JP4768125B2 - 化学的髄核分解の治療方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
政府サポート
本発明はNIH認可2-P50-AR39239およびAG04736に基づいて米国政府サポートの基に行われた。米国政府は本発明について特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願のクロスリファレンス
本願は、そのすべてを参照として本願に組み入れた、1998年10月６日出願の米国出願番号60/103,161の利益を主張するものである。
【０００３】
【発明の属する技術分野】
本発明は化学的髄核分解を必要とする哺乳動物の治療方法に関する。特に、本発明はプロテオグリカン分解酵素の有効なプロテオグリカン開裂量および増殖因子の有効なプロテオグリカン合成量を投与することで構成する治療法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
腰痛は個人および社会にとって破壊的な経済的負担となる。業界ではそれが労働不能の最も頻繁な原因である。合衆国において年間に失われる作業日数は一億日を超えている。Ｊ．クレイマー、「椎間板病」、シュツットガルト、ジョージ・シーム・バーラグ（1981年）。米国では毎年50万人を超える労働者が影響を受け、200億ドル以上かかっている。L.I.クランツラー、Ｌ．等、「神経学臨床講義」3：2（1985年）。腰痛は、ほとんどの場合、腰椎の１つ以上の椎間板における病理学的変形と関連づけられている。
【０００５】
椎間板は、脊柱に掛かる圧迫や回転や引張りのストレスに耐える機能のある特殊線維軟骨結合組織である。M.D.ハムザー等、「解剖学記録」220(4)：337-56（1988年）。この椎間板は静水ショックアブソーバの作用をして、２つの脊椎骨間に生じる力を和らげ、これらの脊椎骨を互いになめらかに噛み合わせる上で役立つ。椎間板は、２つの相互依存するが形態学的に異なった領域、すなわち髄核（NP）と、プロテオグリカンに富んだ内側ゼラチンクッション（PG）と、コラーゲン線維に富んだ同心ラメラから成る外側線維輪（AF）とから成る複雑な構造である。
【０００６】
NPとAFの両方の細胞外基質を生成し維持する細胞の新陳代謝は余りよく知られていない。NPの基質は関節軟骨に見られるものに非常に似ている。M.R.ジェーンク等、「生化学ジャーナル」251(2)：347-56（1988年）。それは、比較的少数の細胞によって成人期中に合成され維持される。NP細胞の75％超は軟骨細胞のようであるが、相当な数の大きい脊索細胞があり、特に成人期の以前にある。B.A.マルドナード等、「整形法研究ジャーナル」10(5)：677-90（1992年）。両方のNP細胞種が、組織の中の最も豊富な分子を構成するアグレカンと呼ばれる大きい分子量の親水性PGを合成するか否かは明確でない。関節軟骨の中のように、これらのアグレカン分子は、主にタイプIIコラーゲンから成る筋原線維ネットワークに絡まれた集合を形成するヒアルロナン（HA）の長い線ストランドと細胞外で相互作用する。E.J.トナー等、「リウマチ性疾患臨床講義、 北アメリカ」19(3)：635-57（1993年）。コラーゲン−アグレカン固形基質の膨張、体液およびイオン移送特性そして本質的な機械特性がＮＰのゆがんだ動きを支配する。コラーゲンネットワークが組織に張力を与え、圧迫こわばり感を与え、組織がリバーシブル変形を受けるようにする、粘弾性の水和不足のアグレカン分子類膨張拡大を妨げる。
AFは、NPからの細胞よりもコラーゲンに富んでPGが少ない基質を合成する軟骨細胞に似た細胞 (B.A.マルドナド等、「整形法研究ジャーナル」10(5)：677-90（1992年））の比較的均質の個体数を含む。重要な点では、一部の細胞は、軟骨に通常はかなりの量が見られることのないPGおよびコラーゲン分子を合成する。J.J.ウー等、生化学ジャーナル248(2)：373-81（1987）；Ｒ．メインおよびR.G.ブルートン、「関節軟骨退化の基本および臨床面」の「軟骨コラーゲンの細胞外基質」（J.R.ウォスナーとD.S.ハウエル、編集者)、マルセルデッカー社、ニューヨーク、81-108頁（1993年）；E.J.ソナー−M.A.等、「北アメリカのリウマチ性疾患診療所：変形性関節症」の「変形性関節症における軟骨変形の体液マーカー」（Ｒ．モスコウィツ、編集者）、W.B.ソーンダーズ社、フィラデルフィア、634-658頁（1993年）。このように、通常AFは線維軟骨として分類される。それはリバーシブル奇形を生じるためよりも強度のために造られる。
【０００７】
椎間板細胞の新陳代謝は、関節軟骨からの軟骨細胞のものほどあまりよく知られていない。この領域での進歩は、生体内の実験的なアプローチに費用がかかる本質および細胞の新陳代謝を研究するための適切な培養系の不足により過去に課された制限により制限されている。チバ等（Ｋ．チバ等、「アルジネートで培養される髄核および線維輪細胞：異なるコンパートメントでの基質代謝の特殊化」、「米国、日本、カナダ、欧州の整形法研究会の第２回合同会議の議事録」、32頁（1995年））は、表現型的に安定した軟骨細胞の新陳代謝および新たに生成する基質の代謝回転を研究するために開発精製されたアルギン酸ビーズ培養系を利用する細胞培養系を開発した。H.J.ハウセルマン等、「基質」12(2)：116-29（1992年）；H.J.ハウセルマン等、「Ｊ．細胞科学」107：17-27（1994年）；S.S.モク等、「Ｊ．生物化学」269(52)：33021-7（1994年）；Ｂ．プティー等、「実験的細胞研究」225；151-161（1996年）。関節軟骨細胞のように、これらのアルギン酸ビーズに捕らえられた椎間板細胞も細胞外基質を改質する。Ｋ．チバ等、「背骨」22(24)：2885-93（1997年）。この細胞培養系は、AFとNP細胞の両方の新陳代謝に対する化合物の影響を研究するために使用できる。この細胞培養系は、基質の代謝的に活性（細胞関連）と不活性（さらに除去）のコンパートメントでの変化を区別できる。またチバ等は、ウサギの椎間板全体をアルギン酸ゲルに閉じ込めることが実行可能であることを示している。Ｋ．チバ、Ｇ．Ｂ．Ｊ．アンダーソン等、「整形外科研究会、翻訳」21：190（1996年）。より密接に生体内の状況をまねるこのアプローチは、椎間板構造の改良保持に導き、高い代謝活性を促進する。
【０００８】
腰部の椎間板ヘルニアは、腰痛の最も一般的原因の１つである。椎間板ヘルニアは、最初は物理療法で保守的に治療するが、他の更に侵略的な治療様式を時には必要とする。例えば、化学的髄核分解、つまり局所的に注入した酵素を使用する椎間板組織の溶解が30年以上使われている。オルマーカー等、「臨床整形外科および関連研究」257：274（1990年）。PGは、NPにおける膨潤圧の大部分の要因となるので、PG（D.S.ブラドフォード等、骨と関節外科ジャーナル−アメリカ版65(9)：1220-31（1983年）；G.M.ヒル等、臨床整形外科および関連研究225：229-233（1987年））またはコラーゲンを低下させる酵素の板間注入は、ヘルニア化塊によって捕らえられた神経根の減圧を起こし、痛みの軽減に役立つ。これら酵素によって治療した椎間板の細胞はＰＧをＮＰに補充できるとの予備の組織学的証拠があり、（D.S.ブラドフォード等、「骨と関節外科ジャーナル−アメリカ版」65(9)：1220-31（1983年））椎骨間のクッションの衝撃吸収性の回復に役立ち、最も重要には、隣接する椎間板に掛かる力やストレスを正常にするのに役立つ。
【０００９】
化学的髄核分解を２つの一般的に使用される酵素、すなわちキモパパインとコラゲナーゼとを使用して実行する場合、併発症が化学的髄核分解から生じることがある。キチェルおよびブラウンは、キモパパイン治療がクモ膜下出血、両下肢麻痺、過敏症そして死亡にもつながることがあることを報告している。「臨床整形外科および関連研究」284：63（1992年）。オルマーカー等は、注入したキモパパインは神経毒性でアレルゲンでもあり、コラゲナーゼによる治療は神経学的欠損につながることがあると記している。「臨床整形外科および関連研究」257：274（1990年）。
【００１０】
椎間板ヘルニアに関連する苦痛な坐骨神経痛は、物理療法と化学的髄核分解とを含む保存療法によって軽減しないことがよくあるので、多くの患者が椎間板の手術を受けている。G.M.ヒル等、「臨床整形外科および関連研究」225；229-233（1987年）。しかし、手術結果は必ずしも満足なものではなく、重要なことはこのアプローチは、腰部の椎間板の除去は下部背骨の重大な非安定化を生じ、後年の変性に対する隣接椎間板の素因となるため、最適からはほど遠いものである。G.M.ヒル等、「臨床整形外科および関連研究」225：229-233（1987年）。
【００１１】
近年、化学的髄核分解のためのより新しい治療方式が開発されている。それはキモパパインやコラゲナーゼなどの蛋白分解酵素の使用時の固有の問題の一部を回避し、外科介入の必要性を避けるものである。そのような化学的髄核分解性酵素の１つは、変形菌の生成物であるコンドロイチナーゼABCである。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸などの粘質多糖を劣化するエンド−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼである。タカハシ等、「背骨」21:2405 (1996年)。オルマーカー等は、コンドロイチナーゼABCがキモパパインほど背骨組織に有害ではないことを記している。「背骨」21:1952 (1996年)。
【００１２】
骨形態形成蛋白質−７（BMP-7）としても知られている骨生成蛋白質−１（OP-1）は、骨細胞および軟骨細胞分化および新陳代謝に強力な影響を及ぼすTGF-β超ファミリーのメンバーである。I.アサヒナ等、「J.細胞生物学」123(4):921-33 (1993年)。骨形成蛋白質は、ラットに皮下注入した場合に新しい骨形成を起こすことが示された。S.D.クック等、「臨床整形外科」324;29-38 (1996年)。組替えヒトOP-1（rhOP-1）が、生体外での造骨細胞の成長と分化を促進することが示されている。T.K.サムパス等、「J.生物化学」267:20352-20360 (1992年)。また、軟骨形成および骨形成系路に沿って間葉基幹細胞の分化も生じる。I.アサヒナ、「J.細胞生物学」123(4)：921-33 (1993年)。また、組替えヒトOP-1は、軟骨細胞に特定の効果を生む。チェン等は、ひよこの胸骨の軟骨細胞の成長を促進することを示した。P.チェン等、「J.細胞科学」108（Pt 1）：105-14 (1995年).この系では、タイプXコラーゲンの合成誘導を記し、OP-1が軟骨胞成熟化に効果を発揮したことも示している。対照的に、ウシ軟骨細胞は、OP-1に対応したタイプXコラーゲンを表さずにPGとタイプIIコラーゲンの合成増加を示した。P.チェン等、「生化学生物物理研究会」197(3):1253-9 (1993年)。増殖因子は、キモパパインやコラゲナーゼなどの蛋白分解酵素を使用する従来の化学的髄核分解治療では使用しない。これは、こうした酵素が増殖因子を開裂したり減成したりするからである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、椎間板ヘルニアの徴候を緩和をするだけでなくAFやNPの安定と修復を強化する化学的髄核分解治療が必要とされている。同様に、脊椎骨を機械的に十分にサポートし、観血的手術介入の必要を取り除く化学的髄核分解治療を必要としている。さらに、その組織の安定性と修復の両方を提供しつつ椎間板組織の両溶解のための１つの治療方式だけを必要とする化学的髄核分解治療方法を必要としている。本発明の治療法はそのような方法を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、化学的髄核分解を必要とする哺乳動物にプロテオグリカン分解酵素の有効なプロテオグリカン開裂量と基質成分の形成を促進することに有効な量の増殖因子とを投与することから成る治療に関する。好ましい態様では、基質成分はプロテオグリカンである。別の好ましい態様では、基質成分はコラーゲンである。
【００１５】
別の態様では、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物に有効なプロテオグリカン合成量の増殖因子を投与することから成る、プロテオグリカン分解酵素による化学的髄核分解後の髄核および/又は線維輪細胞の基質を修復する方法について考察する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物に有効なプロテオグリカン合成量の増殖因子を投与することから成る、プロテオグリカン分解酵素による化学的髄核分解後の髄核および/又は線維輪細胞の補充方法について考察する。
【００１７】
好ましいプロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼである。好ましいコンドロイチナーゼは、コンドロイチナーゼAC、コンドロイチナーゼB、コンドロイチナーゼCを含む。特に好ましいコンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼABCである。
【００１８】
好ましい増殖因子は骨形成蛋白質である。特に好ましい骨形成蛋白質はOP-1である。別の好ましい増殖因子は形質転換増殖因子βである。
【００１９】
好ましい態様では、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とは同時に投与される。
【００２０】
別の態様では、本発明はプロテオグリカン分解酵素と増殖因子とから成る組成物について考察する。好ましくは、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とは、薬学的許容担体および／または溶媒を含む薬剤組成物として配合される。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とから成るキットについて考察する。好ましい態様では、このキットは、プロテオグリカン分解酵素を含む溶媒と増殖因子を含む溶媒とから成る。別の好ましい態様では、このキットは、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とを含む溶媒から成る。こうしたいずれのキットも、化学的髄核分解でのプロテオグリカン分解酵素と増殖因子の使用についての使用説明書を任意で含む。
【００２２】
本発明は一般的な利益と利点を提供するものである。１つの利点は、椎間板基質の構造に対する化学的髄核分解の有害な影響を、治療の一部として椎間板構造の修復促進に有効な増殖因子を含むことで打ち消しできることである。本発明の利益は、増殖因子の投与が、蛋白分解化学的髄核分解酵素の投与により損なわれない点である。別の利点は、酵素にはどんな蛋白質分解活性もなく増殖因子を不活性にしないので、化学的髄核分解酵素の投与は、増殖因子蛋白質の投与と同時に起こる点である。更なる利益は、この治療法は、公知の化学的髄核分解治療よりも併発症が少ない点である。
【００２３】
さらに、本発明の利益と利点は、以下の説明から当業者には明白であろう。
【００２４】
【発明の実施の形態】
この発明に係る方法は化学的髄核分解が必要な哺乳類の治療に関するものである。化学的髄核分解が必要な哺乳類は例えば背中下部の痛みの現れにしたがって行われた診断によってわかる。椎間板ヘルニアは例えば背中下部の痛みの履歴の訴えと、その後の背中下部の診察により診断することができる。ＭＲＩのようなＸ線診断画像が診断を確認するために行うことができる。化学的髄核分解は通常椎間板ヘルニアの膨張がある場合で身体療法では治療困難な哺乳類に対して指示される。
【００２５】
化学的髄核分解は典型的には蛋白質加水分解による椎間板組織の分解を生じさせる酵素の椎間スペースへの直接的な注入により行われる。蛋白質分解を生じさせないプロテオグリカン分解酵素を椎間板組織の粉砕のために使用すると、ＡＦ及びＮＰに存在するプロテオグリカンのグリコサミノグリカン鎖は酵素により裂け、一方プロテオグリカンの核蛋白は無傷のままである。換言すれば、このような蛋白質分解を生じさせないプロテオグリカンはＡＦ及びＮＰのプロテオグリカン成分のグリコサミノグリカン鎖を解重合する。
【００２６】
この発明の治療においては、多くのプロテオグリカン分解酵素を使用することができる。このプロテオグリカン分解酵素は、１，４−ヘキソサミニド結合の削除によるコンドロイチンサルフェイト（特に、コンドロイチン−４−サルフェイト、コンドロイチン−６−サルフェイト）のグリコサミノグリカンを解号重合するコンドロイチナーゼ（コンドロイチンリアーゼ）、ヒアルロニダーゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ヒアルロネイトリアーゼ、コンドロイチンサルファターゼ、コンドロ−６−サルファターゼなどである。特に好ましいコンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼＡＢＣ（コンドロイチンＡＢＣリアーゼ；ＥＣ４．２．２．４）で、これはエンドーβーＮ−アセチルーＤ−ヘキソサミニダーゼである。他の好ましいコンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼＡＣ（コンドロイチンＡＣリアーゼ）、コンドロイチナーゼＢ（コンドロイチンＢリアーゼ）及びコンドロイチナーゼＣ（コンドロイチンＣリアーゼ）である。
【００２７】
