JP4846990B2

JP4846990B2 - アディポネクチン分泌促進剤

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Publication number: JP4846990B2
Application number: JP2004143282A
Authority: JP
Inventors: 俊博秋久; 柾樹小林; 千絵東尾; 哲高橋
Original assignee: 株式会社テラ・ブレインズ
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2004-05-13
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2024-05-13
Also published as: JP2005068132A

Description

本発明は、アディポネクチン分泌促進剤、並びに該アディポネクチン分泌促進剤を含有する抗動脈硬化剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤、食品添加剤、機能性食品及び飼料添加剤に関する。

近年、食生活をはじめとする生活環境の変化や高齢化に伴い、虚血性心疾患、脳血管障害、慢性閉塞性動脈硬化症等の動脈硬化性疾患が急増している。動脈硬化性疾患は、遺伝的背景に糖尿病、高脂血症、高血圧症、喫煙、感染等の動脈硬化危険因子が集積することにより惹起されるといわれている。

そして従来より、かかる動脈硬化を抑制・改善する抗動脈硬化剤の開発が進められている。例えば、米ヌカに含まれるトリテルペンアルコールや各種植物ステロールのフェルラ酸エステルの総称であるγ-オリザノールは、血中脂質を低下させることにより、抗動脈硬化作用を呈することが知られている（特許文献１）。尚、γ-オリザノール及びγ-オリザノールに含まれるシクロアルテノールフェルラ酸エステルには、抗酸化作用（特許文献２）、脳機能改善作用（特許文献３）、及び自律神経調整作用（特許文献４）があることが知られている。また、抗動脈硬化作用を有する植物由来成分として、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを誘導することにより抗動脈硬化を呈するセコイリドイド配糖体（特許文献５）、抗肥満作用を呈することにより抗動脈硬化作用を奏することが予測されるユーカリ属植物の抽出物（特許文献６）等が知られている。

更に近年、脂肪細胞、特に内臓脂肪と動脈硬化性疾患との関連が明らかになってきている。脂肪組織は重量で身体の１０％以上を占める巨大な組織であり、中性脂肪としてエネルギーを貯蔵するのみならず、アディポサイトカイン（脂肪組織由来生理活性物質）を分泌することにより、生体ホメオスタシスの維持に積極的に参与している。

そして、アディポサイトカインの中には、脂肪細胞内に脂肪を蓄積すると共に、その分泌が亢進又は低下することにより、脂肪蓄積に伴う合併症発症に関与する可能性があるものも見出され、脂肪代謝、内分泌異常ひいては動脈硬化の発症に関与していることが明らかになっている。例えば、アディポサイトカインの1種であるアディポネクチンは、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用、血管内皮細胞と単球の接着阻害作用、マクロファージの貪食能の低下作用などにより動脈硬化を抑制することが知られている（非特許文献１〜３）。また、冠動脈疾患患者において、血中アディポネクチン濃度が低下していることが明らかになっており、これらの知見によれば、肥満者や内臓脂肪蓄積者でアディポネクチンの分泌が低下することが、動脈硬化性疾患の発症基盤となっている可能性が示唆されている。このようなアディポネクチンの利用に関しては、例えば、アディポネクチンを含有する肝繊維化抑制剤（特許文献７）が知られている。

特開昭６０−２４８６１１号公報特開平８−３０１５号公報特開昭６２−２７７３２６号公報特開昭６１-１０６５１２号公報特開２００２−１５３２３８号公報特開２００１−２７０８３３号公報特開２００２−３６３０９４号公報「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．」１０２；１２９６−１３０１（２０００）「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．」１０３；１０５７−１０６３（２００１）「Ｂｌｏｏｄ．」９６；１７２３−１７３２（２０００）

しかし、アディポネクチンについては、上記のように、アディポネクチンを含有する肝繊維化抑制剤（特許文献７）が知られているが、これは抗動脈硬化作用等の循環器系疾患に関するものではなく、また、抗動脈硬化作用等の循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病への言及はない。そして、これまでにアディポネクチンを誘導することにより抗動脈硬化作用等を呈する物質に関する知見は得られていないのが実情である。また、抗動脈硬化作用等の循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病においては、薬物療法も重要であるが、同時に運動療法及び食生活の改善などの生活習慣の改善が不可欠である。そこで、最近は医食同源の考えの下、健康によい食品を摂取することにより、かかる疾患の予防・改善を図ることが行われており、このような観点から、アディポネクチン分泌に影響を与えると共に、食品等として摂取可能な成分の開発が望まれている。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、アディポネクチンの分泌を誘導することができるアディポネクチン分泌促進剤、並びに該アディポネクチン分泌促進剤を含有する抗動脈硬化剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤、食品添加剤、機能性食品及び飼料添加剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、動脈硬化症の解決策として、脂肪細胞からより多くのアディポネクチンの分泌を促進することができる物質が抗動脈硬化剤になり得ると考えた。その結果、特定の植物から抽出された成分がアディポネクチンの分泌を誘導することを見出して、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下に示す通りである。
（１）（Ａ）米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃のうちの少なくとも１種から抽出された抽出物並びに／又は（Ｂ）米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃のうちの少なくとも１種若しくはこれらの抽出物の微生物変換体を含有することを特徴とするアディポネクチン分泌促進剤。
（２）ステロール又はその誘導体、レゾルシノール誘導体、及びトリテルペン又はその誘導体のうちの少なくとも１種を含有することを特徴とするアディポネクチン分泌促進剤。
（３）上記トリテルペン又はその誘導体は、ルパン型トリテルペン又はその誘導体、ククルビタン型トリテルペン又はその誘導体、及びシクロアルタン型トリテルペン又はその誘導体のうちの少なくとも１種である上記（２）記載のアディポネクチン分泌促進剤。
（４）上記シクロアルタン型トリテルペン又はその誘導体は、シクロアルテノール及び／若しくは（２４Ｓ）−２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタノール、又はその誘導体である上記（３）記載のアディポネクチン分泌促進剤。
（５）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする抗動脈硬化剤。
（６）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする抗肥満剤。
（７）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする抗糖尿病剤。
（８）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする食品添加剤。
（９）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする機能性食品。
（１０）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のアディポネクチン分泌促進剤を含有することを特徴とする飼料添加剤。

