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JP5677291B2 - 肥満素因の評価方法及びキット、並びに、抗肥満薬及びそのスクリーニング方法、非ヒト動物、脂肪組織、脂肪細胞、トランスジェニックマウス作成方法、抗原、抗体 - Google Patents

肥満素因の評価方法及びキット、並びに、抗肥満薬及びそのスクリーニング方法、非ヒト動物、脂肪組織、脂肪細胞、トランスジェニックマウス作成方法、抗原、抗体 Download PDF

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Description

本発明は、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法と、その方法を実施するキット、並びに、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備える抗肥満薬と、そのスクリーニング方法、それに関する遺伝子を欠損または過剰安定発現させた非ヒト動物と、その脂肪組織または脂肪細胞と、関連遺伝子のトランスジェニックマウスの製造方法、抗原、抗体に関する。
肥満は、メタボリックシンドロームをはじめとする様々な疾患の原因となり、人々のＡＤＬやＱＯＬを損なう。肥満は体脂肪量が過度に増加している状態である。近年、食生活の変容により、肥満人口は増加の一途をたどり、それに伴う合併症に対する医療費も増加している。
このことは、早期に治療を行うことが重要であることを示唆するが、肥満を早期に予知するマーカーは未だ得られていない。
遺伝子多型を肥満の診断に用いる方法がある。それに関連する従来技術としては、特許文献１〜４が挙げられる。
特許文献１には、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＭ、ｐｆ２０、ＤＮＡＨ１１、ＰＫＤ１、ＫＣＮＭＡ１、ＰＫＨＤ１、ＮＲＸＮ３、ＥＰＨＡ７、ＲＯＳ１、ＦＫＳＧ８７、Ｃ３ｏｒｆ６、ＴＯＸ、ＤＬＧ２、ＭＤＳ１、ＦＡＢＰ２、ＥＦＡ６Ｒ、ＦＬＪ２０１２５、Ｃｌｏｒｆ１０、ＣＨＬ１、ＢＩＣＤ１、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＤＡＲＢ２、Ａ２ＢＰ１、ＭＧＣ４３０９、ＰＩＧＲ、ＰＣＳＫ７、ＨＳＦ２から選択される蛋白質をコードする遺伝子またはそれに密接に連鎖する多型を検出することが開示されている。
特許文献２には、縮れ関連タンパク質（ＦＲＺＢ）遺伝子の多型を検出することが開示されている。
特許文献３には、ｇａｄ２遺伝子の５’領域における多型を検出することが開示されている。
特許文献４には、ＥＮＰＰ１のＳＮＰを検出することが開示されている。
しかし、いずれの従来技術も実用化には至っていない。
本発明者は、特許文献５において、ヒト遺伝子に存在する約５万の一塩基多型（ＳＮＰ）に関して網羅的解析を行い、体脂肪量との相関を解析した。その結果、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２におけるＳＮＰ（ｒｓ４９１７８５）などが、肥満の素因となることがわかった。
特表２００８−５３６４７４「メタボリックシンドローム、肥満及びインスリン抵抗性のマーカー」 特表２００６−５２４０４４「肥満及び骨粗鬆症を有すＦＲＺＢ遺伝子における多型の関連性」 特表２００６−５０９５１９「肥満の診断の方法」 特表２００８−５４６３８０「肥満と２型糖尿病のリスクに関連するＥＮＰＰ１（ＰＣ−１）遺伝子のハプロタイプおよびその応用」 特願２００７−２９８０４５「ヒト体脂肪量と関連する遺伝子多型に基づく肥満発症リスクの判定方法」
そこで、本発明は、特許文献５の知見の延長とした有効な手段として、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法と、その方法を実施するキット、並びに、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備える抗肥満薬と、そのスクリーニング方法、それに関する遺伝子を欠損させた非ヒト動物と、その脂肪組織または脂肪細胞を提供することを課題とする。
本発明の肥満素因の評価方法は、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるコピー数多型（ＣＮＶ）、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検出する工程を有することを特徴とする。
ここで、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶが０の場合に、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価してもよい。
遺伝子多型の検出には、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかを用いてもよい。
被験者として日本人を対象としてもよい。
評価キットとして提供してもよく、本発明の肥満素因の評価キットは、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検出する手段を備えることを特徴とする。
また、本発明の抗肥満薬のスクリーニング方法は、被験物質が、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節し得るか否か、または、その活性を阻害または調節し得るか否かを評価する工程と、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節し得るか、または、その活性を阻害または調節し得て、結果的に肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する被験物質を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程とを有することを特徴とする。
ここで、被験物質を非ヒト動物に投与する工程と、被験物質を投与した非ヒト動物における肥満度を測定する工程と、その肥満度を減少させる被験物質を有効物質として選択する工程とを含めてもよい。
また、本発明の抗肥満薬は、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療する作用を備える抗肥満薬であって、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節するか、または、その活性を阻害または調節する薬剤を含有し、脂肪細胞の分化を抑制する作用を具備することを特徴とする。