プロテオグリカン分解酵素にはコンドロイチンサルフェイトやヒアルロン酸を解体するグリコシダーゼをふくむことが分かる。この発明の方法に使用するプロテオグリカン分解酵素の量は実効プロテオグリカン開裂量である。ある特定のプロテオグリカン分解酵素の実効プロテオグリカン開裂量はプロテオグリカン分解酵素がその基質の存在に潜伏する場合、反応最終生成物を測定することにより決定できる。したがって、例えば１単位のコンドロイチナーゼＡＢＣは３７°Ｃ、ｐＨ８．０において、毎分、コンドロイチン−６−サルフェイトから１ミリmol の非飽和二糖の形成物に触媒作用を及ぼす酵素の量として定義される。プロテオグリカン分解酵素の実効プロテオグリカン開裂量は約０．０１U／disk から 約１０U／disk の範囲であり、好ましくは約０．０５U／disk から 約５U／disk であり、より好ましくは約０．１U／disk から 約１０U／disk である。宿主哺乳類に投与するプロテオグリカン分解酵素の量は単位体積当たりの量としても表すことが出来る。したがって、プロテオグリカン分解酵素の実効プロテオグリカン開裂量は約０．０００１U／mL から 約１００U／mL の範囲であり、好ましくは約０．０５U／mL から 約５０U／mL であり、より好ましくは約０．１U／mL から 約２０U／mL である。
【００２８】
この発明の方法はまた化学的髄核分解が必要な哺乳類に対して、マトリックス成分の形成を刺激するために有効な増殖因子の量を投与することに関する。増殖因子の実効プロテオグリカン合成量が投与すること、あるいは増殖因子の実効コラーゲン合成量が投与することが可能である。
【００２９】
この発明では様々の増殖因子が使用できる。増殖因子は細胞の増殖あるいは分化を活性化する蛋白質である。増殖因子は多能性であり、各種の細胞において、細胞増殖および／あるいは細胞分化に導くことが出来る。この発明において有用な増殖因子にはプロテオグリカン及びコラーゲンの製造を刺激することによりマトリックス合成を刺激する増殖因子が含まれる。この発明の方法において使用するのに適した増殖因子には、例えばプロテオグリカン及びコラーゲンの合成のようなマトリックス合成を刺激する潜在能力を有するいかなる増殖因子も含まれる。このような増殖因子は化学的髄核分解に引き続き髄核および／あるいは線維輪のマトリックスを修復する。このような増殖因子はまたプロテオグリカン分解酵素を用いた化学的髄核分解の後にNPおよび／あるいはAFのプロテオグリカンおよび／あるいはコラーゲン成分を補充する。したがって、増殖因子の投与は化学的髄核分解の後の椎間板の機械的強度を回復させる。このようにして、椎間板の融合は遅らせること、あるいはさらに避けることが出来る。
【００３０】
好ましい増殖因子には変換性増殖因子β属の構成員が含まれ、このβ属は多くの間葉あるいは上皮細胞の種類に対して増殖性効果を有する。好ましい変換性増殖因子β属の構成員には骨形態発生蛋白質２（ＢＭＰ−２）；骨形態発生蛋白質４（ＢＭＰ−４）及び変換性増殖因子β−１、β−２及びβ−１(有能ケラチノサイト増殖因子９が含まれる。他の有用な変換性増殖因子β属の構成員には、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ，Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａ蛋白質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ユニビン、ノーダル、スクリュウ、ＡＤＭＰ、ニュウラル及びそのアミノ酸連鎖変異体が含まれる。他の好ましい変換性増殖因子β属には、中胚葉および外胚葉細胞、特にケラチノサイト及び繊維芽細胞の増殖を誘起する表皮性増殖因子（ＥＧＦ）；間葉細胞に対し増殖効果を及ぼす小板誘導の増殖因子（ＰＤＧＦ）、酸及び塩基の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；特に骨成長の成長ホルモンに対する応答を媒介するインシュリン類増殖因子１（ＩＧＦ−１）及び２（ＩＧＦ−２）が含まれる。さらに、好ましい増殖因子には骨形成蛋白質が含まれる。特に好ましい骨形成性蛋白質は骨形態発生蛋白質７（ＢＭＰ−７）としても知られているＯＰ−１である。ＯＰ−１は変換性増殖因子β遺伝子の上科である。これはＭＷ３６，０００の１３９アミノ酸残基同質二重体である。ＯＰ−１は生体内での新たな骨形成を誘発し、骨幹の部分骨欠陥の補修を促進する。
【００３１】
１９９８年１０月６日出願の米国出願第６０／１０３，１６１号に開示され、その全体を参照のために本明細書に組み込むが、この開示内容に示すように、有用な骨形成蛋白質には、少なくとも７０％、好ましくは８０％の連鎖相同性すなわち“類似性”を自然発生蛋白質の群から選択された基準形態発生蛋白質と共有し、アミノ酸連鎖を有する蛋白質が含まれる。基準アミノ酸連鎖と機能的に等価と考えられる候補アミノ酸連鎖はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）のニードルマン等の方法を使用して配列することが出来る。これは、配列プログラム（ディエヌエイスターインコーポレーテッド）等のコンピュータプログラムによって従来より実施されている。候補連鎖における内部間隙及びアミノ酸挿入は、候補連鎖と基準連鎖との間におけるアミノ酸連鎖相同性あるいは同一性の水準として従来より表されていた定義された関係を計算する目的のため無視される。
【００３２】
ここで、「アミノ酸連鎖相同性」はアミノ酸連鎖同一性及び類似性を含むものと理解される。相同性連鎖は同一性および／あるいは類似性アミノ酸残基と共有する。ここで、類似性残基は配列基準連鎖における対応アミノ酸残基の保存的代替物、即ち、「許容点変異」である。したがって、７０％アミノ酸同一性を基準連鎖と共有する候補ポリペプチド連鎖は、配列残基の任意の７０％が基準連鎖における対応残基と同一か保存的代替物かであるものである。
【００３３】
ここで使用する「保存的代替物」とは対応基準残基に物理的あるいは機能的に類似する残基である。例えば、類似する寸法、形状、電荷、等価あるいは水素結合を形成する能力を含む化学的性質等を有する残基である。特に好ましい保存的代替物は、デイホッフ等（1978）の５図解蛋白質連鎖及び構造、Ｓｕｐｐｌ．３、ｃｈ２２（３５４−３５２ページ）ナショナルバイオメディカルレスファウンド、ワシントンＤ．Ｃ．２０００７において、許容される点変異のために定義された判断基準を満たしている。保存的代替物の例として一つのアミノ酸を類似の性質の他のアミノ酸に代えたものがある。例えば以下に示す群内での代替物が周知である。（ａ）バリン、グリシン、（ｂ）グリシン、アラニン、（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン、（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、（ｅ）アスパラギン、グルタミン、（ｆ）セリン、スレオニン、（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン、（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的変異体」あるいは「保存的変異」はまた、結果として生じる代替ポリペプチド連鎖に対する結合特異性を持つ抗体が非代替あるいは親ポリペプチド連鎖に対する結合特異性（即ち、「交差反応」或いは「免疫反応」をもまた持つという条件で、所定のポリペプチド連鎖における非代替の親アミノ酸の代わりに代替アミノ酸の使用を含む。
【００３４】
有用な骨形成活性蛋白質は低、中、高度の厳密度のハイブリッド形成条件下でＤＮＡ或いはＲＮＡ符号化基準骨形成連鎖へハイブリッド形成する核酸により符号化した連鎖から成るアミノ酸連鎖を伴うポリペプチド連鎖を持つ。この連鎖は例えばＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３等の保存された７個シスチン領域を規定するＣ−ターミナル連鎖である。ここで使用されるように、高厳密度ハイブリッド形成条件は４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハルトの溶液、３７℃、１夜にわたる０．１％ＳＤＳ、および５０℃、０．１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄における周知の技術によるハイブリッド形成であると定義される。標準厳密度条件は市場で入手可能な標準的な分子クローニングに関する書籍において特徴づけられている。例えば、サムブルック、フリッシュ、マニアティス著の分子クローニング実験マニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリプレス：１９８９）、ＤＮＡクローニング、１、２巻（Ｄ．Ｎ．グローバ編、１９８５）、オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．ゲイト編、１９８４）、核酸ハイブリッド形成（Ｂ．Ｄ．ヘイムス、Ｓ．Ｊ．ヒギンス編、１９８４）、Ｂ．パーバル著分子クローニングの実践手引き（１９８４）がある。
【００３５】
増殖因子の有効プロテオグリカン合成量は、例えば、Ｌ．ハウスルマンら, J. Cell. Sci. 107:17-27 (1994) によるＤＭＭＢ染料分析法を使用した増殖因子処理済み試料における硫酸塩プロテオグリカン量の分析によって決定できる。あるいは、プロテオグリカンの合成は、増殖因子処理済み試料内の細胞による硫酸３５(35Ｓ)の吸収を観察することで測定できる。プロテオグリカン合成増殖因子は、哺乳動物に対し一日に約１００μg/diskから約１０ｍg/disk、好ましくは一日に約２００μg/diskから１ｍg/disk、さらに好ましくは約２００μg/diskから約５００μg/diskを一回であるいは数回に分けて毎日投与することができる。哺乳動物に対し一回にあるいは数回に分けて一日に投与するプロテオグリカン合成増殖因子の量は、また単位体積当たりの量としても表わすことができる。従って、一回にあるいは数回に分けて一日に約５０ｎg/mLから約５ｍg/mL、好ましくは約２００ｎg/mLから約５００μg/mL、さらに好ましくは約２００ｎg/mLから約５００ｎg/mLのプロテオグリカン刺激増殖因子を哺乳動物に投与することができる。一日の投与量を決めるために、投与単位組成にそのような量あるいはその約数の量を含むことができる。一日に複数回の補助投与により適切な投与を行うことができる。薬を処方する人がそのような投与を望む場合は、一日当たり複数回投与することで一日の全投与量を増加することができる。
【００３６】
この発明で有用な化合物及び/あるいは組成を使用した疾患状態を治療するための投薬治療プログラムは、患者のタイプ、年令、体重、性別、食事や治療状態、疾患の度合、投与経路、さらに活動、効能、薬物動力学及び特定の化合物の毒物学プロフィールなどの薬理学上の検討項目など種々の要素に基づいて、薬剤輸送システムを使用するか、薬剤の組み合わせの一部として化合物を投与するかが選択される。従って、実際に用いられる投薬治療プログラムは非常に広範になり得るため、上記した好ましい投薬治療プログラムから隔たることがある。
【００３７】
増殖因子は、一種類単体または一種類以上の増殖因子を含む「カクテル」のいずれかで投与することができると考えられる。例えば、増殖因子の有効プロテオグリカン合成量を与えるためにOP-1及びBMP-4の混合物を同時に投与することができる。増殖因子カクテルの同時投与を促進するために、本明細書中のいずれかに記載されているように、従来から認められている担体及び賦形剤を含む製薬成分として増殖因子カクテルを調製することができる。
【００３８】
また、プロテオグリカン分解酵素の有効プロテオグリカン開裂量及び増殖因子の有効プロテオグリカン合成量を、化学的髄核分解を必要とする哺乳動物に同時に投与することができると考えられる。コンドロイチンABCなどのプロテオグリカン分解酵素の効果は、注入後１０日で投与量の約２％がNP中に発見できるものの、注入から２４時間以内が最も効果が大きい。高橋ら、脊柱 21:2405-2411 (1966)。増殖因子は増殖因子カスケードを介した効果を誘発するのに少なくとも２４時間要する。例えば、OP-1が軟骨細胞の代謝に対して最大効果を発揮するのは、投与から約７２時間後である。プロテオグリカン分解酵素及び増殖因子の同時投与を促進するため、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子からなる物質の組成として、これら２つの化合物の組み合わせを調製することができる。この組み合わせは、本明細書のいずれかに記載されているように、従来から薬学的に認められている担体及び賦形剤を含む製薬組成物として調製できる。
【００３９】
プロテオグリカン分解酵素の有効プロテオグリカン開裂量及び増殖因子の有効プロテオグリカン合成量を化学的髄核分解を必要とする哺乳動物に対して順次投与することもできる。プロテオグリカン分解酵素の投与後いつの時点でも、好ましくはプロテオグリカン分解酵素投与完了後約２４時間以内に、プロテオグリカン分解酵素投与に続いて増殖因子投与を行うことができる。しかし、増殖因子投与はプロテオグリカン分解酵素投与後に複数回にわたって繰り返し行うことができる。
【００４０】
化学的髄核分解を必要とする哺乳動物は、求める医療成果が得られるまで一度あるいはそれ以上の回数のプロテオグリカン分解酵素投与を受けることができる。 従って、例えば、報告された苦痛がなくなるまで、あるいはMRIなどによる診断分析結果が椎間板のヘルニア形成度の低減を示すまで、プロテオグリカン分解酵素を複数回投与することができる。その後に増殖因子投与を行うことが可能であり、また求める医療成果が得られるまで複数回投与を利用することが可能である。例えば、増殖因子投与に続くAF及びNPの修復がMRIなどによる診断分析結果により確認することができる。症状の反復を防止しあるいはヘルニアの再発を防止することができるように、プロテオグリカン分解酵素投与に続く増殖因子投与がコントロールされることは医療実務家に理解されるところである。プロテオグリカン分解酵素投与は椎間板の間隙内に直接注入することが望ましい。同様に、増殖因子投与は椎間板の間隙内に直接注入することが望ましい。しかしながら、増殖因子は椎間板の間隙に、例えば、移植可能なあるいは外部の椎間板カテーテル付き連続注入ポンプを使用して、連続注入により投与することができると考えられる。
【００４１】
この発明の治療方法は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマなどの哺乳類、サル、チンパンジーあるいはヒトなどの霊長類で、この治療方法を必要とする状態にあるものの治療に使用できる。
【００４２】
この発明に有用な化合物は製薬組成として調製できる。そのような化合物は、薬学的に認められた従来の非中毒性の担体及び賦形剤を含む投薬単位配合物を非経口で投与できる。ここで使用する用語「非経口」には、椎骨間注入あるいは局部注入技術を含む。薬剤の配合について、例えば、ジョン Ｅ．フーバー （編）、レミントン製薬科学（第１８版）、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア、１９９０及びＨ．Ａ．リバーマン及びＬ．ラックマン（編）、薬剤投薬形態、マルセルデッカー社、ニューヨーク、N.Y.、１９８０に記載されている。この明細書のいずれかで述べているように、この発明のプロテオグリカン分解酵素あるいは増殖因子の投与は直接局部注入あるいは椎間板内隙内への局部注入による。
【００４３】
注入可能な製剤、例えば無菌注入水あるいは油性懸濁剤が、適切な溶解剤あるいは湿潤剤及び懸濁剤を使用した周知の技術に従って調製できる。この注入可能な製剤は、非中毒性の非経口希釈剤あるいは溶剤中、例えば1-3-ブタンジオール中の溶液、の無菌注入可能溶液あるいは懸濁剤であってもよい。容認可能な賦形剤及び使用可能な溶剤は水、リンガー溶液及び等浸透圧塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定オイルが溶剤あるいは懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドあるいはジグリセリドを含む混合固定オイルが使用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注入剤の調製に使用できる。ジメチルアセトアミド、イオン及び非イオン洗浄剤、ポリエチレングリコールを含む界面活性剤が使用できる。上記した溶剤及び湿潤剤などの混合液も使用できる。
【００４４】
治療学上の目的で、非経口投与のための配合剤は水あるいは非水の等張無菌注入溶液あるいは懸濁液の形にすることができる。これらの溶液及び懸濁液は、経口投与のための配合剤に使用した周知のひとつあるいはそれ以上の担体あるいは希釈剤を有する無菌粉末あるいは顆粒から準備することができる。この化合物は水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ごま油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び/または種々の緩衝剤に溶解可能である。他の補助薬及び投与のモードは医療技術分野において広く知られている。
【００４５】
この発明で有用な化合物は、ジョン Ｅ．フーバー、（編）、レミントン 製薬科学（第１８版）、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア、１９９０、p.1691に記載されているように、リポソームに配合できる。リポソームは水性媒体中にリン脂肪を分散させることによって形成できる。水あるいは脂質可溶物質はリポソーム中の水空間内に、あるいはリポソームの脂質複層内にそれぞれ捕捉される。従って、周知の従来技術を使用したこの発明の方法で使用するために、増殖因子はリポソーム内に配合される。
【００４６】
