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JP2007528707A - 統合失調症の診断および治療のための標的としてのｅｇｒ遺伝子 - Google Patents

統合失調症の診断および治療のための標的としてのｅｇｒ遺伝子 Download PDF

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JP2007528707A
JP2007528707A JP2006517802A JP2006517802A JP2007528707A JP 2007528707 A JP2007528707 A JP 2007528707A JP 2006517802 A JP2006517802 A JP 2006517802A JP 2006517802 A JP2006517802 A JP 2006517802A JP 2007528707 A JP2007528707 A JP 2007528707A
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schizophrenia
molecule
gene
compound
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JP2006517802A
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デーヴィッド ジェイ． ガーバー，
ジョセフ エー． ゴゴス，
ダイアナ ホール，
マリア カライオーグー，
ススム トネガワ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

本発明は、統合失調症および関連症状の診断および治療のための標的、方法、および試薬を提供する。本発明は、ＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子発現における多型、変異、変動、変更などまたはこのような遺伝子に関連する多型の検出による統合失調症および統合失調症に対する感受性の診断方法を提供する。本発明は、多型および変異型の検出のためのオリゴヌクレオチド、アレイ、および抗体を提供する。本発明は、このような遺伝子が変化したトランスジェニックマウスを提供する。本発明はまた、これらの遺伝子をターゲティングする化合物の投与による統合失調症の治療方法を提供する。本発明は、さらに、このような化合物を同定するためのスクリーニング方法およびスクリーニングの実施によって得られた化合物を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年６月３０日提出の米国特許仮出願番号６０／４８４，０４３号（本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
（政府援助）
合衆国政府は、本発明の開発で使用した助成金を提供した。特に、国立衛生研究所が資金提供したＰ５０−ＭＨ５８８８０および同Ｒ０１−ＭＨ６１３９９は、本発明の開発を援助した。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
（背景）
統合失調症は、全世界で約１％が罹患している重篤な精神疾患である（Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ａ．＆Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ａ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ ２８，３２５−３）。この疾患は、挿間的に生じる種々のいわゆる「陽性」症状（幻覚、妄想、偏執症、精神障害が含まれる）および／または比較的持続する症状（感情の抑揚がない、社会的引きこもり、注意障害、および認識機能障害など）によって特徴づけられる。後者のカテゴリー中の症状は、しばしば「陰性症状」と呼ばれる。
統合失調症の遺伝研究により、それぞれ少しのリスクの増加に寄与する可能性が高い複数の遺伝的感受性エレメントによって特徴づけられる多因子性疾患であることが明らかとなった（Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ，Ｍ．＆ Ｇｏｇｏｓ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｎ １９，９６７−７９）。家柄（ｆａｍｉｌｙ ｌｉｎｋａｇｅ）研究および統合失調症に関連する染色体異常の研究により、多数の統合失調症の感受性遺伝子座が同定された（Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ，Ｍ．＆ Ｇｏｇｏｓ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｎ １９，９６７−７９；Ｔｈａｋｅｒ，Ｇ．Ｋ．＆ Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｗ．Ｔ．，Ｊｒ．（２００１）Ｎａｔ Ｍｅｄ ７，６６７−７１）。これらの遺伝子座は比較的大きな染色体領域を含み、何百もの遺伝子を含むことができる。したがって、これらの領域中の特定の感受性遺伝子が綿密に調査されている。
直接的遺伝子研究に加えて、長年の主な薬理学的研究により、ドーパミン作動性またはＮＭＤＡ受容体介在性シグナル伝達の機能障害が統合失調症の病因の主な要因であるという仮説が主流となっている（Ｓｅｅｍａｎ，Ｐ．（１９８７）Ｓｙｎａｐｓｅ １，１３３−５２；Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４１，２３７−６０）。統合失調症の病因についてのドーパミン仮説は、ドーパミン神経伝達系の機能障害が統合失調症を引き起こす異常で重要な役割を果たすことを支持している。この仮説は、統合失調症治療に有効な多数の薬物が共通のドーパミン受容体遮断特性を有するという所見に起因する。さらに、統合失調症の一定の症状を、ドーパミン作動系に対して正に作用するアンフェタミンなどの薬物によって再現することができる。グルタミン酸機能障害仮説により、統合失調症の原因についての異なるものであるが必ずしも矛盾しない説明を行うことができる。この仮説は、ＮＭＤＡ受容体（グルタミン酸の生理学的受容体）のアンタゴニストとして作用するフェンシクリジン（ＰＣＰ）およびＭＫ−８０１などの一定の化合物への曝露により、統合失調症様症状が発症するという所見から生じた（例えば、Ｊａｖｉｔｔ，Ｄ．ａｎｄ Ｚｕｋｉｎ，Ｒ．，Ａｎａ Ｊ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１９９１ Ｏｃｔ；１４８（１０）：１３０１−８を参照のこと）。これらの仮説は魅力的ではあるが、ドーパミン受容体またはＮＭＤＡ受容体の統合失調症との関連についての説得力のある直接的な遺伝的、生理学的、または生化学的証拠は得られていない。さらに、統合失調症治療のための種々の薬物が存在し、広範に使用されているにもかかわらず、真に満足のいく治療法は存在しない。
したがって、当該分野で統合失調症の病因をさらに理解する必要がある。さらに、当該分野で統合失調症および統合失調症に対する感受性の診断および治療のための方法および試薬の改良が必要である。
（発明の要旨）
本発明は、統合失調症および関連症状の診断および治療のための標的としての初期成長応答（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＥＧＲ）遺伝子およびＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の発現産物の同定に関する。本発明は、被験体から得たか被験体由来のサンプル中のＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型の多型性変異型の検出またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型の検出による統合失調症の診断方法および統合失調症の治療方法を提供する。本発明は、さらに、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ分子の内因性の標的またはレギュレーターの発現レベルおよび／または活性の調整による統合失調症の防止および／または治療方法を提供する。本発明は、さらに、統合失調症および／または関連症状の診断に有用な試薬の同定方法を提供する。さらに、本発明は、統合失調症および／または関連症状の防止および／または治療に有用な化合物の同定方法を提供する。
特に、本発明は、統合失調症または関連症状の種々の診断方法を提供する。例えば、本発明は、（ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、（ｉｉ）サンプル中のＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型の多型性変異型を検出するか、このような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法を提供する。本発明は、さらに、（ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、（ｉｉ）正常な被験体から得たサンプル中で予想されるＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性と比較した、サンプル中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性の変化または変動を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法を提供する。
別の態様では、本発明は、統合失調症もしくは関連症状または統合失調症に対する感受性もしくは関連症状の診断で使用するためのこのような遺伝子および／またはｍＲＮＡまたはタンパク質発現産物の発現の多型、変異、変動、変更などの検出方法を提供する。このような方法は、種々の目的（診断が含まれる）に有用である。
別の態様によれば、本発明は、種々の動物モデルにおける化合物のスクリーニング方法を含む、統合失調症および／または関連症状の治療で有用な化合物の多数の異なるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法を提供する。
別の態様では、本発明は、これらのスクリーニング法にしたがって同定された化合物およびこれらの化合物を含む薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、統合失調症または統合失調症に対する感受性の種々の治療方法を提供する。例えば、本発明は、（ｉ）統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を提供する工程と、（ｉｉ）ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を調整する化合物を被験体に投与する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法を提供する。本発明の一定の実施形態では、化合物は、ＥＧＲタンパク質とＮＡＢタンパク質との間の結合を妨害する。本発明は、さらに、（ｉ）統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を提供する工程と、（ｉｉ）細胞内のカルシウムレベルを調整する化合物を被験体に投与する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法を提供する。本明細書中に記載の種々の治療方法で使用するための化合物を、本明細書中に記載の任意の本発明のスクリーニングまたは他のアプローチの使用によって同定することができる。
本発明は、さらに、統合失調症または関連疾患の治療に有用なオリゴヌクレオチドなどの試薬、オリゴヌクレオチドアレイ、抗体、およびトランスジェニックマウス（ノックアウトマウスおよびノックダウンマウスが含まれる）、ならびに化合物のスクリーニング実施でのその使用方法を提供する。
全ての特許、特許出願、学術論文、書籍、および他の引用文献の内容が、本明細書中で参考として援用される。さらに、以下の標準的な参考資料が本明細書中で参考として援用される：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，ｅｄｉｔｉｏｎ ａｓ ｏｆ Ｍａｒｃｈ ２００２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１；ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍ ａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄ．．ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，２００１；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．（ｅｄ．）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ；８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２１，２０００）；およびＫａｎｄｅｌ，Ｅ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｈ．，Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．，（ｅｄｓ．），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４ ｔｈ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，２０００。任意の援用された参考文献と本明細書との間に不一致が存在する場合、明細書を調整しなければならない。
（定義）
アゴニスト：用語「アゴニスト」とは、ポリペプチドまたは核酸の効果を増大するか、その持続時間を延長する分子をいう。アゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、小分子、イオン、またはポリペプチドもしくは核酸の効果を調整する任意の他の分子が含まれ得る。アゴニストは、ポリペプチドもしくは核酸への結合によってその効果を発揮する分子である場合には直接的アゴニストまたはポリペプチドもしくは核酸への結合以外の機構を介してその効果を発揮する場合には間接的アゴニストであり得る（例えば、ポリペプチドまたは核酸の発現または安定性を変化させるか、ポリペプチドまたは核酸の標的の発現または活性を変化させるか、ポリペプチドまたは核酸を含む経路における中間体との相互作用などによる）。
対立遺伝子：用語「対立遺伝子」とは、ゲノム内に１つの遺伝子座で存在し得る遺伝子またはＤＮＡ配列の１つの異なる形態をいう。この用語には、典型的に遺伝子連鎖研究および遺伝的関連研究で研究される天然に存在する対立遺伝子ならびに遺伝子操作された対立遺伝子の両方が含まれる。
アンタゴニスト：用語「アンタゴニスト」とは、ポリペプチドまたは核酸の効果を減少するか、その持続時間を減少する分子をいう。アゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、またはポリペプチドもしくは核酸の効果を調整する任意の他の分子が含まれ得る。アンタゴニストは、ポリペプチドもしくは核酸への結合によってその効果を発揮する分子である場合には直接的アゴニストまたはポリペプチドもしくは核酸への結合以外の機構を介してその効果を発揮する場合には間接的アゴニストであり得る（例えば、ポリペプチドまたは核酸の発現または安定性を変化させるか、ポリペプチドまたは核酸の標的の発現または活性を変化させるか、ポリペプチドまたは核酸を含む経路における中間体との相互作用などによる）。
抗体：一般に、用語「抗体」とは、本発明の種々の実施形態で天然または全部もしくは部分的に合成することができる免疫グロブリンをいう。抗体は、部分的または全部が合成された天然供給源（例えば、抗原をコードする抗原または構築物で免疫化された動物由来のげっ歯類、ウサギ、ニワトリ（または卵）から精製）に由来し得る。抗体は、任意の免疫グロブリンクラスのメンバー（以下の任意のヒトクラスが含まれる：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）であり得る。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（単鎖可変領域）、もしくは抗原結合部位を保持する他のフラグメント、または組換えによって産生されたｓｃＦｖフラグメント（組換え産生フラグメントが含まれる）などの抗体のフラグメントであり得る。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０−７６５，２００２およびその引用文献を参照のこと。好ましい抗体、抗体フラグメント、および／または抗原結合部位を含むタンパク質ドメインを、例えば、ファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．１９９４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５，１９９４）、リボゾームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．，ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：４９３７−４９４２，１９９７）などを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで作製および／または選択することができる。本発明の種々の実施形態では、抗体は、例えば、げっ歯類起源の可変ドメインをヒト起源の定常ドメインと融合し、それによりげっ歯類抗体の特異的を保持する「ヒト化」抗体である。ヒト起源のドメインは、最初にヒトで合成されるという意味でヒトに直接由来する必要はないことに留意する。代わりに、「ヒト」ドメインを、そのゲノムがヒト免疫グロブリン遺伝子を組み込むげっ歯類で作製することができる。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９，１９９８を参照のこと。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得るが、本発明の目的のためには一般的にモノクローナル抗体が好ましい。
診断情報：本明細書中で使用される、「診断情報」または「診断で使用するための情報」とは、患者が疾患もしくは症状を有するかどうかの決定および／または疾患もしくは症状表現型カテゴリーもしくは疾患もしくは症状の予後もしくは治療（一般的治療または任意の特定の治療）に対して起こり得る応答に関する意義を有する任意のカテゴリーへの分類で有用な任意の情報である。同様に、診断は、任意の診断情報型（被験体が症状（統合失調症など）を有する可能性が高いかどうか、疾患の性質もしくは分類に関する情報、予後に関する情報、および／または適切な治療の選択で有用な情報）の提供をいう。
有効量：一般に、活性成分（ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の「有効量」とは、所望の生物学的応答を誘発するのに必要な量をいう。当業者に認識されるように、有効な特定の薬剤の絶対量は、所望の生物学的評価項目などの要因、送達すべき薬剤、標的組織などの要因に依存して変化し得る。当業者は、さらに、「有効量」を単回用量で投与するか、複数の用量での投与によって達成することができることを理解する。例えば、統合失調症の治療薬の場合、有効量は、患者の臨床的改善（例えば、統合失調症の１つまたは複数の症状の緩和）および／または統合失調症を連想させる表現型の定量試験結果の改善を得るのに十分な量であり得る。
遺伝子：本発明の目的のために、用語「遺伝子」とは、当該分野で理解されている本来の意味を有する。一般に、遺伝子は、コード配列（読み取り枠）に加えて、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列が含まれると理解される。「遺伝子」の定義には、タンパク質をコードするのではなくむしろミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｔＲＮＡなどの機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸に対する言及が含まれることがさらに認識される。明確にするために、本出願で使用される、用語「遺伝子」とは、一般に、タンパク質をコードする核酸部分をいい、この用語は任意選択的に調節配列を含み得ることに留意する。この定義は、用語「遺伝子」の非タンパク質コード発現単位への適用を排除することを意図するよりもむしろ、ほとんどの場合、本明細書中で使用されるこの用語はタンパク質コード核酸をいうことを明確にすることを意図する。
遺伝子産物または発現産物：「遺伝子産物」または「発現産物」とは、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、プロセシング前またはプロセシング後）または遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチド（例えば、修飾前または修飾後）である。化合物または薬剤は、細胞または被験体への化合物または薬剤の適用によりＲＮＡもしくはポリペプチド発現産物のいずれか一方またはその両方が増加する場合に遺伝子発現が増加させると言われる。化合物または薬剤は、細胞または被験体への化合物または薬剤の適用によりＲＮＡもしくはポリペプチド発現産物のいずれか一方またはその両方が減少する場合に遺伝子発現が減少させると言われる。
相同性：用語「相同性」とは、２つまたはそれ以上の核酸配列または２つまたはそれ以上の核酸配列の間の類似度をいう。当該分野で周知のように、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を考えると、相同配列を、ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列のためのＢＬＡＩＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを使用したデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＳＴＡ［発現配列タグ］データベース、ＧＳＴ［遺伝子配列タグ］データベース、ＧＳＳ［ゲノム外観（ｓｕｒｖｅｙ）配列］データベース、生物配列決定計画データベース）の検索によって同定することができる。これらのプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０，Ａｉｔｃｈｕｌ，ＳＦ ａｎｄ Ｇｉｓｈ，Ｗ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ，ｅｔ ａｌ．，”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７に記載されている。相同配列の同定に加えて、上記プログラムは、典型的に、同一性相同（ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）度を示す。２つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に適用される、用語「同一の」または「同一」率は、比較ウィンドウまたは指定した領域が最大に一致するように比較およびアラインメントを行った場合、同一またはアミノ酸残基またはヌクレオチドが特定の比率で同一であるか（例えば、約５０％同一、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）、配列の一部（例えば、少なくとも５０残基、少なくとも１００残基、配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％など）または全配列の同一性がより高い２つまたはそれ以上の配列またはサブシーケンスをいう。上記の任意のプログラムまたはその後のバージョン（例えば、下記のデフォルトパラメーターを使用するか手動で実施する）などの配列比較法を使用して同一率を測定することができる。アラインメントは、好ましくは、ギャップを考慮する（例えば、適切な場合に、最大のアラインメントを達成するために配列の特定の領域にギャップを挿入してアラインメントを行う）。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列の間または２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列の間に存在する同一度または相同度の決定を、当該分野で公知の任意の種々の他のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを使用するか手動で好都合に行うこともできる。適切なプログラムの考察および供給元を、例えば、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．，ａｎｄ Ｑｕｅｌｌｅｔｔｅ，Ｂ．Ｆ．Ｆ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｚｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｒａｗｅｔｚ，Ｓ．（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｉｎａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９で見出すことができる。
ハイブリッド形成：本明細書中で使用される、用語「ハイブリッド形成する」とは、２つの相補核酸配列の間の相互作用をいう。句「高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する」とは、当該分野で認識された高ストリンジェンシー条件下で維持される十分に安定な相互作用を説明する。ハイブリッド形成反応実施のガイダンスを、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９８９およびより最近の改訂版（その全体が本明細書中で参考として援用される）で見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｒａｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１も参照のこと。水性および非水性方法は、この参考文献に記載されており、いずれかを使用することができる。典型的には、約５０〜１００超のヌクレオチド長の核酸配列について、低ストリンジェンシー（例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）およびその後の５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる２回の洗浄（中−低ストリンジェンシー条件では洗浄温度を５５℃に上昇させることができる））；中程度のストリンジェンシー（例えば、４５℃で６×ＳＳＣおよびその後の６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる１回または複数回の洗浄）；高ストリンジェンシー（例えば、４５℃で６×ＳＳＣおよびその後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる１回または複数回の洗浄）；および非常に高いストリンジェンシー（例えば、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳおよびその後の６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳによる１回または複数回の洗浄）などの種々のストリンジェンシーレベルが定義されている。高ストリンジェンシー条件下でのハイブリッド形成は、非常に高い相補性を有する配列間のみで生じる。当業者は、ハイブリッド形成配列の長さなどの種々の因子（ＲＮＡまたはＤＮＡを含むかどうかなど）に基づいて、異なるストリンジェンシー度についてのパラメーターは異なることを認識する。例えば、高、中、または低ストリンジェンシーハイブリッド形成に適切な温度は、一般に、オリゴヌクレオチドなどのより短い配列はより長い配列よりも低い。種々のストリンジェンシーのハイブリッド形成条件のさらなる例は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，ｅｄｉｔｉｏｎ ａｓ ｏｆ Ｍａｒｃｈ ２００２で見出される。
単離：本明細書中で使用される、用語「単離した」とは、１）通常天然では会合している少なくともいくつかの成分から分離していること、２）人の手を含むプロセスによって調製または精製されていること、および／または３）天然に存在しないことを意味する。
連鎖または連結：本明細書中で使用される、「連鎖」または「連結」とは、一般に、遺伝連鎖をいう。２つの遺伝子座（例えば、ＤＮＡマーカー遺伝子座および変異原因疾患などの疾患遺伝子座）は、これらの２つの遺伝子座の間に生じる組換えの確率が５０％（２つの非連結遺伝子座の間の組換えの確率に等しい）未満である場合に、遺伝的に連結していると言われる。用語「連鎖」または「連結」とは、物理的連鎖を言うこともできる。一般に、同一の連続するＤＮＡ片上に存在する場合、２つの遺伝子座は物理的に連結している。２つの遺伝子座間の物理的距離が長いほど、物理的連鎖度は低い。遺伝連鎖と物理的連鎖は対応しているが、この対応は不正確であり、非線型であり得ることが認識される。例えば、任意の特定数の塩基で分離された２つの遺伝子座は、遺伝子座間の領域中の組換え頻度が低い場合、遺伝的に密接に連結することができるが、２つの遺伝子座間の組換え頻度が高い場合、本質的に遺伝的に連結しないか僅かのみ連結し得る。
オリゴヌクレオチド：用語「オリゴヌクレオチド」とは、２塩基長から約７０塩基長までの範囲の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）をいう。オリゴヌクレオチドはしばしば合成であるが、天然に存在するポリヌクレオチドから産生することもできる。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、１つまたは複数の化学結合型、通常、水素結合形成による相補的対合によって相補配列の標的核酸に結合することができる典型的には一本鎖のオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、しばしば５〜６０塩基であり、特定の実施形態では、１０塩基長と４０塩基長との間または１５塩基長と３０塩基長との間であり得る。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーには、天然の塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）が含まれ得る。さらに、ホスホラミダイト連鎖またはホスホロチオエート連鎖などのホスホジエステル結合以外の連鎖によって塩基を結合することができるか、このような連鎖がハイブリッド形成を妨害しない限りこれらは構成要素である塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって結合するペプチド核酸であり得る。本明細書中に記載の任意のオリゴヌクレオチドを、単離形態または精製形態で提供することができる。
作動可能に連結された：核酸に関する用語「作動可能に連結された」とは、１つの核酸配列の発現またはプロセシングが他の核酸配列によって制御、調節、調整などされる２つの核酸配列間の関係をいう。例えば、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結されている。好ましくは、第２の核酸配列に作動可能に連結された核酸配列は、直接的または間接的にこのような配列と共有結合しているが、任意の有効な三次元会合が許容可能である。この用語を、一般に、化学的または物理的に結合した（例えば、共有結合、水素結合、イオン結合）第２の核酸またはポリペプチドの発現、プロセシング、局在化、輸送などを調節する任意の核酸またはポリペプチドに適用することができる。
多型：用語「多型」とは、集団中の２つまたはそれ以上の別の配列または対立遺伝子の発生をいう。「多型性部位」とは、集団のメンバー間でゲノムＤＮＡ配列が異なる位置である。「多型性変異型」とは、集団のメンバー間の多型性部位に存在し得る任意の別の配列または対立遺伝子である。本発明の目的のために、用語「集団」は、全世界の集団または個体の任意の小集団もしくは群をいうことができる。したがって、本明細書中で使用される、用語「多型性変異型」とは、一般に、例えば、組換えＤＮＡテクノロジーによって作製された変異型と対照的な天然に存在する変異型をいう。しかし、この用語には、このような変異型が天然に存在する変異型を複製または再現する場合、組換えＤＮＡテクノロジーによって作製された変異型が含まれる。天然に存在する変異型の複製または再現は、異なるヒトの遺伝的背景またはマウスなどの動物モデルのいずれかにおける天然に存在するヒト変異型の反復発生（例えば、マウスゲノムＤＮＡ内の対応部位での変異の作製）を含むことを意図する。
典型的には、本明細書中に記載の種々の方法（例えば、診断法、原因となる変異の同定方法）のために、集団内に存在する複数の多型性変異型の間で被験体に多型性変異型が存在することを決定することを目的とする。
ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質：本発明によれば、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」とは、ペプチド結合で連結された少なくとも３つのアミノ酸配列を含む。この用語を交換可能に使用することができるが、一般に、ペプチドは、約８アミノ酸と３０アミノ酸との間の配列を示す。ペプチドは、ペプチドまたはペプチド集団をいうことができる。ペプチドは、好ましくは、天然のアミノ酸のみを含むが、当該分野で公知の非天然アミノ酸（すなわち、天然で存在しないがポリペプチド鎖に組み込むことができる化合物；例えば、機能的イオンチャネルに首尾よく組み込まれた非天然アミノ酸の構造を示すＵＲＬがｗｗｗ．ｃｃｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／〜ｄａｄｇｒｐ／Ｕｎｎａｔｓｔｒｕｃｔ．ｇｉｆのウェブサイトを参照のこと）および／またはアミノ酸アナログを代わりに使用することもできる。また、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、抱合のためのリンカー、官能化、または他の修飾などの化学物質の付加によってペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸を使用することができる。好ましい実施形態では、ペプチドの修飾により、より安定な（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増加する）ペプチドが得られる。これらの修飾には、ペプチドの環状化、Ｄ型アミノ酸の組み込みなどが含まれ得る。修飾は実質的にペプチドの所望の生物活性を妨害すべきではないが、このような修飾はペプチドに所望の性質（例えば、生物活性の増加）を付与することができる。
細胞または被験体への化合物または薬剤の適用によってポリペプチド量が増加する場合、化合物または薬剤はポリペプチドの発現を増加させるという。細胞または被験体への化合物または薬剤の適用によってポリペプチド量が減少する場合、化合物または薬剤はポリペプチドの発現を減少させるという。
ポリヌクレオチドまたは核酸：ポリヌクレオチドまたは核酸は、ヌクレオチドのポリマーをいう。この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡをいうことができる。核酸は、一本鎖、二本鎖、またはいくつかの場合、三本鎖であり得る。他で言及しない限り、本明細書中で核酸を５’→３’方向に列挙する。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドを含む。ポリマーには、天然ヌクレオチド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基、修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト連鎖）が含まれ得る。
細胞または被験体への化合物または薬剤の適用によってポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの翻訳産物またはその両方の量が増加する場合、化合物または薬剤はポリヌクレオチド発現を増加させるという。細胞または被験体への化合物または薬剤の適用によってポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの翻訳産物またはその両方の量が減少する場合、化合物または薬剤はポリヌクレオチド発現を減少させるという。