本発明のアディポネクチン分泌促進剤及び本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤は、脂肪細胞からより多くのアディポネクチンの分泌を促進することができる。よって、アディポネクチンの分泌低下がもたらすと考えられる各種疾患、例えば、動脈硬化等の各種循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病、あるいは肥満の予防、改善を図ることができる。
本発明の抗動脈硬化剤、抗肥満剤及び抗糖尿病剤によれば、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を促進することにより、これらの疾患の予防、改善を図ることができる。
本発明の食品添加剤及び本発明の機能性食品によれば、食品の摂取を通じて日常的に本発明のアディポネクチン分泌促進剤を摂取できることから、日常の食生活を通じてアディポネクチンの分泌低下がもたらすと考えられる動脈硬化等の各種循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病、あるいは肥満の予防、改善を図ることができる。更に、本発明の飼料添加剤によれば、動物においても動脈硬化等の各種循環器系疾患や肥満の予防、改善を図ることができる。

本発明について、以下に詳細に説明する。
本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、（Ａ）米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃（ＡｌｐｉｎｉａＺｅｒｕｍｂｅｔｃｖ．Ｖａｒｉｅｇａｔａ、別名：アルピニア）のうちの１種又は２種以上である植物原料から抽出された抽出物並びに／又は（Ｂ）米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃のうちの１種又は２種以上若しくはこれらの抽出物の微生物変換体を含有する。

上記植物原料のうち、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃については、その使用部位に限定はなく、根、茎、葉、花、果実、樹皮等の種々の部位を使用することができる。例えば、月桃の場合は根を用いることが好ましく、シラカバであれば外樹皮を用いるのが好ましい。更に、上記各植物原料はそのまま使用してもよく、あるいは、必要に応じて適度に乾燥させてから用いてもよい。また、抽出の際は、抽出効率を向上させるために、上記植物原料の全体若しくは一部又はその乾燥物を適度に切断若しくは粉砕することが好ましい。

上記抽出の方法、条件については特に限定はなく、必要に応じて種々の抽出方法、抽出条件とすることができる。例えば、溶媒抽出の場合、抽出溶媒としては、水、並びに１価アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール等）、多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等）、酢酸エチル等の酢酸エステル、アセトン等の親水性有機溶媒が挙げられる。尚、本明細書中の「水」には、特段の記載がない限り、加熱した水（通常３０〜１００℃、好ましくは４０〜１００℃、更に好ましくは５０〜９０℃、特に好ましくは温度４０〜７０℃の温水又は７０℃を超えて１００℃以下の熱水）も含む。また、抽出溶媒としては、上記親水性有機溶媒と水との混合溶媒でもよい。かかる混合溶媒として例えば、水／１価アルコール（エタノール及びメタノール等）、又は水／多価アルコール（グリセリン、１，３−ブチレングリコール及びプロピレングリコール等）の混合溶媒等が挙げられる。もっとも、本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、生体に対して用いる素材であることから、生体に刺激を及ぼさないような溶媒を用いることが好ましい。かかる溶媒としては、水、エタノール、及び水／エタノールの混合溶媒が挙げられる。また、原料として月桃、特に月桃の根を用いる場合、抽出溶媒としては、酢酸エステルを用いるのが好ましい。更に、上記抽出溶媒の量についても特に限定はないが、通常は、植物原料の１〜１０００倍量（重量比）、好ましくは１〜１００倍量（重量比、更に好ましくは５〜５０倍量（重量比）、より好ましくは５〜２０倍量（重量比）である。

抽出方法及び抽出条件については、アディポネクチン分泌を促進する成分を十分に抽出でき、抽出物の品質を維持できる範囲で種々の条件とすることができる。例えば、抽出は、非振盪下で行ってもよく、振盪下で行ってもよい。また、抽出温度としては、常温抽出の場合、通常、０℃以上、好ましくは１０℃〜３０℃、更に好ましくは２０〜３０℃とすることができる。また、加熱抽出の場合は３０℃を超え１５０℃以下、好ましくは６０〜１３０℃、更に好ましくは８０〜１００℃とすることができる。更に、抽出時間は通常１０分以上、好ましくは、非振盪下又は常温抽出の場合、１時間〜１０日間、振盪下又は加熱抽出の場合、３０分〜２４時間、更に好ましくは、振盪下又は常温抽出の場合、５時間〜７日間、振盪下又は加熱抽出の場合、１〜１２時間、より好ましくは、振盪下又は常温抽出の場合、１０時間〜３日間、振盪下又は加熱抽出の場合、３〜１０時間である。尚、抽出は、同一原料について１回のみ行ってもよいが、２回以上繰り返して行ってもよい。