上記からわかるように、一投薬形態を作るために担体物質と混合できる活性成分の量は治療される哺乳動物及び投与の特定のモードによって変わる。
【００４７】
他の実施例では、本発明はプロテオグリカン分解酵素及び増殖因子を含むキットを想定している。そのようなキットは本発明の増殖因子と一緒にパッケージ化した本発明のプロテオグリカン分解酵素を含んでいる。このキットは、周知の従来方法でパッケージされている。
【００４８】
本発明のキットは、好ましくはプロテオグリカン分解酵素を含むベセル及び増殖因子を含むベセルからなる。そのようなベセルは、周知のガラス製小ビンあるいは容器、プラスチック製小ビンまたは容器、または他の適切な容器でよい。他の好適な実施例では、このキットはプロテオグリカン分解酵素及び増殖因子を含むベセルからなる。そのようなキットは、本発明の方法によるプロテオグリカン分解酵素及び増殖因子の同時投与のために特に適している。
【００４９】
上記したいずれのキットにも、プロテオグリカン分解酵素及び増殖因子を化学的髄核分解で使用するための説明書がプションで含まれている。例えば、この説明書は本発明キットの構成物の使用についての詳細を提供する。
【００５０】
以下に、さらなる説明のために例を挙げるが、これらの例は本発明を限定するものではない。
【００５１】
例１：組換え型骨形成蛋白質（ＯＰ）を用いたウサギの線維輪（ＡＰ）と随核細胞（ＮＰ）による細胞外基質代謝のアップレギュレーション
原料と方法
細胞培養：
安楽死させたニュージーランドホワイトラビットの脊椎を無菌的に解剖し、腰椎の椎間板（ＩＶＤｓ）を得た。随核（ＮＰ）と線維輪（ＡＦ）は、鈍い解剖によって分離し、別々に貯留した。連続的な酵素分解（プロナーゼで１時間、 コラゲナーゼおよびDNaseIIで１６時間）によって、細胞をそれぞれの組織から単離し、上述したように、単離した細胞を２million/mLの１．２％の低粘性アルギン酸塩で被包した（Chiba,K.et al.,Spine 22:2885(1997)）。この培養物を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、毎日培地を換えて培養した。
【００５２】
rhOP-1 が細胞増殖およびＰＧ合成およびコラーゲン合成に与える影響の測定：
培養７日目、アルギン酸塩に被包された細胞を、種々の濃度の増殖因子（組換え型ヒトOP-1（rhOP-1））存在下、７２時間インキュベートした。この培養は以下のように行った。
【００５３】
（１）細胞増殖を測定するため、培養終了までの６０分の間にこれら培養物の培地にＭＴＴ（５％）を加えた。ビーズをカルキレート試薬で溶解して取り除いてから細胞を溶解し、遠心分離して上澄み液の吸光度を測定した。吸光度は５５０ｎｍであった。（Mosmann,T.J.,Immunol.Methods 65:55(1984).）
（２）ＰＧ合成を測定するため、rhOP-1存在下、７２時間のインキュベートの最後の４時間の間に、35S-sulfate（２０μCi/mL）を培地に添加した。培地を取り除いた後、緩やかな遠心分離によって、溶解したビーズと２つのコンパートメント（細胞間基質（ＣＭ）とfurther removed matrix（ＦＲＭ））とを分離した（Mok,S.S.et al.,J.Biol.Chem.269:33021(1994)）。それぞれの留分は、パパインに溶解し、急速濾過法を用いて35S-PGsを取り除きアルシアンブルーで沈殿させて定量した35S-sulfateに組み入れた。（Masuda,K.et al.,Anal.Biochem.217:167(1994)）
（３）コラーゲン合成を測定するため、rhOP-1による処置中の最後の１６時間、3H-prolinで標識された培養物をＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ培地で培養した。培地を取り除いてからビーズ中のコラーゲンを抽出した。いずれの抽出物もペプシンで分解した後、反水透析した。陽イオン交換カラム中、ＨＰＬＣによって放射能標識したイミノ酸を分離して酸加水分解した後、3H-hydroxyproline（3H-collagenの定量として）を定量した。（Hauselmann,H.J.et al.,J,Cell Sci.107:17(1994)）
アルギン酸ビーズ中へのＰＧおよびコラーゲン蓄積方法
継続的なrhOP-1非存在下、若しくはrhOP-1（100ng/mL）存在下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳでこれらの細胞を培養した。種々の時点において、６０℃においてパパインでビーズを処理し、このパパイン消化物を分析し、ＰＧ（ＤＭＭＢ法によって）ヒドロキシプロリン（酸加水分解後の逆相ＨＰＬＣおよびＰＩＴＣ標識を用いて）およびＤＮＡ（ヘキスト３３２５８色素を用いた蛍光定量法によって）の含有量を求めた。（Chiba,K.et al.,Spine 22:2885(1997)）
統計解析
統計解析は、FisherのＰＬＳＤテストをpost hocテストとして、1つの方法のＡＮＯＶＡによって行った。
【００５４】
結果
細胞増殖およびＤＮＡ含有量
ＭＴＴ分析によって、rhOP-1は、高濃度においてのみ（ＡＦ：１００または２００ng/mL、Ｐ＜０．０１、ＮＰ：１００ ng/mL、Ｐ＜０．０１）、著しい分解促進効果を有することが示された。検討した全時点において、rhOP-1（１００ng/mL）で処理することによってＡＦ培養物（パーセント制御：３日目＝135％、６日目＝１３４％、１１日目＝１２６％、１４日目＝１２６％）のＤＮＡ総含有量が増加していることが認められたが、ＮＦ培養物（Ｐ＜０．０５）ではＤＮＡの増加は認められなかった。
【００５５】
ＰＧ合成
rhOP-1処理によって、１０％ＦＢＦ存在下で維持されたＡＦ、ＮＰ培養物の両方について、ＰＧ合成の増加に顕著な投与量依存性があることを示した（図１参照、Ｐ＜０．００１）。ＰＧ合成速度は、ＤＮＡ１μg単位で表したとき、ＡＦおよびＮＰ培養物の両方について著しく高まったままであった。ＮＰ細胞は、ＡＦ細胞よりもrhOP-1に対する反応性が高かった（パーセント制御としての合成速度：ＡＦ＝２３０％、ＮＰ＝４６０％）。このことから、rhOP-1存在下または非存在下において、ＡＦ細胞はＮＰ細胞よりも多くの35S-PGsを合成していることがわかる。
【００５６】
コラーゲン合成
rhOP-1は、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞の両方によるコラーゲン合成を、投与量依存法で刺激した（図１１参照、）が、ＰＧ合成の場合に比べて反応は小さかった（図１１参照、Ｐ＜０．０１）。ＰＧ合成においても見られたように、rhOP-1は、多量に投与した場合に著しい細胞分裂促進効果を有するが、コラーゲンの合成速度は、ＤＮＡ１μg単位で表したとき、著しく高まったままであった。ＡＦ細胞は全条件下においてＮＰ細胞よりも多くの3H−コラーゲンを生成した。
【００５７】
基質蓄積
１００ng/mLのrhOP-1を培地に加えると、ＡＦビーズおよびＮＦビーズの両方で、ＰＧおよびコラーゲンの総含有量が著しく増加した。このＰＧおよびコラーゲンの総含有量の増加は、ＡＦ、ＮＰともに、１週目は微少量であったが、rhOP-1で培養した２週目では劇的であった。この遅れは、コラーゲン蓄積の場合に特に顕著であった。
【００５８】
考察
これらのデータは、rhOP-1増殖因子のＡＦ細胞、ＮＦ細胞の両方の代謝を刺激する能力を示している。この形態形成蛋白質の細胞に対する分解促進効果は穏やかであるが、１０％ＦＢＳのみが存在する場合よりもＰＧｓおよびコラーゲンの合成を促進することが示された。特に、通常は関節軟骨細胞やＡＦ細胞に比べて試験管内における細胞間基質の再編成への効果がずっと少ないＮＰ細胞の場合に、ＰＧ合成の刺激が顕著であった。面白いことに、ＰＧ合成に対するrhOP-1の刺激効果は、コラーゲン代謝に対するよりも顕著であった。
【００５９】
ヒト椎間板中で、ＮＰのＰＧ含有量は年齢とともに減少し、椎間板が線状または円状に裂けたとき、コラーゲンのネットワーク構成を破壊する変成椎間板疾患に急速に陥ることが（Gower,W.E.et al.,J.Bone Joint Surg.51-A:1154(1969)）、ＭＲＩによってしばしば確認されている。このデータは、プロテオグリカンやコラーゲンの合成を増加させることで、増殖因子rhOP-1が、変成したヒトＩＶＤｓのＡＦ要素やＮＰ要素の基質の合成を促進して修復する治療薬として有用であることを証明した。
【００６０】
例２：コンドロイチナーゼＡＢＣ誘発科学的随核分解処置に続く随核（ＮＰ）および線維環（ＡＰ）によるプロテオグリカン合成に対する骨形成蛋白（ＯＰ−１）の刺激性
原料と方法
無菌環境下、体重３〜４Kgの青年期のニュージーランドホワイトラビットから腰椎を一括除去した（IACUC approval # 94-053）。腰椎間板を解剖し、ＮＰをそれぞれの症例でＡＦから分離した。２million/mLの１．２％の低粘性無菌アルギン酸塩中で連続的に酵素分解および再懸濁を行い、２つの組織から細胞を別々に分離した（Chiba,K.et al.,Spine 22:2885-2893(1997)）。２２本のゲージニードルを通して１０２mLのCaCl２溶液に入れるという溶液滴下法によってビーズを形成した。ビーズ中のＮＰ細胞およびＡＦ細胞は、１０％ＦＢＳ、２５μg/mLのアスコルビン酸、５０μg/mLのゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地によるバッチ培養法で培養した。この完全培地は実験中毎日取り替えた。
【００６１】
培養１４日目、ビーズは３つのグループに分離した。最初に構成されたビーズは、さらに１２日間、この完全培地で培養した。他の２グループ中のビーズは、基質からＰＧｓを枯渇させるために、プロテオグリカン分解酵素およびコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）（０．１U/mL）存在下で２時間１次培養し、３０分×３の洗浄に続いて、OP-1（２００ng/mL）存在下（グループ２）、およびOP-1非存在下（グループ３）の完全培地で１２日間培養した。
【００６２】
種々の時点において、ビーズの基質を６０℃でパパインで消化させて可溶化した。この消化物を、ヘキスト３３２５８色素を用いた蛍光定量法により分析してＤＮＡの含有量を求め、ＤＭＭＢ色素定量法により分析して硫化ＰＧｓの含有量を求めた（Hauselmann,H.J.et al.,J,Cell Sci.107:17-27(1994)）。
【００６３】
いずれの時点においても、全てのＮＰビーズおよびＡＦビーズの分析は、それぞれ９ビーズ３セットで行った。統計解析は、FisherのＰＬＳＤテストをpost hocテストとして、1つの方法のＡＮＯＶＡによって行った。
【００６４】
結果
ＮＰ細胞またはＡＦ細胞をＣ−ＡＢＣで処理している間、ＤＮＡの含有量は減少しなかった。プラトーに達するまでの次の９日間、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞の全てのグループでＤＮＡ含有量は穏やかに増加した。この増加は、ＮＰおよびＡＦビーズをOP-1で培養した場合に比べると著しいものではないが、この差は統計的には重要ではない。図１および図２参照。
【００６５】
ＰＧ含有量をビーズ単位若しくはＤＮＡ１μg単位で表現したときにも、同様の観測および結果が得られた。図３〜図１０、図１２参照。したがって、ここでは、全てのＰＧ含有量の値を、９ビーズ単位で１μgＰＧとして報告する。図１２に示すように、Ｃ−ＡＢＣに触れさせていないＮＰおよびＡＦビーズの硫酸ＰＧ含有量は、培養期間を過ぎても次第に増加した。Ｃ−ＡＢＣによる処理は、８５％以上のＮＰおよびＡＦビーズにおいてＰＧ含有量を失陥させる原因となった。OP-1が投与されていない完全培地に返すことによって、ＮＰおよびＡＦビーズともに基質が修復することが明確に証明されたとはいえ、Ｃ−ＡＢＣ処理しなかったビーズに見られたＰＧ含有量には達しなかった。
【００６６】
OP-1を２００ng/mL投与しても、Ｃ−ＡＢＣで処理した後初めの３日間は基質蓄積に何らの効果も表れなかった。顕著な比較例として、３日目から６日目の間、ＮＰ細胞およびＡＰ細胞ともにOP-1にさらした場合、硫化ＰＧｓと同程度に十分に、の基質修復を制御した。
【００６７】
数時間後、OP-1は、処理した細胞に対して刺激効果を発揮し続け、ＰＧ含有量は、OP-1にさらしていないＣ−ＡＢＣ処理した細胞だけでなく、コントロール細胞よりも著しく高い値を示した（Ｐ＜０．０１）。図１２参照。
【００６８】
考察
これらのデータにより、基質からプロテオグリカン減成酵素によって硫化グリコサミドグリカンをほぼ全部枯渇させた基質の、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞による基質修復への刺激に対する増殖因子OP-1の有効性が証明された。この結果は、色々な理由で予想外であった。
【００６９】
１つ目は、データは、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞が関節軟骨細胞と同程度にＰＧ合成のP-1誘発刺激に敏感であることを示した。定説によって固定されることを期待されていないにも関わらず、OP-1は、関節軟骨中におけるＰＧｓの少量の蓄積よりも、aggrecan 合成の アップレギュレート に効果的なので（Huch,K.,et al.,Arthritis Rheum.40:2157-2161(1997)）、ここで報告したＰＧｓを高めることを反映して、主に新たに合成されたAggrecan分子の基質の修復に組み入れることは、最もあり得そうである。
【００７０】
２つ目は、OP-1または同様の反応方法で関連づけた増殖因子は、試験官内の基質修復への刺激に有用であり、臨床誘発後の化学的随核分解だけでなく、椎間板変質の治療処置にも有用であることが示唆された。
【００７１】
３つ目はプロテオグリカン減成酵素と増殖因子の組み合わせは、コンドロイチナーゼＡＢＣ単独のようなプロテオグリカン減成酵素の用いるよりも、優れた化学的随核分解方法を提供することを示している。
【００７２】
例３：造骨性プロテイン−１による髄核及び線維輪における軟骨基質治療の促進
この例では、細胞、特に椎間板（ＩＶＤｓ）から分離した、髄核（ＮＰ）及び線維輪（ＡＦ）において、軟骨基質治療を促進する造骨性プロテインの有効性を実証している。
【００７３】
この例では、椎間板は、ニュージーランドホワイトラビットから分離し、ＮＰ組織は、ＡＦ組織を解剖して分離した。ＮＰ及びＡＦ細胞は、１．２％低粘性無菌アルギンサン塩内において、続発性の酵素で消化及び再懸濁させて２つの異なる細胞から単離し、ビーズの中に形作る。細胞は、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で、毎日培地を取り替えながら独立して培養する。７日後、各培地を３グループに更に細分化する。１番目のグループは、ＯＰ−１で処理を行わず、対照群とする。２番目のグループには、ＯＰ−１を１００ｎｇ／ｍｌ投与し、３番目のグループには、ＯＰ−１を２００ｎｇ／ｍｌ投与して、ＯＰ−１の存在下で７２時間成長させる。最後４時間は、ＯＰ−１を含む培地に放射性標識３Ｈ−プロリンを加えて培養する。培養の後、培地からコラーゲンを抜き取り、抽出物に混入している放射性標識を測定して、コラーゲン生産量の割合を明らかにする。コラーゲンの生産量は、軟骨基質の修復及び成長と結びつく。ヘキスト３３２５８ダインを用いて各グループのＤＮＡ含有量を計測し、細胞の増殖の割合を明らかにする。
【００７４】
造骨性プロテインは、濃縮−分割する方法で、ＮＰ及びＡＦ共に細胞培養によるコラーゲン生産量を増加させた。３番目のグループは、２番目のグループよりも放射性標識を取り込み、そしてそれは順番に１番目のグループより多くの放射性標識を取り込んだ。造骨性プロテインは、高い濃度の場合は著しい分裂効果を有し、コラーゲン生産量増加の理由となる。それにもかかわらず、増やされた細胞増殖を考慮しても、コラーゲン合成のレートは際立って増加した。
【００７５】
これらの結果は 造骨性タンパク質が成長と細胞外マトリックスの修復を促進することを示唆する。
【００７６】
例４：アニマルモデルにおける椎間板変性の発生。椎間板における変性のための生物機械学及び生化学変化の形態評価。
【００７７】
非常に多数の椎間板が変性したアニマルモデルの中から２つのラビットモデルを選択し、Ｃ - ＡＢＣ円板内注入モデル(カトー, F.等, Clin. Orthop. 253:301-308(1990)と同様、線維輪を刺創する(リプソン, S.J.及び ミュール H, 脊椎 6:194-210 (1981)。これらのモデルは再現可能であり、そして生化学的な変化を変性の異なった段階に記述する。
【００７８】
白色ニュージーランドラビット、体重各２．５ｋｇを使用する。麻酔はケタミン４５ｍｇ／ｋｇを筋肉内に行い、必要に応じてＩＶ５乃至１０ｍｇ／ｋｇに維持し、マスクによる酸素／亜酸化窒素を使用する。前準備及び滅菌布で覆った後、後外側腹膜後アプローチを使用して関節円板の前側および側方を露出する。刺創グループに対しては、１１番メスを使って腹側の線維輪に横切開を行う。化学的髄核分解グループに対しては０．２５ｃｃのＣ−ＡＢＣ（１８７Ｕ／ｍｌ）を微量注射器に２８ゲージ針を用いて円板に注入する。各アニマルは刺創あるいは化学的髄核分解によって治療された２個の円板および２個の対照円板を持っている。この水準はランダムに選ばれる。傷は層状に閉じられ、手術後１日で通常の回復が見られる。２、４、Ｂ、２４週での刺創および化学的髄核分解グループ（合計３０ラビット）から３匹のアニマルが犠牲になる。
【００７９】
形態学的評価