プライマー：用語「プライマー」とは、適切な緩衝液および適切な温度における適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸ならびにＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素などの重合剤の存在下）でのテンプレート指示ＤＮＡ合成の出発点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、意図するプライマーの使用に依存するが、典型的には、約１０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまでの範囲である。短いプライマー分子は、一般についてンプレートとの十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートに対して完全に相補的である必要はないが、テンプレートとハイブリッド形成するために十分に相補的でなければならない。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリッド形成する標的ＤＮＡの配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅すべきＤＮＡ配列の５’末端とハイブリッド形成する５’（上流）プライマーおよび増幅すべき配列の３’末端の相補物にハイブリッド形成する３’（下流）プライマーを含むプライマー対をいう。これらのプライマーを、それぞれ正方向プライマーおよび逆方向プライマーともいう。
本明細書中で使用される、「精製された」とは、多数の他の化合物または物質からの分離を意味する。化合物または物質を、部分的に精製するか、実質的に精製するか、純粋であることができ、実質的に全ての他の化合物または物質から取り出された場合、「純粋」であり、それゆえ、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて純粋である。
調節配列または調節エレメント：用語「調節配列」または「調節エレメント」を、本明細書中で、作動可能に連結された配列の発現（特に、転写であるが、いくつかの場合、スプライシングまたは他のプロセシングなどの他の事象）を指示、増強、または阻害する核酸配列の領域を説明するために使用する。この用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節エレメントが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、調節配列は、ヌクレオチド配列の構成性発現を指示し、他の実施形態では、調節配列は細胞型もしくは組織特異的および／または誘導性発現を指示することができる。例えば、哺乳動物細胞での使用に適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、リンパ特異的プロモーター（例えば、Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５，１９８８）（Ｔ細胞受容体のプロモーター（例えば、Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＳＯ Ｊ．８：７２９，１９８９を参照のこと）および免疫グロブリン（例えば、Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９，１９８３；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７４１，１９８３）など）、およびニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３，１９８９）が含まれる。発生調節プロモーター（マウスホメオボックス（ｈｏｘ）プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４，１９９０）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７，１９８９）が含まれるが、これらに限定されない）も含まれる。
サンプル：本明細書中で使用される、被験体から得た「サンプル」には、以下の任意または全てが含まれ得るが、これらに限定されない：細胞、組織の一部、血液、血清、腹水、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、および他の体液、分泌物、または排出物。サンプルは、例えば、皮膚、頬粘膜もしくは結膜粘膜、胎盤、胃腸管、または他の器官由来の得られた組織サンプルであり得る。胎児または胚の細胞または組織由来のＤＮＡサンプルを、羊水穿刺または絨毛膜標本採取などの適切な方法によって得ることができる。
用語「サンプル」には、このようなサンプルの単離、精製、および／または処理由来の任意の材料も含まれる。生成されたサンプルには、サンプルから抽出されたかｍＲＮＡの増幅または逆転写などにサンプルを供することによって得た核酸またはタンパク質が含まれ得る。
短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）：ｓｉＲＮＡは、２つの個別のＲＮＡ相補鎖を含むＲＮＡ二重鎖を含む。二重鎖部分は、典型的には、約１５〜２９塩基対長、典型的には１７〜２３塩基対（例えば、１９塩基対）の範囲であり、任意選択的に、１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含む。短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれる分子は、類似の二重鎖部分を含む単一の自己相補ＲＮＡ鎖からなり、自己ハイブリッド形成する部分に接続したループをさらに含む。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが１つまたは複数の遊離（非ハイブリッド形成）鎖末端を含む場合、一般に、遊離５’末端はリン酸基を有し、遊離３’末端は水酸基を有することが好ましい。本発明の一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖部分（またはｓｈＲＮＡの自己ハイブリッド形成部分）の１つの鎖（標的転写物に関してアンチセンス鎖）は、標的転写物の領域と正確に相補的である（鎖は１つのミスマッチもなく標的転写物とハイブリッド形成することを意味する）。存在する場合、オーバーハングも相補的であり得る。しかし、本発明の他の実施形態では、完全に相補的である必要はない。
１）非存在下と比較した場合、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの存在下で標的遺伝子転写物の安定性（例えば、半減期）が減少する場合、および／または２）ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの少なくとも一部（アンチセンス鎖または一部）が少なくとも１３、少なくとも１５、少なくとも１７、より好ましくは少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２９ヌクレオチドまでのストレッチについての標的転写物と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％正確な配列的相補性を示す場合、および／または３）ストリンジェントな条件下でｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが標的転写物とハイブリッド形成する場合、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、本明細書中に記載の目的のためにターゲティングされたと見なされる。
小分子：本明細書中で使用される、用語「小分子」とは、比較的低分子量でタンパク質、ポリペプチド、核酸ではない天然に存在するか人為的に作製された（例えば、化学合成による）有機化合物をいう。典型的には、小分子の分子量は、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満である。また、小分子は、典型的には、複数の炭素−炭素結合を有する。
特異的結合：本明細書中で使用される、用語「特異的結合」とは、小分子であり得る第１の分子と第２の（結合）分子（抗体、アゴニスト、またはアンタゴニストなど）との間の相互作用をいう。相互作用は、典型的には、結合分子（例えば、抗体の場合）によって認識される抗原決定基またはエピトープなどの第１の分子の特定の構造の特徴の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープＡに特異的な場合、標識されたＡおよびその抗体の両方を含む反応中のエピトープＡを含むポリペプチドの存在または非標識Ａの存在により、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。特異性が絶対的である必要はないと理解すべきである。例えば、多数の抗体が標的分子中に存在するエピトープに加えて他のエピトープと交差反応することが当該分野で周知である。このような交差反応性は、抗体が使用される適用に依存して許容可能である。したがって、抗体の特異度は、使用される状況に依存する。一般に、他の潜在的パートナーに結合する上記パートナーの結合を好む場合、抗体は特定のパートナーに特異性を示す。当業者は、任意の所与の適用（例えば、標的分子の検出のため、治療目的のため）で適切に実施するのに十分な特異度を有する抗体を選択することができる。小分子である結合分子の場合、相互作用はまた、典型的には、結合分子が結合する分子の特定の構造の特徴（例えば、小分子が適合する割れ目または三次元ポケット）の存在に依存する。
他の標的（例えば、競合物）に対する結合分子の親和性に対する第１の分子に対する結合分子の親和性などのさらなる要因の状況で特異性を評価することができるとも理解すべきである。結合分子が検出することが望ましい特定の分子に対して高親和性を示し、大部分または全ての他の分子に対して低親和性を示す場合、結合分子は、例えば、診断および／または治療目的のための許容可能な試薬である場合が多い。１つまたは複数の状況で一旦結合分子の特異性が確立されると、その特異性を必ずしも再評価することなく他の（好ましくは類似の）状況で使用することができる。
治療：本明細書中で使用される、用語「治療」には、このような用語を提供する疾患、障害、もしくは症状またはこのような疾患、障害、もしくは症状の１つまたは複数の症状もしくは徴候の逆転、緩和、進行の阻害、防止、および／または軽減が含まれ得る。
ベクター：用語「ベクター」とは、本明細書中で、例えば、細胞への別の核酸分子の侵入（例えば、導入、輸送など）を介在することができる核酸分子をいうために使用する。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結される（例えば、挿入される）。ベクターは、自律複製を指示する配列を含み得るか、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに十分な配列を含み得る。有用なベクターには、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターには、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。当業者に自明であるように、ウイルスベクターには、導入された核酸の侵入を介在する核酸に加えて、種々のウイルス成分が含まれ得る。
（一定の実施形態の詳細な説明）
Ｉ．概要
カルシニュリンは、Ｃａ２＋介在性シグナル伝達で重要な役割を果たすカルシウム依存性セリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼである。哺乳動物の脳抽出物におけるその元の同定以来、カルシニュリンは種々の生物学的応答に関与し、神経系におけるカルシニュリンの多数の役割が同定されている。カルシニュリンは、中枢神経系で高度に発現される（Ｋｌｅｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｒｅｎ，Ｈ．＆ Ｗａｎｇ，Ｘ．（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，１３３６７−７０；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｆ．，Ｈａｌｌｉｎ，Ｕ．＆ Ｕｃｈｉｎｏ，Ｈ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１３１，１−１５；Ｒｕｓｎａｋ，Ｆ．ａｎｄ Ｍｅｒｔｚ，Ｐ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）８０（４）：１４８３−１５２２）。カルシニュリンおよびカルシニュリンに関与する多数の分子をコードする遺伝子のゲノム中の位置は同定されている。
米国特許出願番号１０／４００，３４８および引用例１および１９に記載のように、本発明者らは、前脳特異的カルシニュリンＢノックアウトマウスが統合失調症を連想する表現型の範囲を示すことおよびカルシニュリンサブユニット遺伝子およびカルシニュリンシグナル伝達で役割を果たすポリペプチドをコードする多数の他の遺伝子の位置が統合失調症の感受性遺伝子座と一致することに気づいた。本発明者らは、一定のカルシニュリンサブユニットとカルシニュリン相互作用遺伝子との間の統合失調症との相互作用を試験し、ＰＰＰ３ＣＣ遺伝子（カルシニュリンＡγサブユニットをコードする）が統合失調症と関連するという直接的な遺伝的証拠を発見した。
下により詳細に考察するように、統合失調症の原因は同定されていないが、遺伝因子が重要であることが公知である。遺伝子研究によって多数のゲノム領域が感受性遺伝子座として同定されており、これらの領域内の変異または変動が統合失調症の病因に寄与すると考えられるが、各遺伝子、変異、または変動は明確に役割を果たすことが明確に示されていない。統合失調症に関与する特定の変異または変動の同定により、改良された診断試験の基礎が得られる。さらに、変異または変動が統合失調症の感受性および／または病因に寄与する特定の遺伝子の同定により、改良された診断試験の基礎が得られるだけでなく、改良された統合失調症治療の基礎も得られる。本発明者らは、遺伝子連鎖研究により、ＥＧＲ遺伝子ファミリーメンバーの染色体中の位置が統合失調症遺伝子座の位置と一致することを発見した。この発見に関して、本発明は、統合失調症ならびに関連する症状および障害の感受性および／または発症が得られる遺伝子の変異または変化を同定するための方法および試薬、統合失調症または統合失調症に対する感受性を診断するための方法および試薬、統合失調症を防止するための化合物を同定するための方法および試薬、ならびに種々の他の方法および試薬を提供する。
本発明者らは、ＰＰＰ３ＣＣ遺伝子と統合失調症感受性との間に認められた関連がＰＰＰ３ＣＣ遺伝子座自体の変化を反映する可能性が高いが、分析されたＳＮＰがＰＰＰ３ＣＣ遺伝子座内に存在するので、隣接遺伝子に影響を与える変動も認められた関連シグナルに寄与するかこれを担うことが可能であることを認識する。したがって、本発明者らは、認められた関連シグナルに寄与し得る候補遺伝子を同定するためのＰＰＰ３ＣＣ周辺に遺伝子が存在することを決定するためのヒトゲノムドラフト配列を試験した。そのうちで、隣接遺伝子は、本発明者らが統合失調症との関連を認めた、１５０ｋｂのＰＰＰ３ＣＣに近位であるかその内部（図１）および確認された統合性失調症感受性遺伝子座内（２〜８）に存在するＥＧＲ３である。以下にさらに考察されるように、本発明者らは、統合失調症の病因とのその潜在的な関与を支持するＥＧＲ３機能の多数の態様を認識した。
ＥＧＲ２は、染色体位置１０ｑ ２１．３に存在する。本発明者らは、特定の初代集団サンプル中の統合失調症についてのゲノムワイド連鎖スキャン（ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｃａｎ）を行い、この染色体領域と統合失調症との連鎖を検出した（実施例４）。この連鎖は、米国で採取されたファミリーの独立サンプルで複製された。両研究において、ＥＧＲ２は、連鎖について認められたピークマーカーに隣接して存在する。２１０の３つ組み（ｔｒｉａｄ）からなる第３の独立したサンプル中のマイクロサテライトマーカーおよび１つのヌクレオチド多型を使用した分析により、ＥＧＲ２遺伝子周辺でのマイクロサテライトとＳＮＰとの関与についての僅かに有意な証拠が得られた。
実施例１にさらに詳細に説明するように、本発明者らは、他の同定されたＥＧＲ２遺伝子の位置を公知の統合失調症の感受性遺伝子座と比較してこれらの遺伝子も潜在的に統合失調症の感受性遺伝子座に関連するかどうかを決定し、これが事実であることを見出した。詳細には、ＥＧＲ１は、別の確認された統合失調症の感受性遺伝子座（８−１３）内の５ｑ３１．２に存在する（図２）。ＥＧＲ４は、２ｐｌ３−１４での推定統合失調症の感受性遺伝子座（６，１４−１５）内の２ｐｌ３．２に存在する。したがって、４つ全てのＥＧＲ遺伝子ファミリーメンバーは、連鎖研究によって同定された推定統合失調症の感受性遺伝子座内に存在する。
４つ全てのＥＧＲ遺伝子ファミリーメンバーの染色体位置と連鎖または関連研究によって同定された推定統合失調症の感受性遺伝子座の位置との一致により、ＥＧＲ機能の変化が統合失調症の病因における要因であり得ることが示唆される。統合失調症に関与する複数の経路によってＥＧＲ３発現が誘導されるという所見により、さらに支持される。統合失調症の病因におけるＥＧＲ機能の関連の範囲および性質を、ＥＧＲ遺伝子と統合失調症との関連のさらなる直接的遺伝学研究によってさらに確認することができる。本明細書中に記載の発見により、ＥＧＲ転写因子、その発現がＥＧＲ転写因子活性に誘導される分子（例えば、タンパク質）、その活性がＥＧＲ機能を調整する分子（例えば、タンパク質）、およびＥＧＲ経路中の他の遺伝子は、統合失調症、統合失調症感受性、および統合失調症関連症状の診断および治療の標的であることが示唆される。
次の節は、ＥＧＲ遺伝子、その発現産物および活性、関連分子、ならびにＥＧＲ遺伝子を調節するかこれによって調節される分子を考察する。次いで、統合失調症およびその遺伝的な根拠を説明する。その後の節は、本発明の特定の態様をより詳細に説明する。
ＩＩ．ＥＧＲ分子、ＥＧＲ相互作用分子、およびＥＧＲ活性
Ａ．ＥＧＲ転写因子
遺伝子発現の転写制御は、生物の生涯を通して多数の細胞過程の調節で根本的に重要である。一般に、転写因子と呼ばれるタンパク質とＤＮＡおよび他の核タンパク質との相互作用によって、転写を調節する。転写因子は、典型的には、ＤＮＡ内の特定の配列（「ＤＮＡ結合部位」または「ＤＮＡ結合配列」と呼ばれる）に結合し、ＤＮＡ結合部位の下流（すなわち、３’）に頻繁に存在する作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写を調節する。ＤＮＡ結合部位は、典型的には、プロモーターおよび／またはエンハンサー内に存在する。
転写因子の結合により、作動可能に連結された遺伝子の転写が頻繁に活性化される一方で、抑制もされ得る。ＤＮＡ結合および転写の活性化または抑制は、通常、転写因子内の異なる領域によって介在される。したがって、多数の転写因子には、ＤＮＡ結合ドメインおよび異なる転写活性化（または抑制）ドメインが含まれる。これらのドメインは頻繁にモジュールである。例えば、通常はＤＮＡに結合しないタンパク質への特定の転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインの挿入により、頻繁にそのタンパク質に配列特異的ＤＮＡ結合活性が付与される。同様に、タンパク質が適切なＤＮＡ結合ドメインを含む場合、通常は転写を活性化または抑制するタンパク質への特定の転写因子由来の転写活性化（または抑制）ドメインの挿入により、タンパク質を転写アクチベーターまたはリプレッサーに変換することができる。転写活性化ドメインまたは抑制ドメインは、典型的には、基本的転写機構の成分（例えば、コアＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体）などの他の核タンパク質および／または独立してＤＮＡ結合タンパク質であり得るがその必要はないコリプレッサーもしくはコアクチベーターと相互作用する。相互作用は、しばしば、直接物理的相互作用を介するが、その必要はない。コアクチベータータンパク質は転写因子によって介在される転写活性化の範囲を増加させることができる一方で、コリプレッサーは転写因子による転写活性化を防止することができ、そして／または転写を活性化するものから転写を抑制するものに転写因子を変換することができる。
転写因子、コアクチベーター、およびコリプレッサーは、その活性を調整することができる種々のリガンドの結合部位を含み得る。細胞外シグナルは、しばしば、最終的に転写因子活性に収束して影響を与える種々のシグナル伝達経路を介して形質導入される。例えば、細胞外刺激の結果として生じる種々の転写因子のリン酸化および脱リン酸化により、転写因子の局在化、機能活性などの種々の態様を調節することができる。
細胞の挙動および分化状態の著しい変化を頻繁に誘発する転写因子の初期成長応答（ＥＧＲ）ファミリーのメンバーが発見された。これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの増加により、種々の細胞外刺激（初期応答遺伝子と指定される血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、およびホルボールエステル（ＰＭＡ）などの種々の分裂促進刺激が含まれる）によるその後処理が急速に進む。この応答も神経伝達受容体の刺激または脱分極時に起こり得ることが後に発見され、ＥＧＲ遺伝子による転写調節は神経系の分化および成長で役割を果たすことに加えて他の役割を果たす可能性が高いことを示す。
４つの公知のＥＧＲタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを構成する３つのＣｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フィンガードメインを含む（図３Ａ）。これらのドメインは、ＧＣリッチなコンセンサス結合部位（例えば、ＧＣＧ［Ｇ／Ｔ］ＧＧＧＣＧ（図３Ｂ）（１６）（４位のヌクレオチドは、通常Ｇである）に結合する。このＤＮＡ結合配列またはその変異型の１つまたは複数のコピーは多数の遺伝子（典型的には、コード領域の上流）で見出され、類似の結合特異性を示すＥＧＲファミリーメンバーによってこれらの遺伝子の転写を調節することが示されている（１６およびその参考文献）。ＥＧＲ転写因子によってその転写が調節される（例えば、活性化または抑制される）作動可能に連結された遺伝子またはＤＮＡ配列を、「ＥＧＲ調節遺伝子」ということができる。確認または推定されたＥＧＲ調節遺伝子には、形質転換成長因子β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖およびＢ鎖、組織因子、Ｆａｓリガンド、種々のＨｏｘ遺伝子、ストロメライシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−２、ＩＬ２Ｒβ、ＣＤ４４、腫瘍壊死遺伝子α、および黄体形成ホルモンβ（ＬＨβ）が含まれる。これらの遺伝子の上流で見出されたＥＧＲ ＤＮＡ結合部位が同定された（６９およびその参考文献を参照のこと）。ＥＧＲ１によって転写活性化を介在する非標準ＥＧＲ１結合部位は、種々の他の遺伝子（例えば、ＩＬ−２Ｒβ（ＧＣＧＴＡＧＧＡＧＧＣＡ−配列番号１）、ＰＤＧＦ Ａ鎖（ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ−配列番号２）、ラット心臓ミオシン重鎖（ＧＴＧＧＧＧＧＴＧ）、およびｆａｓＬ（ＡＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴ−配列番号３）（およびその参考文献）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＣＣＧＴＧＧＧＴＧ））の調節領域で同定された。ＥＧＲ ＤＮＡ結合部位を含む遺伝子は、推定ＥＧＲ調節遺伝子である。ウィルムス腫瘍抑制遺伝子（ＷＴ１）（染色体位置１１ｐ１３）は、４つの亜鉛フィンガードメインを含む亜鉛フィンガーポリペプチドであり、そのドメインＩＩ−ＩＶはＥＧＲ亜鉛フィンガーに類似する。さらに、ＷＴ１のコンセンサスＤＮＡ標的配列ＧＣＧＴＧＧＧＡＧＴは、コンセンサスＥＧＲ ＤＮＡ結合部位に関連する。
ＥＧＲファミリーメンバーの欠損は、種々の異常で原因となる役割を果たすとされている（３０およびその参考文献）。特に、下垂体ＬＨβを減少させるＥＧＲ１の欠損は、女性不妊に関与する。他の内分泌腺の欠陥は、ＥＧＲ１発現を欠くマウスでも見出される。マウスＥＧＲ２の欠損は、後脳の発達および末梢神経髄鞘形成の重篤な異常を示す。ＥＧＲ２をコードする遺伝子の変異は、末梢神経髄鞘形成の先天性異常患者で見出されている（例えば、シャルコー・マリー・トゥース１型、デジェリン・ソッタス症候群、および先天性髄鞘低形成神経障害）。ＥＧＲ３欠損マウスは、おそらく筋紡錘を欠くという事実の結果として重篤な運動異常を示す。これらのマウスは、感覚性運動失調、側弯、振戦、および下垂症を示す。ＥＧＲ４欠損は、男性不妊および自律性生殖細胞欠陥を引き起こすことを示す。ＥＧＲレベルおよび／または機能活性を調整する化合物は、上記症状および徴候に関連する疾患および症状の治療で有用であり得る。これらの種々の発生局面での役割に加えて、ＥＧＲ転写因子は、シナプス可塑性の根底にある遺伝子の変化に関与すると考えられる。したがって、ＥＧＲレベルおよび／または機能活性を調整する化合物は、学習および／または記憶の改善または学習および／または記憶障害の治療で有用であり得る。
Ｂ．ＥＧＲ調節および相互作用タンパク質
ＥＧＲ１の変異分析により、その欠失によりＥＧＲ１転写活性が増強されるＲ１と呼ばれる阻害ドメインが同定された（図３Ａ）。このドメインは、ＥＧＲ１のアミノ酸２６７から３０６までの範囲として同定された。相同Ｒ１ドメインは、ＥＧＲ２およびＥＧＲ３中に存在する。ベイトとしてＥＧＲ Ｒ１ドメインを使用して行った酵母の２ハイブリッドスクリーニングにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＲ１と相互作用して細胞内でのＥＧＲ１介在性転写を抑制するＮＡＢ１と呼ばれるタンパク質が同定された（６８およびその参考文献）。ＮＡＢ１と有意な相同性を有し、且つＲ１ドメインを介してＥＧＲタンパク質とも相互作用する関連タンパク質ＮＢＡ２がその後発見された。Ｒ１ドメイン中の２９３位の変異（例えば、Ｉ２９３Ａ点変異）により、ＥＧＲ１のＮＡＢタンパク質との相互作用が防止される。Ｒ１ドメインは、ＮＡＢ介在抑制に感受性を示さないタンパク質中のこのドメインの存在により、タンパク質へのＲ１ドメインの挿入によって感受性を示すようにすることができるという点で持ち運び可能である。
ＮＡＢ１の略図を、図４に示す。ＮＡＢ１およびＮＡＢ２は、ＮＡＢ１とＮＡＢ２との間で保存されたＮＣＤ１と呼ばれる領域を介してＲ１ドメインに結合する。ＮＣＤ２と呼ばれるＮＡＢ１およびＮＡＢ２中の第２の保存領域は、ＥＧＲ介在性転写を抑制する（６８）。ＮＡＢタンパク質は、Ｒ１ドメインを欠くＥＧＲ４と相互作用しないようである。ＮＡＢ介在抑制は、ＥＧＲ ＤＮＡ結合部位を含む調節領域（例えば、プロモーター）へのＮＡＢ−ＥＧＲ複合体の補充に関与すると考えられるが、ＮＡＢタンパク質はＥＧＲタンパク質を必要とすることなく一定のプロモーターを抑制することもできる。ＮＡＢタンパク質は、一般に、ＬＨβおよびＦａｓリガンドプロモーターなどの一定のプロモーターでのＥＧＲ介在性転写を抑制する一方で、ＮＡＢタンパク質はむしろＥＧＲ指示転写を刺激する（６９）。多数の合成プロモーターおよび変異プロモーターの分析は、ＥＧＲ ＤＮＡ結合部位の強度（結合親和性）および多様性によりＮＡＢタンパク質が転写コリプレッサー（ＥＧＲ介在性転写の抑制）または転写コアクチベーター（ＥＧＲ介在性転写の増強）として挙動するかどうかが決定されることを示した。したがって、ＥＧＲ結合部位の（結合活性に影響を及ぼす）数および配列の操作により、作動可能に連結された遺伝子のＥＧＲ介在性転写を同時抑制または同時活性化することができる。
Ｃ．統合失調症に対するＥＧＲ３の機能的関連性
いかなる理論に拘束されることも意図するものではないが、本発明者らは、統合失調症の病因に対する潜在的関与と一致するＥＧＲ３の多数の機能的態様を留意する。第１に、ＥＧＲ３発現は、カルシニュリンシグナル伝達によって誘導される（１６）。第２に、ＥＧＲ３発現は、ニューロンの活動（１７）、ＮＭＤＡ受容体活性化（１７）、およびドーパミン作動性伝達（１７）によって誘導される。さらに、ＥＧＲ３発現は、ニューレグリン１／ＥｒｂＢシグナル伝達によって誘導されることが示されている（１８）。カルシニュリンシグナル伝達（１、１９、および継続中の出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ１０／４００，３４８）、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達（２０）、ドーパミン作動性伝達（２１〜２５）、およびニューレグリン１シグナル伝達（２６）の変化は全て統合失調症の病因に関与している。したがって、ＥＧＲ３は、統合失調症の病因に関与すると報告されているいくつかの分子経路と相互作用する。
Ｄ．ＥＧＲ分子およびＥＧＲ相互作用分子
上記説明から証明されるように、ＥＧＲ転写因子は、広範な種々の遺伝子の発現産物を調節し、調節される。いかなる理論に拘束されることも意図するものではないが、ＥＧＲタンパク質が転写因子であるという事実により、その発現レベルおよび／または機能活性の変化（例えば、ＥＧＲファミリーメンバーのコード配列および／または調節配列の変異に起因し得る変化）はＥＧＲ調節遺伝子の発現の変化を反映することが示唆される。このようなＥＧＲ調節遺伝子発現の変化は、ＥＧＲ遺伝子の変異が統合失調症感受性に寄与する手段である可能性が高い。その産物がＥＧＲタンパク質を調節する遺伝子の発現レベルおよび／または機能活性の変化は、ＥＧＲ機能活性を変化させると予想されるので、ＥＧＲ調節遺伝子の発現の変化による統合失調症感受性に寄与する。したがって、その発現産物が直接（例えば、物理的相互作用による）または間接的にＥＧＲ発現を調節する遺伝子およびその発現がＥＧＲによって調節される遺伝子のいずれかの変異はまた、統合失調症感受性に寄与し得る。このような遺伝子およびその発現産物（ＥＧＲ相互作用分子と呼ばれる）も、統合失調症の診断および／または治療の標的である。本明細書中で使用される、句「ＥＧＲ分子」とは、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、またはＥＧＲ４遺伝子によってコードされた分子（ＲＮＡまたはタンパク質）（例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、またはＥＧＲ４タンパク質）をいう。本発明の教示は、ＥＧＲ遺伝子のＤＮＡ結合配列と配列が関連するＤＮＡ結合特異性を有し、それによりＥＧＲ調節遺伝子の調節で役割を果たし得る、ＷＴ１遺伝子によってコードされる分子を含み得ることに留意する。
本明細書中で使用される、句「ＥＧＲ相互作用分子」とは、１つまたは複数のＥＧＲ分子機能活性；ＥＧＲ発現を調節する分子（任意のＥＧＲ分子または他のＥＧＲ相互作用分子の発現の調節が含まれる）；細胞内の位置および／または機能活性；その発現がＥＧＲによって調節されるＲＮＡまたはタンパク質（すなわち、ＥＧＲ調節遺伝子の発現産物）；ＥＧＲ分子および／またはＥＧＲ相互作用分子を修飾および／または翻訳後プロセシングする分子；ならびにＥＧＲ分子の効果を増強または拮抗する分子を変化または調整する（例えば、増強または阻害する）分子（ＲＮＡまたはタンパク質）をいう。ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の「発現の調節」には、転写および／または転写後プロセシング（例えば、スプライシング、ポリアデニル化）および／またはこのような分子をコードする転写物の局在化の調節、このような分子をコードする転写物の翻訳の調節、ならびにこのような分子をコードする転写物の分解もしくは分子自体の分解の調節が含まれ得る。
したがって、用語「ＥＧＲ相互作用分子」には、ＥＧＲ分子と物理的に相互作用する分子が含まれるが、これに限定されないと認識される。本明細書中で使用される、「ＥＧＲ分子」および／または「ＥＧＲ相互作用分子」をコードする一定の遺伝子は、以前にマッピングされたか同定された統合失調症の感受性遺伝子座と一致する。本発明がこのような分子に制限されることを意図しないが、このサブセットには、以下が含まれる：ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、およびＥＧＲ４。これらの分子およびその他を、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、名称（および別名）、および染色体の位置と共に表１に列挙する。今日まで一定のＥＧＲ相互作用分子の染色体位置と一致するかそれに近い統合失調症遺伝子座が存在しないという事実は、単純に、遺伝子研究で統合失調症遺伝子座のサブセットのみしか同定していないという事実を反映し得る。
Figure 2007528707
ＩＩＩ．統合失調症および関連症状の遺伝子分析
統合失調症の原因は未知であるが、有意な遺伝子成分が含まれることが示されている。メンデル型遺伝パターンを示し、且つ１つの遺伝子の変異に起因する嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血などの障害と異なり、統合失調症は多数の異なる遺伝子の変異または変動が異なる程度および異なる組み合せで疾患の発症に寄与し得る多重遺伝子障害であると考えられている。複数の遺伝子の寄与は任意の所与の患者に関与し、これらの遺伝子変異または変化は、個体が統合失調症の病因に寄与し得る辺にまたは変化を有する場合でさえ、患者は臨床的疾患を発症し得ないような種々の浸透度を示すようである。これらの特徴が統合失調症の遺伝的根拠の確実な決定を困難にしている。
多数の遺伝学研究は、おそらく統合失調症発症に寄与する変異または変動を有する一定のゲノムＤＮＡ領域（染色体の位置）に関与していた。（Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ，Ｍ．＆ Ｇｏｇｏｓ，Ｊ．Ａ．（１９９７）Ｎｅｕｒｏｎ １９，９６７−７９；Ｔｈａｋｅｒ，Ｇ．Ｋ．＆ Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｗ．Ｔ．，Ｊｒ．（２００１）Ｎａｔ Ｍｅｄ ７，６６７−７１）。これらの領域は、典型的には、約数キロベース長または数メガベース長であり、これらの領域内のある場所での変異または変化は、このような変異または変化を有する個体が症状を発症する可能性の増加に寄与すると考えられるという事実を反映させるために「感受性遺伝子座」と呼ばれる。したがって、このような領域が単独または組み合わせて少なくとも患者のサブセットで統合失調症に原因として関与する遺伝子を保有する可能性が高い。遺伝学研究には、統合失調症の発生率を一般的な集団と比較する連鎖研究（「統合失調症ファミリー」と呼ばれる集団を研究する）および典型的に統合失調症と診断された関連被験体および非関連被験体を含む集団（例えば、統合失調症のファミリー群）を研究する関連研究が含まれる。関連研究は、コントロール集団および罹患集団における一定のハプロタイプの頻度を比較することができる。あるいは、これらの研究は、一定のハプロタイプの罹患発端者への伝達の不均衡を評価することができる。当該分野で許容されている定義によれば、「ハプロタイプ」とは、１つの染色体上の所与の染色体についての特定の多型性変異型または特定の個体の１つの染色体上に示された多型群についての多型性変異型の組み合わせ（対立遺伝子）であり得る。
連鎖研究および関連研究は、典型的には、遺伝子多型（すなわち、ゲノム中の一定の位置での集団のメンバー間に存在するゲノムＤＮＡ配列間の相違）を使用する（例えば、典型的には、複数の遺伝子が統合失調症などで役割を果たす複雑な形質および疾患についての遺伝学研究のデザインの検討材料の考察については、Ｃａｒｄｏｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｅｌｌ，Ｊ．，（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．９１−９９；Ｋｒｕｇｌｙａｋ，Ｌ．ａｎｄ Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．（１９９５），Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，５６：１２１２−１２２３；Ｊｏｒｄｅ，Ｌ．Ｂ．（２０００），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：１４３５−１４４４；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｒｚｅｗｏｒｓｋｉ，Ｍ．（２００１），Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６９：１−１４および上記論文の参考文献を参照のこと）。例えば、集団は、それぞれ特定の染色体位置で異なるＤＮＡ配列を有する個体の複数の小集団を含み得る。このような多型は、１つのヌクレオチドが異なり得る（本明細書中でＳＮＰと呼ばれる一塩基多型）。（例えば、Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１１：６３７−６４１；Ｗａｌｌ，Ｊ．（２００１），１１：６４７−６５１およびこれらの論文中の参考文献を参照のこと）。ＳＮＰがコード領域内で生じる場合、これらにより、コードされたタンパク質のアミノ酸配列が変化し得るが、頻繁に変化するわけではない。一般に、いかなる理論に拘束されることも意図するものではないが、ＳＮＰは、元はより均一な祖先配列であった変異の結果として生じると考えられる。他の多型には、複数のヌクレオチドの多型、欠失（微小欠失）、挿入、逆位、転座などが含まれる。