また、本発明の非ヒト動物は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を欠損させたことを特徴とする。
また、本発明の非ヒト動物は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を過剰発現または安定発現させたことを特徴とする。
脂肪細胞の分化が抑制され抗肥満の状態である非ヒト動物としてもよい。
そのような非ヒト動物に由来する脂肪組織または脂肪細胞として供してもよい。
また、本発明のトランスジェニックマウスの作成方法は、野生型マウスと比較して体重増加が抑制されるトランスジェニックマウスの作成方法であって、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をベクターに組み込みんだプラスミドを用いて遺伝子導入し、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を過剰発現または安定発現させることを特徴とする。
また、本発明のＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質抗体は、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質に特異的に反応する抗体であって、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、EWRDYFLFNPVTDIEEをエピトープとして有する抗原を用いて製造することによって得られたことを特徴とする。
また、本発明のＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質抗体製造用抗原は、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質に特異的に反応する抗体の製造に用いる抗原であって、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、EWRDYFLFNPVTDIEE をエピトープとして有することを特徴とする。
本発明による肥満素因の評価方法及びキットは、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを有効に評価するので、予防や治療に寄与する。
本発明による抗肥満薬は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節するか、活性を阻害または調節する薬剤を含有し、脂肪細胞の分化を抑制するので、好ましくない他の作用を起こすことなく、肥満または肥満に起因する状態または疾患を、予防または治療することができる。
そのため、糖尿病や、高脂血症、高血圧症、高インスリン血症、動脈硬化症、高脂血症、高血圧症、多嚢胞性卵巣症候群などの予防や治療にも有用である。
本発明による非ヒト動物は、抗肥満状態のモデル動物または肥満状態のモデル動物として有用である。
本発明による脂肪組織または脂肪細胞は、モデル組織や細胞として有用である。
本発明によるトランスジェニックマウスの作成方法は、モデル動物の作成方法として有用である。
本発明による抗原または抗体は、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の欠失の確認に有用である。
ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶと体脂肪量との関係を示すグラフ ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現部位を示すグラフ （ａ）高脂肪食による白色脂肪組織の変化を示すグラフ（ｂ）高脂肪食によるＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現の変化を示すグラフ （ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をノックダウンした場合におけるＳＬＣ２５Ａ２４の発現の変化を示すグラフ （ｂ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をノックダウンした場合における脂肪細胞の分化マーカーａＰ２の発現の変化を示すグラフ （ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をノックダウンした場合における脂肪細胞の分化マーカーＰＰＡＲγの発現の変化を示すグラフ （ｂ）同、分化マーカーＣ／ＥＢＰαの発現の変化を示すグラフ （ｃ）同、分化マーカーＣ／ＥＢＰβの発現の変化を示すグラフ （ｄ）同、分化マーカーＣ／ＥＢＰγの発現の変化を示すグラフ （ｅ）同、分化マーカーＵＣＰ２の発現の変化を示すグラフ （ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を安定発現させた場合におけるＳＬＣ２５Ａ２４の発現の変化を示すグラフ （ｂ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を安定発現させた場合における脂肪細胞の分化マーカーであるａＰ２の発現の変化を示すグラフ ノックアウトマウス用のTargeting Vectorの設計図 マウスＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の構造を示す説明図 マウスＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の構造を示す説明図 ノックアウトマウスにおけるＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の欠失を確認するWestern Blotの結果（写真） 高脂肪食のノックアウトマウスの体重変化を示すグラフ ノックアウトマウスにおいて発現上昇する遺伝子群の表 ノックアウトマウスにおいて発現低下する遺伝子群の表 トランスジェニックマウス作成用のプラスミドの説明図 トランスジェニックマウスにおけるＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の高発現を確認するWestern Blotの結果（写真） （ａ）高脂肪食のオスのトランスジェニックマウスの体重変化を示すグラフ （ｂ）高脂肪食のオスのトランスジェニックマウスの体重変化を示すグラフ