円板の変性度を決定するため、犠牲の１日前にＭＲＩが得られる。これに加えて、ＡＦおよびＮＰの組織学的変化を評価するため、ルーチンな組織学が各期間毎に１個の治療された円板と１個の対照円板に対して実施される。組織学に対しては、移動部位はリン酸塩緩衝ホルマリン内で固定され、脱灰され、パラフィンに包埋され、切開され、Ｈ＆Ｅで染色される。ＭＲＩおよび組織学の結果はトンプソンの判定基準によって等級付される。
【００８０】
ＭＲＩに対しては、移動部位はローディングに先立ち常温で、直径４から５インチのソレノイドコイル（メディカルアドバンセズインコーポレイテド、ミルオーキー、ウィスコンシン州）による１．５テスラ寒冷マグネット（シグマスキャナー、ジェネラルエレクトリックメディカルシステム、ミルオーキー）において撮像される。従来のスピンエコー（ＳＥ）シーケンスが使用される。各移動部位Ｔ２重み付け画像が従来のスピンエコーシーケンスにより矢状面に得られる。Ｔ２重み付けの軸および傍矢状画像がＴＥ３３および８０ｍｓｅｃ．、ＴＲ２０００ｍｓｅｃ．、２ＮＥＸ、スライス厚１．０ｍｍ、ディスプレイ視野８平方ｃｍ、５１２ｘ２５６マトリックスで得られる。
【００８１】
ＮＰ及び内部ＡＦ（正常、暗、中間）の信号変化及び環状裂傷の存在を見るためにＭＲＩ画像が検査される。さらに、円板の高さ、外輪の退化、粘液様変質、終板からのＮＰの分離、真空現象、シュモール小結節、ヘルニア形成などの構造的変化に注目する。退行性変化がベーモン−ロバーツに基づいてIからＶまで等級付けられる（表１）。放射状裂傷を考慮し、円板を以下のように分類される。I：正常、II：横断断裂または周縁断裂、III：放射断裂、IV：円板高さの消失を伴なう進展した退化。組織切片の矢状画像が分析されトンプソンによりIからＶまで等級付けられる（表２）。ＭＲＩ及び組織切片を関連付ける。
【００８２】
表１ ＭＲＩ等級 （ベーモン−ロバーツ）
表２トンプソンによる形態学的等級の記述
生化学試験
目標は、正常円板と比較した時の、円板の病的変質の様々な段階による円板の動的軸の捩り剛さにおける変化とそのヒステリシス反応における変化とを決定することである。
【００８３】
生化学試験は、生化学の組成をできる限り保存するため、全ての動物の安楽死後、１２時間内に行なわれる。
【００８４】
観察記録：動物を安楽死させた後、直ちに腰髄運動体節が得られ、そして椎骨体−円板−椎骨体片は健全のままに、異質の柔らかい組織と後部の変形細胞が取り去られる。各片の優れた部分と劣った部分は遅い速さのダイヤモンドボーン鋸によって切られるので、その結果として生じる優れた表面と劣った表面とは円板の真中横断面に対して平行である。準備された標本は３０分間、５０Ｎの一定の軸方向圧縮荷重を受ける。一定荷重の結果として生じる軸方向変位は、クリープ現象が存在するか調べるために測定される。それから、周期荷重(５０+２０Ｎ)が０．５および５Ｈzの周波数で加えられる。円板組織の永久変形、縁プレートまたは肋軟骨下骨の欠損、或いは体環における薄い裂けまたは裂けを引き起こさないために、２０Ｎの最大荷重が選択される。荷重−無荷重サイクルは、連続するサイクルのための飽和を保証するために、２０回繰り返され、そして、５分の時間間隔が、内部円板の圧力回復を保証するために、各荷重条件間に許される。圧縮試験に続いて、標本は３０分間、無荷重条件に置かれ、同様な方法で適用される捩りモーメントが適用される。平均の捩りモーメントとその振幅は、各々、１．５Ｎｍおよび０．５Ｎｍであり、荷重周波数は０．１および１．０Ｈzである。荷重が加わっている間、荷重電池からの信号、ＬＶＤＴ(捩り試験の場合のＲＶＤＴ)、および圧力センサは１０、５０、１００、または５００Ｈzで標本化される。実験動物から得られる椎骨体−円板−椎骨体片は１回、周期的圧縮および捩り試験を受ける。
【００８５】
しかしながら、最初に健全な円板で得られる椎骨体−円板−椎骨体片および２回目に刺し傷のある円板で得られる椎骨体−円板−椎骨体片に関しては、生化学試験は２回、繰り返される。刺し傷のある脊椎の体円板脊椎の体部分の生化学試験は、負傷直後に生化学反応を調査するために行なわれる。
【００８６】
荷重−変位曲線は、その動的剛さおよびヒステリシスを決定するために、得られ、分析される。動的剛さは、２０番目のサイクルにおける入力ピークからピーク荷重とピークからピーク変位の比として決定される、それ故、ヒステリシスは、荷重および無荷重パスの範囲と荷重パス下の領域の比によって定義される。荷重−内部円板の圧力曲線は、適用される荷重と内部円板の圧力反応との関係を調査するために、得られ、分析される。内部円板の圧力勾配ｄｐ／ｄｌ(ＫＰａ／Ｎ)はピークからピークの圧力をピークからピークの荷重で割ることにより決定され、そして、位相偏移(制御される荷重と内部円板の圧力間の時間遅延)は加荷重および無荷重のパスの範囲によって定義される領域で表現される。クリープ現象は一定の静荷重条件の元で得られる変位−時間曲線から測定される軸方向捩り変位量によって述べられ、そして、内部円板の圧力は、又、対応する内部円板の圧力−時間曲線から決定される同じ時間間隔の間に変化する。
【００８７】
生化学的研究
これらの研究の目的は、刺し傷を受けたことから生じる生化学組成またはＣ−ＡＢＣ内部円板の注射うさぎの円板変性モデルにおける変化を時間経過に従い確認すること、および生機械的特性と円板の生化学的組成とを相関させることである。生機械的試験に続いて、各椎骨体−円板−椎骨体片から円板が切除され、上述の生化学的試験が、又、行なわれる。全ての腰部脊椎体節が除去される。標本の半分は生化学試験のために分析される。円板の生化学的組成は、プロテオグリカン、コラーゲン(ヒドロキシプロリン)およびコラーゲン安定架橋結合体を換算して量が定められる。
【００８８】
その他の標本は、ＰＢＳの４％パラフォマルデハイド内に保存され、脱灰され、パラフィンで包埋され、薄片にされ、そして組織構造および免疫染色によって評価される。各円板の矢状縫合切片(５−８μｍ)はサフラニン−Ｏとともに、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。各動物からの連続する切片はタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンの免疫反応を試験される。人間のタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンに対するマウス単クロン抗体は原抗体として使用される。切片は顕鏡の前にマイヤーのヘマトキシリンで染色される。
【００８９】
例５： 内椎骨の円板変性のための動物モデルにおける内椎骨の円板の生き生きとした回復に介在するＯＰ−１の決定。
【００９０】
この例は、ＮＰおよびＡＦの回復を促進する際に、Ｃ−ＡＢＣ溶解と同時に、或いはＡＦ穿刺時に内部円板に注射されるＯＰ−１の潜在的有用性を試験する。
【００９１】
観察記録：３キログラムの重さの１２匹のニュージーランドうさぎは刺し傷をつけるためおよび刺し傷をつける＋ＯＰ−１のために使用される。各うさぎは刺し傷を受けるひとつの円板、および刺し傷＋ＯＰ−１を受けるもうひとつの円板を持っている。付加的な２４匹のうさぎは４グループ(コントロール薬用塩類の注射、ＯＰ−１のみ、Ｃ−ＡＢＣのみ、Ｃ−ＡＢＣ＋ＯＰ−１)に分けられる。各うさぎは注射された２つの円板のみ持つ。ナトリウムペントバルビタール(２５ｍｇ／Ｋｇ)の静脈注射の処理後、基線レントゲン写真が撮られる。イソフルランの吸入に続いて、各うさぎは側位のうつむきの位置に置かれ、そして腰椎円板の腹側表面は、後方側部の腹膜後への接近を通して露出される。コンドロイチナーゼ−ＡＢＣ(１８７Ｕ／ｍｌ)のみ、ＯＰ−１(２μｇ)のみまたはＯＰ−１(２μｇ)と予め混ぜられたＣ−ＡＢＣはマイクロ注射器に取付けられた２８規格針で２つのより低い腰部の内椎骨の円板(円板毎に溶液３０μｌ)へ注射される。コントロールグループに対して、同じ容量の薬用塩類が注射される。傷は抗生物質を含む無菌の薬用塩類で数回洗浄され、そして層になった縫合線で閉じられる。各グループにおける３匹のうさぎは注射後、２、４、８、１６週間目のペントバルビタールの過度の投与によって安楽死させられる。
【００９２】
安楽死後、円板空間の狭小化の進行を評価するためにレントゲン写真が撮られる。全ての腰部脊椎体節が除去され、ＰＢＳの４％パラフォマルデハイド内に保存され、脱灰され、そしてパラフィンで包埋される。各円板の矢状縫合切片(５−８μｍ)はサフラニン−Ｏとともに、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。各動物からの連続する切片はタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンの免疫反応を試験される。人間のタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンに対するマウス単クロン抗体は原抗体として使用される。切片は顕鏡の前にマイヤーのヘマトキシリンで染色される。
【００９３】
前述のことから、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく多数の修正と変更が生じることが認められる。提示された特別な例に関して何らの制限も受けないことは意図されており、意味されることは理解されるべきである。本開示はクレームの範囲に入るような添付のクレームの修正によって保護されるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪（「AF」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムでの、DNA含量に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。「N.S.」は、時間ゼロでのC-ABC治療前後のAF内のDNA含量の差が重要でないことを示す。
【図２】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核（「NP」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムでの、DNA含量に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。「N.S.」は、時間ゼロでのC-ABC治療前後のNP内のDNA含量の差が重要でないことを示す。
【図３】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪（「AF」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後の合計PGの差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図４】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核（「NP」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後の合計PGの差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図５】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪 (「AF」)の、DNA１マイクログラム当たりのマイクログラムPGで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後のDNA含量当たりの合計PGの差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+) をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図６】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核 (「NP」)の、DNA１マイクログラム当たりのマイクログラムPGで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後のDNA含量当たりの合計PG蓄積の差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図７】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪(「AF」)の、９アルギン酸ビーズ当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+) をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図８】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核 (「NP」)の、９アルギン酸ビーズ当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合のp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図９】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪(「AF」)の、NDA１マイクログラム当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合のp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図１０】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核 (「NP」)の、NDA１マイクログラム当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合のp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図１１】 線維輪（「AF」；白抜きバー）および髄核（「NP」；黒いバー）のプロテオグリカン(「PG」)およびコラーゲン合成に対する組替えヒトOP-1（「rhOP-1」）の効果を示す。対照（「対照」）には、rhOP-1を添加しなかった。PG合成は、対照と比較して、100ng/mlのrhOP-1または200ng/mlのrhOP-1を添加した場合に合成された35S-PGの割合として表した。コラーゲン合成は、対照と比較して、100ng/mlのrhOP-1または200ng/mlのrhOP-1を添加した場合に合成された3H-ヒドロキシプロリンの割合として表した。データはすべて標準誤差バーで表している。
【図１２】 コンドロイチナーゼABC(「C-ABC」)治療に続く、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムとして表した、線維輪（「AF」、左パネル）および髄核（「NP」、右パネル）でのプロテオグリカンの蓄積に対するOP-1の効果を示す反復研究を表す。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「OP-1無しでC-ABC無し」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「OP-1無しでC-ABC有り）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC有りで、OP-1有り）。 データはすべて標準誤差バーで表している。
政府サポート
本発明はNIH認可2-P50-AR39239およびAG04736に基づいて米国政府サポートの基に行われた。米国政府は本発明について特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願のクロスリファレンス
本願は、そのすべてを参照として本願に組み入れた、1998年10月６日出願の米国出願番号60/103,161の利益を主張するものである。
【０００３】
【発明の属する技術分野】
本発明は化学的髄核分解を必要とする哺乳動物の治療方法に関する。特に、本発明はプロテオグリカン分解酵素の有効なプロテオグリカン開裂量および増殖因子の有効なプロテオグリカン合成量を投与することで構成する治療法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
腰痛は個人および社会にとって破壊的な経済的負担となる。業界ではそれが労働不能の最も頻繁な原因である。合衆国において年間に失われる作業日数は一億日を超えている。Ｊ．クレイマー、「椎間板病」、シュツットガルト、ジョージ・シーム・バーラグ（1981年）。米国では毎年50万人を超える労働者が影響を受け、200億ドル以上かかっている。L.I.クランツラー、Ｌ．等、「神経学臨床講義」3：2（1985年）。腰痛は、ほとんどの場合、腰椎の１つ以上の椎間板における病理学的変形と関連づけられている。
【０００５】
椎間板は、脊柱に掛かる圧迫や回転や引張りのストレスに耐える機能のある特殊線維軟骨結合組織である。M.D.ハムザー等、「解剖学記録」220(4)：337-56（1988年）。この椎間板は静水ショックアブソーバの作用をして、２つの脊椎骨間に生じる力を和らげ、これらの脊椎骨を互いになめらかに噛み合わせる上で役立つ。椎間板は、２つの相互依存するが形態学的に異なった領域、すなわち髄核（NP）と、プロテオグリカンに富んだ内側ゼラチンクッション（PG）と、コラーゲン線維に富んだ同心ラメラから成る外側線維輪（AF）とから成る複雑な構造である。
【０００６】