また、抽出方法としては、例えば、常温又は加熱抽出等が挙げられる。より具体的には、常温ホモジナイズ抽出、還流抽出、超臨界流体抽出等により抽出することができる。更に、一度抽出を行って得られた抽出物について、必要に応じて、再度水、エタノール、酢酸エチル、又は水／エタノール等の溶媒で抽出を行ってもよい。この場合の再度の抽出もまた、前の抽出と同様に行ってもよく、あるいは、異なる抽出方法、抽出条件で行ってもよい。また、上記抽出により得られた抽出物について、必要に応じてろ過を行って莢雑物を除いたり、濃縮することにより、有効成分濃度を高めることができる。この濃縮の方法については特に限定はなく、加温によって濃縮する他、低温又は加温下、減圧により濃縮することができる。尚、この濃縮は、抽出物が乾固するまで行ってもよい。また、濃縮する場合、抽出物自体ではなく、抽出物をろ過して得られたろ液を濃縮してもよい。

また、本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、（Ｂ）米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃のうちの１種又は２種以上又はこれらの抽出物の微生物変換体を含有するものでもよい。ここで「微生物変換体」とは、米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、及び月桃のうちの１種又は２種以上又はこれらの抽出物を原料に、これに微生物を作用させて生化学的な反応を行わせることにより得られる物をいう。例えば、米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃のうちの１種又は２種以上又はこれらの抽出物に微生物を加えて特定条件で発酵培養を行うことにより得られる発酵物、又はこのような発酵物から抽出することにより得られた発酵抽出物等が挙げられる。尚、「米糠、羅漢果、シメジ、キク、ライ麦、シラカバ及び月桃のうちの１種又は２種以上若しくはこれらの抽出物」の詳細は、上述の通りである。

本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤は、ステロール又はその誘導体、レゾルシノール誘導体、及びトリテルペン又はその誘導体のうちの１種又は２種以上を含有する。

上記ステロールは、ステロイドアルコール、ステロイド（シクロペンタノペルヒドロフェナントレン骨格、並びに生合成的にこれから由来した化合物群の総称）の側鎖にヒドロキシル基を有する化合物の総称である。通常は３位にヒドロキシル基を有する。また、上記ステロールの誘導体としては、フェルラ酸エステル等のエステル等が挙げられる。上記ステロールは、例えば、米糠、麦角、ライ麦（特に胚芽）、小麦（特に胚芽）、トウモロコシ（特に胚芽）、アマニ油、及びナタネ油等を抽出することにより得ることができる。上記ステロールとしてより具体的には、例えば、エルゴステロール（Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）及びスチグマスタノール（Ｓｔｉｇｍａｓｔａｎｏｌ）、並びにこれらのフェルラ酸エステル等のエステル等が挙げられる。上記エルゴステロールは、例えば、シメジを抽出することにより得ることができ、スチグマスタノール及びそのエステル（フェルラ酸エステル等）は、例えば、米糠を抽出することにより得ることができる。尚、上記エルゴステロールは、麦角、酵母及びキノコ等を含む菌類全ての主ステロールとして存在していることから、これらの菌類から抽出等により得ることもできる。

上記レゾルシノール誘導体は、レゾルシノール（３−ヒドロキシフェノール）の誘導体である。上記レゾルシノール誘導体は、例えば、ライ麦、小麦及びイネ等のイネ科植物、ボタン（ボタン皮）、イチョウ、カシュウ等を抽出等することにより得ることができる。上記レゾルシノール誘導体は、その他にウルシ科植物やヤマモガシ科植物にも含まれているので、これらの植物から抽出等することにより得ることもできる。上記レゾルシノール誘導体としてより具体的には、例えば、５−ｎ−ノナデシルレゾルシノール等が挙げられる。上記５−ｎ−ノナデシルレゾルシノールは、例えば、ライ麦を抽出することにより得ることができる。尚、上記レゾルシノール誘導体のフェノール性水酸基はメチルエーテル等のようにエーテル化されていてもよい。

上記トリテルペンは、スクアランより生合成される脂肪族多環状化合物であり、通常は３位にヒドロキシル基等の酸素含有官能基を有するが、ホパン系トリテルペンの一部のように、３位にヒドロキシル基等の酸素含有官能基を有しないものも上記トリテルペンに含まれる。また、上記トリテルペンの誘導体としては、例えば、上記トリテルペンのフェルラ酸エステル等のエステルの他、上記トリテルペンの配糖体等が挙げられる。上記トリテルペン又はその誘導体として具体的には、例えば、ルパン型トリテルペン又はその誘導体、ククルビタン型トリテルペン又はその誘導体、及びシクロアルタン型トリテルペン又はその誘導体のうちの１種又は２種以上が挙げられる。この中で、シクロアルタン型トリテルペン又はその誘導体は、脂肪蓄積量が比較的少ない場合でも、アディポネクチンをより多く分泌するので好ましい。

上記ルパン型トリテルペン又はその誘導体としてより具体的には、例えば、ルペオール（ｌｕｐｅｏｌ）、ベツリン（ｂｅｔｕｌｉｎ）及び該ベツリン誘導体である４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｓｅｃｏ−ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎｅ−３，２８−ｄｉｏｉｃ
ａｃｉｄ等が挙げられる。また、上記ククルビタン型トリテルペン又はその誘導体としてより具体的には、例えば、羅漢果の甘味配糖体であるモグロシドＶ（ｍｏｇｒｏｓｉｄｅＶ）やククルビタシンＥ（ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｉｎＥ）等が挙げられる。更に、上記シクロアルタン型トリテルペン又はその誘導体としてより具体的には、例えば、シクロアルテノール及びそのエステル（フェルラ酸エステル等）並びに２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタノール（特には（２４Ｓ）−２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタノール）及びそのエステル等が挙げられる。また、その他に、ショウマに含まれるシミゲノール（ｃｉｍｉｇｅｎｏｌ）、シミゴール（ｃｉｍｉｇｏｌ）、ａｃｅｔｙｌｓｈｅｎｇｍａｎｏｌｘｙｌｏｓｉｄｅ及びｃｉｍｉｃｉｆｕｇｏｓｉｄｅ、オウギに含まれるａｓｔｒａｇａｌｏｓｉｄｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ、並びにトラガントに含まれるｔｒａｇｏｓｉｄｅＩ及びＩＩ等が挙げられる。