一定の多型性変異型が、例えば、コードされたタンパク質を変化させることによって疾患または表現型の変動を担うことができ、異なる対立遺伝子を有する個体間に表現型における公知の検出可能な相違が存在しないという点で多数の多型がサイレントであるようであることが認識される。しかし、多型（サイレントまたはそうでなくともよい）は、変異または変動によって疾患に対する感受性を付与し、そして／または疾患の原因となる遺伝子またはＤＮＡ配列（これらはＤＮＡの近接片内に存在する）と物理的および／または遺伝的に連鎖し得る。遺伝子組換えの非存在下では、このような変異または変動に物理的に連鎖する多型は、一般に、変異または変動と共に遺伝する。
任意の所与の多型と原因となる変異または変動との間の遺伝子組換えの増加により、同時遺伝範囲が減少する。遺伝子座間の遺伝子組換えの可能性は遺伝子座間の距離の増加と共に増加するので（必ずしも直線的様式によらない）、特定の多型および特定の表現型の同時遺伝により、多型が原因となる変異または変動の近位に存在することが示唆される。したがって、多型性変異型（例えば、ＳＮＰ）の同時遺伝研究により、単独または他の変異または変動と組み合わせて疾患を引き起こすか疾患に対する感受性を増加させる変異または変動を保有する可能性が高いゲノム領域が同定される。したがって、多型は、変異または変動が疾患の原因的役割を果たし得る候補遺伝子の遺伝子マッピングおよび同定に有用である。さらに、特定の多型性変異型（対立遺伝子）の検出は、本明細書中に記載の疾患または疾患に対する感受性の診断に有用である。
多数の参考文献および米国公開特許出願２００２０１６５１４４に記載のように、連鎖および関連研究により、多数の統合失調症の感受性遺伝子座が同定された。これらの参考文献は代表的なものに過ぎず、当業者はさらなるこのような遺伝子座を学習するために論文を検索することができる。さらに、遺伝学研究から同定された統合失調症感受性領域付近またはその内部に存在する多数の候補遺伝子が統合失調症の病因で役割を果たすことが示唆されている（例えば、Ｓｔｒａｕｂ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（２００２）７１：３３７−３４８；Ｓｔｅｆａｎｎｓｏｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（２００２）７１：８７７−８９２を参照のこと）。しかし、統合失調症中の任意のこれらの候補遺伝子の関与についての明確な証拠を欠いている。
統合失調症は、類似の表現型の範囲を示す精神疾患および障害群の１つである。多数のこれらの症状および障害は、一般的集団における発生率と比較して統合失調症被験体のファミリーメンバーでその頻度が増加する。これらの要因により、統合失調症の感受性および／または病因に寄与する同一の遺伝子の変異または変動もこれらの症状および障害に対する感受性および／または病因に関与する可能性が高くなる。したがって、本発明の方法および試薬は、これらの関連する症状および障害にも適用することができる。
統合失調症に関連する症状には、統合失調性感情障害、回避性人格障害、双極性障害、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、および強迫性障害（ＯＣＤ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの症状の特徴および診断基準は、ＤＳＭ−ＩＩＩ、ＤＳＭ ＩＩＩ−Ｒ、ＤＳＭ−ＩＶ、またはＤＳＭ ＩＶ−Ｒで定義される。説明の目的のために、「統合失調症および／または関連障害もしくは障害」をいうことよりもむしろ、本発明は、統合失調症自体に関して説明する。しかし、方法（例えば、診断法および治療法）および試薬を、統合失調症自体について記載のこれらの症状および障害に関して類似の様式で使用することもできると理解すべきである。同様に、統合失調症の潜在的予防薬または治療薬と同定された化合物を、これらの関連障害の治療および／または防止で使用することもできる。以下の節は、本発明の種々の態様の説明をさらに提供する。
ＩＶ．統合失調症または統合失調症感受性の診断のための方法および試薬
Ａ．診断法
本発明は、統合失調症または統合失調症感受性の種々の診断方法を提供する。特に、本発明は、（ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、（ｉｉ）サンプル中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型の多型性変異型を検出するか、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法を提供する。「統合失調症に対する感受性」とは、被験体が統合失調症を発症していることを必ずしも意味しないが、むしろ、被験体は、統計的な意味では、集団の平均的なメンバーよりも統合失調症を発症する可能性が高いと理解すべきである。本明細書中で使用される、「統合失調症に対する感受性」とは、被験体が、単独または１つまたは複数の他の遺伝的決定因子（例えば、多型性変異型または対立遺伝子）と組み合わせて一部または全ての被験体における統合失調症の発症リスクの増加に寄与し得る場合に存在し得る。被験体が任意のこのような遺伝的決定因子（例えば、適切な遺伝的背景において統合失調症進行のリスクを増大させる遺伝的決定因子）を有するかどうかの解明は、本明細書中で使用される統合失調症に対する感受性の診断の概念に含まれる。このような決定因子は、例えば、遺伝相談の目的で有用である。したがって、統合失調症感受性に関する診断情報の提供には、遺伝相談で有用な情報の提供が含まれ、このような情報の提供は本発明に含まれる。
サンプル自体は、典型的には、被験体から取り出した細胞（例えば、血球）、組織などからなる。被験体は、成人、児童、胎児、または胚であり得る。本発明の一定の実施形態によれば、サンプルを、胎児もしくは胚または母親のいずれかから（例えば、母体循環系に入る胎児または胚細胞から）出生前に得る。サンプルを、検出工程前にさらに処理することができる。例えば、細胞または組織サンプル中のＤＮＡを、サンプルの他の成分から分離し、増幅することができる。被験体から得た全てのサンプル（任意のさらなる種類の処理に供したサンプルが含まれる）を、被験体から得たと見なす。
一般に、多型が遺伝子中に存在する場合、多型は遺伝子の非コード領域またはコード領域中に存在し得る。コード領域中に存在する場合、多型によりタンパク質が変化し得るが、頻繁ではない。このような変化は、コードされたポリペプチドの機能または活性に影響を与えることができるかできない。多型が遺伝子に連結しているが遺伝子内に存在しない場合、多型が遺伝子に接近して連結していることが好ましい。例えば、多型と遺伝子との間の組換え頻度が、約２０％未満、好ましくは約１０％未満、約５％未満、約１％未満、またはそれ以下であることが好ましい。
本発明の任意の上記方法の一定の好ましい実施形態によれば、遺伝子は、マッピングまたは同定した統合失調症の感受性遺伝子座と一致する。例えば、本発明の種々の実施形態によれば、遺伝子は、それぞれマッピングまたは同定した統合失調症の感受性遺伝子座と一致するＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、またはＥＧＲ４をコードし得る。本発明の方法は、依然としてマッピングまたは同定された統合失調症の感受性遺伝子座と一致する遺伝子も含む。「〜と一致する」とは、遺伝子またはその一部が同定された遺伝子座の位置に含まれることまたはその位置に極めて近接して存在することのいずれかを意味する。一般に、遺伝子感受性遺伝子座の同定研究の精度は、約数十センチモルガンであり得る。本発明の一定の実施形態によれば、「極めて近接した」とは、感受性遺伝子座のいずれかの端から２０センチモルガン以内、好ましくは感受性遺伝子座のいずれかの端から１０センチモルガン以内、さらにより好ましくは感受性遺伝子座のいずれかの端から５センチモルガン以内をいう。一般に、感受性遺伝子座を、これらが及ぶ染色体バンドの位置によって指定され（例えば、８ｐ２１は第８染色体、アームｐ、バンド２１をいい、８ｐ２０−２１は第８染色体、アームｐ、バンド２０−２１を含む）、より高い精度で定義することができる（例えば、８ｐ２１．１）。一般に、用語「〜と一致する」および「極めて近接する」を、当業者の知識に照らして解釈することができる。
神経系（例えば、脳）で発現する遺伝子は、統合失調症の感受性遺伝子として特に魅力的な候補であり得る。このような遺伝子を、統合失調症の病因に関与する脳または細胞型もしくは領域などの脳内の特定の領域もしくは細胞型もしくは領域（例えば、前脳、皮質、海馬など）全体で発現することができる。しかし、脳内で発現することが現在認識されていない遺伝子が重要であると証明されることが可能性がある。例えば、このような遺伝子を、特定の発達段階中、特定の環境条件などで脳細胞の小集団のみで発現することができる。統合失調症の感受性遺伝子を、脳に加えて脳の外側で、または脳の代わりに、または脳内で発現することもできる。
本発明は、さらに、（ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、（ｉｉ）正常な被験体から得たサンプル中で予想されるＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性と比較した、サンプル中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性の変化または変動を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法を提供する。例えば、本発明の種々の実施形態によれば、遺伝子は、表１に列挙した任意の分子をコードすることができる。遺伝子は、ＥＧＲ調節遺伝子であり得る。このような遺伝子には、以下が含まれるが、これらに限定されない：形質転換成長因子β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）Ａ鎖およびＢ鎖、組織因子、Ｆａｓリガンド、Ｈｏｘ遺伝子、ストロメライシン、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−２、ＩＬ２Ｒβ、ＣＤ４４、腫瘍壊死遺伝子α、および黄体形成ホルモンβ（ＬＨβ）。
本発明の任意の診断方法の一定の実施形態によれば、方法を、臨床的に疾患または症状が出現する前に適用する。これは、初期介入で有利であり得る。適切な療法を、疾患の発症前に（例えば、出生前診断の場合、出生前に）感受性を示す被験体（または出生前診断の場合、被験体の母親）に実施することができる。このような統合失調症は発達障害の少なくとも一部であり、このような初期介入は疾患の防止に重要であることが判明し得る。
以下の節は、本発明の方法および試薬の特定の実施形態に関するさらなる詳細を提供する。これらは制限を意図しないと理解すべきである。
Ｂ．多型の同定および検出のための方法および試薬
一般に、本発明の実施で使用される多型を、当該分野で周知の任意の多数の方法を使用して最初に同定することができる。例えば、多数の多型が存在し、例えば、実施例１に記載のように検索することができる公的なデータベースで利用可能である。あるいは、多型を見出すことが望ましい領域中のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの配列決定によって多型を同定することができる。１つのアプローチにしたがって、このような領域を増幅するようにプライマーをデザインし、統合失調症を罹患した被験体由来のＤＮＡを獲得し、増幅する。ＤＮＡを配列決定し、配列（「本配列」と呼ぶ）を、「正常」または「野生型」配列を示すように選択した基準配列と比較する。このような配列は、例えば、実施例１に記載の種々のデータベースで公的に利用可能なヒトドラフトゲノム配列またはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースに寄託された配列であり得る。一般に、配列決定によって配列決定された領域と基準配列との間の相違が明らかとなった場合、多型が同定される。この分析は必ずしも本配列または基準配列が「通常」（最も一般的）または野生型の配列であることを前提としていないことに留意する必要がある。多型がその部位に存在することを決定する特定の部位でヌクレオチド配列の相違が同定されるという事実である。ほとんどの場合（特に、ＳＮＰの場合）、任意の位置に多型性変異型が２つだけ存在する。しかし、ＳＮＰの場合、ＤＮＡ中に４つの天然に存在するヌクレオチドが存在するので、４つまでの変異型が存在し得る。挿入などの他の多型は、４つを超える遺伝子座を有し得る。
一旦多型部位が同定されると、任意の種々の方法を使用して、被験体中の任意の特定の多型性変異型の存在を検出することができる。一般に、被験体は、その部位に基準配列または別の配列のいずれかを有し得る。本明細書中で使用される、句「多型の検出」または「多型性変異型の検出」とは、一般に、２つのまたはそれ以上の多型性変異型のいずれが多型部位に存在するのかの決定をいうにもかかわらず、「多型の検出」とは、多型が集団中に存在することを最初に決定するプロセスをいうこともできる。これらの句に与えるべき意味は、当業者の知識に照らして解釈される状況から明らかである。説明の目的のために、被験体が多型部位で定義された基準配列以外の任意の配列（例えば、ヒトドラフトゲノム中に存在する配列）を有する場合、被験体は多型を示すと言うことができる。一般に、所与の多型のために、任意の個体は、多型部位（各染色体上の部位）で１つまたは２つの可能な変異型のいずれかを示す（しかし、個体が欠失などの１つまたは複数の染色体異常を示す場合、これは真ではないかもしれない）。
被験体中の多型または多型性変異型の検出（遺伝子型同定）を、上記のように多型の存在を最初に確立する様式に類似の配列決定によって行うことができる。しかし、一旦多型の存在が確立されると、種々のより有効な方法を使用することができる。多数のこのような方法は、２つまたはそれ以上の多型性変異型の区別を容易にするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのデザインに基づく。
本明細書中で使用される、「プローブ」または「プライマー」とは、典型的には、塩基特異的様式で相補核酸分子とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドをいう。このようなプローブおよびプライマーには、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載のポリペプチド核酸が含まれる。特に、用語「プライマー」とは、一般に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）などの方法を使用したテンプレート指示ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。典型的には、プローブまたはプライマーは、少なくとも約８個、より頻繁には少なくとも約１０〜１５個、典型的には約２０〜２５、頻繁には約４０、５０、または７５個の核酸分子の連続ヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列領域を含む。本発明の一定の実施形態では、プローブまたはプライマーは、１００またはそれ未満のヌクレオチド、好ましくは６〜５０ヌクレオチド、好ましくは１２〜３０ヌクレオチドを含む。本発明の一定の実施形態では、プローブまたはプライマーは、連続ヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列の相補物と少なくとも７０％同一であり、好ましくは少なくとも８０同一であり、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるか、それより高い同一度を有する。本発明の一定の実施形態では、好ましいプローブまたはプライマーは、標的連続ヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列の相補物と選択的にハイブリッド形成することができる。本発明の一定の実施形態によれば、プローブまたはプライマーは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子の組み込みによる標識をさらに含む。
多型部位への異なるか選択的な結合を示すオリゴヌクレオチドを、当業者は容易にデザインすることができる。例えば、多型部位を含む配列（すなわち、配列内または一方もしくは他方の末端に多型部位を含む配列）に完全に相補的なオリゴヌクレオチドは、一般に、別の多型性変異型を含む核酸と対照的に、この配列を含む核酸に優先的にハイブリッド形成する。
多型および／または多型性変異型を検出するために、多型部位を含むＤＮＡの一部を増幅することが非常に望ましい。このような領域を、その部位に隣接するゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲによって増幅および単離することができる。例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．（Ｅｄｓ．）；ＰＣＲ Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｏ Ｂｅｎｃｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２０００；Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：１７（１９９１）；ＰＣＲ（ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，２０２を参照のこと。使用することができる他の増殖方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）、転写増幅（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９））、自律配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０））、および核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。ＰＣＲ増幅用プライマーの選択のガイダンスは当該分野で周知である。例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｏ Ｂｅｎｃｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，２０００を参照のこと。プライマーデザインのための種々のコンピュータプログラムが利用可能である（例えば、「Ｏｌｉｇｏ」（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢ）、および配列決定プログラムのＧＣＧスーツ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１））。
統合失調症または統合失調症に対する感受性の一定の診断方法によれば、サザン分析、ノーザン分析、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成などのハイブリッド形成法を使用することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｌｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照のこと）。例えば、サンプル（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含むサンプル）を、統合失調症に対して感受性を示すか統合失調症を罹患している疑いのある被験体から得る。次いで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡサンプルを、カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分もしくは非コード部分中の多型性変異型またはＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードするコード部分もしくは非コード部分に連結したゲノム領域中の多型性変異型が存在するかどうかを決定するために試験する。多型性変異型の存在を、核酸プローブ（例えば、ＤＮＡプローブ（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブが含まれる））またはＲＮＡプローブへのゲノムＤＮＡ、ＲＭＡ、またはｃＤＮＡ中の遺伝子のハイブリッド形成によって示すことができる。特定の多型性変異型（例えば、統合失調症に対する感受性を示す多型性変異型）と特異的または優先的にハイブリッド形成するように核酸プローブをデザインすることができる。
統合失調症に対する感受性を診断するために、少なくとも１つの核酸プローブとのサンプルの接触によってハイブリッド形成サンプルを形成する。プローブは、典型的には、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中に多型部位を含むか、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分に連結したゲノム領域中に多型性変異型を含むｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および／またはｃＤＮＡ配列とハイブリッド形成することができる核酸プローブ（例えば、放射性、蛍光、または酵素の標識またはタグであり得る）である。核酸プローブは、例えば、全長核酸分子またはその一部（少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチド長など）であり、ストリンジェントな条件下で適切なｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリッド形成するのに十分である。
核酸プローブを多型性部位を含む領域に特異的にハイブリッド形成するために選択された条件下でハイブリッド形成サンプルを維持する。例えば、上記の高ストリンジェンシー条件下または中程度のストリンジェンシー条件下で特異的ハイブリッド形成を行うことができる。特に好ましい実施形態では、特異的にハイブリッド形成のためのハイブリッド形成条件は高ストリンジェンシーである。一般に、プローブは、ハイブリッド形成する領域と完全に相補的であり得る（すなわち、部位が任意の特定の多型配列を含む場合、多型部位を含む領域位と完全に相補的である）。本方法では、複数の核酸プローブ（例えば、多型部位のみが異なる複数のプローブまたは複数の多型部位で多型性変異型を検出するためにデザインした複数のプローブ）を同時に使用することができる。任意の１つの核酸プローブの特異的ハイブリッド形成は、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型性変異型またはＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分に連結したゲノム領域中の多型性変異型を示すので、統合失調症に対する感受性の診断に用いられる。
ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型の多型性変異型またはＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分に連結したゲノム領域中の多型性変異型を検出するために、類似の核酸プローブを使用してノーザン分析を行うことができる。例えば、上記引用のＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと。
本発明の一定の実施形態によれば、上記ハイブリッド形成法において核酸プローブの代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを使用することができる。ＰＮＡは、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシン窒素に結合した有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）を含むペプチド様無機骨格（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位）を有するＤＮＡ模倣物である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｐ．１（１９９４）を参照のこと）。統合失調症に対する感受性を付与するか統合失調症の存在を示す多型性変異型を含む核酸と特異的にハイブリッド形成するようにＰＮＡプローブをデザインすることができる。
別の方法によれば、多型の別の多型性変異型によって制限部位が作製または排除される場合、制限消化分析を使用して、多型の多型性変異型の存在を検出することができる。ゲノムＤＮＡを含むサンプルを、個体から得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、多型部位を含む領域を増幅し、制限フラグメント長多型分析を行う（上記引用のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）。関連ＤＮＡフラグメントの消化パターンは、多型の特定の多型性変異型の有無を示し、それにより、統合失調症に対する感受性の有無を示す。
配列分析を使用して、特異的多型性変異型を検出することもできる。ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルを、被験体から得た。所望ならば、ＰＣＲまたは他の適切な方法を使用して、多型部位を含む部分を増幅することができる。次いで、任意の標準的方法を使用して配列を確認し、多型性変異型の存在を決定する。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用して、例えば、増幅オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブとのドットブロットハイブリッド形成の使用によって多型性変異型の存在を検出することもできる（例えば、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：１６３−１６６を参照のこと）。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書中で「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」ともいう）は、典型的には、多型（例えば、統合失調症に対する感受性に関連する多型）を含む核酸領域に特異的にハイブリッド形成する約１０〜５０塩基対、好ましくは約１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドである。特定の多型に特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、標準的方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）を使用して調製することができる。
多数の多型性変異型が被験体に存在するかを決定するために、個体からＤＮＡを含むサンプルを得る。ＰＣＲを使用して、多型部位を含む部分を増幅することができる。増幅部分を含むＤＮＡを、標準的方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）を使用してドットブロッティングし、ブロットをオリゴヌクレオチドプローブと接触させることができる。次いで、ＤＮＡへのプローブの特異的ハイブリッド形成の存在を検出する。被験体由来のＤＮＡへの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（統合失調症に対する感受性を示す多型性変異型に特異的）の特異的ハイブリッド形成は、統合失調症に対する感受性を示す。
本発明の別の実施形態によれば、被験体由来の核酸部分に相補的なヌクレオチドプローブのアレイを使用して多型を同定することができる。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には、異なる公知の位置において基質表面に結合する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。「Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）」ともよばれるこれらのオリゴヌクレオチドアレイは、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ ９０／１５０７０および９２／１００９２に記載されている。このようなアレイを、一般に、機械的合成またはフォトリソグラフィ法と固相オリゴヌクレオチド合成法との組み合わせを組み込んだ光合成法を使用して産生することができる。Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１），Ｐｉｒｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９０／１５０７０も参照のこと）、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９２／１００９２、ならびに米国特許第５，４２４，１８号６を参照のこと。機械的合成法を使用したこれらのアレイの合成技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号（その全教示が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
アレイには、典型的には、異なる多型性変異型に特異的にハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。この方法によれば、（典型的には増幅された）目的の核酸（例えば、多型部位を含む核酸）をアレイとハイブリッド形成させてスキャニングする。一般に、標準的方法にしたがって、ハイブリッド形成およびスキャニングを行う。例えば、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９２／１００９２およびＷＯ ９５／１１９９５ならびに米国特許第５，４９４，１８６号を参照のこと。ハイブリッド形成および洗浄後、核酸がハイブリッド形成するアレイ上に任意の位置を決定するためにアレイをスキャンする。スキャンから得られたハイブリッド形成データは、典型的には、アレイ上の位置の関数としての蛍光強度の形態である。
アレイは、複数の検出ブロック（すなわち、特定の多型の検出のためにデザインされた複数のプローブ群）を含み得る。このようなアレイを使用して、複数の異なる多型を分析することができる。ハイブリッド形成時に種々の条件（例えば、特定の多型のために最適化した条件）を使用することができるように、検出ブロックを単一アレイまたは複数の異なるアレイに分類することができる。例えば、Ａ−Ｔが豊富なセグメントに分類される多型と異なるゲノム配列のＧ−Ｃが豊富なストレッチに分類される多型の検出を提供することが望ましい。
多型検出のためのオリゴヌクレオチドアレイ使用のさらなる説明を、例えば、米国特許第５，８５８，６５９号および同第５，８３７，８３２号で見出すことができる。オリゴヌクレオチドアレイに加えて、本発明の一定の実施形態でｃＤＮＡアレイを同様に使用することができる。
他の核酸分析方法を使用して、多型および／または多型性変異型を検出することができる。このような方法には、例えば、直接手動配列決定（Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７；Ｂｅａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，２８８，６４４号）；自動蛍光配列決定；一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；固定化変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．ｅｔ ａｌ（１９８９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２３２−２３６）、移動度シフト分析（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２７６６−２７７０）、制限酵素分析（Ｆｌａｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｃｅｌｌ １５：２５；Ｇｅｅｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５０８１）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７−４４０１）；ＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）；ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔＳタンパク質）の使用；対立遺伝子特異的ＰＣＲが含まれる。
本発明の一定の実施形態では、蛍光偏光テンプレート依存性色素ターミネーター組み込み（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｌａｔｅ− ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：ＦＰ−ＴＤＩ）を使用して、多型の複数の多型性変異型のいずれが被験体に存在するかを決定する。この方法は、蛍光偏光によるテンプレート依存性プライマー伸長および検出に基づく。この方法によれば、多型部位を含む増幅したゲノムＤＮＡを、対立遺伝子特異的色素標識ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸および市販の修飾ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの存在下でオリゴヌクレオチドプライマー（多型部位に隣接したＤＮＡテンプレートとハイブリッド形成する様にデザインされている）とインキュベートする。テンプレート上に存在する対立遺伝子に特異的に色素−ターミネーターによってプライマーを伸長させてフルオロフォアの分子量を約１０倍に増加させる。反応終了時、反応混合物中の２つの色素−ターミネーターの蛍光偏光を、分離または精製することなく直接分析する。この同種ＤＮＡ診断法は、感度および特異性が高く、多数のサンプルの自動化遺伝子型同定に適切である。（Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．９，Ｉｓｓｕｅ ５，４９２−４９８，１９９９）。対立遺伝子特異的プローブまたはプライマーの使用に関することよりもむしろ、この方法は１つのヌクレオチドによるプライマーの伸長によって多型部位で多型性変異型に相補的にヌクレオチドが組み込まれるように多型部位に隣接して終結するプライマーを使用することに留意する必要がある。
リアルタイムピロリン酸ＤＮＡ配列決定は、多型および多型性変異型のさらに別の検出アプローチである（Ａｌｄｅｒｂｏｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｉｓｓｕｅ ８，１２４９−１２５８，２０００）。さらなる方法には、例えば、変性高速液体クロマトグラフィ（ｄＨＰＬＣ）と組み合わせたＰＣＲ増幅が含まれる（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１０，ｐｐ．９９６−１００５，１９９７）。
一般に、ゲノム中に存在する多型部位の両コピーに関して被験体の遺伝子型を決定することが重要である。例えば、完全な遺伝子型を、−／−、−／＋、または＋／＋（マイナスは多型部位での基準配列または野生型配列の存在を示し、プラスは基準配列以外の多型性変異型の存在を示す）と特徴づけることができる。この部位に複数の多型性変異型が存在する場合、これを、どれが被験体中に存在するかの特定によって適切に示すことができる。任意の上記検出手段を使用して、被験体のゲノム中に存在する多型の一方または両方のコピーに関して被験体の遺伝子型を決定することができる。
本発明の一定の実施形態によれば、複数の多型性変異型（例えば、複数の多型部位での多型性変異型）の存在を検出することができる方法を並行して、あるいは実質的に同時に使用することが好ましい。オリゴヌクレオチドアレイは、これを行うための１つの適切な手段を提供する。本発明の一定の実施形態にしたがって、他の方法（反応（例えば、増幅、ハイブリッド形成）を行う方法が含まれる）を個別の容器（例えば、マルチウェルプレートの各ウェル内）で行うか、複数の多型性変異型（例えば、複数の多型部位での多型性変異型）の存在を検出するために他の容器で行うこともできる。
