ＦＩＳＨ法及び／又はＨＲＰとＤＡＢを用いた免疫組織化学（ＩＨＣ−ＤＡＢ）法の併用を好適に例示することができる。

本発明の抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法、及び抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定システムにおいて、有効性を判定する対象となる医薬品としては、抗体を有効成分として含む医薬品に限定されず、抗がん剤、抗ウィルス剤、抗生物質等を有効成分とし、がん細胞へのデリバリー手段としてがん細胞特異的タンパク質を認識する抗体が含まれる医薬品や、有効成分が標的とする因子（タンパク質）の関連するシグナル伝達経路の因子を標的とする抗体を含む医薬品等を挙げることができる。上記抗体を成分として含む医薬品における抗体がＨＥＲ２である場合、ＨＥＲ２のシグナル伝達経路の下流に存在する因子として、例えば細胞増殖に関与する因子Ｒａｓ、Ｒａｆ等や、抗アポトーシス因子ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ等を挙げることができる。

上記工程（ａ）において、抗体を成分として含む医薬品における抗体としては、がんの増殖制御因子や転移制御因子やがん細胞特異的タンパク質などを特異的に認識する抗体が好ましく、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。また抗体のクラスやサブクラスは特に制限されず、クラスとしては、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ等を挙げることができ、サブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等を挙げることができる。また、ここでいう「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’_２、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。かかる抗体は、公知の方法で製造することができる（例えば、Harlow E. & Lane D., Antibody, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) を参照）。

上記工程（ａ）における蛍光物質としては、選択された波長の紫外光、可視光等の放射線による照射により蛍光を発する物質であれば特に制限されないが、例えば、有機蛍光物質としてはフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ−５、Ｃｙ−３、アレクサ等が挙げられ、無機蛍光物質としては、蛍光シリカナノ粒子、量子ドット蛍光粒子等の蛍光粒子を挙げることができる。そして、長波長側の方が自家蛍光の影響は少ないため、近赤外領域側、特に近赤外領域の蛍光を発する蛍光物質を用い、該蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域が近赤外領域側（５７０〜８００ｎｍ）、特に近赤外領域（７００〜８００ｎｍ）であることが好ましい。上記有機蛍光物質は、励起光による褪色が急速に生じるため、長時間励起光を照射する解析には不向きであるため、光安定性に富み、長時間励起光を照射しても安定である蛍光粒子、中でも量子ドット蛍光粒子を用いることが好ましい。蛍光粒子としては、励起光の照射により蛍光を発する粒子であればよく、その素材等も制限されず素材自体が蛍光を発するものでも、蛍光物質が含まれた粒子や蛍光物質がコーティングされたことにより、蛍光を発することができる粒子でもよい。また、蛍光粒子の形やサイズは特に限定されず、方形、円盤状、多面体、球状等を挙げることができるが、球状が好ましく、そのサイズは、直径０．００００１ｎｍ〜１ｍｍ、好ましくは直径０．００１ｎｍ〜１００μｍ、更に好ましくは直径０．０１ｎｍ〜１０μｍであり、蛍光粒子が発する蛍光の波長も適宜選択することができる。蛍光粒子は特開平９−２４１６３４や特開２０１０−２４２０５９などに開示された方法により作製することもできるが、ポリスチレン粒子をポリスチレンコア粒子の存在下で適切な蛍光色素またはスチレンの蛍光色素の重合により染色することで調製されたＳＰＨＥＲＯ蛍光粒子（ベイバイオ社製）や、蛍光粒子Estapor（登録商標）標準マイクロ粒子（Merck Chime社製）等の市販品を入手することもできる。蛍光粒子の中でも、コロイド状量子ドット（ＱＤ：Quantum Dot）とも呼ばれる量子ドット蛍光粒子が、蛍光粒子は非常に鋭い発光スペクトルと高い量子効率を併せもつという特性を有することから好ましい。量子ドット蛍光粒子は発光性の半導体ナノ粒子で、直径の範囲は１〜２０ｎｍであり、生物学および医学診断の分野における蛍光イメージングに利用されている。量子ドット蛍光粒子には、輪郭が明確で３次元かつナノサイズの半導体結晶に電子が量子的に閉じ込められており、量子ドット蛍光粒子のサイズが小さくなると半導体のバンドギャップが大きくなるため、サイズによって半導体の光ルミネセンス発光波長を可視スペクトル全体にわたって調節することが可能である。本発明にける量子ドット蛍光粒子としては、発光性の半導体ナノ粒子であればよく、そのサイズは、励起光及び蛍光の波長から、粒子サイズを適宜調節することが好ましい。かかる量子ドット蛍光粒子として、例えば、半導体シェル（ＺｎＳ）で被覆された半導体素材（ＣｄＳｅ）のナノクリスタルである、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ５６５、Ｑｄｏｔ５８５、Ｑｄｏｔ６０５、Ｑｄｏｔ６２５、Ｑｄｏｔ６５５、Ｑｄｏｔ７０５、Ｑｄｏｔ８００（全てInvitrogen社製）等を利用することができる。取得する蛍光波長が８００ｎｍを越えるとカメラの感度が落ちるため、近赤外領域の蛍光を発する量子ドット蛍光粒子のうち、７０５ｎｍの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子（Ｑｄｏｔ７０５）を用いることが好ましい。

上記工程（ａ）において、抗体を蛍光物質で標識する方法としては、該抗体に対して親和性を有する抗体（二次抗体）を介する方法、ビオチン−アビジン法、チオール基−マレイミド基のカップリング反応法、既存の化学リンカーを用いる方法、架橋剤（ＥＤＣ等）を用いた架橋反応法、イオン結合法等を挙げることができるが、上記抗体がヒト化抗体、又はヒト抗体である場合、これらの中でもチオール基−マレイミド基のカップリング反応法を好適に例示することができる。