上記ルパン型トリテルペン又はその誘導体は、例えば、ノボリフジ、シラカバ（特に樹皮）等から抽出することにより得ることができる。また、上記ククルビタン型トリテルペンは、ウリ科植物の特徴的に分布する成分であり、例えば、羅漢果、並びにブリオニア及びカラスウリ等のウリ科植物等から抽出することにより得ることができる。更に、上記シクロアルタン型トリテルペンは、例えば、米糠、ショウマ、オウギ、及びトラガントの他、イグサ（Ｊｕｎｃｕｓｅｆｆｕｓｕｓ）等のイグサ科植物及びキク科植物（例えば、食用菊花弁等）等から抽出することにより得ることができる。特に、シクロアルテノール及びそのエステル（フェルラ酸エステル等）及び（２４Ｓ）−２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタノールは、米糠、イグサ又は食用菊花弁から抽出することにより得ることができるので好ましい。

上記ステロール又はその誘導体、レゾルシノール誘導体、及びトリテルペン又はその誘導体を得る方法については特に限定はない。通常は天然物を原料に抽出することにより得られるが、それ以外にも完全に人工合成によって得てもよく、あるいは、天然物を抽出して得られた成分を出発化合物として、人工的に化学合成を行う半合成によって得てもよい。例えば、上記トリテルペン又はその誘導体に含まれるシクロアルテノール、シクロアルテノールのフェルラ酸エステル、及び（２４Ｓ）−２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタノールは、図２に示すように、米糠等から抽出することにより得られるγ-オリザノールを原料として合成することができる。また、シクロアルテノールのフェルラ酸エステルは、４−プロピオニルフェルラートとシクロアルテノールを塩化２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾロニウム存在下で反応させることによって得ることもできる。また、シクロアルテノールは植物油に広く存在するので、それらの不けん化脂質からも得ることができる。更には、天然物を抽出して得られた成分を出発化合物として、これに微生物を作用させることにより生化学的に反応を行って得てもよい。勿論、人工的な化学合成反応と微生物による生化学的反応とをハイブリッドすることにより得てもよい。例えば、上記ベツリン誘導体である４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｓｅｃｏ−ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎｅ−３，２８−ｄｉｏｉｃａｃｉｄは、シラカバ外樹皮等から抽出等することにより得られたベツリンを原料に、これに微生物（例えば、ＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｌｏｎｇｉｒｏｓｔｒｅＩＦＯ９８７３等）を作用させて生化学的に反応させることにより得ることができる。

上記トリテルペン又はその誘導体に含まれるシクロアルテノール、シクロアルテノールのフェルラ酸エステル、及び（２４Ｓ）−２４，２５−ジヒドロキシシクロアルタノールの調製方法の詳細を以下に示す（図２参照）。
市販品（和光純薬株式会社製）のγ一オリザノール（１００ｇ、約４０％のシクロアルテノールのフェルラ酸エステル及び約４０％の２４−メチレンシクロアルタノールのフェルラ酸エステルを含む）を４倍容量の酢酸エチル−エタノール（３：１、ｖ／ｖ）で２回再結晶させた。得られた結晶部を６〜１０倍量の酢酸エチルで４回再結晶を繰り返し、１６ｇのシクロアルテノールのフェルラ酸エステルを得た。この結晶部を更にアセトン−石油エーテルから再結晶させることにより、純粋なシクロアルテノールのフェルラ酸エステルを板状結晶として得た。

シクロアルテノールのフェルラ酸エステル（１．６０ｇ）に、メタノール−水（９：１、ｖ／ｖ）に溶解させた１０Ｍの水酸化カリウム溶液５０ｍｌを加え、４時間加熱還流することにより加水分解を行った。反応物を減圧濃縮し、残燈を５０ｍｌのクロロホルムに溶解し、水、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄を行った。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾固することにより、１．０６ｇのシクロアルテノールを得た。

シクロアルテノールを無水酢酸−ピリジンによりアセチル化を行い、シクロアルテノールアセタートを得た。このアセタート（２００ｍｇ）を塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（８０ｍｇ）及びｍ−クロロ過安息香酸（１６０ｍｇ）を加え、室温で一晩攪拌を行った。反応溶液は１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液、続いて水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣は順相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分別を行い、（２４Ｓ）−２４−エポキシシクロアルタノールアセタート（３４ｍｇ）とそれの（２４Ｒ）体（６２ｍｇ）を得た。そして、得られた（２４Ｓ）−２４−エポキシシクロアルタノールアセタートを１，２−ジメトキシエタン（４ｍｌ）に溶解し、これに過塩素酸（３滴）を水（２５ｍｌ）に加えて調整した過塩素酸水溶液を１ｍｌ加え、室温で一晩攪拌を行った。反応溶液に２Ｍの炭酸ナトリウム水溶液を加えた後、ジエチルエーテルで抽出を行い、溶媒留去後、（２４Ｓ）−２４、２５−ジヒドロキシシクロアルタノールアセタート（２２ｍｇ）を得た。そして、得られた（２４Ｓ）−２４、２５−ジヒドロキシシクロアルタノールアセタートに２Ｍ水酸化ナトリウムのメタノール溶液を加え、室温で一晩攪拌することにより加水分解し、（２４Ｓ）−２４、２５−ジヒドロキシシクロアルタノールを得た。