NPとAFの両方の細胞外基質を生成し維持する細胞の新陳代謝は余りよく知られていない。NPの基質は関節軟骨に見られるものに非常に似ている。M.R.ジェーンク等、「生化学ジャーナル」251(2)：347-56（1988年）。それは、比較的少数の細胞によって成人期中に合成され維持される。NP細胞の75％超は軟骨細胞のようであるが、相当な数の大きい脊索細胞があり、特に成人期の以前にある。B.A.マルドナード等、「整形法研究ジャーナル」10(5)：677-90（1992年）。両方のNP細胞種が、組織の中の最も豊富な分子を構成するアグレカンと呼ばれる大きい分子量の親水性PGを合成するか否かは明確でない。関節軟骨の中のように、これらのアグレカン分子は、主にタイプIIコラーゲンから成る筋原線維ネットワークに絡まれた集合を形成するヒアルロナン（HA）の長い線ストランドと細胞外で相互作用する。E.J.トナー等、「リウマチ性疾患臨床講義、 北アメリカ」19(3)：635-57（1993年）。コラーゲン−アグレカン固形基質の膨張、体液およびイオン移送特性そして本質的な機械特性がＮＰのゆがんだ動きを支配する。コラーゲンネットワークが組織に張力を与え、圧迫こわばり感を与え、組織がリバーシブル変形を受けるようにする、粘弾性の水和不足のアグレカン分子類膨張拡大を妨げる。
AFは、NPからの細胞よりもコラーゲンに富んでPGが少ない基質を合成する軟骨細胞に似た細胞 (B.A.マルドナド等、「整形法研究ジャーナル」10(5)：677-90（1992年））の比較的均質の個体数を含む。重要な点では、一部の細胞は、軟骨に通常はかなりの量が見られることのないPGおよびコラーゲン分子を合成する。J.J.ウー等、生化学ジャーナル248(2)：373-81（1987）；Ｒ．メインおよびR.G.ブルートン、「関節軟骨退化の基本および臨床面」の「軟骨コラーゲンの細胞外基質」（J.R.ウォスナーとD.S.ハウエル、編集者)、マルセルデッカー社、ニューヨーク、81-108頁（1993年）；E.J.ソナー−M.A.等、「北アメリカのリウマチ性疾患診療所：変形性関節症」の「変形性関節症における軟骨変形の体液マーカー」（Ｒ．モスコウィツ、編集者）、W.B.ソーンダーズ社、フィラデルフィア、634-658頁（1993年）。このように、通常AFは線維軟骨として分類される。それはリバーシブル奇形を生じるためよりも強度のために造られる。
【０００７】
椎間板細胞の新陳代謝は、関節軟骨からの軟骨細胞のものほどあまりよく知られていない。この領域での進歩は、生体内の実験的なアプローチに費用がかかる本質および細胞の新陳代謝を研究するための適切な培養系の不足により過去に課された制限により制限されている。チバ等（Ｋ．チバ等、「アルジネートで培養される髄核および線維輪細胞：異なるコンパートメントでの基質代謝の特殊化」、「米国、日本、カナダ、欧州の整形法研究会の第２回合同会議の議事録」、32頁（1995年））は、表現型的に安定した軟骨細胞の新陳代謝および新たに生成する基質の代謝回転を研究するために開発精製されたアルギン酸ビーズ培養系を利用する細胞培養系を開発した。H.J.ハウセルマン等、「基質」12(2)：116-29（1992年）；H.J.ハウセルマン等、「Ｊ．細胞科学」107：17-27（1994年）；S.S.モク等、「Ｊ．生物化学」269(52)：33021-7（1994年）；Ｂ．プティー等、「実験的細胞研究」225；151-161（1996年）。関節軟骨細胞のように、これらのアルギン酸ビーズに捕らえられた椎間板細胞も細胞外基質を改質する。Ｋ．チバ等、「背骨」22(24)：2885-93（1997年）。この細胞培養系は、AFとNP細胞の両方の新陳代謝に対する化合物の影響を研究するために使用できる。この細胞培養系は、基質の代謝的に活性（細胞関連）と不活性（さらに除去）のコンパートメントでの変化を区別できる。またチバ等は、ウサギの椎間板全体をアルギン酸ゲルに閉じ込めることが実行可能であることを示している。Ｋ．チバ、Ｇ．Ｂ．Ｊ．アンダーソン等、「整形外科研究会、翻訳」21：190（1996年）。より密接に生体内の状況をまねるこのアプローチは、椎間板構造の改良保持に導き、高い代謝活性を促進する。
【０００８】
腰部の椎間板ヘルニアは、腰痛の最も一般的原因の１つである。椎間板ヘルニアは、最初は物理療法で保守的に治療するが、他の更に侵略的な治療様式を時には必要とする。例えば、化学的髄核分解、つまり局所的に注入した酵素を使用する椎間板組織の溶解が30年以上使われている。オルマーカー等、「臨床整形外科および関連研究」257：274（1990年）。PGは、NPにおける膨潤圧の大部分の要因となるので、PG（D.S.ブラドフォード等、骨と関節外科ジャーナル−アメリカ版65(9)：1220-31（1983年）；G.M.ヒル等、臨床整形外科および関連研究225：229-233（1987年））またはコラーゲンを低下させる酵素の板間注入は、ヘルニア化塊によって捕らえられた神経根の減圧を起こし、痛みの軽減に役立つ。これら酵素によって治療した椎間板の細胞はＰＧをＮＰに補充できるとの予備の組織学的証拠があり、（D.S.ブラドフォード等、「骨と関節外科ジャーナル−アメリカ版」65(9)：1220-31（1983年））椎骨間のクッションの衝撃吸収性の回復に役立ち、最も重要には、隣接する椎間板に掛かる力やストレスを正常にするのに役立つ。
【０００９】
化学的髄核分解を２つの一般的に使用される酵素、すなわちキモパパインとコラゲナーゼとを使用して実行する場合、併発症が化学的髄核分解から生じることがある。キチェルおよびブラウンは、キモパパイン治療がクモ膜下出血、両下肢麻痺、過敏症そして死亡にもつながることがあることを報告している。「臨床整形外科および関連研究」284：63（1992年）。オルマーカー等は、注入したキモパパインは神経毒性でアレルゲンでもあり、コラゲナーゼによる治療は神経学的欠損につながることがあると記している。「臨床整形外科および関連研究」257：274（1990年）。
【００１０】
椎間板ヘルニアに関連する苦痛な坐骨神経痛は、物理療法と化学的髄核分解とを含む保存療法によって軽減しないことがよくあるので、多くの患者が椎間板の手術を受けている。G.M.ヒル等、「臨床整形外科および関連研究」225；229-233（1987年）。しかし、手術結果は必ずしも満足なものではなく、重要なことはこのアプローチは、腰部の椎間板の除去は下部背骨の重大な非安定化を生じ、後年の変性に対する隣接椎間板の素因となるため、最適からはほど遠いものである。G.M.ヒル等、「臨床整形外科および関連研究」225：229-233（1987年）。
【００１１】
近年、化学的髄核分解のためのより新しい治療方式が開発されている。それはキモパパインやコラゲナーゼなどの蛋白分解酵素の使用時の固有の問題の一部を回避し、外科介入の必要性を避けるものである。そのような化学的髄核分解性酵素の１つは、変形菌の生成物であるコンドロイチナーゼABCである。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ヒアルロン酸などの粘質多糖を劣化するエンド−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼである。タカハシ等、「背骨」21:2405 (1996年)。オルマーカー等は、コンドロイチナーゼABCがキモパパインほど背骨組織に有害ではないことを記している。「背骨」21:1952 (1996年)。
【００１２】
骨形態形成蛋白質−７（BMP-7）としても知られている骨生成蛋白質−１（OP-1）は、骨細胞および軟骨細胞分化および新陳代謝に強力な影響を及ぼすTGF-β超ファミリーのメンバーである。I.アサヒナ等、「J.細胞生物学」123(4):921-33 (1993年)。骨形成蛋白質は、ラットに皮下注入した場合に新しい骨形成を起こすことが示された。S.D.クック等、「臨床整形外科」324;29-38 (1996年)。組替えヒトOP-1（rhOP-1）が、生体外での造骨細胞の成長と分化を促進することが示されている。T.K.サムパス等、「J.生物化学」267:20352-20360 (1992年)。また、軟骨形成および骨形成系路に沿って間葉基幹細胞の分化も生じる。I.アサヒナ、「J.細胞生物学」123(4)：921-33 (1993年)。また、組替えヒトOP-1は、軟骨細胞に特定の効果を生む。チェン等は、ひよこの胸骨の軟骨細胞の成長を促進することを示した。P.チェン等、「J.細胞科学」108（Pt 1）：105-14 (1995年).この系では、タイプXコラーゲンの合成誘導を記し、OP-1が軟骨胞成熟化に効果を発揮したことも示している。対照的に、ウシ軟骨細胞は、OP-1に対応したタイプXコラーゲンを表さずにPGとタイプIIコラーゲンの合成増加を示した。P.チェン等、「生化学生物物理研究会」197(3):1253-9 (1993年)。増殖因子は、キモパパインやコラゲナーゼなどの蛋白分解酵素を使用する従来の化学的髄核分解治療では使用しない。これは、こうした酵素が増殖因子を開裂したり減成したりするからである。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、椎間板ヘルニアの徴候を緩和をするだけでなくAFやNPの安定と修復を強化する化学的髄核分解治療が必要とされている。同様に、脊椎骨を機械的に十分にサポートし、観血的手術介入の必要を取り除く化学的髄核分解治療を必要としている。さらに、その組織の安定性と修復の両方を提供しつつ椎間板組織の両溶解のための１つの治療方式だけを必要とする化学的髄核分解治療方法を必要としている。本発明の治療法はそのような方法を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、化学的髄核分解を必要とする哺乳動物にプロテオグリカン分解酵素の有効なプロテオグリカン開裂量と基質成分の形成を促進することに有効な量の増殖因子とを投与することから成る治療に関する。好ましい態様では、基質成分はプロテオグリカンである。別の好ましい態様では、基質成分はコラーゲンである。
【００１５】
別の態様では、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物に有効なプロテオグリカン合成量の増殖因子を投与することから成る、プロテオグリカン分解酵素による化学的髄核分解後の髄核および/又は線維輪細胞の基質を修復する方法について考察する。
【００１６】
さらに別の態様では、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物に有効なプロテオグリカン合成量の増殖因子を投与することから成る、プロテオグリカン分解酵素による化学的髄核分解後の髄核および/又は線維輪細胞の補充方法について考察する。
【００１７】
好ましいプロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼである。好ましいコンドロイチナーゼは、コンドロイチナーゼAC、コンドロイチナーゼB、コンドロイチナーゼCを含む。特に好ましいコンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼABCである。
【００１８】
好ましい増殖因子は骨形成蛋白質である。特に好ましい骨形成蛋白質はOP-1である。別の好ましい増殖因子は形質転換増殖因子βである。
【００１９】
好ましい態様では、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とは同時に投与される。
【００２０】
別の態様では、本発明はプロテオグリカン分解酵素と増殖因子とから成る組成物について考察する。好ましくは、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とは、薬学的許容担体および／または溶媒を含む薬剤組成物として配合される。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とから成るキットについて考察する。好ましい態様では、このキットは、プロテオグリカン分解酵素を含む溶媒と増殖因子を含む溶媒とから成る。別の好ましい態様では、このキットは、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子とを含む溶媒から成る。こうしたいずれのキットも、化学的髄核分解でのプロテオグリカン分解酵素と増殖因子の使用についての使用説明書を任意で含む。
【００２２】
本発明は一般的な利益と利点を提供するものである。１つの利点は、椎間板基質の構造に対する化学的髄核分解の有害な影響を、治療の一部として椎間板構造の修復促進に有効な増殖因子を含むことで打ち消しできることである。本発明の利益は、増殖因子の投与が、蛋白分解化学的髄核分解酵素の投与により損なわれない点である。別の利点は、酵素にはどんな蛋白質分解活性もなく増殖因子を不活性にしないので、化学的髄核分解酵素の投与は、増殖因子蛋白質の投与と同時に起こる点である。更なる利益は、この治療法は、公知の化学的髄核分解治療よりも併発症が少ない点である。
【００２３】
さらに、本発明の利益と利点は、以下の説明から当業者には明白であろう。
【００２４】
【発明の実施の形態】
この発明に係る方法は化学的髄核分解が必要な哺乳類の治療に関するものである。化学的髄核分解が必要な哺乳類は例えば背中下部の痛みの現れにしたがって行われた診断によってわかる。椎間板ヘルニアは例えば背中下部の痛みの履歴の訴えと、その後の背中下部の診察により診断することができる。ＭＲＩのようなＸ線診断画像が診断を確認するために行うことができる。化学的髄核分解は通常椎間板ヘルニアの膨張がある場合で身体療法では治療困難な哺乳類に対して指示される。
【００２５】
化学的髄核分解は典型的には蛋白質加水分解による椎間板組織の分解を生じさせる酵素の椎間スペースへの直接的な注入により行われる。蛋白質分解を生じさせないプロテオグリカン分解酵素を椎間板組織の粉砕のために使用すると、ＡＦ及びＮＰに存在するプロテオグリカンのグリコサミノグリカン鎖は酵素により裂け、一方プロテオグリカンの核蛋白は無傷のままである。換言すれば、このような蛋白質分解を生じさせないプロテオグリカンはＡＦ及びＮＰのプロテオグリカン成分のグリコサミノグリカン鎖を解重合する。
【００２６】
この発明の治療においては、多くのプロテオグリカン分解酵素を使用することができる。このプロテオグリカン分解酵素は、１，４−ヘキソサミニド結合の削除によるコンドロイチンサルフェイト（特に、コンドロイチン−４−サルフェイト、コンドロイチン−６−サルフェイト）のグリコサミノグリカンを解号重合するコンドロイチナーゼ（コンドロイチンリアーゼ）、ヒアルロニダーゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ヒアルロネイトリアーゼ、コンドロイチンサルファターゼ、コンドロ−６−サルファターゼなどである。特に好ましいコンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼＡＢＣ（コンドロイチンＡＢＣリアーゼ；ＥＣ４．２．２．４）で、これはエンドーβーＮ−アセチルーＤ−ヘキソサミニダーゼである。他の好ましいコンドロイチナーゼはコンドロイチナーゼＡＣ（コンドロイチンＡＣリアーゼ）、コンドロイチナーゼＢ（コンドロイチンＢリアーゼ）及びコンドロイチナーゼＣ（コンドロイチンＣリアーゼ）である。
【００２７】
プロテオグリカン分解酵素にはコンドロイチンサルフェイトやヒアルロン酸を解体するグリコシダーゼをふくむことが分かる。この発明の方法に使用するプロテオグリカン分解酵素の量は実効プロテオグリカン開裂量である。ある特定のプロテオグリカン分解酵素の実効プロテオグリカン開裂量はプロテオグリカン分解酵素がその基質の存在に潜伏する場合、反応最終生成物を測定することにより決定できる。したがって、例えば１単位のコンドロイチナーゼＡＢＣは３７°Ｃ、ｐＨ８．０において、毎分、コンドロイチン−６−サルフェイトから１ミリmol の非飽和二糖の形成物に触媒作用を及ぼす酵素の量として定義される。プロテオグリカン分解酵素の実効プロテオグリカン開裂量は約０．０１U／disk から 約１０U／disk の範囲であり、好ましくは約０．０５U／disk から 約５U／disk であり、より好ましくは約０．１U／disk から 約１０U／disk である。宿主哺乳類に投与するプロテオグリカン分解酵素の量は単位体積当たりの量としても表すことが出来る。したがって、プロテオグリカン分解酵素の実効プロテオグリカン開裂量は約０．０００１U／mL から 約１００U／mL の範囲であり、好ましくは約０．０５U／mL から 約５０U／mL であり、より好ましくは約０．１U／mL から 約２０U／mL である。
【００２８】
この発明の方法はまた化学的髄核分解が必要な哺乳類に対して、マトリックス成分の形成を刺激するために有効な増殖因子の量を投与することに関する。増殖因子の実効プロテオグリカン合成量が投与すること、あるいは増殖因子の実効コラーゲン合成量が投与することが可能である。
【００２９】
この発明では様々の増殖因子が使用できる。増殖因子は細胞の増殖あるいは分化を活性化する蛋白質である。増殖因子は多能性であり、各種の細胞において、細胞増殖および／あるいは細胞分化に導くことが出来る。この発明において有用な増殖因子にはプロテオグリカン及びコラーゲンの製造を刺激することによりマトリックス合成を刺激する増殖因子が含まれる。この発明の方法において使用するのに適した増殖因子には、例えばプロテオグリカン及びコラーゲンの合成のようなマトリックス合成を刺激する潜在能力を有するいかなる増殖因子も含まれる。このような増殖因子は化学的髄核分解に引き続き髄核および／あるいは線維輪のマトリックスを修復する。このような増殖因子はまたプロテオグリカン分解酵素を用いた化学的髄核分解の後にNPおよび／あるいはAFのプロテオグリカンおよび／あるいはコラーゲン成分を補充する。したがって、増殖因子の投与は化学的髄核分解の後の椎間板の機械的強度を回復させる。このようにして、椎間板の融合は遅らせること、あるいはさらに避けることが出来る。
【００３０】