上記工程（ａ）における組織試料としては、ホルマリン固定パラフィン切片や凍結切片等の固定組織試料切片を例示することができ、病理組織試料、末梢血組織試料、組織から分離された細胞や体液から分離された細胞のセルブロック試料、末梢血白血球又は細胞の浮遊試料を沈降又は遠沈して作成されるセルブロック試料、組織の捺印試料、末梢血、体液、滲出液、細胞を含む液体の塗沫試料等を挙げることができる。

上記工程（ａ）において、前記蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる方法としては特に制限されず、前記接触により抗原−抗体反応が生じることから、接触時の温度は、０〜４０℃が好ましい。また接触時間は、用いる組織試料の種類、抗体の濃度、タイターの高さ、上記接触（反応）温度、標的因子（抗原）の量、局在部位等により異なり、特に限定されず適宜選択されるが、１０分〜１２時間、好ましくは１０分〜２時間を挙げることができる。また、抗体の非特異的な結合を防ぐために、抗体と組織試料とを接触させる前に、ＦＢＳ、ＢＳＡ、ＩｇＧ等でブロッキング処理を行うことができる。

上記工程（ｂ）における励起光の励起波長としては、蛍光物質が発光する蛍光波長よりも短波長であり、人体に対する安全性の面から好ましくは４００〜７００ｎｍ、より好ましくは４５０〜６５０ｎｍ、特に一般的な励起波長に用いられる４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、又は６３５ｎｍを具体的に挙げることができる。

上記工程（ｂ）における蛍光画像としては、蛍光静止画像や、蛍光静止画像及び該蛍光静止画像に対応する蛍光動画像を挙げることができる。上記蛍光静止画像は、一般的なＰＣ等のコンピュータをコントローラとして用い、ＣＣＤカメラの撮影条件の制御、取得蛍光静止画像の画像化と表示、光源の光量の制御等を行うことができる蛍光顕微鏡を用いて取得することができる。蛍光物質が発光する蛍光輝度が飽和しないように、励起光側のフィルター、ダイクロイックミラー等の必要な設定を行い、さらには励起光の露光時間が０．０３から３０〜６０秒になるように設定するのが好ましい。蛍光物質の蛍光各画素輝度が飽和していないかどうか確認する方法として、予め指定した輝度値又は輝度値の最大値に対する予め指定した割合の輝度値（例えば８ビット画像ならば２５５が最大値であるので、２２０という数値や、輝度の最大値の９０％）を設定し、その値を越えたときに飽和していると判断してもよい。また、このとき１つの画素のみでなく、画像全体の予め指定した割合の複数の画素を用いて判断してもよい。蛍光静止画像における蛍光物質の蛍光輝度が１粒子由来であるかどうかを特定する場合に、必要に応じて蛍光動画像を取得することができる。上記蛍光動画像としては、上記蛍光静止画像と同一視野及び同一焦点における動画像を２〜５００ｍｓｅｃの分解能で５０〜２００フレーム取得するのが好ましい。上記蛍光画像を取得するバンドパスフィルタとして、蛍光物質が発する赤、シアン、オレンジ、緑、青等の特定の波長の蛍光のみを透過するように選択されるバンドパスフィルタを用い、上記蛍光物質の全蛍光輝度の２５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上を取得できるバンドパスフィルタを使用するのが望ましい。さらに、上記蛍光画像を取得するバンドパスフィルタは、上記蛍光物質の蛍光輝度の３０％を３０ｎｍ以内、好ましくは１５ｎｍ以内、より好ましくは５ｎｍ以内の波長領域で取得できるバンドパスフィルタを使用するのが望ましい。例えば７０５ｎｍの蛍光を発する蛍光物質を使用する場合、上記蛍光画像を取得するバンドパスフィルタは、蛍光波長の取得領域が６９５〜７４０ｎｍであるバンドパスフィルタであることが好ましい。

上記工程（ｃ）において、自家蛍光画像を取得する方法としては、蛍光物質が発する蛍光波長を取得するために用いたバンドパスフィルタを、該バンドパスフィルタよりも短波長側又は長波長側の近傍領域、好ましくは短波長側の近傍領域の波長を取得できるバンドパスフィルタに代え、上記蛍光静止画像と同一視野及び同一焦点条件下で画像を取得し、蛍光物質の蛍光を含まず、自家蛍光のみが含まれた画像を取得する方法を挙げることができる。長波長の蛍光は、短波長の蛍光と比べ屈折が小さく、短波長の蛍光よりも遠くで焦点を結ぶため、上記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域と自家蛍光画像を取得する波長領域の波長が大きく異なると、上記蛍光静止画像に含まれる自家蛍光の焦点と、自家蛍光画像の自家蛍光の焦点とのずれが大きくなってしまう。このため、上記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域とその近傍領域の波長の差は、１３０ｎｍ以内、好ましくは１２０ｎｍ以内、より好ましくは１１０ｎｍ以内の領域、特に１００ｎｍ以内を好適に例示することができる。本発明の蛍光画像や自家蛍光画像を取得するために用いるバンドパスフィルタとしては、具体的に蛍光波長の取得領域が５０５〜５４５ｎｍ、５６５〜５９５ｎｍ、５８５〜６３０ｎｍ、６４０〜６９０ｎｍ、６９５〜７４０ｎｍ、７６０〜８００ｎｍ等のバンドパスフィルタを挙げることができ、例えば蛍光波長の取得領域が６９５〜７４０ｎｍのバンドパスフィルタを用いて上記蛍光静止画像を取得する場合、自家蛍光画像を取得するバンドパスフィルタは、蛍光波長の取得領域が６４０〜６９０ｎｍであるバンドパスフィルタが好ましい。上記自家蛍光画像を取得するための撮影条件は、上記蛍光静止画像と該自家蛍光画像の同じ領域の自家蛍光の輝度を比較し、任意のＲＯＩ、例えば２５×２５ピクセルの自家蛍光の最大値が蛍光静止画像よりも自家蛍光画像の方が１．１〜１．３倍、好ましくは１．２倍になるように設定する。すなわち、自家蛍光画像の方が蛍光静止画像よりも１０〜３０％、特に２０％程度自家蛍光の輝度を高い値にすることが好ましい。