また、上記ステロール又はその誘導体、レゾルシノール誘導体、及びトリテルペン又はその誘導体を天然物から抽出することにより得る場合、通常は、植物を原料として得る。この場合の植物の種類については特に限定はない。通常は、上述の植物を抽出することにより得ることができるが、好ましくは、米糠、羅漢果、シメジ、キク、及びライ麦のうちの１種又は２種以上をすることにより得ることができる。

脂肪細胞のライフサイクルは、（１）脂肪前駆細胞、（２）成熟脂肪細胞、（３）肥大脂肪細胞の大きく３つに分類できる。そして、（１）脂肪前駆細胞から（２）成熟脂肪細胞への分化、（２）成熟脂肪細胞から（３）肥大脂肪細胞への肥大、及び（３）肥大脂肪細胞から（２）成熟脂肪細胞への分裂による小型化には、いくつかの転写因子が関与している。最も重要な転写因子として、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ）が挙げられる。このＰＰＡＲγの発現が、肥大してアディポネクチンの分泌が低下した脂肪細胞の分裂による正常化に関与すると考えられる。また、（１）前駆脂肪細胞は、（２）成熟脂肪細胞へ分化すると細胞内に脂肪滴を蓄積することが可能になり、正常な（２）成熟脂肪細胞はアディポネクチンを分泌すると考えられる。即ち、脂肪細胞の脂肪蓄積とアディポネクチン分泌には、ＰＰＡＲγの活性化が予測できる。

本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、脂肪細胞の脂肪蓄積量から予測されるよりも多量のアディポネクチンの分泌を促進することができる。このことから、本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、ＰＰＡＲγの活性化を促進することにより、アディポネクチンの分泌を促進するものと考えられる。勿論、これは推測であり、本願発明を限定する趣旨はない。そして、アディポネクチンは、単球の血管内皮細胞への接着の抑制、マクロファージの脂質蓄積、泡沫化の抑制、平滑筋細胞の増殖、遊走の抑制等の作用を示すことから、本発明のアディポネクチン分泌促進剤によりアディポネクチン分泌量を増加させることにより、従来の植物抽出物等とは異なる作用機序により、抗動脈硬化作用を奏すると考えられる。よって、本発明のアディポネクチン分泌促進剤は、抗動脈硬化剤として好適に利用することができる。また、アディポネクチンは、脂肪細胞のインスリン感受性を高め、しかも、脂肪燃焼を促進する作用を有することから、アディポネクチンの分泌量を増加させることにより、抗糖尿病作用及び抗肥満作用をも奏すると考えられる。よって、本発明のアディポネクチンを分泌促進剤は、抗肥満剤及び抗糖尿病剤としても好適に利用することができる。

本発明の抗動脈硬化剤、抗肥満剤及び抗糖尿病剤は、本発明のアディポネクチン分泌促進剤又は本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤を含有する。本発明の抗動脈硬化剤、抗肥満剤及び抗糖尿病剤の投与形態については特に限定はない。通常は経口投与により投与されるが、その他にも、注射等の非経口投与又は外部投与等が挙げられる。

本発明の食品添加剤、機能性食品及び飼料添加剤は、本発明のアディポネクチン分泌促進剤又は本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤を含有する。尚、本発明の「食品」は、飲料も含む概念である。勿論、本発明の「食品」は、飲料以外の食品に限定してもよい。本発明の機能性食品としては、固形食品、クリーム状及びジャム状の半流動食品、ゲル状食品、飲料等の他、これらに添加する食品添加物、食品素材等が挙げられる。

本発明のアディポネクチン分泌促進剤及び本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤、並びに本発明の抗動脈硬化剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤、食品添加剤及び飼料添加剤の形態について特に限定はない。本発明のアディポネクチン分泌促進剤等の形態としては、例えば、液状（必要に応じて脱色等の後処理をした液も含む。）でもよいし、液状物を濃縮した濃縮液でもよい。また、その他にも、噴霧式乾燥や凍結乾燥等の公知の方法により溶媒を除去した固形物や粉末化した粉末物でもよい。その他、液状、粉末品、造粒等により得られる造粒品、打錠成形等により得られる錠剤、及びマイクロカプセル等が挙げられる。

本発明のアディポネクチン分泌促進剤及び本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤、並びに本発明の抗動脈硬化剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤、食品添加剤及び飼料添加剤は、アディポネクチン分泌促進を阻害しない限り、その他の物質を含んでいてもよい。例えば、従来より薬剤等に添加されている公知の物質を添加することができる。具体的には、例えば、界面活性剤、油剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等の１種又は２種以上を必要に応じて適宜配合してもよい。例えば、本発明のアディポネクチン分泌促進剤等が粉末品、造粒品の場合、製造における計量を容易にするために、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、トウモロコシ澱粉及びジャガイモ澱粉等の増量剤等を添加することができる。また、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム及びポリエチレングリコール等の滑沢剤、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリジン等の結合剤、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、及びグリコール酸デンプンナトリウム等の崩壊剤、発泡剤、色素、甘味料、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩等の湿潤剤、及び一般に非毒性で医薬的処方に用いられる薬学的に非活性な物質を含んでもよい。その他の薬効成分を含んでいてもよい。