好ましい増殖因子には変換性増殖因子β属の構成員が含まれ、このβ属は多くの間葉あるいは上皮細胞の種類に対して増殖性効果を有する。好ましい変換性増殖因子β属の構成員には骨形態発生蛋白質２（ＢＭＰ−２）；骨形態発生蛋白質４（ＢＭＰ−４）及び変換性増殖因子β−１、β−２及びβ−１(有能ケラチノサイト増殖因子９が含まれる。他の有用な変換性増殖因子β属の構成員には、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ，Ｖｇｌ、Ｖｇｒ、６０Ａ蛋白質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ユニビン、ノーダル、スクリュウ、ＡＤＭＰ、ニュウラル及びそのアミノ酸連鎖変異体が含まれる。他の好ましい変換性増殖因子β属には、中胚葉および外胚葉細胞、特にケラチノサイト及び繊維芽細胞の増殖を誘起する表皮性増殖因子（ＥＧＦ）；間葉細胞に対し増殖効果を及ぼす小板誘導の増殖因子（ＰＤＧＦ）、酸及び塩基の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；特に骨成長の成長ホルモンに対する応答を媒介するインシュリン類増殖因子１（ＩＧＦ−１）及び２（ＩＧＦ−２）が含まれる。さらに、好ましい増殖因子には骨形成蛋白質が含まれる。特に好ましい骨形成性蛋白質は骨形態発生蛋白質７（ＢＭＰ−７）としても知られているＯＰ−１である。ＯＰ−１は変換性増殖因子β遺伝子の上科である。これはＭＷ３６，０００の１３９アミノ酸残基同質二重体である。ＯＰ−１は生体内での新たな骨形成を誘発し、骨幹の部分骨欠陥の補修を促進する。
【００３１】
１９９８年１０月６日出願の米国出願第６０／１０３，１６１号に開示され、その全体を参照のために本明細書に組み込むが、この開示内容に示すように、有用な骨形成蛋白質には、少なくとも７０％、好ましくは８０％の連鎖相同性すなわち“類似性”を自然発生蛋白質の群から選択された基準形態発生蛋白質と共有し、アミノ酸連鎖を有する蛋白質が含まれる。基準アミノ酸連鎖と機能的に等価と考えられる候補アミノ酸連鎖はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）のニードルマン等の方法を使用して配列することが出来る。これは、配列プログラム（ディエヌエイスターインコーポレーテッド）等のコンピュータプログラムによって従来より実施されている。候補連鎖における内部間隙及びアミノ酸挿入は、候補連鎖と基準連鎖との間におけるアミノ酸連鎖相同性あるいは同一性の水準として従来より表されていた定義された関係を計算する目的のため無視される。
【００３２】
ここで、「アミノ酸連鎖相同性」はアミノ酸連鎖同一性及び類似性を含むものと理解される。相同性連鎖は同一性および／あるいは類似性アミノ酸残基と共有する。ここで、類似性残基は配列基準連鎖における対応アミノ酸残基の保存的代替物、即ち、「許容点変異」である。したがって、７０％アミノ酸同一性を基準連鎖と共有する候補ポリペプチド連鎖は、配列残基の任意の７０％が基準連鎖における対応残基と同一か保存的代替物かであるものである。
【００３３】
ここで使用する「保存的代替物」とは対応基準残基に物理的あるいは機能的に類似する残基である。例えば、類似する寸法、形状、電荷、等価あるいは水素結合を形成する能力を含む化学的性質等を有する残基である。特に好ましい保存的代替物は、デイホッフ等（1978）の５図解蛋白質連鎖及び構造、Ｓｕｐｐｌ．３、ｃｈ２２（３５４−３５２ページ）ナショナルバイオメディカルレスファウンド、ワシントンＤ．Ｃ．２０００７において、許容される点変異のために定義された判断基準を満たしている。保存的代替物の例として一つのアミノ酸を類似の性質の他のアミノ酸に代えたものがある。例えば以下に示す群内での代替物が周知である。（ａ）バリン、グリシン、（ｂ）グリシン、アラニン、（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン、（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、（ｅ）アスパラギン、グルタミン、（ｆ）セリン、スレオニン、（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン、（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的変異体」あるいは「保存的変異」はまた、結果として生じる代替ポリペプチド連鎖に対する結合特異性を持つ抗体が非代替あるいは親ポリペプチド連鎖に対する結合特異性（即ち、「交差反応」或いは「免疫反応」をもまた持つという条件で、所定のポリペプチド連鎖における非代替の親アミノ酸の代わりに代替アミノ酸の使用を含む。
【００３４】
有用な骨形成活性蛋白質は低、中、高度の厳密度のハイブリッド形成条件下でＤＮＡ或いはＲＮＡ符号化基準骨形成連鎖へハイブリッド形成する核酸により符号化した連鎖から成るアミノ酸連鎖を伴うポリペプチド連鎖を持つ。この連鎖は例えばＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３等の保存された７個シスチン領域を規定するＣ−ターミナル連鎖である。ここで使用されるように、高厳密度ハイブリッド形成条件は４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハルトの溶液、３７℃、１夜にわたる０．１％ＳＤＳ、および５０℃、０．１ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄における周知の技術によるハイブリッド形成であると定義される。標準厳密度条件は市場で入手可能な標準的な分子クローニングに関する書籍において特徴づけられている。例えば、サムブルック、フリッシュ、マニアティス著の分子クローニング実験マニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリプレス：１９８９）、ＤＮＡクローニング、１、２巻（Ｄ．Ｎ．グローバ編、１９８５）、オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．ゲイト編、１９８４）、核酸ハイブリッド形成（Ｂ．Ｄ．ヘイムス、Ｓ．Ｊ．ヒギンス編、１９８４）、Ｂ．パーバル著分子クローニングの実践手引き（１９８４）がある。
【００３５】
増殖因子の有効プロテオグリカン合成量は、例えば、Ｌ．ハウスルマンら, J. Cell. Sci. 107:17-27 (1994) によるＤＭＭＢ染料分析法を使用した増殖因子処理済み試料における硫酸塩プロテオグリカン量の分析によって決定できる。あるいは、プロテオグリカンの合成は、増殖因子処理済み試料内の細胞による硫酸３５(35Ｓ)の吸収を観察することで測定できる。プロテオグリカン合成増殖因子は、哺乳動物に対し一日に約１００μg/diskから約１０ｍg/disk、好ましくは一日に約２００μg/diskから１ｍg/disk、さらに好ましくは約２００μg/diskから約５００μg/diskを一回であるいは数回に分けて毎日投与することができる。哺乳動物に対し一回にあるいは数回に分けて一日に投与するプロテオグリカン合成増殖因子の量は、また単位体積当たりの量としても表わすことができる。従って、一回にあるいは数回に分けて一日に約５０ｎg/mLから約５ｍg/mL、好ましくは約２００ｎg/mLから約５００μg/mL、さらに好ましくは約２００ｎg/mLから約５００ｎg/mLのプロテオグリカン刺激増殖因子を哺乳動物に投与することができる。一日の投与量を決めるために、投与単位組成にそのような量あるいはその約数の量を含むことができる。一日に複数回の補助投与により適切な投与を行うことができる。薬を処方する人がそのような投与を望む場合は、一日当たり複数回投与することで一日の全投与量を増加することができる。
【００３６】
この発明で有用な化合物及び/あるいは組成を使用した疾患状態を治療するための投薬治療プログラムは、患者のタイプ、年令、体重、性別、食事や治療状態、疾患の度合、投与経路、さらに活動、効能、薬物動力学及び特定の化合物の毒物学プロフィールなどの薬理学上の検討項目など種々の要素に基づいて、薬剤輸送システムを使用するか、薬剤の組み合わせの一部として化合物を投与するかが選択される。従って、実際に用いられる投薬治療プログラムは非常に広範になり得るため、上記した好ましい投薬治療プログラムから隔たることがある。
【００３７】
増殖因子は、一種類単体または一種類以上の増殖因子を含む「カクテル」のいずれかで投与することができると考えられる。例えば、増殖因子の有効プロテオグリカン合成量を与えるためにOP-1及びBMP-4の混合物を同時に投与することができる。増殖因子カクテルの同時投与を促進するために、本明細書中のいずれかに記載されているように、従来から認められている担体及び賦形剤を含む製薬成分として増殖因子カクテルを調製することができる。
【００３８】
また、プロテオグリカン分解酵素の有効プロテオグリカン開裂量及び増殖因子の有効プロテオグリカン合成量を、化学的髄核分解を必要とする哺乳動物に同時に投与することができると考えられる。コンドロイチンABCなどのプロテオグリカン分解酵素の効果は、注入後１０日で投与量の約２％がNP中に発見できるものの、注入から２４時間以内が最も効果が大きい。高橋ら、脊柱 21:2405-2411 (1966)。増殖因子は増殖因子カスケードを介した効果を誘発するのに少なくとも２４時間要する。例えば、OP-1が軟骨細胞の代謝に対して最大効果を発揮するのは、投与から約７２時間後である。プロテオグリカン分解酵素及び増殖因子の同時投与を促進するため、プロテオグリカン分解酵素と増殖因子からなる物質の組成として、これら２つの化合物の組み合わせを調製することができる。この組み合わせは、本明細書のいずれかに記載されているように、従来から薬学的に認められている担体及び賦形剤を含む製薬組成物として調製できる。
【００３９】
プロテオグリカン分解酵素の有効プロテオグリカン開裂量及び増殖因子の有効プロテオグリカン合成量を化学的髄核分解を必要とする哺乳動物に対して順次投与することもできる。プロテオグリカン分解酵素の投与後いつの時点でも、好ましくはプロテオグリカン分解酵素投与完了後約２４時間以内に、プロテオグリカン分解酵素投与に続いて増殖因子投与を行うことができる。しかし、増殖因子投与はプロテオグリカン分解酵素投与後に複数回にわたって繰り返し行うことができる。
【００４０】
化学的髄核分解を必要とする哺乳動物は、求める医療成果が得られるまで一度あるいはそれ以上の回数のプロテオグリカン分解酵素投与を受けることができる。 従って、例えば、報告された苦痛がなくなるまで、あるいはMRIなどによる診断分析結果が椎間板のヘルニア形成度の低減を示すまで、プロテオグリカン分解酵素を複数回投与することができる。その後に増殖因子投与を行うことが可能であり、また求める医療成果が得られるまで複数回投与を利用することが可能である。例えば、増殖因子投与に続くAF及びNPの修復がMRIなどによる診断分析結果により確認することができる。症状の反復を防止しあるいはヘルニアの再発を防止することができるように、プロテオグリカン分解酵素投与に続く増殖因子投与がコントロールされることは医療実務家に理解されるところである。プロテオグリカン分解酵素投与は椎間板の間隙内に直接注入することが望ましい。同様に、増殖因子投与は椎間板の間隙内に直接注入することが望ましい。しかしながら、増殖因子は椎間板の間隙に、例えば、移植可能なあるいは外部の椎間板カテーテル付き連続注入ポンプを使用して、連続注入により投与することができると考えられる。
【００４１】
この発明の治療方法は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマなどの哺乳類、サル、チンパンジーあるいはヒトなどの霊長類で、この治療方法を必要とする状態にあるものの治療に使用できる。
【００４２】
この発明に有用な化合物は製薬組成として調製できる。そのような化合物は、薬学的に認められた従来の非中毒性の担体及び賦形剤を含む投薬単位配合物を非経口で投与できる。ここで使用する用語「非経口」には、椎骨間注入あるいは局部注入技術を含む。薬剤の配合について、例えば、ジョン Ｅ．フーバー （編）、レミントン製薬科学（第１８版）、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア、１９９０及びＨ．Ａ．リバーマン及びＬ．ラックマン（編）、薬剤投薬形態、マルセルデッカー社、ニューヨーク、N.Y.、１９８０に記載されている。この明細書のいずれかで述べているように、この発明のプロテオグリカン分解酵素あるいは増殖因子の投与は直接局部注入あるいは椎間板内隙内への局部注入による。
【００４３】
注入可能な製剤、例えば無菌注入水あるいは油性懸濁剤が、適切な溶解剤あるいは湿潤剤及び懸濁剤を使用した周知の技術に従って調製できる。この注入可能な製剤は、非中毒性の非経口希釈剤あるいは溶剤中、例えば1-3-ブタンジオール中の溶液、の無菌注入可能溶液あるいは懸濁剤であってもよい。容認可能な賦形剤及び使用可能な溶剤は水、リンガー溶液及び等浸透圧塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定オイルが溶剤あるいは懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドあるいはジグリセリドを含む混合固定オイルが使用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注入剤の調製に使用できる。ジメチルアセトアミド、イオン及び非イオン洗浄剤、ポリエチレングリコールを含む界面活性剤が使用できる。上記した溶剤及び湿潤剤などの混合液も使用できる。
【００４４】
治療学上の目的で、非経口投与のための配合剤は水あるいは非水の等張無菌注入溶液あるいは懸濁液の形にすることができる。これらの溶液及び懸濁液は、経口投与のための配合剤に使用した周知のひとつあるいはそれ以上の担体あるいは希釈剤を有する無菌粉末あるいは顆粒から準備することができる。この化合物は水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ごま油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び/または種々の緩衝剤に溶解可能である。他の補助薬及び投与のモードは医療技術分野において広く知られている。
【００４５】
この発明で有用な化合物は、ジョン Ｅ．フーバー、（編）、レミントン 製薬科学（第１８版）、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア、１９９０、p.1691に記載されているように、リポソームに配合できる。リポソームは水性媒体中にリン脂肪を分散させることによって形成できる。水あるいは脂質可溶物質はリポソーム中の水空間内に、あるいはリポソームの脂質複層内にそれぞれ捕捉される。従って、周知の従来技術を使用したこの発明の方法で使用するために、増殖因子はリポソーム内に配合される。
【００４６】
上記からわかるように、一投薬形態を作るために担体物質と混合できる活性成分の量は治療される哺乳動物及び投与の特定のモードによって変わる。
【００４７】
他の実施例では、本発明はプロテオグリカン分解酵素及び増殖因子を含むキットを想定している。そのようなキットは本発明の増殖因子と一緒にパッケージ化した本発明のプロテオグリカン分解酵素を含んでいる。このキットは、周知の従来方法でパッケージされている。
【００４８】
本発明のキットは、好ましくはプロテオグリカン分解酵素を含むベセル及び増殖因子を含むベセルからなる。そのようなベセルは、周知のガラス製小ビンあるいは容器、プラスチック製小ビンまたは容器、または他の適切な容器でよい。他の好適な実施例では、このキットはプロテオグリカン分解酵素及び増殖因子を含むベセルからなる。そのようなキットは、本発明の方法によるプロテオグリカン分解酵素及び増殖因子の同時投与のために特に適している。
【００４９】
上記したいずれのキットにも、プロテオグリカン分解酵素及び増殖因子を化学的髄核分解で使用するための説明書がプションで含まれている。例えば、この説明書は本発明キットの構成物の使用についての詳細を提供する。
【００５０】
以下に、さらなる説明のために例を挙げるが、これらの例は本発明を限定するものではない。
【００５１】
例１：組換え型骨形成蛋白質（ＯＰ）を用いたウサギの線維輪（ＡＰ）と随核細胞（ＮＰ）による細胞外基質代謝のアップレギュレーション
原料と方法
細胞培養：
安楽死させたニュージーランドホワイトラビットの脊椎を無菌的に解剖し、腰椎の椎間板（ＩＶＤｓ）を得た。随核（ＮＰ）と線維輪（ＡＦ）は、鈍い解剖によって分離し、別々に貯留した。連続的な酵素分解（プロナーゼで１時間、 コラゲナーゼおよびDNaseIIで１６時間）によって、細胞をそれぞれの組織から単離し、上述したように、単離した細胞を２million/mLの１．２％の低粘性アルギン酸塩で被包した（Chiba,K.et al.,Spine 22:2885(1997)）。この培養物を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で、毎日培地を換えて培養した。
【００５２】
rhOP-1 が細胞増殖およびＰＧ合成およびコラーゲン合成に与える影響の測定：
培養７日目、アルギン酸塩に被包された細胞を、種々の濃度の増殖因子（組換え型ヒトOP-1（rhOP-1））存在下、７２時間インキュベートした。この培養は以下のように行った。
【００５３】
（１）細胞増殖を測定するため、培養終了までの６０分の間にこれら培養物の培地にＭＴＴ（５％）を加えた。ビーズをカルキレート試薬で溶解して取り除いてから細胞を溶解し、遠心分離して上澄み液の吸光度を測定した。吸光度は５５０ｎｍであった。（Mosmann,T.J.,Immunol.Methods 65:55(1984).）