本発明は、コンピュータ読み取り可能媒体に保存された多型性配列のリストを含むデータベースにおいて、前記多型性配列がＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分もしくは非コード部分またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域で生じ、前記リストが統合失調症または統合失調症に対する感受性の遺伝子診断の実施または統合失調症または統合失調症に対する感受性の遺伝子研究の実施で有用であると同定された多型に大部分が、または完全に制限される、データベースを提供する。
Ｃ．プライマー、プローブ、オリゴヌクレオチドアレイ、およびキット
本発明は、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード分または非コード部分中の多型の多型性変異型またはＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード分または非コード部分に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型を検出することができるプローブおよびプライマーを提供する。本発明の一定の実施形態によれば、多型部位での特定の多型性変異型の存在は統合失調症に対する感受性を示すか統合失調症の診断に用いられる。遺伝子には、本明細書中に記載の任意の遺伝子の多型を検出することができるプライマーが含まれるが、これらに限定されない（例えば、表１に列挙した遺伝子およびＥＧＲ分子による調節のための標的である遺伝子）。特に、本発明は、表２、３、４、および５で定義されたＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、またはＥＧＲ４遺伝子中の多型の多型性変異型を検出することができるオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供する。
本発明の一定の実施形態によれば、対立遺伝子特異的プライマーおよび／またはプローブは、検出すべき対立遺伝子と正確に対応することが好ましいが（すなわち、これらは配列が同一であるか、任意の可能な変異型を含む多型部位を含むＤＮＡ部分と完全に相補的である）、例えば、３’末端の約６〜８ヌクレオチドが検出すべき対立遺伝子に対応し（すなわち、配列が同一であるか完全に相補的である）、プライマーまたはプローブの性質に有意に影響を与えることなく１０個までの残りのヌクレオチド（８、６、４、２、または１個など）を変化させることができるその誘導体も提供される。
本発明は、さらに、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型部位に隣接して終結するか、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分に連結するゲノム領域中の多型部位に隣接して終結するオリゴヌクレオチドプライマー組を提供する。このようなプライマーは、例えば、上記の蛍光偏光テンプレート依存性色素ターミネーターの組み込みで有用である。特に、本発明は、それぞれ表２、３、４、および５で定義されたＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、またはＥＧＲ４をコードする遺伝子中の多型部位に直接隣接して終結するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
本発明は、３’側上の多型部位に直接隣接したヌクレオチド位置で終結し、且つこの部位から５’方向に少なくとも８ヌクレオチド且つ１００ヌクレオチド未満伸長する各多型のためのプライマーを提供する。上記には両ＤＮＡ鎖を示す配列を有するプライマーの２つのクラスが含まれることに留意する。本発明の一定の実施形態によれば、プライマーは、５’方向に少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチド伸長している。本発明の一定の実施形態によれば、プライマーは、５’方向に８０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、または３０未満のヌクレオチドが伸長している。本発明は、さらに、多型部位に存在する多型の多型性変異型が統合失調症に対する感受性を付与するか統合失調症の存在を示す、カルシニュリンサブユニットもしくはカルシニュリン相互作用分子をコードする遺伝子中の任意の多型部位またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型部位について同様に終結および伸長するプライマーを提供する。
一般に、任意の従来の合成方法を使用して、プライマーおよびプローブを作製することができる。このような方法の例を、標準的なテキスト（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ；Ｖｏｌｕｍｅ ２０；Ｅｄ．Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌ，Ｈｕｍａｎａ ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３）で見出すことができる。本発明の一定の実施形態によれば、検出を容易にするためにプライマーおよび／またはプローブを標識する。
本発明のプライマーおよびプローブを、組（例えば、多型性変異型が特定の多型部位に存在し得る一部または全ての可能な多型性変異型間に存在することを決定することができる組）で好都合に提供することができる。組には、対立遺伝子特異的プライマーもしくはプローブおよび／または多型部位に直接隣接して終結するプライマーが含まれ得る。複数の多型部位で多型性変異型を検出することができる複数のプライマーおよび／またはプローブ組を提供することができる。
任意の種々の他の成分（本発明の方法で使用するための適切な包装および使用説明書、適切な緩衝液、ヌクレオチド、および／または熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、他の酵素、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールプライマーおよび／またはプローブなどが含まれるが、これらに限定されない）をさらに含むことができる、プライマーまたはプローブを診断および／または研究目的のキットの形態で提供することができる。
本発明は、さらに、１つまたは複数の上記の本発明のプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを提供する。特に、本発明は、表２、３、４、および５に列挙した任意の多型の多型性変異型を検出することができるオリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを提供する。このようなアレイを、診断および／または研究目的のキットの形態で提供することができる。キットは、オリゴヌクレオチドアレイのハイブリッド形成およびプロセシングに特異的なさらなる成分に加えて、上記の任意の成分を含み得る。アレイのスキャニングによって得られたデータの分析のための適切なソフトウェア（すなわち、コンピュータ読み取り可能媒体に保存されたコンピュータ読み取り可能命令）を本発明によって提供することができる。このようなソフトウェアは、例えば、サンプルの遺伝子型の徴候を有するユーザーを提供し、そして／または被験体の統合失調症に対する感受性の程度を評価するか、被験体が統合失調症を罹患する可能性を評価することができる。
本発明の一定の実施形態によれば、ＦＤＡ承認の診断キットに必要な良好な製造手段に従ってキットを製造する。
Ｄ．ｍＲＮＡの変化の検出
本発明の一定の実施形態によれば、被験体が統合失調症に感受性を示すかこれに罹患しているかどうかを決定するために、ｍＲＮＡ発現の変化または変動を検出する。被験体から得たサンプル中のカルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子をコードするｍＲＮＡの発現レベル（すなわち、存在）、発現パターン（例えば、細胞内局在化、細胞型特異性が含まれる一過性または空間的発現パターン）などを決定し、正常な被験体から得たサンプルで予想される発現レベルまたは発現パターンと比較する。ｍＲＮＡサイズ、プロセシング（例えば、スプライシング変異型、ポリアデニル化などの存在）も比較することができる。本発明の一定の実施形態によれば、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子は、統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされるものである。
一般に、当該分野で公知の任意の多数の適切な方法（ノーザンブロッティング、ｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドアレイハイブリッド形成、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成、ＲＮアーゼ保護、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ）などが含まれるが、これらに限定されない）を使用して、このような検出および／または比較を行うことができる。過去のデータ（例えば、正常の集団における公知の発現レベル、パターン、またはサイズ）を、コントロールサンプルに対する検出法の実施よりもむしろ比較の目的で使用することができる。
本発明は、上記分析の実施に有用なｃＤＮＡプローブおよびＰＣＲプライマー（例えば、１つまたは複数の多型性変異型と特異的にハイブリッド形成するｃＤＮＡプローブおよびＰＣＲプライマー）を提供する。このようなプローブおよびプライマーは多型部位を含むことができ、その任意の可能な変異型中に多型部位を含む領域と配列が完全に相補的であるか同一であり得る。本発明の一定の実施形態によれば、プローブおよび／またはプライマーはエクソン特異的である（例えば、特定のエクソンを含むか欠く変異型と選択的または特異的にハイブリッド形成する）。上記などの他の成分に加えて、例えば、上記のｃＤＮＡプローブおよび／またはプライマーを含む診断および／または研究目的のキットも本発明で提供する。
Ｅ．タンパク質の変化の検出
本発明の一定の実施形態によれば、被験体が統合失調症に対して感受性を示すかこれに罹患しているかどうかを決定するために、タンパク質の発現および／または活性の変化または変動を検出する。被験体から得たサンプル中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現レベル（すなわち、存在）、発現パターン（例えば、細胞内局在化、細胞型特異性が含まれる一過性または空間的発現パターン）、サイズ、他の細胞構成要素との会合（例えば、ＤＮＡとの複合）などを決定し、正常な被験体から得たサンプル中で予想される発現レベルまたは発現パターンと比較する。本発明の一定の実施形態によれば、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子は、統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされるものである。
一般に、当該分野で公知の任意の多数の適切な方法（免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ、タンパク質チップ（例えば、抗体と関連タンパク質との比較）などが含まれるが、これらに限定されない）を使用して、このような検出および／または比較を行うことができる。過去のデータ（例えば、正常の集団における公知の発現レベル、活性、発現パターン、またはサイズ）を、比較の目的で使用することができる。
本発明は、サブユニットまたは分子が統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされる、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子に特異的に結合することができる抗体を提供する。特に、本発明は、被験体中の変異の存在が統合失調症に対する感受性またはその存在を示す、このようなＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の変異型に特異的に結合することができる抗体を提供する。このような抗体は、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子と多型性変異型によってコードされる部位で異なる変異型とを区別することができる。
一般的に適用可能な抗体の産生方法は、当該分野で周知であり、上記参考文献に広範に記載されている（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。全長ポリペプチド、部分的ポリペプチド、融合タンパク質、またはペプチド（免疫原性を増強するための別の部分と抱合することができる）のいずれかでの動物（またはヒト）の免疫化によって抗体を作製することができることに留意する。抗体の特異性は、動物を免疫化するために使用した特定の調製物および抗体がポリクローナルまたはモノクローナルのいずれであるかに依存して変化する。例えば、ペプチドを使用する場合、得られた抗体は、そのペプチドによって提示された抗原決定基のみと結合する。ポリペプチドの特定の領域（例えば、細胞外ドメイン）に特異的に結合する抗体を構築部および／または選択することが望ましい。この領域に対応するペプチドまたはポリペプチドフラグメントでの動物の免疫化によってこのような特異性を達成することができる。あるいは、所望の領域に特異的に結合する抗体を同定するためにモノクローナル抗体のパネルをスクリーニングすることができる。上記のように、本発明の一定の実施形態によれば、抗体は、多型部位によってコードされる領域を含む抗原決定基に特異的に結合する。本発明の一定の実施形態によれば、このような抗体は、１つのアミノ酸が異なる分子を区別することができる。本明細書中に記載の任意の抗体を標識することができる。
本発明は、パネル（例えば、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の複数の変異型に特異的に結合することができる抗体のパネルまたは複数のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の複数の変異型に特異的に結合することができる抗体のパネル）中の上記抗体を提供する。抗体を、上記のさらなる成分（酵素反応用基質が含まれる）を含むキットとして提供することができる。抗体を、研究、診断、および／または治療目的で使用することができる。
一般に、好ましい抗体は、高親和性（例えば、その標的に対して２００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＫｄ）を有する。本発明の一定の実施形態によれば、好ましい抗体は、正常な組織（例えば、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、甲状腺、膀胱、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚などの鍵となる重要な組織）とは有意な反応性を示さない。心臓、腎臓、中枢神経系および末梢神経系組織ならびに肝臓に対する反応性が低い抗体が特に好ましい。組織との反応性の文脈では、本明細書中で使用される、用語「有意な反応性」とは、免疫組織化学に適切な条件下で目的の組織に適用した場合に汚染を誘発しないか無視できるほどの汚染（例えば、ほんの僅かな正の細胞がほとんど負の細胞の領域で散乱している）を誘発する抗体または抗体フラグメントをいう。
本発明の一定の実施形態によれば、被験体から得たサンプル中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の機能活性を検出および／または測定し、正常な被験体から得たサンプルで予想されるＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性と比較する。本発明の一定の実施形態によれば、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子は、統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされるものである。機能活性の検出および／または測定で使用すべき特定のアッセイはアッセイされる特定の分子に依存することが認識される。例えば、分子がキナーゼまたはホスファターゼである場合、適切なアッセイは、キナーゼまたはホスファターゼの基質を使用したキナーゼまたはホスファターゼアッセイである。ＥＧＲ分子などの転写因子の場合、活性は、適切なレポーター構築物を使用して測定することができる転写を活性化または抑制する能力であり得る。活性は、別の分子に結合し、そして／または他の分子の活性などを阻害する能力であり得る。例えば、ＮＡＢ１およびＮＡＢ２は、ＥＧＲ分子が相互作用する標的ＤＮＡ結合部位に依存して、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、およびＥＧＲ３に結合し、転写コリプレッサーまたはコアクチベーターとして機能することが公知である。このような場合、活性は、ＥＧＲ分子へのＮＡＢ１またはＮＡＢ２の結合および／または適切なＤＮＡ結合部位を含むレポーターの転写を活性化または阻害するＥＧＲ分子の能力であり得る。転写因子のＤＮＡに結合する能力（例えば、ＤＮＡ標的配列に特異的に結合する能力）またはＤＮＡもしくは任意の特定の標的配列に対する転写因子の結合親和性を増加または減少させる第２の分子の能力を、当該分野で周知の方法（例えば、核フットプリンティング、ゲルシフトアッセイなど）によって測定することもできる。
Ｖ．統合失調症または統合失調症感受性の治療で有用な化合物のスクリーニングのための方法および試薬
本発明は、統合失調症または統合失調症感受性の治療で有用な化合物のスクリーニングするために使用することができる多数の方法および試薬を提供する。これらの方法にしたがって同定された任意の本発明の試薬、方法、および化合物は、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療に関する使用に制限されないが、種々の他の目的のために使用することができることを留意する。下記スクリーニングを便宜上および容易な理解のみのためにカテゴリーに分類し、この分類は化合物の適用を制限してその作用機構を制限することを決して意図しないことも留意する。
Ａ．ＥＧＲを調整する（増強または減少させる）化合物のスクリーニング
１．転写アッセイ
本発明の１つの方法によれば、ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションなどを使用して、ＥＧＲ分子および任意選択的にＮＡＢ分子などの１つまたは複数のＥＧＲ相互作用分子を発現し、ＥＧＲ機能に適切な宿主である細胞（例えば、細胞株）にＥＧＲレポーター構築物（例えば、１つまたは複数のＥＧＲ ＤＮＡ結合部位を含むＥＧＲ反応性調節エレメントに作動可能に連結された検出可能なマーカーをコードする核酸を含む構築物）を移入する。特定の細胞型で活性なプロモーターに作動可能に連結された分子のコード配列を含む適切な発現構築物のトランスフェクションによって、ＥＧＲ分子およびＥＧＲ相互作用分子の発現を達成することができる。細胞へのＥＧＲ分子およびＥＧＲ相互作用分子の他の移入方法（例えば、微量注入）も使用することができる。あるいは、１つまたは複数のＥＧＲ分子および／またはＮＡＢ分子を発現する細胞株を宿主として使用することができ、内因的に発現しない任意の所望の成分を提供することができる（例えば、ＤＮＡトランスフェクションによる）。一般に、多数の市販の細胞株（例えば、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞）は、適切な宿主である。本発明の一定の実施形態によれば、治療効果が所望される特徴と類似の特徴を示す細胞株（例えば、神経細胞株またはグリア細胞株）を使用することができる。
本発明の一定の実施形態によれば、ＮＡＢ１またはＮＡＢ２を天然に発現する細胞の使用を回避することが好ましい。本発明の一定の実施形態では、望ましくない分子の発現を、ＲＮＡｉ（例えば、細胞への分子をターゲティングするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの移入）によって減少または排除する。例えば、特定のＥＧＲ分子のアクチベーターまたはインヒビターを検出するためのスクリーニングでは、他のＥＧＲ分子の発現を最小にすることが望ましい。このような目的のために、スクリーニングでアクチベーターまたはインヒビターを模索するＥＧＲ分子をコードするｍＲＮＡに対する有意な相同性を欠くＲＮＡｉによってそのレベルが減少されるべきｍＲＮＡの標的領域を選択することが望ましい。ＥＧＲ分子とＮＡＢ１またはＮＡＢ２などの特異的ＥＧＲ結合分子との間の結合を増強または破壊する分子を同定するためのスクリーニングでは、他のＥＧＲ結合分子の発現を最小にすることが望ましい。
ＥＧＲ応答性調節エレメントは、１つまたは複数のＥＧＲコンセンサスＤＮＡ結合部位もしくは任意の他のＥＧＲ ＤＮＡ結合部位（天然に存在するＥＧＲ ＤＮＡ結合部位または天然に見出されないという意味での人工物のいずれかと同一）またはその組み合わせを含み得る。ＥＧＲ ＤＮＡ結合部位の配列および数の適切な選択により、ＮＡＢタンパク質がレポーター遺伝子の転写を抑制または活性化するかどうかを決定することが可能であり、これは本発明の一定のスクリーニングの実施で有用である。例えば、ＮＡＢタンパク質の存在が転写を活性化する系が望ましい場合、ＴＧＦ−β遺伝子調節領域中の調節エレメントに類似する調節エレメントを使用することができる。ＮＡＢタンパク質の存在がＥＧＲ介在性転写を抑制する系が望ましい場合、ＬＨβ遺伝子調節領域中の調節エレメントに類似の調節エレメントを使用することができる。転写を活性化するＥＧＲの能力および／またはＥＧＲ介在性転写を抑制または活性化するＮＡＢ分子の能力を容易に決定することができる。一般に、検出可能なマーカーをコードする広範な種々のレポーター遺伝子を使用することができる。適切なマーカーには、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺによってコードされる）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および多数のその変異型、ルシフェラーゼなどが含まれる。多数のＥＧＲレポーター構築物が当該分野で公知である（例えば、６８〜７０およびその参考文献を参照のこと）。その発現を容易に定量可能なマーカーを使用することが望ましい。
すべての所望の成分（ＥＧＲ分子、ＥＧＲレポーター、および任意選択的にＥＧＲ相互作用分子）を発現する細胞を、レポーター構築物（例えば、ＥＧＲ標的ＤＮＡ配列に作動可能に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーターの場合、ルシフェラーゼ）の活性の評価によって測定することができるＥＧＲ転写活性を刺激するための神経成長因子（ＮＧＦ）などの成長因子で処理することができる。化合物（例えば、組み合わせライブラリー、天然産物集団のメンバーなど）の有無におけるレポーター活性の比較を使用して、ＥＧＲ介在性転写が変化した（例えば、増加または減少した）化合物を同定する。そのうちで、これらの化合物は、直接（例えば、ＥＧＲ分子への直接結合による）または多の相互作用を介して（例えば、ＮＡＢ分子またはＥＧＲ標的ＤＮＡ配列への結合による）ＥＧＲ活性を増減させる化合物である。ＥＧＲ特異性を確認するために、効果を減少させるはずである１つまたは複数のＥＧＲ分子の非存在下または効果を増強させるはずである増加したレベルのＥＧＲ分子を使用して、同一のアッセイを行うことができる。これは、アッセイ時のＲＮＡｉによって特定のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子を欠損する細胞株または１つまたは複数のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を減少させる細胞株を使用することができる。
したがって、本発明は、（ｉ）ＥＧＲ分子およびＥＧＲレポーターを含む生物学的な系を提供する工程と、（ｉｉ）前記生物学的な系を化合物と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記化合物の存在下での前記レポーターの転写応答を前記化合物の非存在下での応答または予想される応答と比較する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための候補化合物の同定方法を提供する。化合物の存在下での転写応答が化合物の非存在下で生じるか生じると予想される転写応答が異なる（例えば、より多いまたはより少ない）場合、化合物を統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のためのＥＧＲ活性のモジュレーターおよび候補化合物と同定する。「生物学的な系」とは、生体分子（例えば、核酸、ポリペプチド、ポリサッカリド、脂質など）が存在する任意の容器、ウェル、またはコンテナ（細胞または細胞集団、組織、生物など）を意味する。典型的には、生物学的な系は、細胞または細胞集団であるが、精製または組換えタンパク質を使用して容器中で方法を行うこともできる。一般に、このようなアッセイは、任意の多数の異なる機構によってＥＧＲ発現または機能活性に影響を与える化合物を同定することができる。例えば、このような化合物は、（ｉ）ＥＧＲ ＤＮＡ結合部位へのＥＧＲ分子の結合を妨害し（例えば、それ自体による部位への結合またはＥＧＲ分子への結合のいずれかによる）、（ｉｉ）ＥＧＲ分子とＥＧＲ相互作用分子との間の結合を破壊または増強し、（ｉｉｉ）結合以外の機構によってＥＧＲ機能を調節するＥＧＲ相互作用分子を活性かまたは阻害する（例えば、リン酸化／脱リン酸化、局在化への影響、細胞外シグナルの伝達などによる）ことができる。
ＥＧＲ分子とＥＧＲ相互作用分子との間の結合の妨害または増強によってＥＧＲ分子を阻害または活性化する化合物をスクリーニングするために、ＮＡＢ１またはＮＡＢ２などのＥＧＲ相互作用タンパク質のトランスフェクションまたは付加と組み合わせてアッセイを使用することができる。このような化合物は、例えば、Ｒ１ドメインと結合することができ、それによりＮＡＢタンパク質の結合を防止することができる。上記のように、レポーター中に存在する特定のＤＮＡ標的配列に依存して、ＮＡＢ１またはＮＡＢ２などのＥＧＲ相互作用分子は、相互作用するＥＧＲ分子の転写活性を抑制（大半の場合）または活性化（一定の場合）することが予想される。特に、ＥＧＲレポーターが、ＮＡＢタンパク質がリプレッサーとして作用するＥＧＲ応答性調節エレメントを含む場合、ＮＡＢタンパク質およびＥＧＲタンパク質の結合を破壊する分子はレポーター活性を増加させ、ＮＡＢタンパク質およびＥＧＲタンパク質の結合を増強する分子はレポーター活性を減少させる。逆に、ＥＧＲレポーターが、ＮＡＢタンパク質がアクチベーターとして作用するＥＧＲ応答性調節エレメントを含む場合、ＮＡＢタンパク質およびＥＧＲタンパク質の結合を破壊する分子はレポーター活性を減少させ、ＮＡＢタンパク質およびＥＧＲタンパク質の結合を増強する分子はレポーター活性を増加させる。したがって、スクリーニングは、阻害化合物および活性化化合物の両方を同定することができる。任意の上記スクリーニングでは、相互作用分子をコードする遺伝子のトランスフェクションの非存在下でのアッセイの繰り返しまたは相互作用分子の発現を阻害するためのＲＮＡｉの使用によって、特異性を決定することができる。次いで、統合失調症の動物モデルにおいて同定された化合物を試験することができる（以下の実施例５のＥ節）。
本発明の一定の実施形態では、ＥＧＲ分子、ＥＧＲ相互作用分子、および／または他の細胞分子を使用するスクリーニング法は、このような分子の多型性変異型（例えば、統合失調症または統合失調症感受性に関連する変異型）を使用することができる。天然に存在するその異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）と同一の分子を使用してＥＧＲ分子、ＥＧＲ相互作用分子などを使用する本明細書中に記載のスクリーニング法を行う必要はないことにも留意する。代わりに、分子は、その天然に存在する対応物と比較して１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を置換、欠失、および／または付加することができる。本発明の一定の実施形態では、ＥＧＲ分子のアミノ酸置換または欠失により、ＮＡＢタンパク質との分子の相互作用が減少または消失され、このような分子を使用する。本発明の一定の実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である（すなわち、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換する）。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは公知である。例えば、このようなファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。本発明の一定の実施形態では、天然に存在する異形と同一ではないが実質的に同一である（例えば、少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である）分子を使用する。例えば、分子は、天然に存在する分子と比較して、１個から１０個との間のヌクレオチドまたはアミノ酸が置換、付加、または欠失して変化し得る。
２．ＥＧＲタンパク質およびＥＧＲ結合タンパク質を遮断する分子のさらなるスクリーニング
標準的な酵母２および／または３ハイブリッドアッセイを使用して、ＥＧＲタンパク質（例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、またはＥＧＲ３）へのＮＡＢ１またはＮＡＢ２などのＥＧＲ結合タンパク質の結合を遮断するか、Ｒ１ドメインなどのＥＧＲ１、ＥＧＲ２、またはＥＧＲ３のフラグメントへのＮＡＢ１またはＮＡＢ２などのＥＧＲ結合タンパク質の結合を遮断する分子をスクリーニングすることができる。ファージディスプレイを使用して、ＥＧＲ分子、ＥＧＲ相互作用分子、またはＲ１、ＮＣＤ１、もしくはＮＣＤ２ドメインなどのそのフラグメントに結合するペプチドを選択することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを使用して、ＥＧＲ分子もしくはその一部またはＥＧＲ相互作用分子もしくはその一部に特異的に結合する化合物（例えば、小分子）を同定することもできる。分子またはその一部を、組換えＤＮＡ技術を使用して発現するか、化学合成するか、細胞から精製することができる。本発明の一定の実施形態によれば、組換え蛍光タグ化ＥＧＲおよびＮＡＢタンパク質を使用した生体発光共鳴エネルギー移動スクリーニング（Ｂｏｕｔｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ （２００２） ２３（８） ： ３５１−４）を使用する。
例えば、標識化合物を使用した直接ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを使用して、ＥＧＲ分子のＥＧＲ結合タンパク質との結合を破壊する能力と無関係にＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子に結合する化合物を同定することもできる。化合物を、阻害性または活性化タンパク質へのＥＧＲ分子の結合を阻害または増強する能力についてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。例えば、阻害性または活性化タンパク質へのＥＧＲ分子の結合を阻害する候補化合物の能力を、１つまたは複数のこれらの成分を発現する細胞由来の精製（例えば、組換え）タンパク質および／または抽出物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。候補化合物の非存在下または存在下で成分を混合することができ、ＥＧＲ分子を含む複合体を単離し、これらが阻害性または活性化タンパク質を含むかどうかを決定するアッセイを行うことができる。適切な単離および検出方法（例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）を使用することができる。阻害性または活性化タンパク質へのＥＧＲ分子の結合を阻害する候補化合物の能力を、インタクトな細胞で、例えば、免疫共沈降を使用して同様にアッセイすることができる。細胞は、天然に成分を発現することができるか、そうなるように操作することができる。次いで、同定された化合物を上記などの細胞ベースのアッセイで試験し、そして／または統合失調症の動物モデルに投与することができる（実施例５を参照のこと）。
組換えタンパク質を使用した任意の方法は、タグ（例えば、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡエピトープタグなど）を含むタンパク質を使用することが望ましい。適切な発現ベクターの構築および細胞へのその移入を、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載の標準的な方法を使用して行うことができる。容易に検出可能なマーカー（例えば、ＧＦＰなどの蛍光または発光マーカー）を含むようにＥＧＲタンパク質または１つまたは複数のＥＧＲ相互作用分子を操作することが望ましい。このような容易に検出可能なタンパク質は、タンパク質の細胞内局在化および／またはＤＮＡへのその結合などに対する化合物の効果の研究に有用であり得る。上記の任意の種々の化合物の同定法およびスクリーニング法を高速処理形式で使用することができるか、高速処理スクリーニングのために容易に修飾することができる。
Ｂ．分子薬物デザイン
本発明は、例えば、ＥＧＲ分子またはＮＡＢ１またはＮＡＢ２などのＥＧＲ相互作用分子の三次元構造（結晶構造、ＮＭＲ溶液構造など）を使用した統合失調症または統合失調症感受性の治療のための候補化合物の同定のための分子モデリングに基づいた合理的薬物デザインを提供する。このような方法は、例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、またはＥＧＲ３などのＥＧＲ分子とＮＡＢ１またはＮＡＢ２との間の結合を妨害することができる化合物の同定で特に有用であり得る。
構造情報を使用して、スクリーニングのための適切な化合物ライブラリーの選択を誘導することもできる。したがって、本発明は、（ｉ）ＥＧＲ分子またはＥＧＲ分子を含む複合体の分子構造を提供する工程と、（ｉｉ）ＥＧＲ分子に結合するかＥＧＲ分子のＥＧＲ相互作用分子への結合を防止すると予想される構造を同定する工程と、（ｉｉｉ）統合失調症または統合失調症感受性の治療のための候補化合物などの構造を有する化合物を選択する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の治療のための候補化合物の同定方法を提供する。次いで、同定された化合物を、統合失調症の動物モデルに投与することができる（実施例５を参照のこと）。
Ｃ．さらなるＥＧＲ相互作用分子のスクリーニング
いかなる理論に拘束されることも意図するものではないが、統合失調症感受性に関連するゲノム領域中に４つのＥＧＲ遺伝子が存在するという本発明者らの発見により（実施例１を参照のこと）、ＥＧＲ調節遺伝子の潜在的標的遺伝子を含むＥＧＲ分子およびＥＧＲ相互作用分子は統合失調症の病因に関与し得ることが示唆される。したがって、ＥＧＲ相互作用分子およびＥＧＲ調節遺伝子は、診断薬および／または治療薬の開発のための魅力的な分子標的である。ＥＧＲ分子およびＥＧＲ調節遺伝子産物と相互作用する化合物は、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための魅力的な候補化合物である。さらなるＥＧＲ相互作用タンパク質を、ベイトとしてＥＧＲ分子またはその一部を使用した標準的な２つまたは３つのハイブリッド法（例えば、酵母または哺乳動物細胞などにおける）を使用して同定することができる。さらに、ＥＧＲ相互作用タンパク質を、標準的な生化学手段（例えば、細胞抽出物を全長ＥＧＲタンパク質またはその一部のいずれかを使用したＥＧＲ親和性カラムクロマトグラフィに供する）によって同定することができる。
種々のアプローチを使用して、さらなるＥＧＲ調節遺伝子を同定することができる。ヒトゲノムドラフト配列を、ＥＧＲタンパク質によって調節されることが公知の遺伝子中で見出されるＥＧＲコンセンサスＤＮＡ結合配列またはＥＧＲ結合配列と同一または類似のＤＮＡ配列について検索することができる。あるいは、組換え発現ＥＧＲ分子に結合するＤＮＡのフラグメントを単離することができる。レポーターアッセイを使用して、候補ＥＧＲ応答エレメント由来の転写を活性化または抑制するＥＧＲタンパク質の能力を分析することができる。ゲルシフトアッセイ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイ、および当該分野で公知の他の方法を使用して、特定の調節領域ＥＧＲ分子によって結合することを確認し、そして／または結合部位をマッピングすることができる。その調節領域が１つまたは複数のＥＧＲ ＤＮＡ結合部位を含む遺伝子は、候補ＥＧＲ調節遺伝子である。