以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
（１）植物由来成分の調製
植物原料として、米糠、羅漢果、ブナシメジ、キク、ライ麦、シラカバ（外皮）及び月桃（根）を使用した。該植物原料から適宜の抽出及び精製を繰り返すことにより、これらの植物に含まれる成分として、９０種類の植物由来成分を単離した。一例として、羅漢果からのモグロシドＶの単離及びブナシメジからのエルゴステロールの単離のスキームを図３及び図４に示す。尚、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｓｅｃｏ−ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎｅ−３，２８−ｄｉｏｉｃａｃｉｄは、シラカバ外樹皮等から抽出等することにより得られたベツリンを原料に、これに微生物（例えば、ＣｈａｅｔｏｍｉｕｍｌｏｎｇｉｒｏｓｔｒｅＩＦＯ９８７３等）を作用させることにより得た。

（２）前駆脂肪細胞分化誘導物質のスクリーニング及びアディポネクチンの定量
脂肪前駆細胞から脂肪細胞の分化誘導活性３Ｔ３−Ｌ１細胞（大日本製薬株式会社より分譲）を用いて調べた。上記３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ウシ胎児血清を１０％濃度で含むダルベッコ改変イーグル培地（増殖培地）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養することにより、シャーレ内で継代培養を行った。継代培養後、上記３Ｔ３−Ｌ１細胞をトリプシン処理することにより、上記３Ｔ３−Ｌ１細胞をシャーレから剥がした。次いで、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った後、９６ウェルマルチプレートに細胞数が２×１０^４ｃｅｌｌになるように分注し、コンフルエントになるまで培養した。その後、培地を除去し、新たに培地に対して上記方法により得られた９０種類の植物抽出成分、デキサメタゾン及びイソブチルメチルキサンチンをそれぞれ終濃度５０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び３００μｇ／ｍｌになるように加えた培地をウェルに添加した。陽性対照として、脂肪前駆細胞の分化誘導物質として既知であるインドメタシンを６９μｇ／ｍｌ（２００μＭ）の濃度になるように添加した培地をウェルに添加した。そして、２日間培養した後、再度培地を除去し、新たにインスリンを終濃度で１μｇ／ｍｌになるように加えた培地をウェルに添加した。２日後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）により洗浄後、ホルマリンを用いて固定し、細胞内に蓄積された脂肪滴をオイルレッド０を用いて染色した。そして、５４０ｎｍでの吸光度を測定することにより、脂肪細胞への分化誘導能を評価した。

上記で培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養上清中に分泌されたアディポネクチンの量を、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で定量した。この定量は、大塚製薬社製の「マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」を使用し、キット付属の使用説明書に記載されている測定方法に従って行った。

そして、上記で測定した５４０ｎｍにおける吸光度をＸ軸に、アディポネクチンの分泌量をＹ軸に示したグラフを図１に示す。ただし、図１のＸ軸及びＹ軸に表記の数値は、それぞれ陽性対照区における吸光度及び濃度を１．０とした場合の相対値である。

上記方法により得られた植物抽出成分９０種類について、脂肪蓄積量とアディポネクチン分泌量との関係を探索した結果、多くの植物抽出成分は、図１の白丸で示すように、脂肪蓄積量（オイルレッド０染色）とアディポネクチン分泌量に正の相関が認められた。しかし、図１の黒四角で示すように、脂肪蓄積量が陽性対照区と同等もしくはそれ以下であるにもかかわらず、アディポネクチン分泌量が陽性対照区よりも比較的多い植物抽出成分９種（Ｎｏ．７、８、１４、１８、２５、３２、３５、４２及び８８）が存在することが認められた。これらの植物抽出成分のうち、Ｎｏ．７、８、１４、１８、２５、３２、３５及び４２の８種について、その構造を調べた。その結果を以下の表１及び化１〜化３にまとめた。これら８種類の植物抽出成分の構造は、陽性対照として用いたインドメタシン及び既知のＰＰＡＲγアゴニストであるチアゾリジン誘導体（ＴＺＤ）と類似点は認められなかった。尚、Ｎｏ．８８については、月桃（根）の酢酸エチル抽出成分であることは判明しているが、その具体的構造は不明であった。

また、Ｎｏ．７、８、１４、１８、２５、３２、３５及び４２の植物抽出成分の培養液への添加濃度を調べたところ、添加濃度は３８．８〜１３２．８μＭであり、これは、陽性対照であるインドメタシンの濃度（２００μＭ）よりも低い濃度であった。これらのことから、特に上記８種類の植物由来成分は、従来よりアディポネクチン分泌を促進ことが知られているインドメタシンよりも優れたアディポネクチン分泌促進能を有することが分かる。

（３）遺伝子発現試験
上記方法により、アディポネクチン分泌促進作用が認められた植物由来成分の一つであるエルゴステロールについて、以下に記載の方法により、遺伝子発現試験を実施した。

３Ｔ３−Ｌ１細胞は、上記スクリーニングの時と同じ条件で、シャーレ内で継代培養を行なった。培養後の３Ｔ３−Ｌ１細胞をトリプシン処理することによりシャーレより剥がし、１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、新しい増殖用液体培地に３Ｔ３−Ｌ１細胞を再度懸濁した。
デキサメタゾン及びイソブチルメチルキサンチンをそれぞれ終濃度として２．５μＭ及び１．３５ｍＭ含む増殖用液体培地（分化用培地）に、試験化合物としてエルゴステロール（和光純薬製）を５０、１００及び１５０μＭになるように添加し、各々を試験培地として調製した。３５ｍｍφシャーレに上記３Ｔ３−Ｌ１細胞を播種し、コンフルエントになるまで３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した後、培地を除去し、上記各試験培地において２日間培養した後、再度培地を除去し、新たにインスリンを終濃度として１μｇ／ｍｌ含む増殖用液体培地（脂肪細胞用培地）を加えた。３日後に培地を新しい脂肪細胞用培地に全量交換し、さらに３日間培養した。