（２）ＰＧ合成を測定するため、rhOP-1存在下、７２時間のインキュベートの最後の４時間の間に、35S-sulfate（２０μCi/mL）を培地に添加した。培地を取り除いた後、緩やかな遠心分離によって、溶解したビーズと２つのコンパートメント（細胞間基質（ＣＭ）とfurther removed matrix（ＦＲＭ））とを分離した（Mok,S.S.et al.,J.Biol.Chem.269:33021(1994)）。それぞれの留分は、パパインに溶解し、急速濾過法を用いて35S-PGsを取り除きアルシアンブルーで沈殿させて定量した35S-sulfateに組み入れた。（Masuda,K.et al.,Anal.Biochem.217:167(1994)）
（３）コラーゲン合成を測定するため、rhOP-1による処置中の最後の１６時間、3H-prolinで標識された培養物をＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ培地で培養した。培地を取り除いてからビーズ中のコラーゲンを抽出した。いずれの抽出物もペプシンで分解した後、反水透析した。陽イオン交換カラム中、ＨＰＬＣによって放射能標識したイミノ酸を分離して酸加水分解した後、3H-hydroxyproline（3H-collagenの定量として）を定量した。（Hauselmann,H.J.et al.,J,Cell Sci.107:17(1994)）
アルギン酸ビーズ中へのＰＧおよびコラーゲン蓄積方法
継続的なrhOP-1非存在下、若しくはrhOP-1（100ng/mL）存在下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳでこれらの細胞を培養した。種々の時点において、６０℃においてパパインでビーズを処理し、このパパイン消化物を分析し、ＰＧ（ＤＭＭＢ法によって）ヒドロキシプロリン（酸加水分解後の逆相ＨＰＬＣおよびＰＩＴＣ標識を用いて）およびＤＮＡ（ヘキスト３３２５８色素を用いた蛍光定量法によって）の含有量を求めた。（Chiba,K.et al.,Spine 22:2885(1997)）
統計解析
統計解析は、FisherのＰＬＳＤテストをpost hocテストとして、1つの方法のＡＮＯＶＡによって行った。
【００５４】
結果
細胞増殖およびＤＮＡ含有量
ＭＴＴ分析によって、rhOP-1は、高濃度においてのみ（ＡＦ：１００または２００ng/mL、Ｐ＜０．０１、ＮＰ：１００ ng/mL、Ｐ＜０．０１）、著しい分解促進効果を有することが示された。検討した全時点において、rhOP-1（１００ng/mL）で処理することによってＡＦ培養物（パーセント制御：３日目＝135％、６日目＝１３４％、１１日目＝１２６％、１４日目＝１２６％）のＤＮＡ総含有量が増加していることが認められたが、ＮＦ培養物（Ｐ＜０．０５）ではＤＮＡの増加は認められなかった。
【００５５】
ＰＧ合成
rhOP-1処理によって、１０％ＦＢＦ存在下で維持されたＡＦ、ＮＰ培養物の両方について、ＰＧ合成の増加に顕著な投与量依存性があることを示した（図１参照、Ｐ＜０．００１）。ＰＧ合成速度は、ＤＮＡ１μg単位で表したとき、ＡＦおよびＮＰ培養物の両方について著しく高まったままであった。ＮＰ細胞は、ＡＦ細胞よりもrhOP-1に対する反応性が高かった（パーセント制御としての合成速度：ＡＦ＝２３０％、ＮＰ＝４６０％）。このことから、rhOP-1存在下または非存在下において、ＡＦ細胞はＮＰ細胞よりも多くの35S-PGsを合成していることがわかる。
【００５６】
コラーゲン合成
rhOP-1は、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞の両方によるコラーゲン合成を、投与量依存法で刺激した（図１１参照、）が、ＰＧ合成の場合に比べて反応は小さかった（図１１参照、Ｐ＜０．０１）。ＰＧ合成においても見られたように、rhOP-1は、多量に投与した場合に著しい細胞分裂促進効果を有するが、コラーゲンの合成速度は、ＤＮＡ１μg単位で表したとき、著しく高まったままであった。ＡＦ細胞は全条件下においてＮＰ細胞よりも多くの3H−コラーゲンを生成した。
【００５７】
基質蓄積
１００ng/mLのrhOP-1を培地に加えると、ＡＦビーズおよびＮＦビーズの両方で、ＰＧおよびコラーゲンの総含有量が著しく増加した。このＰＧおよびコラーゲンの総含有量の増加は、ＡＦ、ＮＰともに、１週目は微少量であったが、rhOP-1で培養した２週目では劇的であった。この遅れは、コラーゲン蓄積の場合に特に顕著であった。
【００５８】
考察
これらのデータは、rhOP-1増殖因子のＡＦ細胞、ＮＦ細胞の両方の代謝を刺激する能力を示している。この形態形成蛋白質の細胞に対する分解促進効果は穏やかであるが、１０％ＦＢＳのみが存在する場合よりもＰＧｓおよびコラーゲンの合成を促進することが示された。特に、通常は関節軟骨細胞やＡＦ細胞に比べて試験管内における細胞間基質の再編成への効果がずっと少ないＮＰ細胞の場合に、ＰＧ合成の刺激が顕著であった。面白いことに、ＰＧ合成に対するrhOP-1の刺激効果は、コラーゲン代謝に対するよりも顕著であった。
【００５９】
ヒト椎間板中で、ＮＰのＰＧ含有量は年齢とともに減少し、椎間板が線状または円状に裂けたとき、コラーゲンのネットワーク構成を破壊する変成椎間板疾患に急速に陥ることが（Gower,W.E.et al.,J.Bone Joint Surg.51-A:1154(1969)）、ＭＲＩによってしばしば確認されている。このデータは、プロテオグリカンやコラーゲンの合成を増加させることで、増殖因子rhOP-1が、変成したヒトＩＶＤｓのＡＦ要素やＮＰ要素の基質の合成を促進して修復する治療薬として有用であることを証明した。
【００６０】
例２：コンドロイチナーゼＡＢＣ誘発科学的随核分解処置に続く随核（ＮＰ）および線維環（ＡＰ）によるプロテオグリカン合成に対する骨形成蛋白（ＯＰ−１）の刺激性
原料と方法
無菌環境下、体重３〜４Kgの青年期のニュージーランドホワイトラビットから腰椎を一括除去した（IACUC approval # 94-053）。腰椎間板を解剖し、ＮＰをそれぞれの症例でＡＦから分離した。２million/mLの１．２％の低粘性無菌アルギン酸塩中で連続的に酵素分解および再懸濁を行い、２つの組織から細胞を別々に分離した（Chiba,K.et al.,Spine 22:2885-2893(1997)）。２２本のゲージニードルを通して１０２mLのCaCl２溶液に入れるという溶液滴下法によってビーズを形成した。ビーズ中のＮＰ細胞およびＡＦ細胞は、１０％ＦＢＳ、２５μg/mLのアスコルビン酸、５０μg/mLのゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地によるバッチ培養法で培養した。この完全培地は実験中毎日取り替えた。
【００６１】
培養１４日目、ビーズは３つのグループに分離した。最初に構成されたビーズは、さらに１２日間、この完全培地で培養した。他の２グループ中のビーズは、基質からＰＧｓを枯渇させるために、プロテオグリカン分解酵素およびコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）（０．１U/mL）存在下で２時間１次培養し、３０分×３の洗浄に続いて、OP-1（２００ng/mL）存在下（グループ２）、およびOP-1非存在下（グループ３）の完全培地で１２日間培養した。
【００６２】
種々の時点において、ビーズの基質を６０℃でパパインで消化させて可溶化した。この消化物を、ヘキスト３３２５８色素を用いた蛍光定量法により分析してＤＮＡの含有量を求め、ＤＭＭＢ色素定量法により分析して硫化ＰＧｓの含有量を求めた（Hauselmann,H.J.et al.,J,Cell Sci.107:17-27(1994)）。
【００６３】
いずれの時点においても、全てのＮＰビーズおよびＡＦビーズの分析は、それぞれ９ビーズ３セットで行った。統計解析は、FisherのＰＬＳＤテストをpost hocテストとして、1つの方法のＡＮＯＶＡによって行った。
【００６４】
結果
ＮＰ細胞またはＡＦ細胞をＣ−ＡＢＣで処理している間、ＤＮＡの含有量は減少しなかった。プラトーに達するまでの次の９日間、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞の全てのグループでＤＮＡ含有量は穏やかに増加した。この増加は、ＮＰおよびＡＦビーズをOP-1で培養した場合に比べると著しいものではないが、この差は統計的には重要ではない。図１および図２参照。
【００６５】
ＰＧ含有量をビーズ単位若しくはＤＮＡ１μg単位で表現したときにも、同様の観測および結果が得られた。図３〜図１０、図１２参照。したがって、ここでは、全てのＰＧ含有量の値を、９ビーズ単位で１μgＰＧとして報告する。図１２に示すように、Ｃ−ＡＢＣに触れさせていないＮＰおよびＡＦビーズの硫酸ＰＧ含有量は、培養期間を過ぎても次第に増加した。Ｃ−ＡＢＣによる処理は、８５％以上のＮＰおよびＡＦビーズにおいてＰＧ含有量を失陥させる原因となった。OP-1が投与されていない完全培地に返すことによって、ＮＰおよびＡＦビーズともに基質が修復することが明確に証明されたとはいえ、Ｃ−ＡＢＣ処理しなかったビーズに見られたＰＧ含有量には達しなかった。
【００６６】
OP-1を２００ng/mL投与しても、Ｃ−ＡＢＣで処理した後初めの３日間は基質蓄積に何らの効果も表れなかった。顕著な比較例として、３日目から６日目の間、ＮＰ細胞およびＡＰ細胞ともにOP-1にさらした場合、硫化ＰＧｓと同程度に十分に、の基質修復を制御した。
【００６７】
数時間後、OP-1は、処理した細胞に対して刺激効果を発揮し続け、ＰＧ含有量は、OP-1にさらしていないＣ−ＡＢＣ処理した細胞だけでなく、コントロール細胞よりも著しく高い値を示した（Ｐ＜０．０１）。図１２参照。
【００６８】
考察
これらのデータにより、基質からプロテオグリカン減成酵素によって硫化グリコサミドグリカンをほぼ全部枯渇させた基質の、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞による基質修復への刺激に対する増殖因子OP-1の有効性が証明された。この結果は、色々な理由で予想外であった。
【００６９】
１つ目は、データは、ＮＰ細胞およびＡＦ細胞が関節軟骨細胞と同程度にＰＧ合成のP-1誘発刺激に敏感であることを示した。定説によって固定されることを期待されていないにも関わらず、OP-1は、関節軟骨中におけるＰＧｓの少量の蓄積よりも、aggrecan 合成の アップレギュレート に効果的なので（Huch,K.,et al.,Arthritis Rheum.40:2157-2161(1997)）、ここで報告したＰＧｓを高めることを反映して、主に新たに合成されたAggrecan分子の基質の修復に組み入れることは、最もあり得そうである。
【００７０】
２つ目は、OP-1または同様の反応方法で関連づけた増殖因子は、試験官内の基質修復への刺激に有用であり、臨床誘発後の化学的随核分解だけでなく、椎間板変質の治療処置にも有用であることが示唆された。
【００７１】
３つ目はプロテオグリカン減成酵素と増殖因子の組み合わせは、コンドロイチナーゼＡＢＣ単独のようなプロテオグリカン減成酵素の用いるよりも、優れた化学的随核分解方法を提供することを示している。
【００７２】
例３：造骨性プロテイン−１による髄核及び線維輪における軟骨基質治療の促進
この例では、細胞、特に椎間板（ＩＶＤｓ）から分離した、髄核（ＮＰ）及び線維輪（ＡＦ）において、軟骨基質治療を促進する造骨性プロテインの有効性を実証している。
【００７３】
この例では、椎間板は、ニュージーランドホワイトラビットから分離し、ＮＰ組織は、ＡＦ組織を解剖して分離した。ＮＰ及びＡＦ細胞は、１．２％低粘性無菌アルギンサン塩内において、続発性の酵素で消化及び再懸濁させて２つの異なる細胞から単離し、ビーズの中に形作る。細胞は、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で、毎日培地を取り替えながら独立して培養する。７日後、各培地を３グループに更に細分化する。１番目のグループは、ＯＰ−１で処理を行わず、対照群とする。２番目のグループには、ＯＰ−１を１００ｎｇ／ｍｌ投与し、３番目のグループには、ＯＰ−１を２００ｎｇ／ｍｌ投与して、ＯＰ−１の存在下で７２時間成長させる。最後４時間は、ＯＰ−１を含む培地に放射性標識３Ｈ−プロリンを加えて培養する。培養の後、培地からコラーゲンを抜き取り、抽出物に混入している放射性標識を測定して、コラーゲン生産量の割合を明らかにする。コラーゲンの生産量は、軟骨基質の修復及び成長と結びつく。ヘキスト３３２５８ダインを用いて各グループのＤＮＡ含有量を計測し、細胞の増殖の割合を明らかにする。
【００７４】
造骨性プロテインは、濃縮−分割する方法で、ＮＰ及びＡＦ共に細胞培養によるコラーゲン生産量を増加させた。３番目のグループは、２番目のグループよりも放射性標識を取り込み、そしてそれは順番に１番目のグループより多くの放射性標識を取り込んだ。造骨性プロテインは、高い濃度の場合は著しい分裂効果を有し、コラーゲン生産量増加の理由となる。それにもかかわらず、増やされた細胞増殖を考慮しても、コラーゲン合成のレートは際立って増加した。
【００７５】
これらの結果は 造骨性タンパク質が成長と細胞外マトリックスの修復を促進することを示唆する。
【００７６】
例４：アニマルモデルにおける椎間板変性の発生。椎間板における変性のための生物機械学及び生化学変化の形態評価。
【００７７】
非常に多数の椎間板が変性したアニマルモデルの中から２つのラビットモデルを選択し、Ｃ - ＡＢＣ円板内注入モデル(カトー, F.等, Clin. Orthop. 253:301-308(1990)と同様、線維輪を刺創する(リプソン, S.J.及び ミュール H, 脊椎 6:194-210 (1981)。これらのモデルは再現可能であり、そして生化学的な変化を変性の異なった段階に記述する。
【００７８】
白色ニュージーランドラビット、体重各２．５ｋｇを使用する。麻酔はケタミン４５ｍｇ／ｋｇを筋肉内に行い、必要に応じてＩＶ５乃至１０ｍｇ／ｋｇに維持し、マスクによる酸素／亜酸化窒素を使用する。前準備及び滅菌布で覆った後、後外側腹膜後アプローチを使用して関節円板の前側および側方を露出する。刺創グループに対しては、１１番メスを使って腹側の線維輪に横切開を行う。化学的髄核分解グループに対しては０．２５ｃｃのＣ−ＡＢＣ（１８７Ｕ／ｍｌ）を微量注射器に２８ゲージ針を用いて円板に注入する。各アニマルは刺創あるいは化学的髄核分解によって治療された２個の円板および２個の対照円板を持っている。この水準はランダムに選ばれる。傷は層状に閉じられ、手術後１日で通常の回復が見られる。２、４、Ｂ、２４週での刺創および化学的髄核分解グループ（合計３０ラビット）から３匹のアニマルが犠牲になる。
【００７９】
形態学的評価
円板の変性度を決定するため、犠牲の１日前にＭＲＩが得られる。これに加えて、ＡＦおよびＮＰの組織学的変化を評価するため、ルーチンな組織学が各期間毎に１個の治療された円板と１個の対照円板に対して実施される。組織学に対しては、移動部位はリン酸塩緩衝ホルマリン内で固定され、脱灰され、パラフィンに包埋され、切開され、Ｈ＆Ｅで染色される。ＭＲＩおよび組織学の結果はトンプソンの判定基準によって等級付される。
【００８０】
ＭＲＩに対しては、移動部位はローディングに先立ち常温で、直径４から５インチのソレノイドコイル（メディカルアドバンセズインコーポレイテド、ミルオーキー、ウィスコンシン州）による１．５テスラ寒冷マグネット（シグマスキャナー、ジェネラルエレクトリックメディカルシステム、ミルオーキー）において撮像される。従来のスピンエコー（ＳＥ）シーケンスが使用される。各移動部位Ｔ２重み付け画像が従来のスピンエコーシーケンスにより矢状面に得られる。Ｔ２重み付けの軸および傍矢状画像がＴＥ３３および８０ｍｓｅｃ．、ＴＲ２０００ｍｓｅｃ．、２ＮＥＸ、スライス厚１．０ｍｍ、ディスプレイ視野８平方ｃｍ、５１２ｘ２５６マトリックスで得られる。
【００８１】
ＮＰ及び内部ＡＦ（正常、暗、中間）の信号変化及び環状裂傷の存在を見るためにＭＲＩ画像が検査される。さらに、円板の高さ、外輪の退化、粘液様変質、終板からのＮＰの分離、真空現象、シュモール小結節、ヘルニア形成などの構造的変化に注目する。退行性変化がベーモン−ロバーツに基づいてIからＶまで等級付けられる（表１）。放射状裂傷を考慮し、円板を以下のように分類される。I：正常、II：横断断裂または周縁断裂、III：放射断裂、IV：円板高さの消失を伴なう進展した退化。組織切片の矢状画像が分析されトンプソンによりIからＶまで等級付けられる（表２）。ＭＲＩ及び組織切片を関連付ける。
【００８２】
表１ ＭＲＩ等級 （ベーモン−ロバーツ）
目標は、正常円板と比較した時の、円板の病的変質の様々な段階による円板の動的軸の捩り剛さにおける変化とそのヒステリシス反応における変化とを決定することである。
【００８３】
生化学試験は、生化学の組成をできる限り保存するため、全ての動物の安楽死後、１２時間内に行なわれる。
【００８４】
観察記録：動物を安楽死させた後、直ちに腰髄運動体節が得られ、そして椎骨体−円板−椎骨体片は健全のままに、異質の柔らかい組織と後部の変形細胞が取り去られる。各片の優れた部分と劣った部分は遅い速さのダイヤモンドボーン鋸によって切られるので、その結果として生じる優れた表面と劣った表面とは円板の真中横断面に対して平行である。準備された標本は３０分間、５０Ｎの一定の軸方向圧縮荷重を受ける。一定荷重の結果として生じる軸方向変位は、クリープ現象が存在するか調べるために測定される。それから、周期荷重(５０+２０Ｎ)が０．５および５Ｈzの周波数で加えられる。円板組織の永久変形、縁プレートまたは肋軟骨下骨の欠損、或いは体環における薄い裂けまたは裂けを引き起こさないために、２０Ｎの最大荷重が選択される。荷重−無荷重サイクルは、連続するサイクルのための飽和を保証するために、２０回繰り返され、そして、５分の時間間隔が、内部円板の圧力回復を保証するために、各荷重条件間に許される。圧縮試験に続いて、標本は３０分間、無荷重条件に置かれ、同様な方法で適用される捩りモーメントが適用される。平均の捩りモーメントとその振幅は、各々、１．５Ｎｍおよび０．５Ｎｍであり、荷重周波数は０．１および１．０Ｈzである。荷重が加わっている間、荷重電池からの信号、ＬＶＤＴ(捩り試験の場合のＲＶＤＴ)、および圧力センサは１０、５０、１００、または５００Ｈzで標本化される。実験動物から得られる椎骨体−円板−椎骨体片は１回、周期的圧縮および捩り試験を受ける。