上記工程（ｄ）において、補正蛍光画像を取得する方法としては、蛍光静止画像及び自家蛍光画像をＪＰＥＧやＴＩＦ等の画像ファイルに変換した後、Image J（http://rsb.info.nih.gov/ij/）、Photoshop（Adobe社製）、After Effect（Adobe社製）、G−Count（株式会社ジーオングストローム社製）等の画像解析ソフトを用いて、自家蛍光画像の輝度を基に蛍光静止画像の輝度から自家蛍光の輝度を除く処理を挙げることができる。なお、画像ファイルに変換する際、すべての蛍光分布が入るように閾値を選択するのが好ましい。

上記工程（ｅ）において、抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする方法としては、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ＰＩ（Propidium Iodide）等のＤＮＡに結合して蛍光を発する核酸染色剤で細胞核を染色した後、蛍光画像と同一視野における染色された細胞核数の総数をカウントする方法を挙げることができるが、蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域が近赤外領域である場合、蛍光特性が類似している赤色の蛍光を発するＰＩよりも青色の蛍光を発するＤＡＰＩ、又はヘキストを用いることが好ましい。

上記工程（ｆ）において、蛍光粒子１粒子を特定する方法としては、例えば蛍光画像における蛍光粒子の蛍光輝度を測定し、蛍光１粒子が発する蛍光の輝度情報を基に上記蛍光粒子が何粒子に相当するか求める方法や、蛍光粒子が有する「ブリンキング（明滅）性」を利用する方法等を挙げることができるが、蛍光粒子が量子ドット蛍光粒子である場合、ブリンキング（明滅）性を利用する方法が好ましい。ここで「ブリンキング（明滅）性」とは、励起光を照射したときの照射時間もしくは照射量に対して発光強度が突然殆どゼロ（ＯＦＦ）となる滅時間（消滅時間）が数ｍｓｅｃ〜５ｓｅｃ近く続き、再び元の発光強度を得ることを繰り返す性質のことをいう。また、「ブリンキング（明滅）性」を利用した蛍光粒子１粒子を特定する方法とは、蛍光静止画像又は蛍光動画像を基に、励起光を任意の時間、例えば１０〜１００秒照射した場合の蛍光粒子の消滅時間を測定し、該蛍光粒子が１粒子であるかの評価を行い、蛍光粒子１粒子を特定する方法のことをいう。例えば蛍光粒子として７０５ｎｍの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子を用いる場合、励起光を２０秒間照射した場合の量子ドット蛍光１粒子の消滅時間は約４秒となり、すなわち消滅時間が約４秒である蛍光粒子を１粒子由来の量子ドット蛍光粒子であると特定できる。ここで量子ドット蛍光粒子が消滅したかどうかを判断するために、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度の閾値を適宜設定することができ、例えば量子ドット蛍光粒子の最大蛍光輝度の０〜３０％、好ましくは５〜１５％、より好ましくは１０％を閾値として設定する。特定した１粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光輝度を、Image J、Photoshop、After Effect、G-Count等の画像解析ソフトを用いて測定する。上記測定により１粒子の平均蛍光輝度の算出は、労力と正確性を考慮すると、２〜２００蛍光粒子、好ましくは５〜１０蛍光粒子を用いて行う。

上記工程（ｇ）においては、１細胞あたりの蛍光粒子数を算出する。１細胞あたりの蛍光粒子数は、上記補正蛍光画像から得られた量子ドット蛍光粒子の全蛍光輝度の値（画面内の全蛍光輝度）、上記細胞核染色画像から得られた細胞数、及び量子ドット蛍光粒子１粒子あたりの平均蛍光輝度の値（１粒子蛍光輝度）を、式［（画面内の全蛍光輝度／１粒子蛍光輝度）／細胞数＝画像内の全蛍光粒子数／細胞数＝蛍光粒子数／細胞］に入力することにより算出することができる。

上記工程（ａ）〜（ｄ）を備えた本発明の判定方法により、判定対象の組織試料と正常組織試料の補正蛍光画像をそれぞれ取得し、両補正蛍光画像内の蛍光輝度を比較して、判定対象の組織試料の補正蛍光画像における蛍光輝度の方が高い場合、医薬品に含まれる抗体が認識するタンパク質が多いことが示唆されるため、判定対象を、かかる医薬品による治療効果が見込まれると判定することや、かかる医薬品投与適用患者として好適であると判定することができる。また、上記工程（ａ）〜（ｇ）を備えた本発明の判定方法により、判定対象の組織試料と正常組織試料の１細胞あたりの蛍光粒子数をそれぞれ算出し、両者を比較して、判定対象の組織試料における１細胞あたりの蛍光粒子数の方が多い場合、医薬品に含まれる抗体が認識するタンパク質が多いことが示唆されるため、判定対象を、かかる医薬品による治療効果が見込まれると判定することや、かかる医薬品の投与適用患者として好適であると判定することができる。例えば、乳がんの抗体医療品であるトラスツズマブの有効成分である抗ＨＥＲ２抗体を量子ドット蛍光粒子で標識し、かかる量子ドット蛍光粒子標識抗体を用い、１細胞あたりのトラスツズマブにより検出される蛍光粒子数を求め、その数を指標にして、トラスツズマブ投与適応患者を選定することや、トラスツズマブの治療効果を予測することができる。