本発明者は、特許文献５に開示した知見の延長として、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶと体脂肪量との間でも相関を見出した。また、そのＣＮＶとＳＮＰとの間に連鎖不均衡の関係があることも確認した。次いで、マウスを用いた実証実験を行い、本発明に至った。
以下に、実施例と、本発明の根拠となる実証実験を示して、本発明を説明する。本発明の実施形態は、下記の例に限らず、特許文献５など従来公知の技術を適宜援用可能である。
図１は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶと体脂肪量との関係を示すグラフである。
５２７名の閉経後女性を対象とし、体脂肪率(%FAT)はＤＥＸＡ法で測定した。対象者の末梢血よりＤＮＡを採取し、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１（１番染色体108534690-108535300）に存在するＣＮＶのコピー数を判定した。
ＣＮＶの検出には、ｑＰＣＲによる解析で、対象ｇＤＮＡ 5ngに対してＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１を対象としたＴａｑＭａｎプローブ＆プライマー(FAM ラベル)とリファレンス遺伝子としてのＲＮａｓｅＰ(VICラベル ABI;4316844)を用いて、ＳＬＣ２５Ａ２４−ＲＮａｓｅＰ ｄｅｌｔａＣｔ値を算出し、リファレンスｇＤＮＡ ＨａｐＭａｐ ＮＡ１９０００ 5ngも同様にｄｅｌｔａＣｔ値を算出する。次に、対象ｇＤＮＡのｄｅｌｔａＣｔ値−リファレンスｇＤＮＡのｄｅｌｔａＣｔ値からｄｅｌｔａＣｔ値を算出する。対象検体のｄｅｌｔａＣｔ値からＬｏｇ２換算した値を用いて混合ガウスモデルによる主成分分析(Principal Component A nalysis)よりコピー数を判定した。
その結果、ＣＮＶ＝０は７４名、ＣＮＶ＝１は９４名、ＣＮＶ＝２は２５２名、ＣＮＶ＝４は３０名となった。ＣＮＶ＝０と１以上との対象者における％ＦＡＴをｕｎ−ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔで検定したところ、両群間の％ＦＡＴ値は統計学的に有意差を生じ、ＣＮＶ＝０の場合に体脂肪量が多いことが判明した。
これにより、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検出することで、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価することが可能である。ＤＮＡチップなどの肥満素因の評価キットとして提供してもよい。
このＣＮＶと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検出して、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かの評価に用いてもよい。
ＣＮＶとＳＮＰとの間における連鎖不平衡の関係を同定するためには、ＣＮＶの異なる群の間で、genotypingした遺伝子多型の各アレルの頻度を求めることで行ってもよい。例えば、まず遺伝子多型のgenotypingを行い、続いてＣＮＶ＝０の群と１以上の群との間において、genotypingした遺伝子多型の各アレルの頻度をχ二乗検定し、統計上有意(P<0.05)なものをＣＮＶと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型と定義できる。
なお、ＳＮＰの場合は、genotypingをして、genotypeからＤ’及びｒ２を算出することで１に近い値をとるものを連鎖不平衡と定義できる。
なお、ＣＮＶとは、ある集団の中で1細胞当たりのコピー数が個体間で異なるゲノム領域のことを呼ぶ。ゲノムＤＮＡの数の多型としては、他にＳＮＰ、ＶＮＴＲやマイクロサテライト多型などが知られている。
ＣＮＶは、コントロールと比較して相対的にコピー数が多い場合と少ない場合とがあり、それぞれ重複および欠失と呼ばれる。通常ヒト等の細胞には遺伝子は２コピーあり、１つは父方、もう１つは母方に由来するとされるが、個体によっては１細胞当たり１コピーのみであったり、あるいは３コピー以上存在する。このような遺伝子の重複や欠失は、正常な形質をもつヒトのゲノム中に高頻度に見られ、ＣＮＶは、疾患感受性や薬剤感受性などを含めヒトの形質差に広く関与している可能性が示唆されている。
また、遺伝子の中にも、正常な機能を有するアレル、機能が亢進または減少するアレル、機能を全く失うようなアレルが存在することがあり、単に遺伝子レベルではなく、特定のアレルのコピー数の変化が表現型に影響を及ぼすことがある。
ＣＮＶ、並びに、それと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検出する方法には、ヒト血液または組織を材料として、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが利用できる、
例えば、ＢＡＣアレイＣＧＨ法は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ’ｓ ＫＯＧＥＮＯＭＥ Ｐｒｏｊｅｃｔで作成されたＤＮＡ断片からなるＢＡＣクローンを、スライドガラス上にスポットしたアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼージョン法であり、被験ＤＮＡと正常細胞由来のＤＮＡをそれぞれ異なった蛍光色素で標識し、その蛍光強度の比較を行うことによりＣＮＶを検出する方法である。
ＢＡＣクローンをスポットしたアレイは、市販のものを利用可能である。例えば、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣ Ａｒｒａｙ（登録商標）、ＳＰＥＣＴＲＡＬ ＧＥＮＯＭＩＣＳ社のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐ（登録商標）などがある。
ＢＡＣクローンと反応させるＤＮＡは、ランダムプライム法などで標識する。標識したＤＮＡ溶液は、酢酸ナトリウムやエタノールを用いて、ＤＮＡに取り込まれなかった標識物質等除去するため洗浄する。精製された標識ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション溶液に溶解する。水浴中で加熱することによりＤＮＡを熱変性させ、インキュベータ内で静置することにより、繰り返し配列をブロックする。
ハイブリダイゼーション及び洗浄後のアレイスライドは、レーザースキャナーやＣＣＤカメラなどの定量的検出装置により、被験ＤＮＡ及びコントロールＤＮＡ由来蛍光による画像を得ることができる。