【００８５】
しかしながら、最初に健全な円板で得られる椎骨体−円板−椎骨体片および２回目に刺し傷のある円板で得られる椎骨体−円板−椎骨体片に関しては、生化学試験は２回、繰り返される。刺し傷のある脊椎の体円板脊椎の体部分の生化学試験は、負傷直後に生化学反応を調査するために行なわれる。
【００８６】
荷重−変位曲線は、その動的剛さおよびヒステリシスを決定するために、得られ、分析される。動的剛さは、２０番目のサイクルにおける入力ピークからピーク荷重とピークからピーク変位の比として決定される、それ故、ヒステリシスは、荷重および無荷重パスの範囲と荷重パス下の領域の比によって定義される。荷重−内部円板の圧力曲線は、適用される荷重と内部円板の圧力反応との関係を調査するために、得られ、分析される。内部円板の圧力勾配ｄｐ／ｄｌ(ＫＰａ／Ｎ)はピークからピークの圧力をピークからピークの荷重で割ることにより決定され、そして、位相偏移(制御される荷重と内部円板の圧力間の時間遅延)は加荷重および無荷重のパスの範囲によって定義される領域で表現される。クリープ現象は一定の静荷重条件の元で得られる変位−時間曲線から測定される軸方向捩り変位量によって述べられ、そして、内部円板の圧力は、又、対応する内部円板の圧力−時間曲線から決定される同じ時間間隔の間に変化する。
【００８７】
生化学的研究
これらの研究の目的は、刺し傷を受けたことから生じる生化学組成またはＣ−ＡＢＣ内部円板の注射うさぎの円板変性モデルにおける変化を時間経過に従い確認すること、および生機械的特性と円板の生化学的組成とを相関させることである。生機械的試験に続いて、各椎骨体−円板−椎骨体片から円板が切除され、上述の生化学的試験が、又、行なわれる。全ての腰部脊椎体節が除去される。標本の半分は生化学試験のために分析される。円板の生化学的組成は、プロテオグリカン、コラーゲン(ヒドロキシプロリン)およびコラーゲン安定架橋結合体を換算して量が定められる。
【００８８】
その他の標本は、ＰＢＳの４％パラフォマルデハイド内に保存され、脱灰され、パラフィンで包埋され、薄片にされ、そして組織構造および免疫染色によって評価される。各円板の矢状縫合切片(５−８μｍ)はサフラニン−Ｏとともに、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。各動物からの連続する切片はタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンの免疫反応を試験される。人間のタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンに対するマウス単クロン抗体は原抗体として使用される。切片は顕鏡の前にマイヤーのヘマトキシリンで染色される。
【００８９】
例５： 内椎骨の円板変性のための動物モデルにおける内椎骨の円板の生き生きとした回復に介在するＯＰ−１の決定。
【００９０】
この例は、ＮＰおよびＡＦの回復を促進する際に、Ｃ−ＡＢＣ溶解と同時に、或いはＡＦ穿刺時に内部円板に注射されるＯＰ−１の潜在的有用性を試験する。
【００９１】
観察記録：３キログラムの重さの１２匹のニュージーランドうさぎは刺し傷をつけるためおよび刺し傷をつける＋ＯＰ−１のために使用される。各うさぎは刺し傷を受けるひとつの円板、および刺し傷＋ＯＰ−１を受けるもうひとつの円板を持っている。付加的な２４匹のうさぎは４グループ(コントロール薬用塩類の注射、ＯＰ−１のみ、Ｃ−ＡＢＣのみ、Ｃ−ＡＢＣ＋ＯＰ−１)に分けられる。各うさぎは注射された２つの円板のみ持つ。ナトリウムペントバルビタール(２５ｍｇ／Ｋｇ)の静脈注射の処理後、基線レントゲン写真が撮られる。イソフルランの吸入に続いて、各うさぎは側位のうつむきの位置に置かれ、そして腰椎円板の腹側表面は、後方側部の腹膜後への接近を通して露出される。コンドロイチナーゼ−ＡＢＣ(１８７Ｕ／ｍｌ)のみ、ＯＰ−１(２μｇ)のみまたはＯＰ−１(２μｇ)と予め混ぜられたＣ−ＡＢＣはマイクロ注射器に取付けられた２８規格針で２つのより低い腰部の内椎骨の円板(円板毎に溶液３０μｌ)へ注射される。コントロールグループに対して、同じ容量の薬用塩類が注射される。傷は抗生物質を含む無菌の薬用塩類で数回洗浄され、そして層になった縫合線で閉じられる。各グループにおける３匹のうさぎは注射後、２、４、８、１６週間目のペントバルビタールの過度の投与によって安楽死させられる。
【００９２】
安楽死後、円板空間の狭小化の進行を評価するためにレントゲン写真が撮られる。全ての腰部脊椎体節が除去され、ＰＢＳの４％パラフォマルデハイド内に保存され、脱灰され、そしてパラフィンで包埋される。各円板の矢状縫合切片(５−８μｍ)はサフラニン−Ｏとともに、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される。各動物からの連続する切片はタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンの免疫反応を試験される。人間のタイプIIコラーゲンおよびタイプIコラーゲンに対するマウス単クロン抗体は原抗体として使用される。切片は顕鏡の前にマイヤーのヘマトキシリンで染色される。
【００９３】
前述のことから、本発明の真の精神と範囲から逸脱することなく多数の修正と変更が生じることが認められる。提示された特別な例に関して何らの制限も受けないことは意図されており、意味されることは理解されるべきである。本開示はクレームの範囲に入るような添付のクレームの修正によって保護されるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪（「AF」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムでの、DNA含量に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。「N.S.」は、時間ゼロでのC-ABC治療前後のAF内のDNA含量の差が重要でないことを示す。
【図２】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核（「NP」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムでの、DNA含量に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。「N.S.」は、時間ゼロでのC-ABC治療前後のNP内のDNA含量の差が重要でないことを示す。
【図３】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪（「AF」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後の合計PGの差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図４】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核（「NP」）の、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後の合計PGの差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図５】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪 (「AF」)の、DNA１マイクログラム当たりのマイクログラムPGで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後のDNA含量当たりの合計PGの差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+) をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図６】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核 (「NP」)の、DNA１マイクログラム当たりのマイクログラムPGで表した、総プロテオグリカン(「PG」)蓄積に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。時間ゼロでのC-ABC治療前後のDNA含量当たりの合計PG蓄積の差は、p<0.05で統計的に重要である。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、10日、14日、17日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図７】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪(「AF」)の、９アルギン酸ビーズ当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+) をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合にp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図８】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核 (「NP」)の、９アルギン酸ビーズ当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合のp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図９】 コンドロイチナーゼABCで治療した線維輪(「AF」)の、NDA１マイクログラム当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日、21日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合のp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図１０】 コンドロイチナーゼABCで治療した髄核 (「NP」)の、NDA１マイクログラム当たりの毎分のカウント（「CPM」）で表した、プロテオグリカン(「PG」)合成に対するOP-1の効果を示す（「C-ABC」）。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「C-ABC(-)、OP-1(-)」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(-)」）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC(+)、OP-1(+)」）。データはすべて標準誤差バーで表している。アスタリスク（＊）は、C-ABC治療から７日、14日後にC-ABC(+)、OP-1(+)をC-ABC(+)、OP-1(-)と比較した場合のp<0.05での統計的に重要な違いを示している。
【図１１】 線維輪（「AF」；白抜きバー）および髄核（「NP」；黒いバー）のプロテオグリカン(「PG」)およびコラーゲン合成に対する組替えヒトOP-1（「rhOP-1」）の効果を示す。対照（「対照」）には、rhOP-1を添加しなかった。PG合成は、対照と比較して、100ng/mlのrhOP-1または200ng/mlのrhOP-1を添加した場合に合成された35S-PGの割合として表した。コラーゲン合成は、対照と比較して、100ng/mlのrhOP-1または200ng/mlのrhOP-1を添加した場合に合成された3H-ヒドロキシプロリンの割合として表した。データはすべて標準誤差バーで表している。
【図１２】 コンドロイチナーゼABC(「C-ABC」)治療に続く、９アルギン酸ビーズ当たりのマイクログラムとして表した、線維輪（「AF」、左パネル）および髄核（「NP」、右パネル）でのプロテオグリカンの蓄積に対するOP-1の効果を示す反復研究を表す。白抜きバーは、C-ABCまたはOP-1で治療してない細胞のデータを示す（「OP-1無しでC-ABC無し」）。斜線のバーは、C-ABCのみで治療した細胞のデータを示す（「OP-1無しでC-ABC有り）。黒いバーは、C-ABCとOP-1とで治療した細胞のデータを示す（「C-ABC有りで、OP-1有り）。 データはすべて標準誤差バーで表している。
Claims (28)
- 化学的髄核融解を必要とする哺乳動物の治療のために必要な薬剤の製造において、
(a)コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸を分解できる有効量のプロテオグリカン分解酵素；および
(b)プロテオグリカンまたはコラーゲンの形成を刺激することに有効な量の増殖因子
の使用。 - 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼであることを特徴とする請求項１記載の使用。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする請求項２記載の使用。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＡＣであることを特徴とする請求項２記載の使用。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＢあることを特徴とする請求項２記載の使用。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＣであることを特徴とする請求項２記載の使用。
- 前記増殖因子は骨形成蛋白質であることを特徴とする請求項１記載の使用。
- 前記骨形成蛋白質はＯＰ-１であることを特徴とする請求項７記載の使用。
- 前記増殖因子は形質転換増殖因子βであることを特徴とする請求項１記載の使用。
- 前記プロテオグリカン分解酵素及び前記増殖因子は同時に投与されることを特徴とする請求項１記載の使用。
- コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸を分解できるプロテオグリカン分解酵素と椎間板の髄核、線維輪または髄核と線維輪の両方のプロテオグリカンまたはコラーゲンの形成を刺激するための増殖因子とからなり、
化学的髄核融解を必要とする哺乳動物の治療において、同時に、別々にまたは２４時間以内の間隔で連続して用いるための併用製剤である組成物。 - 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼであることを特徴とする請求項１１記載の物質の組成物。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする請求項１２記載の物質の組成物。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＡＣであることを特徴とする請求項１２記載の物質の組成物。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＢあることを特徴とする請求項１２記載の物質の組成物。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＣであることを特徴とする請求項１２記載の物質の組成物。
- 前記増殖因子は骨形成蛋白質であることを特徴とする請求項１１記載の物質の組成物。
- 前記骨形成蛋白質はＯＰ-１であることを特徴とする請求項１７記載の物質の組成物。
- 前記増殖因子は形質転換増殖因子βであることを特徴とする請求項１１記載の物質の組成物。
- コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸を分解できるプロテオグリカン分解酵素と椎間板の髄核、線維輪または髄核と線維輪の両方のプロテオグリカンまたはコラーゲンの形成を刺激するための増殖因子とからなるキット。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼであることを特徴とする請求項２０記載のキット。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする請求項２１記載のキット。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＡＣであることを特徴とする請求項２１記載のキット。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＢあることを特徴とする請求項２１記載のキット。
- 前記プロテオグリカン分解酵素はコンドロイチナーゼＣであることを特徴とする請求項２１記載のキット。
- 前記増殖因子は骨形成蛋白質であることを特徴とする請求項２０記載のキット。
- 前記骨形成蛋白質はＯＰ-１であることを特徴とする請求項２６記載のキット。
- 前記増殖因子は形質転換増殖因子βであることを特徴とする請求項２０記載の物質のキット。
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