別のアプローチは、ディファレンシャルスクリーニングを行うことである。例えば、成長因子またはＥＧＲを活性化する他の分子に曝露した細胞から単離したｍＲＮＡを、曝露していない細胞から単離したｍＲＮＡと比較することができる。ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して、比較を好都合に行うことができる。他のスクリーニング形態（例えば、減法的（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリッド形成）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）も使用することができる（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９９５） ．Ｓｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４８４− ４８７）。ＥＧＲ活性が刺激される条件下でそのｍＲＮＡ発現が変化する（上方制御または下方制御される）遺伝子は、候補ＥＧＲ調節遺伝子である。遺伝子が上方制御されるか下方制御されるかは、一般に、特異的ＥＧＲ結合部位および／または系中のＮＡＢタンパク質などのＥＧＲ結合分子の存在に依存する。発現の相違を確認するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。
ＲＮＡｉを使用して、ＥＧＲ分子またはＮＡＢタンパク質などのＥＧＲ相互作用分子の発現を阻害することができる。ＥＧＲ分子が阻害された細胞から単離したｍＲＮＡを、ＥＧＲ分子が阻害されていない細胞から単離したｍＲＮＡと比較することができる。また、ｃＤＮＡマイクロアレイまたは多の方法を使用して、比較を行うことができる。ＥＧＲ活性が阻害される条件下でそのｍＲＮＡ発現が変化する（上方制御または下方制御される）遺伝子は、候補ＥＧＲ調節遺伝子である。候補遺伝子数を減少させるために、ＥＧＲコンセンサスまたは非コンセンサス結合部位のこのような遺伝子の上流領域の検索を行うことができる。レポーターアッセイおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを使用して、実際のＥＧＲ調節遺伝子として候補遺伝子の同一性を確認することができる。したがって、本発明は、さらなるＥＧＲ調節遺伝子の多数の同定方法を提供する。
ＥＧＲ調節遺伝子または任意の型のＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子として同定されたこのような遺伝子の位置を、以前に同定された統合失調症遺伝子座と一致するかどうかを決定するための本発明に記載の方法にしたがって試験することができ、そして／または統合失調症感受性と関連するかどうかを決定するために遺伝子連鎖研究を行うことができる。このような一致および／または遺伝子連鎖が見出された場合、遺伝子は、本明細書中に記載の方法よる統合失調症の診断および／または治療の候補である。本明細書中に記載の方法（例えば、データベースの検索、配列決定など）を使用して、遺伝子中の多型を同定することができる。したがって、本発明は、（ａ）ＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子を同定する工程と、（ｂ）前記遺伝子の位置が公知の統合失調症の感受性遺伝子座と一致するかどうかを決定するか、遺伝子中の多型が統合失調症または統合失調症感受性に関連するかどうかを決定するために遺伝学研究（例えば、連鎖研究）を行う工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断および／または治療のための標的の同定方法を提供する。この遺伝子は、ＥＧＲ調節遺伝子またはＥＧＲタンパク質に結合してＥＧＲ活性または発現などを調節する分子をコードする遺伝子であり得る。脳内で発現する分子（その発現が脳に制限されるか、脳内で支配的に生じる分子が含まれるが、これに限定されない）が好ましい。
Ｄ．スクリーニング用化合物
上記の任意の化合物同定法（または他の方法）での使用に適切な化合物には、小分子、天然産物、ペプチド、核酸などが含まれる。化合物の供給源には、天然産物の抽出物、合成化合物の回収物、およびコンビナトリアルケミストリーによって生成された化合物ライブラリーが含まれる。化合物ライブラリーは、当該分野で周知である。１つの代表例は、ＣｈｅａｎＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，１６９８１ Ｖｉａ Ｔａｚｏｎ，Ｓｕｉｔｅ Ｇ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２７から市販されているＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）として公知である。ＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）は、１０，０００と５０，０００との間の薬物様手動合成小分子を含む。最大数の化合物を有する最大薬理作用団種を対象とする「普遍的」ライブラリーを形成するために化合物を予め選択し、このライブラリーは高速処理またはより低速のスクリーニングのいずれかに適切である。さらなるライブラリーの説明については、例えば、Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｖｅｒ Ｔｗｏ Ｍｉｌｌｉｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｂｏｔｈ Ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙｓ”，Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１２０，８５６５−８５６６，１９９８； Ｆｌｏｙｄ ＣＤ，Ｌｅｂｌａｎｃ Ｃ，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ，Ｐｒｏｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３６： ９１−１６８，１９９９を参照のこと。多数のライブラリーが、例えば、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ５９２６，Ｋｉｎｇｗｏｏｄ，ＴＸ ７７３２５；３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，６６５ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ １０４，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ１９３４１−１１５１ ； Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，１６９９ Ｈａｎｌｅｙ Ｒｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，６３１４４−２９１３などから市販されている。米国特許第６，４４８，４４３号およびＰＣＴ公開Ｗ０９９６４３７９も参照のこと。
一般に、任意の適切な溶媒、好ましくは、スクリーニングが細胞を含む場合、細胞成長に悪影響を及ぼさない溶媒中に化合物を溶解することができる。消耗の効果についての化合物の濃度範囲を試験することができる。当業者に周知のように、実質的に任意の化合物は、十分に高濃度で存在する場合、実質的に生物に悪影響を及ぼし得る。好ましい化合物は、治療薬としての投与に実用的な濃度で（例えば、治療を受ける被験体が許容不可能な副作用を生じない濃度で）その効果を示す。例えば、比較的低濃度（０．１μｇ／ｍｌ未満など）、より高濃度（０．１〜１μｇ／ｍｌ、１〜１００μｇ／ｍｌなど）、さらにより高濃度（例えば、１ｍｇ／ｍｌまで）でスクリーニングを行うことができる。一般に、当業者は、適切な試験濃度範囲を選択することができ、上記例は制限を意図しない。
１つのアプローチによれば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、もしくはＥＧＲ３で見出されるＲ１ドメインの配列、またはＲ１ドメインの一部を含む配列を有するポリペプチドを使用する。ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス）ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、またはＥＧＲ３のいずれか由来のＲ１ドメインを使用することができる。Ｒ１ドメインは、Ｒ１ドメインを含むＥＧＲ分子と特定のＥＧＲ調節遺伝子に関してＥＧＲタンパク質を阻害（大半の場合）または活性化（一部の場合）するＮＡＢタンパク質との間の相互作用を減少または防止するドミナントネガティブとして作用することが示されている（７１）。ＥＧＲタンパク質とＮＡＢタンパク質との相互作用の阻害によってＥＧＲ活性を調整することができる小ポリペプチドを同定するために（例えば、上記のレポーターアッセイを使用して）Ｒ１のフラグメントを試験することができる。小分子ペプチド模倣物を、当該分野で公知の方法を使用してこのようなポリペプチドの構造に基づいてデザインし、ＥＧＲ−ＮＡＢ相互作用を破壊するその能力について試験する。このようなスクリーニングによりＥＧＲ−ＮＡＢ相互作用を安定化する分子も同定される可能性がある。これらのペプチド模倣物を使用して、スクリーニングに適切な分子の組み合わせライブラリーを作製することができる。
Ｅ．動物モデルおよびヒトにおける候補化合物の有効性についてのスクリーニング
本明細書中に記載の任意のスクリーニング法（または他の適切な方法）を使用して同定した候補化合物を、統合失調症のための任意の適切な動物モデル（遺伝子モデルおよび薬理学的モデルの両方が含まれる）で試験することができる。例えば、このような化合物を、ＣＮＢ前脳特異的ノックアウトマウス（１９）および／またはＧａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ： ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ”，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ．２００１に記載の任意のマウスで試験することができる。このような分子には、（例えば、遺伝子ターゲティングテクノロジーを使用して）選択または開発した種々のマウス株（例えば、ＮＭＤＡ受容体、ドーパミン輸送体などの神経伝達系の種々の成分が変異または欠失したマウスなど）が含まれる。あるいは、統合失調症を連想させる症状を発症するＰＣＰなどの適切な化合物への動物の曝露によって動物モデルを得ることができる。
動物モデルで化合物を試験する場合、化合物の予想される標的が変異または欠失していない動物モデルを使用することが好ましい（化合物がこのような動物モデルで同様に有効である場合、このような動物モデルを通常は化合物の特異性についてのコントロールとして使用することができるが、予想される標的との相互作用に関連しない機構を介して作用する可能性が最も高い）。統合失調症、関連疾患、またはそれに対する感受性を有したヒト被験体で候補化合物を試験することもできる。
一般に、有効性についてのこのような試験は、候補化合物を被験体（動物または植物のいずれか）に投与する工程と、化合物の投与によって統合失調症の任意の徴候または症状が改善または軽減する（または統合失調症の発症率が減少する）かどうかを決定するために被験体を観察する工程を含む。統合失調症の動物モデルに特徴的な任意の表現型（すなわち、統合失調症を連想させる表現型）（実施例５に記載の活性および挙動が含まれるが、これらに制限されない）を評価することができる。特に、（１）自発運動；（２）常同行動；（３）無生物に対する探索行動；および（４）不安様挙動などの表現型を評価することができる。これらの活動および挙動の増加は、統合失調症および／または関連症状を罹患したヒト被験体で見出される障害に対応する認知機能障害を示すと見なされる。（１）社会的相互作用；（２）プレパルス抑制；（３）潜在抑制；および（４）造巣行動などの挙動および／または活動のさらなる態様。これらの以上の大部分または全ての障害または異常は、統合失調症および／または関連症状に罹患したヒト被験体で見出された障害に対応する認知機能で障害を示すと見なされる。これらの多くが種々の現在利用可能な遺伝子マウスモデルおよび／またはヒト被験体で統合失調症様症状を誘導することが公知の薬理学的化合物（例えば、コカイン、ＰＣＰ）で投与したマウスでも見出される。
ヒトでは、統合失調症または関連症状を罹患しているか罹患していると疑われる患者の診断および／または評価で使用される任意のパラメーターを評価することができる。被験体における統合失調症についての候補治療薬の臨床試験の実施方法は十分に確立されている。本発明の一定の実施形態によれば、本明細書中に記載の任意の本発明の方法を使用した被験体が統合失調症のリスクがあるかこれに罹患しているかの同定によって臨床試験のためのヒト被験体を選択する。例えば、被験体から得たサンプル中のＥＧＲ分子、ＥＧＲ相互作用分子、カルシニュリンサブユニット、またはカルシニュリン相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型の多型性変異型の検出またはこのような遺伝子に連結されたゲノム領域中の多型の多型性変異型の検出によって被験体を選択することができる。本発明の一定の実施形態によれば、任意の本発明の方法を使用して選択した被験体群を、任意の他の診断基準を使用して選択した被験体群と比較する。
したがって、本発明は、（ｉ）統合失調症を連想させる１つまたは複数の表現型のリスクがあるかこれを示す被験体を提供する工程と、前記被験体が少なくともＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子の発現が変化していることと、（ｉｉ）前記被験体に候補化合物を投与する工程と、（ｉｉｉ）前記被験体における表現型の重症度または発生率を前記候補化合物を投与しない被験体の重症度または発生率と比較する工程とを含む、統合失調症の治療のための化合物の同定方法を提供する。典型的には、この方法を動物群を使用して行う。化合物を投与した被験体において表現型が重症度が低いか頻度が減少する場合、化合物を統合失調症および／または統合失調症感受性の治療のための化合物と同定する（しかし、勿論これをさらなる方法を使用して確認することができる）。
本発明は、さらに、（ａ）統合失調症のための動物モデルを構成する動物にＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性を増減させる化合物を投与する工程と、（ｂ）動物の少なくとも１つの表現型パラメーターを評価する工程と、前記化合物の非存在下で動物の表現型パラメーターが統合失調症を連想させるその正常値と比較して変化することと、（ｃ）化合物の投与によって表現型パラメーターがより正常な値に修復される場合に化合物を統合失調症または統合失調症感受性の治療または防止の候補化合物と同定する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の治療または防止のための候補化合物の同定方法を提供する。パラメーターの値を、化合物を投与しない被験体の値と比較することができる。本発明の一定の実施形態によれば、化合物を投与した被験体および化合物を投与しない被験体（すなわち、コントロール）は、一般に、類似しているか同一の動物であり得る。（ヒストリカルコントロールを使用することができることに留意する。）野生型マウスおよび／またはヒト被験体において化合物の効果を評価することもできる。動物モデルは、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子が変化していても変化していなくてもよい。
化合物は、例えば、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする転写物にターゲティングしたｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導剤（ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を減少させる）、ＮＡＢタンパク質にターゲティングしたｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導剤（ＮＡＢタンパク質の発現が減少し、それによって特定のＥＧＲ調節遺伝子の転写に関してＥＧＲ機能活性が増加（大半の場合）または減少（一部の場合）する）であり得る。化合物は、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、もしくはＥＧＲ３のＲ１ドメインまたはＲ１ドメインの一部の配列を含む配列を有するポリペプチドであり得る。上記のように、Ｒ１ドメインは、Ｒ１ドメインを含むＥＧＲ分子と特定のＥＧＲ調節遺伝子に関してＥＧＲタンパク質を阻害（大半の場合）または活性化（一部の場合）するＮＡＢタンパク質との間の相互作用を遮断するドミナントネガティブとして作用することが示されている。化合物は、任意の上記スクリーニングアプローチによって同定された分子であり得る。一般に、任意の利用可能な経路（静脈内投与、経口投与、局所送達（例えば、脳などの標的部位への注射、局所送達）、吸入、経皮などが含まれる）を使用して、化合物を送達させることができる。
Ｆ．候補化合物の有効性のスクリーニングのための動物モデル
本発明は、変化した形態のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子を発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を提供する。本発明は、さらに、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子を過剰発現するトランスジェニック動物を提供する。本発明は、低形質遺伝子座がＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする任意の遺伝子であり得る、ＥＧＲマウスハイポモルフを提供する。好ましくは、マウスは、統合失調症を連想させる１つまたは複数の表現型を示す。
「ハイポモルフ」とは、野生型レベル未満であるが遺伝子の完全な欠失（または発現の完全な消失）よりも高いレベルで所与の遺伝子を発現する動物を意味する。例えば、ハイポモルフは、野生型発現レベルの５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、またはさらにより低い比率であるが０を超える遺伝子を発現することができる。野生型発現レベルの１０％と３０％との間で発現するハイポモルフが好ましい。遺伝子の完全な欠失または不活化によって胚が死亡または厳しく欠失して目的の表現型（例えば、統合失調症を連想させる表現型）の評価が防止されるか妨げられる場合、ハイポモルフマウスは特に好ましい。例えば、（２５）に記載のＰＧＫプロモーターなどのプロモーターの「ノックイン」によってハイポモルフマウスを作製することができる。このプロモーターは、標的遺伝子座で転写を厳しく抑制することが示されており、この方法を使用してマウスＮＭＤＡ受容体ハイポモルフを作製した（２５）。一般に、用語「ハイポモルフ」とは、組織特異的または領域ノックアウトをいわない。しかし、この用語は、発現の組織または領域特異的減少を含む。
本発明は、さらに、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする任意の遺伝子が組織制限発現するマウスを提供する。特に、本発明は、１つまたは複数の神経系領域（例えば、１つまたは複数の脳領域）中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子を欠くかその発現が減少したマウスを提供する。
一般に、任意の上記遺伝子を過剰発現または過小発現するマウスを、種々の従来の、最近開発された、または新興のトランスジェニックまたはノックアウト技術にしたがって作製することができる。このような技術には、細胞または組織特異的調節エレメント、誘導系の使用などが含まれ得る。例えば、Ｋｗａｎ，Ｋ．，"Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ： ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ．"Ｇｅｎｅｓｉｓ，３２ （２）： ４９−６２，２００２ ； Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ，Ｍ．，"Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ"，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２ （１０）： ７４３−５５，２００１ ； Ｂｏｃｋａｍｐ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１ （３）： １１５−３２ （２００２）を参照のこと。
本明細書中で使用される、「トランスジェニック動物」とは、１つまたは複数の動物細胞が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、および両生類などが含まれる。導入遺伝子は、好ましくはトランスジェニック動物の細胞のゲノムに組み込まれているかゲノム中で生じる外因性ＤＮＡまたは再構成物（例えば、内因性染色体ＤＮＡの欠失）である。したがって、「ノックアウト」動物が含まれる。導入遺伝子は、内因性遺伝子を置換することができるが、その必要はない。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の１つまたは複数の細胞型または組織中でのコードされた産物の発現を指示することができる。
本発明の一定の実施形態によれば、マウスハイポモルフまたは有効なヌル変異体を、マウス中のＥＧＲ分子にターゲティングされたかＥＧＲ相互作用分子にターゲティングされたｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡｉ誘導剤の発現によって作製する。（所望ならば、組織型もしくは細胞型特異的様式または誘導様式で行うことができる。）本発明の一定の実施形態によれば、例えば、Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６ （２００３）； Ａｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１４ ： １２０７−１２１２ （２００３）、またはＤｏｒｓｅｔｔ，Ｙ．ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｄｒａｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３： ３１８−３２９ （２００４）で引用した他の参考文献（本明細書中で参考として援用される）に記載のレンチウイルスベクターを使用してこのような発現を行う。ホモまたはヘテロ接合体を作製するためにこのようなマウスを交配することができる。本発明は、さらに、任意の本発明の任意のマウスとこの群の他のメンバーまたは任意の異なる遺伝子型のマウス（統合失調症のモデルとして使用したマウス（例えば、ＮＭＤＡ受容体のサブユニット、ドーパミン輸送体、カルシニュリン相互作用分子をコードする遺伝子が変異したマウス）および組織特異的様式でｃｒｅなどのリコンビナーゼを発現するマウスが含まれるがこれらに限定されない）との交配によって作製されたマウスを提供する。
本発明は、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の変異型を発現し、相同ヒトタンパク質中の変異型の位置に対して相同な位置で変異型が生じ、変異型が統合失調症または統合失調症感受性に関連する、トランスジェニック動物を提供する。ヒト変異液は、統合失調症または統合失調症に対する感受性に関連する多型性変異型を有する遺伝子によってコードされる。
主にマウスに関して記載しているが、本発明は、このような動物に制限されず、遺伝子操作された変異型を作製することができる任意の他の動物（ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、およびおそらく霊長類が含まれる）も含まれる。特に、ｓｉＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングがトランスジェニックラットで証明されていることに留意する（Ｈａｓｕｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００２ Ｄｅｃ ４ ； ５３２ （１−２）： ２２７−３０）。
上記の任意の動物を使用して、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための候補化合物の有効性をスクリーニングすることができる。任意の特定のタンパク質が低形質のマウスは、そのタンパク質の活性を増強するようにデザインされた化合物の試験に特に有用であり得る。これらのマウスを、候補化合物を立証するための生化学的アッセイおよび挙動アッセイの両方に使用することができる。
ＶＩ．統合失調症または統合失調症感受性の治療のための化合物および方法
Ａ．化合物および使用方法
本発明は、上記の任意の本発明の化合物同定法にしたがって同定した化合物を提供する。本発明の一定の実施形態によれば、好ましい化合物は、中枢神経系中で治療有効濃度を達成することができるように血液脳関門を通過する能力を示す。候補化合物（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して同定した化合物）を、例えば、血液脳関門を通過する能力を増強するための親油性部分との抱合または当該分野で公知の任意の種々の方法によって適切に修飾することができる。本発明の一定の実施形態によれば、化合物が血液脳関門を通過する可能性を増大させるために、化合物ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）を、適切な出発化合物および／または置換基を使用して合成する。
一般に、上記のように同定された任意の化合物を、望ましくない性質を減少または排除するためおよび／または所望の性質を増強するために、さらに最適化することができる。例えば、溶解性を増加させるか、吸収性を増加させるか、生物学的利用能を増強するように化合物を修飾することができる。このような化合物は、治療薬および／またはさらなる化合物のデザインまたは選択のためのリード化合物として有用であり得る。したがって、本発明は、上記スクリーニング法によって同定された化合物の誘導体（例えば、生物学的利用能が増強され、血液脳関門の通過能力が増強され、安全性プロフィールが改善された誘導体）を提供する。
上記の本発明の方法にしたがって同定された任意の化合物は研究および治療目的の両方のためにさらに多くで使用することができ、統合失調症または統合失調症感受性の治療で使用するための候補化合物としてのその同定は決してその適用に制限されないことを留意する。
本発明は、（ｉ）統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を提供する工程と、（ｉｉ）上記の任意の本発明の方法にしたがって同定した化合物を被験体に投与する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法を提供する。化合物を統合失調症または統合失調症感受性の治療または予防に有効な量で投与することが好ましい。
本発明は、（ｉ）統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を提供する工程と、（ｉｉ）ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を調整する化合物を被験体に投与する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法を提供する。本発明の種々の実施形態によれば、化合物はＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を増強する。本発明の一定の他の実施形態によれば、化合物はＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を減少させる。本発明の一定の実施形態によれば、化合物はＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性を調整する（例えば、増強させるか減少させる）。本発明の一定の実施形態によれば、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される。適切な化合物には、上記の任意の本発明の化合物スクリーニング法にしたがって同定された化合物が含まれるが、これらに限定されない。
Ｂ．遺伝子療法
本発明はまた、カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子（このようなサブユニットまたは分子の改変異形が含まれる）が被験体の細胞で発現する、遺伝子療法を使用した統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法を提供する。ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子は、表１に列挙した任意のものまたはその他であり得る。あるいは、本発明の一定の実施形態によれば、サブユニットまたは分子の内因性発現を減少または排除するために、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をターゲティングした阻害ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡｉ誘導剤を発現させる。他の遺伝子療法ベースのこれらの分子の発現の減少方法も使用することができる。ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の転写を調整する方法も本発明の範囲内である。例えば、米国特許第６，３２６，１６６号を参照のこと。遺伝子療法のための方法およびベクターは、当該分野で公知である。一般に、遺伝子療法ベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および多数の非ウイルスベクターが含まれる。本発明の方法によれば、所望のサブユニットまたは分子をコードする核酸を、適切な調節エレメントの調節下で遺伝子療法ベクターに移入する。最適な細胞型もしくは組織または全身での誘導性または構成性発現を達成するために、このような調節エレメントを選択することができる。
遺伝子療法プロトコールは、インフルエンザウイルス感染の前、実質的に同時、同時、または後にカルシニュリンサブユニットもしくはカルシニュリン相互作用分子または阻害ｓｉＲＮＡの発現を指示することができる有効量の遺伝子療法ベクターを被験体に投与する工程を含み得る。上記の代わりまたは上記と組み合わせて使用することができる別のアプローチは、細胞集団（例えば、被験体由来の幹細胞または免疫系細胞）を単離し、任意選択的に組織培養で細胞を拡大し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでカルシニュリンサブユニットもしくはカルシニュリン相互作用分子または阻害ｓｉＲＮＡの発現を指示することができる遺伝子療法ベクターを細胞に投与することである。次いで、細胞を被験体に戻すことができる。任意選択的に、カルシニュリンサブユニットもしくはカルシニュリン相互作用分子またはｓｉＲＮＡを発現する細胞を、被験体に移入する前にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞株または被験体ではない個体由来の細胞であり得る細胞集団を使用することができる。被験体由来の幹細胞、免疫系細胞などを単離してこれらを被験体に戻す方法は、当該分野で周知である。例えば、化学療法を受けた患者における骨髄移植、末梢血幹細胞移植などのためにこのような方法を使用する。
さらに別のアプローチでは、経口遺伝子療法を使用することができる。例えば、米国特許第６，２４８，７２０号は、プロモーターの調節下の遺伝子が微粒子中に防御的に含まれ、有効な形態で細胞に送達され、それにより非浸襲性遺伝子送達が達成される方法および組成物を記載している。微粒子の経口投与後、遺伝子は上皮細胞（吸収腸上皮細胞が含まれる）に取り込まれ、消化管関連リンパ組織に取り込まれ、さらに粘膜上皮から離れた細胞に輸送される。前記米国特許に記載されるように、微粒子は遺伝子を粘膜上皮から離れた部位に遺伝子を送達することができる（すなわち、上皮障壁を通過して全身循環に侵入し、それにより他の位置に細胞を移動させることができる）。
ＶＩＩ．さらなる方法、試薬、および化合物
本発明は、統合失調症または統合失調症感受性の治療、統合失調症感受性の治療法の開発、本明細書中に記載の他の本発明の方法の実施、または種々の他の目的のために使用することができる多数のさらなる方法、試薬、および化合物を提供する。
Ａ．ＲＮＡｉ誘導剤
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、アンチセンスおよびリボザイムベースのアプローチと異なる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって介在される転写後遺伝子サイレンシング機構である。ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＩＣＥＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３，２００１）と呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ様酵素による２つの２１ｎｔ鎖（それぞれ５’リン酸基および３’水酸基を有し、２ｎｔの３’オーバーハングに隣接した１９ｎｔ二重鎖領域が存在するように他の鎖と正確に相補的な１９ｎｔ領域を含む）から構成されるより小さなｄｓＲＮＡ分子への最初のプロセシング後に種々の型の細胞中のｍＲＮＡの配列特異的分解を指示すると考えられる。したがって、典型的には、ＲＮＡｉは、全部で約２１ヌクレオチドと２３ヌクレオチドとの間となる典型的には各鎖上に１〜２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する約１９ヌクレオチド長の二本鎖領域を含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって介在される。哺乳動物細胞では、約３０ヌクレオチドよりも長いｄｓＲＮＡは、典型的には、インターフェロン応答を介した非特異的ｍＲＮＡ分解を誘導する。しかし、一般に、哺乳動物細胞中のｓｉＲＮＡの存在により、好ましくはインターフェロン応答を誘導しないか、このような応答が誘導される場合には許容不可能な副作用が得られるレベルに誘導せずに配列特異的に遺伝子がスプライシングする。
一般に、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、好ましくは約１９塩基対長であり、任意選択的に１つまたは２つの一本鎖オーバーハング（例えば、３’オーバーハング）をさらに含むＲＮＡ二重鎖を含む。二重鎖領域は、一般に、約１５ヌクレオチド長から約２９ヌクレオチド長までの範囲であってよく、いくつかの目的のために、１９塩基対を超える長さの二重鎖が好ましい。ｓｉＲＮＡは、一般に、互いにハイブリッド形成した２つのＲＮＡ鎖を含み、標的ｍＲＮＡに関してその一方がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖（すなわち、相補鎖）である。ｓｉＲＮＡは、リン酸基および／または水酸基（例えば、５’リン酸基）を含み得る１つまたは複数の遊離鎖末端を含み得る。ｓｉＲＮＡは、標的転写物とハイブリッド形成することができる部分を含む。ｓｉＲＮＡの１つの鎖（アンチセンス鎖）（またはｓｈＲＮＡの自己相補部分のアンチセンス鎖−以下を参照のこと）は、典型的には、標的転写物の領域と正確に相補的であり、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡアンチセンス鎖が１つのミスマッチもなく標的転写物とハイブリッド形成することを意味する。しかし、一般に、完全な相補性は必要ない。完全な相補性が達成されない本発明の一定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ末端またはその付近に任意のミスマッチが存在することが好ましい。
ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または微量注入などの方法によって哺乳動物細胞に導入された場合、または任意の種々のプラスミドベースのアプローチ（例えば、細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを産生するｓｈＲＮＡなど）を介して細胞中で発現する場合、遺伝子発現を下方制御することが示されている。ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ誘導剤を使用したＲＮＡ干渉は、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４４６−４４８，Ｍａｙ ２００２に概説されている。上記で引用されたＹｕ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９（９），６０４７−６０５２（２００２）；Ｓｕｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９（８），５５１５− ５５２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．，１６，９４８−９５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０−５５３（２００２）；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｔａｉｒａ，Ｋ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，４９７−５００（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０，５０５−５０８（２００２）；Ｄｏｒｓｅｔｔ，Ｙ，ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（その教示が本明細書中の説明に関連し、且つ補足する）も参照のこと。構造、長さ、ミスマッチ数、ループサイズ、オーバーハング中のヌクレオチドの同一性などの多数の変動が有効なＲＮＡｉ誘発遺伝子サイレンシングと一致し、一般に、試行錯誤的アプローチにより少なくとも８０％の任意の特定の標的の発現をサイレンシングすることができる１つまたは複数の有効なｓｉＲＮＡ配列を同定することが可能である。さらに、多数の公的に利用可能なアルゴリズムまたは独自のアルゴリズムがサイレンシングを有効に介在しそうなｓｉＲＮＡ配列の選択に利用可能である。例えば、ＵＲＬがｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／のウェブサイトで利用可能なＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｓｉＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍを参照のこと。
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれる分子は、一般に、互いにハイブリッド形成して二本鎖（二重鎖）構造が得られ、これを細胞内でプロセシングして１つまたは複数のｓｉＲＮＡを産生することができる、センス部分およびアンチセンス部分（標的ｍＲＮＡ配列に関して）を含む１つの自己相補ＲＮＡ鎖を含む。相補性部分は、典型的には、構造全体がステム、ループ、および任意選択的にオーバーハング（好ましくは３’オーバーハング）を含むヘアピンに類似するようにループを形成する非自己相補領域によって分離している。ステムは、約１９ヌクレオチドであり、ループは約１〜２０、より好ましくは約４〜１０、最も好ましくは約６〜８ｎｔ長であり、そして／またはオーバーハングは約１〜２０、より好ましくは約２〜１５ｎｔ長であり得る。本発明の一定の実施形態では、ステムは、１５ヌクレオチド長から２９ヌクレオチド長までの範囲である。４ヌクレオチドまたはそれ以上のループは、より短いループよりも立体障害を受ける可能性が低いので好ましい。オーバーハングは、５’水酸基および３’水酸基を含み得る。オーバーハングは、複数のＵ残基（例えば、１Ｕ残基と５Ｕ残基との間）を含み得るが、その必要はない。ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分およびセンス部分の配列をｓｉＲＮＡに関して選択する。
上記のｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ依存性機構を介してターゲティングし、それによりタンパク質合成率も減少するｍＲＮＡの分解を誘発する。この経路を介して作用するｓｉＲＮＡに加えて、一定のＲＮＡ（テンプレート転写物の３’ＵＴＲに結合するＲＮＡ）は、古典的なＲＮＡ干渉に関連するがこれと異ならない機構（例えば、その安定性の減少よりもむしろ転写物の翻訳の減少）によってテンプレート転写物によってコードされるタンパク質の発現を阻害することができる。このようなＲＮＡを、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼び、典型的には、約２０ヌクレオチド長と２６ヌクレオチド長との間（例えば、２２ｎｔ長）である。天然に存在するｍｉＲＮＡが、典型的には、約４〜１５ｎｔのループを有する約７０ｎｔ長である小一過性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ前駆体として公知のより長いヘアピン様前駆体に由来すると考えられる（Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ １０６，２３−２４，２００１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４−８３８，２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，２６５４−２６５９を参照のこと）。この型の内因性ＲＮＡは多数の生物（哺乳動物が含まれる）で同定されており、この転写後遺伝子サイレンシング機構は広範囲に及び得ることが示唆される（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５８，２００１；Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ，Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８（４），１７１−１７３，２００２および上記の２論文の参考文献）。ミクロＲＮＡは、哺乳動物細胞における標的部位を含む標的転写物の翻訳を遮断することが示されている（Ｚｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，９，１−２０，２００２）。
３’ＵＴＲ内（または標的転写物の他の場所）で結合して翻訳を阻害する天然に存在するか人為的な（すなわち、人によってデザインされた）ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ／テンプレート二重鎖中のより多数のミスマッチを許容することができ、特に、二重鎖の中心領域内のミスマッチを許容することができる。実際、天然に存在するｓｔＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳を阻害することが示されたｍｉＲＮＡで示されるようなミスマッチを頻繁に示すので、いくつかのミスマッチが望ましいか必要であり得るという証拠が存在する。例えば、標的転写物とハイブリッド形成する場合、このようなｍｉＲＮＡは、ミスマッチ領域によって分離された完全に相補的な２つのストレッチを頻繁に含む。種々の構造が可能である。例えば、ｍｉＲＮＡは、複数の非同一（ミスマッチ）領域を含み得る。非同一性（ミスマッチ）領域は、標的およびｍｉＲＮＡは共に非対合ヌクレオチドを含むという意味で対称である必要はない。典型的には、完全な相補性のストレッチは、少なくとも５ヌクレオチド長（例えば、６、７、またはそれ以上のヌクレオチド長）であり、ミスマッチ領域は、例えば、１、２、３、または４ヌクレオチド長であり得る。
したがって、二重鎖構造を含む種々のＲＮＡ分子組が種々の機構を介したサイレンシングを介在することができることが明らかである。本発明の目的のために、分解の誘発、翻訳の阻害、または他の手段のいずれかによってその一部が標的転写物に結合してその発現を減少させる任意のこのようなＲＮＡを、ＲＮＡｉ誘導剤と見なし、このようなＲＮＡを作製するか（すなわち、ＲＮＡの前駆体として役立つ）、このようなＲＮＡの転写のテンプレートとして役立つ任意の構造は、本発明の実施で有用である。
本発明の文脈では、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導剤は、例えば、統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体におけるＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を調整する治療目的およびカルシニュリンの活性またはレベルを調整する統合失調症の治療のための化合物の同定のための種々の本発明の方法の両方で有用である。特に、ＲＮＡｉは哺乳動物の脳で有効であることが示されており、ｓｈＲＮＡ分子の転写のためのテンプレートを提供するベクターを脳に移入して、局所遺伝子発現を下方制御することが示されていることに留意する（Ｈｏｍｍｅｌ，ＪＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９（１２）１５３９−１５４４）。ｓｉＲＮＡ二重鎖または一方もしくは両方の鎖の一部、および／または３’オーバーハングに対して多数の化学修飾を行うことができる一方で、サイレンシング活性が消失されず、且つ頻繁に有意に減少しないことにさらに留意する（上記参照のＤｏｒｓｅｔｔ，Ｙ，ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．）。このような修飾は、一般に、ｓｉＲＮＡの安定性、細胞取り込み、および／または細胞内有効性を増強することができる。本発明は、任意のこのような修飾（例えば、ホスホロチオエート、２’−Ｏメチル、２’−Ｏ，４’−メチレンヌクレオチドなど）および、例えば、アンチセンス分野由来の当該分野で公知の他の修飾を有するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用を含む。
したがって、本発明は、（ｉ）ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の発現を阻害すべき生物学的な系を提供する工程と、（ｉｉ）カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子をコードする転写物をターゲティングしたＲＮＡｉ誘導剤と系を接触させる工程とを含む、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本発明の一定の実施形態によれば、サブユニットまたは分子は、統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされる。本発明の一定の実施形態によれば、生物学的な系は細胞を含み、接触工程は細胞内でのＲＮＡｉ誘導剤の発現を含む。本発明の一定の実施形態によれば、生物学的な系は被験体（例えば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物被験体）を含み、接触工程は被験体へのＲＮＡｉ誘導剤の投与または被験体での誘導剤の発現を含む。本発明の一定の実施形態によれば、薬剤は誘導的および／または細胞型もしくは組織特異的様式で発現する。
本発明は、任意のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする転写物をターゲティングするＲＮＡｉ誘導分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または任意のこれらの転写物のテンプレートを提供するベクター）を提供する。特に、本発明は、被験体中の多型性変異型の存在が統合失調症に対する感受性またはその存在を示す、このような転写物の多型性変異型をコードする転写物を選択的にまたは特異的にターゲティングするＲＮＡｉ誘導剤を提供する。この文脈における、用語「選択的または特異的にターゲティングする」とは、ＲＮＡｉ誘導剤により他の変異型（すなわち、被験体におけるその発現が統合失調症に対する感受性またはその存在を示さない被験体）よりも変異型の発現が減少することを示すことを意図する。転写物は、例えば、表１に列挙した任意の分子またはその多型性変異型をコードすることができる。ＲＮＡｉ誘導剤を、必要に応じてさらなる成分を含むキットの形態で提供することができる。
Ｂ．全長および部分的アンチセンスＲＮＡ転写物
アンチセンスＲＮＡ転写物は、同一細胞中の任意の他のＲＮＡ転写物の一部または全部と相補的な塩基配列を有する。このような転写物は、種々の機構（ＲＮＡスプライシングの調整、ＲＮＡ輸送の調整、およびｍＲＮＡの翻訳の調整が含まれる）を介して遺伝子発現を調整することが示されている（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ａｎｎａｌｓ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：７０，１９９２，Ｎｅｌｌｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８：４１９，１９９３ Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｍｏｎｉａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８９：３，１９９９；Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：４３８，２０００；Ｆｒｅｎｃｈ ａｎｄ Ｇｅｒｄｅｓ，Ｃｕｒｒ．ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，３：１５９，２０００，Ｔｅｎ ａｎｄ Ｒｏｕｚｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，５：１３６０，２０００）。
Ｃ．アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド
アンチセンス核酸は、一般に、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ転写物）の地位部に相補的であるので標的と結合して二重鎖を形成することができる一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、または修飾ＲＮＡ）である。典型的には、これらは、１５〜３５ヌクレオチド長の範囲であるが、１０ヌクレオチド長から約５０ヌクレオチド長までの範囲であり得るオリゴヌクレオチドである。典型的には、結合により、標的核酸の機能が減少または阻害される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに結合した場合には転写を遮断し、ｍＲＮＡに結合した場合には翻訳を阻害し、そして／または核酸を分解することができる。ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用ポリペプチドの発現を、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの配列と相補的な配列を含むアンチセンス核酸またはペプチド核酸の投与によって減少させることができる。アンチセンステクノロジーおよびその適用は当該分野で周知であり、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．Ｉ．（ｅｄ．）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ ３１３ ａｎｄ ３１４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，２０００およびその参考文献に記載されている。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（ｅｄ．）"Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"（ｌｓｔ ｅｄ），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７０５６６１；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）およびその参考文献も参照のこと。
細胞中の任意のＲＮＡ転写物の一部と相補的な塩基配列を使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の機構（ＲＮＡスプライシングの調整、ＲＮＡ輸送の調整、およびｍＲＮＡの翻訳の調整が含まれる）を介して遺伝子発現を調整することができる（Ｄｅｎｈａｒｄｔ，１９９２）。アンチセンスオリゴヌクレオチドの種々の性質（安定性、毒性、組織分布、細胞取り込み、および結合親和性が含まれる）を、化学修飾（ｉ）ホスホジエステル骨格（例えば、ペプチド核酸、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、およびホスホラミデートオリゴヌクレオチド）の置換、（ｉｉ）糖塩基（例えば、２’−Ｏ−プロピルリボースおおよび２’−メトキシエトキシリボース）の修飾、および（ｉｉｉ）ヌクレオシドの修飾（例えば、Ｃ−５プロピニルＵ、Ｃ−５チアゾールＵ、およびフェノキサジンＣ）が含まれる）によって変化させることができる（Ｗａｇｎｅｒ，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１：１１１６，１９９５；Ｖａｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．Ｌｅｔｔ．，６９：２１７，１９９９；Ｎｅｉｌｓｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：７１，１９９９；Ｗｏｏｌｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：１７６３，１９９０）。
本発明は、（ｉ）ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の発現を阻害すべき生物学的な系を提供する工程と、（ｉｉ）ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする転写物とハイブリッド形成するアンチセンス分子と系を接触させる工程とを含む、カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子をコードする遺伝子の発現の阻害方法を提供する。本発明の一定の実施形態によれば、サブユニットまたは分子は、統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされる。本発明の一定の実施形態によれば、生物学的な系は細胞を含み、接触工程は細胞内でのアンチセンス分子の発現を含む。本発明の一定の実施形態によれば、生物学的な系は被験体（例えば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物被験体）を含み、接触工程は被験体へのアンチセンス分子の投与または被験体でのアンチセンス分子の発現を含む。発現は、誘導性および／または組織もしくは細胞特異的であり得る。アンチセンス分子は、オリゴヌクレオチドまたはより長い核酸分子あり得る。本発明は、このようなアンチセンス分子を提供する。
Ｄ．リボザイム
リボザイムまたはデオキシリボザイムと呼ばれる一定の核酸分子は、ＲＮＡ分子の配列特異的切断を触媒することが示されている。ＲＮＡまたはＤＮＡ酵素中のヌクレオチドと標的ＲＮＡ中のヌクレオチドとの相補的対合によって切断部位を決定する。したがって、ＲＮＡおよびＤＮＡ酵素を、任意のＲＮＡ分子を切断し、それによりその分解速度を増加させる用にデザインすることができる（Ｃｏｔｔｅｎ ａｎｄ Ｂｉｒｎａｔｉｅｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．８：３８６１−３８６６，１９８９；Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：２４３，１９９６；Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：５２７，１９９６；Ｓｕｎ，ｅｔ ａｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５２：３２５，２０００）。例えば、Ｇｏｔｔｅｎ ａｎｄ Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，"Ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ"，ＥＭＩＢＯ Ｊ．８：３８６１−３８６６，１９８９も参照のこと。
本発明は、（ｉ）カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子をコードする遺伝子の発現を阻害すべき生物学的な系を提供する工程と、（ｉｉ）カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子をコードする転写物とハイブリッド形成して転写物の切断を指示するリボザイムと系を接触させる工程とを含む、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の発現の阻害方法を提供する。本発明の一定の実施形態によれば、サブユニットまたは分子は、統合失調症の感受性遺伝子座内またはそれに連結しているか、統合失調症に対する感受性または統合失調症の発症に起因または寄与する機能的変異が存在し得る遺伝子によってコードされる。本発明の一定の実施形態によれば、生物学的な系は細胞を含み、接触工程は細胞内でのリボザイムの発現を含む。本発明の一定の実施形態によれば、生物学的な系は被験体（例えば、マウスまたはヒトなどの哺乳動物被験体）を含み、接触工程は被験体へのリボザイムの投与または被験体でのリボザイムの発現を含む。本発明の一定の実施形態によれば、発現は、誘導性および／または組織もしくは細胞特異的であり得る。本発明は、上記のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする転写物またはその多型変異型を切断するようにデザインされたリボザイムを提供する。
ＶＩＩＩ．統合失調症または統合失調症感受性の治療のための薬学的組成物
本明細書中に記載のように同定された化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む本発明の組成物を、任意の利用可能な経路（非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、直腸、および膣が含まれるが、これらに限定されない）による送達のために処方することができる。好ましい送達経路には、非経口、経粘膜、直腸、および膣が含まれる。本発明の薬学的組成物には、典型的には、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせた活性化合物もしくはその塩または関連化合物もしくはアナログが含まれる。本明細書中で使用される、用語「薬学的に許容可能なキャリア」には、薬学的投与に適合可能な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。治療または他の目的のための核酸またはポリペプチドの送達のために、任意の種々の脂質および／または高分子キャリアおよびマトリクスを使用することが望ましい。（例えば、ポリマーベースの送達ストラテジーの考察については、Ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．による特許および公開ＰＣＴ出願を参照のこと。）ＨＩＶｔａｔタンパク質または１つまたは複数のその一部を含み、細胞に送達すべきカーゴ分子（ｃａｒｇｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）と共有結合した新規の輸送ポリペプチドに関する米国特許出願６，３１６，００３号などに記載のストラテジーを使用することが望ましい。
その意図する投与経路に適合するように薬学的組成物を処方する。非経口、皮内、皮下への適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張化剤。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を使用してｐＨを調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入することができる。
注射に適切な薬学的組成物には、典型的には、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は滅菌されており、且つシリンジでの取り扱いが容易な範囲の流動性であるべきである。好ましい薬学的処方物は、製造および保存条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。一般に、関連キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって微生物作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって、注射用組成物の吸収を延長させることができる。
上記列挙の成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じてその後濾過滅菌することによって、滅菌注射用溶液を調製することができる。一般に、上記列挙のもの由来の基剤となる分散媒および必要な他の成分を含む滅菌賦形剤への活性化合物の組み込みによって分散液を調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌した溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。経口治療投与の目的のために、賦形剤と共に活性化合物を組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態で使用することができる。含嗽剤用の流動物キャリアを使用して、経口組成物を調製することができる。薬学的に適合可能な結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、およびトローチなどは、任意の以下の成分または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの香味物質。胃腸管内での安定性を改善し、そして／または吸収を増強するための薬剤を、経口送達のための処方物に有利に組み込むことができる。
吸入による投与のために、本発明の組成物を、適切な高圧ガス（例えば、二酸化炭素などのガス）を含む加圧コンテナまたはディスペンサーまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で送達することが好ましい。
経粘膜手段または経皮手段によって全身投与することもできる。経粘膜または経皮投与のために、障壁を浸透するのに適切な浸透剤を処方物に使用する。このような浸透剤（例えば、経粘膜投与のための界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体）は当該分野で一般的に公知である。鼻腔内噴霧または座剤の使用によって経粘膜投与を行うことができる。経皮投与のために、当該分野で一般的に知られるように、オイントメント、軟膏、ゲル、またはクリーム中に活性化合物を処方する。
直腸送達のための座剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の座剤用基剤を使用）または貯留浣腸の形態で化合物を調製することもできる。
１つの実施形態では、制御放出処方物（インプラントおよびマイクロカプセル化送達系が含まれる）などの身体からの急速な排出から化合物を保護するキャリアを使用して、活性化合物を調製する。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は、当業者に自明である。材料を、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。薬学的に許容可能なキャリアとしてリポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体共に感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む）を使用することができる。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法にしたがって、これらを調製することができる。
投与が容易で投薬量が均一な投薬単位形態で経口または非経口組成物を処方することが有利である。本明細書中で使用される、「投薬単位形態」とは、治療をうける被験体のために単回投薬量として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は必要な薬学的キャリアと組み合わせて所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含む。
このような化合物の毒性および治療的有効性を、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死滅させる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的有効性を示す用量）の決定）によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で示すことができる。有毒な副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小にすることによって副作用を減少させるために罹患組織部位にこのような化合物をターゲティングする送達系をデザインするのに注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトでの使用のための一定範囲の投薬量の処方で使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。投薬量は、使用した投薬形態および使用した投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用した任意の化合物のために、細胞培養アッセイから治療有効用量を評価することができる。細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために用量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィによって血漿レベルを測定することができる。
治療有効量の薬学的組成物は、典型的には、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。薬学的組成物を必要に応じて種々の間隔および異なる期間（例えば、約１週間と１０週間との間、２週間と８週間との間、約３週間と７週間との間、約４、５、または６週間で週１回など）で投与することができる。一定の条件のために、管理下で疾患を保持するために不確定に治療組成物を投与する必要があり得る。当業者は、一定の因子（疾患または障害の重症度、以前の治療、全体的な健康状態、および／または被験体の年齢、ならびに存在する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない）が被験体を有効に治療するのに必要な投薬量およびタイミングに影響を与え得ることを認識している。一般に、本明細書中に記載の本発明の組成物での被験体の治療には、単回治療が含まれ得るが、多くの場合、一連の治療が含まれ得る。
用量の例には、被験体のｋｇまたはサンプル重量あたりｍｇまたはμｇ量の本発明の組成物が含まれる（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）。例えば、予め選択した所望の応答が得られるまでの漸増用量の投与によって、適切な用量を特定のレシピエントに任意選択的に合わせることができることがさらに理解される。任意の特定の被験体のための特定の用量レベルは種々の因子（使用した特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食事、投与期間、投与経路、排出速度、任意の薬物の組み合わせ、および調整すべき発現または活性の程度が含まれる）に依存し得ると理解される。
本発明の薬学的組成物を、投与説明書と共にコンテナ、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
任意の本発明の化合物を、統合失調症の治療に有用なさらなる薬剤と共に同時投与することができる。多数のこのような薬剤は当該分野で公知であり、広範な種々の典型的および非典型的抗精神病薬が含まれる。さらに、抗精神病薬の副作用の改善に有用な化合物と共に化合物を同時投与することができる。例えば、上記目的に有用な多数の薬剤の考察については、Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，２００１を参照のこと。同時投与される化合物を、被験体に個別に投与することができるか、共に処方することができる。
ＩＸ．感受性遺伝子座および機能変異の同定のための方法および試薬
本発明は、さらなる統合失調症の感受性遺伝子座（統合失調症または統合失調症に対する感受性の診断で有用な多型）の同定および統合失調症に起因するか寄与する機能変異の同定のための体系的アプローチを提供する。本発明は、（ｉ）ＣＮサブユニットまたはＣＮ相互作用タンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子に連結した１つまたは複数の多型を同定する工程と、（ｉｉ）統合失調症を罹患した被験体から得たサンプルを含むサンプル組を提供する工程と、（ｉｉｉ）多型の１つまたは複数の変異型と統合失調症との連鎖または関連についてサンプルを試験する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の診断で有用な多型の同定方法を提供する。連鎖または関連が存在する場合、多型は統合失調症または統合失調症に対する感受性の診断で有用である。したがって、このような多型は、統合失調症の感受性遺伝子座中に存在することができるか、これを定義することができる。サンプル組は、統合失調症を罹患した１つまたは複数のファミリーから得たサンプルを含むことができ、関連および非関連個体の両方を含むことができる。
本発明は、さらに、（ｉ）ＣＮサブユニットまたはＣＮ相互作用タンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子に連結した多型を同定する工程と、（ｉｉ）多型の多型性変異型が統合失調症に対する感受性に連結または関連していることを決定する工程と、（ｉｉｉ）統合失調症を罹患した１人または複数の被験体から得たサンプル中の遺伝子および任意選択的に前記遺伝子の調節領域を配列決定する工程と、（ｉｖ）得られた配列を前記遺伝子の正常配列または野生型配列と比較する工程と、（ｖ）工程（ｉｉｉ）で得た配列が前記正常配列または野生型配列と異なる場合、前記多型性変異が統合失調症の原因となるか寄与する変異を示すと同定する工程とを含む、統合失調症に起因または寄与する候補機能変異の同定方法を提供する。
方法は、さらに、ｍＲＮＡの豊富さ、サイズ、組織発現パターンの試験、コードされたタンパク質の豊富さ、サイズ、組織発現パターン、および／または活性の試験を含む、正常な被験体および統合失調症を罹患した被験体における遺伝子発現を分析する工程を含み得る。
実施例１：ＥＧＲ遺伝子およびＥＧＲ分子と相互作用し、且つ統合失調症の感受性遺伝子座と一致する分子をコードする遺伝子の位置
材料と方法
遺伝子位置分析
ＰＰＰ３ＣＣ遺伝子の統合失調症との関連の分析時に、認められた関連シグナルに寄与し得るＰＰＰ３ＣＣ周辺の候補遺伝子を同定するために、ヒトドラフト配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｈｕｍ_ｓｒｃｈ? ｃｈｒ=ｈｕｍ_ｃｈｒ．ｉｎｆ＆ｑｕｅｒｙ）を試験した。そのうちで、周辺遺伝子はＥＧＲ３である。
他のＥＧＲ分子および一定のＥＧＲ相互作用分子の正確な染色体位置を決定するために、「ＥＧＲ」などの用語を使用して、化学論文および／またはマップ閲覧機能／ヒトドラフト配列部位（ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ− ｂｉｎ／Ｅｎｔｒｅｚ／ｈｕｍ_ｓｒｃｈ?ｃｈｒ=ｈｕｍ_ｃｈｒ．ｉｎｆ ＆ ｑｕｅｒｙ）を調査した。さらなるＥＧＲ分子を同定するために、「ＥＧＲ」などの問い合わせ用語を使用してマップ閲覧機能／部位を検索し、遺伝子の正確な染色体位置を取り出した。遺伝子の染色体部分を説明する用語（例えば、ＥＧＲ１の場合、第５または５ｑ染色体）を、用語「統合失調症」と組み合わせ、これらの染色体上に存在する統合失調症の感受性遺伝子座を説明する刊行物を取り出すために、個別の組み合わせを使用してＥｎｔｒｅｚ Ｐｕｂｍｅｄデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）を検索した。一致を検出するために、統合失調症遺伝子座の染色体位置を、遺伝子の遺伝子座と比較した。より詳細な分析のために、ヒトゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）またはヒトＥｎｓｅｍｂｌサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ_ ｓａｐｉｅｎｓ／）を使用して、正確な遺伝子の位置を所与の感受性領域についての最大有意性マーカーの位置と比較した。