また、ＦＩＳＨ法は、染色体標本の調べたいゲノム領域に、ハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列を有するプローブを蛍光物質で標識し、染色体のゲノム領域にハイブリダイズさせ、それにより得られる蛍光シグナルの数量を蛍光顕微鏡下で計数する方法である。
図２は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現部位を示すグラフであり、図３（ａ）は、高脂肪食による白色脂肪組織の変化を示すグラフ、図３（ｂ）は、高脂肪食によるＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現の変化を示すグラフである。
Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（4週齢、n=6）に継続的に餌を与えた。飼育は、標準食群と高脂肪食群(日本クレア、High Fat Diet 32)で実施した。飼育期間は１２週間とし、１２週経過時点で解剖して、組織の重量測定、各組織におけるＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現量を測定するためのリアルタイムＰＣＲ法をそれぞれ行った。白色脂肪組織は腎臓周囲に存在する白色脂肪組織を採取し、その重量を測定後、ＲＮＡ抽出を行った。
その結果、図２に示すように、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現は白色脂肪組織で高く、図３（ａ）に示すように、高脂肪食群では白色脂肪組織の重量が有意に高く、図３（ｂ）に示すように、高脂肪食群ではＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量が有意に高かった。
図４（ａ）は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をノックダウンした場合において、ＳＬＣ２５Ａ２４の発現の変化を示すグラフ、図４（ｂ）は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をノックダウンした場合において、脂肪細胞の分化マーカーであるａＰ２の発現の変化を示すグラフである。図中、＋−は、分化誘導刺激の有無を示す。発現はリアルタイムＰＣＲ法により検討した。
マウスの脂肪細胞前駆細胞の３Ｔ３Ｌ１細胞を用い、ｓｉＲＮＡ(DHARMACON、siGEN OME SMART pool Cat# M-054013-00)によるＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をノックダウンした(コントロール：DHARMACON、siCONTROL Non-Targeting siRNA #5 Cat#D-001 210-05)。ｓｉＲＮＡ(5nM)は１日目にトランスフェクション(QIAGEN、HiPerFect)を行った。
ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした次の日より分化誘導を開始した。分化誘導においては、10% FBS入りDulbecco's modified Eagle's medium
(DMEM)に、0.5mM isobutylmethylxanthine (IBMX、Sigma)、1μM dexamethasone (Dex、Sigma) 並びに10μg/ml bovine insulin (Sigma) (MDI mixture)を加えたmediumにて培養を開始した。４日目に同様のmediumにてmedium交換を行い、５日目にＲＮＡを回収した。
その結果、図４（ａ）に示すように、ｓｉＳＬＣ２５Ａ２４によりＳＬＣ２５Ａ２４の発現が低下した。この時、脂肪細胞の分化マーカーであるａＰ２の発現は、図４（ｂ）に示すように、コントロールでは分化誘導刺激により誘導されるが、その発現誘導がｓｉＳＬＣ２５Ａ２４により顕著に抑制された。
他の脂肪細胞分化マーカーについても同様に検討した。図５（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ分化マーカーＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＵＣＰ２の発現の変化を示すグラフである。
図示の通り、いずれも、ｓｉＳＬＣ２５Ａ２４により発現が抑制された。
なお、分化マーカーａＰ２は、脂肪細胞の脂肪酸結合蛋白であり、脂肪細胞とマクロファージには発現し、炎症と代謝反応を結合する。ａＰ２欠損マウスの研究から、この脂質シャペロンが、２型糖尿病や動脈硬化などのメタボリックシンドロームの病態に重要な役割を果たしていることが分かってきた。遺伝的または食餌性肥満のマウスモデルにおいては、ａＰ２欠損がインスリン抵抗性からマウスを保護することが知られている。
分化マーカーＰＰＡＲγは、ペルオキシソーム増殖薬応答性受容体であり、殆どの脊椎移動物において発現している核内での受容体であり、炭化水素、脂質、タンパク質等の細胞内代謝と細胞の分化に密接に関与している転写因子群である。ＰＰＡＲのサブタイプであるＰＰＡＲγは、ａＰ２遺伝子の脂肪酸特異的エンハンサーに結合する因子として同定された。ＰＰＡＲγは、脂肪細胞分化及びエネルギー貯蔵において必須な転写因子であり、糖尿病改善薬チアゾリジン誘導体の標的因子として注目されている。
Ｃ／ＥＢＰは、塩基性アミノ酸の領域とロイシンジッパーを持ったｂＺＩＰタンパク質であり、異なった遺伝子にコードされたＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰ１、ＣＨＯＰからなるファミリーを構成している。
Ｃ／ＥＢＰαは脂肪細胞や肝細胞の最終分化に関与することが知られている。３Ｔ３−Ｌ１培養前駆脂肪細胞を用いたin vitro の検討において、Ｃ／ＥＢＰβやＣ／ＥＢＰδが誘導され、これらがＣ／ＥＢＰαやＰＰＡＲγを誘導する。ＰＰＡＲγは脂肪蓄積に関与し、Ｃ／ＥＢＰαは脂肪細胞におけるインスリン感受性を決定する。それぞれ脂肪細胞においても発現が持続されることにより、脂肪細胞の形態、機能維持に重要と考えられている。一方、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδは脂肪細胞では発現が低下することから、分化過程早期でＣ／ＥＢＰαやＰＰＡＲγを誘導することや、一過性の細胞増殖に働くことが主な機能であると考えられている。