培養液を除去し、ＲＮＡ抽出試薬である「ＩＳＯＧＥＮ」（ニッポンジーン製）を加えた後、使用説明書の記載に従って、上記３Ｔ３−Ｌ１細胞からＲＮＡを回収し、乾燥させた。この乾燥させたＲＮＡに対し、「Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＴｇｒａｄｅ）ｆｏｒＨｅａｔＳｔｏｐ」（ニッポンジーン製）を用いて、使用説明書の記載に従って、ＤＮａｓｅ処理を行なった。そして、「Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＹｏｕ−ＰｒｉｍｅＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＢｅａｄｓ」（アマシャムバイオサイエンス製）及び「Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_１５Ｐｒｉｍｅｒ」（プロメガ製）を用い、抽出した（全）ＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成した。

本試験では、３Ｔ３−Ｌ１細胞中で発現するＰＰＡＲγ、アディポネクチン、レプチン、及びａＰ２の該４種類のタンパク質をコードする遺伝子を目的遺伝子として、それらの領域をＰＣＲ法により増幅した。該ＰＣＲ法におけるサンプル調製及び温度等の条件は、「ＴａＫａＲａＴａｑ」（タカラバイオ製）に添付されている使用方法に従った。いずれの細胞にも定常的に発現するＧ３ＰＤＨをコントロールとして用いた。また、上記目的遺伝子各々に対するプライマーは、以下の配列番号１〜１０に示す通りである。
そして、上記ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルを用いて１００Ｖ、２０分間の条件で電気泳動を行ない、増幅された遺伝子の同定及び半定量を行なった。その結果を図５に示す。

図５より、３Ｔ３−Ｌ１細胞において定常的に発現するＧ３ＰＤＨ及び脂肪細胞へ分化すると発現するａＰ２は、対照群及びエルゴステロール添加群の両群で発現していることが分かる。一方、エルゴステロール添加群では、添加濃度に依存してＰＰＡＲγ及びアディポネクチンの発現が促進され、レプチンの発現が抑制されていることが分かる。この結果から、エルゴステロールによって、ＰＰＡＲγの発現とアディポネクチンの発現が亢進されることが分かる（図５参照）。

（４）生体中のエルゴステロール量、アディポネクチン量及び中性脂肪量の測定
以下の方法により、アディポネクチン分泌促進能が確認されたエルゴステロールをラットに投与し、エルゴステロール量、アディポネクチン量及び中性脂肪量を測定した。

９週齢のオスのＳＤラットを通常飼料、水は自由摂取条件下で１週間予備飼育をし、１０ｍＭエルゴステロールを溶解したダイズ油（和光純薬製）を単回経口投与した。対照群として、ダイズ油のみを単回経口投与した。投与量はラットの体重１００ｇあたり１ｍＬになるようにした。
投与後の各時間において、尻尾採血又は屠殺採血を行なった。尻尾採血の場合、尻尾末端血管からヘパリン加工済みヘマトクリット採血管（以下、「ヘマト管」と記す）を用いて約１５０μL採血し、ヘマト管のまま４℃で１３００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、血清を採取した。採血後は生理食塩水１５０μＬを腹腔注射した。屠殺採血の場合、ネンブタール３００μＬを腹腔注射後、開腹し、腹部動脈より採血を行なった。血液は、ヘパリン３００μＬと混合し、４℃で１３００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、血清を採取した。

（Ａ）血中エルゴステロール濃度の測定
血清中のエルゴステロール濃度を計算する検量線を作成するために、標品エルゴステロールを用いて、濃度の異なるエルゴステロール溶液を用意した。即ち、標品エルゴステロール１．０ｍｇをメタノール１．０ｍＬに溶解した後に、段階的に希釈した５種類の溶液を調製し、この吸光度を分光光度計で２８２ｎｍの波長で測定した。得られた吸光度に基づき、エルゴステロールの吸光係数ε＝１１９００Ｍ^−１ｃｍ^−１（λＭａｘ；２８２ｎｍ）から計算して、エルゴステロール濃度を求め、更に１０倍希釈を行い、３種類の溶液（標準溶液）を調製した。

一方、上記血清３０μＬにメタノール１２０μＬを加え５倍希釈溶液にした。タンパク類を沈殿させるために、卓上遠心器で３分間遠心をして上清を回収し、次いでフィルターサイズ０．４５μｍのウルトラフリー−ＭＣ（ミリポア製）を用いて、１２０００ｒｐｍ、５分、２０℃の条件で遠心ろ過を行った。ろ過された溶液を測定用のサンプルとした。

血中エルゴステロール濃度の測定は、ＨＰＬＣにより行った。
カラムはＳｙｍｍｅｔｒｙＣ８ステンレスカートリッジカラム（３．９×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ、ウォーターズ製）を使用し、カラムの汚染を防ぐために、ＳｅｎｔｒｙＳｙｍｍｅｔｒｙＣ８ガードカラム（３．９×２０ｍｍ、粒子径５μｍ、ウォーターズ製）を本カラムの前に接続した。また、システムに送液する移動相として、メタノール：アセトニトリル：水＝２５：２５：１の混合溶液を調整した。全ての溶媒、溶液は０．２０μｍのフィルターでろ過をした後に使用した。
上記標準溶液及びサンプルをそれぞれ２５μＬずつシステムに注入した。溶液は流速１．０ｍＬ・ｍｉｎ^−１で送液し、エルゴステロールは２８０ｎｍの波長で検出した。