さらなるＥＧＲ相互作用分子を同定するために、マップ閲覧機能／部位を、「ＥＧＲ」、「ＮＡＢ」などの問い合わせ用語を使用してさらに検索し、ＥＧＲ標的遺伝子（例えば、その転写がＥＧＲタンパク質によって活性化または抑制される遺伝子）が含まれる遺伝子の正確な染色体位置を取り出す。遺伝子の染色体位置を説明する用語を、用語「統合失調症」と組み合わせ、これらの染色体上に存在する統合失調症の感受性遺伝子座を説明する刊行物を取り出すためにこの組み合わせを使用してＥｎｔｒｅｚ Ｐｕｂｍｅｄデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｋｅｚ／）を検索する。一致を検出するために、統合失調症遺伝子座の染色体位置を、遺伝子の遺伝子座と比較した。より詳細な分析のために、ヒトゲノムブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）またはヒトＥｎｓｅｍｂｌサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ_ ｓａｐｉｅｎｓ／）を使用して、正確な遺伝子の位置を所与の感受性領域についての最大有意性マーカーの位置と比較した。
結果
ＥＧＲタンパク質およびＥＧＲ結合タンパク質をコードする遺伝子の位置。ＥＧＲ遺伝子の変異が統合失調症の病因に寄与するかどうかを調査するために、４つの公知のヒトＥＧＲ遺伝子（ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、およびＥＧＲ４）の染色体位置を、正確に同定された統合失調症の感受性遺伝子座と比較した。４つ全てのＥＧＲ遺伝子の染色体位置は、本発明者らまたは他者のいずれかによって同定された正確にマッピングされた統合失調症遺伝子座と一致することが認められた。
上記のように、ＥＧＲ３は、本発明者らが統合失調症との関連を認めており、且つ確認された統合失調症の感受性遺伝子座内のＰＰＰ３ＣＣ遺伝子（図１）の１５０ｋｂ内の８ｐ２１．３に存在する（２〜８）。
ＥＧＲ２は、１０ｑ２１．３に存在する。本発明者らによって行われた多数の遺伝学研究により、この染色体領域の間に統合失調症との連鎖が検出された（実施例４）。
ＥＧＲ１は、別の確認された統合失調症の感受性遺伝子座内の５ｐ３１．２に存在する（８〜１３）。
ＥＧＲ４は、２ｐ１３−１４での推定統合失調症の感受性遺伝子座内の２ｐ１３．２に存在する（６、１４〜１５）。
したがって、４つ全てのＥＧＲ遺伝子ファミリーメンバーは、連鎖研究によって同定された推定統合失調症の感受性遺伝子座内に存在する。
実施例２：統合失調症患者におけるＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の配列研究
材料と方法
患者サンプル。本研究での使用に適切な患者サンプル（例えば、米国人および南アフリカ人の患者サンプル）は以前に記載されている（Ｌｉｕ Ｈ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｓｏｂｉｎ Ｃ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｇａｌｋｅ ＢＬ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＭＬ，Ｌｅｎａｎｅ Ｍ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｂ，Ｗｉｊｓｍａｎ ＥＭ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｍａｒ １９；９９（６）：３７１７−２２；Ｌｉｕ Ｈ，Ａｂｅｃａｓｉｓ ＧＲ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｋｎｏｗｌｅｓ Ａ，Ｄｅｍａｒｓ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＹＪ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｄｅｃ ２４；９９（２６）：１６８５９−６４）。１つのこのようなサンプル（成人型統合失調症（ＡＳ）サンプル）についての詳細な情報は、Ｓｏｂｉｎ，Ｃ．，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｍ．Ｌ．，Ｃｏｎｒｙ，Ａ．，Ｗｅｉｌｌｅｒ，Ｆ．，Ｇａｖｉｇａｎ，Ｃ．，Ｈａｉｍａｎ，Ｃ．＆ Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ，Ｍ．（２００１）Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｒｅｓ．１０１，１０１−１１３で提供されている。南アフリカ人サンプルは、本発明者らのアフリカーナ起源の統合失調症患者の継続的な収集物の一部であり、他の部分に詳述されている（Ｍ．Ｋ．，Ｍ．Ｔｏｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｂ．Ｒ．，Ｓ．Ｃ．Ｈ．，Ｍ．Ｌ．Ｂ．，Ｈ．Ｐｒｅｔｏｒｉｕｓ，Ｓ．Ｌａｙ，Ｊ．Ａ．Ｇ．，ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｒ．，未発表の研究）。両サンプルの発端者は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ Ｅｄ．（ＤＳＭ−ＩＶ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．（１９９４）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｍ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ））の統合失調症または統合失調性感情障害の生涯の基準を満たす。遺伝学研究のための診断インタビュー（ＤＩＧＳ）（Ｎｕｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５１，８４９−８５９）の使用によって特訓を受けた臨床家は参加者にインタビューを行った。ＣＯＳサンプルについての詳細な情報は、Ｕｓｉｓｋｉｎ，Ｓ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｃｈｉｌｄ Ａｄｏｌｅｓｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｆｙ ３８，１５３６−１５４３およびＮｉｃｏｌｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １５７，７９４−８００に記載されている。全ＣＯＳ発端者は、１３歳の誕生日前および精神病発症の平均年齢（１０．１歳）（±１．８歳）で精神病の症状を発症した統合失調症の未修正の基準をみたした。精神保健研究所（ＮＩＭＨ）サンプルを、ＮＩＭＨ人類遺伝学イニシアティブデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｚｏｒｋ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｎｉｍｈ）から得る。
ＰＣＲ／配列決定
コードおよび非コードエクソンを含むエクソン配列、プロモーター配列、およびいくつかのイントロン配列に及ぶゲノムフラグメントを増幅するためにＰＣＲプライマーをデザインした。ＵＣＳＣワーキングヒトドラフト部位で利用可能なヒトドラフト配列（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）を、全プライマーデザインのために使用する。各ＰＣＲプライマー対は、特定のゲノムフラグメントを増幅するようにデザインされた正方向および逆方向プライマーからなる。正方向ＰＣＲプライマーは、５’末端で１８ｂｐの正方向普遍的配列決定タグ：５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号４）と融合した１９〜２１ｂｐの相同配列を含む。逆方向ＰＣＲプライマーは、５’末端で１８ｂｐの逆方向普遍的配列決定タグ：５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号５）と融合した１９〜２１ｂｐの相同配列を含む。これにより、全ての配列決定反応を準備するためにこれらの２つのプライマーを使用して全ＰＣＲフラグメントを両方向で配列決定することが可能である。プログラミングされたＰＣＲテトラドマシン（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を使用してＰＣＲ反応を行う。ＯｐｔｉＰｒｉｍｅ １０×ＰＣＲ緩衝液６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、一定の反応を行う。適切なＯｐｔｉＰｒｉｍｅ緩衝液条件下での２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、４００ｎＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む２５μｌ反応混合物中で特定の配列を増幅する。ＰＣＲ増幅条件は以下である：９４℃で５分間の最初の変性、その後に以下の条件を３４サイクル：９４℃で４５秒間、適切なアニーリング温度（通常、６２．５℃）で６０秒間、７２℃で６０秒間の伸長；その後の７２℃で７分間の最終伸長工程。製造者の説明書にしたがって、１Ｍ ＧＣ融解物および４００ｎＭプライマーを含む２５μｌの反応物中で、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣゲノムポリメラーゼミックス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してＧＣリッチフラグメントを増幅する。ＧＣリッチＰＣＲ増幅は以下のように行う：９５℃で１分間の最初の変性、その後の以下の３４増幅サイクル：９４℃で３０秒間、６８℃で３分間；その後の６８℃で７分間の最終伸長工程。ＰＣＲフラグメントを２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製する。ＡＣＧＴ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ，ＩＬ）によって全配列決定反応を行う。
配列分析
ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用して配列分析を行う。患者の配列を、ＵＣＳＣウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）で利用可能なヒトゲノムドラフト配列と比較する。各フラグメントについて患者の配列およびヒトドラフト配列を含むコンティグを構築し、比較によって多型を同定する。
遺伝子型同定
遺伝子型同定のために使用される多型（例えば、ＳＮＰ、マイクロサテライトマーカー）は、直接配列決定によって同定されるか、ＮＣＢＩ ＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／およびＣｅｌｅｒａデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ／）、ＪＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃｊｐ／）、またはその他（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙｏｎ Ｄｅｍａｎｄ）にリンクしているＵＣＳＣワーキングヒトドラフト部位（ＵＲＬがｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／のウェブサイトを参照のこと）、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓサイト（ＵＲＬがｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｃａｒｄｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照のこと）を含むＳＮＰデータベースで見出される。挿入／欠失多型を、各被験体由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲによって分類し、アガロースゲル電気泳動によって評価したフラグメントサイズの変化によって同定する。制限エンドヌクレアーゼ部位が変化する一塩基多型（ＳＮＰ）を、制限フラグメント長多型遺伝子同定を使用して分類する（Ｌｉｕ Ｈ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｓｏｂｉｎ Ｃ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｇａｌｋｅ ＢＬ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＭＬ，Ｌｅｎａｎｅ Ｍ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｂ，Ｗｉｊｓｍａｎ ＥＭ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｍａｒ １９；９９（６）：３７１７−２２；Ｌｉｕ Ｈ，Ａｂｅｃａｓｉｓ ＧＲ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｋｎｏｗｌｅｓ Ａ，Ｄｅｍａｒｓ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＹＪ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｍａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｄｅｃ ９４，９９（２６）：１６８５９−６４）。簡単に述べれば、ＳＮＰにわたるフラグメントを、各被験体のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲによって増幅し、１０μｌのＰＣＲ産物を、製造者（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の仕様書にしたがって１５μｌの反応物中において関連制限酵素で消化する。消化された産物を、４％アガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウム染色によって視覚化し、Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で撮影する。Ｌｉｕ Ｈ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｓｏｂｉｎ Ｃ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｇａｌｋｅ ＢＬ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＭＬ，Ｌｅｎａｎｅ Ｍ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｂ，Ｗｉｊｓｍａｎ ＥＭ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｍａｒ １９；９９（６）：３７１７−２２；Ｌｉｕ Ｈ，Ａｂｅｃａｓｉｓ ＧＲ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｋｎｏｗｌｅｓ Ａ，Ｄｅｍａｒｓ Ｓ，ＣｈｅｎＹＪ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｄｅｃ ２４；９９（２６）：１６８５９−６４ および本明細書中に記載の他の参考文献で参照された刊行物に記載の蛍光偏光テンプレート依存性色素ターミネーター組み込み（ＦＰ−ＴＤＩ）遺伝子型同定を使用して制限部位を変化させないＳＮＰを遺伝子型同定する。
結果
統合失調症感受性に寄与し得る６つの遺伝子（ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子のいずれかをコードする遺伝子）中の潜在的な機能多型および関連研究のために使用することができる多型を同定するために、独立した統合失調症患者組から単離したゲノムＤＮＡ中のこれらの遺伝子のコード配列および非コードエクソンならびにいくつかのプロモーター領域を決定する。
配列決定ストラテジーは、配列決定すべき領域を対象とするフラグメントのＰＣＲ増幅およびその後のこれらのフラグメントの配列決定からなる。患者のゲノムＤＮＡ由来のエクソン配列およびいくつかのプロモーター配列にわたるフラグメントを増幅するようにＰＣＲプライマーをデザインし、全てのフラグメントを同一の２つのプライマーを使用して正方向および逆方向で配列決定することができるように普遍的配列決定プライマーでタグ化する。スプライスドナー部位およびレシピエント部位ならびにいくつかの場合に推定分岐部位を対象とするために各側面に少なくとも１００ｂｐの隣接イントロン配列を含むエクソンフラグメントを配列決定する。多型を同定するために、得られた配列を、ヒトドラフト配列と比較する。
実施例３：ＥＧＲ遺伝子およびＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の関連研究および関連の同定
材料と方法
関連分析
１つのＳＮＰおよび複数のＳＮＰハロタイプの伝達を、Ｔｒａｎｓｍｉｔプログラム（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｏｃｔ；６５（４）：１１７０−７）を使用した伝達不均衡試験によって分析する。列挙したＰ値は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｅ．ｃｉｍｒ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌａｙｔｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｒａｎｓｍｉｔ．ｔｘｔに記載のＴｒａｎｓｍｉｔプログラムによって計算した全意義レベルを示す。Ｔａｒｎｓｍｉｔプログラム（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｏｃｔ；６５（４）：１１７０−７）ＴＤＴ分析から得た全カイ二乗値からＰ値を計算する。あるいはまたはそれに加えて、Ｔｒａｎｓｍｉｔプログラムを使用した拡大伝達不均衡試験（ｅＴＤＴ）および／または血統伝達不均衡試験（ｐＴＤＴ）を使用して分析を行う。伝達不均衡を同定するためにデータを同様に分析する類似のプログラムまたは他の手段を使用することもできる。
結果
統合失調症の病因におけるＥＧＲ分子およびＥＧＲ相互作用分子の関与をさらに調査するために、候補遺伝子（例えば、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、および／またはＮＡＢ２）を、多数の罹患ファミリーを含むサンプルにおける疾患の関連について体系的に試験する。ＮＣＢＩ、Ｃｅｌｅｒａ、ＪＳＮＰデータベース、または他の供給源から得たさらなる一塩基多型（ＳＮＰ）を補足した直接配列決定（上記を参照のこと）によって同定された多型を使用する。ＥＧＲ１、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、およびＥＧＲ２についての分析で使用するための適切な多型を、表２、３、４、および５に列挙する。公知である場合、多型の名称および頻度を、個別のカラムまたは供給源を同定するカラムのいずれかに列挙する。名称は、便宜上使用される任意の識別名である。
Figure 2007528707
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最初に、多数の統合失調症の三徴候（ｔｒｉａｄ）（親および罹患した発端者）についての遺伝子型を、試験した全ての多型（以後、便宜上ＳＮＰと呼ぶ）に関して、米国人集団（Ｌｉｕ Ｈ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｓｏｂｉｎ Ｃ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｇａｌｋｅ ＢＬ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＭＬ，Ｌｅｎａｎｅ Ｍ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｂ，Ｗｉｊｓｍａｎ ＥＭ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｍａｒ １９；９９（６）：３７１７− ２２；Ｌｉｕ Ｈ，Ａｂｅｃａｓｉｓ ＧＲ，Ｈｅａｔｈ ＳＣ，Ｋｎｏｗｌｅｓ Ａ，Ｄｅｍａｒｓ Ｓ，Ｃｈｅｎ ＹＪ，Ｒｏｏｓ ＪＬ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ ＪＬ，Ｇｏｇｏｓ ＪＡ，Ｋａｒａｙｉｏｒｇｏｕ Ｍ．（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｄｅｃ ２４ ９９（２６）：１６８５９−６４）から採取した。次いで、任意の各ＳＮＰまたは複数の（例えば、２、３、４、および５）ＳＮＰの組み合わせの認められた伝達がサンプルにおける予想される値から逸脱しているかどうかを決定するためのスライドウィンドウストラテジーを使用したＴｒａｎｓｍｉｔプログラムを使用して、伝達不均衡試験（ＴＤＴ）を使用する。
少なくとも一定の頻度（例えば、３％）のハプロタイプを考慮し、全有意性を示すＰ値をＴＤＴ分析から得た全カイ二乗値から計算する。任意の個別または複数のＳＮＰ組み合わせについて予想される伝達との著しい乖離が認められた遺伝子を同定する。Ｐ＞０．０５であるが＜０．１が好ましいＳＮＰまたは複数のＳＮＰ組み合わせを、おそらく伝達不均衡および疾患との関連の傾向を示すと同定する。
一般に、任意の特定の遺伝子のサンプル回収物中の１つのＳＮＰまたは複数のＳＮＰハロタイプについて統計的に有意な伝達不均衡の所見により、この遺伝子と統合失調症との関連が証明される。このような結果は、遺伝子の機能活性の変化が統合失調症感受性に寄与するという証拠を提供し、調整（例えば、一過性および／または空間的活性パターンの増強、阻害、または変化）によって統合失調症を治療または防止するための治療アプローチを提供することができることが示唆される。このような結果は、遺伝子機能のモジュレーターのスクリーニングが統合失調症および関連障害の新規の療法の同定に有用であるという証拠をさらに提供する。
この研究での任意の特定の遺伝子の有意な伝達不均衡の検出の失敗は、これらの遺伝子と統合失調症との関連の欠如を必ずしも示さない。例えば、異なる遺伝子を異なる集団中の統合失調症と関連づけることができ、このような集団の研究により関連が明らかになる場合があり得る。全ハプロタイプブロックが望ましいように本明細書中に記載の分析の対象であるかどうかが現在不明であるので、確実に全遺伝子を示すためにこのような遺伝子についてより多くのＳＮＰを試験することも必要であり得る。さらに、現定数のファミリーではより弱いが有意な関連を検出するのに十分な検出力を有することができないので、より多くのファミリーの試験により関連が明らかとなり得る。さらに、いくつかの遺伝子は、変異またはゲノム不安定性（例えば、欠失）のレベルが高くなる傾向があり得る。これが真である場合、非常に頻繁に変異が起こり、特定のハプロタイプと関連しないようにヒト集団中で継続している。
任意の特定の遺伝子と統合失調症との関連をさらに調査するために、上記の最初の試験で関連が見出された任意のＳＮＰに関する遺伝子型同定を、好ましくは、試験の回収物およびより広い血統の両方を含むさらなるサンプルを使用して行う。種々の地理的位置から回収したサンプルを含むことが望ましい。スライドウィンドウストラテジーを使用したＴｒａｎｓｍｉｔプログラムを使用して決定したＴＤＴを再度使用して、任意の各ＳＮＰまたは複数の（２、３、４、および５つの）ＳＮＰの組み合わせで認められた伝達が組み合わせサンプルにおける期待値から逸脱しているかどうかを決定する。有意な伝達不均衡（Ｐ＜０．０５）を示すＳＮＰまたは複数のＳＮＰ組み合わせを同定する。有意性の高い伝達不均衡（例えば、Ｐ＜０．００１またはより低いＰ値）を特に留意する。
認められた伝達不均衡を駆動する２つまたはそれ以上のＳＮＰからなる特定の複数のＳＮＰハプロタイプを同定するために各ハプロタイプの伝達試験を行う。詳細には、統計的有意性の高い予想される頻度よりも高く伝達されたハプロタイプを同定する。このようなハプロタイプの同定により、関連遺伝子の変動が統合失調症感受性と関連し、特定のハプロタイプが統合失調症のリスクハプロタイプとして定義されることが強く示唆される。上記配列決定で同定することができる任意の患者のこの遺伝子のコード配列の変異が特に重要である。このようなＳＮＰは、いくつかの患者／ファミリーにおいて疾患感受性に寄与する機能変異を示し得る。
実施例４：ＥＧＲ２と統合失調症との関連の証明
本発明者らは、ＥＧＲ２と統合失調症との関連の可能性を調査するために多数の研究を行った。特に、特定の創始者集団サンプルにおける全ゲノム連鎖スキャンを行い、この染色体領域と統合失調症との連鎖を検出した。表５の左から３列目に示すように、１．７７および２．１８のＬｏｋｉ ＬＯＤスコアを得た。Ｌｏｋｉ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔａｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｔｈｏｍｐｓｏｎ／Ｇｅｎｅｐｉ／Ｌｏｋｉ．ｓｈｔｍｌ）は、Ｍａｒｋｏｖ ｃｈａｉｎ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ多点連鎖および分離分析を使用して巨大な血統で認められた定量的形質を分析するソフトウェアパッケージである。複数の遺伝子座によって形質を決定することができる。
この連鎖を、米国で回収したファミリーの独立したサンプルで複製した。ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｓ／ｐｍｏｒｋ／ｆｉｎａｌ_ｐｒｏｊｅｃｔ／ＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒ．ｈｔｍｌ）を使用して分析を行い、１．８４および２のノンパラメトリックＬＯＤスコアを得た（表５の左から４列目）。両研究において、ＥＧＲ２は、認められた連鎖のピークマーカーに隣接した６３，９１６，３５９位〜６３，９２０，７１８位に存在する。２１０の試験からなる第３の独立したサンプルにおけるマイクロサテライトマーカーおよび一塩基多型を使用した分析により、ＥＧＲ２遺伝子の周辺で２つのマイクロサテライトマーカーと２つのＳＮＰとの関連についての僅かに有意な証拠が得られた（表５、最も右の列）。詳細には、ハプロタイプベースのハプロタイプ相対リスク（ＨＨＲＲ）における０．００１および０．００４のＰ値が２つのマイクロサテライトマーカーから得られ、２つのＳＮＰについて０．０５のＨＨＲＲのＰ値を得た（表５）（ｎｓ＝有意でない）。
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実施例５：統合失調症の動物モデルにおける候補化合物の試験
材料と方法
本実施例は、統合失調症を連想させる表現型を緩和する（例えば、試験で測定したパラメーターをより正常な値に修正する）試験化合物（例えば、上記のスクリーニング法にしたがって同定した化合物）の能力を評価するために実施することができる試験を説明する。さらなる試験（例えば、造巣行動の評価、潜在阻害の評価、および変動）も使用することができる。
動物および実験デザイン
統合失調症の動物モデルにおいて統合失調症を連想させる表現型を緩和するかどうか決定するために、ＥＧＲ機能活性を調整する候補化合物の能力を決定する。化合物は、１つまたは複数の標的遺伝子（その転写がＥＧＲ ＤＮＡ結合部位から駆動される合成レポーター遺伝子が含まれる）の転写を刺激または抑制する１つまたは複数ＥＧＲタンパク質の能力を増減することができる。例えば、候補化合物は、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、および／またはＥＧＲ３のＮＡＢ１および／またはＮＡＢ２との結合を破壊することができる。本明細書中に記載のように候補化合物を同定する。
適切な動物モデルには、Ｚｅｎｇ，Ｈ．，Ｃｈａｔｔａｒｊｉ，Ｓ．，Ｂａｒｂａｒｏｓｉｅ，Ｍ．，Ｒｏｎｄｉ−Ｒｅｉｇ，Ｌ．，Ｐｈｉｌｐｏｔ，Ｂ．Ｄ．，Ｍｉｙａｋａｗａ，Ｔ．，Ｂｅａｒ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｓ．，Ｆｏｒｅｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｍｐａｉｒｓ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｗｏｒｋｉｎｇ／ｅｐｉｓｏｄｉｃ−ｌｉｋｅ ｍｅｍｏｒｙ，Ｃｅｌｌ，１０７（２００１）６１７−２９に詳述の前脳特異的カルシニュリンノックアウトマウス（ＣＮ変異体）が含まれる。他の適切な動物モデルを使用することもできる（上記を参照のこと）。
化合物の投与
静脈内注射、経口、または脳への注射によって、マウス群に滅菌溶媒中に溶解した種々の用量の候補化合物を投与するか、溶媒のみ（コントロールマウス）を投与する。単回用量または複数回用量の化合物のいずれかの投与後の種々の測定低で試験を行う。
運動機能試験
ロータロッド試験を使用して運動神経およびバランスを試験する。加速ロータロッド（ＵＧＯ Ｂａｓｉｌｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｒｏｔａｒｏｄ）を使用してロータロッド試験を行い、これは、マウスの回転ドラム（直径３ｃｍ）上への配置および各動物がロッド上でバランスを保つことができる時間の測定からなる。ロータロッドの速度を、５分間で４〜４０ｒｐｍに加速する。
対象探査試験
この試験は、５回の試験（１０分／試験）からなる。マウスを透明なホワイトプレキシグラス製のボックス（４０×４０×３０ｃｍ）に入れ、１日目（試験１）は自由に探索させ、２日目（試験２）は目的物（ｏｂｊｅｃｔ）を用いない。３日目に、マウスを２つの同一の目的物（目的物Ａ；試験３）が存在するボックス中にマウスを入れる。試験３の１０分後、目的物の１つを新規の目的物（目的物Ｂ）と置換し、マウスに２つの異なる目的物（目的物Ａおよび目的物Ｂ；試験４）を含むボックスを探査させる。翌日、目的物Ｂを別の新規の目的物（目的物Ａおよび目的物Ｃ；試験５）と置換する。
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータに接続したカラーＣＣＤカメラ（Ｓｏｎｙ ＤＸＣ−１５１Ａ）を使用して、挙動をモニタリングする。自発運動、各動物が物体周辺で過ごした時間、およびフィールドの中央部分で過ごした時間を記録する。物体周辺の目的の領域（ＲＯＩ）を、物体の位置の中心から直径８ｃｍの円と定義する。マウス画像の中心が各物体について定義されたＲＯＩの範囲内である場合、マウスは「物体の周辺に」いると見なされる。Ｉｍａｇｅ ＯＥソフトウェアを使用して、分析を自動で行う（「画像分析」を参照のこと）。物体に対する記憶の指数としての認識指数（ＲＩ）を、（ｔＢ／（ｔＡ＋ｔＢ））／１００と定義する。
オープンフィールド試験
各被験体を、オープンフィールド装置（４０ ｘ ４０ ｘ ３０ ｃｍ； Ａｃｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）の中心に配置する。各試験後にこの装置を水で洗浄する。全移動距離（ｃｍ）、垂直運動、中心で過ごした時間、エピソードの数および持続時間、ならびに常同行動のビームブレーキ数を記録する。６０分間データを収集した。
ホットプレート試験
ホットプレート試験を使用して、疼痛刺激に対する感受性を評価する。マウスを５５．０（±０．３）℃のホットプレート（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）に配置し、最初の後肢反応時間を記録する。後肢反応は、足の震えまたは足を舐める行為のいずれかである。
明／暗移行試験
明／暗移行試験で使用した装置は、小さな開口部を含む黒色の仕切りによって同一サイズの２つの区域に分割されたケージ（２１×４２×２５ｃｍ）（Ｏ'Ｈａｒａ & Ｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）からなる。１つのチャンバーを明るく照らす一方で、他方のチャンバーを暗くする。マウスを照射側に配置し、１０分間２つのチャンバーを自由に移動させる。各試験後にチャンバーを水で洗浄する。総移行数、暗所で過ごした時間、および移動距離を、Ｉｍａｇｅ ＬＤ４ソフトウェア（「画像分析」を参照のこと）によって記録する。
社会的相互作用試験
異なるケージに収容した同一遺伝子型の２匹のマウスを共にボックス（４０×４０×３０ｃｍ）に配置し、１０分間自由に探索させる。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータに接続したＣＣＤカメラ（Ｓｏｎｙ ＤＸＣ−１５１Ａ）を使用して、社会的行動をモニタリングする。Ｉｍａｇｅ ＳＩソフトウェアを使用して、分析を自動で行う（「画像分析」を参照のこと）。接触数、接触あたりの平均持続時間、および総移動距離を測定する。
潜在抑制試験
訓練日（１日目）に、各マウスをショッキングチャンバー（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）（ボックスＡ）に配置する。マウスを以下の２つの群に分割する：予備曝露群（Ｐ群）および非予備曝露群（ＮＰ群）。Ｐ群に４０トーン（６８ｄＢ、持続時間：５秒、刺激間隔：２５秒）を与え、ＮＰ群には同期間刺激を与えない。チャンバーへのトーン予備曝露または曝露直後に、０．４０ｍＡで２秒間のフットショック（ＵＳ）で同時終結した５秒間のホワイトノイズトーン（ＣＳ）からなるトーン−ショック対を、２５秒間の刺激間隔で両群に送達する。その後、マウスを２５秒間保持し、その後ホームケージに戻す。２日目に、状況に対する静止（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）の測定のために、マウスをボックスＡに５分間配置する。３日目に、マウスをホワイトプレキシグラス製のチャンバー（ボックスＢ）に入れ、１８０秒後、指示した静止を測定するために１８０秒間トーンを送達する。
プレパルス抑制試験
驚愕反射測定システム（ＭＥＤ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，ＶＴ）を使用する。マウスをプレキシグラス製のシリンダーに配置して５分間撹乱しないことによって、試験活動を始める。驚愕刺激として使用したホワイトノイズの持続時間は、全試験型で４０秒である。プレパルス刺激から開始して１６０ｍ秒間（反応を１ｍ秒後とに測定する）驚愕反応を記録する。各チャンバー中のバックグラウンドノイズレベルは、７０ｄＢである。１６０ｍ秒のサンプリングウィンドウの間に記録されたピーク驚愕振幅を従属変数として使用する。試験活動は、６つの試験型（すなわち、驚愕刺激のみの試験については２つの型、プレパルス抑制試験については４つの型）からなる。驚愕刺激の強度は、１００、１０５、１１０、または１２０ｄＢである。驚愕刺激前に１００ｍ秒間プレパルス音を与え、その強度は７４ｄＢまたは７８ｄＢであった。プレパルス刺激および驚愕刺激の４つの組み合わせを使用した（被験体の最初のバッチおよび被験体の第２のバッチの第１の試験については、７４〜１１０、７８〜１１０、７４〜１２０、および７８〜１２０；動物の第２のバッチの第２の試験については、７４〜１００、７８〜１００、７４〜１０５、および７８〜１０５）。６つの試験型の６つのブロック（プレパルスと驚愕刺激との組み合わせを使用した４つの試験型および２つの驚愕刺激のみの試験）を、各試験型をブロック内で１回与えられるような疑似乱数順序で与える。平均試験間隔は、１５秒である（範囲：１０〜２０秒）。
Ｐｏｒｓｏｌｔ強制水泳試験
装置は、４つのガラスビーカー（高さ１５ｃｍ×直径１０ｃｍ）からなる。マウスが互いを認識するのを防止するために、シリンダーを不透明のパネル互いに分離する。シリンダーを、７．７ｃｍの高さまで水（２３℃）で満たす。マウスをシリンダーに配置し、１０分間の試験期間でその挙動を記録する。Ｉｍａｇｅ ＰＳソフトウェアを使用して、データの収集および分析を自動で行う（「画像分析」を参照のこと）。保存した画像ファイルを使用して、Ｉｍａｇｅ ＯＦソフトウェア（「画像分析」を参照のこと）によって移動距離を測定する。
造巣の定量
デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｅ，ＮＹ）を使用して造巣写真を撮影し、コンピュータにエクスポートする。ＮＩＨ画像プログラムを使用して、各ケージについてのｎｅｓｔｌｅｔの散在粒子数を計数する（「画像分析」を参照のこと）。
画像分析