ＵＣＰ２は、脱共役タンパク質であり、体内の熱産生を調節する働きがある。ＵＣＰが活性化されると、熱エネルギーとなり体温維持に機能する。ＵＣＰにはいくつか種類があり、ＵＣＰ１は褐色脂肪細胞に存在し、ＵＣＰ２は白色脂肪細胞や骨格筋、脾臓、小腸など全身に幅広く分布し、ＵＣＰ３は主に骨格筋に、ＵＣＰ４及びＵＣＰ５は主に脳に存在する。
図６（ａ）は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を安定発現させた場合において、ＳＬＣ２５Ａ２４の発現の変化を示すグラフ、図６（ｂ）は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を安定発現させた場合において、脂肪細胞の分化マーカーであるａＰ２の発現の変化を示すグラフである。
マウスの脂肪細胞前駆細胞３Ｔ３−Ｌ１にプラスミド(pcDNA3-FLAG-SLC25A24)をトランスフェクションし、抗生物質(G418)で選択を行い、ＳＬＣ２５Ａ２４安定発現細胞を樹立した。
図６（ａ）に示すように、クローン#7及びクローン#8においてリアルタイムＰＣＲ法によりＳＬＣ２５Ａ２４の高発現が確認され、図６（ｂ）に示すように、この２種類の細胞において分化マーカーａＰ２の高発現が確認された。これにより、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を安定発現させた場合は、脂肪細胞の分化を誘導することが確認された。
ＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウスを、定法に従って作成した。
図７は、ＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウス用のTargeting Vectorの設計図である。
このTargeting VectorをマウスＥＳ細胞のＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子に挿入した。
図８は、マウスＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の構造を示す説明図である。
マウスＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子は１０個のエクソンより構成されている。本実施例で用いたノックアウトマウス作成用Targeting Vectorでは、マウスＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子Ｅｘｏｎ２上流のスプライスアクセプターを残し、Ｅｘｏｎ２の途中からＥｘｏｎ２下流のスプライスドナーまでを削り、そこにストップコドンとＳＶ４０ｐｏｌｙＡを挿入する。
仮に、この遺伝子のプロモーター活性が強力でｐｏｌｙＡでは下流の転写が止まらずミスリードした場合でも、Ｅｘｏｎ２（127bp）が飛ばされるとフレームシフトがおこりノックアウトすることができる。また、Ｅｘｏｎ２上流のスプライスアクセプターでトラップできれば、下流に挿入したストップコドンまでしか転写・翻訳されない。
本実施例でのノックアウトマウス設計において、転写・翻訳されると予想される蛋白質は７３ＡＡ（約8KDa）であり、これはオリジナル配列（NM_172685）のＮ末端側に相当する。
図９は、マウスＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の構造を示す説明図である。
ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質はＮ末端からＥＦハンドドメイン(EF)が３個存在し、Ｃ末端には膜貫通ドメイン(TM)が６個存在する。本実施例でのノックアウトマウスではＥＦハンドドメインの２つ目の途中から削る設計になる。
図１０は、ノックアウトマウスにおけるＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の欠失を確認するWestern Blotの結果（写真）である。
ＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトにおいて実際にＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質が欠失しているかを、Western Blot法により検討した。
野生型（Wt）及びＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウス（KO）の白色脂肪組織より蛋白質を抽出し、抗ＳＬＣ２５Ａ２４抗体を用いてWestern Blotを行ったところ、ノックアウトマウス由来の白色脂肪組織においてＳＬＣ２５Ａ２４蛋白が欠失されていることが確認された。
抗ＳＬＣ２５Ａ２４抗体は、以下のように作成した。
ヒトＳＬＣ２５Ａ２４とマウスＳＬＣ２５Ａ２４での共通のアミノ酸配列である１４６番目から１６１番目の配列（EWRDYFLFNPVTDIEE）のＣ末端に、システインを付加した合成ペプチドを、抗原としてウサギに免疫感作することによって、ヒト及びマウスに対するＳＬＣ２５Ａ２４ポリクローナル抗体を得た。
抗体の調製方法は、宿主動物への免疫感作を行うことにより抗体を産生する従来公知の方法を適宜利用できる。
免疫感作させる宿主動物の種類は、特に制限されず、例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、モルモット等の哺乳類、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類などが使用できる。
抗原の投与方法も、特に制限されず、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与などが適宜利用できる。
ポリクローナル抗体を調製する場合には、免疫感作させた宿主動物の血清や腹水液等の体液を回収し、抗体を単離精製すればよい。
モノクローナル抗体を調製する場合には、例えば、免疫感作させた宿主動物における脾臓細胞やリンパ球様細胞等の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、そのハイブリドーマを増殖させ、特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を単離精製すればよい。
ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の精製方法も、特に制限されず、例えば、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などが適宜利用できる。