前記本発明の判定システムにおける励起光照射手段としては、水銀ランプ（１００Ｖ）、水銀ランプ（２００Ｖ）、キセノンランプ（７５Ｖ）、キセノンランプ（１５０Ｖ）、ハロゲンランプ（１２Ｖ１００Ｗ）、タングステンランプ（６Ｖ３０Ｗ）、キセノンランプ［波長２５０〜１，０００ｎｍ］、タングステンランプ［波長２５０〜１，０００ｎｍ］、Ｃｒ：ＬｉＳＡＦランプ［波長４３０ｎｍ］、ヘリウム−カドミニウムレーザー［波長３２５、４４２ｎｍ］、ＵＶアルゴンレーザー［波長３５１、３６４ｎｍ］、アルゴンイオンレーザー［波長４８８、５１４ｎｍ］、ヘリウムネオンレーザー［波長５４３、５９４、６３３ｎｍ］、クリプトンイオンレーザー［波長５６８、６４７ｎｍ］、ＬＤ励起ＣＷ／Ｑ−ＣＷ（連続発振／準連続発振）固体レーザー［波長３７５ｎｍ、４０５、４４０、４７３、４８８、５０５、５１５、５３２、５６１、５９４、６３５、７８５、１０６４ｎｍ］等を挙げることができ、これら中でも、人体に対する安全性の面から４００〜７００ｎｍの励起波長、好ましくはＬＤ励起ＣＷ／Ｑ−ＣＷ固体レーザー［波長４８８、５３２、６３５ｎｍ］を好適に例示することができる。

また、本発明の判定システムにおける蛍光画像取得手段としては、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡等を挙げることができる。かかる蛍光画像取得手段により、取得できる蛍光画像としては、蛍光静止画像と自家蛍光画像、必要に応じて蛍光動画像を挙げることができる。

また、本発明の判定システムにおける蛍光画像取得用バンドパスフィルタとしては、蛍光静止画像（蛍光動画像）及び自家蛍光画像の取得用バンドパスフィルタを挙げることができ、また、細胞核蛍光画像を取得するバンドパスフィルタとしては、使用する核酸染色剤の蛍光特性によって異なり、例えばＤＡＰＩの最大蛍光波長が４６１ｎｍ、ヘキスト３３３４２、及びヘキスト３３２５８の最大蛍光波長が４６５ｎｍ、ＰＩ（Propidium Iodide）の最大蛍光波長が６１７ｎｍであることから、それら波長を十分カバーするバンドパスフィルタを用いることが好ましい。

以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。

［ＩＨＣ−ＱＤｓ法を用いて免疫染色した組織試料の作製法］
ヒト乳がん病理組織として、ＩＨＣ−ＤＡＢ法に基づいた評価が、Ｓｃｏｒｅ０が６例、Ｓｃｏｒｅ１が６例、Ｓｃｏｒｅ２が１１例、Ｓｃｏｒｅ３が１４例の計３７例を選択した。また、症例の背景は、表１に示すように偏りの無い様に配慮した。上記３７例の組織について一般的な病理組織診断に用いる方法で、組織試料を調製した。すなわち、がん患者の乳房組織検体をホルマリンを用いて固定し、アルコールで脱水処理をした後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸しパラフィン包埋を行い、組織試料を作製した（図１（ａ））。続いて上記組織試料を２〜４μｍの切片にし、キシレンで脱パラフィン処理を行い、アルコール処理を行った後、脱イオン水で洗浄した。抗体が効率的に固定組織内の抗原部位へアクセスできるようにするために、上記試料の賦活化を１０ｍＭクエン酸溶液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間条件下で行い、固定組織構造を緩める処理を施した。続いて上記試料を脱イオン水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で順次洗浄した後、７０５ｎｍの蛍光を発する量子ドット蛍光粒子（Ｑｄｏｔ７０５）で標識されたトラスツズマブの有効成分であるＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ＋Ｑｄｏｔ７０５）１５ｎＭを含むＰＢＳ溶液中で２５℃、３時間抗体反応を行った。ここでは、トラスツズマブにＱｄｏｔ７０５を標識する方法として、還元されたトラスツズマブのチオール基と量子ドット蛍光粒子のマレイミド基との間のカップリング反応を用いた（図１（ｂ））。なお、コントロールとしてＱｄｏｔ７０５で標識されたヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＧ＋Ｑｄｏｔ７０５）を用いた。ＰＢＳ溶液で４回洗浄した後、細胞数をカウントするためにＤＡＰＩ染色（２μｇ/ｍｌ ＰＢＳ）を２５℃、１０分間行うことで細胞核を染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、封入し、免疫染色（ＩＨＣ−ＱＤｓ）法を行った組織試料を作製した（図１（ａ））。

［蛍光免疫組織染色法の問題点］
上記実施例１で作製した免疫染色した組織試料について、共焦点ユニット（横河電機社製）、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）、及びElectron-Multiplier CCD（ＥＭ-ＣＣＤ）カメラ（Andor社製）を組み合わせた装置を用いて４８８ｎｍの励起光を照射した後、波長取得領域が６９５−７４０ｎｍのバンドパスフィルタを用いて量子ドット蛍光粒子（トラスツズマブに標識）の蛍光画像（蛍光静止画像）を取得した。図２には、ＩＨＣ−ＤＡＢ法によりＳｃｏｒｅ３と評価された病例を例として示しているが、コントロールとしてヒトＩｇＧ＋Ｑｄｏｔ７０５を用いた場合は量子ドット蛍光粒子による蛍光は殆ど観察されないのに対して、トラスツズマブ＋Ｑｄｏｔ７０５を用いた場合、量子ドット蛍光粒子による蛍光が観察された。これらの結果は、ＨＥＲ２タンパク質にトラスツズマブが特異的に結合していることを裏付けており、トラスツズマブ＋Ｑｄｏｔ７０５は乳がん細胞に発現するＨＥＲ２タンパク質を特異的に検出できることを示している。他方、量子ドット蛍光粒子による蛍光に加えて自家蛍光によるバックグラウンドが存在することから、自家蛍光を排除する必要性が生じた。自家蛍光は組織試料の種類や組織試料内の場所によって大きく異なるため、一定の閾値を決められない。従って、量子ドット蛍光粒子（トラスツズマブに標識）の蛍光輝度を正確に計測するためには、自家蛍光を排除する必要がある。