挙動研究のために使用した全てのアプリケーション（ＩｍａｇｅＳＩ、ＩｍａｇｅＯＥ、ＩｍａｇｅＬＤ４、ＩｍａｇｅＰＳ、ＩｍａｇｅＯＦ、およびＩｍａｇｅＦＺ）を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータで実行する。アプリケーションは、公的ドメインであるＮＩＨ画像プログラム（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ ＨｅａｌｔｈのＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄによって開発され、インターネットのｈｔｔｐ ： ／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／で利用可能）に基づき、Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｍｉｙａｋａｗａによって各試験のために修正している（Ｏ'Ｈａｒａ ａ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎから利用可能）。
統計分析
ＳｔａｔＶｉｅｗ （ＳＡＳ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはＳＡＳ（ＳＡＳ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して統計分析を行う。両側ｔ検定、二元配置の分散分析、または二元配置の反復測定による分散分析によって、データを分析する。表およびグラフ中の値は、平均±ＳＥＭとして示す。
結果
活動および挙動の種々の態様を評価するために、ＣＮ変異マウス（例えば、ＣＮ前脳特異的ノックアウトマウス）または統合失調症のための他の動物モデル（本実施例では、「モデルマウス」という）を候補化合物または溶媒の投与後に一連の試験に供する。これらの試験統合失調症および他の精神障害を罹患したヒト被験体で変化した活動および挙動の態様を反映する。候補化合物を投与していないマウスは、統合失調症および／または関連障害に特徴的な表現型を示す挙動および／または活動の種々の異常を示す。１つまたは複数のこれらの異常を緩和する（例えば、より正常な値にパラメーターを修正する）候補化合物の能力を、コントロール（非投与）モデルマウスと種々の用量の候補化合物を投与したモデルマウスとの関連パラメーターの比較によって決定する。関連パラメーターに対する化合物の効果を、野生型マウス（例えば、モデルマウスと類似遺伝子を有する野生型マウス）でも評価する。マウスを、標準的な方法による毒性の一般的徴候および統合失調症を連想させる挙動および／または活動の異常を同定するようにデザインした試験におけるその性能についてもモニタリングする。
自発運動、常同行動、無生物に対する探索行動
種々の異なる試験を使用して自発運動を測定する。例えば、物体探索時のより長い総移動距離および社会的相互作用試験によって示される多動表現型は、一般に、モデルマウスで特徴的である。オープンフィールド試験における垂直運動数および常同行動の数および／または持続時間もまた、野生型と比較してモデルマウスで有意に増加し得る。モデルマウスの自発運動および／または常同行動のエピソード数を修復するための挙動および／または活動を修正する化合物の能力を、化合物を投与しているか投与していないモデルマウスにおけるこのようなエピソードの数の計数によって決定する。野生型マウスにおけるこのパラメーターに対する化合物の効果も評価する。
モデルマウスにおける物体付近で過ごした時間は、野生型マウスよりも有意に長くあり得る。物体付近で過ごす時間をより正常な値に修復するために挙動および／または活動を修正する化合物の能力を、化合物を投与しているか投与していないモデルマウスについてのこの時間の測定によって決定する。野生型マウスにおけるこのパラメーターに対する化合物の効果も評価する。モデルマウスおよび野生型マウスにおける認識指数パラメーターに対する化合物の効果を評価する。
化合物を投与しているか投与していないモデルマウスおよび野生型マウスにおける前記パラメーターの比較によって、Ｐｏｒｓｏｌｔ強制水泳試験における移動距離および姿勢を固定されて過ごした時間によって評価した「行動の諦め（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｓｐａｉｒ）」に対する化合物の効果を決定する。
社会的相互作用の減少および不安様挙動の増加
モデルマウスはオープンフィールド装置の中心領域中で有意に短時間滞在し得るが、これは一般に不安の増加と見なされる（Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．，Ｗｈａｔ'ｓ Ｗｒｏｎｇ Ｗｉｔｈ Ｍｙ Ｍｏｕｓｅ? Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００．）。明／暗移行試験では、２つの区画間の移行数は、野生型マウスと比較してモデルマウスで有意に減少し得る。移行数は、照射区画の滞在期間よりも良好な不安測定であると見なされている（Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．，Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｎｘｉｅｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｂｉｏｂｅｈａｖ Ｒｅｖ，９ （１９８５）３７−４４）。自発運動の経過時間をより正常な値に修復するために挙動および／または活動を修正する化合物の能力を、化合物を投与しているか投与していないモデルマウスにおける粒子を計数したこれらのパラメーターの試験によって決定する。野生型マウスにおけるこれらのパラメーターに対する化合物の効果も評価する。
社会的相互作用試験では、モデルマウスの社会的接触数は、野生型マウスよりも少なく、そして／または総接触持続時間および平均接触持続時間は野生型マウスよりも有意に短くあり得る。社会的接触数をより正常な値に修復するための挙動および／または活動を修正する化合物の能力を、化合物を投与しているか投与していないモデルマウスにおいて決定する。野生型マウスにおけるこのパラメーターに対する化合物の効果も評価する。
プレパルス抑制障害
プレパルス抑制率（感覚運動ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）の指数）を変化させることができる（例えば、これは、野生型マウスよりもモデルマウスで有意に低くあり得る）。プレパルス抑制率をより正常な値に修復するために挙動および／または活動を修正する化合物の能力を、化合物を投与しているか投与していないモデルマウスにおけるプレパルス抑制との比較によって決定する。野生型マウスにおけるこのパラメーターに対する化合物の効果も評価する。
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図１は、関連する連鎖研究によるＰＰＰ３ＣＣおよびマーカーに関するＥＧＲ３のゲノムでの位置を示す図である。ＰＰＰ３ＣＣは、ヌクレオチド２２６５１２２８−２２７５１３１２位の８ｐ２１．３に存在し、ＥＧＲ３はヌクレオチド２２８９８４０１−２２９０３９８３位の８ｐ２１．３に存在する。Ｄ８Ｓ１３６［Ｐｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５（２）］は、ヌクレオチド２２７８５９５６位に存在し；Ｄ８Ｓ１７７１［Ｂｌｏｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８（４）；Ｇｕｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１（５）］は、ヌクレオチド２５７９４６４４位に存在し；Ｄ８Ｓ１７５２［Ｂｌｏｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８（４）］はヌクレオチド２３０２２２０６位に存在し；Ｄ８Ｓ１７１５、Ｄ８Ｓ１３３［Ｋｅｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６（３）］はヌクレオチド２２３２１１７０位および１９８４９２９２位にそれぞれ存在する。全ヌクレオチド位置は、２００２年１１月のヒトドラフト配列に由来する。 図２は、関連する連鎖研究によるマーカーに関するＥＧＲ１のゲノムでの位置を示す図である。ＥＧＲ１は、ヌクレオチド１３７８３２０４４−１３７８３５８６７位の５ｑ３１．２に存在する。Ｄ５Ｓ８０４およびＤ５Ｓ３９３［Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．（９）］は、ヌクレオチド１２５２１６２３７位および１３５７３２３７０位にそれぞれ存在する。ＩＬ９およびＤ５Ｓ３９９［Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．（１０）］は、ヌクレオチド１３５２６２３７９位および１３５９９４３８０位にそれぞれ存在する。Ｄ５Ｓ４１４［Ｐａｕｎｉｏ ｅｔ ａｌ．（１１）］はヌクレオチド１３７７０９５１７位に存在し、ＣＳＦ１Ｒ［Ｈｏｖａｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１２）］は、ヌクレオチド１４９４３８９７９位に存在する。全ヌクレオチド位置は、２００３年４月のヒトドラフト配列に由来する。 図３Ａは、ＥＧＲ転写因子ファミリーの４つのメンバーのアラインメントを示す略図である（３０から適合）。３つの亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを標識し、黒で示す。ＮＡＢ（ＮＧＦＩ−Ａ）結合タンパク質に結合し、且つＥＧＲ４中に存在しないＲ１抑制ドメインを灰色で示す。図３Ｂは、仮説標的遺伝子上流の標準的なＥＧＲ応答エレメント（ＲＥ）に結合するＥＧＲファミリーメンバーを示す略図である（３０から適合）。 ＮＡＢ１およびＮＡＢ２内に存在する２つの保存されたＮＣＤ１およびＮＣＤ２ドメインの位置を示すＮＡＢ１の略図を示す（６８から適合）。ＮＣＤ１はＲ１ドメインを含むＥＧＲファミリーメンバーへの結合を介在する。ＮＣＤ２は、ＥＧＲ介在性トランス活性化を抑制すると考えられる。

Claims (95)

  1. （ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、
    （ｉｉ）該サンプル中の、ＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の、コード部分または非コード部分中の多型の多型性変異型を検出するか、このような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法。
  2. 前記遺伝子またはその一部が統合失調症の感受性遺伝子座と一致する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子座が遺伝的に同定された遺伝子座である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記多型が、ＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の、コード部分または非コード部分で生じる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記多型が、前記遺伝子のコード部分で生じる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記多型性変異型により、前記遺伝子によってコードされるＥＧＲタンパク質またはＥＧＲ相互作用分子のアミノ酸配列が変化する、請求項５に記載の方法。
  7. 前記多型がＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子に連結されたゲノム領域で生じる、請求項１に記載の方法。
  8. 前記多型が前記遺伝子に遺伝的に連結している、請求項７に記載の方法。
  9. 前記遺伝子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
  10. 前記多型が、表２、３、４、および５のいずれかに列挙されたマーカーから選択される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記サンプル中の、ＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする１つまたは複数の遺伝子の、コード部分または非コード部分またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域中の、複数の多型の多型性変異型を個別または並行して検出するために前記方法を行う、請求項１に記載の方法。
  12. 前記検出工程が、前記サンプルをオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程を含み、ここで、該アレイが、サンプル中のＥＧＲ分子をコードするかＥＧＲ相互作用分子をコードする１つまたは複数の遺伝子の、コード部分または非コード部分、またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域中の、複数の多型の多型性変異型を特異的に検出するようにデザインした複数のオリゴヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記複数の多型が統合失調症のリスクハプロタイプを含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
  14. 少なくとも１つの多型が、表２、３、４、または５のいずれかに列挙したマーカーから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記検出工程が、前記サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、ここで、該オリゴヌクレオチドが、多型の多型性変異型を特異的に検出または増幅するようにデザインされている、請求項１に記載の方法。
  16. 前記検出工程が、前記サンプルをオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程を含み、ここで、該アレイが、多型の多型性変異型を特異的に検出するようにデザインされた１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  17. 多型性変異型が統合失調症リスクの増加に関連する場合、前記被験体が統合失調症に感受性を示すかこれに罹患していると決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. （ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、
    （ｉｉ）正常な被験体から得たサンプル中で予想されるＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性と比較した、該サンプル中のＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現または活性の変化または変動を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法。
  19. 前記変化または変動が、ＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードするｍＲＮＡの存在の増減またはＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子の存在の増減を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記変化または変動により、ＥＧＲ標的遺伝子の転写が増減する、請求項１８に記載の方法。
  22. （ｉ）統合失調症または統合失調症感受性について試験すべき被験体から得たサンプルを提供する工程と、
    （ｉｉ）該サンプル中の、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の変化または変動を検出する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の診断方法。
  23. 前記変化または変動が、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子のアミノ酸配列、サイズ、または組織もしくは細胞内分布の変化または変動を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記検出工程が、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子と特異的に結合する抗体の使用を含む、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記検出工程が、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の変異型に特異的に結合する抗体を使用する工程を含み、該変異型の存在が、統合失調症の感受性または存在を示す、請求項２２に記載の方法。
  27. 統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を提供する工程と、
    ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を調整する化合物を該被験体に投与する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法。
  28. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を増大させる、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を減少させる、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性を調整する、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性を増大させる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性を減少させる、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を調整する、請求項２７に記載の方法。
  34. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を増大させる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を減少させる、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記化合物が前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子に結合する、請求項２７に記載の方法。
  37. 前記化合物がＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の第２の分子への結合を妨害する、請求項２７に記載の方法。
  38. 前記化合物がＥＧＲ分子とＮＡＢ１またはＮＡＢ２のいずれかとの結合を妨害する、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
  40. 前記投与工程が、遺伝子療法ベクターの前記被験体への導入を含む、請求項２７に記載の方法。
  41. 前記遺伝子療法ベクターが、ＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードする核酸またはＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子の標的遺伝子の発現産物を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 請求項１に記載の方法または任意の他の適切な方法を使用して、統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を同定する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  43. ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子中またはこれに連結する１つまたは複数の多型を同定する工程と、
    統合失調症を罹患した被験体から得たサンプルを含むサンプル組を提供する工程と、
    該多型の１つまたは複数の変異型の統合失調症との連鎖または関連について、該サンプルを試験する工程と、
    該連鎖または関連が、該多型の１つまたは複数の変異型と統合失調症の感受性との間で存在する場合、該多型が統合失調症の診断で有用と同定する工程を含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の診断に有用な多型の同定方法。
  44. ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子中またはこれに連結する多型を同定する工程と、
    該多型の多型性変異型が統合失調症に対する感受性に連鎖または関連することを決定する工程と、
    統合失調症を罹患した１人または複数の被験体から得たサンプル中の、該遺伝子および任意選択的な該遺伝子の調節領域を配列決定する工程と、
    得られた配列を、同じ遺伝子の正常配列または野生型配列と比較する工程と、
    該配列決定工程で得た配列が、該正常配列または野生型配列と異なる場合、該多型性変異が、統合失調症の原因となるかまたは寄与する変異を示すと同定する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性に寄与するか原因となる変異の同定方法。
  45. ＥＧＲ分子およびＥＧＲレポーターを含む生物学的な系を提供する工程と、
    該生物学的な系を化合物と接触させる工程と、
    該化合物の存在下での該レポーターの転写応答を、前記化合物の非存在下での応答または予想される応答と比較する工程と、
    該化合物の存在下での転写応答が該化合物の非存在下で生じるか生じると予想される転写応答と異なる場合、該化合物を、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための候補化合物と同定する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための候補化合物の同定方法。
  46. 前記生物学的な系が細胞または細胞集団である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記生物学的な系がＮＡＢ分子をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  48. ＥＧＲ分子および内因性ＥＧＲモジュレーターを含む生物学的な系を提供する工程と、
    該生物学的な系を化合物と接触させる工程と、
    該化合物の存在下での該ＥＧＲ分子および内因性ＥＧＲモジュレーターの結合の範囲または速度を、該化合物の非存在下で生じるか生じると予想される結合の範囲または速度と比較する工程と、
    該化合物の存在下での該ＥＧＲ分子および内因性ＥＧＲインヒビターの結合の範囲または速度が、該化合物の非存在下で生じるか生じると予想される結合の範囲または速度と異なる場合、該化合物を、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための候補化合物と同定する工程を含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療のための候補化合物の同定方法。
  49. 前記内因性ＥＧＲモジュレーターがＮＡＢタンパク質である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記比較工程が２つまたは３つのハイブリッドスクリーニングを行う工程を含む、請求項４８に記載の方法。
  51. ＥＧＲ分子の分子構造を提供する工程と、
    該ＥＧＲ分子に結合するかＥＧＲ分子のＥＧＲ相互作用分子への結合を防止すると予想される構造を同定する工程と、
    統合失調症または統合失調症感受性の治療のための候補化合物などの構造を有する化合物を選択する工程とを含む、統合失調症または統合失調症感受性の治療のための候補化合物の同定方法。
  52. 統合失調症の動物モデルまたは統合失調症のリスクがあるかこれに罹患しているヒト被験体で、前記化合物を試験する工程をさらに含む、請求項４５、請求項４８、または請求項５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 被験体を提供する工程と、
    候補化合物を該被験体に投与する工程であって、ここで、該候補化合物がＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の活性または存在を調整する、工程と、
    該被験体における表現型の重症度または発生率を、前記候補化合物が投与されない被験体で存在するか存在すると予想される表現型の重症度または発生率と比較する工程と、
    該被験体における表現型の重症度または発生率が、該化合物を投与していない被験体で存在するか存在すると予想されるものよりも低い場合、該候補化合物を、統合失調症または統合失調症感受性の治療のための化合物と同定する工程とを含む、統合失調症の治療のための化合物の同定方法。
  54. 統合失調症を連想させる１つまたは複数の表現型のリスクがあるかこれを示す被験体を提供する工程であって、ここで、該被験体が、少なくとも１つのＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子またはこのような分子をコードする遺伝子が変化している、工程と、
    該被験体に候補化合物を投与する工程と、
    該被験体における表現型の重症度または発生率を、該候補化合物が投与されない被験体で存在するか存在すると予想される表現型の重症度または発生率と比較する工程と、
    該被験体における表現型の重症度または発生率が、前記化合物を投与していない被験体で存在するか存在すると予想されるものよりも低い場合、該候補化合物を、統合失調症または統合失調症感受性の治療のための化合物と同定する工程とを含む、統合失調症の治療のための化合物の同定方法。
  55. 前記変化が発現レベルまたは発現パターンの変化である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記変化がアミノ酸配列の変化である、請求項５４に記載の方法。
  57. 前記被験体がＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子の多型性変異型を示し、該変異型の存在が、統合失調症を連想させる１つまたは複数の表現型と関連する、請求項５４に記載の方法。
  58. 前記被験体がマウスである、請求項５４に記載の方法。
  59. 前記被験体がヒトである、請求項５４に記載の方法。
  60. 前記被験体が遺伝子操作されている、請求項５４に記載の方法。
  61. 前記被験体が、ＥＧＲ分子およびＥＧＲ相互作用分子からなる群より選択される少なくとも２つの分子の変化を有する、請求項５４に記載の方法。
  62. 前記被験体が、少なくとも１つのＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の発現を欠損している、請求項５４に記載の方法。
  63. 誘導体が、任意選択的に生物学的利用能を増大させるか、血液脳関門を通過する能力を増大させるか、安全プロフィールを改善させる、請求項４５、請求項４８、請求項５１、請求項５３、または請求項５４のいずれか１項に記載の方法にしたがって同定した化合物またはその誘導体。
  64. 請求項６３に記載の化合物と、
    薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物。
  65. 統合失調症のリスクがあるかこれに罹患している被験体を提供する工程と、
    請求項６４に記載の任意の薬学的組成物を単独または統合失調症もしくは統合失調症感受性の治療のための第２の化合物またはこのような化合物の副作用を軽減する化合物と同時に被験体に投与する工程とを含む、統合失調症または統合失調症に対する感受性の治療方法。
  66. 請求項１に記載の方法にしたがって、前記被験体を、統合失調症のリスクがあるかこれに罹患していると同定する工程をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 遺伝子またはその一部が統合失調症の感受性遺伝子座と一致する、ＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分もしくは非コード部分中の多型の天然に存在する多型性変異型、またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型を、特異的に検出するかまたは増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチド。
  68. 前記遺伝子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項６７に記載のオリゴヌクレオチド。
  69. 前記多型が、表２、３、４、および５のいずれかに列挙されたマーカーから選択される、請求項６８に記載のオリゴヌクレオチド。
  70. 遺伝子またはその一部が統合失調症の感受性遺伝子座と一致する、ＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分もしくは非コード部分中に多型部位を含む天然に存在する核酸領域、またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型の多型性変異型を、特異的に検出または増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチド。
  71. 前記統合失調症の感受性遺伝子座が遺伝的に同定される、請求項７０に記載のオリゴヌクレオチド。
  72. 前記遺伝子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項７０に記載のオリゴヌクレオチド。
  73. 前記多型が、表２、３、４、および５のいずれかに列挙されたマーカーから選択される、請求項７２に記載のオリゴヌクレオチド。
  74. 前記オリゴヌクレオチドが多型性部位のいずれか側の反対のＤＮＡ鎖とハイブリッド形成する、請求項６７または請求項７０に記載のオリゴヌクレオチド対。
  75. 請求項６７または請求項７０に記載のオリゴヌクレオチドならびに包装、使用説明書、緩衝液、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、酵素、ポジティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールサンプル、およびネガティブコントロールプライマーまたはプローブからなる群より選択される１つまたは複数の品目を含むキット。
  76. 請求項６７または請求項７０に記載の複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイ。
  77. 前記オリゴヌクレオチドが、複数の異なる多型部位で多型性変異型を検出する、請求項７６に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
  78. 請求項７６に記載のオリゴヌクレオチドアレイならびに包装、使用説明書、緩衝液、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、酵素、ポジティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールサンプル、およびネガティブコントロールプライマーまたはプローブからなる群より選択される１つまたは複数の品目を含むキット。
  79. ３’側の天然に存在する多型部位のすぐ隣りのヌクレオチド位置で終結し、この部位から５’方向に少なくとも８個且つ１００個未満のヌクレオチドが伸長するプライマーであって、該多型性部位が、ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分または非コード部分中の多型部位であるか、このような遺伝子に連結したゲノム領域中の多型部位である、プライマー。
  80. 前記遺伝子またはその一部が統合失調症の感受性遺伝子座と一致する、請求項７９に記載のプライマー。
  81. 前記統合失調症の感受性遺伝子座が遺伝的に同定される、請求項８０に記載のプライマー。
  82. 前記遺伝子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項８０に記載のプライマー。
  83. 前記多型が、表２、３、４、および５のいずれかに列挙されたマーカーから選択される、請求項８０に記載のプライマー。
  84. 前記プライマーが、前記多型性部位の位置に隣接する反対のＤＮＡ鎖とハイブリッド形成する、請求項７９に記載のプライマー対。
  85. 請求項７９に記載のプライマーならびに包装、使用説明書、緩衝液、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、酵素、ポジティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールサンプル、およびネガティブコントロールプライマーまたはプローブからなる群より選択される１つまたは複数の品目を含むキット。
  86. ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子をコードする転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子。
  87. 前記ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子が統合失調症の感受性遺伝子座と一致する遺伝子によってコードされる、請求項８６に記載のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子。
  88. 前記統合失調症の感受性遺伝子座が遺伝的に同定される、請求項８７に記載のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子。
  89. 前記分子がこのような転写物の多型性変異型をコードする転写物を選択的または特異的にターゲティングし、被験体中の前記多型性変異型の存在が統合失調症の感受性または存在を示す、請求項８６に記載のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子。
  90. 前記転写物が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される分子をコードする、請求項８６に記載のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子。
  91. 請求項８６に記載のｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子ならびに包装、使用説明書、緩衝液、ポジティブコントロールサンプル、およびネガティブコントロールｓｉＲＮＡまたはｓＲＮＡからなる群より選択される１つまたは複数の品目を含むキット。
  92. ＥＧＲ分子またはＥＧＲ相互作用分子の変異型に特異的に結合する抗体であって、カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子が、多型性変異型を含む遺伝子によってコードされ、被験体中の該多型性変異型の存在が、統合失調症に対する感受性またはその存在を示す、抗体。
  93. 前記カルシニュリンサブユニットまたはカルシニュリン相互作用分子が、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＮＡＢ１、およびＮＡＢ２からなる群より選択される、請求項９２に記載の抗体。
  94. 請求項９２に記載の抗体ならびに包装、使用説明書、緩衝液、基質、二次抗体、酵素、ポジティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールサンプル、およびネガティブコントロール抗体からなる群より選択される１つまたは複数の品目を含むキット。
  95. コンピュータ読み取り可能媒体に保存された多型性配列のリストを含むデータベースであって、該多型性配列が、ＥＧＲ分子もしくはＥＧＲ相互作用分子をコードする遺伝子のコード部分もしくは非コード部分またはこのような遺伝子に連結したゲノム領域で生じ、該リストが、統合失調症または統合失調症に対する感受性の遺伝子診断の実施、または統合失調症または統合失調症に対する感受性の遺伝子研究の実施で有用であると同定された多型に、大部分が制限されるかまたは完全に制限される、データベース。
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