抗体の産生をスクリーニングする方法も、特に制限されず、例えば、ラジオイムノアッセイ法、エンザイムイムノアッセイ法などが適宜利用できる。
このようにして得られる抗体は、それ自体を抗体として使用してもよいし、酵素処理等を施して得られる抗体の活性フラグメントとして使用してもよいし、他の薬剤等と混合させて試薬等として使用してもよい。
図１１は、高脂肪食のノックアウトマウスの体重変化を示すグラフである。
上記で得たＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウスを系統維持し、８週齢から高脂肪飼料（商品名；HFD32、日本クレア製、脂肪含有率32質量％）を負荷し、ノックアウトマウス２系統と野生型マウス(C57BL/J)との体重比較を行った。
その結果、野生型マウスよりノックアウトマウスの方が、雌雄共に有意に低体重となった(オスP=0.0064、メスP=0.019)。
次に、ノックアウトマウスの白色脂肪組織における遺伝子変化を探索するため、マイクロアレイ法による検討を行った。
ＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウス由来の白色脂肪組織と野生型マウス由来の白色脂肪組織からｍＲＮＡを抽出した。このｍＲＮＡを用い、定法に従ってマイクロアレイ法（Affymetrix社GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array）による発現解析を行った。
図１２は、ノックアウトマウスにおいて発現上昇する遺伝子群の表であり、図１３は、ノックアウトマウスにおいて発現低下する遺伝子群の表である。
発現上昇する遺伝子としては、ＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウス由来白色脂肪組織において、野生型に比してシグナル強度比が１．５以上となった遺伝子群を列挙した。発現低下する遺伝子としては、ＳＬＣ２５Ａ２４ノックアウトマウス由来白色脂肪組織において、野生型に比してシグナル強度比が０．７５以下となった遺伝子群を列挙した。
ノックアウトマウスにおいて発現上昇する遺伝子群の上位には、ステロイド代謝に関係する遺伝子群が複数含まれていた（Hsd3b1、Cyp11b1、Cyp11a1、Srd5a2、Cyp21a1、Hsd3b6、Star）。
ＳＬＣ２５Ａ２４トランスジェニックマウスを、定法を援用して作成した。
図１４は、トランスジェニックマウス作成のために用いたプラスミド (pCAGGS-SLC25A24-HA-FLAG-pA)の説明図である。
単離したヒトＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をｐＣＡＧＧＳベクターに組み込み、Ｃ末端にＨＡ−ＦＬＡＦＧタグを付加したプラスミド（pCAGGS-SLC25A24-HA-FLAG-pA）を作成した。
ｐＣＡＧＧＳベクターは、ＣＡＧプロモーター、すなわち、Cytomegalovirus enhancerと Chicken β-actin promoterをつなげた構造と、ウサギのβ−グロビン遺伝子のｐｏｌｙＡシグナルサイトによって、導入したい遺伝子をほぼ全身に過剰発現させることができる。作成したプラスミドを用い、定法に従って、全身においてＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子が高発現する(C57BL/Jをバックグラウンドとする) ＳＬＣ２５Ａ２４トランスジェニックマウスを作成した。
図１５は、トランスジェニックマウスにおけるＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質の高発現を確認するWestern Blotの結果（写真）である。
ＳＬＣ２５Ａ２４トランスジェニックマウスにおいて実際にＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質が高発現するかを、Western Blot法により検討した。
野生型（Wt）及び２系統のトランスジェニックマウス（ＴＧ２：Line2、ＴＧ１４：Line14）の白色脂肪組織より蛋白質を抽出し、抗ＳＬＣ２５Ａ２４抗体を用いてWestern Blotを行った。
その結果、２系統のトランスジェニックマウスにおいて、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質は野生型マウスより高発現することが確認された。また、導入したＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子にはＦＬＡＧタグを付加しているので、抗ＦＬＡＧ抗体により、導入ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現も検出することが可能である。
図１６は、高脂肪食のトランスジェニックマウスの体重変化を示すグラフであり、図１６（ａ）は、高脂肪食のオス、図１６（ｂ）は、高脂肪食のメスの結果を示す。
上記で得たＳＬＣ２５Ａ２４トランスジェニックマウスを２系統（Line2、Line14）維持し、４週齢から高脂肪飼料（商品名；HFD32、日本クレア製、脂肪含有率32質量％）を負荷し、ノックアウトマウス２系統と野生型マウス(C57BL/J)との体重比較を行った。
その結果、野生型マウスよりトランスジェニックマウスの方が、雌雄共に有意に低体重となった(高脂肪食オスLine2: P=0.0066、Line14: P=0.0018。高脂肪食メスLine2: P=0.039、Line14: P=0.036)。
以上より、ＳＬＣ２５Ａ２４の発現量の変化は、体重に直接影響を与えることが判明した。
以上より、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節するか、または、その活性を阻害または調節する薬剤を用い、脂肪細胞の分化を抑制する作用を具備する抗肥満薬が得られることが分かる。本発明による抗肥満薬は、脂肪過多等の肥満を改善し得るので医薬として有用である。
なお、抗肥満薬は、必ずしもＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制するか、活性を阻害しなくてもよく、発現を調節するか活性を調節し、結果的に脂肪細胞の分化を抑制する作用を具備すればよい。
ＳＬＣ２５Ａ２４のオルソログは特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サルなどの哺乳動物等の非ヒト動物に由来するものを対象とし得る。