生体組織染色における自家蛍光の影響を除く方法として、（ａ）励起光照射による自家蛍光褪色法、又は（ｂ）コントラスト調整法等が知られている（図３）。上記（ａ）励起光照射による自家蛍光褪色法に関して、量子ドット蛍光粒子が有する光安定性により、長時間光照射しても量子ドット蛍光粒子由来の輝度は褪色させず、自家蛍光のみを褪色させることは可能だが、自家蛍光の完全褪色には長時間必要であり、また照射面のみの自家蛍光しか褪色できないという欠点もある。また上記（ｂ）コントラスト調整法では量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度が自家蛍光の輝度と比べ十分強い場合は自家蛍光のみの輝度を消すことは可能だが、量子ドット蛍光粒子の輝度が自家蛍光の輝度と十分差が無い場合、コントラストの調整により量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度が消えてしまうことが考えられる。さらに、自家蛍光は試料の種類や場所によって大きく異なるため、一定の閾値を決められない。

［自家蛍光を除いた補正蛍光画像の作成］
必要なのは、バックグラウンドである自家蛍光の蛍光強度がゼロ（０）の蛍光静止画像である。そうすれば、蛍光静止画像内の全蛍光を量子ドット蛍光粒子由来の蛍光として計算することができる。上記実施例２のコントラスト調整法は、蛍光強度の割り算であるため、割り算ではゼロ（０）は作れず、したがってゼロ（０）を作り出せる引き算を用いた画像処理方法が必要となる。そこで、蛍光静止画像の自家蛍光を除く画像処理方法として、以下に示す方法を考案した。まず、励起波長が４８８ｎｍの励起光（レーザー）を用いて量子ドット蛍光粒子で免疫染色した乳がん組織試料に照射し、量子ドット蛍光粒子の蛍光画像（量子ドット蛍光粒子の蛍光＋自家蛍光）を、蛍光波長の取得領域が６９５〜７４０ｎｍのバンドパスフィルタで取得した後、かかる蛍光画像と全く同じ焦点面及び同じ視野で自家蛍光のみの自家蛍光画像を、蛍光波長の取得領域が６４０〜６９０ｎｍのバンドパスフィルタで取得する。続いて、かかる蛍光画像（量子ドット蛍光粒子の蛍光＋自家蛍光）及び自家蛍光画像を５１２×５１２ピクセルで取り込み、２５６階調のＪＰＥＧ画像に変換した後（図４（ａ））、蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子の蛍光＋自家蛍光）の各ピクセルに含まれる輝度情報（０−２５５の値）から自家蛍光画像（自家蛍光）に含まれる輝度情報（０−２５５の値）を引くことで、量子ドット蛍光粒子の蛍光のみの画像（補正蛍光画像）を作成する方法である。

かかる補正蛍光画像を作成するために、まず様々な波長範囲における自家蛍光の蛍光波長特性を調べた。量子ドット蛍光粒子で免疫染色しないがん組織試料を４８８ｎｍの励起波長で励起した後、蛍光波長の取得領域が５０５〜５４５ｎｍ、５６５〜５９５ｎｍ、５８５〜６３０ｎｍ、６４０〜６９０ｎｍ、６９５〜７４０ｎｍ、及び７６０〜８００ｎｍのバンドパスフィルタ計６種類を用いて、同一視野及び同一焦点の自家蛍光画像を取得した。かかる６種類のバンドパスフィルタで取得した自家蛍光画像全てに関して、同一領域の５１２×５１２ピクセルの画像をＪＰＥＧ画像へ変換し、かかるＪＰＥＧ画像において、同一領域の５１２×４２０ピクセル（トータル２１０５４０ピクセル）の画像を切り出した後、かかる画像内の蛍光輝度の平均値を求め、「自家蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル」を算出した（値1））。また、上記６種類のバンドパスフィルタで取得したそれぞれの自家蛍光画像において、自家蛍光が存在しない背景（バックグラウンド）の画像を背景蛍光画像として取得し、かかる背景蛍光画像の蛍光輝度を測定した。かかる測定では、２５×２５ピクセルの背景蛍光画像における蛍光輝度を任意の３領域で求め、「背景蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル」を算出した（値2））。なお、かかる３領域は、上記６種類のバンドパスフィルタで取得した各自家蛍光画像において、同一領域を測定した。上記1）及び2）の値を用い、背景蛍光の蛍光輝度を除いた自家蛍光の蛍光輝度平均値（以下、単に「自家蛍光の蛍光輝度」という）は、式「(自家蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル−背景蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル)×ピクセル数」＝「(値1）−値2）)×ピクセル数」を基に算出した。上記６種類のバンドパスフィルタそれぞれの自家蛍光の蛍光輝度を算出し、それぞれのバンドパスフィルタが取得する蛍光波長幅（５０５〜５４５ｎｍ：４０ｎｍ、５６５〜５９５ｎｍ：３０ｎｍ、５８５〜６３０ｎｍ：４５ｎｍ、６４０〜６９０ｎｍ：５０ｎｍ、６９５〜７４０ｎｍ：４５ｎｍ、７６０〜８００ｎｍ：４０ｎｍ）で除することにより、波長幅あたりの自家蛍光の蛍光輝度平均値を算出した。かかる波長あたりの自家蛍光の蛍光輝度を、それぞれのバンドパスフィルタが取得する蛍光波長の中心にプロットし、点線で結ぶことにより、自家蛍光の蛍光波長特性を示す図を作成した（図４（ｂ））。