上記方法により得られた標準溶液の測定結果に基づいて、解析ソフトを使用して検量線を作製した。
一方、上記サンプルのうち、エルゴステロールを投与していないコントロール群で、エルゴステロールのピークが検出される時間の場所に、採血時間によってあまりピーク面積が変化しない未知ピークが検出された。このピーク面積を測定し、コントロール群で平均した値を、上記サンプルのうち、エルゴステロール投与群のそれぞれの時間で得られたピーク面積から引き、得られた値を純粋なエルゴステロールのピーク面積とした。得られたピーク面積を用い、検量線に基づいてエルゴステロールの濃度を求めた。この結果を図６に示す。尚、上記サンプルは前処理段階で５倍希釈していたので、得られた濃度を５倍して、血清中のエルゴステロール濃度とした。

（Ｂ）血清中アディポネクチン量及び血清中中性脂肪量の測定
エルゴステロール投与群及び対照群の投与後１２、２４及び４８時間の血清中アディポネクチン量（μｇ／ｍＬ）を、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法で定量した。この定量は大塚製薬社製の「マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」を使用し、キット付属の使用説明書に記載されている測定方法に従って行なった。また、エルゴステロール投与群及び対照群の投与後１２、２４、３６及び４８時間の血清中中性脂肪量（ｍｇ／ｄＬ）を社団法人半田市医師会健康管理センターに依頼して測定した。これらの結果を図７に示す。

（３）結果
図６より、血中エルゴステロール濃度を投与後４時間毎に測定した結果、最高血中濃度到達時間は投与後４〜１２時間であり、最高血中濃度は約１．８μＭであった。この結果より、投与したエルゴステロールは血中に移行することが確認された。

図７（Ａ）より、対照群と比較して、エルゴステロール投与群では、血清中アディポネクチン量の上昇が認められた。この結果から、エルゴステロールは経口投与しても、アディポネクチンを分泌促進できることが分かる。
また、図７（Ｂ）より、血清中の中性脂肪量（トリグリセリド量）は、通常、油を食事で摂取した場合には上昇するが、エルゴステロールを摂取した場合には、油脂摂取後の血清中中性脂肪量の上昇を抑制することができることが分かる。血中の中性脂肪量の抑制メカニズムは未だ不明であるが、エルゴステロールによりアディポネクチンが誘導され、抗肥満及び抗動脈硬化作用を呈すること示唆された。

尚、本発明においては、前記具体的実施例に示すものに限られず、目的、用途に応じて本発明の範囲内で種々変更した実施例とすることができる。

本発明のアディポネクチン分泌促進剤及び本発明の他のアディポネクチン分泌促進剤は、脂肪細胞からより多くのアディポネクチンの分泌を促進することができる。そのため、アディポネクチンの分泌低下がもたらすと考えられる各種疾患、例えば、動脈硬化等の各種循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病、あるいは肥満の予防、改善に利用することができる。また、本発明の抗動脈硬化剤、抗肥満剤及び抗糖尿病剤もまた、アディポネクチンの分泌低下がもたらすと考えられる各種疾患、例えば、動脈硬化等の各種循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病、あるいは肥満の予防、改善に利用することができる。更に、本発明の食品添加剤及び本発明の機能性食品は、日常の食生活を通じてアディポネクチンの分泌低下がもたらすと考えられる動脈硬化等の各種循環器系疾患や糖尿病等の生活習慣病、あるいは肥満の予防、改善を図ることができることから、広く飲食品分野において利用することができる。また、本発明の飼料添加剤によれば、動物においても動脈硬化等の各種循環器系疾患や肥満の予防、改善を図ることができることから、広く畜産分野において利用することができる。

実施例の３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪蓄積量とアディポネクチン分泌量との関係を示したグラフである。 γ−オリザノールからシクロアルタン型トリテルペン誘導体を合成する経路を示す説明図である。羅漢果からのモグロシドＶの単離のスキームを示す説明図である。ブナシメジからのエルゴステロールの単離のスキームを示す説明図である。本実施例の遺伝子発現試験の（Ａ）ｍＲＮＡの発現量及び（Ｂ）電気泳動ゲル写真を複写した図である。本実施例のエルゴステロール投与後の時間に対する血清中のエルゴステロール濃度をプロットしたグラフである。本実施例のエルゴステロール投与後の（Ａ）血清中アディポネクチン量及び（Ｂ）血清中中性脂肪量をプロットしたグラフである。

ＰＰＡＲγをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したフォアードプライマー。

ＰＰＡＲγをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したリバースプライマー。

アディポネクチンをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したフォアードプライマー。

アディポネクチンをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したリバースプライマー。

レプチンをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したフォアードプライマー。

レプチンをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したリバースプライマー。

ａＰ２をコードする遺伝子のＰＣＲで使用したフォアードプライマー。

ａＰ２をコードする遺伝子のＰＣＲで使用したリバースプライマー。

Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したフォアードプライマー。

Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子のＰＣＲで使用したリバースプライマー。

Claims

シクロアルテノール、シクロアルテノールフェルラ酸エステル及びスチグマステロールフェルラ酸エステルの少なくとも１種を、有効成分として含有することを特徴とする、アディポネクチン分泌促進剤。
スチグマステロールフェルラ酸エステルを、有効成分として含有する、請求項１記載のアディポネクチン分泌促進剤。
インドメタシンより高いアディポネクチン分泌促進能を有することを特徴とする、請求項１又は２記載のアディポネクチン分泌促進剤。