また、対象とするＳＬＣ２５Ａ２４は、脂肪細胞の分化能を有する限り、そのコードするアミノ酸配列に１以上の変異を有していてもよい。
本発明による抗肥満薬は、医薬上許容される担体を適宜含有してもよい。
そのような担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、アップルジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられる。
抗肥満薬の経口投与に好適な形態としては、水や生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含むカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、散剤、顆粒剤等などが挙げられる。
静脈内注射や、皮下注射、筋肉注射、局所注入など、非経口投与に好適な形態としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等を含めてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等を含めてもよい。
このような製剤は、アンプルやバイアルのように、単位投与量または複数回投与量ずつ容器に封入してもよい。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存してもよい。
抗肥満薬の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式、疾患の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢などによって異なるが、成体１日当たり約０．００１ｍｇ〜約５．０ｇ／ｋｇが目安となる。
抗肥満薬のスクリーニングには、被験物質が、ＳＬＣ２５Ａ２４の発現を抑制または調節し得るか否か、または、その活性を阻害または調節し得るか否かを評価する工程と、ＳＬＣ２５Ａ２４の発現を抑制または調節し得るか活性を阻害または調節し得て、結果的に肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する被験物質を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程とを有する。
評価する工程では、スクリーニング方法に供される被験物質に、任意の公知化合物や新規化合物が使用でき、例えば、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、核酸（ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど）、糖質（単糖、二糖、オリゴ糖、多糖など）、脂質（飽和または不飽和の直鎖、分岐鎖、環を含む脂肪酸など）、アミノ酸、蛋白質（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
被験物質によるＳＬＣ２５Ａ２４の発現を抑制または調節するか活性を阻害または調節する作用を評価可能であれば任意の方法が可能であり、例えば、非ヒト動物、あるいはＳＬＣ２５Ａ２４の発現抑制または調節か活性阻害または調節を測定可能な細胞を用いて行ってもよい。
非ヒト動物を用いて行う場合、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物などが挙げられる。肥満または肥満に起因する状態または疾患を示すモデル動物を用いてもよい。
肥満または肥満に起因する状態または疾患を示すモデル動物としては、例えば、肥満状態または疾患のモデル動物（ob/obマウス、Ayマウス、Zucker-fattyラット、Otsuka long-evans fatty (OLETF)ラット、グルタミン酸などの薬物投与による過食誘発マウス及びラットなど）や、肥満に起因する状態または疾患のモデル動物として、高脂肪食負荷されたモデル動物や耐糖能異常に起因する疾患のモデル動物（db/dbマウス、KKAyマウス、Wistar-fattyラット、Goto-Kakizaki (GK)ラット、Otsuka long-evans fatty (OLETF)ラット、秋田マウス、ストレプトゾトシンなどの薬物投与による膵破壊マウス及びラットなど）、低アディポネクチン血症のモデル動物（アディポネクチン欠損マウス、ob/obマウス、A-ZIP脂肪萎縮症マウスなど）、高インスリン血症のモデル動物（IRS1欠損マウスなど）、動脈硬化症のモデル動物（apoE欠損マウス、LDL受容体欠損マウス、WHHLウサギなど）、高血圧症のモデル動物（11βHSD導入マウス、SHRラット、SHRSPラットなど）が挙げられる。
非ヒト動物が用いられる場合、被験物質の非ヒト動物への投与には従来公知の方法が利用できる。例えば、経口投与、非経口投与（静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、局所注入など）が挙げられる。投与量、投与間隔、投与期間等は、用いる被験物質や動物の種類等に応じて適宜設定される。
非ヒト動物における肥満度を測定するには、体脂肪量の他に、体脂肪率や、体重、基礎代謝などを指標として利用できる。
また、被験物質を投与した動物におけるＳＬＣ２５Ａ２４の発現量を測定することによって、被験物質がＳＬＣ２５Ａ２４の発現を抑制する効果があるかを評価してもよい。
発現量の測定は、例えば、非ヒト動物から脂肪組織等の生体試料を採取し、その試料中の転写産物等を測定することにより行ってもよい。
非ヒト動物の組織や細胞、例えば、脂肪組織または脂肪細胞を用いて、スクリーニングを行ってもよい。
ＳＬＣ２５Ａ２４の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、脂肪細胞等のＳＬＣ２５Ａ２４発現細胞であり、ＳＬＣ２５Ａ２４の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞である。
ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の転写調節領域、その領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。
ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の転写調節領域は、ＳＬＣ２５Ａ２４の発現を制御し得る領域であれば任意であり、例えば、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の転写調節領域の塩基配列において１以上の塩基が、欠失、置換、付加された塩基配列からなり、転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。