次に、上記自家蛍光の蛍光波長特性に量子ドット蛍光粒子の蛍光波長特性を対応付けるために、上記実施例１に記載の方法により量子ドット蛍光粒子で免疫染色した乳がん組織試料を、４８８ｎｍの励起光で励起し、蛍光波長の取得領域が６９５〜７４０ｎｍのバンドパスフィルタを用いて蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）を取得した。続いて、かかる蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）と同一視野及び同一焦点の蛍光動画像を取得し、かかる蛍光動画像を用いて下記の実施例４で示す方法（量子ドット蛍光粒子が有する明滅反応を利用する方法）により量子ドット蛍光粒子の１粒子を特定した。その後、蛍光静止画像を用いて、特定した量子ドット蛍光粒子の１粒子の蛍光輝度を測定した。すなわち、自家蛍光と重なっていない量子ドット蛍光粒子の１粒子に注目し、かかる１粒子の蛍光が全て網羅されるようなピクセル範囲(９〜２５ピクセル)についての蛍光輝度を求め、「蛍光静止画像の蛍光輝度／ピクセル）を算出した（値3））。また、蛍光静止画像において、自家蛍光も量子ドット蛍光粒子の蛍光も存在しない背景（バックグラウンド）の画像を背景蛍光画像として取得し、かかる背景蛍光画像の蛍光輝度を測定した。かかる測定では、量子ドット蛍光粒子１粒子の蛍光輝度を測定したときと同じピクセル数を有する任意の３領域の蛍光輝度を求め、「背景蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル」を算出した（値4））。上記値3）及び値4）を用いて、背景蛍光の蛍光輝度を除いた量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度（以下、単に「量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度」という）は、式「(蛍光静止画像の蛍光輝度平均値／ピクセル−背景蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル)×ピクセル数」＝「(値3）−値4）)×ピクセル数」を基に算出した。さらに、蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）において、量子ドット蛍光粒子の蛍光を含まない自家蛍光のみの領域から、量子ドット蛍光粒子１粒子の蛍光輝度を測定したときと同じピクセル数を有する任意の３領域の蛍光輝度を求め、「自家蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル」を算出した（値5））。かかる値5）を用い、自家蛍光の蛍光輝度に対する量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度は、式「量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度／（［自家蛍光画像の蛍光輝度平均値／ピクセル］×ピクセル数)」＝（［値3）-値4）］×ピクセル数）／（［値5）-値4）］×ピクセル数）を基に算出した。以上の操作を１５の異なる蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）に対して行い、得られた計１５蛍光粒子分の値から、その平均値（自家蛍光の蛍光輝度に対する量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度平均値）を求めた結果、１．８８±０．１０（平均値±s.e.m.）として算出された。量子ドット蛍光粒子（Ｑｄｏｔ７０５）の蛍光輝度変化は、例えばインビトロジェンのホームページ（http://www.invitrogen.jp/qdot/index.shtml）に掲載されているパンフレット（ファイル名：2008-20-CBQdot）の記載を参考にし、（Ｑｄｏｔ７０５の蛍光輝度を示す面積）／（自家蛍光の蛍光輝度を示す面積）比が、１．８８になるように量子ドット蛍光粒子や自家蛍光の蛍光輝度を示す面積を決定し、自家蛍光とともにＱｄｏｔ７０５の蛍光波長特性を示す図を作成した（図４（ｂ））。なお、かかる面積の決定には、便宜的に蛍光波長が６９５〜７４０ｎｍの自家蛍光の蛍光輝度を示す面積を四角形とみなして行った。（Ｑｄｏｔ７０５の蛍光輝度を示す面積）／（自家蛍光の蛍光輝度を示す面積）比が１．８８であることは、蛍光静止画像において全蛍光輝度（量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度＋自家蛍光の蛍光輝度）のうち、バックグランドとなる自家蛍光の蛍光輝度が占める割合は５０％を超えることを示しており、量子ドット蛍光粒子の蛍光輝度を定量するためには、自家蛍光の蛍光輝度を除く必要があることが再確認された。

自家蛍光を除いた補正蛍光画像は、以下の手順にしたがって作成した。すなわち、ＩＨＣ−ＱＤｓ法を行った組織試料に対して４８８ｎｍ励起光を４０秒間照射し、蛍光波長の取得領域が６９５〜７４０ｎｍのバンドパスフィルタにより取得した蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）（４０ｓ／ｆｒａｍｅ×１枚）、及び上記蛍光静止画像と同一視野及び同一焦点で蛍光波長の取得領域が６４０〜６９０ｎｍのバンドパスフィルタにより取得した自家蛍光画像（４０ｓ／ｆｒａｍｅ×１枚）を得た。また、細胞数をカウントするために、４００ｎｍ励起光で組織試料を励起し、蛍光波長の取得領域が４２０〜５００ｎｍのバンドパスフィルタにより取得した細胞核画像（ＤＡＰＩより検出）を得た（図５右下）。蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）と自家蛍光画像内の同じ領域の自家蛍光を比較し、任意のＲＯＩ（例２５×２５ピクセル）の自家蛍光の最大値が「蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）×１．２倍＝自家蛍光画像」になるようにする。すなわち、自家蛍光画像の方が蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）と比べ、約２０％程度自家蛍光の輝度が高い値になるようにする。このように自家蛍光由来の輝度を調整した状態でＪＰＥＧ像に変換する（図５左上、及び右上）。なお、ＪＰＥＧ像へ変換する際、すべての蛍光が取り込まれるように閾値を設定した。自家蛍光を除き、量子ドット蛍光粒子のみの補正蛍光画像を取得するために、「蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）−自家蛍光画像」の処理をPhotoshopの画像解析ソフトを用いて行った（図５左下）。この際、量子ドット蛍光粒子１個分の輝度が消えていないこと、また自家蛍光部分の蛍光強度が引き算後、ゼロ（０）になっていることを任意の複数領域で確認した。このようにして、ＩＨＣ−ＤＡＢ法による病理診断を行った組織試料における蛍光静止画像（量子ドット蛍光粒子＋自家蛍光）、及び補正蛍光画像を取得した（図６）。

［量子ドット蛍光粒子１粒子あたりの平均蛍光輝度の算出法］
量子ドット蛍光粒子の１粒子あたりの平均蛍光輝度を算出するために、蛍光輝度が１粒子由来であるかどうかを決定する必要があるが、ここでは量子ドット特有の「ブリンキング（明滅）性」を利用した。ブリンキング（明滅）の境界となる閾値として、量子ドット蛍光粒子の最大蛍光輝度の１０％を設定すると（図７の矢頭参照）、１粒子の量子ドット蛍光粒子であれば、２０秒間の照射時間においてoff−state（滅状態）は約４秒になる（図７）。そのため、約４秒間のoff−state（滅状態）を持つ粒子の平均強度を測定すれば、１粒子蛍光輝度が得られる。そこで、蛍光静止画像に対応する蛍光動画像を取得するために、励起光を照射した後に２００〜４００ミリ秒の分解能で１００枚の連続した蛍光静止画像を蛍光波長の取得領域が６９０〜７３０ｎｍのバンドパスフィルタを用いて取得し、蛍光動画像（２００〜４００ｍｓ／ｆｒａｍｅ×１００枚）を得た。上記蛍光動画像を用いて、約４秒間のoff−stateを持つ粒子を蛍光粒子１粒子として特定した後、特定した後、静止画像において対応する粒子の蛍光輝度をImage J画像解析ソフトを用いて決定した。これを５〜１０個の粒子に対して行ない、１粒子あたりの平均蛍光輝度を算出した。

［１細胞あたりの粒子数の算出法］
補正蛍光画像から得られた量子ドット蛍光粒子の全蛍光輝度の値（画面内の全蛍光輝度）と、細胞核染色画像（ＤＡＰＩより検出）から測定した細胞数と、さらには量子ドット蛍光粒子１粒子あたりの平均蛍光輝度の値（１粒子蛍光輝度）を、式［（画面内の全蛍光輝度／１粒子蛍光輝度）／細胞数＝画像内の全蛍光粒子数／細胞数＝蛍光粒子数／細胞］に入力することで、１細胞あたりの量子ドット蛍光粒子数を算出することができる。さらに、コントロールである量子ドット蛍光粒子で標識されたヒトＩｇＧを用いた場合でも同様に行ない、「トラスツズマブに標識した量子ドット蛍光粒子数／細胞−ヒトＩｇＧに標識した量子ドット蛍光粒子数／細胞」を行うことにより、量子ドット蛍光粒子数（トラスツズマブを標識）から非特異的な粒子数を除き、１細胞あたりの真の蛍光粒子数を算出した。

［乳がんにおける従来の診断方法とＩＨＣ−ＱＤｓ法との比較］
ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出されたトラスツズマブの有効成分であるＨＥＲ２抗体が認識するＨＥＲ２タンパク質量が、ＨＥＲ２遺伝子コピー数と関連性があるかどうかを調べるために、ＦＩＳＨ法によりＨＥＲ２遺伝子コピー数を測定した。ＦＩＳＨ法は、以下に示した操作手順により行った。ＩＨＣ−ＱＤｓ法を行った上記３７例の組織試料についてヘモディー（Ｈｅｍｏ−Ｄｅ）で室温、１０分間、３回処理を行うことで脱パラフィン処理した後、１００％エタノールで室温、５分間、２回洗浄し、脱水処理を行った。ＤＮＡプローブの到達性を向上させるために、上記組織試料に対して以下に示した１）〜３）の処理、すなわち１）細胞膜及び核膜のタンパク質の除去（０．２Ｎ ＨＣｌで室温、２０分間）、２）ホルマリンによる架橋構造の分解（１Ｍ ＮａＳＣＮで８０℃、３０分間）、及び３）細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解（２５ｍｇ プロテアーゼ［２５００−３０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ］［ペプシン］／１Ｍ ＮａＣｌ［ｐＨ２．０］５０ｍｌで３７℃、６０分間）、を順次行った。ＤＮＡを１本鎖に変性させるために、上記組織試料を変性溶液（７０％ ホルムアミド／ＳＳＣ［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム］）で７２℃、５分間処理をした後、ＨＥＲ２遺伝子検出用ＤＮＡプローブ及びヒト１７番染色体セントロメア検出用プローブ（パスビジョンＨＥＲ−２ＤＮＡプローブキット[Abbott Japan社製]）を用いたハイブリダイゼーション処理を、３７℃、２日間行った。ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにＤＡＰＩ染色（２μｇ/ｍｌＰＢＳ）を２５℃、１０分間行い細胞核を染色した。従来技術の組織染色法であるＩＨＣ−ＤＡＢ法により算出したＨＥＲ２タンパク質量（ＩＨＣ−ＤＡＢ ｓｃｏｒｅ）とＦＩＳＨ法により算出されたＨＥＲ２遺伝子コピー数（ＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅ）とを比較した場合、両者に定量的な関係はなかった（図８、（ａ））。他方、ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出された蛍光粒子標識トラスツズマブで検出した蛍光粒子数（ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅ）とＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅとを比較した場合、ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅとＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅは強く相関していた（相関係数（Ｒ）＝０．７００９、ｐ＜０．００１）（図８、（ｂ））。すなわち、ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出されたトラスツズマブで検出されるＨＥＲ２タンパク質量とＨＥＲ２遺伝子コピー数がともに定量的に評価され、両者が相関付けられた。この結果は、これまではＩＨＣ−ＤＡＢ ｓｃｏｒｅが２を示す症例の病理判断をＦＩＳＨ法により再検討する必要があったが、ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出されたＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅは、ＦＩＳＨ法により算出されたＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅと定量的な関係にあるため、ＦＩＳＨ法による再検討を必要としない。また、ＩＨＣ−ＤＡＢ法と比べ、より簡素化した操作手順で行う事ができる点においてもＩＨＣ−ＱＤｓ法は優れている（図９）。さらに図１０には、ＩＨＣ−ＤＡＢ ｓｃｏｒｅとＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅとを比較した結果を示すが、ＩＨＣ−ＤＡＢ法では同一の判定基準（例えばＳｃｏｒｅ２又はＳｃｏｒｅ３）とされていた症例においても、ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅを求めた場合非常に幅の広いレンジで検出されることがわかった。これらの結果は、ＩＨＣ−ＤＡＢ法とＩＨＣ−ＱＤｓ法とは免疫組織染色法という点では同じであるにもかかわらず、従来技術のＩＨＣ−ＤＡＢ法は、ＨＥＲ２タンパク質の発現量を４段階のみでしか評価できず不十分な評価法であるのに対し、ＩＨＣ−ＱＤｓ法は、ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅを算出することによって高精度かつ定量的に評価できることを示している。さらに、図１０の点線で囲った３病例については、ＩＨＣ−ＤＡＢ法ではｓｃｏｒｅ２の判定基準を示す一方、ＩＨＣ−ＱＤｓ法では極めて低い値であり、その値はＩＨＣ−ＤＡＢ法によるｓｃｏｒｅ０、又はｓｃｏｒｅ１の病例と同程度であった。このことは、ＩＨＣ−ＱＤｓ法で用いた治療薬としての抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ）とＩＨＣ−ＤＡＢ法で用いた診断薬としての抗ＨＥＲ２抗体のエピトープが異なることが原因である可能性が考えられる。従って、治療薬に含まれる抗体を用いた組織染色による診断方法は、治療薬に含まれる抗体のエピトープと異なる抗体を用いたＩＨＣ−ＤＡＢ法等の診断方法と比べ、治療薬を投与する適応患者を選定する上で有効であると考えられる。