本発明では、ＳＬＣ２５Ａ２４の遺伝子を欠損させた非ヒト動物、並びに、それに由来する組織または細胞も提供可能である。
その非ヒト動物は、抗肥満または低インスリンまたは低レプチンの状態のモデル動物であり得て、野生型に比べて有意な差異が認められるものである。
それに由来する組織または細胞は、本発明によるスクリーニング、肥満の改善が所望される疾患または状態のマーカー遺伝子のスクリーニング、脂肪細胞マーカー遺伝子のスクリーニング、肥満の改善が所望される疾患または状態の病態メカニズムの解析などに有用である。これらは、例えば、マイクロアレイやプロテインチップ等を用い、本発明による非ヒト動物における発現プロファイルを測定し、対照動物の発現プロファイルと比較する発現プロファイル解析により可能である。
本発明による肥満素因の評価方法及びキットによると、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを有効に評価するので、肥満に関連する様々な疾病の予防や早期治療に寄与する。また、本発明による抗肥満薬によると、脂肪細胞の分化を抑制するので、好ましくない他の作用を起こすことなく、肥満に関連する様々な疾病の治療に寄与する。これにより、社会問題化しつつある肥満対策に有用であり、産業上利用価値が高い。

Claims (11)

  1. 肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、
    被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるコピー数多型（ＣＮＶ）を検出する工程を有し、
    ここで、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶが０の場合に、肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価する
    ことを特徴とする肥満素因の評価方法。
  2. ＣＮＶの検出に、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかを用いる
    請求項１に記載の肥満素因の評価方法。
  3. 被験者が日本人である
    請求項１または２に記載の肥満素因の評価方法。
  4. 肥満または肥満に起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、
    被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン１におけるＣＮＶを検出する手段を備える
    ことを特徴とする肥満素因の評価キット。
  5. 抗肥満薬をスクリーニングする方法であって、
    被験物質が、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節し得るか否か、または、その活性を阻害または調節し得るか否かを評価する工程と、
    ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現を抑制または調節し得るか、または、その活性を阻害または調節し得て、結果的に肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する被験物質を、肥満または肥満に起因する状態または疾患を予防または治療する有効物質として選択する工程と、を有する
    ことを特徴とする抗肥満薬のスクリーニング方法。
  6. 被験物質を非ヒト動物に投与する工程と、
    被験物質を投与した非ヒト動物における肥満度を測定する工程と、
    その肥満度を減少させる被験物質を有効物質として選択する工程とを含む
    請求項５に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
  7. 非ヒト動物が、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を欠損させたことを特徴とする非ヒト動物である、請求項６に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
  8. 非ヒト動物が、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を過剰発現または安定発現させたことを特徴とする非ヒト動物である、請求項６に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
  9. 非ヒト動物が、脂肪細胞の分化が抑制され抗肥満の状態である、請求項７または８に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
  10. 非ヒト動物が、野生型マウスと比較して体重増加が抑制されるトランスジェニックマウスであって、
    前記トランスジェニックマウスが、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子をベクターに組み込んだプラスミドを用いて遺伝子導入し、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子を過剰発現または安定発現させることを特徴とする方法によって作成される、請求項６に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
  11. ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子の発現が、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質に特異的に反応する抗体を用いて確認され、
    ここで、前記ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質抗体が、ＳＬＣ２５Ａ２４蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち、EWRDYFLFNPVTDIEEをエピトープとして有する抗原を用いて製造することによって得られたことを特徴とする、請求項１０に記載の抗肥満薬のスクリーニング方法。
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