[トラスツズマブ単剤療法病例における治療効果とＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅ又はＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅとの対比］
トラスツズマブ単剤療法による治療効果を示す指標として、Response（薬剤の治療効果）、又はＴＴＰ（Time To Progression；薬剤投与により腫瘍増殖が制御されている期間）の２つの指標が世界的に広く使用されている。上記２つの指標に加え、ＩＨＣ−ＱＤｓ法により算出したトラスツズマブで検出されるＨＥＲ２タンパク質量（ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅ）が治療効果を示す指標となり得るかどうかを検証した。そこで、遠隔転移が確認され、かつトラスツズマブ単剤療法が施行されていた表２に示す６症例について、ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅを算出し、ＴＴＰとの関連性について調べたところ、ＩＨＣ−ＱＤｓ ｓｃｏｒｅとＴＴＰは強く相関していた（相関係数（Ｒ）＝０．６９）（図１１（ｂ））。他方、ＦＩＳＨ ｓｃｏｒｅとＴＴＰには相関は認められなかった（図１１（ａ））。これらの結果から、量子ドット蛍光粒子で標識したトラスツズマブを用いたＩＨＣ−ＱＤｓ法により、乳がん組織におけるＨＥＲ２を標的としたトラスツズマブの治療効果を予測できることが示されるとともに、従来技術のＦＩＳＨ法を用いてトラスツズマブの治療効果を予測することは、困難であることを示された。

本発明の判定方法は、医薬品の投与適応患者の選定や、医薬品の治療効果の予測の分野に好適に利用することができる。例えば、量子ドット蛍光粒子で標識された抗体として乳がんの抗体医療品であるトラスツズマブを用い、１細胞あたりのトラスツズマブにより検出される蛍光粒子数を求め、その数を指標にして、トラスツズマブ投与適応患者の選定や、トラスツズマブの治療効果の予測に利用することができる。

Claims (9)

1. 以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えた組織染色方法を用いることを特徴とする抗体を成分として含む医薬品の有効性の判定方法。
   （ａ）抗体を成分として含む医薬品における抗体を蛍光物質で標識し、該蛍光標識された抗体を組織試料と接触させる工程；
   （ｂ）前記抗体が接触した組織部位に励起光を照射し、蛍光画像を取得する工程；
   （ｃ）前記蛍光画像と同一視野及び同一焦点における、前記蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域よりも短波長側又は長波長側の近傍領域の自家蛍光画像を取得する工程；
   （ｄ）前記蛍光画像の蛍光輝度から、前記自家蛍光画像の蛍光輝度を除く画像処理をし、補正蛍光画像を取得する工程；
2. 抗体を成分として含む医薬品における抗体が、がんの増殖制御因子又は転移制御因子を認識する抗体であることを特徴とする請求項１記載の判定方法。
3. がんの増殖制御因子又は転移制御因子がＨＥＲ２（human epidermal growth factor receptor 2）であることを特徴とする請求項２記載の判定方法。
4. がんが、乳がんであることを特徴とする請求項２又は３記載の判定方法。
5. 蛍光物質が発する蛍光波長の取得領域とその近傍領域の波長の差が１００ｎｍ以内であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の判定方法。
6. 蛍光物質が、蛍光粒子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の判定方法。
7. 蛍光粒子が、量子ドット蛍光粒子であることを特徴とする請求項６記載の判定方法。
8. さらに以下の工程（ｅ）〜（ｇ）を備えたことを特徴とする請求項６又は７記載の判定方法。
   （ｅ）抗体が接触した組織部位の細胞数をカウントする工程；
   （ｆ）蛍光画像を基に、蛍光粒子１粒子を特定し、該蛍光粒子１粒子に対応する補正蛍光画像内の蛍光粒子１粒子の平均蛍光輝度を計測する工程；
   （ｇ）補正蛍光画像内の全蛍光輝度を、前記蛍光粒子１粒子の平均蛍光輝度で除して蛍光粒子数を求め、該蛍光粒子数を工程（ｅ）でカウントした細胞数で除し、１細胞あたりの蛍光粒子数を算出する工程；
9. 蛍光粒子が有する明滅性を利用して、蛍光粒子１粒子を特定することを特徴とする請求項８記載の判定方法。

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